KR20190042020A - 보툴리눔 독소의 효능 증대를 위한 생분해성 폴리머 제제 - Google Patents

보툴리눔 독소의 효능 증대를 위한 생분해성 폴리머 제제 Download PDF

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사라 미쉘 스키드모어
이병국
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아키나, 인크.
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Abstract

보툴리눔 독소와 같은 단백질 약물 전달용 생분해성 마이크로 파티클의 제제화 방법이 개발되었다. 상기 방법은 폴리머-용해된 유기 용매에 분산시키기 전에 유기 용매로 단백질을 침전시키고 세척하여 물/용매 계면에 노출되는 것을 방지하고 단백질 약물의 생체 활성을 유지하고 템플레이트 또는 에멀젼 방법으로 마이크로 파티클을 제조하는 단계를 포함한다. 보툴리눔 독소와 같은 하나 이상의 단백질 제제를 폴리머 중에 포획된 하나 이상의 생분해성 폴리머로 형성되는 생분해성 마이크로 파티클이 또한 제공된다. 침전된 보툴리눔 독소 및 보툴리눔 독소-로딩된 마이크로 파티클은 또한 서모겔 또는 가교화된 하이드로 겔로 제형화될 수 있다. 이들 마이크로 파티클 내의 단백질의 안정성뿐만 아니라 포획된 제제의 제어된 방출은 제제의 지속적인 효능을 제공한다.

Description

보툴리눔 독소의 효능 증대를 위한 생분해성 폴리머 제제
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2016.8.26.에 출원된 미국출원번호 62/380,229의 우선권을 주장하고, 이하 전체로 통합된다.
본 발명은 일반적으로 약물 전달 시스템, 특히 장시간 유효 기간 동안 보툴리눔 독소와 같은 불안정한 단백질 전달을 위한 생분해성 폴리머 제제 분야에 관한 것이다.
지난 수십 년 동안, 특히 구강 경로를 통해 장내 투여를 위해 수천 가지의 지속 방출 약물 전달 시스템이 개발되었다. 그러나 1989년 이래로 주사제 장기 투여 제제(즉, 최대 6 개월까지)로서 약제를 전달하기 위한 클리닉에서의 사용이 승인된 제품은 약 20 개에 지나지 않았다. 대부분의 주사용 디포 제제는 마이크로 파티클, 고형 임플란트 또는 원위치에서의 형성 임플란트의 형태로 존재하며 현재 임상 용도로 사용되는 모든 주사용 제제는 생분해성 폴리머를 사용하므로 전달 시스템을 나중에 제거할 필요가 없다.
지금까지 마이크로 파티클 제제를 제조하는 가장 널리 사용되는 방법은 이중 유화 공정이며(Ye, et al., Issues in long-term protein delivery using biodegradable microparticles, J. Control. Release, 156, pp. 241-260(2010)), 먼저 약물을 적합한 용매(약물 용해도에 따라 물 또는 유기 용매 중 어느 하나)에 용해시킨 다음, 용해된 폴리머를 함유하는 제 2 용매에 첨가하여 유 중수 또는 유 중 어느 하나를 만든다 유제. 그러나 단백질 약물의 경우 수용성 단백질이 물/용매 계면에 노출되면 변성되기 쉽기 때문에 고체 단백질 분말을 혼합하여 유제를 만드는 것이 일반적이다(Ye, et al., J. Control. Release, 156, pp. 241-260(2010)).
그러나, 이 유제 공정은 단백질 분말을 유기 폴리머 용액에 균일하게 분산시키기가 어렵기 때문에 제형화에 어려움이 따르며, 복잡한 제조 방법이 필요하다.
예를 들어, 재조합 인간 성장 호르몬 소마토프틴의 주사용 제형은 PLGA 마이크로 파티클로 제제화되고 NUTROPIN DEPOT®으로 시판된다. 소마트로핀은 분자량이 22,124 달톤인 191 아미노산 잔기의 단백질이다. NUTROPIN DEPOT®은 Alkermes 'PROLEASE® 공정에 의해 제조되었으며 1999 년 미국 식품의 약국(FDA)의 승인을 받았다. 그러나 NUTROPIN DEPOT®의 생산은 제조상의 어려움으로 2004 년에 중단되었다.
또한, 크기가 크고 이질적인 단백질 분말은 종종 기존의 방법을 사용하여 마이크로 파티클 제조에 적합하지 않게 만든다. 준비된 PLGA 마이크로 파티클의 최종 크기는 일반적으로 불균일하고 크기가 커서 주사를 위해 큰 지름의 바늘이 필요하다. 예를 들어, somatropin(NUTROPIN DEPOT®으로 판매), triptorelin(TRELSTAR®로 판매) 및 risperidone(RISPERIDAL CONSTA®로 판매)의 마이크로 파티클 제형은 외경이 0.813mm(즉, 21 게이지 이하) 인 바늘이 필요하다. 나트 렉손(VIVITROL®으로 시판)의 장시간 주사용 제제의 전달은 외경이 0.902mm(즉, 20 게이지) 인 바늘을 필요로한다. 이와 비교하여, 인슐린의 전달은 전형적으로 외경이 0.356mm 이하(즉, 28 게이지 이상) 인 바늘을 필요로한다.
마이크로 파티클 또는 보다 큰 크기의 고체 임플란트 이외에, 원위치 형성 폴리머 용액이 장기 약물 전달에 사용되어 왔다(Dunn, et al., Biodegradable in-situ forming implants 및 이를 제조하는 방법, 미국 특허 제 4,938,763 호(1990) Dunn and Yarborough, 커플 링 주사기 시스템 및 혼합 조성물을 얻는 방법, 미국 특허 제 8,226,598 호(2012)). 예를 들어, 약물 및 PLGA를 N-메틸-2-피롤리돈(NMP)과 같은 유기 용매에 용해시키고 약물-PLGA 용액을 체내에 주입한다. 이어서, 용매를 생체 내에서 제제로부터 주변 조직으로 제거하여 겔 또는 고체 생분해성 제제를 남긴다.
그러나 원위치 겔(in-situ gel) 형성 방법은 단백질처럼 3 차 구조를 가지고 있지 않은 작은 분자 약물과 펩타이드 약물에 대해서만 사용되어왔다.
약물의 장시간 방출을 위해 PLGA 마이크로 파티클을 제형화하는 현재의 제조 방법은 단백질 약물에 대해 몇 가지 단점을 가지고있다. 고려해야 할 요소는 단백질의 생물학적 활성을 유지하는 것이 중요하다. 단백질의 생물학적 활성을 유지하는 것이 중요하다. 온도의 변화, 용제-물 계면에 대한 노출, 또는 제조 공정 전반에 걸친 수-공기 계면에의 노출에 의해 쉽게 변성 될 수 있다. 결과적으로, 많은 단백질 약물은 통상적 인 제조 방법에서 통상적으로 사용되는 공정에 노출된 후에 효능이 감소한다.
대표적인 단백질 약물은 보툴리눔 독소이다. 보툴리누스 독소는 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔에 의해 생성된 매우 강력한 신경독이다. 약학적으로 허용되는 양의 보툴리눔 독소가 치료 및 미용 목적을 위해 확립되었고, 생물 의학 및 화장품 산업에서 응용의 수가 증가하고있다. 보툴리눔 독소는 사시, 안면 경련 및 반 면제 경련뿐만 아니라 통증, 요로 장애, 전립선 기능 장애, 만성 편두통, 발한 등의 치료를위한 과도한 활동성 골격근을 특징으로 하는 신경근 질환 치료를 위해 미국 FDA의 승인을 받았다. 보툴리눔 독소는 주름 및 미간 칙칙한 선의 외관을 개선하기 위해 화장품 용도에도 사용됩니다. 보툴리눔 독소의 근육 내 주사 효과는 일반적으로 투여 후 며칠 내에 투여 량에 따라 발생한다. 전형적으로, 보툴리눔 독소는 0.9 % 염화나트륨과 같은 건조 분말의 재구성에 의해 수용액으로 제형화되어 의료용 또는 화장품 용으로 사용된다. 그러나, 이 방법으로 제형화된 보툴리눔 독소를 근육 주사 1 회 투여한 경우의 전형적인 증상 완화 기간은 투여 후 평균 약 3-4 개월이다. 보툴리누스 독소의 의학적 또는 미용적 적용의 부작용을 경험할 위험이 관리되는 양이 증가함에 따라 증가하기 때문에, 투여 량 및 투여 방식은 현재 인간에서 사용하기 위한 보툴리눔 독소의 유효 기간을 제한한다. 보툴리누스 독소의 독성 증상으로는 메스꺼움, 걷기 및 삼키는 것이 어려울 수 있으며 호흡 근육의 마비로 진행될 수 있으며 심장 마비로 진행될 수 있다. 현재 사용 가능한 것보다 독소의 영향을 오래 유지하기 위해 새로운 전달 시스템을 사용할 수 있다면 다양한 응용 분야에 독소를 사용하면 얻을 수 있는 이점이 커진다. 따라서, 보툴리눔 독소와 같은 단백질 약물의 생체 활성을 유지하는 개선된 연장 방출 제형을 제조하는 개선된 방법에 대한 필요성이 존재한다.
매우 조절된 약물 동력학 및 장시간 방출로 전달하기 위해 보툴리눔 독소와 같은 고효율 단백질을 지속 전달 시스템, 예를 들어 마이크로 파티클 및 겔로 제형화하는 개선된 방법이 또한 필요하다. 대부분의 방법은 균일한 방출을 얻기 위해 입자 전체에 활성 성분을 균일하게 분산시킬 것을 요구한다. 이것은 단백질이 매우 활성 인 경우에 문제가 되며, 따라서 매우 적은 양이 입자에 통합됩니다. 상업적으로 이용 가능한 모든 보툴리눔 독소의 용량은 생물학적 활성 단위로 표시됩니다. 보툴리눔 독소 1 단위는 Swiss-Webster 암컷 마우스에서 계산된 중간 복강 내 치사량(LD50)에 해당한다. BOTOX®(Allergan)는 보툴리눔 독소 타입 A의 무균 동결 건조된 형태이다. 이것은 보툴리누스 홀 변형균의 배양물에서 생산되어 일련의 산 침전물에 의해 독소 및 기타 단백질을 함유한 결정질 복합체로 정제됩니다. BOTOX®의 특정 활성은 신경 독소 단백질 복합체 약 20 단위/나노 그램이다. BOTOX®의 각 바이알에는 방부제가 없는 멸균된 진공 건조된 형태로 클로스트리디움 보툴리눔 A 형 신경독 복합체 100 단위(U), 알부민(인간) 0.5 밀리그램 및 염화나트륨 0.9 밀리그램이 들어 있다. 보툴리눔 독소의 특정 활성은 유형 및 제조 방법에 따라 달라지며, 따라서 상이한 제형은 상이한 특정 활성을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 단백질 약물의 장시간 방출을 위한 폴리머 전달 시스템, 예를 들어 마이크로 파티클 및 겔의 제형을 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 단백질 활성제의 생물학적 활성에 최소한의 또는 영향을 미치지 않는 단백질 활성제의 제어된 방출을 위한 전달 시스템의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 현재의 수용액 제제에 의해 달성된 시간보다 더 긴 시간 동안 보툴리눔 독소를 전달하기 위한 마이크로 파티클을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 보툴리눔 독소의 생체 활성을 유지하고 생체 내에서 그의 효능을 연장시키는 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 단일 투여 후에 단백질 활성제의 숙주 대상으로의 지속 방출을 위한 조성물, 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
보툴리눔 독소와 같은 강력한 단백질 또는 펩타이드 활성제의 전달을 위해 폴리머 마이크로 파티클을 제형화하는 방법이 개발되었다. 전달 될 단백질은 전형적으로 소량의 단백질만을 필요로 하는 치료적, 예방적 또는 진단적 활성을 가질 것이다. 상기 방법은 단백질 활성제의 생물학적 활성을 유지하고 생체 내 효능을 향상시키기 위해 단백질의 제어 방출을 촉진한다. 이 방법은 또한 마이크로 파티클 내 활성의 균일한 분산을 용이하게 하는 안정화 부형제의 현명한 조합을 통해 약물 동력학을 개선함으로써 방출의 조절 및 지속 기간을 현저히 개선한다.
폴리머 마이크로 파티클에 의한 전달을 위한 예시적인 단백질 활성제는 매우 강력한 독소이며 원하는 약물 동력학에 따라 방출을 위해 캡슐화하기 어렵다는 것이 유명한 보툴리눔 독소이다. 마이크로 파티클로 제형화할 수 있는 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C, D, E, F, G 및 이들의 혼합물을 포함한다. 바람직한 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A 및 B이다. 보툴리눔 독소와 같은 활성제의 나노 스케일 양이 임상적 적용에 요구되는 바람직한 실시예에서, 활성제는 캡슐화 전에 불활성 벌크화제와 혼합된다. 예시적인 단백질 벌크화제는 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)이다. 놀랍게도, 소량으로 존재하는 보툴리눔 독소는 HSA와 혼합하고, 그 활성을 유지하며, 후술되는 바와 같이 실시 될 경우 마이크로 파티클 내에 균일하게 분산된다.
전형적으로, 상기 방법은(a) 탈수된 단백질을 수용액에서 혼합하여 단백질 용액을 형성하는 단계;(b) 침전제를 형성하기 위해 용액으로부터 단백질을 침전시키는 단계;(c) 침전제를 세척 용매로 1 회 이상 세척하여 용매 세척된 침전제를 형성하는 단계;(d) 용매-세척된 침전제를 폴리머를 함유하는 용액에 혼합 또는 분산시켜 폴리머-단백질 용액을 형성하는 단계; 및 (e) 에멀젼 용액으로 유화시켜 폴리머-단백질 용액으로부터 단백질을 캡슐화하는 폴리머 마이크로 파티클을 제조하는 단계를 포함한다. 침전된 단백질을 용매로 세척하는 것은, 특히 보툴리눔 독소에 대해, 원하는 균일한 캡슐화 및 조절된 방출을 얻는 데 중요하다는 것이 밝혀졌다. 예시적인 세척 용매는 아세톤, 아세토 니트릴, 디옥산, 에탄올, 2-메톡시 에틸 아세테이트, 메톡시 에탄올, 에톡시 에탄올, 부톡시 에탄올, 2-프로판올, 프로필렌 글리콜 메틸 에테르, 에탄디올, 1,2-프로판디올, 3차-부틸 알코올, 디에틸렌글리콜 및 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 에멀젼 용매는 벤질 알콜, n-부틸 아세테이트, 클로로포름, 디옥산, 디클로로 메탄, 에틸 아세테이트, 에틸 포르메이트, 메틸 포르메이트, 페네틸 아민, 트리아세틴 및 이들의 조합 물을 포함한다. 바람직한 에멀젼 용매는 디옥산 및 디클로로 메탄의 조합이다.
예시적인 생체 적합성 폴리머는 폴리(락티드), 폴리(글리콜라이드) 및 폴리(락티드-코-글리콜라이드), 폴리 카프로락톤, 폴리 에스테르 아미드, 폴리 안하이드라이드, 폴리(아미노산), 폴리 오르토 에스테르, 폴리시아 아크릴레이트, 폴리(p-디옥사논), 폴리(알킬렌옥살레이트), 생분해성 폴리 우레탄, 이들의 블렌드 및 공중합체. 바람직한 생분해성 폴리머는 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA로도 알려진 폴리(락티드-코-글리콜리드)이다. 일부 실시예에서, 폴리머의 분자량 및 락티드:글리콜라이드(L:G) 비는 갇힌 활성제의 방출 동력 및 방출 지속 시간과 같은 마이크로 파티클의 물리적 특성에 영향을 주기 위해 선택된다.
상기 방법에 따라 제형화된 마이크로 파티클가 또한 제공된다. 입자는 직경이 적어도 1 미크론이고, 단백질 치료제, 예방제 또는 진단제를 폴리머에 포획된 하나 이상의 생분해성 폴리머로 형성된다. 바람직한 실시예에서, 마이크로 파티클은 보툴리눔 독소, HSA 및 PLGA를 포함한다. 전형적으로, 마이크로 파티클와 관련된 보툴리눔 독소의 양은 약 1 단위 내지 약 5,000 단위의 보툴리눔 독소이며, 예를 들어 마이크로 파티클와 관련된 보툴리눔 독소의 양은 약 10 단위 내지 약 3,000 단위의 보툴리눔 독소 A, 약 10 단위 내지 약 3,000 단위의 보툴리눔 독소 B, 또는 둘 다. HSA와 같은 담체의 양은 일반적으로 보툴리눔 독소보다 훨씬 더 높습니다. 예를 들어, 100 단위의 보툴리눔 독소가 0.5-1.0 mg의 HSA로 희석됩니다.
일부 예에서, 생분해성 폴리머 제제는 의도된 효과를 생성하기 위해 초기 양으로 약물을 전달하고이어서 원하는 시간 동안 효과를 유지하기 위해 원하는 기간 동안 약물을 계속 방출한다. 전형적으로, 입자는 마이크로 미터 또는 서브 마이크로 미터 범위의 크기를 갖는다.
질병, 장애 또는 미용 결손은 유효량의 마이크로 파티클을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하여 대상의 질병, 장애 또는 미용 결핍의 하나 이상의 증상을 감소 시키거나 예방함으로써 치료된다. 마이크로 파티클 제형은 바람직하게는 주사 투여된다. 전형적으로, 폴리머성 마이크로 파티클은 당량의 약물을 함유하는 수용액 제제의 생물학적 활성보다 포획된 단백질의 생물학적 활성을 향상시킨다.
보툴리눔 독소를 용출하는 마이크로 파티클은 근육 경직/경련 또는 운동 장애(자궁 경부 근긴장 이상증, 사경근 운동) 치료, 통제할 수 없는 발한 치료, 주름의 미용적 외관 개선, 매우 빈번한 편두통 환자의 두통 예방에 사용할 수 있다.
도 1은 상이한 분자량을 갖는 PLGA를 포함하는 78 개의 상이한 마이크로 파티클 제제 각각에 대해, 상이한 락티드:글리콜라이드(L:G) 비율 및 상이한 말단 그룹을 의미한다.
도 2는 수용액(대조군;(-))과, 0.3(▲,■), 0.6(x, ●), 1.5(□), 3(Δ), 6(○) 단위/주사를 함유하는 PLGA 마이크로 파티클로 전달된 보툴리눔 독소의 주사 후 시간(일)에 대한 디지트 어브덕션 스코어(digit abduction score,DAS) 분석 반응(0-4)을 보여주는 선 그래프이고, 사용된 PLGA는 디클로로 메탄(DCM)에 용해된 L:G = 75:25, 107,000 Da 및 15 %(w/v)이었다.
도 3은 수용액(대조군;(-)) 및 0.5(◇),0.6(□), 0.75(△), 1(○) 단위/주사를 함유하는 PLGA 마이크로 파티클로 전달된 보툴리눔 독소의 주사 후, 시간(일)에 대한 DAS 분석 응답(0-4)을 나타내는 선 그래프이다. 사용된 PLGA는 디클로로 메탄(DCM)에 용해된 L:G = 75:25, 107,000 Da 및 15 %(w/v)이었다. 0.75와 0.50 단위에 사용된 PLGA는 L:G = 60:40과 120,000Da이고, 1 및 0.6 단위에 사용된 PLGA는 L:G = 85:15와 150,000Da이었다.
도 4는 수용액(대조군;(△/○)) 및 4 단위/주사(□)를 함유한 서모겔(Akina PolySciTech의 AK097)에 분산된 PLGA 마이크로 파티클에 아연-침전된 보툴리눔 독소/알부민의 주입 후, 시간(일)에 대한 동안의 DAS 분석 응답(0-4)을 보여주는 선 그래프이다. AK097은 중량 평균 분자량(Mw)이 6,300 Da 인 PLGA 및 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), PLGA-PEG-PLGA 트리블록 공중합체의 트리블록 공중합체이다. PLGA 마이크로 파티클은 PLGA 85:15, 24,000 Da, 5 %(w/v)에서 독소/알부민(5 %)으로 채워진 PLGA 50:50, 44,000 Da, 7 %(w/v) PLGA 85:15, 24,000 Da, 20 %(w/v)로 덮여있다.
도 5는 각각 1 단위 및 0.5 단위을 갖는 수용액에서 전달된 아연-침전 보툴리눔 독소/알부민의 주사 후(대조;(△/○)), 그리고 2(●) 및 3(□) 단위/주사를 함유하는 서모 겔 A 및 2(▲) 및 3(□) 단위/주사를 함유하는 서모 겔 B에 각각 전달된 아연-침전된 독소/알부민을 주사후, 시간(일)에 대한 DAS 분석 응답(0-4)을 나타내는 선형 그래프이다. 서모 겔 A 및 B는 6,400 Da의 동일한 Mw를 가지나 27.5 ℃ 및 30.0 ℃의 열-겔화 온도를 각각 갖는 AK 019 및 AK091 PLGA-PEG-PLGA 트리 블록 공중합체이다.
I. 정의
"유효량" 또는 "적절한 양"이라는 용어는 증상이나 특정 상태 또는 장애의 측정가능한 개선 또는 예방 효과를 가져 오거나 예상 수명을 연장시키거나 환자의 삶의 질을 전반적으로 향상시키는 데 필요한 최소 농도이다. 유효량은 특정 생물학적 활성 분자 및 치료할 특정 상태 또는 장애에 좌우된다. 보툴리눔 독소(botulinum toxin) 또는 모노클로날 항체와 같은 많은 단백질의 유효량은 당업계에 잘 알려져 있다.
"중간 유효 투여량"은 그것을 취하는 개체군 50 %에서 양적 효과(전부 또는 전무)를 낳는 투여량 (50 % 개체군 기준을 나타내는 중앙값)입니다. 또한 ED50으로 줄여서 사용하는 경우도 있는데, 이는 "약물을 수용한 사람의 50 %에게 유효 복용량"을 의미합니다. ED50은 일반적으로 약물 효과의 합리적인 기대치의 척도로 사용되지만 임상가가 사용할 수 있는 투여량을 나타내는 것은 아니다. 이것은 효능과 독성에 달려 있다. 약물의 독성과 치사율은 각각 TD50과 LD50에 의해 정량화될 수 있다. 이상적으로는, 유효량은 약물이 치료적으로 관련성이 있기 위해 독성 또는 치사량보다 실질적으로 적을 것이다.
"서모겔(thermogel)", "감열성 폴리머(thermosensitive polymer)" 및 "열 응답성 폴리머(thermoresponsive polymer)"라는 용어는 서로 바꾸어 사용할 수 있으며 실내 온도나 냉장고 온도와 같이 저온에서 수용액에 용해된 상태로 유지되지만, 고온, 예컨대 30℃ 또는 체온 에서는 겔 상태로 침전하는 고분자를 의미한다. 서모겔은 전형적으로 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 PLGA와 같은 친수성 및 소수성 블록으로 구성된 블록공중합체이다. 두 블록 사이의 균형은 겔화 온도, 즉 수용액이 겔이 되는 온도를 결정한다.
여기에서 사용된 "치료" 또는 "치료하는"은 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상의 중증도 또는 발병을 감소시키기 위해 질환, 장애 또는 미용 결손을 갖는 대상 또는 시스템에 조성물을 투여하는 것을 의미한다. "예방" 또는 "예방"은 주름과 같은 질병, 장애 또는 미용상 결함이 있는 대상 또는 시스템에 조성물을 투여하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "마이크로 파티클(microparticles)"은 1 마이크론 내지 400 마이크론, 전형적으로 200 마이크론 미만, 보다 전형적으로 150 마이크론 미만의 직경을 갖는 입자를 지칭하며, 가장 바람직하게는 본원에서 직경 100 마이크론 미만 범위에 있는 입자를 지칭한다. 미소 입자는 별도로 명시하지 않는 한 마이크로 캡슐, 마이크로 캐리어, 마이크로 비히클, 마이크로 구조, 마이크로 구체를 포함한다.
"생체 적합성"이란 용어는 그 자체가 숙주(예: 동물 또는 인간)에 대하여 독성이 아니며 또한 숙주에서 독성 성분을 방출하기 위해 분해되지 않는 하나 이상의 물질을 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 캐리어"라는 용어는 용매, 분산 매질, pH 완충제, 불활성 벌크 화제, 및 일반적으로 안전하다고 간주되는 미국 FDA (즉, "GRAS")에 의해 열거된 것과 같은, 다른 물질을 포함한다.
II. 마이크로 파티클
전형적으로, 마이크로 파티클은 (1) 하나 이상의 생분해성 폴리머(들); 및 (2) 하나 이상의 불안정한 활성제를 포함한다. 마이크로 파티클은 선택적으로 하나 이상의 추가적인 활성제 및/또는 약학적으로 허용가능한 부형제로 임의로 제형화된다.
일부 형태에서, 생분해성 폴리머는 2 종 이상의 상이한 폴리머의 혼합물을 형성하도록 선택된다. 예를 들어, 일부 형태에서, 생분해성 폴리머는 결합될 때 특정 기능 특성을 나타내기 위해 선택된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 2 종 이상의 생분해성 폴리머가 조합되어 감열성 또는 감열성 마이크로 파티클을 형성한다.
마이크로 파티클은 합성 폴리머(예컨대, PLGA) 및 천연 폴리머(예컨대, 히알루론산)의 다양한 폴리머를 사용하여 제조될 수 있다. 분자량, 락티드:글리콜라이드(L:G) 비 및 상대 농도와 같은 폴리머의 구조 파라미터는 용액-겔 전이 온도, 분해 동역학(예:생체내 분해 시간), 단백질-적재 효능 및 생체 반응(예:생체내 독성 및 면역 반응)과 같은 요구되는 기능을 제공하기 위하여 선택된다.
생분해성 PLGA 마이크로 파티클은 피하 또는 근육내 투여 후에 생체내에서 일, 주 또는 월에 걸쳐 분해 및 방출을 조절하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 알부민 방출에 의해 측정된 마이크로 파티클로부터의 단백질 방출(즉, 생체내 전달)은 L:G 비의 함수이다. 다른 실시예에서, 마이크로 파티클로부터 단백질의 방출은 하나 이상의 인자에 의해 조절된다. 일부 실시예에서, 에멀젼 방법에 따라 제형화된 마이크로 파티클로부터 단백질의 방출은 용매 조성물 및 L:G 비 및 사용된 폴리머의 분자량 양자에 의해 결정된다.
일부 실시예에서, 단백질의 방출은 연속적인 방식으로 일어난다. 다른 실시예에서, 단백질의 방출은 2 상 또는 다중 상 방식으로 일어난다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 초기 버스트(burst) 방출은 PLGA의 락티드 함량이 증가함에 따라 감소한다. 추가의 실시예에서, 전체 방출 속도는 마이크로 파티클 제조에 사용된 용매에 좌우된다.
마이크로 파티클을 제조하는데 사용되는 폴리머의 분자량은 원하는 폴리머 특성을 갖는 마이크로 파티클을 제공하기 위하여 선택될 수 있다. 폴리머 마이크로 파티클은 바람직하게는 약 1,000 달톤(Da) 내지 1,000,000 Da(1,000,000 달톤)의 중량 평균 분자량(Mw)을 갖는 폴리머로부터 제형화된다.
분자량에 따라 변할 수 있는 폴리머의 예시적인 물리적 특성은 온도-감도(temperature-sensitivity)이다. 예를 들어, 폴리머는 고체 또는 액체로서 존재할 수 있거나 폴리머의 분자량 및 조성물에 의해 결정된 주어진 온도에 따라 고체 상태에서 액체 상태로 전이할 수 있다. 주어진 온도 범위와 관련된 용액-겔 전이 점을 갖는 폴리머 및 폴리머의 조성물은 서모겔(서모겔들)이라고 한다. 일부 실시예에서, 서방형 전달 시스템을 제형화하는데 사용되는 폴리머는 폴리머의 겔화 온도에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 열감응 폴리머의 용액-겔 전이 온도는 서모 겔을 제형하는데 사용되는 하나 이상의 폴리머의 함수이다. 일부 실시예에서, 상이한 겔화 온도를 갖는 둘 이상의 폴리머를 조합하여 원하는 용액-겔 전이 온도를 갖는 서모겔을 형성할 수 있다. 예시적인 겔화 온도는 0 ℃ 이상 및 전형적으로 4 ℃ 이상, 예컨대 10 ℃ 또는 10 ℃ 초과 내지 40 ℃ 또는 40 ℃ 초과이다. 바람직한 실시예에서, 마이크로 파티클은 37 ℃ 이하와 같이 건강한 사람의 전형적인 체온 이하의 겔화 온도를 갖도록 제형화된다.
서모겔로서 사용하기 위한 예시적인 폴리머는 PLGA-PEG-PLGA 블록 공폴리머, 예를 들어 하기 표 1에 제시된 것을 포함한다.
Figure pct00001
Tsol-gel: 졸-겔 전이 온도; PDLL:폴리(DL-락티드); P(LCL):폴리(락티드-co-카프로락톤); mPEG:메톡시 PEG; PCL:폴리카프로락톤; PLLGA-PEG-PLLGA:PLGA-PEG-PLGA에서의 L-키랄 락티드 및 그렇지 않으면 DL 라세믹; CL:L:카프로락톤:락티드. AK 시리즈 폴리머는 Akina PolySciTech 사의 것임.
서모겔로서 사용하기 위한 폴리머는 Akina PolySciTech(West Lafayette, IN)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 건조된 서모겔 폴리머의 물속 용해는 보통 하루는 걸리지만 소량의 생체적합성 수혼화성 용제를 첨가하면 빠르게 진행될 수 있다. 특히, 저 분자량의 폴리(에틸렌 글리콜)의 첨가는 물에서 후속 가용화 속도를 개선하기 위해 건조된 폴리머에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 폴리(락티드-co-카프로락톤)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(락티드-co-카프로락톤)(Akina의 AK109)에 PEG 400 Da를 25:75의 비율로 첨가하면, PolySciTech)는 수성 용해 시간을 1 일 이상에서 2 시간까지 감소시켜 열분해 용액을 생성할 수 있다.
B. 치료, 예방 및 진단제
치료용, 예방용 및 진단용 약제는 입자로 캡슐화될 수 있다. 이들은 단백질 또는 펩타이드, 핵산, 지질, 당 또는 다당류, 작은 분자(전형적으로 1,000 Da 미만의 분자량), 또는 이들의 조합일 수 있다. 특히 가수 분해가 불안정한 불안정한 약제에 특히 적합하다.
이 방법은 주로 보툴리눔 독소에 적용된 것으로 테스트되었지만, 다른 생물학적 및/또는 인간 성장 호르몬(rHGH), 인간 인슐린, 난포-자극 호르몬(FSH), 에리트로포이에틴(EPO), 과립구집락 자극인자(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)과 같은 거대 분자 기반 치료 물질에 적용 가능하다. 알파-갈락토시다아제 A, 알파-L-이두로니드아제, 조직 플라스미노겐 활성제(TPA), 플루코스레브로시다아제, 인터페론, 인슐린 유사 성장 인자, 항체, 사이토카인 및 백신을 포함한다. 또한 펩타이드, 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 침묵 리보핵산(siRNA) 뿐만 아니라 기타 불안정한 물질. 이러한 제제는 폴리머 마이크로 파티클에 혼입되기 전에 담체 단백질과 함께 공-침전될 수 있다. 선택되는 치료제에 기초하여, 생성된 제제는 광범위한 범위의 치료, 예방 및/또는 진단용도로 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 오직 하나의 활성제 만이 약물 용출 마이크로 파티클에 혼입된다. 일부 실시예에서, 둘 이상의 단백질 활성제가 동일한 약물 용출 마이크로 파티클 내에 혼입된다. 다른 실시예에서, 하나 이상의 단백질 활성제 및 하나 이상의 비 단백질 활성제가 동일한 약물 용출 마이크로 파티클 내에 혼입된다.
일반적으로, 생체적합성 마이크로 파티클을 제조하는 방법은 마이크로 파티클에 의해 전달될 캡슐화된 단백질 제제의 구조에 어떠한 제한도 부과하지 않는다. 예를 들어, 마이크로 파티클 내에 제제화된 단백질은 3,000 Da 내지 1 백만 Da 또는 그 이상의 질량을 가질 수 있으며, 임의의 아미노산 서열일 수 있다.
생물학적 활성제는 예를 들어 질병 또는 장애의 치료, 예방, 진단, 치료 또는 완화에 사용되며, 신체, 부위 또는 부위의 구조 또는 기능에 영향을 미치거나 생물학적으로 활성을 나타내는 물질이다 또는 소정의 생리적 환경(예를 들어, 프로드러그)에 노출시 더욱 활성을 나타낸다. 약제는 인간 또는 동물의 몸에서 국소적으로 또는 전신적으로 작용하는 생물학적, 생리학적 또는 약리학적 활성 물질일 수 있다.
활성제 대 폴리머 비율(폴리머 1mg 당 활성제의 단위 또는 mg)은 활성제의 총 투여량, 효능 및 방출 속도를 조절하도록 제어될 수 있다. 적합한 폴리머 대 활성제 비율은 1000:1,100:1, 10:1, 1:1(폴리머 1mg 당 활성제의 단위)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 비율은 약 100 단위 보툴리눔 독소:1 밀리그램의 마이크로 파티클이다.
바람직한 생체 활성 제제는 단백질 약물과 같은 폴리 펩타이드이다. 기술된 마이크로 파티클에 혼입될 수 있는 예시적인 단백질 약물은 보툴리눔 독소를 포함한다.
1. 보툴리눔 독소
기술된 약물 용출 마이크로 파티클과 함께 사용하기 위한 바람직한 단백질 약물은 혐기성 그람 양성 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔 및 관련 종에 의해 생성된 보툴리눔 신경 독소이다.
보툴리눔 독소는 약 150,000 g/mol의 몰 질량을 가지며(중쇄 및 경쇄 독소 만 해당) 보툴리눔 중독이라고 하는 인간과 동물에서 신경 마비 질환을 일으키는 강력한 신경 독성 물질이다. 복합물 형태의 보툴리눔 독소의 분자량은 약 600,000 내지 900,000 g/mol의 분자량을 갖는다.
보툴리눔 중독의 효과는 C. 보툴리눔균 배양체 또는 포자에 감염된 식품을 섭취한 후 18 시간에서 36 시간 후에 나타난다. 보툴리눔 독소는 분명히 내장의 안쪽을 통해 약화되어 말초 신경 운동 뉴런을 공격할 수 있다. 보툴리눔 독소 중독의 증상으로는 메스꺼움, 보행 장애 및 삼키는 증상이 포함될 수 있으며 호흡 근육의 마비, 심장 마비 및 사망으로 진행될 수 있다.
신경 전달 물질은 뉴런의 세포질 내 시냅스 소포에 포장된 다음 소포가 원형 막과 도킹 및 융합하는 내부 원형질막으로 운반된다. 막 융합의 탐침으로 클로스트리디움 신경 독을 사용하는 신경 세포의 연구는 시냅스 소포와 신경 세포의 세포 막의 융합이 소포 또는 표적 막과 관련된 특정 단백질의 존재에 의존한다는 것을 밝혀냈다. 이 단백질들은 SNAREs라고 불린다. 시냅토브레빈(synaptobrevin) 또는 VAMP(vesicle-associated membrane protein; 소포-관련 멤브레인 단백질)라고도 불리는 단백질은 소포-관련 SNARE(vesicle-associated SNARE; v-SNARE)이다. 시냅토브레빈에는 적어도 두 개의 동형(isoform)이 있다. 이 두 가지 동형은 포유류의 중추 신경계에서 차별적으로 발현되며, 신경 내분비 세포의 뉴런 및 분비 기관에서 시냅스 소포와 선택적으로 연관되어있다. 표적 멤브레인-관련 SNARE(t-SNARES)는 신택신(syntaxin) 및 SNAP-25를 포함한다. 도킹 후, VAMP 단백질은 신택신(syntaxin)과 SNAP-25와의 핵심 복합체를 형성한다. 코어 복합체의 형성은 막 융합에 필수적인 단계인 것으로 보인다(Neimann, et al., Trends in Cell Biol.4:179-185(1994)).
보툴리눔 독소를 함유하는 다양한 PLGA 제형이 기술되었지만, PLGA 마이크로 파티클 내에 캡슐화된 보툴리눔 독소의 효능은 입증되지 않았다(Donovan, Botulinum toxin implant, 미국 특허 제 6312708 호(2001 년), Donovan, 생분해성 보툴리눔 독소 이식, 미국 특허 제 6,506,399 호 Donovan and Brady, Neurotoxin implant, 미국 특허 6,306,423(2001), Donovan and Brady, 생분해성 신경독 임플란트, 미국 특허 6,383,509(2002), Donovan and Brady, Controlled neurotoxin system, 미국 특허 6,585,993(2003), Hughes and Olejnik, Stabilized biodegradable neurotoxin implants, 미국 특허 7,691,381(2010), Hughes and Olejnik, Stabilized biodegradable neurotoxin implant, 미국 특허 8,501,187(2013)).
BOTOX®, DYSPORT®, XEOMIN®은 알부민 및 기타 부형제가 함유된 동결 건조 정제 보툴리눔 독소이다. 시판되는 보툴리눔 독소는 의학 및 화장품 용도로 사용된다. A 형 보툴리눔 독소는 클로스트리듐 보툴리눔의 홀 균주(Hall strain)의 배양 물로 만들어진다. 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 일련의 산 침전물에 의해 정제되고 진공 건조 전에 염분 및 알부민을 함유하는 용액에 재용해되는 결정질 복합체로 정제된다. 진공 건조된 제품은-4℃ 또는 그 이하의 냉동고에 보관하다. BOTOX®, DYSPORT®, XEOMIN® 및 기타 제품은 근육 내 주사 전에 멸균되고 보존되지 않은 수용액으로 재구성될 수 있다. BOTOX®의 각 바이알에는 방부제가 없는 멸균된 진공 건조된 형태로 클로스트리둠 보툴리눔 독소 A 형 정제된 신경 독 복합체, 0.5 밀리그램의 인간 혈청 알부민 및 0.9 밀리그램의 염화나트륨 약 100 단위(U)가 들어 있다.
진공 건조된 BOTOX®를 재구성하기 위해 방부제가 없는 멸균 생리 식염수(0.9 % 염화나트륨 주입액)를 적정량의 희석액을 적절한 크기의 주사기에 넣고 사용하다. BOTOX®는 버블 링 또는 이와 유사한 격렬한 교반으로 변질될 수 있으므로 희석제는 유리 병에 부드럽게 주입된다. 살균 이유 때문에 BOTOX®는 바이알을 냉동고에서 꺼내어 재구성한 후 4 시간 이내에 투여하는 것이 바람직하다. 이 4 시간 동안 재구성된 BOTOX®는 약 2 ℃에서 약 8 ℃의 냉장고에 보관할 수 있다. 재구성된 냉장 BOTOX®는 2 주 이상 유효하다. Neurology, 48:249-53:1997.
클로스트리디움 보툴리눔의 포자는 토양에서 발견되며 보툴리눔 중독의 사례의 많은 원인 인 가정용 통조림 공장의 부적절하게 멸균되고 밀폐된 식품 용기에서 자랄 수 있다.
보툴리눔 독소는 여러 상업적 출처에서 구할 수 있다. List Biological Laboratories, Inc.(Campbell, CA)로부터 입수 가능한 클로스트리디움 보툴리눔으로부터의 타입 A 복합체. 독소는 용해성이며 100 mg는 적절한 수성 완충액 1 mL에 쉽게 용해된다. 보툴리눔 독소 용액을 분취하여 냉동 보관할 수 있다.
2. 기타 단백질 활성제
마이크로 파티클은 호르몬, 항체, 성장 인자, 사이토 카인, 면역 조절제, 인테그린 및 독소를 전달할 수 있다. 단백질 활성제의 포괄적인 목록은 Leader, et al.(Nature Reviews Drug Discovery(7) pp. 21-39(2008) 및 그 참고 문헌)에서 제공되며, 그 내용은 참고로 포함된다.
기술된 방법을 사용하여 폴리머 마이크로 파티클로 제제화되거나 재 형성될 수 있는 예시적인 단백질 약물은 소마트로핀(NUTROPIN DEPOT®)을 포함한다. 예시적인 펩타이드 약물은 루푸로라이드(LUPRON DEPOT® 및 ELIGARD®), 고세렐린(ZOLADEX®DEPOT), 옥토라이드(SANDOSTATIN LAR® DEPOT), 트립토레린(TRELSTAR DEPOT®), 부세레린(Buserelin)(SOMATULINE® DEPOT), 엑세나티드(BYDUREON®) 및 파지레오티드pasireotide(SIGNIFOR® LAR)가 포함된다.
기술된 방법에 따라 제형화될 수 있는 폴리머 마이크로 파티클로 제제화될 수 있는 기타 단백질 약물은 인슐린 및 인슐린 유사체, 성장 호르몬 소마토프틴, 메카 세트르틴, 베타-글루코-셀레시다제, 알글루코시다아제-알파, 아데노신 데아미나제, 에리트로포이에틴, 인터페론, L-아스파라기나제 및 라니비주맙(예:LUCENTIS®).
베바시주맙(예:AVASTIN®), 세툭시맙(예:ERBITUX®), 파니투무맙(예:VECTIBIX®), 알렘투주맙(예:CAMPATH®), 리툭시맙(예:RITUXAN ®) 및 트라스투주맙(예:HERCEPTIN®).
면역 조절 단백질 치료제의 비제한적 목록에는 아바타셉트(ORENCIA®), 아나킨라(ANTRIL®, KINERET®), 아디리무맙(HUMIRA®), 에타너셉트(ENBREL®), 인플릭시 맙(REMICADE®), 알에이셉트바실리시맙(SIMULECT®), 다클리즈맙(ZENAPAX®) 및 뮤로납-CD3(ORTHOCLONE®, 아드레날린) OKT3®이 있다.
3. 진단 및 보조제
마이크로 파티클은 질환 및 장애의 생체내 진단, 조영제, 생물학적 기능에 영향을 미치거나 조절하는 호르몬, 생체 외 분석 또는 진단 방법에 유용한 단백질, 다른 활성제를 안정화 시키거나, 다른 활성제를 비활성 상태에서 활성 상태로 또는 반대로 전환 시키거나, 완충제 및 충전제를 전환시키는 샤프롱으로서 유용한 단백질을 포함한다.
마이크로 파티클은 비 단백질 활성제를 단독으로 또는 하나 이상의 단백질 활성제와 조합하여 전달할 수 있다. 폴리머 마이크로 파티클을 통해 전달될 수 있는 비 단백질 활성제는 소분자, 탄수화물, 다당류, 뉴클레오타이드, 올리고 뉴클레오타이드 및 지질을 포함 하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 소분자 활성제는 유기 및 유기 금속 화합물을 포함한다. 예시적인 생체 폴리머는 핵산을 포함한다. 활성제는 친수성, 소수성 또는 양친매성일 수 있다.
예시적인 생체 활성제는 항염증제, 면역 조절제, 세포 이동을 촉진시키는 분자, 세포 분열을 촉진 또는 지연시키는 분자, 세포 증식 및 분화를 촉진 또는 지연시키는 분자, 표현형을 자극하는 분자 혈관 신생을 촉진 또는 지연시키는 분자, 세포 외 기질의 성질을 증진 또는 지연시키는 분자, 신호 전달 리간드, 마취제, 항생제, 스테로이드 및 화학 요법제를 포함할 수 있다.
예시적인 비 단백질 진단제는 파라 아미 게 네틱 분자, 형광 화합물, 자성 분자, 방사성 핵종, X선 조영제 및 MRI 조영제를 포함한다.
III. 약물 용출 마이크로 파티클의 제조 방법
생물 분해성 폴리머에 로딩한 후, 보툴리눔 독소를 비롯한 캡슐화된 단백질 약물의 효능을 향상시키는 생체적합성 마이크로 파티클의 제조 방법이 확립되었다. 상기 방법은 생분해성 폴리머의 비 수용액을 알부민과 같은 벌크제와 혼합된 하나 이상의 단백질 활성제와 혼합하고 비 수성 용매 중에서 세척한 다음 마이크로 제조 또는 에멀젼 방법으로 마이크로 파티클을 제조하는 것을 포함한다. 전형적으로, 상기 방법은 보툴리눔 독소와 같은 캡슐화된 단백질 제제를 함유하는 생체적합성 마이크로 파티클을 생성한다. 상기 방법은 생체내 보툴리눔 독소의 제어 방출 전달 시스템의 대규모 생산에 사용될 수 있다. 치료적, 예방적 및 진단적 단백질을 함유하는 마이크로 파티클은 통상적인 기술을 사용하여 투여될 수 있다.
상기 방법은 물( "W") 및/또는 하나 이상의 비 수성 용매 또는 오일( "O")의 에멀젼을 사용하여 단백질-로딩된 마이크로 파티클을 제형화하는 것을 포함한다. 예시적인 실시예에서, 상기 방법은 W/O/O 또는 W/O 또는 W/O 이중 에멀젼을 형성하기 위해 다량의 물에 W/O 또는 O/O의 에멀젼을 첨가하는 것을 포함한다. 단백질 침전물을 사용하는 방법은 물과 유기 용매 사이의 계면에서 일어나는 수 용성 단백질의 변성과 관련된 단백질 활성제의 활성 손실을 극복한다.
상기 방법은(a) 단백질 침전제를 생성하기 위해 벌 킹제와 혼합된 활성제의 침전;(b) 단백질 침전제를 세척하여 용매로 세척된 침전제를 생성시키는 단계;(c) 습식 분쇄에 의한 용매 세척된 침전물의 크기를 택일적으로 감소 시키거나 건식 분쇄 또는 극저온 건조에 의한 동결 건조 침전물의 크기를 감소시키는 단계;(d) 침전제를 폴리머에 분산시키는 단계; 및(e) 마이크로 조립체 또는 에멀젼 방법에 의해 마이크로 파티클을 제조하는 단계를 포함한다. 각 방법 단계는 아래에서 더 자세히 설명된다.
A. 치료제, 예방 또는 진단제의 침전( "활성제")
생체적합성 폴리머 내에서 제형화하기 위한 단백질은 건조 분말로서 제공되고 수용액에 용해된 후 침전된다. 수용액에 추가의 안정제를 첨가하여 단백질 침전물의 안정성을 향상시킬 수 있다.
1. 탈수 단백질 제공
전형적으로, 상기 방법에서 사용하기 위한 단백질 활성제는 탈수된 형태로, 예를 들어, 건조된 분말로서 제공된다. 탈수는 동결 건조, 분무 건조 및 분무 동결 건조와 같은 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 전형적으로, 단백질의 동결 건조 방법은(1) 동결(생성물을 동결시키고 건조에 적합한 고체 매트릭스를 생성하는 것을 포함 함);(2) 1 차 건조(낮은 목표 수준에서 제품 온도를 유지하면서 제품 환경의 압력을 감소시킴으로써 승화를 통해 얼음을 제거하는 것을 포함 함);(3) 2 차 건조(잔류 수분 함량이 목표 수준에 도달할 때까지 결합 수를 제거하는 것을 포함). 단백질을 건조시키는 과정에 대한 포괄적인 안내서는 Chang and Patro (미국 제약 학자 협회, Biopharmaceuticals의 Lyophilization에서 Protein Pharmaceuticals의 동결 건조 공정 개발, 113-138(2004))에서 제공된다.
예시적인 방법에서, 탈수는 단백질로부터 90-100 %의 물을 제거한다. 전형적으로, 탈수 공정은 단백질의 생물학적 활성을 감소 시키거나 달리 변화시키지 않는 방식으로 수행된다. 2 개 이상의 단백질이 사용되는 경우 탈수 전 또는 후에 단백질을 결합할 수 있다.
적합한 벌크/담체 물질은 알부민, 젤라틴 또는 트랜스페린과 같은 다양한 단백질 및 폴리 비닐 피롤리돈 또는 히드 록시 프로필 메틸 셀룰로오스와 같은 폴리머를 포함한다. 보툴리눔 독소에 적용되는 가장 보편적인 벌킹/담체 단백질은 알부민이다.
A. 보툴리눔 독소의 제조
예시적인 실시예에서, 단백질 활성제는 클로스트리디움 보툴리늄(C. 보툴리눔) 유래의 보툴리눔 신경 독소 타입 A 복합체(즉, 보툴리눔 독소)이며, 이는 인간에서 매우 높은 효능 및 독성을 갖는다.
비. 벌크 요원의 준비
활성제가 극히 소량으로 요구되는 경우, 예를 들어 보툴리눔 독소와 같이 매우 높은 활성 및/또는 높은 독성을 갖는 활성제, 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 하나 이상의 부가적인 부형제가 벌킹 제 또는 담체. 단백질 약물은 종종 매우 강력하기 때문에, 원하는 효과를 얻기 위해서는 대개 소량이 필요하다. 부형제 또는 벌크제제가 없는 경우에는 적절한 전달 시스템을 개발하고 생산하는 것이 비현실적일 수 있다. 따라서, 보툴리눔 독소와 같은 활성제의 나노 스케일 양이 임상적용에 요구되는 일부 형태에서, 활성제는 예를 들어 불활성 벌크제와 혼합함으로써 희석된다.
보툴리눔 독소와 함께 사용하기 위한 예시적인 벌크제 단백질은 인간 혈청 알부민("HSA") 또는 알부민이다. 예시적인 실시예에서, 독소(100㎍)의 스톡 용액을 트리스 완충액과 같은 적합한 수성 완충액에서 희석하여 작동 용액, 예를 들어, 10㎍ 독소(또는 대략 10,000 마우스 단위). 이 용액을 벌크제 단백질(예, HSA)과 혼합하여 50 mM Tris-HCl pH 7.5에서 50 mg/mL의 용액을 제조한다.
2. 첨가제의 선택
일부 실시예에서, 상기 방법은 하나 이상의 단백질 활성제를 침전시키기 위한 적합한 시약 및 조건을 선택하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 활성제가 보툴리눔 독소이고 벌크제제가 알부민(독소/알부민) 인 경우, 다양한 제제는 수용액으로부터 독소/알부민을 침전시키는 능력에 대해 시험할 수 있다.
예시적인 방법에서, 예를 들어, 플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트(FITC-라벨링)를 사용하여 단백질을 표지함으로써 침전물을 동정한다. 일반적으로 벌크제제가 사용되는 경우, 벌킹 제는 해석의 편의를 위해 라벨링된다. 예를 들어, 활성제가 보툴리눔 독소이고 벌크제제가 알부민(독소/알부민) 인 경우, 독소/알부민 혼합물 중의 단백질의 대부분은 알부민이며, 제제는 알부민을 침전시키는 능력에 대해 스크리닝된다.
예시적인 침전제는 염화 아연(아연Cl2)과 같은 염, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 폴리머, 용매, 이온 쌍, 아미노산 및 지방산을 포함 하나 이에 한정되지는 않는다. 침전제의 구체적인 예로는 L-히스티딘 메틸 에스테르, L-시스테인 에틸 에스테르, Nα-(3차-부톡시카르보닐)-L-아스파라긴, L-프롤린 벤질 에스테르, N-아세틸-L-트립토판, 젠티신산, 펜테틱산, 옥탄산 및 염화 아연.
일부 실시예에서, 침전제는 1 회 이상의 스크리닝을 사용하여 하나보다 많은 제제를 침전시키는 능력에 대해 선택된다. 예를 들어, 벌크제제가 사용되는 경우, 제 1 라운드의 스크리닝을 수행하여 벌크제제를 침전 시키는데 적합한 하나 이상의 제제를 동정한 다음, 제 2 회 또는 추가로 스크리닝하여 이들 제제가 벌킹을 침전 시키는데 적합한 지 여부를 결정한다 하나 이상의 활성제 또는 다른 부형제와 조합된 약제. 예를 들어, 활성제가 보툴리눔 독소이고 부피화제가 알부민(독소/알부민) 인 경우, 알부민을 침전시키는 능력을 갖는 것으로 밝혀진 제제는이어서 독소/알부민 혼합물을 침전시키는 능력에 대해 스크리닝된다.
적합한 침전제의 선택을 결정하는 인자는 활성제의 생체 활성을 유지할뿐만 아니라 바람직한 크기 및 밀도와 같은 후속 공정에 적합한 특성을 갖는 침전제를 생성하는 능력을 포함한다.
활성제가 보툴리눔 독소이고 벌크제제가 알부민(독소/알부민) 일 때, 바람직한 침전제는 염화 아연이다. 예시적인 방법에서, 사용된 염화 아연의 최종 농도는 약 1 % 중량 대 부피(w/v)이다.
선택된 침전제를 첨가한 후, 예를 들어, 원심 분리에 의해 상등액을 제거하여 침전된 단백질을 수집한다.
3. 생물학적 활동을 위한 보툴리눔 독소의 효소 분석
단백질을 폴리머 마이크로 파티클에 혼입시키는 단계는 종종 단백질을 변성시켜 생체 활성을 상실하게한다(Schellman, Bio폴리머, 17, pp.1305-1322(1978), van de Weert 등, Pharm. Res., 17, pp . 1159-1167(2000)). 따라서, 상기 방법은 선택적으로 침전이 활성제의 생물학적 활성에 영향을 미치는지를 결정하는 테스트를 포함할 수 있다.
바람직한 실시예에서, 단백질이 보툴리눔 독소 및 알부민(독소/알부민) 인 경우, 바람직한 생물학적 시험은 형광 공명 에너지 전달(FRET) SNAP-25 엔도펩티다아제 검정에 의한 독소 활성의 측정이다. 보툴리눔 독소는 신경 전달 물질 방출에 필요한 단백질을 절단하는 아연 의존성 엔도 펩 티다 제이다. 독소 엔도 펩 티다 제 활성의 기질 중 하나는 25 kDa(SNAP-25)의 시냅 토좀 관련 단백질이다. 따라서, 예시적인 실시예에서, FRET SNAP-25 엔도펩티다아제 측정 키트(Biosentinel 's Botest)를 사용하여 천연 SNAP-25 기질을 단백질 분해 절단하기 위한 독소의 능력을 측정한다. SNAP-25/endopeptidase 분석은 표적 분자 인 SNAP-25에 대한 독소의 작용을 측정하다. 이것은 잠재적인 시험 관내 대체 검사 방법이다. FRET 분석은 마우스 마비 연구를 사용하지 않고 독소 활동을 탐지하여 많은 독소 제제의 검사를 허용하다.
예시적인 방법에서, 아연-침전된 독소/알부민을 제조하고 분액으로 나누었다. 일부 샘플은 대조군으로 냉장고에 보관하고 다른 샘플은 용매 세척을 위해 유기 용제로 세척하다. 독소/알부민 침전물을 녹이기 위해 모든 샘플에 100 mM EDTA 500 μL를 넣는다. 용해된 독소/알부민을 원심 분리 필터 장치(예컨대, Millipore, 10,000 Da를 절단한 Mw)로 옮기고, 필터 장치를 원심 분리하고, 순수한 물을 첨가하여 EDTA 및 염화 아연을 제거한다.
여과 액을 제거한 후 독소/알부민을 50 mM Tris pH 7.5로 완충액으로 교환하고 깨끗한 마이크로 튜브로 회수하고 FRET 분석법(BioSentinel, Inc.의 BoTest 키트)을 사용하여 효소 활성을 시험하다.
B. 단백질의 용매 세척
용매 세척 공정은 선택된 용매를 사용하여 침전된 단백질을 세척하는 단계를 포함한다. 전형적으로, 용매 세척 단계는 폴리머 마이크로 파티클 내의 단백질 활성제의 로딩 및 균질한 분포를 향상시킨다.
침전된 단백질로부터 침전물 및 상등액을 제거한 후, 잔류하는 물은 예를 들어 수혼화성 용매와 혼합함으로써 제거된다. 전형적으로, 하나 이상의 수혼화성 용매가 침전된 단백질에 적절한 부피비로 첨가되어 침전물로부터 잔류하는 물을 제거한다. 수혼화성 용매는 침전된 단백질에 적어도 1:1, 예를 들어 5:1, 10:1 또는 10:1 이상의 체적비로 첨가될 수 있다. 용매 용액의 혼합은 통증성 또는 교반에 의해 수행된다.
1. 세척 용제의 선택
물을 제거하는데 사용될 수 있는 적합한 용매는 단백질 활성제의 생물학적 활성을 유지하는 용매를 포함한다. 따라서, 상기 방법은 침전된 단백질로부터 물을 제거하기 위해 수혼화성 용매를 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다. 예시적인 용매는 아세톤, 아세토니트릴, 디옥산, 에탄올, 2-메톡시 에틸 아세테이트, 메톡시 에탄올,에톡시 에탄올, 부톡시 에탄올, 2-프로판올, 프로필렌 글리콜 메틸 에테르, 에탄디올, 1,2-프로판디올, 3차-부틸 알코올, 디에틸렌 글리콜 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 피리딘, 테트라히드로푸란 아세토니트릴 등이있다. 바람직하게는, 물과 혼합 가능한 용매는 원심 분리 또는 투석 여과에 의한 용매 세척된 침전물의 분리를 용이하게하기 위해 점도가 낮다.
2. 용매 세척된 단백질의 회수
용매로 세척된 단백질 침전물은 임의의 적합한 수단, 예컨대 원심 분리를 사용하여 수집될 수 있다. 용매-세척된 단백질 침전물은이어서 폴리머(예를 들면, 디옥산, 디클로로메탄, 아세트산 n-부틸 또는 다른 용매 중의 PLGA 용액)와 혼합되어 마이크로 파티클을 만든다. 이 용매 세척 공정은 독소의 생체 활성을 유지하면서 유제 또는 미세 가공 방법에 의해 PLGA 마이크로 파티클을 제조할 수 있게한다. 일부 실시예에서, 용매-세척된 단백질 분말은 동결 건조된다.
예시적인 실시예에서, 용매-세척된 보툴리눔 독소/알부민 침전물은 샘플의 부피에 따라 1 분 이상 동안 4,500-5,000 상대 원심력(rcf)에서 원심 분리에 의해 수집된다. 평평한 바닥 원심 컨테이너가 바람직하다.
C. 단백질 분말의 크기 감소
상기 방법은 동결 건조된 단백질 분말을 분쇄하여 건조 공정으로부터 직접 생성되는 것보다 작은 크기를 갖는 입자를 생성시키는 단계를 포함할 수 있다. 전형적으로, 동결 건조된 단백질 분말은 마이크로 미터 및 서브 마이크로 미터 크기의 입자로 분쇄된다.
분말 분쇄의 예시적인 방법은 예를 들어 유 봉과 모르타르를 사용하여 수동으로 분쇄하거나, 예를 들어 유성 볼 밀 기계(Changsha Deco Equipment Co., China) 또는 크라이 오 밀(CryoMill) Retsch). 예시적인 실시예에서, 자동화 밀링 공정에 사용하기 위한 분쇄 볼은 지르콘 늄 산화물, 스테인리스 스틸, 마노, 텅스텐, 알루미나 또는 테플론(폴리 테트라 플루오로 에틸렌; PTFE)과 같은 가변 플라스틱으로 제조된다. 전형적으로, 단백질 분말은 용매의 부재(건식 분쇄) 또는 존재(습식 분쇄)하에 분쇄하여 크기 감소시킨다. 건식 분쇄는 다음 절에서 설명하는 바와 같이 온도 조절제의 존재하에 수행될 수 있다.
1. 건식 밀링
기술된 방법에 사용하기 위한 단백질 분말은 적절한 "건조"분쇄 방법을 사용하여 원하는 평균 분말 크기의 입자를 갖는 분말을 생성하기에 적절한 시간 동안 분쇄된다. 건식 밀링은 수동 또는 자동화 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 핸드 밀링에 의해 제조된 예시적인 분말 크기는 약 10 ㎛이다. 유성 볼 밀링과 같은 자동화된 공정에 의해 제조된 예시적인 분말 크기는 약 1 미크론 이하이다. 분쇄 시간은 출발 물질의 양 및 원하는 입자 크기에 따라, 예를 들어, 수분 내지 수 시간에서 선택될 수 있다.
단백질 분말의 분쇄는 분말 상태의 온도를 증가시켜 단백질 상태를 변화시키고 생물학적 활성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서, 분쇄는 온도 조절 환경, 예를 들어 4 ℃에서 수행된다. 일부 실시예에서, 분쇄 공정을 통한 단백질 분말의 온도 제어는 분쇄 장치 자체에 의해 수행된다. 특정 실시예에서, 얼음, 드라이 아이스 또는 액체 질소와 같은 냉매는 연삭과 관련된 열의 임의의 증가를 방해하기 위해 분쇄 용기에 근접 배치된다. 예를 들어, 자동 연삭 장비가 사용될 때, 챔버는 유성 볼 밀링 중에 온도가 낮게 유지되도록 분쇄 컨테이너 주변에서 얼음, 드라이 아이스 또는 액체 질소를 유지하는 데 사용될 수 있다. 양자 택일로, CryoMill(Retsch)을 이용한 cryomilling은 또한 submicron 크기의 단백질 분말을 생산하는 데 사용되었다.
바람직하게는, 단백질 분말의 분쇄는 단백질의 생물학적 활성을 유지시킨다.
2. 습식 분쇄
일부 실시예에서, 단백질 분말을 적절한 시간 동안 분쇄하여 용매의 존재하에 원하는 평균 분말 크기의 입자를 갖는 분말을 수득한다(즉, "습식 분쇄", "습식 분쇄"). 습식 분쇄는 예를 들어, 건조 상태(즉, 용액 또는 냉각제가 없는 상태)에서 분쇄될 때, 단백질의 효능의 감소로 이어질 수 있는 온도 증가를 방지할 수 있다. 따라서 습식 분쇄 법은 연삭에 의해 발생된 열을 방산하고 보툴리눔 독소와 같은 단백질의 열 유도 불 활성화를 피하기 위한 대안 수단을 나타낸다.
단백질 분말의 습식 분쇄에 유용한 용매는 단백질 분말의 특성에 기초하여 선택될 수 있다. 예시적인 용매는 유기 용매 아세톤, 아세토니트릴, n-부틸 아세테이트, 디옥산, 디클로로메탄 및 에틸 아세테이트를 포함 하나 이에 한정되지 않는다. 다른 적합한 유기 용매는 표 7에서 볼 수 있다.
습식 분쇄의 예시적인 방법에서, 상이한 직경 크기(예를 들어, 각각 10 mm, 5 mm 및 1 mm)의 분쇄 볼 및 단백질 분말을 적절한 크기의 내용 매성 용기에서 유기 용매와 혼합하고, 예:30 mL 테플론 용기. 용기는 밀링 머신 상에 장착되고 적절한 시간(예를 들어, 1 내지 6 시간) 동안 적절한 속도(예를 들어, 분당 300-900 회전, rpm)로 회전된다. 손으로 연삭, 유성 볼 밀링, 저온 살균 및 용매 세척으로 제조된 입자는 마이크로 파티클 및 겔 제제를 제조하는 데 적합하다.
특정 실시예에서, 보툴리눔 독소/알부민 단백질 분말은 수 분쇄 및/또는 유성형 볼 밀링의 조합을 사용하여 유기 용매 중에 현탁된 상태로 1 ㎛ 미만의 입자 크기로 분쇄된다.
D. 마이크로 파티클 제조
상기 방법은 마이크로 파티클을 제조하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 용매-세척된 단백질 분말을 사용하여 마이크로 파티클을 제조하는 방법은 물-용해된 단백질을 공기-물-용매 계면에 노출시 발생하는 단백질의 변성 또는 불 활성화를 회피한다.
마이크로 임프린트 리소그래피, 용매 보조 마이크로 몰딩, 마이크로 유체 접촉 프린팅, 마이크로 콘택트 핫 프린팅, 스텝 및 플래쉬 임프린트 리소그래피, 비접촉 콘택트 프린팅에서의 입자 복제를 포함하는 약물 전달 애플리케이션을 위한 마이크로 파티클을 제조하기 위한 몇 가지 미세 제조 기술이 개발되었다. 습윤 템플레이트 및 하이드로 겔 템플리 팅 방법.
약물 전달에 적합한 마이크로 파티클을 제조하기 위한 적절한 미세 제조 기술의 선택은 로딩된 약물을 잃지 않고 불순물을 제거할 수 있는지 여부, 제조 재현성 및 약물 방출 동력의 제어를 포함하는 요인을 고려해야한다.
마이크로 파티클은 폴리머 대 단백질의 상이한 질량비를 함유하도록 제형화될 수 있다. 전형적으로, 마이크로 파티클은 단백질보다 많은 양의 폴리머를 포함한다. 예를 들어, 마이크로 파티클은 1:1 내지 99:1, 예를 들어, 2:1,4:1,9:1,19:1 및 49:1의 폴리머 대 단백질의 질량비를 포함하도록 제형화될 수 있다. 특정 구현 예에서, 마이크로 파티클은 단백질 대 개질된 폴리머의 질량비가 9:1이다.
마이크로 파티클 내에 캡슐화된 치료제, 예방제 및 진단제의 최종 농도는 이론적인 물질 수지 계산에 의해 결정될 수 있다.
캡슐화제가 보툴리눔 독소를 포함하는 일부 실시예에서, 마이크로 파티클은 폴리머 대 보툴리눔 독소의 질량비가 1,000,000:1 내지 10:1 범위에 있다. 폴리머 마이크로 파티클의 제조를 위한 바람직한 방법은 유화액에 의한 것이다.
1. 유화액 법에 의한 마이크로 파티클 제조
상기 방법은 침전된 단백질의 용매 세척에 의해 수득된 단백질 입자를 사용하는 에멀젼에 의한 마이크로 파티클의 제조, 선택적으로 드라이 아이스 챔버에서의 건식 볼 밀링, 저온 밀링 및/또는 습식 볼 밀링을 임의로 드라이 아이스 챔버에서 제조하는 것을 포함한다. 에멀젼에 의한 입자 제형의 경우, 단백질 입자는 하나 이상의 용매를 포함하는 폴리머 용액에 첨가된다. 에멀젼은 전형적으로 고체/오일/물(S/O/W) 에멀젼을 사용하여 수행된다.
예시적인 방법에서, 아연-침전된 보툴리눔 독소 및 알부민 단백질이 마이크로 파티클로 형성될 원하는 마이크로 파티클(들)의 용액에 첨가된다. 아연-침전된 단백질 입자는 선택된 용매(예:디클로로메탄 또는 1:1 디클로로메탄:디옥산의 혼합물)에 용해된 폴리머(예:PLGA)에 분산되어 고체/오일(S/O) 분산액을 형성한다. S/O 분산액은 폴리 비닐 알콜(PVA) 및 아연 이온을 함유한 수용액에 첨가되어 침전된 단백질이 물에 용해되는 것을 방지하다.
전형적으로, 에멀젼 방법을 통해 폴리머 마이크로 파티클로 제형화된 단백질은 매우 높은 효율로 마이크로 파티클에 로딩된다. 예를 들어, 폴리머의 크기와 구조는 80 %-100 %에서 로딩 효능에 영향을 줄 수 있다.
에이. 유제 방법 용제 선택
유제에 의한 마이크로 파티클의 제조에 사용되는 용매는 비등 온도(BP) 및 수용해도를 포함하는 원하는 물리적 성질에 기초하여 선택될 수 있다. 전형적으로, 에멀젼 방법에 사용되는 용매의 선택은 마이크로 파티클 내에 캡슐화된 단백질 약물의 방출 속도에 영향을 줄 것이다. 조절된 방출 특성을 갖는 마이크로 파티클의 제조에서 핵심 단계는 폴리머가 용해되는 유기 용매(들)가 형성 마이크로 파티클을 흘리고 폴리머가 고형화되는 중요한 시점이다. 많은 다른 상호 작용이이 인터페이스에서 동시에 발생하다. 하나는 폴리머가 용매와 상호 작용하는 정도를 정의하는 용매-폴리머 상호 작용이다. 또 다른 것은 용제-약물 상호 작용이며,이 경우에는 침전물이 폴리머 용매에 크게 용해되지 않으므로이 경우에는 최소이다. 그 중 세 번째는 용제 제거 메커니즘이다. 유제 배스 아래에서, 용매는 형성 마이크로 파티클을 떠나 물로 용해된다. 또한 휘발성 용매는 마이크로 파티클이 형성되어 경화될 때 유제로부터 증발하다. 유사한 프로세스가 하이드로 겔 템플리트 미세 가공 접근법에도 적용된다. 이러한 상황에서, 용매가 폴리머 매트릭스를 떠나는 속도가 중요하다. 용매가 너무 빨리 떠나는 경우 경화 폴리머 사슬은 함께 방향을 바꾸고 마이크로 파티클 표면 전체에 균일한 피부를 형성할 수 있는 충분한 시간을 갖지 못하다. 이 피부가 없는 경우, 확산에 의한 방출은 물이 큰 구멍을 통해 마이크로 파티클로 신속하게 유입되어 로딩된 치료제를 용해시킴으로써 매우 빠를 수 있다. 이 용매 제거 공정은 증발 및 유제 배쓰 내로의 용매의 용해에 의해 추진되기 때문에, 용매의 비등점 및 그의 수혼화성이 고려해야 할 중요한 요소이다. 이 효과는 디클로로메탄 및 디옥산과 같은 다양한 용매를 사용하는 실험을 상세히 설명하는 아래의 예에서 강조된다. 약물 및 폴리머가 일정하게 유지되는 경우에도, 마이크로 파티클로부터의 제거에 영향을 미치는 용매 및 다른 파라미터의 주요 인자는 약물 부하의 방출 특성에 급격한 영향을 미친다.
벤질 알콜(BA), n-부틸 아세테이트(nBA), 클로로포름(ChF), 디클로로메탄(DCM), 에틸 아세테이트(EA), 에틸 포르메이트(EF) 메틸 포르메이트(MF), 펜에틸아민(PhA), 트리아세틴(TAc) 및 디옥산(Dx)이다. 예시적인 용매 및 각각의 끓는점(BP) 및 수용해도의 목록이하기 표 2에 제공되어있다.
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일부 실시예에서, 둘 이상의 용매의 혼합물이 사용된다. 아연-침전 보툴리눔 독소/알부민 단백질의 에멀젼 제형에 사용하기 위한 용매의 예시적인 혼합물은 DCM/Dx, BA/EA, BA/MF, ChF/TAc의 조합을 포함한다. 단백질 입자는 적합한 용매에 용해된 폴리머에 분산되어 "S/O"분산액을 형성한 다음 아연을 함유한 PVA 용액에 첨가하여 침전된 단백질이 물에 녹지 않도록하다.
B. 유제 절차
마이크로 파티클은 원하는 용매에 분산된 용매로 세척된 단백질 침전제로부터 생산된다. 바람직하게는, 단백질/폴리머 마이크로 파티클을 제조하기 위한 에멀젼 방법은 단백질의 구조를 변성, 분해 또는 비가 역적으로 비가 역적으로 변화시키는 임의의 단계 또는 시약을 포함하지 않는다. 따라서, 에멀젼에 의한 마이크로 파티클의 제조 방법은 캡슐화된 단백질의 생물학적 활성을 유지시킨다.
보툴리눔 독소/알부민 PLGA 마이크로 파티클을 제조하는 예시적인 방법에서, PLGA(750mg)를 적합한 부피의 바람직한 유기 용매(예:5mL의 DCM 또는 DCM/Dx를 1:1의 비율로)에 용해시킨다. PVA(31,000 Da)의 1 % 수용액을 증류수에 용해시켜 제조한다. 염화 아연 용액(3 mg/mL)을 약 1 %(w/v)의 농도로 첨가하여 PVA-아연 용액을 형성한다.
용매 세척된 독소/알부민 침전물(50mg)을 10-20 초 동안 통증성(vortexing)하여 PLGA 용액에 분산시켜 오일 중 고체(S/O) 분산액을 제조하였다. PVA-아연 용액을 균질화시키고, PLGA-보툴리눔 독소/알부민(S/O) 분산액을 PVA-아연 용액에 첨가하였다.
S/O 분산액을 PVA-아연에 첨가하는 것은 일정하고 일정한 유속, 예를 들어 0.25 mL/초를 사용하여 수행된다. 혼합물은 균질화 속도에 따라 적절한 시간, 예를 들어 1-30 분 동안 유화된다. 추가로 150 mL의 PVA-아연 용액을 균질화 유제 용액에 첨가하고 5 내지 30 분, 바람직하게는 15 분 동안 연속적으로 유화시킨다. 그 후 용액을 1.6L의 PVA-아연 용액에 신속하게 붓고 혼합한다(예:600 rpm/분의 속도로 자석 교반하면서). 온도의 바람직하지 않은 증가(예를 들어, 10 ℃의 배양기에서의 혼합)를 방지하기 위해 온도 조절된 환경에서, 용액의 혼합은 60-100 분, 바람직하게는 75 분과 같은 적절한 시간 프레임 동안 수행된다.
경화된 마이크로 파티클은 임의의 적합한 수단, 예를 들어 75㎛ 및 20㎛ 메쉬를 사용하여 수집되고, 과량의 수성 용매(예를 들어, 3 내지 4ℓ의 증류수)로 세척된다.
마이크로 파티클은(예를 들어, 5,000 rpm, 4,500 rcf에서 원심 분리하여) 수집되고 저장 또는 나중에 사용하기 위해 즉시 사용되거나 적절한 완충액에 저장되거나 건조(예를 들어, 밤새 동결 건조)될 수 있다.
에멀젼 방법에 따라 제형화된 보툴리눔 독소/알부민 마이크로 파티클은 마이크로 파티클로 제형화되기 이전과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 독소를 함유한다. 특정 실시예에서, 에멀젼 방법에 따라 PLGA 마이크로 파티클을 제조하는데 사용되는 용매-세척된 독소의 생물학적 활성의 확인은 공급자로부터의 표준 조작 절차에 따라 FRET 분석 키트에 의해 결정된다. 예를 들어 마이크로 파티클을 0.1 % sodium azide가 함유된 PBS-Tween(0.05 %)(pH 7.5) 5 mL에 37 ℃에서 50 rpm의 진탕 배양기에 현탁시킨다. 미리 결정된 시간 지점에서 각 시험관을 원심 분리하고 상등액을 알부민-방출 분석법, 예를 들어 microBCA 단백질 분석 키트 및 테 트라 코어 BTX 분석 키트로 보툴리눔 독소 ELISA 분석법, 독소에 대해 회수한다 효소 활성 분석은 FRET 분석 키트를 사용하여 공급 업체의 표준 작동 절차에 따라 수행된다. FRET 분석은 1-100 ng/mL의 독소 농도에서 독소 효소 활성을 검출할 수 있다. FRET 분석은 마우스 마비 실험과 같은 오랜 생체내 분석의 필요없이 독소의 효소 활성을 쉽고 빠르게 측정하는 방법을 제공하다.
2. 마이크로 파티클 형성을 위한 다른 방법
a. 폴리머 템플레이트 방법
폴리머 템플레이트 미세 제조 방법(Acharya, et al., J. Control. Release, 141, pp. 314-319(2010), Park 등, Sol-gel phase 가역성 하이드로 겔 템플레이트 및 그의 용도, 미국 특허 제 8,951,567 호(2015)). 일부 실시예에서, 보툴리눔 독소와 같은 캡슐화된 단백질 약물의 효능을 증진시키는 약물-용출 마이크로 파티클은 "PVA 템플레이트 방법", "하이드로 겔 템플레이트 방법"또는 "수성 폴리머 몰드 방법 "(Acharya, et al., J. Control. Release, 141, pp.314-319(2010), Park 등, Sol-gel phase-reversible hydrogel templates and uses, 미국 특허 제 8,951,567 호 Lu, et al., Int. J. Pharm., 461, 258-269(2014), He and Park, Mol. Pharm., 13, pp. 2164-2171(2016)).
실리콘 웨이퍼 템플레이트는 임의의 특정 값(예를 들어, 1.5㎛ 내지 100㎛ 또는 그 이상)으로 제어될 수 있는 소정의 직경을 갖는 기둥 또는 공동으로 준비된다. 50μm의 예시적인 마이크로 파티클은 생체내 적용을 위한 일반적인 바늘을 사용하여 용이한 주사에 적합한 크기로되어있다. 실리콘 웨이퍼 템플레이트 위에 겔을 형성하거나 건조되어 멤브레인을 형성할 수 있는 수성 폴리머 솔루션이 추가된다. 예를 들어, 젤라틴은 온도를 낮춤으로써 하이드로 겔을 형성하는데 사용된다; PVA는보다 탄력 있고 복원력이 있으며 다루기 쉬운 폴리머 템플레이트를 만드는데 사용된다. 젤라틴 또는 PVA 템플레이트를 마스터 템플레이트에서 벗겨 낸 다음 캐비티를 노출시키는 평평한 표면에 놓는다. 공동은이어서 유기 용매(예:디클로로메탄, 에틸 아세테이트 또는 벤질 알코올)에 용해된 약물-PLGA 혼합물로 채워진다. 상이한 분자량 및 상이한 L:G 비을 갖는 다양한 PLGA가 사용될 수 있다. 하이드로 겔/폴리머 템플레이트 방법의 주요 이점은 균일한 마이크로 파티클 크기 및 템플레이트에 형성된 마이크로 파티클의 용이한 수집에 있다. 마이크로 파티클은 물과 같은 적절한 용매에 템플레이트를 단순히 용해시킴으로써 템플레이트로부터 방출된다.
방출된 마이크로 파티클은 미세 메시를 통해 원심 분리 또는 여과에 의해 세척되고 수집될 수 있다.
i. 단백질/폴리머 준비
일반적으로, 폴리머 용액은 생분해성 폴리머를 유기 용매에 용해시킴으로써 제조된다. 마이크로 파티클에서 사용하기 위한 건조 폴리머 분말을 소정 농도(w/v)로 칭량하고, 적합한 유기 용매에 용해시킨 다음, 용액을 단백질 침전 분말에 직접 첨가한다. 분말은 예를 들어, 통증성(vortexing)에 의해 폴리머 용액에 혼합되고 균질화된다. 예시적인 방법에서, PLGA, PDLA, PLLA 또는 PCL은 유기 용매에 용해되어 용액을 최종 부피의 약 80 %까지 가져온다. 그런 다음, 단백질 분말을 첨가하고 용액에 혼합하고 추가의 유기 용매를 첨가하여 용액을 최종 부피로 가져온다.
ii. 템플레이트 준비
폴리머 템플레이트 미세 가공은 템플레이트 준비 단계를 포함한다. 전형적으로, 템플레이트(예를 들어, 폴리머 몰드)는 PVA와 같은 수성 폴리머를 사용하여 제조되며, 이는 소정의 크기 및 형상의 마이크로-웰을 갖는 폴리머 몰드를 제조하는데 사용된다. PVA 몰드의 예시적인 마이크로 우물은, 예를 들어 50㎛, 20㎛ 또는 1.5㎛와 같은 100㎛ 내지 2㎛ 범위의 크기를 갖는 약 500㎛ 내지 1.0㎛의 직경을 가지며, 500 ㎛, 예를 들면 50 ㎛이다.
예시적인 방법에서, 마이크로 파티클의 미세 제조는 PDMS 캐스트 상에 제조된 PVA 템플레이트를 사용하여 수행된다. PVA 템플리트의 제조를 위한 방법 단계는 다음을 포함한다 :
1. PVA의 4.0 % 용액의 제조;
2. PVA 용액을 PDMS 카운터 몰드에 적용하는 것; 2.
3. PDMS 카운터 몰드 내에서 PVA 용액의 건조; 과
4. PDMS 카운터 금형에서 PVA 템플레이트 제거.
템플리트는 소정의 크기 및 형상 범위를 갖는 마이크로 파티클을 생성하도록 제형화될 수 있다. 마이크로 파티클의 예시적인 형상은 구체, 큐브, 별, 실린더 등과 같은 모양 및 패턴을 포함한다.
iii. 입자 컵 제조
적절한 템플레이트의 제조에이어서, 마이크로 파티클의 "컵"의 폴리머 외피가 제조된다. 상기 방법에 따라 제형화된 마이크로 파티클은 단일 제형 내에 이중 또는 다중 작용기를 제공할 수 있다. 예를 들어, 다중 방출 프로파일(외부 입자로부터의 버스트 방출 및 내부 성분으로부터의 지속 방출), 지속 방출 동역학의 가변성, 및 종래의 전달 시스템에 비해 캡슐화된 단백질의 향상된 효능.
단일 층 컵 제제
폴리머 비히클 또는 "컵"의 제조를 위해, 폴리머를 몰드에 붓고 놓는다. 전형적으로, PVA 몰드가 제조된 후에, 유리판에 고정시키고, 적합한 어플리케이터(예를 들어 면도날)를 사용하여 폴리머-단백질 혼합물 용액 300 μL를 마이크로-웰 상에 적층시킨다. 몰드 내의 마이크로 파티클은 예를 들어 상온에 밤새 노출시킴으로써 건조된다.
다층(양파) 컵 배합
입자 제조 방법은 하나 이상의 폴리머 층(즉, "양파 컵")을 갖는 폴리머 "컵"의 형성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 입자의 제조는 동일하거나 상이한 폴리머 용액을 사용하여 단층 폴리머 템플레이트를 제조하는데 사용되는 공정의 단계적 반복을 포함한다. 예시적인 방법에서, 상이한 L:G 비, 분자량 및/또는 말단 그룹을 갖는 다양한 PLGA 폴리머가 다층(양파) 고 형체에 기초하여 마이크로 파티클을 제조하기 위해 선택된다. 단일 층 컵을 제조하기 위해, 소정의 직경의 마이크로 웰을 충진하기 위해(예를 들어, 면도날을 사용하면서 기울이는 동안) 적합한 양(예를 들어, 100-200μL)의 폴리머 용액을 확보된 PVA 몰드에 붓는다. 이어서, 기존의 "컵"( "양파 컵")에 추가 폴리머 층을 추가하기 위해 하나 이상의 추가 폴리머 용액을 이전 층의 건조 후 동일한 방식으로 반복적으로 채운다. PVA 몰드 내의 다중 층 컵은 예를 들어 주위 온도에 밤새 노출시킴으로써 건조된다.
iv. 입자 컵 채우기
단일 층 컵 또는 양파 컵의 제형에 따라, 내부 공간은 적절한 약물 용액과 혼합된 단백질 약물 분말 또는 결정으로 채워진다. 예시적인 방법에서, 유기 용매 범위의 단백질 약물 침전물 및 폴리머의 상대 농도는 각각 5-10 %(w/v) 및 5-20 %(w/v)이다. 용매는 단일 또는 다층 폴리머 컵의 제조에 사용된 폴리머의 용해도를 고려하여 선택된다. 예비 형성된 컵 층(즉, 예비 형성된 컵 층의 폴리머를 용해시키지 않는 것)과 상용 성인 용매 만이 사용될 수 있다.
단백질 분말을 포함하는 적당한 양의 폴리머 용액은 전형적으로 템플레이트 당 100 내지 200 ㎕이다. 컵의 제조에 사용된 폴리머를 용해시키는 비혼화성 용매는 컵 층의 내부 표면을 손상시켜 초기 파열 및 낮은 약물 로딩을 초래할 수 있는 공극 또는 균열을 잠재적으로 생성한다.
예시적인 실시예에서, 폴리머 컵은 100-200㎕의 폴리머 용액과 혼합된 아연-침전된 보툴리눔 독소 및 알부민 분말로 충전된다. 폴리머 "컵"의 코어가 충전된 후, 상부 커버 층은 "블랭크(blank)"폴리머(예컨대, PLGA)를 사용하여 형성된다. 상부 커버 층에 대해, 코어와 동일한 폴리머가 여러 번 사용되거나, 또는 상이한 폴리머가 사용된다. 상단 층의 형성 후, PVA 몰드는 예를 들어 고정된 배양기 오븐 내에서 약 3 내지 12 시간 동안 두어 20 내지 70 ℃에서 건조된다.
건조된 마이크로 파티클은 PVA 몰드를 10 분간의 이중 증류수에 약 30 분 동안 용해시킴으로써 수집한다. 이어서, 용매로서 증류수를 사용하여 106 ㎛ 메쉬 및 38 ㎛ 메쉬를 통해 연속적으로 여과하여 마이크로 파티클을 세척 및 수집한다. 잔류 PVA를 제거한 후, 물에 부유된 마이크로 파티클을 5,000 rpm(상대 원심력 4,500, rcf)에서 1 ~ 3 분 동안 원심 분리하고, 상층 액을 제거하고, 마이크로 파티클을 진공하에 완결되도록 건조시킨다(예:실온에서 밤새 ).
특정 실시예에서, 폴리머 템플레이트 방법에 따라 마이크로 파티클을 제조하는 데 필요한 단계는 SpinSwiper machine(US 2016/0128941 A1 2016)과 같은 자동화 기계 내에서 수행된다. SpinSwiper 기계에는 PVA 템플레이트에 있는 마이크로 우물의 회전 템플레이트에 용액을 공급하는 "블레이드"를지지하는 크로스 암이 포함되어 있다.
E. 생분해성 서모겔 폴리머 및 하이드로겔
상기 방법은 단백질-로딩된 마이크로 파티클 또는 아연-침전된 단백질을 겔-형성 수성 폴리머 겔로 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 겔은 마이크로 파티클 또는 아연-침전된 단백질을 둘러싸고, 마이크로 파티클의 방출 동역학을 추가로 제어하는 추가 층을 제공한다.
바람직하게는, 마이크로 파티클 또는 아연-침전된 단백질은 열 젤인 폴리머와 혼합된다. 서모겔은 용액으로 존재하며 온도가 졸-겔 전이 온도보다 높아지면 겔화를 시작하다. 따라서, 실온에서 수용액에 용해된 폴리머는 체온과 같은 온도의 증가에 따라 겔이될 수 있다. 대안적으로, 보툴리눔 독소/알부민의 마이크로 파티클 또는 침전물은 하이드로 겔 입자, 예를 들어 가교된 히알루론산 겔 입자 내에 캡슐화된다. 마이크로 파티클을 둘러싸고있는 겔의 존재는 약물 방출의 동역학을 추가로 제어하는 확산 장벽을 제공한다.
F. 캐리어 및 부형제
약물 용출 마이크로 파티클은 조직 또는 조직 내강에 투여하기 위한 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 제제화될 수 있다. 적합한 담체는 물, 생리 식염수 및 인산 완충 식염수와 같은 멸균 액체 및 폴리 비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 알긴산 염 및 히알루론산과 같은 수성 또는 수성 겔을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, 담체는 감열성 폴리머를 함유할 수 있다. 상기 제제는 또한 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.
일반적으로, 마이크로 파티클은 단위 투여 형태로, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 향낭과 같은 밀봉된 용기에서 건조 동결 건조된 분말 또는 무-수성 농축 물로서 개별적으로 또는 함께 공급된다. 제형이 주사 또는 점적에 의해 투여되는 경우, 주사기, 병 또는 멸균된 약학 급수, 식염수 또는 다른 완충액을 함유하는 다른 적합한 용기로 분배될 수 있다.
단백질 약물을 포함하는 생체적합성 마이크로 파티클은 환자의 신체 내로 마이크로 파티클을 투여하기 위한 적합한 부형제를 포함하는 조성물로 제형화될 수 있다. 특정 실시예에서, 단백질 약제를 포함하는 마이크로 파티클은 예컨대 근육 내, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 피부 비듬(scarification)을 통해 주사에 의해 환자에게 전달하기에 적합한 담체 또는 부형제로 제형화된다. 전형적인 담체는 생리 식염수, 인산염 완충 식염수, 포도당 용액 및 기타 주사 가능한 담체이다.
따라서, 전달 비히클을 갖거나 갖지 않는 단백질 약물을 포함하는 생체적합성 마이크로 파티클을 포함하는 제형이 기술된다. 생체적합성 마이크로 파티클은 하나 이상의 약학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 약학 조성물은 생체적합성 마이크로 파티클의 목적 및 용도에 따라 상이한 투여 메카니즘에 따라 제형화될 수 있다. 비경구 투여(피하 주사, 근육 내, 복강 내 또는 정맥 내), 국소 또는 경피 투여(수동적 또는 이온 삼투 요법 또는 일렉트로 포 레이션 사용) 또는 생 침식성 삽입물을 사용하여 투여하기 위해 제형화된 약학 조성물이 기술된다.
비경구 투여
일부 실시예에서, 생체적합성 마이크로 파티클은 비경구 투여에 의한 수용액 내 투여를 위해 제형화된다. 제제는 또한 현탁액 또는 에멀젼의 형태일 수 있다. 일반적으로, 유효량의 활성제, 약학적으로 수용 가능한 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제 및/또는 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 희석제, 예를 들어 다양한 완충액(예:트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트)의 멸균 수 또는 완충 식염수, 및 임의로 세제 및 용해제(예:Tween® 20, Tween(예:아스 코르 빈산, 메타 중아 황산나트륨), 방부제(예:티 메로 살, 벤질 알코올) 및 부피가 큰 물질(예:락토오스, 만니톨)을 포함할 수 있다. 비 수성 용매 또는 비히클의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일 및 옥수수 기름과 같은 식물성 기름 및 올레산 에틸과 같은 주사 가능한 유기 에스테르가 있다.
제제는 동결 건조시키고 사용 직전에 재용해/재현탁시킬 수 있다. 제제는 예를 들어, 박테리아 보유 필터를 통한 여과, 살균제를 조성물에 혼입시킴으로써, 조성물을 조사함으로써, 또는 조성물을 가열함으로써 멸균될 수 있다.
IV. 사용 방법
기술된 방법에 따라 제형화된 마이크로 파티클 및/또는 서모겔 내로의 단백질 활성제의 혼입은 활성을 유지하고 투여 후 약물의 유용성을 증가시킨다.
캡슐화된 단백질 제제는 제조에 사용된 마이크로 파티클(들)의 입자 및 조성물의 설계에 따라 연속적 또는 맥동적(pulsatile) 방식으로 마이크로 파티클로부터 방출될 수 있다. 인간 대상과 같은 대상체에 투여시, 마이크로 파티클은 활성제에 대한 생체내 저장소를 나타내는 제어 방출 전달 시스템을 제공한다. 따라서, 상기 생체적합성 폴리머 마이크로 파티클은 한 번에 다량의 활성제를 투여할 수 있다. 일부 예에서, 생체적합성 폴리머 마이크로 파티클 내에서 활성제의 전달은 활성제 단독으로 가능한 것보다 많은 양의 활성제를 안전하게 투여할 수 있게한다. 예를 들어, 보툴리눔 독소가 마이크로 파티클에 로딩될 때, 마이크로 파티클은 보툴리눔 독소의 생체내 저장소를 나타내는 보툴리눔 독소의 전달 시스템을 제공한다. 저장소는 폴리머의 조성에 의해 영향을받는 제어된 방식으로 치료 량의 보툴리눔 독소를 폴리머로부터 방출할 수 있다.
보툴리눔 독소는 약 1 일에서 3 개월 이상, 예를 들어 약 6 개월의 기간 동안 운반자로부터 방출될 수 있다.
마이크로 파티클은 전형적으로 폴리머 입자로부터의 캡슐화된 약물의 방출 속도가 생체내 분해 속도에 의해 영향을받을 수 있도록 실질적으로 생분해성인 물질로 구성된다.
A. 투여 방법
국부적인 전달 방법은 전신 전달과 관련된 심각한 부작용을 줄이는 이점이 있다. 기술된 약물 방출 용 마이크로 파티클을 사용하는 것의 한 가지 이점은, 단백질 약물의 전달을 위한 기존의 제제와는 달리, 기재된 방법에 따라 제조된 마이크로 파티클 내의 단백질 약물이보다 생체 이용 가능할 수 있고, 더 큰 효능.
약물 용출 마이크로 파티클의 제제는 조직 내로의 직접 주입 또는 조직 루멘 내 주입될 수 있다. 대표적인 조직 내강은 호흡기, 위장관 및 비뇨 생식기의 내강을 포함하다. 여기에는 비강, 폐, 식도, 직장, 방광, 질, 요도 및 자궁강과 같은 구멍이 포함된다.
일부 실시예에서, 약물 용출 마이크로 파티클은 수술 중에 표적 조직에 적용되는 겔로 제형화된다. 다른 실시예에서, 약물 용출 마이크로 파티클은 액체 중에 현탁되고 조직 내로 주입된다. 추가의 실시예에서, 약물 용출 마이크로 파티클은 효과적인 시간 동안 루멘 내로 주입된다.
약물 용출 마이크로 파티클을 함유하는 제형은 방광경, 내시경 또는 다른 적절한 방법을 사용하여 액체, 점성의 액체 또는 겔형 물질을 분무, 롤링, 페인트 또는 스폰지함으로써 방광, 다른 체강 또는 피부의 원하는 위치에 투여될 수 있다 스코프 장치. 스코프 장치를 사용하면 제제를 투여하기 전에 투여 영역을 확인할 수 있다. 스코프 장치는 제형을 함유하는 분무 장치, 거즈(gauze), 롤러 또는 스폰지를 포함하지만 이에 제한되지 않는 제형 용 애플리케이터를 포함할 수 있다. 어플리케이터는 제형이 바람직하지 않은 영역에 우발적으로 도포되지 않도록 제형이 투여될 때까지 적절한 커버를 사용하여 보호될 수 있다. 애플리케이터는 스코프 장치의 끝 부분에 부착하여 고정밀 도로 관리할 수 있다. 스코프 장치 용 액체 분무 도구는 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, Yamamoto 및 Kidooka의 미국 특허 제 7,588,172 호 및 제 6,354,519 호에 설명되어있다.
약물 용출 마이크로 파티클의 제제는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상, 예방적, 진단적 또는 미용적 효과로부터 효과적인 경감을 제공하도록 이러한 규칙 성으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 제형은 단일 투여로, 예를 들어, 단일 투여로 전달된다. 전형적으로, 기재된 방법에 따라 제형화된 약물 용출 마이크로 파티클 내에서 전달될 때 치료 효과 또는 화장 효과를 달성하기 위해 요구되는 활성제의 투여 횟수는 동일한 효과를 달성하는데 필요한 동일 또는 동등한 활성제의 투여 횟수보다 적다 마이크로 파티클의 부재.
B. 복용량
마이크로 파티클은 보툴리눔 독소와 같은 단백질 활성제의 전달을 향상시켜 지속적인 효과를 나타낼 수 있다. 예제를 참조하십시오. 따라서, 단백질 활성제의 전달을 위해 이들 약물-방출 마이크로 파티클을 사용하는 이점은 캡슐화되지 않은 약물의 제형을 투여할 때 요구되는 투여량과 비교하여 원하는 효과를 얻기 위해 필요한 활성제의 투여 빈도를 감소시키는 능력이다.
바람직한 실시예에서, 약물 용출 마이크로 파티클은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상으로부터 경감을 달성하거나 또는 바람직한 미용 효과를 달성하기에 효과적인 양으로 투여된다. 바람직하게는, 기재된 방법에 따라 제형화된 약물 용출 마이크로 파티클 내에서 전달될 때 치료 효과 또는 미용 효과를 달성하기 위해 요구되는 활성제의 투여 빈도는 마이크로 파티클의 부재하에 투여된 동등한 활성제의 투여 빈도보다 적다.
약물 용리 형 마이크로 파티클 제제의 상이한 크기 투여 단위가 사용될 수 있다. 보툴리눔 독소 및 알부민 또는 다른 단백질 활성제를 포함하는 탈수된 약물 용출 미세 분말의 건조 분말을 함유하는 투약 단위는 제약 상 허용되는 담체와 함께 용기에서 재구성될 수 있다. 바람직하게는, 제약 상 허용되는 담체는 수성 담체이다. 약물-용출 마이크로 파티클의 적절한 양은 0.1-1 mg, 1-10 mg, 10-100 mg, 100-300 mg, 300-600 mg 및 600-1,000 mg을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
보툴리눔 독소가 로딩된 폴리머 마이크로 파티클의 투여량 형태는 보툴리눔 독소 약 1 내지 약 50,000 단위의 양을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 폴리머와 관련된 보툴리눔 독소의 양은 약 10 단위 내지 약 2,000 단위의 보툴리눔 독소 타입 A이다. 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 타입 B 인 경우, 바람직하게는 마이크로 파티클과 관련된 보툴리눔 독소의 양 약 100 단위 내지 약 30,000 단위의 보툴리눔 독소 타입 B이다.
전형적으로, 연속적인 기간에 걸쳐 마이크로 파티클에 의해 투여되는 타입 A 보툴리눔 독소의 양은 수혜자의 체중 kg 당 약 0.01 단위와 수혜자의 체중 kg 당 약 25 단위 사이, 바람직하게는 약 0.1 단위/kg 체중 및 약 15 단위/kg 체중량, 가장 바람직하게는 약 1 단위/kg 체중량 및 약 10 단위/kg 체중량을 포함한다.
전형적으로, 연속적인 기간 동안 마이크로 파티클에 의해 투여되는 타입 B 보툴리눔 독소의 양은 수혜자의 약 0.01 단위/kg 내지 수혜자의 약 1,000 단위/kg 체중 사이이다. 예를 들어, 보툴리눔 독소는 약 1 내지 약 10,000 단위의 양으로 환자의 근육에 보툴리눔 독소를 포함하는 폴리머 성 마이크로 파티클의 근육 내(i.m.) 또는 경피(s.d.) 주입에 의해 투여될 수 있다.
C. 치료할 질병 및 장애
약물 용출 마이크로 파티클은 질환 또는 장애 치료용 단백질 활성제를 전달하는데 사용될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 보툴리눔 독소는 근육 경련 또는 과민성 방광, 편두통 또는 주름과 같은 방광 장애를 포함하는 운동 장애와 같은 고통을 치료하기 위해 환자에게 투여된다.
바람직한 실시예에서, 보툴리눔 독소를 함유하는 폴리머 마이크로 파티클은 보툴리눔 독소가 클리닉에서 사용이 승인된 하나 이상의 질병 또는 장애를 치료하는데 사용된다. 투여량, 처방 및 투여 위치는 치료할 질환 또는 장애에 따라 다를 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서, 투여량, 주사 횟수, 주사 부위 및 보툴리눔 독소를 함유하는 마이크로 파티클의 투여 빈도는 치료에 대한 조건 및 반응에 의해 결정될 것이다. 전형적으로, 반응(예를 들어, 감소, 중지 또는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 변화)은 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일 이내에 관찰되거나, 예를 들어 투여 후 2 주. 투여 효과는 치료할 질환 또는 장애에 따라 달라질 수 있으며, 투여 후 예를 들어 투여 후 3 내지 6 개월 동안 1 일 내지 1 년 이상 지속될 수 있다.
전형적으로, 보툴리눔 독소를 함유하는 폴리머 마이크로 파티클은 안구 질환, 근육 경직/경련 및 주름을 치료할 때, 영향을받는 근육 내로(예를 들어, 근육 내로) 주입에 의해 제공된다.
편두통을 예방하기 위해 사용될 때, 보툴리눔 독소를 함유한 폴리머 마이크로 파티클이 두경부의 근육에 주입된다. 보툴리눔 독소를 함유하는 폴리머 마이크로 파티클은 과도한 발한 치료를 위해 피부에 주입된다(예를 들어, 피부 내로). 과민성 방광과 같은 방광 장애를 치료할 때, 보툴리눔 독소를 함유한 폴리머 마이크로 파티클이 방광의 근육 또는 내강으로 주입된다.
보툴리눔 독소 또는 다른 단백질 활성제의 투여를 위한 생체적합성 폴리머 마이크로 파티클을 사용하여 방광 장애 치료에서 개선된 효능이 수득된다. 마이크로 파티클은 전형적으로 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어 식염수 또는 인산염 완충 식염수로 방광의 조직 또는 내강에 주사 또는 점적하여 투여된다.
제제로 치료할 수 있는 대표적인 방광 장애는 출혈성 방광염, 간질성 방광염/통증성 방광 증후군(IC/PBS) 및 암을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 약물 용출 마이크로 파티클 내에 캡슐화된 보툴리눔 독소로 치료함으로써 완화될 수 있는 증상으로는 혈뇨, 요실금, 위의 음부 통증, 염증 및 요폐가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
보툴리눔 독소는 아세틸콜린(acetylcholine)이라는 화학 물질의 방출을 막음으로써 근육을 이완시킨다. 따라서, 일부 실시예에서, 폴리머 마이크로 파티클 내에 캡슐화된 보툴리눔 독소(예:독소 타입 A 및 B)가 눈 운동, 근육 경직/경련 등과 관련된 근육 활동과 같은 장애 관련 운동을 치료하는 데 사용된다.
일부 실시예에서, 폴리머 마이크로 파티클 내에 캡슐화된 보툴리눔 독소는 교차점 눈(사시) 또는 비 제어 점멸(눈꺼풀 통과)을 치료하여 근육 경직/경련 또는 운동 장애(자궁 경관 근력 긴장, 사경 등)을 치료하는 데 사용된다.
상기 제제는 또한 질, 위장관(위 및 아래), 구강, 기도, 식도, 비강, 외이도 및 피부를 포함하지만 이에 한정되지 않는 신체의 다른 부위의 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
또한 심한 겨드랑이 땀을 치료하는데도 사용된다. 보툴리눔 독소는 땀샘을 활성화시키는 화학 물질을 차단함으로써 작동하다. 일부 실시예에서, 보툴리눔 독소는 폴리머 마이크로 파티클 내에 캡슐화되어 주름의 미용 외관을 감소시킨다. 그것은 또한 매우 빈번한 편두통을 가진 사람들의 두통을 예방하기 위해 사용된다.
본 발명은 다음의 비제한적인 실시예를 참조로 추가로 이해될 것이다.
실시예들
하기 실시예는 마우스 마비 테스트에 의해 측정된 독소의 시험 관내 및 생체내 효능의 지속 방출을 위한 생분해성 폴리머 제제를 예시한다. 실시예에 설명된 "마우스 단위"는 약간 다르다. 다른 롯트에서 독소의 효능은 제한된 수의 마우스를 사용하여 측정해야 하기 때문이다. 따라서, 각 실시예에서, 생체 분해성 폴리머 제제의 효능을 비교하기 위해 용액 제어 제제가 항상 사용되었다.
실시예1:다양한 성질을 갖는 약물-용출 생분해성 폴리머 마이크로 파티클의 제제
재료 및 방법
보툴리눔 독소/알부민 마이크로 파티클의 제제
List Biological Laboratories, Inc.(Campbell, CA)로부터 입수 가능한 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum)으로부터의 타입 A 복합체.
보툴리눔 독소(100 μg)를 1 mL의 트리스 완충액으로 희석시켰다. 용액을 100 μL 분량으로 나누어 냉동했다. 각 100μL 분액(독소 10㎍ 또는 마우스 단위 약 10,000 개 포함)을 20mL의 알부민 용액(50mM Tris-HCl pH 7.5 중 50mg/mL)에 희석시켰다.
생분해성 폴리머 마이크로 파티클에 단백질을 혼입시키는데 일반적으로 수반되는 일련의 단계는 종종 단백질을 변성시켜 생체 활성을 상실하거나 감소시킨다 [J.A. Schellman, Solvent denaturation, Biopolymers, 17(1978) 1305-1322; M. van de Weert, W.E. Hennink, W. Jiskoot, poly(lactic-co-glycolic acid) microparticles, Pharm. Res., 17 (2000) 1159-1167].
보툴리눔 독소를 혈청 알부민(독소/알부민)과 혼합하고 염화 아연을 사용하여 침전시켰다. 염화 아연에 의해 얻어진 독소/알부민 침전물은 아연-침전된 독소 또는 아연-침전된 단백질이라 불린다.
단백질은 약 0.1 %의 염화 아연 농도에서 침전하기 시작했다. 알부민 분석 결과, 염화 아연에 의해 99 % 이상의 알부민이 침전되었다. 보통 1 %의 최종 염화 아연이 사용되었다. 용액을 원심 분리하여 상청액을 제거하여 아연-침전된 단백질을 수집하고 동결 건조시켰다. 아연-침전된 독소는 생체 분해성 폴리머 마이크로 파티클을 제조하는 다양한 단계를 거친 후에도 마우스 마비 시험 및 SNAP-25 기질을 사용하는 생체 외 독소 엔도펩티다아제 활성으로 측정한대로 그 생체 활성을 유지하였다.
형광 공명 에너지 전달(FRET) SNAP-25 엔도펩티다아제 측정 키트(Biosentinel 's Botest)를 사용하여 천연 SNAP-25 기질을 단백질 분해 분해하는 독소의 능력을 측정하였다. FRET 분석은 마우스 마비 연구를 사용하지 않고 독소 활성의 탐지를 허용하여 많은 독소 제제의 검사를 허용했다.
대안으로, 상청액을 제거한 후, 잔류하는 아연-침전된 단백질을 기재된 바와 같이 추가의 처리를 위해 선택된 용매(용매 세척)로 세척하였다. 용매 세척 단계는 새로운 에멀젼 방법으로 독소가 충진된 마이크로 파티클을 제조하는 데 중요했다.
시험관 내 약물로드 및 방출 시험
인간에서 임상 용도로 단일 투여량으로 요구되는 보툴리눔 독소의 양은 매우 적다(예컨대, 나노 그램(ng)의 양이 요구됨). 전형적으로, 마이크로 파티클에 혼입될 필요가 있는 보툴리눔 독소의 양은 동일한 입자에 혼입된 알부민의 양보다 훨씬 적다. 따라서, 단백질 방출 연구를 위한 값은 알부민 방출 동역학을 측정함으로써 결정되었다.
마이크로 파티클은 건조 후 무게를 측정하고, 알부민 방출, 약물 로딩 및 형태 분석을 각각 연구하기 위해 10 mg 미만의 몇몇 샘플로 분리하였다. 1 mL의 디옥산에 시료를 용해시켜 약물 부하를 측정하였다. 샘플을 원심 분리하고, 상등액을 제거하고, 잔류하는 아연-침전물을 0.05 M 수산화나트륨 1 mL에 용해시켰다. 또는, 폴리머 마이크로 파티클을 디옥산/아세토니트릴 혼합물에 용해시키고 단백질 침전물을 0.1M 수산화나트륨에 용해시킨다. 두 방법 중 하나를 통해 단백질을 바이신코닉산(bicinchoninic acid,BCA) 분석법(Thermo Scientific 제품 번호 23225)으로 시험했다.
장기 알부민 방출을 위해, 0.1 % 아지드화 나트륨이 함유된 pH 7.4의 0.05 % Tween® 20(PBST)이 첨가된 0.01M 인산 완충 식염수 1mL에 37 ℃에서 3 분간 건조된 마이크로 파티클 샘플을 배양했다. 소정의 시점에서, 샘플을 10 초 동안 통증성하고, 7200 rpm에서 2 분간 원심 분리하고, 상등액을 분석을 위해 취했다. 알부민 함량은 BCA 분석에 의해 분석되었고 누적 방출이 기록되었다.
시험관 내 분해 촉진 시험
마이크로 파티클을 pH 3.0의 0.1M 초산 나트륨 완충액 1mL에 60 ℃에서 배양하였다. 각 제제로부터의 마이크로 파티클 샘플을 특정 시점에서 광학 현미경으로 관찰하였다. 마이크로 파티클의 모양이나 크기의 변화는 분해 시간을 결정하기 위해 기록되었다.
일반적으로 임상적으로 사용되는 보툴리눔 독소의 양은 100 단위 이하이다. 사용된 독소의 양은 알부민과 같은 다른 단백질로 희석되지 않는다면 100 ng의 범위로 취급하기가 매우 어렵다. 독소의 각 단위에 대해 약 1 mg의 혈청 알부민을 첨가하면 보툴리눔 독소의 활성 또는 방출 동력에 영향을 주지 않으면서 약 1:10,000의 알부민에 대한 독소의 비율을 제공하다. 따라서, 상이한 폴리머 마이크로 파티클 제제가 단백질 방출의 동력학에 미치는 영향을 결정하기 위해, 마이크로 파티클은 알부민 단독으로 로딩되었다.
결과
마이크로 파티클은 총 투여량의 처음 40-50 %가 비경구 투여 후 며칠 이내에 방출되고 나머지 투여량은 수주 내지 수개월에 걸쳐 천천히 방출되도록 알부민을 전달하도록 설계되었다.
단백질 방출 동력학은 사용된 PLGA의 유형에 의존하기 때문에, (1) 폴리머의 평균 분자량; (2) L:G 비; (3) 에스테르 또는 산 말 단기의 혼입으로 다양한 형태의 폴리머를 사용하여 마이크로 파티클을 제조하고 폴리(락트산)(PLA), 폴리(D-락트산)(PDLA), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 및 폴리 카프로락톤(PCL)을 포함한다.
알부민은 아연-침전된 단백질의 용매 세척 후에 생분해성 폴리머 마이크로 파티클에 장입되었다. 다양한 분자량 및 L:G 비의 생분해성 폴리머를 사용하여 50 ㎛ 마이크로 파티클을 제조했다. 생분해성 폴리머 농도는 10 % 미만에서 40 % 이상까지 다양했다. 알부민 농도는 총 무게의 5 % 미만에서 20 % 이상까지 분포했다. 생분해성 폴리머를 용해시키는 용매에는 디클로로메탄, 디옥산, 에틸 아세테이트 및 벤질 알콜이 포함된다. 초기 생분해성 폴리머 배합물의 방출 프로파일을 도 1에 나타내었다. 도 1에 도시된 바와 같이, 방출 프로파일은 마이크로 파티클을 제조하는데 사용된 조성물 및 방법에 따라 크게 변화한다.
알부민 방출 프로파일에 대해 몇 가지 일반적인 관찰이 이루어졌다:
1. PLLA 제제는 20,000~250,000Da의 분자량 범위에서 소 혈청 알부민(BSA)의 초기 방출을 최소화하기 위해 PDLA 제제보다 유리하다. 이는 폴리(L-락트산)(PLLA)의 높은 결정성 및 폴리(D-락트산)(PDLA)의 상대적으로 낮은 결정성 때문일 수 있다. 결정성이 높기 때문에 표면 근처의 BSA조차도 갇히고 버스트 방출이 최소화된다;
2. PDLA 및 PLLA의 혼합물로 제조된 마이크로 파티클은 하이브리드 방출 프로파일을 나타내며, 즉, 초기 버스트 방출은 개개의 폴리머 배합물에 의해 수득된 것 사이에 있었고, 이어서 정상 상태로 방출되었다;
3. PLLA와 PDLA의 50:50 물리적 혼합물로 제조된 마이크로 파티클 제제는 단지 12 %의 초기 방출 방출로 5 개월 이상 0 차 방출을 거의 나타내지 않았다;
4. 사용된 용매의 종류는 초기 버스트 방출의 정도에 영향을 미쳤다. 버스트 방출은 다이옥산 제형보다 디클로로메탄(DCM) 제형에 대해 더 높았다. DCM과 디옥산의 끓는점은 각각 39 ℃와 101 ℃이며 DCM의 건조가 빠를수록 초기 버스트 방출이 높아지기 때문에 폴리머 구조가 간결 해진다.
PLGA 제형의 방출 프로파일을 조절할 수 있는 능력은 장기 투여 형을 개발할 때 가장 중요한 요소 중 하나이다. 초기 버스트 방출, 정상 상태 방출 및 저하 시간을 제어할 수 있는 기능을 통해 거의 제로 오더 방출에서 일정 기간 동안 제공되는 여러 개의 박동 출시에 이르기까지 수많은 응용 프로그램에 대한 전달 시스템을 개발할 수 있다.
도 1의 데이터는 방출 프로파일이 폴리머 결정성(폴리머 유형에 의해 제어 됨), 폴리머 분자량, 폴리머의 L:G 비, 마이크로 파티클 형태 및 용매의 영향을 크게 받는다는 것을 보여준다. 이들 마이크로 파티클은 하이드로 겔 템플레이트 방법을 사용하여 제형화하였다.
실시예 2:폴리머 마이크로 파티클이 안전하게 투여될 수 있는 보툴리눔 독소의 양을 증가시킨다.
방법
보툴리눔 독소/알부민 함유 폴리머 마이크로 파티클의 제제
수용액 내 보툴리눔 독소와 알부민은 소금, 탄소 지방산, PEG, 용매, 아미노산, 염화 아연(아연Cl2) 등 다양한 침전제를 사용하여 침전되었다. 이 중 아연Cl2는 두 단백질을 침전시키는 능력과 침전된 단백질을 쉽게 처리할 수 있는 능력 때문에 선택되었다. 1 %(또는 73 mM)의 아연Cl2 농도에서, 용액 중의 99 %의 단백질이 침전되었다. 침전된 단백질을 원심 분리 및 동결 건조하여 수집하였다.
독소/알부민 분말을 유봉과 막자 사발을 사용하여 수동으로 분쇄하고 다양한 독소 양을 생분해성 폴리머 마이크로 파티클에 적재하였다. 알부민 방출 및 기타 동역학 연구를 위해 PLGA, PLLA, PDLLA 및 PCL을 포함한 다양한 폴리머가 사용되었다. 단순히 임상적 사용의 역사로 인해 PLGA가 독소 연구에 사용되었다.
마우스 마비 모델.
치료학적 치료를 위한 보툴리눔 독소의 효능은 마우스 단위로 측정된다. 마우스 1 단위의 보툴리눔 독소 A는 마우스의 특정 중량, 계통 및 성(예를 들어, 18-20 g 암컷 스위스-웹스터 마우스)의 50 %(LD50)에 치명적인 양으로 정의된다.
생쥐를 죽이지 않고 생체내에서 방출된 독소의 효능을 조사하기 위해 마우스 마비 모델을 사용했다. 생분해성 폴리머 마이크로 파티클 또는 겔 제제를 1mL 주사기에 부착된 25~27 게이지 바늘을 사용하여 근육 주사하여 마우스에 투여했다. 마우스 단위가 잘 정의되어 있지만, 효능은 독소의 준비 및 사용된 마우스 그룹에 따라 다를 수 있다. 이 연구에서 용액에 0.75 단위 이상의 독소를 주사하면 대부분의 마우스가 사망했다. 한편, 투여된 독소가 0.50 내지 0.75 단위의 범위에 있을 때, 마우스는 마비를 보였다. 따라서 마우스 마비 모델을 사용하여 독소 효능을 연구하는 데 사용할 수 있는 독소 투여량의 좁은 범위가 있었다. 마우스 마비는 숫자 외전 스코어(DAS) 분석법을 사용하여 분석되며 DAS 반응은 1에서 4까지의 범위를 가진다(Aoki, European Journal of Neurology, 6, S3-S10(1999), Aoki, KR) 쥐의 보툴리눔 신경 독소 혈청 형 A, B, F의 마진. "Toxicon 39.12(2001):1815-1820). 높은 DAS 반응은 강한 마비를 나타낸다. 독소 주입 후 마비가 용액 또는 폴리머 제제 중 어느 하나가 독소 효능의 척도로 사용되었다.
독소의 용량은 마우스 단위 1 개를 기준으로 설명하다. 마우스 단위 1 개는 약 1 ng이지만 최소 50 pg까지 가능하다. 단위당 생물학적 활성 독소의 정확한 양은 다양할 수 있으며 배치에 따라 다르다.
결과
보툴리눔 독소/알부민을 수작업으로 분쇄한 후 생분해성 폴리머 마이크로 파티클에 넣었다. 도 2는 서로 다른 독소 단위를 함유한 마이크로 파티클 주입 후 마비 정도의 결과를 보여준다.
총 독소 투여량이 3 단위 및 6 단위로 주입된 모든 마우스는 처음에 1 단위 이상이 방출 되었기 때문에 사망했다. 마이크로 파티클의 총 독소가 1.5 단위(용액으로 주사하면 마우스를 죽인다)일 때, 마우스의 마비는 45 일 동안 유지되었다.
또 다른 그룹에서는 0.5 단위 독소 용액을 주사한 대조군 마우스가 16 일 동안 만 마비를 보였다. 이 마우스 그룹에서 0.75 단위 용액 독소 살생 마우스를 주입 했으므로 용액에 0.5 단위 독소 만 주입했다. 반면에, 마이크로 파티클이 1.5 단위 독소의 총 투여량을 전달했지만, 마우스는 죽지 않았다. 대조적으로, 마우스는 용액 중에 0.5 단위의 독소가 주입된 마우스보다 훨씬 오래 마비되었다.
이 데이터는 마이크로 파티클 독소 전달 시스템이 보툴리눔 독소의 단일 투여의 효과를 확장시키는 안전한 수단임을 입증하다.
실시예 3:폴리머 마이크로 파티클이 보툴리눔 독소의 효능을 증가시킨다.
보툴리눔 독소/알부민-로딩된 폴리머 마이크로 파티클을 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하였다. 대조군 0.5 단위 용액은 마우스 마비를 약 16 일 동안 유지하는 반면, 마이크로 파티클 제제는 독소 효과를 독소 효과를 최대 37 일까지 연장시켰다 마이크로 파티클.
도 3에서 볼 수 있듯이 마이크로 파티클 제형에 의한 독소의 장기 효능은 마우스에 주입되는 독소의 양에 달려 있다. 저용량 독소가 함유된 생분해성 폴리머 마이크로 파티클의 마우스 마비 연구는 마이크로 파티클에 사용된 독소의 양이 독소의 영향에 대한 시간의 길이에 비례함을 입증했다. 독소의 양이 용액에서 0.75-1.00 단위를 초과하면 쥐가 죽는다. 대조적으로 동일한 양이 마이크로 파티클을 사용하여 전달되면 독소 효과는 생쥐를 죽이지 않고도 오래 지속된다.
실시예 4:서모겔들 중의 폴리머 마이크로 파티클이 보툴리눔 독소의 효능을 증가시킨다.
방법
에멀젼 법으로 제조된 아연-침전된 독소/알부민 입자를 서모겔에 분산시켜 아연-침전된 독소의 효능 및 이후의 용매 세척을 시험하였다. 또한 독소 효능의 연장에 대한 서모겔의 영향도 조사되었다.
저온(예컨대, 4 ℃)에서 수용액에 용해되는 PLGA-PEG-PLGA 트리 블록 공폴리머를 포함하는 서모겔은 체온에서 겔이되었다. 겔화 온도는 서모겔의 화학 구조 및 분자량에 따라 달라진다. 마이크로 파티클을 둘러싸고있는 겔이 존재하기 때문에, 독소 방출은 추가로 제어되었다. 서모겔없이 아연-침전물을 대조군으로 사용하였다. 서모겔을 4 ℃에서 20 %(w/v) 농도의 증류수와 염화 아연 용액(3 mg/mL)에 용해시켰다.
독소 서모겔 혼합물(50 μL)은 1 ML 주사기에 연결된 25 ~ 27 게이지 바늘을 사용하여 마우스에 근육 주사되었다.
결과
도 4에서 볼 수 있듯이 4 단위의 독소를 함유한 제제는 마우스를 죽이지는 못했지만 더 오래 지속되는 효능으로 더 강한 DAS 반응을 보였다. 습식 분쇄된 독소는 수동으로 토양 독소와 마찬가지로 효능을 유지했다. 다른 연구에서, 3 단위의 독소를 함유한 마이크로 파티클은 열 입자없이 주사된 쥐를 죽였다. 마이크로 파티클/서모 겔 제제에 대한 곡선 하의 면적, 즉 시간의 함수로서의 DAS 응답은 1 단위 대조군보다 약 4 배 더 높았다. 독소 효능은 전달된 전체 단위와 관련이 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 상이한 유형의 생분해성 폴리머로 제조된 마이크로 파티클은 다양한 방출 동력으로 로딩된 알부민(및 따라서 독소)을 방출할 수 있고 독소 효과는보다 높은 독소로도 2-4에 도시된 것보다 더 연장될 수 있다 금액.
실시예 5:아연-침전 보툴리눔 독소의 효능을 연장시키는 서모겔
방법
독소 방출을 조절하고 유지하는 데있어 다양한 유형의 서모겔의 영향을 조사하기 위해 아연-침전된 독소를 서모겔과 함께 증류수에 3 mg/mL의 아연 용액에 분산시켰다. 두 가지 유형의 서모겔이 2 또는 3 단위의 독소를 전달하는 데 사용되었다.
결과
도 5에서 볼 수 있듯이, 일반적으로 2 또는 3 단위의 독소를 함유한 서모겔(서모겔) 제제는 생쥐를 죽이지 않고도 독소 효능을 연장시켰다. 이러한 결과는 서모겔이 독소의 방출을 지연시키는 능력을 제공함을 나타낸다. 서모겔에 분산된 아연-침전된 독소의 효능을 유지하는 능력을 시험하기 위해 다양한 서모겔을 시험하였다. 사용된 서모 일겔은 PLGA-PEG-PLGA 트리 블록 공폴리머 및 Akina PolySciTech(West Lafayette, IN)로부터 입수 가능한 다른 유형의 블록 공폴리머를 포함한다. 표 3은 테스트한 서모겔을 나열하다. 서모겔은 졸-겔 전이 온도보다 높은 겔이된다. 아연-침전된 독소/알부민 입자를 서모 젤과 혼합하여 마우스에 주사하였다.
Figure pct00003
PDLL:폴리(DL-락티드); P(LCL):폴리(락티드-co-카프로락톤); mPEG:메톡시 PEG; PCL:폴리 카프로락톤; PLLGA-PEG-PLLGA:PLGA-PEG-PLGA에서 L-키랄 락티드, 그렇지 않으면 DL 라세미.
다양한 서모겔 제형에 의한 마우스 마비의 결과는 표 4에 요약되어 있다. 이 데이터는 일부 서모겔이 효과적이었고 다른 것은 효과가 없었음을 보여준다. 졸-겔 전이 온도가 너무 낮으면, 즉 실온이 낮으면 마우스에 주사하는 동안에도 용액이 겔을 형성하기 시작한다. 더 빠른 겔 형성은 많은 경우에 유리할 수 있지만, 어떤 경우에는 젤 형성이 주사 중에 발생하여 원하는 양의 독소를 마우스에 투여하는 결과를 낳는다. 요약하면, 약 37 ℃의 졸-겔 전이 온도를 갖는 서모겔은 대조군보다 더 높은 효능을 나타냈다.
Figure pct00004
실시예 6:아연-침전된 독소/알부민 침전물의 크기가 효능에 영향을 준다.
동결 건조된 아연-침전된 독소/알부민 분말 입자를 마이크로 미터 및 서브-마이크로 미터 크기 범위의 치수를 갖는 보다 작은 입자로 분쇄하였다.
방법
동결 건조된 아연-침전된 독소/알부민의 입자를 수동으로(즉, 유봉과 유체를 사용하여 수동으로) 또는 산화 지르코늄, 스테인레스 스틸, 마노, 텅스텐, 알루미나 또는 스틸 코어를 가진 테프론과 같은 다양한 플라스틱으로 만들어진 그라인딩 볼을 사용하는 유성형 볼밀 기계(Changsha Deco Equipment Co., China)를 사용하여 분쇄된다.
습식 분쇄를 위해, 동결 건조된 독소/알부민 입자를 디클로로메탄(DCM) 또는 n-부틸 아세테이트(nBA)의 유기 용매에 현탁시켰다. 습식 분쇄 공정은 드라이 아이스가 존재하지 않거나 존재할 때 수행되었다.
결과
동결 건조된 아연-독소/알부민 침전물을 수 시간 동안 수동으로 분쇄하여 약 10 ㎛의 평균 입자 크기를 생성시켰다.
유성 볼 밀링(즉, 건식 분쇄 또는 건식 분쇄라고 함)에 의해 분쇄될 때 평균 입자 크기는 10 배(즉, 약 1㎛ 이하의 크기로) 감소되었다. 건식 분쇄 공정은 시험 동물에서 감소된 마비에 의해 나타나는 바와 같이, 건식 분쇄 공정에 의해 유발된 에틸 시료의 온도 증가로 인해, 독성, 생물 활성을 현저하게 감소시켰다.
건식 분쇄 공정 중 온도 상승을 방지하기 위해, 분쇄 챔버는 유성 밀링 머신에서 드라이 아이스로 채워진 챔버로 둘러싸였고 분쇄 공정은 2 시간 동안 지속되었다. 1 시간 후에 챔버를 신선한 드라이 아이스로 채웠다.
드라이 아이스 챔버에 의해 제어된 온도로 건조 밀링에 의해 제조된 동결 건조된 아연-침전된 독소/알부민 입자는 보존된 독소 생체 활성을 나타내고, 건식 밀링 중 온도 증가가 독소 효능에 부정적으로 작용한다는 것을 입증하였다.
밀링 중의 온도 증가는 또한 유기 용매의 존재하에 동결 건조된 아연-침전된 독소/알부민 입자를 밀링함으로써 제거되었다. 이 과정을 습식 분쇄 또는 습식 분쇄라고 한다.
손 바닥과 유성 볼 밀링된 독소 샘플 모두 마이크로 파티클을 만드는데 사용되었다. 표 5에서 마우스 마비 분석의 결과는 드라이 아이스 챔버가 사용된 경우 및 드라이 아이스 챔버가 있는 경우와 없는 습식 분쇄 공정 중에 건조 분쇄 공정 중에 독소 활성이 유지됨을 보여준다.
Figure pct00005
동결 건조된 아연-침전된 독소/알부민 입자의 유기 용매에 대한 노출이 보툴리눔 독소의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 것을 확인하기 위해 아연-침전된 독소 입자를 유기 용매와 혼합하고, 주사 후 생체 내 독소 활성을 평가하였다 시험 동물.
표 6에 나타난 바와 같이 독소의 생체 활성은 n-부틸 아세테이트, 디옥산 또는 디클로로메탄에 노출된 후에도 유지되었다. 이러한 용매는 일반적으로 PLGA 마이크로 파티클 제조에 사용되므로 건조 및/또는 습식 분쇄에 의해 제조된 동결 건조된 아연-침전된 독소/알부민 입자를 폴리머 템플레이트 방법 또는 에멀젼 방법에 따라 마이크로 파티클로 제제화하기 위한 PLGA-용해 용매와 혼합 할 수있다.
Figure pct00006
실시예 7:유기 용매로의 수용액에서 아연-침전된 독소/알부민의 세척
방법
아연-침전된 보툴리눔 독소/알부민 분말을 수용액에 분산시키고 수혼화성 용매로 세척하여 침전물로부터 물을 제거하고 폴리머 용해 용액에 분산시켜 마이크로 파티클을 형성시켰다. 수용액 중의 독소/알부민 침전물을 원심 분리 (5,000 rcf, 2 분)에 의해 수집하였다. 상등액(물)을 제거하고, 물과 혼합 가능한 용매를 10:1 (용매:침전물) 이상의 부피비로 침전물에 첨가하고, 통증성 또는 교반에 의해 혼합하여 용매 세척된 독소/알부민 용액을 만들었다.
마이크로 파티클 내에 캡슐화된 보툴리눔 독소의 효능을 보존하는 능력에 대해 총 21 가지 세척 용제를 비교했다. 용매 세척 단계에 대해 평가된 용매 목록을 표 7에 제공한다. 각 시험 용매에 대해, 용매 세척된 독소/알부민 침전물을 원심 분리 (5000 rcf, 2 분)에 의해 수집하였다. 수집된 침전물을 3 mg/mL 염화 아연을 함유하는 용액을 첨가하여 희석하여 약 10 단위의 보툴리눔 독소를 함유하는 용액을 수득하였다. 보툴리눔 독소의 활성에 대한 세척 용제의 영향을 평가하기 위해 약 50 μL의 각 용매로 세척한 보툴리눔 독소 용액을 근육 내 (IM) 경로를 통해 시험 동물에 주입했다.
결과
표 7은 용매 세척 후 독소 활성을 유지하는 용매를 확인하는 데 사용되는 용매를 나열한다. 쥐에서 주사 후 48 시간 이내에 치사율이 유지됨에 따라 입증된 바와 같이, 1 ~ 14 번 열거된 용매는 용매 세척 후 독소 활성을 유지했다. 주사 후 48 시간 생존한 마우스의 생존에 의해 입증된 바와 같이, 15-21 번에 열거된 용매는 독소 활성을 유지하지 못했다. 주목할 것은, 용제 # 11-14가 독소 활성을 유지했지만, 이들 용매는 상대적으로 높은 점성을 나타내어 원심 분리에 의한 용매 세척된 침전물의 수집을 방해한다.
표 6은 약 2 단위/injection을 사용하여 수행된 마비 연구의 결과도 제공한다. 이 분석에서, 2와 4 사이의 DAS 반응은 생물학적 활성을 갖는 보툴리눔 독소를 나타낸다. 용매 번호 # 1-5 및 9는 용매로 세척되지 않은 대조 침전물과 유사한 효능을 보였다. 특히, 용매 1 내지 3 개 (즉, 아세톤, 아세토니트릴 및 디옥산)는 PLGA 마이크로 파티클을 제조하기 위한 독소/알부민 침전물을 세척하기 위한 우수한 후보 물질로 확인된 반면, 이는 이들이 PLGA를 용해시키기 때문이며, 시험된 다른 용매 (Nos. 4-21)는 확인되지 않았다.
Figure pct00007
용제 평가 시험에 근거하여 용제 세척된 독소/알부민 침전물을 PLGA 미립구 제조용으로 다이옥산, DCM, n-부틸 아세테이트 및 기타 용매에 용해된 PLGA와 혼합하였다.
실시예 8:용매로 세척된 독소가 장입된 PLGA 마이크로 파티클에 대한 에멀젼 방법
방법
파티클 제제
PLGA 750mg을 용매 5mL (DCM 또는 DCM/Dx = 1:1)에 녹여 냉장고 (4 ~ 10 ℃)에 보관하였다. 31,000 Da의 분자량을 갖는 PVA를 1 % (w/v)의 농도 ( "PVA-아연")의 증류수 및 염화 아연 용액 (3 mg/mL)에 용해시켰다. 솔벤트로 세척한 독소/알부민 침전물 (50mg)을 PLGA 용액에 10-20 초 동안 통증성하면서 분산시켜 오일 내 (S/O) 분산을 만들었다. PVA-아연 용액 (400 mL 용기에 250 mL)을 4,000 rpm에서 사각 구멍 고 전단 스크린 유형의 로터가 있는 L5M-A 실험실 믹서 (Silverson Machines, Inc.)를 사용하여 얼음 조에서 1 분 동안 균질화시켰다.
S/O 분산액을 5 mL 피펫을 사용하여 PVA-아연 용액에 0.25 mL/sec의 유속으로 첨가한 다음 15 분간 유화시켰다. 150 mL의 PVA-아연 용액을 균질화 유제 용액에 첨가하고 15 분 동안 연속적으로 유화시켰다. 그 후, 용액을 600 rpm에서 자기 교반하면서 1.6 L의 PVA-아연 용액에 신속하게 부었다. 교반은 10 ℃의 배양기에서 75 분 동안 계속되었다. 경화된 마이크로 파티클을 75㎛ 및 20㎛ 망으로 수집한 후, 3 내지 4ℓ의 증류수로 세척하였다. 마이크로 파티클를 5,000 rpm (4,500 rcf)에서 1 분간 원심 분리하고 밤새 동결 건조시켰다.
결과
마이크로 파티클은 S/O/W 에멀젼 방법을 사용하여 상이한 L:G 비율 및 용매의 PLGA 공폴리머로 제조되었다. 상이한 마이크로 파티클에 보툴리눔 독소를 로딩하는 효능을 표 8에 나타내었다. 표 8의 샘플 # 1 및 # 2를 용매 효과를 연구하기 위해 제조하고, 독소를 갖는 샘플 # 2 및 # 3을 PLGA L:G 비율. PLGA 75:25로 제조된 마이크로 파티클는 약 98 %의 단백질 로딩 효율 및 약 94 %의 PLGA 85:15를 가졌다. 결과는 솔벤트 세척된 독소가 포함된 S/O/W 에멀젼이 높은 생산성과 재현성을위한 안정된 조건을 제공함을 나타낸다 (표 8 참조).
Figure pct00008
실시예 9:에멀젼 방법으로 제조된 마이크로 파티클로부터 방출된 독소의 활성
방법
아연-침전된 독소/알부민을 제조하고 분액으로 나누었다. 일부 샘플은 대조군으로서 냉장고에 보관하고 다른 샘플은 용매 세척을 위해 유기 용매로 세척하였다. 독소/알부민 침전물을 녹이기 위해 모든 시료를 100 mM EDTA 500 μL가 들어있는 용액에 넣었다. 용해된 독소/알부민 침전물을 아미콘 울트라(Amicon ultra)-0.5 원심 필터 장치(Millipore, MW 10,000 Da 절단)에 옮겼다. 필터 장치를 13,000 rcf에서 3 분간 원심 분리하였다. 여액을 제거한 후, 순수를 필터 장치에 500㎕까지 첨가하고 원심 분리하여 EDTA 및 염화 아연을 제거하였다. 여액을 제거한 후, 50 mM Tris pH 7.5를 500 μL까지 필터 장치에 첨가하고 두 번 원심 분리하였다. 버퍼 교환된 독소/알부민은 필터 장치를 깨끗한 마이크로 튜브에 거꾸로 놓음으로써 회복되었다. 필터 장치를 원심 분리기에 넣고 13,000 rcf에서 3 분간 원심 분리하였다. 독소/알부민을 깨끗한 마이크로 튜브에 수집하였다. 샘플을 FRET 분석 (BioSentinel, Inc.의 BoTest 키트)을 사용하여 효소 활성에 대해 시험하였다.
용매로 세척한 독소를 사용하여 유제 방법으로 PLGA 마이크로 파티클을 제조하였다. 마이크로 파티클을 37 ℃, 0.1 % 아지화 나트륨 함유 PBS-Tween (0.05 %) (pH 7.5) 5 mL에 50 rpm의 진탕 배양기에서 현탁시켰다. 미리 결정된 시점에서, 각 시험관을 5,000 rpm에서 1 분간 원심 분리하고, Tetracore BTX 분석 키트로 보툴리눔 독소 ELISA 분석을 위해 microBCA 단백질 검정 키트로 알부민 방출 분석을 위해 상등액 500 μL를 회수하고, 공급자로부터의 표준 조작 절차에 따라 FRET 분석 키트로 독소 효소 활성 분석을 실시했다. 샘플링 후, 시험관을 진탕 배양기로 되돌려 놓았다.
결과
에멀젼 방법을 사용하여 제형화된 PLGA 85:15의 마이크로 파티클을 FRET 분석에 사용하여 1 내지 100 ng/mL의 독소 농도에서 독소 효소 활성을 검출하였다.
ELISA 분석과 함께 FRET 분석의 결과를 표 9에 제공한다. 결과는 ELISA에 의해 측정된 방출된 독소의 양은 FRET 분석에 의한 양과 유사하고 마이크로 파티클로부터 방출된 독소는 효소 적으로 활성이 있음을 입증하였다. FRET 분석은 마우스 마비 실험없이 독소의 효소 활성을 측정하는 쉽고 빠른 방법을 제공했다. 데이터는 FRET 분석에 의해 측정된 독소의 양이 전체 알부민 측정으로부터의 독소:알부민의 비율로부터 추정된 양보다 더 크다는 것을 나타냈다 (표 8 참조). 이는 용액 내의 독소의 대부분이 염화 아연에 의해 침전되고 독소 활성이 마이크로 파티클 제조 공정에서 감소하지 않았음을 시사한다.
Figure pct00009
실시예 10:가교된 히알루론산 겔에 포착된 마이크로 파티클
방법
오버 헤드 교반기를 사용하여 0.01M NaHPO4 완충액에 1 % FITC-표식된 히알루론산 (FITC-HA)을 용해시켜 마이크로 파티클을 캡슐화한 HA 가교 겔의 샘플을 제조 하였다. 마이크로 파티클은 40 ℃, 1000 rpm에서 마이크로 튜브 열 쉐이커를 사용하여 2 mL 바이알에 0.5 mL의 HA 용액에 분산시켰다. 다음으로, 가교 결합제 인 1,2,7,8-디에톡시 옥탄 (ODDE)을 흔들어 섞어서 물에 10 % v/v로 용해시키고, 10 % ODDE 19 ㎕를 마이크로 파티클/HA 혼합물에 첨가하면서 진탕시키면서 첨가 하였다. 용액을 40 ℃에서 2.5 시간 동안 흔들어 반응시킨 다음 4 ℃에서 밤새 보관 하였다. 이 슬러리를 강철 600 ㎛ (# 30 mesh) 체로 밀어 넣어 HA를 분쇄하고 펑크 캡이있는 2 mL 바이알에 넣었다. 이어서, 이것을 진공하에 2 내지 3 일 동안 진공 건조시켰다. 이어서, 이 슬러리를 물에 재용 해 재구성하여 형광 현미경 하에서 촬영 하였다.
결과
형성된 FITC-HA 겔은 PLGA 마이크로 파티클의 외부 주위를 캡슐화하는 것으로 관찰되었으며, FITC 태그의 형광 이미징을 사용하여 위치를 확인 하였다. HA 겔 캔은 PLGA 마이크로 파티클 뿐만 아니라 침전된 보툴리눔 독소 입자를 캡슐화하여 보툴리눔 독소 방출 속도를 연장하고 조절하는데 도움을 준다.

Claims (51)

  1. 하나 이상의 캡슐화된 단백질의 제어 방출을 위해 폴리머 마이크로 파티클를 제형화하는 방법으로서,
    (a) 단백질을 수용액에 용해시켜 단백질 용액을 형성시키는 단계;
    (b) 침전제를 형성하기 위해 상기 용액으로부터 단백질을 침전시키는 단계;
    (c) 선택적으로 침전제를 세척 용매로 1 회 이상 세척하여 용매로 세척된 침전제를 형성하는 단계;
    (d) 폴리머를 함유하는 용액에 침전제를 혼합 또는 분산시켜 폴리머-단백질 분산액을 형성하는 단계; 및
    (e) 폴리머-단백질 분산액으로부터 단백질을 캡슐화하는 폴리머 마이크로 파티클을 제조하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계(b)의 침전제가 L-히스티딘 메틸 에스테르, L-시스테인 에틸 에스테르, Nα-(3차-부톡시카르보닐)-L-아스파라긴, L-프롤린 벤질 에스테르, N-아세틸-L-트립토판, 젠티신산, 펜테틴산, 옥탄산, 아연 클로라이드, 및 이들의 조합로 이루어진 군에서 선택되는 침전제 것인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 침전화 제가 염화 아연인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 세척 용매가, 아세톤, 아세토니트릴, 디옥산, 에탄올, 2-메톡시 에틸 아세테이트, 메톡시 에탄올, 에톡시 에탄올, 부톡시 에탄올, 2-프로판올 프로필렌 글리콜 메틸에테르, 에탄디올, 1,2-프로판디올, 3차-부틸 알코올, 디에틸렌 글리콜 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 폴리머 용매가 벤질 알콜, n-부틸 아세테이트, 클로로벤젠, 클로로포름, 디옥산, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 에틸 벤조네이트, 에틸 포르메이트, 메틸 포르메이트, 메틸 n-프로필 케톤, 펜에틸아민, 트리아세틴, 트리클로로 에틸렌 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 폴리머 용매가 디옥산 및 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트 및 디클로로메탄의 조합인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 폴리머 용매 분산액이 마이크로 패턴화된 템플레이트를 사용하여 마이크로 파티클로 형성되는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 마이크로 패턴화된 템플레이트는 폴리(비닐 알콜)을 포함하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 마이크로 파티클이 폴리머-단백질 분산액을 비-폴리머 용매에 첨가하여 에멀젼을 형성시킴으로써 형성되는 것 인 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 비-용매가 폴리머를 용해시키는 유기 용매 또는 용매로 예비-컨디셔닝된 수성 용매인 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 예비 컨디셔닝에 사용되는 유기 용매가 디클로로메탄 인 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 에멀젼은 수용액에서 0.1 % 내지 1.3 % 농도의 디클로로메탄을 포함하는 것인 방법.
  13. 제 9 항에 있어서, 예비 컨디셔닝에 사용되는 유기 용매가 에틸 아세테이트 인 방법.
  14. 제 9 항에 있어서, 상기 에멀젼은 0.1 중량 % 내지 8.7 중량 % 농도의 에틸 아세테이트를 수용액으로 포함하는 것 인 방법.
  15. 제 9 항에 있어서, 약물-폴리머 에멀젼을 오버헤드 교반기 또는 고속 균질 기로 혼합하는 방법.
  16. 제 9 항에 있어서, 에멀젼이 L-히스티딘 메틸 에스테르, L-시스테인 에틸 에스테르, Nα-(3차-부톡시카르보닐)-L-아스파라긴, L-프롤린 벤질 에스테르, N-아세틸-L-트립토판, 젠티신산, 펜테틱산, 옥탄산 또는 염화 아연으로 이루어진 군에서 선택되는 용해 방지제를 포함하는 수성 에멀젼인 것인 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 용해 방지제가 염화 아연 인 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 염화 아연의 농도가 0.1 % 내지 10 % w/v 인 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 단백질이 보툴리눔 독소 유형 A, B, C, D, E, F, G 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 보툴리눔 독소를 포함하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 보툴리눔 독소가 A 형 보툴리눔 독소 인 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 약 1 단위 내지 약 50,000 단위의 보툴리눔 독소 A가 마이크로 파티클와 결합되는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 마이크로 파티클와 관련된 보툴리눔 독소의 양은 약 100 단위 내지 약 30,000 단위의 보툴리눔 독소 A인 것을 특징으로하는 방법.
  23. 제 19 항에 있어서, 약 100 단위 내지 약 30,000 단위의 보툴리눔 독소 B가 마이크로 파티클과 결합하는 방법.
  24. 제 1 항에 있어서, 단백질이 혈청 알부민 단백질을 포함하는 방법.
  25. 제 1 항에 있어서, 폴리머가 생분해성 폴리머 인 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 생분해성 폴리머가 폴리락티드, 폴리(락티드-코-글리콜라이드), 폴리카프로락톤, 폴리오르토에스테르, 폴리(에스테르 아미드), 폴리 무수물, 폴리(p-디옥사논), 폴리(에틸렌 글리콜) 블록 공폴리머, 콜라겐 및 다른 단백질, 히알루론산 및 기타 폴리사카라이드, 핵산, 렌드 및 그의 공폴리머로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 폴리머가 약 50:50 내지 100:1의 L:G 비를 갖는 폴리(락티드-코-글리콜리드) 인 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 폴리머가 약 75:25 내지 85:15의 L:G 비율을 갖는 폴리(락티드-코-글리콜리드) 인 방법.
  29. 제 1 항에 있어서, 용매 세척이 아세톤, 아세토니트릴, 디옥산, 에탄올, 2-메톡시 에틸 아세테이트, 메톡시 에탄올,에톡시 에탄올, 부톡시 에탄올, 2-프로판올, 프로필렌 글리콜 메틸 에테르, 에탄디올, 1,2 프로판디올, 3차 부틸 알콜, 디에틸렌 글리콜, 메탄올, N-메틸피롤리돈, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 피리딘, 테트라히드로푸란 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된느 것인 방법.
  30. 제 1 항에 있어서, 용매 세척이 단백질 활성을 유지하고 용매가 아세톤, 아세토니트릴, 디옥산, 에탄올, 2-메톡시 에틸 아세테이트, 메톡시 에탄올,에톡시 에탄올, 부톡시 에탄올, 2-프로판올, 프로필렌 글리콜 메틸 에테르, 에탄디올, 1,2-프로판디올, 3차-부틸 알코올, 디에틸렌 글리콜 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된느 것인 방법.
  31. 제 1 항에 있어서, 침전제가 용매 세척의 부재하에 또는 용매 세척 후에 동결 건조에 의해 건조되는 방법.
  32. 제 1 항에 있어서, 용매로 세척된 침전물을 폴리머 용액과 직접 혼합하는 방법.
  33. 제 1 항에 있어서, 건식 또는 습식 분쇄에 의해 침전제의 크기를 감소시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 분쇄 온도가 고화된 이산화탄소 또는 액체 질소의 온도에서 조절되는 방법.
  35. 제 33 항에 있어서, n-부틸 아세테이트, 디옥산, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트 또는 이들의 조합과 혼합된 침전물의 습식 분쇄를 포함하는 방법.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제형화된, 단백질을 캡슐화하는 다수의 폴리머 마이크로 파티클을 포함하는 약학 조성물.
  37. 제 36 항에 있어서, 수성 감열성 폴리머 용액으로 구성된 희석제에 분산된 약학 조성물.
  38. 제 37 항에 있어서, 수성 감열성 폴리머 용액이 4 ℃ 내지 40 ℃의 범위 내에서 액체와 겔 사이에서 전이하는 약학 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서, 수성 감열성 폴리머 용액이 20 ℃ 내지 38 ℃의 범위 내에서 액체와 겔 사이에서 전이하는 약학 조성물.
  40. 제 37 항에 있어서, 수성 감열성 폴리머가 폴리(락티드-코-글리콜리드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(락티드-코-글리콜라이드), 폴리(락 타이드)-b (에틸렌 글리콜)-b-폴리(락티드-코-카프로락톤), 폴리(카프로락톤)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(카프로락톤), 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(카프로락톤) 또는 이들의 조합에서 선택되는 약학 조성물.
  41. 제 37 항에 있어서, 수성 감열성 폴리머 용액이 수용액에서 5 % 내지 40 % (w/v)의 농도로 포함되는 약학 조성물.
  42. 제 41 항에 있어서, 수성 감열성 폴리머 용액이 10 내지 30 % (w/v)의 농도로 수용액에 첨가되는 약학 조성물.
  43. 제 36 항에 있어서, 겔 형성 용액 또는 겔로 이루어진 희석제에 분산된 약학 조성물.
  44. 제 43 항에 있어서, 겔 형성 용액이 히알루론산이고 겔이 가교된 히알루론산 인 약학 조성물.
  45. 제 36 항에 있어서, 단백질이 보툴리눔 독소 유형 A, B, C, D, E, F, G 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 보툴리눔 독소를 포함하는 약학 조성물.
  46. 제 36 항에 있어서, 하나 이상의 치료제, 예방제 또는 진단제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  47. 제 1 항의 방법에 따라 제형화된 다수의 Zn-침전된 보툴리눔 독소/알부민을 포함하는 약학 조성물.
  48. 제 47 항에 있어서, 수성 감열성 폴리머 용액으로 구성된 희석제에 분산된 약학 조성물.
  49. 제 47 항에 있어서, 수성 겔로 구성된 희석제에 분산된 약학 조성물.
  50. 하나 이상의 질환, 미용 결핍의 장애를 치료하는 방법으로서, 질환의 장애, 질환 또는 미용적 결점의 하나 이상의 증상을 감소 또는 예방하기 위하여, 제 36 항의 약학 조성물의 유효량을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 치료될 하나 이상의 질병, 장애 또는 미용 결핍은 출혈성 방광염, 간질성 방광염/통증성 방광 증후군, 출혈성 방광염, IC/PBS, 혈뇨, 요실금, 치골상 통증, 염증 및 요폐, 사시, 통제되지 않은 깜박임(눈꺼풀 패종), 근육 경직/경련, 자궁경부 근긴장 이상증, 사경, 발한, 바람직하지 않은 주름, 두통 및 편두통을 포함하는 군에서 선택되는 것인 방법.
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