ES2917248T3 - Formulaciones de polímeros biodegradables para aumentar la eficacia de la toxina botulínica - Google Patents

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Abstract

Se han desarrollado métodos para la formulación de micropartículas biodegradables para la administración de fármacos proteicos, como la toxina botulínica. Los métodos incluyen los pasos de precipitar y lavar proteínas con solvente orgánico para eliminar el agua antes de dispersarse en solvente orgánico disuelto de polímero para evitar la exposición a las interfaces de agua/solvente y mantener la bioactividad de los fármacos proteicos y la fabricación de micropartículas por plantilla o método de emulsión de emulsión o método de emulsión.. Las micropartículas biodegradables, formadas por uno o más polímeros biodegradables que han atrapado en el polímero, uno o más agentes de proteínas, como la toxina botulínica, también se proporcionan. La toxina botulínica precipitada y las micropartículas cargadas de toxina botulínica también se pueden formular en termogeles o hidrogeles reticulados. La estabilidad de la proteína dentro de estas micropartículas, así como la liberación controlada de los agentes atrapados, proporciona una eficacia sostenida de los agentes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Formulaciones de polímeros biodegradables para aumentar la eficacia de la toxina botulínica
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio y la prioridad del documento de EE.UU. n.° 62/380.229, presentado el 26 de agosto de 2016.
Campo de la invención
La invención pertenece al campo de los sistemas de suministro de fármacos en general y, en particular, al campo de las formulaciones de polímeros biodegradables para el suministro de proteínas lábiles, es decir, la toxina botulínica durante un período prolongado de eficacia.
Antecedentes de la invención
A lo largo de las últimas décadas, se han desarrollado miles de sistemas de suministro de fármacos de liberación prolongada para la administración enteral, en especial, por vía oral. Sin embargo, desde 1989 solo ha habido aproximadamente 20 productos aprobados para su uso en el campo clínico para el suministro de fármacos como formulaciones inyectables de absorción lenta a largo plazo (es decir, durante semanas hasta seis meses). La mayoría de las formulaciones de absorción lenta inyectables están en forma de micropartículas, implantes sólidos, o implantes de formación in situ, y todas las formulaciones inyectables actualmente en uso clínico emplean polímeros biodegradables, para que los sistemas de suministro no tengan que ser retirados más tarde.
Hasta la fecha, el método más utilizado para producir formulaciones de micropartículas es el proceso de doble emulsión (Ye et al., "Issues in long-term protein delivery using biodegradable microparticles", J. Control. Release, 156, págs. 241-260 (2010)), donde primero se disuelve un fármaco en un disolvente adecuado (ya sea agua o un disolvente orgánico dependiendo de la solubilidad del fármaco), y luego se añade al segundo disolvente que contiene el polímero disuelto, para preparar una emulsión de agua en aceite o de aceite en aceite. Para los fármacos proteicos, sin embargo, ha sido una práctica común incorporar proteínas sólidas en polvo para preparar emulsiones, porque las proteínas disueltas en agua son propensas a la desnaturalización tras la exposición a la fase de contacto de agua/disolvente (Ye et al., J. Control. Release, 156, págs. 241-260 (2010)). Este proceso de emulsión, sin embargo, presenta problemas de formulación debido a la dificultad de dispersar uniformemente las proteínas en polvo en soluciones de polímeros orgánicos, y requiere métodos de fabricación complicados.
Por ejemplo, la formulación inyectable de la hormona de crecimiento humano recombinante somatropina se formula en micropartículas de PLGA y se comercializa como NUTROPIN DEPOT®. La somatropina es una proteína de 191 restos de aminoácidos, que tiene un peso molecular de 22.124 Dalton. NUTROPIN DEPOT® fue fabricado mediante el proceso PROLEASE® de Alkermes y aprobado por la Administración de Medicamentos y Alimentos de Estados Unidos (FDA, Food and Drug Administraron) en 1999. Sin embargo, la producción de NUTROPIN DEPOT® se suspendió definitivamente en 2004 debido a dificultades de fabricación.
Adicionalmente, el tamaño grande y heterogéneo de las proteínas en polvo las suele hacer inadecuadas para la fabricación de micropartículas utilizando los métodos existentes. El tamaño final de las micropartículas de PLGA preparadas es generalmente heterogéneo y grande, requiriendo agujas de calibre de gran diámetro para la inyección. Por ejemplo, las formulaciones de micropartículas de somatropina (comercializadas como NUTROPIN DEPOT®), triptorelina (comercializadas como TRELSTAR®) y risperidona (comercializadas como RISPERIDAL CONSTA®) requieren agujas con un diámetro exterior de 0,813 mm (es decir, calibre 21 o menor). El suministro de la formulación inyectable de liberación lenta de naltrexona (comercializada como VIVITROL®) requiere una aguja con un diámetro exterior de 0,902 mm (es decir, calibre 20). En comparación, el suministro de insulina normalmente requiere una aguja que tenga un diámetro exterior de 0,356 mm o menor (es decir, calibre 28 o mayor).
Además de micropartículas o implantes sólidos de mayor tamaño, se han utilizado soluciones de polímero de formación in situ para el suministro de fármacos a largo plazo (Dunn, et al., Biodegradable in-situ forming implants and methods of producing the same, patente de EE.UU. n.° 4.938.763 (1990); Dunn y Yarborough, "Coupling syringe system and methods for obtaining mixed composition", patente de EE. UU. n.° 8.226.598 (2012)). Por ejemplo, se disuelven un fármaco y PLGA en un disolvente orgánico tal como A/-metil-2-pirrol¡dona (NMP), y se inyecta la solución de fármaco-PLGA en el organismo. Posteriormente, se elimina el disolvente in vivo de la formulación al tejido circundante, dejando una formulación en gel o sólida biodegradable. El método de formación de gel in situ, sin embargo, solo se ha utilizado para fármacos de bajo peso molecular y fármacos peptídicos que no tienen la estructura terciaria que tienen las proteínas.
Los métodos de fabricación actuales para formular micropartículas de PLGA para fármacos de liberación lenta tienen varias desventajas para los fármacos proteicos. Un factor que se ha de considerar es la importancia de mantener la actividad biológica de las proteínas, que pueden desnaturalizarse fácilmente por los cambios de temperatura, exposición a superficies de contacto de disolvente-agua o exposición a superficies de contacto de agua-aire durante todo el proceso de fabricación. Por consiguiente, muchos fármacos proteicos presentan una eficacia reducida después de la exposición a los procesos comúnmente empleados en los métodos de fabricación convencionales.
El fármaco proteico utilizado en la presente invención es la toxina botulínica. La toxina botulínica es una neurotoxina sumamente potente producida por la bacteria Clostridium botulinum. Se han establecido cantidades farmacéuticamente aceptables de toxina botulínica para fines terapéuticos y cosméticos, y tienen un número creciente de aplicaciones en las industrias biomédica y cosmética. Las toxinas botulínicas han sido aprobadas por la FDA de EE. UU. para el tratamiento de trastornos neuromusculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos, incluyendo estrabismo, blefaroespasmo y espasmo hemifacial, así como para el tratamiento del dolor, trastornos urinarios, disfunción prostática, migrañas crónicas, sudoración, etc. La toxina botulínica también se utiliza en aplicaciones cosméticas para mejorar el aspecto de las arrugas y las líneas de expresión glabelares. Los efectos de la inyección intramuscular de toxina botulínica normalmente se producen en los días posteriores a la administración, en función de la dosis administrada. Normalmente, la toxina botulínica se formula en una solución acuosa mediante la reconstitución de un polvo seco, por ejemplo, en cloruro de sodio al 0,9 %, para su uso como agente médico o cosmético. Sin embargo, la duración típica del alivio sintomático de una única inyección intramuscular de toxina botulínica formulada de esta manera tiene un promedio de aproximadamente tres-cuatro meses después de la administración. Debido a que los riesgos de experimentar efectos secundarios de la aplicación médica o cosmética de la toxina botulínica aumentan al aumentar la cantidad administrada, la cantidad y la pauta de administración actualmente limitan la duración de la eficacia de la toxina botulínica para uso en seres humanos. Los síntomas de la toxicidad de la toxina botulínica pueden incluir náuseas, dificultad para caminar y tragar, pudiendo progresar a parálisis de los músculos respiratorios e insuficiencia cardíaca. Los beneficios de utilizar la toxina para diversas aplicaciones aumentarán si se dispone de nuevos sistemas de suministro para mantener el efecto de la toxina durante más tiempo del que se dispone en la actualidad. Así pues, existe la necesidad de métodos mejorados para fabricar formulaciones mejoradas de liberación lenta que mantengan la bioactividad de los fármacos proteicos, es decir, toxina botulínica.
También existe la necesidad de métodos mejorados para formular proteínas de alta potencia, es decir, toxina botulínica en sistemas de suministro sostenido, por ejemplo, micropartículas y geles, para el suministro con farmacocinética muy controlada y liberación lenta. La mayoría de los métodos requieren una dispersión uniforme del principio activo en toda la partícula para obtener una liberación uniforme. Esto es un problema cuando la proteína es muy activa y, por lo tanto, se incorporan cantidades muy pequeñas a las partículas. Las dosis de todas las toxinas botulínicas disponibles en el mercado se expresan en términos de unidades de actividad biológica. Una unidad de toxina botulínica corresponde a la mediana de la dosis letal (DL50) intraperitoneal calculada en ratones hembra Swiss-Webster. El BOTOX® (Allergan) es una forma liofilizada estéril de toxina botulínica de tipo A. Se produce a partir de un cultivo de la cepa Hall de C. botulinum y se purifica mediante una serie de precipitaciones en ácido, obteniéndose un complejo cristalino que contiene la toxina y otras proteínas. La actividad específica del BOTOX® es de aproximadamente 20 unidades/nanogramo de complejo de neurotoxina y proteína. Cada vial de BOTOX® contiene 100 unidades (U) de complejo de neurotoxina de Clostridium botulinum de tipo A, 0,5 miligramos de albúmina (humana) y 0,9 miligramos de cloruro de sodio en forma estéril, desecada al vacío y sin conservantes. La actividad específica de la toxina botulínica depende del tipo y de la forma de preparación, y por tanto, diferentes formulaciones pueden tener diferentes actividades específicas.
Por lo tanto, es un objeto de la invención proporcionar métodos y composiciones para la formulación de sistemas de suministro poliméricos, por ejemplo, micropartículas y geles, para la liberación lenta de fármacos proteicos, es decir, toxina botulínica.
También es un objeto de la invención proporcionar métodos para la fabricación de sistemas de suministro para la liberación controlada de principios activos proteicos, es decir, toxina botulínica, que ejercen un impacto mínimo o nulo sobre la actividad biológica de los principios activos proteicos.
Es un objeto adicional de la invención proporcionar micropartículas para el suministro de toxina botulínica durante períodos de tiempo mayores que los que se consiguen con las actuales formulaciones en solución acuosa.
Es otro objeto de la invención proporcionar sistemas que mantengan la bioactividad de la toxina botulínica y prolonguen su eficacia in vivo.
Otro objeto más de la invención es proporcionar composiciones, métodos y dispositivos para la liberación prolongada de principios activos proteicos, es decir, toxina botulínica, a un sujeto hospedador tras una sola administración.
Sumario de la invención
La invención se define mediante las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que esté fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines informativos.
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los dispositivos, compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del organismo humano (o animal) mediante terapia.
Se han desarrollado métodos para formular micropartículas de polímero para el suministro de potentes principios activos proteicos o peptídicos, es decir, toxinas botulínicas. La proteína que se suministrará normalmente tendrá una actividad terapéutica, profiláctica o diagnóstica, requiriéndose solo pequeñas cantidades de proteína. Los métodos mantienen la actividad biológica de los principios activos proteicos y facilitan la liberación controlada de las proteínas para mejorar la eficacia in vivo. El método también mejora la farmacocinética mediante la combinación acertada de excipientes estabilizantes que faciliten la dispersión uniforme del principio activo en la micropartícula, mejorando así significativamente el control y la duración de la liberación.
El agente proteico activo utilizado en la presente invención para el suministro mediante micropartículas de polímero es la toxina botulínica, que es una toxina muy potente y que es notoriamente difícil de encapsular para su liberación con la farmacocinética deseada. Las toxinas botulínicas que se pueden formular en micropartículas incluyen la toxina botulínica de tipo A, B, C, D, E, F, G y mezclas de estas. Las toxinas botulínicas preferidas son las toxinas botulínicas de tipo A y B. Cuando se requieren cantidades nanométricas de principios activos, tales como toxinas botulínicas, para aplicaciones clínicas, los principios activos se mezclan con un agente voluminizador inerte antes de la encapsulación. Un ejemplo de agente voluminizador proteico es la SeroAlbúmina Humana (SAH). Sorprendentemente, la toxina botulínica, que está presente en pequeña cantidad, se mezcla con la SAH, conserva su actividad y se dispersa uniformemente en las micropartículas, si se procesa como se describe a continuación y en los ejemplos.
Los métodos de formulación micropartículas de polímero para la liberación controlada de toxina botulínica comprenden las etapas de:
(a) disolver la toxina botulínica y una proteína voluminizadora en una solución acuosa para formar una solución de toxina botulínica-proteína;
(b) hacer precipitar la toxina botulínica-proteína de la solución con un agente precipitante seleccionado del grupo que consiste en éster metílico de L-histidina, éster etílico de L-cisteína, Na-(terc-butoxicarbonil)-L-asparagina, éster bencílico de L-prolina, A/-acetil-L-triptófano, ácido gentísico, ácido pentético, ácido octanoico, cloruro de cinc y combinaciones de los mismos, para formar un precipitante;
(c) lavar el precipitante una o más veces con un disolvente de lavado para formar un precipitante lavado con disolvente; (d) mezclar o dispersar el precipitante en una solución de un polímero para formar una dispersión de polímero-toxina botulínica-proteína; y
(e) preparar micropartículas de polímero que encapsulan la toxina botulínica-proteína a partir de la dispersión de polímero-toxina botulínica-proteína.
Se encontró que lavar la proteína precipitada con disolvente resultó ser fundamental para obtener la encapsulación uniforme y la liberación controlada deseadas, en especial para la toxina botulínica. Algunos ejemplos de disolventes de lavado incluyen acetona, acetonitrilo, dioxano, etanol, acetato de 2-metoxietilo, metoxietanol, etoxietanol, butoxietanol, 2-propanol, éter metílico de propilenglicol, etanodiol, 1,2-propanodiol, alcohol ferc-butílico, dietilenglicol y combinaciones de los mismos. Algunos ejemplos de disolventes de emulsión incluyen alcohol bencílico, acetato de n-butilo, cloroformo, dioxano, diclorometano, acetato de etilo, formiato de etilo, formiato de metilo, fenetilamina, triacetina y combinaciones. Un disolvente de emulsión preferido es una combinación de dioxano y diclorometano.
Algunos ejemplos de polímeros biocompatibles incluyen polihidroxiácidos tales como poli(láctidos), poli(glicólidos) y poli(láctico-co-glicólidos), policaprolactona, poliesteramidas, polianhídridos, poli(aminoácidos), poliortoésteres, policianoacrilatos, poli(p-dioxanona), poli(oxalatos de alquileno), poliuretanos biodegradables, mezclas y copolímeros de los mismos. Un polímero biodegradable preferido es poli(láctido-co-glicólido), también conocido como poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA). En algunas realizaciones, los pesos moleculares y las proporciones de láctido:glicólido (L:G) de los polímeros se seleccionan para influir en propiedades físicas de las micropartículas, tales como la cinética de liberación y la duración de la liberación de los principios activos atrapados.
También se proporcionan micropartículas formuladas de acuerdo con los métodos. Las partículas tienen al menos un micrómetro de diámetro y están formadas por uno o más polímeros biodegradables que tienen atrapada en el polímero una toxina botulínica. En una realización preferida, las micropartículas incluyen toxina botulínica, SAH y PLGA. Normalmente, la cantidad de la toxina botulínica asociada con las micropartículas es de entre aproximadamente 1 unidad y aproximadamente 5000 unidades de toxina botulínica, por ejemplo, la cantidad de la toxina botulínica asociada con las micropartículas es de entre aproximadamente 10 unidades y aproximadamente 3000 unidades de toxina botulínica A, entre aproximadamente 10 unidades y aproximadamente 3000 unidades de toxina botulínica B, o ambas. La cantidad de portador, tal como SAH, suele ser de órdenes de magnitud superiores a los de la toxina botulínica. Por ejemplo, se diluyen 100 unidades de toxina botulínica con entre 0,5 y 1,0 mg de SAH.
En algunas formas, las formulaciones de polímeros biodegradables suministran fármacos en una cantidad inicial para producir un efecto deseado y, posteriormente, siguen liberando el fármaco durante un período de tiempo deseado para mantener el efecto durante el tiempo deseado. Normalmente, las partículas tienen un tamaño en el intervalo de los micrómetros o submicrómetros.
Las enfermedades, los trastornos o los defectos cosméticos se tratan mediante la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad eficaz de las micropartículas para reducir o prevenir uno o más síntomas de la enfermedad, del trastorno o del defecto cosmético en el sujeto. Las formulaciones de micropartículas se administran preferentemente por inyección. Normalmente, las micropartículas de polímero potencian la actividad biológica de las proteínas atrapadas en mayor medida que las formulaciones de solución acuosa que contienen una cantidad equivalente del fármaco.
Se pueden utilizar micropartículas que eluyan la toxina botulínica para el tratamiento de la rigidez muscular/los espasmos musculares o de trastornos del movimiento (tales como distonía cervical, tortícolis), para el tratamiento de la sudoración incontrolable, para mejorar el aspecto cosmético de las arrugas y para prevenir dolores de cabeza en las personas con migrañas muy frecuentes.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico lineal que muestra las cantidades relativas de albúmina liberada de las micropartículas (% del total) en función del tiempo (días) para cada una de las 78 formulaciones diferentes de micropartículas, que incluyen PLGA con diferentes pesos moleculares, diferentes proporciones de láctido:glicólido (L:G) y diferentes grupos terminales, respectivamente.
La Figura 2 es un gráfico lineal que muestra las respuestas del ensayo de puntuación de la abducción digital (DAS, Digit Abduction Score) (0-4) a lo largo del tiempo (días) después de la inyección de toxina botulínica suministrada en solución acuosa (Control; (-)) y en micropartículas de PLGA que contienen 0,3 (A , ■), 0,6 (x, •), 1,5 (□), 3 (A) y 6 (o) unidades/inyección, respectivamente. El PLGA utilizado fue L:G = 75:25, 107.000 Da y 15% (p/v) disuelto en diclorometano (DCM).
La Figura 3 es un gráfico lineal que muestra las respuestas del ensayo de puntuación de la abducción digital (DAS, Digit Abduction Score) (0-4) a lo largo del tiempo (días) después de la inyección de toxina botulínica suministrada en solución acuosa (Control; (-)) y en micropartículas de PLGA que contienen 0,5 (0), 0,6 (□), 0,75 (A) y 1 (o) unidad/inyección, respectivamente. El PLGA utilizado fue L:G = 75:25, 107.000 Da y 15% (p/v) disuelto en diclorometano (DCM). El PLGA utilizado para 0,75 y 0,50 unidades fue L:G=60:40 y 120.000 Da, y el PLGA para 1 y 0. 6 unidades fue L:G = 85:15 y 150.000 Da.
La Figura 4 es un gráfico lineal que muestra las respuestas del ensayo de puntuación de abducción digital (DAS) (0­ 4) a lo largo del tiempo (días) después de la inyección de toxina botulínica/albúmina precipitadas con Zn suministrada en solución acuosa (Control; (A/o)) y en micropartículas de PLGA dispersas en un termogel (AK097 de Akina PolySciTech) que contiene 4 unidades/inyección (□). AK097 es un copolímero de tres bloques de PLGA y poli(etilenglicol) (PEG), Copolímero de tres bloques de PLGA-PEG-PLGA con el peso molecular medio en peso (PMp) de 6.300 Da. Las micropartículas de PLGA estaban hechas de 3 capas exteriores de PLGA a 50:50, 44.000 Da, 7 % (p/v) relleno de toxina/albúmina (5 %) en PLGA a 85:15, 24.000 Da, 5 % (p/v) y con recubrimiento de PLGA a 85:15, 24.000 Da, 20 % p/v).
La Figura 5 es un gráfico lineal que muestra las respuestas del ensayo de puntuación de abducción digital (DAS) (0­ 4) a lo largo del tiempo (días) después de la inyección de toxina botulínica/albúmina precipitadas con Zn suministrada en una solución acuosa que tiene 1 unidad y 0,5 unidades, respectivamente (Control; (A/o)), y toxina/albúmina precipitada con Zn en Termogel A que contiene 2 (•) y 3 (□) unidades/inyección, y Termogel B que contiene 2 (A ) y 3 (■) unidades/inyección, respectivamente. Los Termogeles A y B son copolímeros de tres bloques de PLGA-PEG-PLGA AK 019 y AK091 que tienen el mismo PMp de 6400 Da, pero temperaturas de termogelificación de 27,5 °C y 30.0 °C, respectivamente.
Descripción detallada de la invención
1. Definiciones
La expresión "cantidad eficaz" o "cantidad adecuada" es la concentración mínima requerida para lograr una mejora o prevención medible de cualquier síntoma o de una afección o un trastorno en particular, para efectuar una mejora medible de la esperanza de vida o para mejorar en general la calidad de vida del paciente. La cantidad eficaz depende de la molécula biológicamente activa específica y de la afección o del trastorno específico que se vaya a tratar. Las cantidades eficaces de muchas proteínas, tales como la toxina botulínica o los anticuerpos monoclonales, son conocidas en la técnica.
La "mediana de la dosis eficaz" es la dosis que produce un efecto cuántico (todo o nada) en el 50 % de la población que la toma (mediana referida al 50 % de la población base). A veces también se abrevia como DE50, que significa "dosis eficaz, para el 50 % de las personas que reciben el fármaco". La DE50 comúnmente se utiliza como una medida de la expectativa razonable del efecto de un fármaco, pero no representa necesariamente la dosis que un facultativo podría utilizar. Esta depende de la eficacia y de la toxicidad. La toxicidad y letalidad de un fármaco se puede cuantificar mediante la DT50 y la DL50, respectivamente. De manera ideal, la dosis eficaz sería sustancialmente menor que la dosis tóxica o letal para que un fármaco sea terapéuticamente adecuado.
El término "termogel", y las expresiones "polímero termosensible" y "polímero termorreactivo" se utilizan indistintamente y se refieren a polímeros que permanecen disueltos en solución acuosa a temperaturas más bajas, tales como la temperatura ambiente o de la nevera, pero que precipitan a un estado de gel a temperaturas más altas, por ejemplo, 30 °C o la temperatura corporal. Los termogeles normalmente son copolímeros de bloques que consisten en bloques hidrófilos e hidrófobos, tales como poli(etilenglicol) (PEG) y PLGA, respectivamente. El equilibrio entre los dos bloques determina la temperatura de gelificación, es decir, la temperatura a la que una solución acuosa se convierte en gel.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" o "tratar" significa administrar una composición a un sujeto o un sistema con una enfermedad, un trastorno o un defecto cosmético para reducir la gravedad o la aparición de uno o más síntomas, de la enfermedad o del trastorno. "Prevención" o "prevenir" significa administrar una composición a un sujeto o un sistema en riesgo de padecer una enfermedad, un trastorno o un defecto cosmético, tales como arrugas.
Como se utiliza en el presente documento, "micropartículas" se refiere a partículas que tienen un diámetro de entre un micrómetro y 400 micrómetros, normalmente menos de 200 micrómetros, más normalmente menos de 150 micrómetros, lo más preferentemente, para los usos descritos en el presente documento, en el intervalo de menos de 100 micrómetros de diámetro. Las micropartículas incluyen microcápsulas, microportadores, microvehículos, microestructuras y microesferas a menos que se especifique lo contrario.
El término "biocompatible" se refiere a uno o más materiales que no son tóxicos para el hospedador (por ejemplo, un animal o un ser humano), ni se degradan para liberar componentes tóxicos en el hospedador.
La expresión "portador farmacéuticamente aceptable" incluye, medios de dispersión, agentes tampón del pH, agentes voluminizadores inertes y otros materiales tales como los enumerados por la FDA de EE. UU. como considerados seguros en general (es decir, "GRAS" [Generally Regarded as Safe]).
II. Micropartículas
Normalmente, las micropartículas incluyen (1) uno o más polímeros biodegradables; y (2) uno o más principios activos lábiles. Las micropartículas se formulan opcionalmente con uno o más principios activos adicionales y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
A. Polímeros
Las micropartículas de polímero se formulan preferentemente a partir de polímeros biocompatibles no tóxicos y no inmunológicos. Los ejemplos de polímeros biodegradables incluyen poli(láctido-co-glicólido) (PLGA), poli(ácido láctico) o poliláctido (PLA), y poli(£-caprolactona) (PCL), poli(ácido glicólico) o poliglicólido (PGA), poli(ácido D-láctico) o poli(D-láctido) (PDLA), poli(ácido L-láctico) o poli(L-láctido) (PLLA), polianhídridos, poli(orto-ésteres), colágeno y derivados celulósicos, y ácido hialurónico.
En algunas formas, los polímeros biodegradables se seleccionan para formar mezclas de dos o más polímeros diferentes. Por ejemplo, en algunas formas, los polímeros biodegradables se seleccionan para presentar propiedades funcionales específicas cuando se combinan. Por ejemplo, en algunas realizaciones se combinan dos o más polímeros biodegradables para formar micropartículas termosensibles o termorreactivas.
Las micropartículas se pueden fabricar utilizando una variedad de polímeros, tanto sintéticos (por ejemplo, PLGA) como naturales (por ejemplo, ácido hialurónico). Se seleccionan parámetros estructurales de polímeros, tales como el peso molecular, la proporción de láctido:glicólido (L:G) y la concentración relativa para proporcionar funciones deseadas, tales como la temperatura de transición de solución-gel, la cinética de degradación (por ejemplo, el tiempo hasta la degradación in vivo), la eficacia de carga de proteínas y la biorreactividad (por ejemplo, la toxicidad y reactividad inmunológica in vivo).
Se pueden fabricar micropartículas de PLGA biodegradables para controlar la degradación y la liberación durante períodos de tiempo que varían de días, semanas o meses in vivo después de la administración subcutánea o intramuscular. Por ejemplo, la liberación de proteínas desde micropartículas (es decir, el suministro in vivo), medida, por ejemplo, por la liberación de albúmina, es una función de la proporción de L:G. En otras realizaciones, la liberación de proteínas de las micropartículas se rige por más de un factor. En algunas realizaciones, la liberación de proteínas de las micropartículas formuladas de acuerdo con el método de la emulsión se rige tanto por la composición del disolvente como por la proporción de L:G y el peso molecular del polímero utilizado.
En algunas realizaciones, la liberación de proteínas se produce de manera continua. En otras realizaciones, la liberación de proteínas se produce de forma bifásica o multifásica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la gran liberación inmediata inicial disminuye a medida que aumenta el contenido de láctido del PLGA. En realizaciones adicionales, la velocidad de liberación global depende del disolvente utilizado para fabricar las micropartículas.
Se puede seleccionar la masa molecular de los polímeros utilizados para fabricar micropartículas para proporcionar micropartículas que tengan las características poliméricas deseadas. Las micropartículas de polímero se formulan preferentemente a partir de polímeros que tienen un peso molecular medio en peso (PMp) de entre aproximadamente 1000 Dalton (Da) y 1.000.000 Da, ambos inclusive.
Un ejemplo de propiedad física de un polímero que puede variar según el peso molecular es la sensibilidad a la temperatura. Por ejemplo, un polímero puede existir en forma de sólido o líquido, o puede pasar de un estado sólido a un estado líquido en función de una temperatura dada determinada por el peso molecular y la composición del polímero. Los polímeros y las composiciones de polímeros que tienen un punto de transición de solución-gel asociado con un intervalo de temperaturas determinado se denominan termogeles. En algunas realizaciones, los polímeros utilizados para formular sistemas de suministro de liberación prolongada se seleccionan en función de la temperatura de gelificación de los polímeros. Por ejemplo, la temperatura de transición de solución-gel de los polímeros termosensibles depende del uno o más polímeros utilizados para formular el termogel. En algunas realizaciones, se combinan dos o más polímeros que tienen diferentes temperaturas de gelificación para formar termogeles que tienen una temperatura de transición de solución-gel deseada. Los ejemplos de temperaturas de gelificación son superiores a 0 °C y normalmente superiores a 4 °C, tal como de 10 °C, o superiores a 10 °C hasta 40 °C, o superiores a 40 °C. En una realización preferida, las micropartículas están formuladas para tener una temperatura de gelificación por debajo de la temperatura corporal típica de un ser humano sano, tal como por debajo de 37 °C.
Los ejemplos de polímeros para usar como termogeles incluyen copolímeros de bloques de PLGA-PEG-PLGA, por ejemplo, los presentados en la Tabla 1, a continuación.
Tabla 1: Ejemplos de termogeles
Polímeros termogeles (a base de PLGA) Proporción de L:G (p/p) Peso molecular (Da) Tsol-qel ( C) PLGA-PEG-PLGA (AK012) 50:50 1000-1000-1000 > 12,5 PLGA-PEG-PLGA (AK019) 50:50 1500-1500-1500 > 27,5 PLGA-PEG-PLGA (AK024) 75:25 1100-1000-1100 > 15,0 PLGA-PEG-PLGA (AK085) 50:50 1400-1500-1400 > 32,5 PLLGA-PEG-PLLGA (AK087) 75:25 1100-1000-1100 > 17,5 PLGA-PEG-PLGA (AK091) 86:14 1500-1500-1500 > 30,0
PLGA-PEG-PLGA (AK097) 94:06 1700-1500-1000 > 27,5 PDLL-PEG-PDLL (AK100) 100:0 1700-1500-1700 > 30,0 PDLL-PEG-PDLL (AK046) 100:0 1000-1000-1000 > 17,5 Polímeros termogeles (a base de Proporción de CL:L Peso molecular
caprolactona) (p/p) (Da) Tsol-gel ( C) PLCL-PEG-PLCL (AK108) 75:25 1600-1500-1600 > 30,0 PLCL-PEG-PLCL (AK109) 60:40 1700-1500-1700 > 30,0 mPEG-PCL (AK036) 100:0 750-2500 > 15,0 PCL-PEG-PCL (AK035) 100:0 1000-1000-1000 > 12,5 Tsol-gel: Temperatura de transición de sol-gel; PDLL: poli(DL-láctido); P(LCL): Poli(láctido-co-caprolactona); mPEG: metoxi-PEG; PCL:
policaprolactona; PLLGA-PEG-PLLGA: L-láctido quiral en PLGA-PEG-PLGA y, si no, es racémico DL; CL:L: caprolactona:láctido. Los polímeros de la serie AK son de Akina PolySciTech.
Los polímeros para usar como termogeles están disponibles en el mercado en Akina PolySciTech (West Lafayette, IN). La disolución del polímero termogel desecado en agua suele tardar un día, pero puede ocurrir más rápido si se añade una pequeña cantidad de disolvente hidromiscible biocompatible. De manera destacable, se puede añadir poli(etilenglicol) de bajo peso molecular al polímero desecado para mejorar la posterior velocidad de solubilización en agua. Por ejemplo, la adición de PEG de 400 Da, en una proporción de 25:75, a poli(láctido-co-caprolactona)-bpoli(etilenglicol)-b-poli(láctido-co-caprolactona) (AK109 de Akina PolySciTech) puede disminuir el tiempo de disolución acuosa de más de un día a 2 horas para generar una solución termogelificante.
B. Agentes terapéuticos, profilácticos y de diagnóstico
Los agentes terapéuticos, profilácticos y de diagnóstico pueden encapsularse en partículas. Estos pueden ser proteínas o péptidos, ácidos nucleicos, lípidos, azúcares o polisacáridos, moléculas pequeñas (peso molecular normalmente inferior a 1000 Da) o combinaciones de los mismos. Es particularmente adecuado para agentes lábiles, en especial, aquellos que son inestables hidrolíticamente.
El principio activo utilizado en la presente invención es la toxina botulínica.
En determinadas realizaciones, solo se incorpora un principio activo en las micropartículas de elución de fármaco. En algunas realizaciones, se incorporan dos o más principios activos proteicos dentro de las mismas micropartículas de elución de fármaco. En otras realizaciones, se incorporan uno o más principios activos proteicos y uno o más principios activos no proteicos dentro de las mismas micropartículas de elución de fármaco.
Generalmente, los métodos para fabricar micropartículas biocompatibles no imponen ninguna limitación sobre la estructura del agente proteico encapsulado que las micropartículas van a suministrar. Por ejemplo, las proteínas formuladas dentro de micropartículas pueden tener una masa de entre 3000 Da y 1 millón de Da, o más, y pueden ser de cualquier secuencia de aminoácidos.
Un agente biológicamente activo es una sustancia que, por ejemplo, se utiliza para el tratamiento, la prevención, el diagnóstico, la cura o la mitigación de una enfermedad o un trastorno, que afecta a la estructura o función del organismo, de la región o del sitio en el que se encuentra, o se vuelve biológicamente activo o más activo tras la exposición a un entorno fisiológico predeterminado (tal como un profármaco). Los agentes pueden ser sustancias biológica, fisiológica o farmacológicamente activas que actúan local o sistémicamente en el organismo humano o animal.
La proporción del principio activo con respecto al polímero (unidad o mg de principio activo por mg de polímero) se puede controlar para regular la dosis total, la eficacia y la velocidad de liberación del principio activo. Las proporciones adecuadas del polímero con respecto al principio activo incluyen, pero sin limitación: 1000:1, 100:1, 10:1, 1:1, ambos inclusive (unidad de principio activo por mg de polímero). La proporción preferida es de aproximadamente 100 unidades de toxina botulínica: 1 mg de micropartículas.
El fármaco proteico que se incorpora a las micropartículas descritas es la toxina botulínica.
1. Toxina botulínica
El fármaco proteico para usar con las micropartículas de elución de fármaco descritas es la neurotoxina botulínica, por ejemplo, como la producida por la bacteria anaerobia grampositiva Clostridium botulinum y especies relacionadas.
La toxina botulínica tiene una masa molar de aproximadamente 150.000 g/mol (solo para la toxina de cadenas ligeras y pesadas) y es una potente neurotoxina, que provoca una enfermedad neuroparalítica en seres humanos y animales conocida como botulismo. El peso molecular de la forma compleja de la toxina botulínica es de entre aproximadamente 600.000 y 900.000 g/mol.
Los efectos del botulismo normalmente aparecen de 18 a 36 horas después de ingerir los alimentos infectados con un cultivo o esporas de C. botulinum. Aparentemente, la toxina botulínica puede pasar atenuada a través del revestimiento del intestino y atacar las neuronas motoras periféricas. Los síntomas de intoxicación por toxina botulínica pueden incluir náuseas, dificultad para caminar y tragar, y pueden progresar a la parálisis de los músculos respiratorios, insuficiencia cardiaca y muerte.
Los neurotransmisores se empaquetan en vesículas sinápticas dentro del citoplasma de las neuronas y luego se transportan a la membrana plasmática interna, donde las vesículas se acoplan y fusionan con la membrana plasmática. Los estudios de células nerviosas que emplean neurotoxinas clostridiales como sondas de la fusión con la membrana han revelado que la fusión de vesículas sinápticas con la membrana celular en las células nerviosas depende de la presencia de proteínas específicas que están asociadas con la vesícula o la membrana diana. Estas proteínas se han denominado SNARE (Soluble NSF Attachment protein REceptor, receptores de proteínas de fijación soluble de NSF). Una proteína denominada, como alternativa, sinaptobrevina o VAMP (Vesicle-Associated Membrane Protein, proteína de membrana asociada a vesículas) es un SNARE asociado a vesículas (v-SNARE, vesicle-associated SNARE). Hay al menos dos isoformas de sinaptobrevina; estas dos isoformas se expresan de manera diferencial en el sistema nervioso central de los mamíferos y se asocian selectivamente con vesículas sinápticas en las neuronas y los orgánulos secretores de las células neuroendocrinas. Los SNARE asociados a la membrana diana (t-SNARE, target membrane-associated SNARE) incluyen la sintaxina y la SNAP-25 (Synaptosome-Associated Protein of 25 kDa, proteína asociada al sinaptosoma de 25 kDa). Después del acoplamiento, la proteína VAMP forma un complejo nuclear con la sintaxina y la SNAP-25; la formación del complejo nuclear parece ser una etapa esencial para la fusión en la membrana (Neimann, et al., Trends in Cell Biol. 4:179-185 (1994)).
Se han descrito diferentes formulaciones de PLGA que contienen toxina botulínica, pero no se ha demostrado la eficacia de la toxina botulínica encapsulada en las micropartículas de PLGA (Donovan, "Botulinum toxin implant", patente de EE.UU. n.° 6312708 (2001); Donovan, "Biodegradable botulinum toxin implant", patente de EE.UU. n.° 6.506.399 (2003); Donovan y Brady, "Neurotoxin implant", patente de EE.UU. n.° 6.306.423 (2001); Donovan y Brady, "Biodegradable neurotoxin implant", patente de EE.UU. n.° 6.383.509 (2002); Donovan y Brady, "Controlled release neurotoxin system", patente de EE.UU. n.° 6.585.993 (2003); Hughes y Olejnik, "Stabilized biodegradable neurotoxin implants", patente de EE.UU. n.° 7.691.381 (2010); Hughes y Olejnik, "Stabilized biodegradable neurotoxin implants", patente de EE. UU. n.° 8.501.187 (2013)).
La forma disponible en el mercado de toxina botulínica para usar en aplicaciones médicas y cosméticas se comercializa como BOTOX®, DYSPORT®, XEOMIN®, que son toxina botulínica purificada, criodesecada, con albúmina y otros excipientes. La toxina botulínica de tipo A se elabora a partir de un cultivo de la cepa Hall de Clostridium botulinum. El complejo de toxina botulínica de tipo A se purifica mediante una serie de precipitaciones en ácido, obteniéndose un complejo cristalino que se vuelve a disolver en una solución que contiene solución salina y albúmina antes del desecado al vacío. El producto desecado al vacío se almacena en un congelador a o por debajo de -4 °C. El BOTOX®, DYSPORT®, XEOMIN® y otros productos se pueden reconstituir con una solución acuosa estéril y sin conservantes antes de la inyección intramuscular. Cada vial de BOTOX® contiene aproximadamente 100 unidades (U) de complejo de neurotoxina purificada de toxina de Clostridium botulinum de tipo A, 0,5 miligramos de seroalbúmina humana y 0,9 miligramos de cloruro de sodio en forma desecada al vacío, estéril, sin conservantes.
Para reconstituir el BOTOX® desecado al vacío, se utiliza solución salina normal estéril sin conservantes (inyección de cloruro de sodio al 0,9 %) extrayendo la cantidad adecuada de diluyente en la jeringa del tamaño adecuado. Dado que el BOTOX® se desnaturaliza por burbujeo o por una agitación violenta similar, el diluyente se inyecta suavemente en el vial. Por motivos de esterilidad, el BOTOX® se administra preferentemente en las cuatro horas posteriores a la retirada del vial del congelador y de su reconstitución. Durante estas cuatro horas, el BOTOX® reconstituido se puede almacenar en una nevera a de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 8 °C. El BOTOX® reconstituido y refrigerado conserva su potencia durante al menos dos semanas. Neurology, 48:249-53:1997.
Las esporas de Clostridium botulinum se encuentran en el suelo, y se pueden desarrollar en recipientes de alimentos que no hayan sido esterilizados y sellados de forma adecuada de fábricas de conservas caseras, siendo la causa de muchos de los casos de botulismo.
La toxina botulínica está disponible de múltiples fuentes comerciales. Complejo de tipo A de Clostridium botulinum disponible en List Biological Laboratories, Inc. (Campbell, CA). La toxina es soluble, y 100 pg se disuelven fácilmente en 1 ml de tampón acuoso adecuado. Las soluciones de toxina botulínica se pueden convertir en alícuotas y congelarse.
2. Otros principios activos proteicos
Las micropartículas pueden suministrar además hormonas, anticuerpos, factores de crecimiento, citocinas, inmunomoduladores, integrinas y toxinas. En Leader, et al., (Nature Reviews Drug Discovery (7) págs. 21-39 (2008) y las referencias del mismo), se proporciona una lista completa de principios activos proteicos.
Los ejemplos de fármacos proteicos incluyen la somatropina (NUTROPIN DEPOT®). Los ejemplos de fármacos peptídicos incluyen leuprolida (LUPRON DEPOT® y e LiGARD®), goserelina (Zo La DEX® d Ep OT), octreotida (SANDOSTATIN LAR® DEPOT), triptorelina (TRELSTAR DEPOT®), buserelina, lanreotida (SOMATULINE® DEPOT), exenatida (BYDUREON®) y pasireotida (SIGNIFOR® LAR).
Otros fármacos proteicos incluyen, pero sin limitación, insulina y análogos de insulina, hormona del crecimiento somatotropina, mecasermina, p-gluco-cerebrosidasa, alglucosidasa-a, adenosina desaminasa, eritropoyetina, interferones, L-asparaginasa y ranibizumab (por ejemplo, LUCENTIS®).
Una lista no limitativa de agentes terapéuticos proteicos antineoplásicos incluye Bevacizumab (por ejemplo, AVASTIN®), Cetuximab (por ejemplo, e Rb ITUX®), Panitumumab (por ejemplo, Ve CTIBIX®), Alemtuzumab (por ejemplo, CAMPATH®), Rituximab (por ejemplo, RITUXAN®) y Trastuzumab (por ejemplo, HERCEPTIN®).
Una lista no limitativa de agentes terapéuticos proteicos inmunorreguladores incluye abatacept (ORENCIA®), anakinra (ANTRIL®, KINERET®), adalimumab (HUMIRA®), etanercept (ENBREL®), infliximab (REMICADE®), alefacept (AMEVIVE®), efalizumab (RAPTIVA®), natalizumab (TYSAb Ri®), eculizumab (SOLIRIS®), globulina antitimocítica (conejo) (THYMOGLOBULIN®), basiliximab (SIMULECT®), daclizumab (ZENAPAX®) y muromonab-CD3 (ORTHOCLONE®, OKT3®).
3. Agentes de diagnóstico y auxiliares
Las micropartículas pueden suministrar además agentes proteicos de diagnóstico y/o auxiliares que tengan una amplia selección de actividades, incluido el diagnóstico in vivo de enfermedades y trastornos, agentes de formación de imagen, hormonas que influyen en o controlan las funciones biológicas, proteínas útiles para métodos analíticos o de diagnóstico ex vivo, y proteínas útiles como chaperonas para estabilizar otros principios activos, catalizar o generar la conversión de otros principios activos de un estado inactivo a un estado activo o viceversa, agentes tampón y agentes de carga.
Las micropartículas pueden suministrar principios activos no proteicos, junto con uno o más principios activos proteicos. Los principios activos no proteicos que se pueden suministrar a través de las micropartículas de polímero incluyen, pero sin limitación, moléculas pequeñas, hidratos de carbono, polisacáridos, nucleótidos, oligonucleótidos y lípidos. Los ejemplos de principios activos de molécula pequeña incluyen compuestos orgánicos y organometálicos. Los ejemplos de biomacromoléculas incluyen ácidos nucleicos. Los principios activos pueden ser hidrófilos, hidrófobos o anfifílicos.
Los ejemplos de agentes bioactivos pueden incluir, pero sin limitación, agentes antiinflamatorios, agentes inmunomoduladores, moléculas que promueven la migración celular, moléculas que promueven o retardan la división celular, moléculas que promueven o retardan la proliferación y diferenciación celular, moléculas que estimulan la modificación fenotípica de las células, moléculas que promueven o retardan la angiogénesis, moléculas que promueven o retardan la vascularización, moléculas que promueven o retardan la disposición de la matriz extracelular, ligandos de señalización, anestésicos, antibióticos, esteroides y agentes quimioterapéuticos.
Los ejemplos de agentes de diagnóstico no proteicos incluyen moléculas paramagnéticas, compuestos fluorescentes, moléculas magnéticas, radionúclidos, agentes de formación de imágenes de rayos X y agentes de contraste de IRM.
MI. Métodos de fabricación de micropartículas de elución de fármaco
Se han establecido métodos para fabricar micropartículas biocompatibles que potencien la eficacia de los fármacos proteicos encapsulados, incluyendo la toxina botulínica, tras la carga en polímeros biodegradables. Los métodos incluyen combinar una solución no acuosa de polímeros biodegradables con uno o más principios activos proteicos mezclados con un agente voluminizador tal como albúmina y lavados en disolventes no acuosos, a continuación, producir micropartículas mediante métodos de microfabricación o de emulsión. Normalmente, los métodos producen micropartículas biocompatibles que contienen agentes proteicos encapsulados, tales como toxina botulínica. Los métodos se pueden utilizar para la producción a gran escala de sistemas de suministro de liberación controlada de toxina botulínica in vivo. Las micropartículas que contienen proteínas terapéuticas, profilácticas y de diagnóstico pueden administrarse utilizando las técnicas habituales.
Los métodos incluyen la formulación de micropartículas cargadas de proteína utilizando una emulsión de agua (W ") y/o uno o más disolventes o aceites no acuosos ("O"). En un ejemplo de realización, los métodos incluyen la adición de una emulsión de W/O u O/O a una gran cantidad de agua para formar una emulsión doble de W/O/W u O/O/W. Los métodos de uso de precipitados proteicos superan la pérdida de actividad de los principios activos proteicos asociados con la desnaturalización de las proteínas disueltas en agua que se produce en la fase de contacto entre el agua y un disolvente orgánico.
Los métodos incluyen las etapas de (a) precipitación de principios activos mezclados con un agente voluminizador para producir un precipitante proteico; (b) lavado de los precipitantes proteicos para producir un precipitante lavado con disolvente; c) como alternativa, reducción del tamaño de los precipitantes lavados con disolvente mediante molienda en húmedo o reducción del tamaño de los precipitantes criodesecados mediante molienda en seco o criomolienda, (d) dispersión del precipitante en un polímero; y (e) fabricación de las micropartículas mediante métodos de microfabricación o emulsión. Cada una de las etapas del método se describe con mayor detalle, a continuación.
A. Precipitación de agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico ("principios activos")
Las proteínas para formularse dentro de polímeros biocompatibles se proporcionan en forma de polvos secos y se disuelven en una solución acuosa, y, a continuación, se hacen precipitar. Se pueden añadir agentes estabilizantes adicionales a la solución acuosa para mejorar la estabilidad del precipitado proteico.
1. Suministro de proteína deshidratada
Normalmente, los principios activos proteicos para usar en los métodos se proporcionan en forma deshidratada, por ejemplo, en forma de un polvo desecado. La deshidratación se puede llevar a cabo utilizando métodos conocidos, tales como la liofilización, el desecado por pulverización y la criodesecación por pulverización. Normalmente, los métodos para la liofilización de proteínas se llevan a cabo en tres etapas, que incluyen (1) la congelación (que implica congelar el producto y crear una matriz sólida apta para el desecado); (2) el desecado principal (que implica la eliminación del hielo mediante sublimación mediante la reducción de la presión del entorno del producto mientras se mantiene la temperatura del producto a un nivel diana bajo); y (3) el desecado secundario (que incluye la eliminación del agua unida hasta que el contenido de humedad residual alcance el nivel deseado). En Chang y Patro ("Freezedrying Process Development for Protein Pharmaceuticals", en Lyophilization of Biopharmaceuticals, American Association of Pharmaceutical Scientists, págs. 113-138 (2004)), se proporciona una guía completa de los procesos de desecado de proteínas.
En un ejemplo de método, la deshidratación elimina el 90-100 % del agua de la proteína. Normalmente, el proceso de deshidratación se lleva a cabo de manera que no reduzca ni altere la actividad biológica de la proteína. Cuando se utilizan dos o más proteínas, las proteínas se pueden combinar antes, o después, de la deshidratación.
Los materiales voluminizadores/portadores adecuados incluyen diferentes proteínas tales como albúmina, gelatina o transferrina, y polímeros tales como polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa. La proteína voluminizadora/portadora más común aplicada para la toxina botulínica es la albúmina.
a. Preparación de toxina botulínica
En un ejemplo de realización, el principio activo proteico es el complejo de neurotoxina botulínica de tipo A (es decir, toxina botulínica) de Clostridium botulinum (C. botulinum), que tiene una potencia y una toxicidad extremadamente altas en los seres humanos.
b. Preparación de agentes voluminizadores
Cuando se requiere un principio activo en cantidades sumamente pequeñas, por ejemplo, un principio activo que tenga una actividad y/o una toxicidad extremadamente alta/s, tal como la toxina botulínica, se pueden incluir uno o más excipientes adicionales, tales como polipéptidos o proteínas, como agente voluminizador o portador. En la presente invención, se incluye una proteína voluminizadora. Dado que los fármacos proteicos suelen ser muy potentes, normalmente se requieren cantidades muy pequeñas para lograr el efecto deseado. En ausencia de un excipiente o agente voluminizador, puede resultar poco práctico desarrollar y producir sistemas de suministro adecuados. Por lo tanto, en algunas formas, cuando se requieren cantidades a escala nanométrica de principios activos, tales como toxinas botulínicas, para aplicaciones clínicas, los principios activos se diluyen, por ejemplo, mezclándolos con agentes voluminizadores inertes.
Un ejemplo de proteína voluminizadora para usar con la toxina botulínica es la seroalbúmina humana ("SAH") o la albúmina. En un ejemplo de realización, se diluye una solución madre de la toxina (100 |jg) en un tampón acuoso adecuado, tal como el tampón Tris, para producir una solución de trabajo, por ejemplo, una alícuota de 100 j l que contenga 10 jg de toxina (o aproximadamente 10.000 unidades murinas). Esta solución se mezcla con la proteína voluminizadora (por ejemplo, SAH) para preparar una solución de 50 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5.
2. Selección de un precipitante
En algunas realizaciones, los métodos incluyen la etapa de seleccionar reactivos y condiciones adecuados para hacer precipitar uno o más principios activos proteicos.
Por ejemplo, cuando el principio activo es toxina botulínica y el agente voluminizador es albúmina (toxina/albúmina), se pueden probar diferentes agentes para determinar su capacidad para hacer precipitar toxina/albúmina en una solución acuosa.
En un ejemplo de método, los precipitados se identifican marcando la proteína, por ejemplo, utilizando isotiocianato de fluoresceína (marcaje con FITC). Normalmente, cuando se utiliza agente voluminizador, el agente voluminizador se marca para facilitar la interpretación. Por ejemplo, cuando el principio activo es toxina botulínica y el agente voluminizador es albúmina (toxina/albúmina), la mayor parte de la proteína de la mezcla de toxina/albúmina es albúmina, y los agentes se criban para detectar la capacidad de precipitación de la albúmina.
Los precipitantes utilizados en la presente invención se seleccionan entre éster metílico de L-histidina, éster etílico de L-cisteína, Na-(terc-butoxicarbonil)-L-asparagina, éster bencílico de L-prolina, A/-acetil-L-triptófano, ácido gentísico, ácido pentético, ácido octanoico, cloruro de cinc o combinaciones de los mismos.
En algunos aspectos, los precipitantes se seleccionan por su capacidad para precipitar más de un agente utilizando más de una sola serie de cribado. Por ejemplo, cuando se utiliza agente voluminizador, se realiza una primera serie de cribado para identificar uno o más agentes adecuados para hacer precipitar el agente voluminizador, seguida de una segunda o más series de cribado para determinar si estos mismos agentes son adecuados para hacer precipitar el agente voluminizador junto con uno o más principios activos u otros excipientes. Por ejemplo, cuando el principio activo es toxina botulínica y el agente voluminizador es albúmina (toxina/albúmina), los agentes identificados que tienen la capacidad de hacer precipitar la albúmina se criban posteriormente en cuanto a la capacidad de hacer precipitar la mezcla de toxina/albúmina.
Los factores que determinan la selección de un precipitante adecuado incluyen la capacidad de producir precipitantes que tengan propiedades adecuadas para los procesos posteriores, tales como el tamaño y la densidad deseables, así como de mantener la bioactividad del principio activo.
Cuando el principio activo es toxina botulínica y el agente voluminizador es albúmina (toxina/albúmina), un precipitante preferido es el cloruro de cinc. En un ejemplo de método, la concentración final de cloruro de cinc utilizada es de aproximadamente el 1 % en peso por volumen (p/v).
Después de la adición del precipitante seleccionado, se retira el sobrenadante, por ejemplo, por centrifugación, para recoger la proteína precipitada.
3. Ensayo enzimático de toxina botulínica para determinar la actividad biológica
Las etapas implicadas en la incorporación de proteínas a micropartículas de polímero suelen desnaturalizan las proteínas y producir la pérdida de bioactividad (Schellman, Biopolymers, 17, págs. 1305-1322 (1978); van de Weert, et al., Pharm. Res., 17, págs. 1159-1167 (2000)). Por lo tanto, los métodos pueden incluir opcionalmente pruebas para determinar si la precipitación afecta a la actividad biológica de un principio activo.
En un ejemplo de realización, cuando la proteína es toxina botulínica y albúmina (toxina/albúmina), una prueba biológica preferida es la medición de la actividad de la toxina mediante el ensayo de endopeptidasa SNAP-25 de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer). La toxina botulínica es una endopeptidasa dependiente del cinc que escinde las proteínas necesarias para la liberación de neurotransmisores. Uno de los sustratos para la actividad de la toxina endopeptidasa es la proteína asociada al sinaptosoma de 25 kDa (SNAP-25). Por lo tanto, en un ejemplo de realización, se utiliza el kit de ensayo de endopeptidasa SNAP-25 de FRET (Biosentinel's Botest) para medir la capacidad de la toxina para escindir proteolíticamente los sustratos naturales de SNAP-25. El ensayo de endopeptidasa/SNAP-25 mide la acción de la toxina sobre su molécula diana, SNAP-25, y se trata de un posible método de prueba de reemplazo in vitro. El ensayo de FRET permite la detección de la actividad de la toxina sin utilizar el estudio de parálisis en ratones, permitiendo probar muchas formulaciones de toxinas.
En un ejemplo de método, se prepara la toxina/albúmina precipitada con Zn y se divide en partes alícuotas. Algunas muestras se almacenan en una nevera como control y otras muestras se lavan con disolventes orgánicos para el lavado con disolvente. A todas las muestras se les añaden 500 pl de EDTA 100 mM mientras se agita para disolver el precipitado de toxina/albúmina. La toxina/albúmina disuelta se transfiere a un dispositivo de filtro centrífugo (por ejemplo, Millipore, PM de corte de 10.000 Da), se centrifuga el dispositivo de filtro y se añade agua pura para eliminar el EDTA y el cloruro de cinc.
Después de eliminar el filtrado, se intercambia la toxina/albúmina en tampón Tris 50 mM pH 7,5, se recupera en un microtubo limpio y se prueba la actividad enzimática utilizando el ensayo de FRET (kit BoTest de BioSentinel, Inc.).
B. Lavado con disolvente de proteínas
El proceso de lavado con disolvente incluye la etapa de lavar las proteínas precipitadas usando un disolvente seleccionado. Normalmente, las etapas de lavado con disolvente potencian la carga y la distribución homogénea de los principios activos proteicos en las micropartículas de polímero.
Después de la precipitación y la eliminación del sobrenadante de la proteína precipitada, se elimina el agua restante, por ejemplo, mezclando con un disolvente hidromiscible. Normalmente, se añaden uno o más disolventes hidromiscibles a la proteína precipitada en una proporción en volumen adecuada para eliminar el agua residual del precipitado. Se pueden añadir disolventes hidromiscibles a la proteína precipitada en una proporción en volumen de al menos 1:1, por ejemplo, 5:1, 10:1 o superior a 10:1. La mezcla de soluciones disolventes se lleva a cabo mediante vórtice o agitación.
1. Selección de disolventes de lavado
Los disolventes adecuados que se pueden utilizar para eliminar el agua incluyen aquellos que mantienen la actividad biológica de los principios activos proteicos. Por lo tanto, los métodos pueden incluir la etapa de cribar disolventes hidromiscibles para eliminar el agua de las proteínas precipitadas. Los ejemplos de disolventes incluyen acetona, acetonitrilo, dioxano, etanol, acetato de 2-metoxietilo, metoxietanol, etoxietanol, butoxietanol, 2-propanol, éter metílico de propilenglicol, etanodiol, 1,2-propanodiol, alcohol terc-butílico, dietilenglicol, metanol, W-metilpirrolidona, dimetilacetamida, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, piridina, tetrahidrofuranocetonitrilo, etc. Preferentemente, los disolventes hidromiscibles tienen baja viscosidad, para facilitar el aislamiento del precipitado lavado con disolvente por centrifugación o diafiltración.
2. Recuperación de proteínas lavadas con disolvente
Los precipitados proteicos lavados con disolvente se pueden recoger utilizando cualquier medio adecuado, tal como por centrifugación. Posteriormente, el precipitado proteico lavado con disolvente se mezcla con polímero (por ejemplo, solución de PLGA en dioxano, diclorometano, acetato de n-butilo u otro disolvente) para fabricar micropartículas. Este proceso de lavado con disolvente permite la preparación de micropartículas de PLGA mediante métodos de emulsión o microfabricación, manteniendo la bioactividad de la toxina. En algunas realizaciones, la proteína en polvo lavada con disolvente se criodeseca.
En un ejemplo de realización, el precipitado de toxina botulínica/albúmina lavado con disolvente se recoge mediante centrifugación a una fuerza centrífuga relativa (fcr) de 4500-5000 durante un minuto o más, dependiendo del volumen de la muestra. Se prefiere un recipiente centrífugo de fondo plano.
C. Reducción del tamaño de proteína en polvo
Los métodos pueden incluir la etapa de trituración de la proteína en polvo criodesecada para crear partículas que tengan un tamaño más pequeño que el que se produce directamente con el proceso de desecado. Normalmente, la proteína en polvo criodesecada se muele en partículas de tamaños micrométricos y submicrométricos.
Los ejemplos de métodos para triturar el polvo incluyen la trituración manual, por ejemplo, usando un mortero, o la trituración utilizando medios automatizados, por ejemplo, usando bolas de trituración implementadas dentro de un molino de bolas planetario (Changsha Deco Equipment Co., China) o CryoMill (Retsch). En un ejemplo de realización, las bolas de trituración para usar en un proceso de molienda automatizado son de óxido de circonio, acero inoxidable, ágata, wolframio, alúmina o plásticos variables tales como teflón (politetrafluoroetileno; PTFE). Normalmente, las proteínas en polvo se someten a reducción de tamaño mediante molienda en ausencia (molienda en seco) o presencia (molienda en húmedo) de un disolvente. La molienda en seco se puede realizar en presencia de un agente de control de la temperatura como se describe en la siguiente sección.
1. Molienda en seco
Las proteínas en polvo para usar en los métodos descritos se muelen durante un tiempo adecuado para producir un polvo que tenga partículas del tamaño de polvo promedio deseado, utilizando métodos convencionales de molienda "en seco". La molienda en seco se puede llevar a cabo utilizando métodos manuales o automatizados. Un ejemplo de tamaño de polvo producido mediante molienda manual es de aproximadamente 10 pm. Un ejemplo de tamaño de polvo producido mediante procesos automatizados, tales como molienda en molino de bolas planetario, es de aproximadamente 1 micrómetro o menor. Los tiempos de trituración se pueden seleccionar de acuerdo con la cantidad de material de partida y el tamaño de partícula deseado, por ejemplo, de unos cuantos minutos a varias horas.
La trituración de proteínas en polvo puede producir un aumento en la temperatura del polvo, lo que puede dar lugar a cambios en el estado de la proteína y posiblemente conducir a una reducción de la actividad biológica. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la trituración se lleva a cabo en un ambiente de temperatura controlada, por ejemplo, a 4 °C. En algunas realizaciones, el propio aparato de trituración implementa el control de la temperatura de la proteína en polvo durante todo el proceso de trituración. En una realización particular, se coloca un refrigerante tal como hielo, hielo seco o nitrógeno líquido cerca del recipiente de trituración para contrarrestar cualquier aumento de calor asociado con la trituración. Por ejemplo, cuando se utiliza un equipo de trituración automatizado, se puede utilizar una cámara para contener el hielo, hielo seco o nitrógeno líquido alrededor del recipiente de molienda a fin de mantener baja la temperatura durante la molienda con el molino de bolas planetario. Como alternativa, también se utilizó la criomolienda usando CryoMill (Retsch) para producir proteínas en polvo de tamaño submicrométrico.
Preferentemente, la trituración de proteínas en polvo mantiene la actividad biológica de la proteína.
2. Molienda en húmedo
En algunas realizaciones, las proteínas en polvo se muelen durante un tiempo adecuado para producir un polvo que tenga partículas del tamaño de polvo promedio deseado en presencia de un disolvente (es decir, "molienda en húmedo"; "trituración en húmedo"). La molienda en húmedo puede evitar aumentos de temperatura que pueden conducir a una reducción de la eficacia de la proteína, por ejemplo, cuando se tritura en estado seco (es decir, en ausencia de una solución o un agente refrigerante). Por lo tanto, los métodos de molienda en húmedo representan un medio alternativo para disipar el calor generado por la trituración y evitar la desactivación inducida por el calor de proteínas, tales como toxina botulínica.
Los disolventes útiles para la molienda en húmedo de proteínas en polvo se pueden seleccionar en función de las características de la proteína en polvo. Los disolventes de ejemplo incluyen, pero sin limitación, los disolventes orgánicos acetona, acetonitrilo, acetato de n-butilo, dioxano, diclorometano y acetato de etilo. En la Tabla 7, se pueden ver otros disolventes orgánicos adecuados.
En un ejemplo de método de molienda en húmedo, se mezclan bolas de trituración de diferentes tamaños de diámetro (por ejemplo, 10 mm, 5 mm y 1 mm, respectivamente) y la proteína en polvo con un disolvente orgánico en un recipiente resistente a los disolventes de un tamaño apropiado, por ejemplo, un recipiente de teflón de 30 ml. El recipiente se monta en una máquina de molienda y se hace rotar a una velocidad adecuada (por ejemplo, 300­ 900 revoluciones por minuto; rpm) durante un período de tiempo adecuado (por ejemplo, 1-6 horas). Las partículas preparadas mediante trituración manual, molienda en molino de bolas planetario, criomolienda y lavado con disolvente son adecuados para preparar micropartículas y formulaciones de gel.
En una realización particular, la proteína en polvo de toxina botulínica/albúmina se tritura hasta un tamaño de partícula inferior a 1 micrómetro mientras se suspende en un disolvente orgánico utilizando una combinación de trituración manual y/o molienda en molino de bolas planetario.
D. Fabricación de micropartículas
Los métodos incluyen la etapa de fabricar las micropartículas. Preferentemente, los métodos de fabricación de micropartículas utilizando proteína en polvo lavada con disolvente evitan la desnaturalización o desactivación de la proteína que se produce tras la exposición de la proteína disuelta en agua a la fase de contacto de aire-aguadisolvente.
Se han desarrollado varias técnicas de microfabricación para fabricar micropartículas para aplicaciones de suministro de fármacos, incluida la litografía de microimpresión, el micromoldeo asistido por disolvente, la impresión por contacto de microfluidos, la impresión en caliente de microcontacto, la litografía de impresión paso a paso e instantánea, la replicación de partículas en matrices no humectantes y los métodos de matrices de hidrogel.
La selección de técnicas de microfabricación apropiadas para fabricar micropartículas adecuadas para el suministro de fármacos debe considerar factores que incluyen si es posible eliminar las impurezas sin perder el fármaco cargado, la reproducibilidad de fabricación y el control de la cinética de liberación de fármacos.
Las micropartículas se pueden formular para que contengan diferentes proporciones en masa de los polímeros con respecto a las proteínas. Normalmente, las micropartículas incluyen una mayor masa de polímeros que de proteínas. Por ejemplo, las micropartículas se pueden formular para incluir una proporción en masa del polímero con respecto a la proteína de entre 1:1 y 99:1, por ejemplo, de 2:1, 4:1, 9:1, 19:1 y 49:1. En una determinada realización, las micropartículas tienen una proporción en masa de polímero modificado con respecto a proteína de 9:1.
La concentración final de agentes terapéuticos, profilácticos y de diagnóstico encapsulados dentro de las micropartículas se puede determinar mediante cálculos teóricos de balance de masas.
Cuando el agente encapsulado incluye toxina botulínica, las micropartículas pueden, por ejemplo, tener una proporción en masa del polímero con respecto a la toxina botulínica que varía entre 1.000.000:1 y 10:1, ambas inclusive. Un método preferido para la fabricación de micropartículas de polímero es mediante emulsión.
1. Fabricación de micropartículas mediante el método de emulsión
Los métodos incluyen la fabricación de micropartículas por emulsión usando partículas de proteína obtenidas mediante el lavado con disolvente de proteína precipitada, incluyendo, opcionalmente, la molienda de bolas en seco en una cámara de hielo seco, la criomolienda y/o la molienda de bolas en húmedo, opcionalmente, en una cámara de hielo seco. Para la formulación de partículas por emulsión, se añaden partículas de proteína a una solución de polímero que incluye uno o más disolventes. La emulsión normalmente se lleva a cabo utilizando una emulsión de sólido/aceite/agua (S/O/W).
En un ejemplo de método, las proteínas toxina botulínica y albúmina precipitadas con Zn se añaden a una solución del/de los polímero/s deseado/s que se convertirá en micropartículas. Las partículas de proteína precipitadas con Zn se dispersan en el polímero (por ejemplo, PLGA) disuelto en un disolvente seleccionado (por ejemplo, diclorometano, o una mezcla de diclorometano:dioxano 1:1) para formar una dispersión de sólido/aceite (S/O). A continuación, se añade la dispersión de S/O a una solución acuosa que contiene alcohol polivinílico (PVA) e iones de cinc para evitar que la proteína precipitada se disuelva en el agua.
Normalmente, las proteínas formuladas en micropartículas de polímero mediante los métodos de emulsión se cargan en micropartículas con una eficacia muy alta. Por ejemplo, el tamaño y la estructura del polímero pueden influir en la eficacia de la carga entre del 80 %-100 %.
a. Selección de disolventes para el método de emulsión
Los disolventes utilizados en la fabricación de micropartículas por emulsión se pueden seleccionar en función de las propiedades físicas deseadas, incluyendo la temperatura de ebullición (p.e.) y la solubilidad en agua. Normalmente, la elección del disolvente utilizado para los métodos de emulsión afectará a la velocidad de liberación de los fármacos proteicos encapsulados dentro de las micropartículas. Una etapa clave en la producción de micropartículas con propiedades de liberación controlada es el momento fundamental en el que el/los disolvente/s orgánico/s en el/los que se disuelve el polímero abandonan la micropartícula en formación y el polímero se solidifica. En esta superficie de contacto, se producen muchas interacciones diferentes simultáneamente. Una es una interacción de disolventepolímero que define hasta qué punto el polímero prefiere interactuar con el disolvente. Otra es la interacción de disolvente-fármaco, que, en este caso, es mínima, ya que el precipitado está en gran parte sin disolver en el disolvente polimérico. Un tercio de ellas es el mecanismo de eliminación del disolvente. En un baño de emulsión, el disolvente abandona la micropartícula en formación y se disuelve en el agua. Adicionalmente, el disolvente volátil se evapora de la emulsión a medida que se forman y endurecen las micropartículas. Se aplican procesos similares al enfoque de microfabricación en matrices de hidrogel. En estas situaciones, la velocidad a la que el disolvente abandona la matriz de polímero es importante. Si el disolvente la abandona demasiado rápido, las cadenas poliméricas endurecidas no tendrán tiempo suficiente para reorientarse conjuntamente y desarrollar una piel uniforme a lo largo de la superficie de las micropartículas. En ausencia de esta piel, la liberación por difusión puede ser muy rápida, ya que el agua entrará rápidamente en la micropartícula a través de los poros grandes y disolverá el agente terapéutico cargado. Dado que este proceso de eliminación de disolvente es impulsado por la evaporación y disolución del disolvente en el baño de emulsión, el punto de ebullición del disolvente y su miscibilidad con el agua son factores clave que se deben considerar. Este efecto se destaca en los siguientes ejemplos que detallan experimentos que utilizan diversos disolventes tales como diclorometano y dioxano. Incluso manteniendo el fármaco y el polímero constantes, los factores clave del disolvente y otros parámetros que afectan a su eliminación de las micropartículas afectan drásticamente a las propiedades de liberación de la carga de fármaco.
Los ejemplos de disolventes útiles para los métodos de emulsión incluyen, pero sin limitación, alcohol bencílico (BA), acetato de n-butilo (nBA), cloroformo (ChF), diclorometano (DCM), acetato de etilo (EA), formiato de etilo (EF), formiato de metilo (MF), fenetilamina (PhA), triacetina (TAc) y dioxano (Dx). En la siguiente Tabla 2, se proporciona una lista de ejemplos de disolventes y el punto de ebullición (p.e.) y la hidrosolubilidad asociados de cada uno.
T l 2. Di lv n il r l m m l i n.
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En algunas realizaciones, se utiliza una mezcla de más de un disolvente. Un ejemplo de mezcla de disolventes para usar en la formulación de emulsión de proteínas toxina botulínica/albúmina precipitadas con Zn incluye combinaciones de DCM/Dx, BA/EA, BA/MF, ChF/TAc. Las partículas de proteína se dispersan en polímero disuelto en un disolvente adecuado para formar una dispersión de "S/O", que luego se añade a una solución de PVA que contiene Zn para evitar que la proteína precipitada se disuelva en el agua.
b. Procedimientos de emulsión
Las micropartículas se producen a partir de precipitantes de proteína lavados con disolvente dispersos en un disolvente deseado. Preferentemente, los métodos de emulsión para fabricar micropartículas de proteína/polímero no incluyen etapas ni reactivos que desnaturalicen, degraden o alteren irreversiblemente la estructura de la proteína. Por lo tanto, los métodos para la fabricación de micropartículas por emulsión mantienen la actividad biológica de las proteínas encapsuladas.
En un ejemplo de método de preparación de micropartículas de PLGA de toxina botulínica/albúmina, se disuelve PLGA (750 mg) en un volumen adecuado de un disolvente orgánico deseado (por ejemplo, 5 ml de DCM o DCM/Dx en una proporción de 1:1). Se prepara una solución acuosa al 1 % de PVA (31.000 Da) disolviéndola en agua destilada. Se añade una solución de cloruro de cinc (3 mg/ml) a una concentración de aproximadamente el 1 % (p/v) para formar una solución de PVA-Zn.
El precipitado de toxina/albúmina lavado con disolvente (50 mg) se dispersa en la solución de PLGA mediante agitación con vórtice durante 10-20 segundos, para fabricar una dispersión de sólido en aceite (S/O). La solución de PVA-Zn se homogeneíza, y se añade la dispersión de PLGA-toxina botulínica/albúmina (S/O) a la solución de PVA-Zn.
La adición de la dispersión de S/O en el PVA-Zn se lleva a cabo utilizando un caudal estable, constante, por ejemplo, 0,25 ml/s. La mezcla se emulsiona durante un período de tiempo adecuado, por ejemplo, 1-30 minutos dependiendo de la velocidad de homogeneización. A continuación, se añaden 150 ml adicionales de solución de PVA-Zn a la solución de emulsión homogeneizadora y se emulsiona de manera continua durante 5-30 minutos, preferentemente 15 minutos. A continuación, se vierte la solución rápidamente en 1,6 l de solución de PVA-Zn y se mezcla (por ejemplo, con agitación magnética a una velocidad de 600 revoluciones/minuto; rpm). La mezcla de la solución se lleva a cabo durante un período de tiempo adecuado, tal como 60-100 minutos, preferentemente 75 minutos), en un ambiente de temperatura controlada para evitar aumentos de temperatura no deseados (por ejemplo, mezclando en una estufa de incubación a 10 °C).
Las micropartículas endurecidas se recogen utilizando cualquier medio adecuado, por ejemplo, utilizando mallas de 75 |jm y 20 jm , y se lavan con un exceso de disolvente acuoso (por ejemplo, 3-4 l de agua destilada).
Las micropartículas se recogen (por ejemplo, mediante centrifugación a 5000 rpm; 4500 fcr) y se pueden utilizar inmediatamente o almacenarse en un tampón adecuado, o desecarse (por ejemplo, mediante criodesecación durante la noche) para su almacenamiento o uso posterior.
Las micropartículas de toxina botulínica/albúmina formuladas de acuerdo con los métodos de emulsión contienen toxina que tiene esencialmente la misma actividad biológica que antes de formularse en micropartículas. En una realización particular, la confirmación de la actividad biológica de la toxina lavada con disolvente utilizada para fabricar micropartículas de PLGA de acuerdo con el método de emulsión se determina mediante el kit de ensayo de FRET de acuerdo con el procedimiento operativo convencional de los proveedores. Por ejemplo, las micropartículas se suspenden en 5 ml de PBS-Tween (0,05 %) (pH 7,5) que contiene azida sódica al 0,1 % a 37 °C en una estufa de incubación con agitación a 50 rpm. En puntos de tiempo predeterminados, se centrifuga cada tubo de ensayo y se extrae el sobrenadante para un ensayo de liberación de albúmina, por ejemplo, con el kit de ensayo de proteínas microBCA, y para el análisis ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, enzimoinmunoanálisis de adsorción) de toxina botulínica con el kit de ensayo Tetracore BTX, y para el ensayo de actividad enzimática de la toxina con el kit de ensayo de FRET de acuerdo con el procedimiento operativo convencional de los proveedores. El ensayo de FRET puede detectar la actividad enzimática de la toxina a una concentración de toxina de 1-100 ng/ml. El ensayo de FRET proporciona una forma fácil y rápida de medir la actividad enzimática de la toxina sin necesidad de largos análisis in vivo, tales como los experimentos de parálisis en ratones.
2. Otros métodos para formular micropartículas
a. Método de matriz de polímero
Se han preparado micropartículas que tienen un tamaño homogéneo predeterminado utilizando un método de microfabricación de matrices de polímero (Acharya, et al., J. Control. Release, 141, págs. 314-319 (2010); Park, et al., "Sol-gel phase-reversible hydrogel templates and uses thereof", patente de EE. UU. n.° 8.951.567 (2015)). En algunas realizaciones, las micropartículas de elución de fármaco que potencian la eficacia de los fármacos proteicos encapsulados tales como la toxina botulínica, se preparan mediante microfabricación de matrices de polímero, también conocida como el "método de matriz de PVA", "método de matriz de hidrogel" o "método de molde de polímero hidrosoluble" (Acharya, et al., J. Control. Release, 141, págs. 314-319 (2010); Park, et al., "Sol-gel phase-reversible hydrogel templates and uses thereof', patente de EE.u U. n.° 8.951.567 (2015); Lu, et al., Int. J. Pharm., 461, págs.
258-269 (2014); He y Park, Mol. Pharm., 13, págs. 2164-2171 (2016)).
Se prepara una matriz de oblea de silicio con pilares o cavidades con un diámetro predeterminado que se puede controlar a cualquier valor específico (por ejemplo, de 1,5 pm a 100 pm o mayor). Los ejemplos de micropartículas de 50 pm tienen un tamaño adecuado para una fácil inyección con agujas comunes para aplicaciones in vivo. Encima de la matriz de oblea de silicio, se añade una solución de un polímero hidrosoluble que puede formar un gel o que puede desecarse para formar una membrana. Por ejemplo, se utiliza gelatina para formar un hidrogel bajando la temperatura; se utiliza PVA para preparar una matriz de polímero más dura y resistente, y fácil de manejar. La matriz de gelatina o de PVA se despega de la matriz maestra y luego se coloca sobre una superficie plana para dejar al descubierto las cavidades. A continuación, se llenan las cavidades con una mezcla de fármaco y PLGa disuelta en un disolvente orgánico (por ejemplo, diclorometano, acetato de etilo o alcohol bencílico). Se pueden utilizar diversos PLGA con diferentes pesos moleculares y diferentes proporciones de L:G. La principal ventaja del método de la matriz de polímero/hidrogel es el tamaño uniforme de las micropartículas y la fácil extracción de las micropartículas formadas en la matriz. Las micropartículas se liberan de la matriz simplemente disolviendo las matrices en un disolvente adecuado, tal como agua.
Las micropartículas liberadas pueden lavarse y extraerse mediante centrifugación o filtración a través de mallas finas.
i. Preparación de proteínas/polímeros
Normalmente, las soluciones de polímeros se preparan disolviendo polímeros biodegradables en disolventes orgánicos. Los polímeros en polvo seco para usar en las micropartículas se pesan a una concentración predeterminada (p/v), se disuelven en un disolvente orgánico adecuado y, a continuación, se añade la solución directamente al precipitado proteico en polvo. El polvo se mezcla y se homogeneíza en la solución de polímero, por ejemplo, mediante agitación con vórtice. En un ejemplo de método, se disuelven PLGA, PDLA, PLLA o PCL en un disolvente orgánico para llevar la solución a aproximadamente el 80 % del volumen final. A continuación, se añade la proteína en polvo y se mezcla en la solución, y se añade más disolvente orgánico para llevar la solución hasta el volumen final.
ii. Preparación de matrices
La microfabricación de matrices de polímero incluye la etapa de preparación de las matrices. Normalmente, las matrices (por ejemplo, los moldes de polímero) se preparan utilizando un polímero hidrosoluble, tal como PVA, que se utiliza para fabricar moldes de polímero que tienen micropocillos de un tamaño y una forma predeterminados. Los ejemplos de micropocillos en moldes de pVa tienen un diámetro de entre aproximadamente 500 pm y 1,0 pm, ambos inclusive, por ejemplo, un tamaño que varía de 100 pm a 2 pm, ambos inclusive, tal como 50 pm, 20 pm o 1,5 pm, con una profundidad de hasta 500 pm, por ejemplo, 50 pm.
En un ejemplo de método, la microfabricación de micropartículas se lleva a cabo utilizando una matriz de PVA preparada en un molde de PDMS. Las etapas del método para la preparación de la matriz de PVA incluyen:
1. Preparación de una solución al 4,0 % de PVA;
2. Aplicación de la solución de PVA en un contramolde de PDMS;
3. Desecado de la solución de PVA dentro del contramolde de PDMS; y
4. Retirada de la matriz de PVA del contramolde de PDMS.
Se pueden formular matrices para producir micropartículas que tengan una selección de tamaños y formas predeterminados. Los ejemplos de formas de micropartículas incluyen formas y patrones, tales como esferas, cubos, estrellas, cilindros, etc.
Mi. Fabricación de copas de partículas
Tras la preparación de una matriz adecuada, se prepara la cubierta exterior polimérica de la "copa" de la micropartícula. Las micropartículas formuladas de acuerdo con los métodos pueden proporcionar funcionalidades dobles o múltiples dentro de una sola formulación. Por ejemplo, múltiples perfiles de liberación (gran liberación inmediata de partículas externas y liberación prolongada de componentes internos), variabilidad de la cinética de liberación prolongada, así como una mayor eficacia de las proteínas encapsuladas en relación con los sistemas de suministro convencionales.
Formulaciones de copa de una sola capa
Para la preparación del vehículo polimérico o "copa", los polímeros se vierten en el molde y se endurecen. Normalmente, una vez preparado el molde de PVA, se fija a una placa de vidrio y se disponen 300 pl de solución de mezcla de polímero y proteína sobre los micropocillos, utilizando un aplicador adecuado (por ejemplo, una cuchilla de afeitar). A continuación, se desecan las micropartículas dentro del molde, por ejemplo, mediante la exposición durante la noche a la temperatura ambiente.
Formulaciones de copa multicapa (cebolla)
Los métodos de fabricación de partículas pueden incluir la formación de una "copa" polimérica que tenga más de una sola capa de polímero (es decir, una "copa de tipo cebolla"). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la fabricación de partículas incluye repeticiones por etapas del proceso utilizado para preparar un molde de polímero de una sola capa, usando las mismas o diferentes soluciones poliméricas. En un ejemplo de métodos, se seleccionan diferentes polímeros de PLGA con diferentes proporciones de L:G, pesos moleculares y/o grupos terminales para fabricar micropartículas basadas en la conformación multicapa (cebolla). Para fabricar una copa de una sola capa, se vierte una cantidad adecuada (por ejemplo, 100-200 pl) de solución de polímero en un molde de PVA fijado para llenar los micropocillos de diámetro predeterminado (por ejemplo, usando una cuchilla de afeitar, mientras se inclina). Posteriormente, para añadir una capa de polímero adicional a la "copa" existente ("copa de tipo cebolla"); "copa multicapa"), se rellena con una o más soluciones de polímero adicionales repetidamente de la misma manera tras el desecado de la capa anterior. A continuación, se desecan las copas multicapa dentro del molde de PVA, por ejemplo, mediante la exposición durante la noche a la temperatura ambiente.
iv. Llenado de las copas de partículas
Tras la formulación de la copas de una sola capa o de las copas de tipo cebolla, se rellenan los espacios internos de fármaco proteico en polvo o cristales, mezclados con una solución de polímero adecuada. En un ejemplo de método, las concentraciones relativas de precipitado de fármaco proteico y polímero en disolvente orgánico varían entre el 5­ 10 % (p/v) y el 5-20 % (p/v), respectivamente. El disolvente se selecciona considerando la solubilidad del polímero utilizado para la fabricación de las copas de polímero de una o varias capas. Solo se pueden utilizar aquellos disolventes que sean compatibles con la capa de la copa previamente formada (es decir, aquellos que no disuelven el polímero de una capa de la copa previamente formada).
Una cantidad adecuada de solución de polímero que incluye proteína en polvo es normalmente de entre 100 y 200 pl por matriz. Los disolventes incompatibles que disuelven el polímero utilizado en la fabricación de la copa comprometerán la superficie interna de la capa de la copa, pudiendo producir poros o grietas que pueden dar lugar a una gran liberación inmediata inicial y a una baja carga de fármaco.
En un ejemplo de realización, las copas de polímero se llenan de polvo de albúmina y toxina botulínica precipitadas con Zn, mezclado con 100 y 200 pl de solución de polímero. Una vez llenado el núcleo de la "copa" de polímero, se forma la capa de cubierta superior usando un polímero "en blanco" (por ejemplo, PLGA). Para las capas de cubierta superiores, se utiliza el mismo polímero que el del núcleo varias veces o, como alternativa, se utilizan diferentes polímeros. Tras la formación de la capa superior, se desecan los moldes de PVA a entre 20-70 °C, por ejemplo, colocándolos dentro de un horno de incubación estacionario durante aproximadamente 3 a 12 horas.
Las micropartículas desecadas se recogen disolviendo el molde de PVA en 10 ml de agua doblemente destilada durante aproximadamente 30 minutos. A continuación, las micropartículas se lavan y se recogen mediante filtración sucesiva a través de una malla de 106 pm y a través de una malla de 38 pm, respectivamente, usando agua destilada como disolvente. Tras eliminar el PVA residual, las micropartículas suspendidas en agua se centrifugan a 5000 rpm (4500 de fuerza centrífuga relativa; fcr) durante 1~3 minutos, se elimina el sobrenadante y las micropartículas se desecan completamente al vacío (por ejemplo, durante la noche a temperatura ambiente).
En una realización particular, las etapas necesarias para fabricar micropartículas de acuerdo con el método de matriz de polímero se implementan dentro de una máquina automatizada, tal como la máquina SpinSwiper (documento US 2016/0128941 A1 2016). La máquina SpinSwiper incluye una cruceta que soporta una "cuchilla" que alimenta la solución a una matriz rotatoria de micropocillos presentes en una matriz de PVA.
E. Agente en hidrogeles y polímeros de termogel biodegradables
Los métodos pueden incluir mezclar las micropartículas cargadas con proteínas o las proteínas precipitadas con Zn en un gel de polímeros hidrosolubles formadores de gel. El gel rodea las micropartículas o las proteínas precipitadas con Zn y proporciona una capa adicional que controla aún más la cinética de liberación de las micropartículas.
Preferentemente, las micropartículas o proteínas precipitadas con Zn se mezclan con un polímero que es un termogel. Los termogeles existen en forma de solución y comienzan la gelificación cuando la temperatura supera la temperatura de transición de sol-gel. Por lo tanto, los polímeros disueltos en una solución acuosa a temperatura ambiente pueden convertirse en un gel al aumentarse la temperatura, por ejemplo, hasta la temperatura corporal. Como alternativa, las micropartículas o precipitados de toxina botulínica/albúmina se encapsulan dentro de partículas de hidrogel, por ejemplo, partículas de gel de ácido hialurónico reticulado. La presencia de un gel que rodea las micropartículas presenta una barrera de difusión que controla aún más la cinética de liberación del fármaco.
F. Portadores y excipientes
Las micropartículas de elución de fármaco se pueden formular con un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable para la administración en tejido o en una luz tisular. Los portadores adecuados incluyen, pero sin limitación, líquidos estériles, tal como agua, solución salina y solución salina tamponada con fosfato, y geles acuosos o hidrosolubles tales como polivinilpirrolidona, polietilenglicol (PEG), alginato y ácido hialurónico. Adicionalmente, el portador puede contener polímeros termosensibles. Las formulaciones también pueden contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes o agentes tampón del pH.
Generalmente, las micropartículas se suministran bien por separado o se mezclan conjuntamente en una forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en forma de un polvo liofilizado seco o concentrado exento de agua en un recipiente cerrado herméticamente, tal como una ampolla o bolsita que indica la cantidad de principio activo. Cuando la formulación deba administrarse por inyección o instilación, se puede dispensar con una jeringa, un bote u otro recipiente adecuado que contenga agua estéril de grado farmacéutico, solución salina u otro tampón.
Las micropartículas biocompatibles que incluyen fármacos proteicos pueden formularse en composiciones que incluyan un excipiente adecuado para administrar las micropartículas en el organismo de un sujeto. En determinadas realizaciones, las micropartículas, incluidos los fármacos proteicos, se formulan en un portador o excipiente adecuado para suministrarse a un sujeto mediante inyección, por ejemplo, por vía intramuscular, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o mediante escarificación cutánea. Los portadores típicos son solución salina, solución salina tamponada con fosfato, soluciones de glucosa y otros portadores inyectables.
Por lo tanto, se describen formulaciones que incluyen micropartículas biocompatibles que incluyen fármacos proteicos con o sin vehículos de suministro. Las micropartículas biocompatibles se pueden formular en composiciones farmacéuticas que incluyen uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Se pueden formular composiciones farmacéuticas para diferentes mecanismos de administración, según el fin deseado de las micropartículas biocompatibles y el uso previsto. Se describen composiciones farmacéuticas formuladas para la administración por vía parenteral (inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa), tópica o transdérmica (ya sea pasivamente, o usando iontoforesis o electroporación) o usando insertos bioerosionables.
Administración parenteral
En algunas realizaciones, las micropartículas biocompatibles se formulan para su administración en una solución acuosa, por inyección parenteral. La formulación también puede estar en forma de suspensión o emulsión. En general, se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen cantidades eficaces de un principio activo, diluyentes farmacéuticamente aceptables, conservantes, solubilizantes, emulsionantes y/o portadores. Dichas composiciones incluyen los diluyentes, por ejemplo, agua estéril o solución salina tamponada de diferente contenido de tampón (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato) y, opcionalmente, aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes, por ejemplo, Tween® 20, Tween® 80 también conocido como polisorbato 20 u 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio) y conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico) y sustancias voluminizadoras (por ejemplo, lactosa, manitol). Los ejemplos de disolventes o vehículos no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo.
Las formulaciones pueden liofilizarse y redisolverse/resuspenderse inmediatamente antes de su uso. La formulación se puede esterilizar mediante, por ejemplo, filtración a través de un filtro de retención de bacterias, la incorporación de agentes esterilizantes a las composiciones, la irradiación de las composiciones o el calentamiento de las composiciones.
IV. Métodos de uso
La incorporación de principios activos proteicos a micropartículas y/o termogeles formulados de acuerdo con los métodos descritos mantiene la actividad y aumenta la disponibilidad del fármaco tras la administración.
Los agentes proteicos encapsulados se pueden liberar de las micropartículas de manera continua o pulsátil, de acuerdo con el diseño de las partículas y la composición del/ los polímero/s utilizado/s para la fabricación. Tras la administración a un sujeto, tal como un sujeto humano, las micropartículas proporcionan un sistema de liberación controlada que representa un depósito in vivo para el principio activo. Por lo tanto, las micropartículas de polímero biocompatibles descritas permiten la administración de una gran cantidad de un principio activo de una sola vez. En algunas realizaciones, el suministro de un principio activo dentro de micropartículas de polímero biocompatible permite la administración segura de una dosis mayor del principio activo de lo que sería posible con el principio activo solo. Por ejemplo, cuando se carga la toxina botulínica en las micropartículas, las micropartículas proporcionan un sistema para el suministro de la toxina botulínica que representa un depósito in vivo de toxina botulínica. El depósito puede liberar cantidades terapéuticas de la toxina botulínica desde el polímero de una manera controlada que está influenciada por la composición del polímero.
La toxina botulínica puede liberarse del portador durante un período de tiempo de aproximadamente 1 día a más de 3 meses, por ejemplo, aproximadamente 6 meses.
La micropartícula normalmente comprende una sustancia que es esencialmente biodegradable, de modo que la cinética de liberación de un fármaco encapsulado desde las partículas de polímero puede verse influenciada por la velocidad de degradación in vivo.
A. Métodos de administración
Los métodos de suministro localizados tienen la ventaja de reducir los efectos adversos graves asociados con el suministro sistémico. Una ventaja de utilizar las micropartículas eluyentes de fármacos descritas, a diferencia de las formulaciones existentes para el suministro de fármacos proteicos, es que los fármacos proteicos en micropartículas producidos de acuerdo con los métodos descritos pueden ser más biodisponibles, suministrando así menores cantidades del principio activo con la misma o mayor eficacia.
Las formulaciones de micropartículas de elución de fármaco pueden administrarse localmente mediante inyección directamente en el tejido o instilarse en una luz tisular. Las luces tisulares representativas incluyen las de las vías respiratorias, y los tractos gastrointestinal y urogenital. Estas incluyen cavidades tales como la cavidad nasal, pulmonar, esofágica, rectal, vesical, vaginal, uretral y uterina.
En algunas realizaciones, las micropartículas de elución de fármaco se formulan en un gel que se aplica a un tejido diana durante la cirugía. En otra realización, las micropartículas de elución de fármaco se suspenden en un líquido y se inyectan en un tejido. En una realización adicional, las micropartículas de elución de fármaco se instilan en una luz durante un tiempo eficaz.
Las formulaciones que contienen micropartículas de elución de fármaco se pueden administrar en una ubicación deseada de la vejiga, otra cavidad corporal o en la piel mediante pulverización, laminación, pintura o aplicación con una esponja de un líquido, líquido viscoso o material de tipo gel utilizando una cistoscopia, endoscopio u otro dispositivo endoscópico adecuado. El uso de un dispositivo endoscópico permite la identificación de la zona de administración antes de administrar la formulación. El dispositivo endoscópico puede incluir un aplicador para la formulación que incluye, pero sin limitación, un dispositivo de pulverización, una gasa, un rodillo o una esponja que contiene la formulación. El aplicador se puede proteger usando una cubierta adecuada hasta que se vaya a administrar la formulación para que la formulación no se aplique accidentalmente en un zona no deseada. El aplicador se puede conectar al final del dispositivo endoscópico para permitir una administración de alta precisión. Las herramientas de pulverización de líquido para dispositivos endoscópicos son conocidas en la técnica, por ejemplo, dicha herramienta se describe en las patentes de EE.UU. n.°. 7.588.172 y 6.354.519 de Yamamoto y Kidooka.
Las formulaciones de micropartículas de elución de fármaco se pueden administrar con dicha regularidad para proporcionar un alivio eficaz de uno o más síntomas de una enfermedad o un trastorno, y efectos profilácticos, de diagnóstico o cosméticos. En algunas realizaciones, las formulaciones se suministran en una sola administración, por ejemplo, mediante una sola inyección. Normalmente, el número de administraciones de principio activo necesarias para lograr un efecto terapéutico o cosmético cuando se suministra dentro de micropartículas de elución de fármaco formuladas de acuerdo con los métodos descritos es menor que el número de administraciones del mismo principio activo o equivalente que se necesitan para lograr el mismo efecto en ausencia de las micropartículas.
B. Dosis
Las micropartículas pueden potenciar el suministro de principios activos proteicos tales como la toxina botulínica, dando lugar a la eficacia sostenida. Véanse los ejemplos. Por lo tanto, una ventaja de utilizar estas micropartículas liberadoras de fármaco para el suministro de principios activos proteicos es la capacidad de disminuir la frecuencia de administración del principio activo necesaria para lograr el efecto deseado, en comparación con la dosis necesaria cuando se administran formulaciones de fármacos sin encapsular.
En realizaciones preferidas, las micropartículas de elución de fármaco se administran en una cantidad eficaz para lograr el alivio de uno o más síntomas de una enfermedad o un trastorno, o para lograr un efecto cosmético deseado. Preferentemente, la frecuencia de administración del principio activo necesaria para lograr un efecto terapéutico o cosmético cuando se suministra dentro de micropartículas de elución de fármaco formuladas de acuerdo con los métodos descritos es menor que la del principio activo equivalente administrado en ausencia de las micropartículas.
Se pueden utilizar unidades de dosificación de diferentes tamaños de la formulación de micropartículas de elución de fármaco. Una unidad de dosificación que contiene un polvo seco de micropartículas de elución de fármaco deshidratadas que incluyen toxina botulínica y albúmina u otros principios activos proteicos puede reconstituirse en un recipiente con un portador farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, el portador farmacéuticamente aceptable es un portador acuoso. Las cantidades adecuadas de micropartículas de elución de fármaco incluyen, pero sin limitación, 0,1-1 mg, 1-10 mg, 10-100 mg, 100-300 mg, 300-600 mg y 600-1000 mg.
Una forma farmacéutica de micropartículas de polímero cargadas con toxina botulínica puede incluir una cantidad de entre aproximadamente 1 unidad y aproximadamente 50.000 unidades de la toxina botulínica. Preferentemente, la cantidad de toxina botulínica asociada con el polímero es de entre aproximadamente 10 unidades y aproximadamente 2000 unidades de una toxina botulínica de tipo A. Cuando la toxina botulínica es una toxina botulínica de tipo B, preferentemente, la cantidad de toxina botulínica asociada a las micropartículas es de entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 30.000 unidades de una toxina botulínica de tipo B.
Normalmente, la cantidad de toxina botulínica de tipo A administrada por las micropartículas durante un período continuo es de entre aproximadamente 0,01 unidades/kg de peso corporal del receptor y aproximadamente 25 unidades/kg de peso corporal del receptor, ambas inclusive, preferentemente de entre aproximadamente 0,1 unidades/kg de peso corporal del receptor y aproximadamente 15 unidades/kg de peso corporal del receptor, lo más preferentemente de entre aproximadamente 1 unidad/kg de peso corporal del receptor y aproximadamente 10 unidades/kg de peso corporal del receptor.
Normalmente, la cantidad de toxina botulínica de tipo B administrada por las micropartículas durante un período continuo es de entre aproximadamente 0,01 unidades/kg de peso corporal del receptor y aproximadamente 1000 unidades/kg de peso corporal del receptor, ambas inclusive. Por ejemplo, la toxina botulínica se puede administrar mediante inyección intramuscular (i.m.) o subdérmica (s.d.) de micropartículas de polímero que incluyen toxina botulínica en un músculo de un paciente en una cantidad de entre aproximadamente 1 unidad y aproximadamente 10.000 unidades.
C. Enfermedades y trastornos que se van a tratar
Las micropartículas de elución de fármaco se pueden utilizar para suministrar principios activos proteicos para el tratamiento de enfermedades o trastornos.
En una realización preferida, se administra toxina botulínica a un paciente, para tratar una afección tal como un trastorno del movimiento, incluyendo un espasmo muscular o trastornos de la vejiga, tales como vejiga hiperactiva, migrañas o arrugas.
En realizaciones preferidas, se utilizan micropartículas de polímero que contienen toxina botulínica para tratar una o más enfermedades o trastornos para los que se ha aprobado el uso clínico de la toxina botulínica. La cantidad, la pauta y la ubicación de la administración pueden variar según la enfermedad o el trastorno que se vaya a tratar. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la dosis, el número de inyecciones, el sitio de las inyecciones y la frecuencia con la que se administran las micropartículas que contienen toxina botulínica estarán determinados por la afección y la respuesta al tratamiento. Normalmente, una respuesta (por ejemplo, reducción, cese o cambios en uno o más síntomas de la enfermedad o del trastorno) se observa 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días después de la administración, o más tiempo después, por ejemplo, hasta 2 semanas después de la administración. El efecto de la administración puede variar según la enfermedad o el trastorno que se vaya a tratar, y puede durar de un día a un año o más después de la administración, por ejemplo, de 3 a 6 meses después de la administración.
Normalmente, las micropartículas de polímero que contienen toxina botulínica se administran por inyección, en los músculos afectados (por ejemplo, por vía intramuscular) cuando se tratan trastornos oculares, rigidez/espasmos musculares y arrugas.
Cuando se utiliza para prevenir las migrañas, las micropartículas de polímero que contienen toxina botulínica se inyectan en los músculos de la cabeza y del cuello. Las micropartículas de polímero que contienen toxina botulínica se inyectan en la piel (por ejemplo, por vía intradérmica) para el tratamiento de la sudoración excesiva. Cuando se tratan los trastornos de la vejiga, tales como vejiga hiperactiva, las micropartículas de polímero que contienen toxina botulínica se inyectan en los músculos o la luz de la vejiga.
La eficacia mejorada en el tratamiento de los trastornos de la vejiga se obtiene utilizando micropartículas de polímero biocompatible para la administración de toxina botulínica u otros principios activos proteicos. Las micropartículas normalmente se administran en un portador farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina o solución salina tamponada con fosfato mediante inyección o instilación en el tejido o la luz de la vejiga.
Los trastornos vesicales representativos que se pueden tratar con las formulaciones incluyen, pero sin limitación, cistitis hemorrágica, cistitis Intersticial/Síndrome de Vejiga Dolorosa (CI/SVD) y cáncer. Los síntomas que pueden aliviarse mediante el tratamiento con toxina botulínica encapsulada en micropartículas de elución de fármaco incluyen, pero sin limitación, hematuria, urgencia urinaria, dolor suprapúbico, inflamación y retención urinaria.
La toxina botulínica relaja los músculos al bloquear la liberación de una sustancia química llamada acetilcolina. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la toxina botulínica (por ejemplo, toxina de tipo A y B) encapsulada dentro de micropartículas de polímero se utiliza para tratar trastornos asociados con el movimiento, tales como con la actividad muscular relacionada con el movimiento del ojo, la rigidez/los espasmos musculares, etc.
En algunas realizaciones, la toxina botulínica encapsulada dentro de micropartículas de polímero se utiliza para tratar la bizquera (estrabismo) o el parpadeo incontrolado (blefaroespasmo), para tratar la rigidez/los espasmos musculares o trastornos del movimiento (tales como distonía cervical, tortícolis).
Las formulaciones también se pueden utilizar para tratar trastornos de otras partes del cuerpo, incluidos, pero sin limitación, la vagina, el tracto gastrointestinal (superior e inferior), la boca, las vías respiratorias, el esófago, la cavidad nasal, el conducto auditivo y la piel.
También se utiliza para tratar la sudoración intensa de las axilas. La toxina botulínica actúa bloqueando las sustancias químicas que activan las glándulas sudoríparas. En algunas realizaciones, la toxina botulínica encapsulada dentro de micropartículas de polímero para reducir el aspecto cosmético de las arrugas. También se utiliza para prevenir los dolores de cabeza en personas con migrañas muy frecuentes.
La presente invención se entenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran las formulaciones de polímeros biodegradables para la eficacia in vitro e in vivo de la liberación prolongada de la toxina medida mediante la prueba de parálisis en ratones. La "unidad murina" descrita en los ejemplos varía ligeramente, porque la eficacia de la toxina en los diferentes lotes necesitaba medirse usando solo un número limitado de ratones. Así pues, en cada ejemplo, siempre se utilizó la formulación de control de la solución para comparar la eficacia de las formulaciones de polímeros biodegradables.
Solo los ejemplos que comprendan las características de las reivindicaciones son de acuerdo con la invención. Ejemplo 1: Formulación de micropartículas de polímero biodegradable de elución de fármaco que tienen diferentes propiedades
Materiales y métodos
Formulación de micropartículas de toxina botulínica/albúmina
Complejo de tipo A de Clostridium botulinum disponible en List Biological Laboratories, Inc. (Campbell, CA). Se diluyó la toxina botulínica (100 |jg) con 1 ml de tampón Tris.
Se preparó la solución en alícuotas de 100 j l y se congeló. Se diluyó cada alícuota de 100 jE (que contenía 10 jg de toxina o aproximadamente 10.000 unidades murinas) en 20 ml de solución de albúmina (50 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5).
La serie de etapas comúnmente implicada en la incorporación de proteínas a micropartículas de polímero biodegradable suele desnaturalizar las proteínas, produciendo una pérdida o reducción de su bioactividad [J. A. Schellman, "Solvent denaturation", Biopolymers, 17 (1978) 1305-1322; M. van de Weert, W. E. Hennink, W. Jiskoot, "Protein instability in poly(lactic-co-glycolic acid) microparticles", Pharm. Res., 17 (2000) 1159-1167].
Se mezcló la toxina botulínica con seroalbúmina (toxina/albúmina) y se precipitó usando cloruro de cinc. El precipitado de toxina/albúmina obtenido mediante cloruro de cinc se denomina toxina precipitada con Zn o proteínas precipitadas con Zn.
Las proteínas comenzaron a precipitar a concentraciones de cloruro de cinc de aproximadamente el 0,1 %. El ensayo de albúmina mostró que precipitó más del 99 % de la albúmina mediante el cloruro de cinc. Por lo general, se utilizó el cloruro de cinc final del 1 %. Se centrifugó la solución para recoger las proteínas precipitadas con Zn eliminando el sobrenadante y criodesecándolas. La toxina precipitada con Zn mantuvo su bioactividad, medida mediante la prueba de parálisis en ratones y la actividad de endopeptidasa de toxina in vitro usando el sustrato de SNAP-25, incluso después de pasar por distintas etapas en la fabricación de micropartículas de polímero biodegradable.
Se usó el kit de ensayo de endopeptidasa SNAP-25 de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) (Biosentinel's Botest) para medir la capacidad de la toxina para escindir proteolíticamente los sustratos de SNAP-25 naturales. El ensayo de FRET permitió la detección de la actividad de la toxina sin utilizar el estudio de parálisis en ratones, permitiendo probar muchas formulaciones de toxinas.
Como alternativa, después de eliminar el sobrenadante, se lavaron las proteínas restantes precipitadas con Zn con un disolvente seleccionado (lavado con disolvente) para su posterior procesamiento, según lo descrito. La etapa de lavado con disolvente fue fundamental para la preparación de micropartículas cargadas con toxina mediante nuestro nuevo método de emulsión.
Pruebas de carga y liberación de fármacos in vitro
La cantidad de toxina botulínica necesaria como dosis única para uso clínico en los seres humanos es muy pequeña (por ejemplo, se requieren cantidades de nanogramos (ng)). Normalmente, la cantidad de toxina botulínica necesaria para incorporarla a las micropartículas es mucho menor que la cantidad de albúmina incorporada a las mismas partículas. Por lo tanto, los valores para los estudios de liberación de proteínas se determinaron midiendo la cinética de liberación de la albúmina.
Se pesaron las micropartículas después del desecado y se separaron en varias muestras de menos de 10 mg para estudiar la liberación de la albúmina, la carga de fármaco y el análisis de la morfología, respectivamente. La carga de fármaco se determinó disolviendo una muestra en 1 ml de dioxano. Se centrifugó la muestra, se retiró el sobrenadante, y se disolvió el precipitado de Zn restante en 1 ml de NaOH 0,05 M. Como alternativa, las micropartículas de polímero se disuelven en una mezcla de dioxano/acetonitrilo y el precipitado proteico se disuelve en NaOH 0,1 M. Mediante cualquiera de los métodos, la proteína se analiza mediante el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Scientific prod n.° 23225).
Para la liberación de albúmina a largo plazo, se incubaron muestras por triplicado de micropartículas desecadas a 37 °C en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato 0,01 M con Tween® 20 al 0,05% (PBST) a pH 7,4 que contenía azida sódica al 0,1 %. En puntos de tiempo predeterminados, las muestras se agitaron durante 10 segundos, se centrifugaron a 7.200 rpm durante 2 minutos y se tomó el sobrenadante para su análisis. Se analizó el contenido de albúmina mediante el ensayo de BCA y se registró la liberación acumulativa.
Pruebas de degradación acelerada in vitro
Las micropartículas se incubaron a 60 °C en 1 ml de tampón de acetato de sodio 0,1 M a pH 3,0. Se observó una muestra de micropartículas de cada formulación mediante microscopía óptica en puntos de tiempo especificados. Se observaron los cambios en la forma o el tamaño de las micropartículas para determinar el tiempo de degradación.
Normalmente, la cantidad de toxina botulínica utilizada clínicamente está en el intervalo de 100 unidades o menos. La cantidad de toxina utilizada estuvo en el intervalo de 100 ng, haciéndola difícil de manejar, si no se diluía con otras proteínas, tales como albúmina. La adición de aproximadamente 1 mg de seroalbúmina por cada unidad de toxina proporciona una proporción de la toxina con respecto a la albúmina de aproximadamente 1:10.000, sin afectar a la actividad ni a la cinética de liberación de la toxina botulínica. Así pues, para determinar el impacto de diferentes formulaciones de micropartículas de polímero en la cinética de liberación de proteínas, las micropartículas solo se cargaron con albúmina.
Resultados
Las micropartículas se diseñaron para administrar albúmina de manera que el primer 40-50 % de la dosis total se liberara unos días después de la administración parenteral, y que la dosis restante se liberara lentamente durante un período de tiempo que variaba de semanas a meses.
Dado que la cinética de liberación de las proteínas depende del tipo de PLGA utilizado, incluyendo (1) el peso molecular medio del polímero; (2) la proporción de L:G; y (3) la incorporación de grupos terminales de éster o ácido, se utilizaron diferentes tipos de polímeros para fabricar micropartículas y se examinó su comportamiento de liberación de albúmina, que incluyeron poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido D-láctico) (PDLA), poli(ácido L-láctico) (PLLA), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) y policaprolactona (PCL).
La albúmina se cargó en micropartículas de polímero biodegradable después del lavado con disolvente de la proteína precipitada con Zn. Se usaron polímeros biodegradables de diferentes pesos moleculares y proporciones de L:G para fabricar micropartículas de 50 |jm. La concentración de polímero biodegradable se varió de menos del 10 % a más del 40 %. La concentración de albúmina varió de menos del 5 % a más del 20 % del peso total. Los disolventes utilizados para disolver polímeros biodegradables incluyen diclorometano, dioxano, acetato de etilo y alcohol bencílico. Los perfiles de liberación de las 78 formulaciones iniciales de polímeros biodegradables se muestran en Figura 1. Como se muestra en la Figura 1, los perfiles de liberación varían mucho dependiendo de la composición y el método utilizado para fabricar micropartículas.
Se hicieron varias observaciones generales sobre los perfiles de liberación de la albúmina: 1. las formulaciones de PLLA tienen la ventaja con respecto a las formulaciones de PDLA de que reducen al mínimo la gran liberación inmediata inicial de seroalbúmina bovina (SAB) en el intervalo de peso molecular de 20.000-250.000 Da. Esto puede deberse al alto grado de cristalinidad del poli(ácido L-láctico) (PLLA) y a la relativamente baja cristalinidad del poli(ácido D-láctico) (PDLA). El alto grado de cristalinidad permite que incluso la SAB cercana a la superficie quede atrapada y se reduzca al mínimo la gran liberación inmediata;
2. Las micropartículas hechas de mezclas de PDLA y PLLA mostraron perfiles de liberación híbridos, es decir, la gran liberación inmediata inicial estuvo entre las obtenidas mediante formulaciones de polímeros individuales, seguida por la liberación en estado estacionario;
3. La formulación de micropartículas hecha de una mezcla física a 50:50 de PLLA y PDLA mostró una liberación de orden casi nulo durante más de 5 meses con solo un 12 % de gran liberación inmediata inicial; y
4. El tipo de disolvente utilizado afectó al grado de la gran liberación inmediata inicial. La gran liberación inmediata fue mayor para las formulaciones de diclorometano (DCM) que para las formulaciones de dioxano. Los puntos de ebullición de DCM y dioxano son de 39 °C y 101 °C, respectivamente, y el desecado más rápido de DCM podría haber dado lugar a estructuras de polímero menos compactas, para una gran liberación inmediata inicial superior.
Tener la capacidad de controlar los perfiles de liberación de las formulaciones de PLGA es uno de los factores más importantes en el desarrollo de formas farmacéuticas a largo plazo. La capacidad de controlar la gran liberación inmediata inicial, la liberación en estado estacionario y el tiempo de degradación permiten el desarrollo de sistemas de suministro para innumerables aplicaciones, desde una liberación de orden casi nulo hasta múltiples liberaciones pulsátiles suministradas durante un período de tiempo.
Los datos de la Figura 1 muestran que los perfiles de liberación están muy influenciados por la cristalinidad del polímero (controlada por el tipo de polímero), el peso molecular del polímero, la proporción de L:G del polímero, la forma de las micropartículas y el disolvente. Estas micropartículas se formularon utilizando el método de matriz de hidrogel.
Ejemplo 2: Las micropartículas de polímero aumentan la cantidad de toxina botulínica que se puede administrar de forma segura
Métodos
Formulación de micropartículas de polímero cargadas de toxina botulínica/albúmina
Se hicieron precipitar la toxina botulínica y la albúmina en solución acuosa usando diferentes agentes precipitantes, incluyendo sales, ácidos grasos de carbono, PEG, disolventes, aminoácidos y cloruro de cinc (ZnCh). De estos, se escogió el ZnCh por su capacidad para hacer precipitar ambas proteínas y por el fácil manejo de las proteínas precipitadas. A la concentración de ZnCh del 1 % (o 73 mM), precipitó el 99 % de la proteína en solución. Las proteínas precipitadas se recogieron mediante centrífuga y se criodesecaron.
El polvo de toxina/albúmina se trituró manualmente usando un mortero y se cargaron cantidades variables de toxina en micropartículas de polímero biodegradable. Para la liberación de la albúmina y otros estudios cinéticos, se utilizó una amplia variedad de polímeros incluyendo PLGA, PLLA, PDLLA y PCL. Simplemente, debido a su historial de uso clínico, se utilizó PLGA para los estudios de la toxina.
El modelo de parálisis en ratones.
La potencia de la toxina botulínica para el tratamiento terapéutico se mide por unidad murina. Una unidad murina de toxina botulínica A se define como la cantidad que es letal al 50 % (DL50) de un grupo de cierto peso, cepa y sexo de los ratones (por ejemplo, 18-20 g de ratones hembra Swiss-Webster).
Para examinar la eficacia de la toxina liberada in vivo sin matar ratones, se utilizó el modelo de parálisis en ratones. Se inyectaron micropartículas de polímero biodegradable o formulaciones de gel a ratones por vía intramuscular usando una aguja de calibre 25~27 acoplada a las jeringas de 1 ml. Aunque la unidad murina esté bien definida, la potencia puede variar dependiendo de la preparación de toxina y también del grupo de ratones utilizado. En estos estudios, la mayoría de los ratones murió cuando se les inyectaron más de 0,75 unidades de toxina en solución. Por otro lado, los ratones presentaron parálisis cuando la toxina administrada varió entre 0,50 y 0,75 unidades. Así pues, había un intervalo reducido de dosis de toxina que podía usarse para estudiar la potencia de la toxina usando el modelo de parálisis en ratones. La parálisis en ratones se analiza utilizando el ensayo de abducción digital (DAS), y la respuesta de DAS varía de 1 a 4 (Aoki, European Journal of Neurology, 6, S3-S10 (1999), Aoki, K. R. "A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice". Toxicon 39.12 (2001): 1815-1820). La respuesta de DAS alta indica la parálisis más fuerte. La parálisis después de la inyección de toxina, ya sea en solución 0 formulación de polímero, se utilizó como medida de la eficacia de la toxina.
La dosis de toxina se describe por referencia a la "unidad murina", donde 1 unidad murina es igual a aproximadamente 1 ng, pero puede extenderse a tan poco como 50 pg. La cantidad exacta de toxina biológicamente activa por unidad puede variar y depende del lote.
Resultados
La toxina botulínica/albúmina se cargó en micropartículas de polímero biodegradable después de la trituración manual. La Figura 2 muestra los resultados del grado de parálisis tras la inyección de micropartículas que contienen diferentes unidades de toxina.
Todos los ratones que recibieron por inyección la dosis total de toxina de 3 unidades y 6 unidades murieron, porque se liberó más de 1 unidad al principio. Cuando la toxina total de la micropartícula fue de 1,5 unidades (que mata a los ratones si se inyecta en forma de solución), la parálisis de los ratones se mantuvo durante 45 días.
En otro grupo, los ratones de control que recibieron por inyección 0,5 unidades de solución de toxina solo mostraron parálisis durante 16 días. En este grupo de ratones, la inyección de 0,75 unidades de toxina en solución mató a los ratones y, por lo tanto, solo se inyectó una dosis total de 0,5 unidades de toxina en solución. Por otro lado, aunque las micropartículas liberaron una dosis total de 1,5 unidades de toxina, los ratones no murieron. Por el contrario, los ratones quedaron paralizados durante mucho más tiempo que los ratones que recibieron por inyección 0,5 unidades de toxina en solución.
Estos datos demuestran que el sistema de suministro de toxina en micropartículas proporciona un medio seguro para prolongar los efectos de una sola administración de toxina botulínica.
Ejemplo 3: Las micropartículas de polímero aumentan la eficacia de la toxina botulínica
Se prepararon micropartículas de polímero cargadas con toxina botulínica/albúmina como se describe en el Ejemplo 2. La solución de control de 0,5 unidades mantuvo la parálisis de los ratones durante aproximadamente 16 días, mientras que las formulaciones de micropartículas prolongaron el efecto de la toxina hasta 37 días, dependiendo de la cantidad de toxina cargada en las micropartículas.
Como se muestra en la Figura 3, la eficacia a largo plazo de la toxina mediante una formulación de micropartículas depende de la cantidad de toxina inyectada en los ratones. El estudio de parálisis en ratones de micropartículas de polímero biodegradable cargadas con toxinas a dosis bajas demostró que la cantidad de toxina utilizada en las micropartículas es proporcional al período de duración de los efectos de la toxina. Si la cantidad de toxina supera las 0,75-1,00 unidades en solución, los ratones mueren. Por el contrario, si se suministra la misma cantidad utilizando micropartículas, el efecto de la toxina dura más tiempo sin matar a los ratones.
Ejemplo 4: Las micropartículas de polímero en termogeles aumentan la eficacia de la toxina botulínica
Métodos
Se dispersaron partículas de toxina/albúmina precipitadas con Zn preparadas mediante el método de emulsión en un termogel para probar la eficacia de la toxina precipitada con Zn y el posterior lavado con disolvente. Adicionalmente, también se examinó el efecto de los termogeles sobre el grado de eficacia de la toxina.
Los termogeles que incluyen copolímeros de tres bloques de PLGA-PEG-PLGA que se disuelven en una solución acuosa a baja temperatura (por ejemplo, a 4 °C) se convierten en gel a la temperatura corporal. La temperatura de gelificación depende de la estructura química y del peso molecular de un termogel. Debido a la presencia de un gel que rodea las micropartículas, se controló aún más la liberación de toxina. Los precipitados de Zn sin termogeles se usaron como controles. El termogel se disolvió en agua destilada y solución de cloruro de cinc (3 mg/ml) al 20 % (p/v) de concentración a 4 °C.
Se inyectaron mezclas de termogel y toxina (50 j l ) a ratones por vía intramuscular usando una aguja de calibre 25~27 acoplada a las jeringas de 1 ml.
Resultados
Como se muestra en la Figura 4 , la formulación que contenía 4 unidades de toxina no mató a los ratones, pero mostró respuestas de DAS más potentes con una eficacia mucho más duradera. La toxina molida en húmedo mantuvo su eficacia, al igual que la toxina triturada manualmente. En otros estudios, las micropartículas que contienen 3 unidades de toxina mataron a los ratones cuando se inyectaron sin el termogel. El área bajo la curva, es decir, la respuesta del DAS en función del tiempo, para la formulación de micropartículas/termogel fue aproximadamente 4 veces mayor que el control de 1 unidad. La eficacia de la toxina está relacionada con la unidad total suministrada. Como se muestra en la Figura 1, las micropartículas hechas de diferentes tipos de polímeros biodegradables pueden liberar la albúmina cargada (y, por lo tanto, también la toxina) con diferentes cinéticas de liberación, y el efecto de la toxina puede prolongarse aún más de lo que se muestra en las Figuras 2-4 con mayores cantidades de toxinas.
Ejemplo 5: Los termogeles amplían la eficacia de la toxina botulínica precipitada con Zn
Métodos
Para examinar el efecto de diferentes tipos de termogel en el control y mantenimiento de la liberación de toxina, se dispersó toxina precipitada con Zn en una solución de cinc a 3 mg/ml en agua destilada junto con un termogel. Se utilizaron dos tipos diferentes de termogeles que suministraban 2 o 3 unidades de toxina.
Resultados
Como se muestra en la Figura 5 , las formulaciones de termogel que contenían 2 o 3 unidades de toxina en general prolongaron la eficacia de la toxina sin matar a los ratones. Estos hallazgos indicaron que los termogeles brindan la capacidad de retardar la liberación de la toxina. Se probaron diferentes termogeles para examinar su capacidad para mantener la eficacia de la toxina precipitada con Zn dispersada en termogeles. Los termogeles utilizados incluyen copolímeros de tres bloques de PLGA-PEG-PLGA y otro tipo de copolímeros de bloque disponibles en Akina PolySciTech (West Lafayette, IN). La Tabla 3 enumera los termogeles probados. Los termogeles se vuelven geles por encima de la temperatura de transición de sol-gel. Las partículas de albúmina/toxina precipitadas con Zn se mezclaron con termogeles y se inyectaron en ratones.
________ Tabla 3. Termogeles obtenidos en PolySciTech utilizados para el suministro sostenido de toxina._______ Polímeros termogeles (a base de PLGA) Pr° p° rción de L G m ol. P (Da) Morfología del gel PLGA-PEG-PLGA (AK012) 50:50 1000-1000-1000 Trasparente PLGA-PEG-PLGA (AK019) 50:50 1500-1500-1500 Trasparente PLGA-PEG-PLGA (AK024) 75:25 1100-1000-1100 Trasparente PLGA-PEG-PLGA (AK085) 50:50 1400-1500-1400 Trasparente PLLGA-PEG-PLLGA (AK087) 75:25 1100-1000-1100 Opaca PLGA-PEG-PLGA (AK091) 86:14 1500-1500-1500 Trasparente PLGA-PEG-PLGA (AK097) 94:06 1700-1500-1000 Trasparente PDLL-PEG-PDLL (AK100) 100:0 1700-1500-1700 Trasparente PDLL-PEG-PDLL (AK046) 100:0 1000-1000-1000 Trasparente Polímeros termogeles (a base de proporción DE CL:LA
Mol. P (Da) Morfología del gel caprolactona) (p/p)
PLCL-PEG-PLCL (AK108) 75:25 1600-1500-1600 Opaca PLCL-PEG-PLCL (AK109) 60:40 1700-1500-1700 Opaca mPEG-PCL (AK036) 100:0 750-2500 Opaca PCL-PEG-PCL (AK035) 100:0 1000-1000-1000 Opaca PDLL: poli(DL-láctido); P(LCL): Poli(láctido-co-caprolactona); mPEG:
metoxi-PEG; PCL: policaprolactona; PLLGA-PEG-PLLGA: el láctido L-quiral en PLGA-PEG-PLGA es racémico DL.
Los resultados de la parálisis en ratones mediante diferentes formulaciones de termogel se resumen en la Tabla 4.
Estos datos demuestran que algunos termogeles fueron eficaces, mientras que otros no lo fueron. Si la temperatura de transición de sol-gel es demasiado baja, es decir, a temperatura ambiente de menor, entonces, la solución comienza a formar un gel incluso durante la inyección en el ratón. La formación de gel más rápida puede ser ventajosa para muchas aplicaciones; sin embargo, en algunos casos, se produjo formación de gel durante la inyección, produciendo la administración de una cantidad de toxina inferior a la deseada al ratón. Resumiendo, los termogeles que tenían una temperatura de transición de sol-gel de aproximadamente 37 °C tuvieron una mayor eficacia que el control.
T l 4. P r li i n r n m i n xin l min r i i n Zn n f rm l i n rm l.
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continuación
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Ejemplo 6: El tamaño de los precipitados de toxina/albúmina precipitadas con Zn influye en la eficacia
Las partículas en polvo de toxina/albúmina precipitadas con Zn criodesecadas se trituraron en partículas más pequeñas, que tenían dimensiones en el intervalo de tamaños micrométricos y submicrométricos.
Métodos
Las partículas de toxina/albúmina precipitadas con Zn criodesecadas se trituraron manualmente (es decir, a mano usando un mortero) o usando una máquina de molino de bolas planetario (Changsha Deco Equipment Co., China) usando bolas de trituración de óxido de circonio, acero inoxidable, ágata, wolframio, alúmina o plásticos variables tales como el teflón con núcleo de acero.
Para la molienda en húmedo, las partículas de toxina/albúmina criodesecadas se suspendieron en un disolvente orgánico de diclorometano (DCM) o acetato de n-butilo (nBA). Los procesos de molienda en húmedo se llevaron a cabo en ausencia o presencia de hielo seco.
Resultados
El precipitado de toxina/albúmina con Zn criodesecado se trituró manualmente durante períodos de tiempo de hasta varias horas para producir un tamaño medio de partícula de aproximadamente 10 pm.
El tamaño medio de partícula se redujo a una décima parte (es decir, a un tamaño de aproximadamente 1 pm o menor) cuando se trituró mediante molienda con molino de bolas planetario (lo que se denomina molienda en seco o trituración en seco). Sin embargo, el proceso de trituración en seco produjo toxina significativamente reducida, bioactividad, como lo demuestra una parálisis reducida en los animales de prueba, probablemente debido al aumento de la temperatura de la muestra provocado por el proceso de molienda en seco.
Para evitar los aumentos de temperatura durante el proceso de molienda en seco, se rodeó la cámara de molienda de una cámara llena de hielo seco en una máquina de molienda planetaria, y el proceso de molienda continuó durante 2 horas. La cámara se llenó con hielo seco nuevo después de 1 hora.
Las partículas de toxina/albúmina precipitadas con Zn criodesecadas preparadas mediante molienda en seco con la temperatura controlada por la cámara de hielo seco presentaron una bioactividad de la toxina preservada, demostrando que los aumentos de temperatura durante la molienda en seco afectan negativamente a la eficacia de la toxina.
El aumento de temperatura durante la molienda también se evitó moliendo las partículas de toxina/albúmina precipitadas con Zn criodesecadas en presencia de un disolvente orgánico. Este proceso se denomina molienda en húmedo o trituración en húmedo.
Se utilizaron tanto las muestras de toxina molidas manualmente como las molidas con molino de bolas planetario para fabricar micropartículas. Los resultados del ensayo de parálisis en ratones de la Tabla 5 muestran que la actividad de la toxina se mantuvo durante el proceso de trituración en seco cuando se usó la cámara de hielo seco, y durante el proceso de trituración en húmedo con y sin la cámara de hielo seco.
Tabla . R l l n n r n rí l xin l min ri l m lienda.
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continuación
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Para confirmar que la exposición de partículas de toxina/albúmina precipitadas con Zn criodesecadas a disolventes orgánicos no afectó a la actividad biológica de la toxina botulínica, se mezclaron las partículas de toxina precipitadas con Zn con disolventes orgánicos y se evaluó la actividad de la toxina in vivo después de la inyección en animales de prueba. Como se muestra en la Tabla 6, la bioactividad de la toxina se mantuvo tras la exposición al acetato de nbutilo, dioxano o diclorometano. Estos disolventes se usan comúnmente para la fabricación de micropartículas de PLGA, por lo tanto, las partículas de toxina/albúmina precipitadas con Zn criodesecadas preparadas mediante molienda en seco y/o en húmedo se pueden mezclar con disolventes disueltos en PLGA para formular micropartículas de acuerdo con métodos de matriz de polímero o métodos de emulsión.
Tabla 6. Resultados de la prueba de toxicidad de las partículas de toxina/albúmina precipitadas con Zn criodesecadas tras la exposición de los disolventes.
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Ejemplo 7: Lavado de toxina/albúmina precipitadas con Zn en solución acuosa con disolventes orgánicos
Métodos
Se dispersó polvo de toxina botulínica/albúmina precipitadas con Zn en una solución acuosa y se lavó con disolventes hidromiscibles para eliminar el agua del precipitado y dispersarlo en soluciones disueltas en polímero para formular micropartículas. El precipitado de toxina/albúmina en solución acuosa se recogió por centrifugación (5.000 fcr, 2 min.). Se eliminó el sobrenadante (agua) y se añadió un disolvente hidromiscible al precipitado en una proporción de volumen de 10:1 (disolvente: precipitado), o superior, y se mezclaron mediante vórtice o agitación para producir una solución de toxina/albúmina lavada con disolvente.
Se comparó un total de 21 disolventes de lavado diferentes en cuanto a su capacidad para preservar la eficacia de la toxina botulínica encapsulada en micropartículas. En la Tabla 7 , se proporciona una lista de los disolventes evaluados para la etapa de lavado con disolvente. Para cada disolvente de prueba, el precipitado de toxina/albúmina lavado con disolvente se recogió mediante centrifugación (5.000 fcr, 2 min.). El precipitado recogido se diluyó mediante la adición de una solución que contenía 3 mg/ml de cloruro de cinc, proporcionando una solución que contenía aproximadamente 10 unidades de toxina botulínica. Para evaluar el efecto de cada uno de los disolventes de lavado sobre la actividad de la toxina botulínica, se inyectaron muestras de prueba de aproximadamente 50 pl de cada solución de toxina botulínica lavada con disolvente en los animales de prueba por vía intramuscular (i.m.).
Resultados
La Tabla 7 enumera los disolventes utilizados para identificar aquellos que mantienen la actividad de la toxina después del lavado con disolvente. Los disolventes enumerados como los n.° 1-14 mantuvieron la actividad de la toxina después del lavado con disolvente, como lo demuestra la letalidad mantenida en las 48 horas siguientes a la inyección en los ratones. Los disolventes enumerados como los n.° 15-21 no mantuvieron la actividad de la toxina, como lo demuestra la supervivencia de los ratones 48 horas después de la inyección. Cabe señalar que, aunque los disolventes n.° 11-14 mantuvieron la actividad de la toxina, estos disolventes presentan una viscosidad relativamente alta, impidiendo la fácil recogida del precipitado lavado con disolvente mediante centrifugación.
La Tabla 7 también proporciona los resultados del estudio de parálisis, que se llevó a cabo utilizando aproximadamente 2 unidades/inyección. En este ensayo, la respuesta de DAS entre 2 y 4 indicó que la toxina botulínica tiene actividad biológica. Los disolventes n.° 1-5 y 9 mostraron una eficacia similar al precipitado de control que no se lavó con disolvente. En particular, disolventes n.° 1-3, (es decir, acetona, acetonitrilo y dioxano), fueron identificados como buenos candidatos para lavar precipitados de toxina/albúmina para la fabricación de micropartículas de PLGA, porque disuelven el PLGA, mientras que los otros disolventes (n.° 4-21) probados no.
Tabla 7. Disolventes utilizados para el lavado con disolventes, y datos de parálisis y letalidad en ratones.
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Basándose en la prueba de evaluación de disolventes, se mezcló el precipitado de toxina/albúmina lavado con disolvente con PLGa disuelto en dioxano, DCM, acetato de n-butilo y otros disolventes para fabricar micropartículas de PLGA.
Ejemplo 8: Métodos de emulsión para micropartículas de PLGA cargadas con toxina lavada con disolvente
Métodos
Formulación de partículas
Se disolvió PLGA (750 mg) en 5 ml de disolvente (DCM o DCM/Dx = 1:1) y se almacenó en la nevera (4~10 °C). Se disolvió PVA con un peso molecular de 31.000 Da en agua destilada y solución de cloruro de cinc (3 mg/ml) a una concentración del 1 % (p/v) ("PVA-Zn"). Se dispersó precipitado de toxina/albúmina lavado con disolvente (50 mg) en la solución de PLGA con agitación con vórtice durante 10-20 segundos, para fabricar una dispersión de sólido en aceite (S/O). La solución de PVA-Zn (250 ml en un recipiente de 400 ml) se homogeneizó utilizando un mezclador de laboratorio L5M-A (Silverson Machines, Inc.) con un rotor de tipo tamiz de alta cizalla de orificios cuadrados a 4000 rpm durante 1 minuto en un baño de hielo.
Se añadió la dispersión de S/O a la solución de PVA-Zn utilizando una pipeta de 5 ml a un caudal de 0,25 ml/s y, a continuación, se emulsionó durante 15 minutos. Los 150 ml de la solución de PVA-Zn se añadieron a la solución de emulsión de homogeneización y se emulsionaron de manera continua durante 15 minutos más. A continuación, se vertió la solución rápidamente en los 1,6 l de solución de PVA-Zn con agitación magnética a 600 rpm. Se siguió agitando durante 75 minutos en una estufa de incubación a 10 °C. Se recogieron las micropartículas endurecidas con mallas de 75 pm y 20 pm y, posteriormente, se lavaron con 3-4 l de agua destilada. Las micropartículas se centrifugaron a 5000 rpm (4500 fcr) durante 1 minuto y se criodesecaron durante la noche.
Resultados
Las micropartículas se fabricaron con copolímeros de PLGA de diferentes proporciones de L:G y disolventes utilizando el método de emulsión de S/O/W. La eficacia de la carga de toxina botulínica en las diferentes micropartículas se demuestra en la Tabla 8. Las muestras n.° 1 y n.° 2 de la Tabla 8 se fabricaron para estudiar el efecto del disolvente, y las muestras n.° 2 y n.° 3 que tenían toxina se fabricaron para estudiar el efecto de la proporción de L:G del PLGA. Las micropartículas fabricadas con PLGA a 75:25 resultaron tener una eficacia de carga de proteínas de aproximadamente el 98 % y PLGA a 85:15 de aproximadamente el 94 %. Los resultados indican que la emulsión de S/O/W con la toxina lavada con disolvente proporciona condiciones estables para lograr una alta productividad y reproducibilidad (véase la Tabla 8).
Tabla 8. Carga de proteínas y eficacia de carga de las micropartículas cargadas de toxina/albúmina lavadas con disolvente.
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La liberación de proteínas de las micropartículas, medida mediante la liberación de albúmina, se rigió por la composición del disolvente y la proporción de L:G. En este estudio de formulación en particular, la liberación de proteína estuvo en función de la proporción de L:G. La gran liberación inmediata inicial disminuyó a medida que aumentaba la proporción de L:G. Adicionalmente, la velocidad de liberación dependía del disolvente utilizado para fabricar las micropartículas.
Ejemplo 9: Actividad de la toxina liberada de las micropartículas fabricadas mediante el método de emulsión
Métodos
Se preparó toxina/albúmina precipitadas con Zn y se dividió en alícuotas. Algunas muestras se almacenaron en una nevera como control y otras muestras se lavaron con disolventes orgánicos para el lavado con disolvente. Todas las muestras se mezclaron en una solución que contenía 500 pl de EDTA 100 mM mientras se agitaba con vórtice para disolver el precipitado de toxina/albúmina. El precipitado de toxina/albúmina disuelto se transfirió a un dispositivo de filtración centrífuga Amicon ultra-0,5 (Millipore, PM de corte de 10.000 Da). El dispositivo de filtración se centrifugó durante 3 minutos a 13.000 fcr. Tras retirarse el filtrado, se añadió agua pura al dispositivo de filtración hasta 500 pl y se centrifugó para eliminar el EDTA y el cloruro de cinc. Después de eliminar el filtrado, se añadió Tris 50 mM a pH 7,5 al dispositivo de filtración hasta 500 pl y se centrifugó dos veces. La toxina/albúmina intercambiadas con tampón se recuperó colocando el dispositivo de filtración boca abajo en un microtubo limpio. El dispositivo de filtración se colocó en la centrífuga y se centrifugó durante 3 minutos a 13.000 fcr. Se recogió la toxina/albúmina en el microtubo limpio. Se analizó la actividad enzimática de las muestras utilizando un ensayo de FRET (kit BoTest de BioSentinel, Inc.).
La toxina lavada con disolvente se usó para fabricar micropartículas de PLGA mediante el método de emulsión. Las micropartículas se suspendieron en 5 ml de PBS-Tween (0,05 %) (pH 7,5) que contiene azida sódica al 0,1 % a 37 °C en una estufa de incubación con agitación a 50 rpm. En puntos de tiempo predeterminados, se centrifugó cada tubo de ensayo a 5000 rpm durante 1 minuto y se extrajeron 500 pl de sobrenadante para el ensayo de liberación de albúmina con el kit de ensayo de proteínas microBCA, para el ensayo de ELISA de toxina botulínica con el kit de ensayo Tetracore BTX, y para el ensayo de actividad enzimática de la toxina con el kit de ensayo de FRET de acuerdo con el procedimiento operativo convencional de los proveedores. Después del muestreo, los tubos de ensayo se devolvieron a la estufa de incubación con agitación.
Resultados
Se usaron micropartículas de PLGA a 85:15 formuladas usando el método de emulsión para análisis de FRET a fin de detectar la actividad enzimática de la toxina a la concentración de toxina de 1-100 ng/ml.
Los resultados del ensayo de FRET, junto con el ensayo de ELISA, se proporcionan en la Tabla 9. Los resultados establecieron que las cantidades de toxina liberada medidas por ELISA son similares a los del ensayo de FRET, y que la toxina liberada de las micropartículas era enzimáticamente activa. El ensayo de FRET proporcionó un medio fácil y rápido para medir la actividad enzimática de la toxina sin experimentos de parálisis en ratones. Los datos indicaron que la cantidad de toxina medida mediante el ensayo de FRET es mayor que la cantidad estimada a partir de la proporción de toxina: albúmina de la medición de albúmina total (véase la Tabla 8). Esto sugiere que la mayor parte de la toxina en la solución fue precipitada por el cloruro de cinc y que la actividad de la toxina no disminuyó durante el proceso de fabricación de micropartículas.
Tabla 9. La actividad enzimática de la toxina lavada con disolvente tras su liberación desde las micropartículas en el Día 1.
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Ejemplo 10: Micropartículas encapsuladas en gel de ácido hialurónico reticulado
Método
Se preparó una muestra de gel de HA reticulado que encapsulaba micropartículas disolviendo ácido hialurónico marcado con FITC al 1 % (HA-FITC) en tampón de NaHPO40,01 M utilizando un agitador de hélice. Se dispersaron las micropartículas en 0,5 ml de solución de HA en un vial de 2 ml utilizando un agitador térmico de microtubos a 40 °C, 1000 rpm. A continuación, el agente de reticulación, 1,2,7,8-diepoxioctano (ODDE), se disolvió al 10 % v/v en agua con agitación para dispersarlo y se añadieron 19 pl de ODDE al 10 % a la mezcla de micropartículas/HA mientras se agitaba. La solución se dejó reaccionar a 40 °C con agitación durante 2,5 horas y después se almacenó a 4 °C durante la noche. A continuación, se empujó esta suspensión a través de un tamiz de acero de 600 pm (malla n.° 30) para romper el HA y se volvió a colocar en un vial de 2 ml con una tapa perforada. A continuación, se desecó al vacío durante 2-3 días en un vacío profundo. A continuación, se volvió a disolver esta suspensión en agua para reconstituirla y obtener imágenes bajo un microscopio de fluorescencia.
Resultados
Se observó que el gel de HA-FITC formado realizó la encapsulación alrededor del exterior de las micropartículas de PLGA, y su ubicación se confirmó usando imágenes de fluorescencia del marcador FITC. El recipiente de gel de HA se usa para encapsular no solo micropartículas de PLGA, sino también partículas de toxina botulínica precipitadas para ayudar a prolongar y controlar la velocidad de liberación de toxina botulínica.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para formular micropartículas de polímero para la liberación controlada de toxina botulínica, que comprende las etapas de:
(a) disolver la toxina botulínica y una proteína voluminizadora en una solución acuosa para formar una solución de toxina botulínica-proteína;
(b) hacer precipitar la toxina botulínica-proteína de la solución con un agente precipitante seleccionado del grupo que consiste en éster metílico de L-histidina, éster etílico de L-cisteína, Na-(ferc-butoxicarbonil)-L-asparagina, éster bencílico de L-prolina, A/-acet¡l-L-triptófano, ácido gentísico, ácido pentético, ácido octanoico, cloruro de cinc y combinaciones de los mismos, para formar un precipitante;
(c) lavar el precipitante una o más veces con un disolvente de lavado para formar un precipitante lavado con disolvente; (d) mezclar o dispersar el precipitante en una solución de un polímero para formar una dispersión de polímero-toxina botulínica-proteína; y
(e) preparar micropartículas de polímero que encapsulan la toxina botulínica-proteína a partir de la dispersión de polímero-toxina botulínica-proteína.
2. El método de la reivindicación 1, en donde:
(i) el agente voluminizador de la etapa (a) es albúmina;
(ii) el disolvente de lavado de la etapa (c) se selecciona del grupo que consiste en acetona, acetonitrilo, dioxano, etanol, acetato de 2-metoxietilo, metoxietanol, etoxietanol, butoxietanol, 2-propanol éter metílico de propilenglicol, etanodiol, 1,2-propanodiol, alcohol terc-butílico, dietilenglicol y combinaciones de los mismos; o
(iii) el disolvente polimérico de la etapa (d) se selecciona del grupo que consiste en alcohol bencílico, acetato de nbutilo, clorobenceno, cloroformo, dioxano, diclorometano, acetato de etilo, etil-benzoato, formiato de etilo, formiato de metilo, metil-n-propilcetona, fenetilamina, triacetina, tricloroetileno y combinaciones de los mismos; opcionalmente, en donde el disolvente polimérico es una combinación de dioxano y diclorometano o acetato de etilo y diclorometano.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la dispersión de disolvente polimérico se transforma en micropartículas utilizando una matriz de micropatrón, o en donde la dispersión de disolvente polimérico se transforma en micropartículas utilizando una matriz de micropatrón que comprende alcohol polivinílico.
4. El método de la reivindicación 1, en donde las micropartículas se forman mediante la adición de la dispersión de polímero-toxina botulínica-proteína a un disolvente no polimérico para formar una emulsión; opcionalmente, en donde: (i) el disolvente no polimérico es un disolvente acuoso preacondicionado con un disolvente o disolventes orgánicos que disuelven el polímero y, opcionalmente, en donde el disolvente orgánico utilizado para el preacondicionamiento es diclorometano, además, opcionalmente, en donde la emulsión comprende diclorometano a una concentración de entre el 0,1 % y el 1,3 % en una solución acuosa;
(ii) el disolvente orgánico utilizado para el preacondicionamiento es acetato de etilo;
(iii) la emulsión comprende acetato de etilo a una concentración de entre el 0,1 % y el 8,7 % en solución acuosa; (iv) la emulsión de fármaco-polímero se mezcla con un agitador de hélice o un homogeneizador de alta velocidad; o (v) la emulsión es una emulsión acuosa que contiene un agente de prevención de la disolución seleccionado del grupo que consiste en éster metílico de L-histidina, éster etílico de L-cisteína, Na-(ferc-butoxicarbonil)-L-asparagina, éster bencílico de L-prolina, W-acetil-L-triptófano, ácido gentísico, ácido pentético, ácido octanoico y cloruro de cinc, y opcionalmente en donde el agente de prevención de la disolución es cloruro de cinc que es de entre el 0,1 % y el 10 % p/v.
5. El método de la reivindicación 1, en donde la toxina botulínica;
(i) comprende una toxina botulínica seleccionada del grupo que consiste en toxina botulínica de tipo A, B, C, D, E, F, G y mezclas de las mismas;
(ii) es una toxina botulínica de tipo A, y entre aproximadamente 1 unidad y aproximadamente 50.000 unidades de toxina botulínica A están asociadas con las micropartículas;
(iii) es una toxina botulínica de tipo A, y entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 30.000 unidades de toxina botulínica A están asociadas con las micropartículas; o
(iv) es una toxina botulínica de tipo B, y entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 30.000 unidades de toxina botulínica B están asociadas con las micropartículas.
6. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende una proteína seroalbúmina.
7. El método de la reivindicación 1, en donde el polímero:
(i) es un polímero biodegradable;
(ii) es un polímero biodegradable seleccionado del grupo que consiste en poliláctido, poli(láctido-co-glicólido), copolímeros de bloques de poli(láctido-co-glicólido)-poli(etilenglicol), mezclas y copolímeros de los mismos;
(iii) es un polímero biodegradable que es un poli(láctido-co-glicólido) que tiene una proporción de láctido:glicólido (L:G) de entre aproximadamente 50:50 y 100:1, ambas inclusive; o
(iv) es un polímero biodegradable que es un poli(láctido-co-glicólido) que tiene una proporción de L:G de entre aproximadamente 75:25 y 85:15, ambas inclusive.
8. El método de la reivindicación 1, en donde:
(i) el lavado con disolvente se realiza usando un disolvente seleccionado del grupo que consiste en acetona, acetonitrilo, dioxano, etanol, acetato de 2-metoxietilo, metoxietanol, etoxietanol, butoxietanol, 2-propanol, éter metílico de propilenglicol, etanodiol, 1,2-propanodiol, alcohol ferc-butílico, dietilenglicol, metanol, W-metilpirrolidona, dimetilacetamida, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, piridina, tetrahidrofurano o combinaciones de los mismos; (ii) el lavado con disolvente mantiene la actividad de la proteína, y el disolvente se selecciona del grupo que consiste en acetona, acetonitrilo, dioxano, etanol, acetato de 2-metoxietilo, metoxietanol, etoxietanol, butoxietanol, 2-propanol, éter metílico de propilenglicol, etanodiol, 1,2-propanodiol, alcohol ferc-butílico, dietilenglicol y combinaciones de los mismos;
(iii) el precipitante se deseca mediante criodesecación en ausencia de lavado con disolvente o después del lavado con disolvente; o
(iv) el precipitado lavado con disolvente se mezcla directamente con la solución de polímero.
9. El método de la reivindicación 1, que comprende además:
(i) reducir el tamaño de los precipitantes mediante molienda en seco o en húmedo;
(ii) reducir el tamaño de los precipitantes mediante molienda en seco o en húmedo, en donde la temperatura de molienda se controla a la temperatura del dióxido de carbono solidificado o del nitrógeno líquido; o
(iii) reducir el tamaño de los precipitantes mediante molienda en húmedo del precipitado mezclado con acetato de nbutilo, dioxano, diclometano, acetato de etilo o combinaciones de los mismos.
10. Una composición farmacéutica, que comprende una pluralidad de micropartículas de polímero que encapsulan la toxina botulínica, formulada de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, en donde:
(i) la composición farmacéutica se dispersa en un diluyente que consiste en una solución acuosa de polímero termosensible;
(ii) la composición farmacéutica se dispersa en un diluyente que consiste en una solución acuosa de polímero termosensible, en donde la solución acuosa de polímero termosensible cambia de líquido a gel dentro del intervalo de 4 °C a 40 °C o de 20 °C a 38 °C;
(iii) la composición farmacéutica se dispersa en un diluyente que consiste en una solución acuosa de polímero termosensible, en donde el polímero acuoso termosensible se selecciona entre poli(láctido-co-glicólido)-bpoli(etilenglicol)-b-poli(láctido-co-glicólido), poli(láctido)-b-poli(etilenglicol)-b-poli(láctido), poli(láctido-cocaprolactona)-b-poli(etilenglicol)-b-poli(láctido-co-caprolactona), poli(caprolactona)-b-poli(etilenglicol)-bpoli(caprolactona), metoxi-poli(etilenglicol)-b-poli(caprolactona) o combinaciones de los mismos;
(iv) la composición farmacéutica se dispersa en un diluyente que consiste en una solución acuosa de polímero termosensible, en donde la solución acuosa de polímero termosensible se incluye a una concentración de entre el 5 % y el 40 % (p/v) en la solución acuosa;
(v) la composición farmacéutica se dispersa en un diluyente que consiste en una solución acuosa de polímero termosensible, en donde la solución acuosa de polímero termosensible se añade a la solución acuosa a una concentración de entre el 10 % y el 30 % (p/v);
(vi) la composición farmacéutica se dispersa en un diluyente que consiste en una solución formadora de gel o un gel; o
(vii) la composición farmacéutica se dispersa en un diluyente que consiste en una solución formadora de gel o un gel, y la solución formadora de gel es ácido hialurónico y el gel es ácido hialurónico reticulado.
12. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, en donde la toxina botulínica se selecciona del grupo que consiste en toxina botulínica de tipo A, B, C, D, E, F, G y mezclas de las mismas.
13. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 que comprende además uno o más agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico.
14. Una composición farmacéutica, que comprende:
(i) una pluralidad de toxina botulínica/albúmina precipitadas con Zn, formulada de acuerdo con el método de la reivindicación 1;
(ii) una pluralidad de toxina botulínica/albúmina precipitadas con Zn, formulada de acuerdo con el método de la reivindicación 1 dispersada en un diluyente que consiste en una solución acuosa de polímero termosensible; o (iii) una pluralidad de toxina botulínica/albúmina precipitadas con Zn, formulada de acuerdo con el método de la reivindicación 1 dispersada en un diluyente que consiste en un gel acuoso.
15. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 para usar en un método para tratar una o más enfermedades, trastornos o defectos cosméticos, que comprende la etapa de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 10 para reducir o prevenir uno o más síntomas de una enfermedad, un trastorno o defectos cosméticos en el sujeto;
opcionalmente, en donde una o más enfermedades, trastornos o defectos cosméticos que se van a tratar se seleccionan del grupo que consiste en cistitis hemorrágica, cistitis intersticial/síndrome de vejiga dolorosa, hematuria, urgencia urinaria, dolor suprapúbico, inflamación y retención urinaria, bizquera (estrabismo), parpadeo incontrolado (blefaroespasmo), rigidez/espasmos musculares, distoma cervical, tortícolis, sudoración incontrolable, arrugas no deseables, dolores de cabeza y migrañas.
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