ES2914784T3 - Conjugados de bacitracina-oligómeros de alginato - Google Patents

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Abstract

Un conjugado de bacitracina-oligómero de alginato que comprende un antibiótico de la clase bacitracina conectado de forma covalente a al menos un oligómero de alginato a través de un enlace covalente directo o un conector molecular covalente, en el que dicho oligómero de alginato tiene 2 a 50 residuos de monómero, o una sal, solvato, hidrato, diastereoisómero, tautómero o enantiómero farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de bacitracina-oligómeros de alginato
La presente invención proporciona una forma modificada novedosa de antibióticos de la clase bacitracina que tiene propiedades ventajosas. En particular, se ha encontrado que al proporcionar antibióticos de la clase bacitracina como conjugados con oligómeros de alginato, el espectro de actividad del antibiótico, que normalmente en forma no conjugada se restringe a bacterias gram-positivas, se puede ampliar sorprendentemente para incluir bacterias gramnegativas. De acuerdo con lo anterior, la invención está dirigida a proporcionar usos y métodos médicos que utilizan conjugados de bacitracina-oligómero de alginato en el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas. La invención proporciona adicionalmente métodos para preparar los conjugados de la invención.
Se conocen antibióticos efectivos contra bacterias Gram negativas y se ha mostrado que su eficacia se puede mejorar mediante la adición de fragmentos de oligómeros de alginato (véase documento WO 2010/139956 A1).
Sin embargo, el uso terapéutico de los antibióticos de la clase bacitracina conocidos se restringe actualmente al tratamiento de infecciones con bacterias Gram positivas porque dichos antibióticos tienen una eficacia muy limitada, si es que tienen alguna, contra las bacterias Gram negativas. Cualquier eficacia contra las bacterias Gram negativas que se pueda observar experimentalmente es normalmente tan pequeña que las cantidades requeridas para ejercer un efecto terapéutico darían lugar a efectos secundarios inaceptables. Ahora se ha observado que conjugar de forma covalente oligómeros de alginato con antibióticos de la clase bacitracina amplía el espectro de actividad terapéuticamente útil contra especies de bacterias tales como las bacterias Gram negativas. En otras palabras, los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato son una clase de entidades químicas novedosas que tienen una eficacia antibacteriana terapéuticamente útil contra bacterias Gram negativas y Gram positivas. Los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato de la invención representan por lo tanto agentes terapéuticos mejorados para el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas en sujetos animales. Los antibióticos de la clase de bacitracina son una clase bien conocida y bien caracterizada de antibióticos de polipéptidos cíclicos que inhiben la síntesis de la pared celular bacteriana (Ming, L-J., et al., 2002, Journal of Inorganic Chemistry, Vol 91(1):46 -58, que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad). La bacitracina se aisló inicialmente de cultivos de Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis y desde entonces se ha descubierto que este aislado es una mezcla compleja de congéneres dodecapeptídicos estructuralmente similares. Los congéneres más prevalentes en dichos aislados hasta la fecha se han denominado bacitracina A1, A2, B1, B2, B3, C, D1, D2, D3, E, F, G, H1, H2, H3, I1, I2, I3 y X. Se considera que la bacitracina A1, A2, B1, B2, B3, C, D1, D2, D3 y E tienen la mayor eficacia antibiótica y las preparaciones de bacitracina naturales normalmente están comprendidos predominantemente de bacitracina A y bacitracina B.
Los antibióticos de la clase de bacitracina se pueden describir generalmente como dodecapéptidos cíclicos ramificados, más específicamente péptidos heptacíclicos que tienen una cadena lateral pentapeptídica, que demuestran eficacia antibiótica, que se considera es principalmente en virtud a la inhibición de la síntesis de la pared celular bacteriana. Más específicamente, se considera que los antibióticos de la clase de bacitracina se unen al pirofosfato de undecaprenilo, lo que impide el reciclaje de este portador de azúcar durante la síntesis de peptidoglicano y esto, a su vez, inhibe la síntesis de la pared celular bacteriana. Las especies Gram positivas pueden tener paredes celulares que contienen hasta un 90% de peptidoglicano, mientras que las especies Gram negativas pueden tener tan solo un 10%. Se considera que esto explica los aparentes efectos antibacterianos selectivos de la bacitracina contra las especies Gram negativas y Gram positivas. La actividad antibacteriana depende de la formación de complejos con cationes de metales divalentes, por ejemplo, Zn2+, Mg2+, Mn2+, y Co2+.Como tales, se han propuesto derivados que portan una variedad de grupos quelantes de metales (documento WO 97/47313).
Funcionalmente, la clase es muy eficaz contra bacterias Gram positivas, especialmente bacilos y cocos Gram positivos, que incluyen Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Micrococcus y Clostridium. Por el contrario, la eficacia contra las bacterias Gram negativas es muy limitada y normalmente en la medida en que las cantidades requeridas para la eficacia terapéutica se asocian con efectos secundarios normalmente inaceptables. Sin embargo, el uso sistémico se asocia con problemas de toxicidad (es decir, toxicidad para el sujeto o “anfitrión” al que se administra el antibiótico de la clase de bacitracina, a saber, “toxicidad del anfitrión”), en particular nefrotoxicidad. El uso tópico localizado y el uso oral para tratar infecciones del GI (la bacitracina se absorbe poco en el tracto GI) es menos problemático.
Subsiste la necesidad continua de antibióticos novedosos y también formas para hacer que los antibióticos existentes sean más flexibles de utilizar.
Los oligómeros de alginato se han descrito extensamente en la literatura. Brevemente, los alginatos son polímeros lineales de ácido p-D-manurónico (M) conectado (1-4) y/o su epímero C-5 de ácido a-L-gulurónico (G). La estructura primaria de los alginatos puede variar mucho. Los residuos de M y G se pueden organizar como bloques homopoliméricos de residuos de M o G contiguos, como bloques de residuos de M y G alternos y residuos de M o G individuales que se pueden encontrar intercalados entre estas estructuras de bloques. Una molécula de alginato puede comprender algunas o todas estas estructuras y dichas estructuras pueden no estar uniformemente distribuidas por todo el polímero. En extremo, existe un homopolímero de ácido gulurónico (poliguluronato) o un homopolímero de ácido manurónico (polimanuronato). Los oligómeros de alginato se pueden obtener a partir de polímeros de alginato que normalmente se aíslan de fuentes naturales como polímeros grandes de alto peso molecular (por ejemplo, un peso molecular promedio en el rango de 300.000 a 500.000 Dalton). Dichos polímeros de alginato grandes se pueden degradar o descomponer, por ejemplo, mediante hidrólisis química o enzimática para producir estructuras de alginato de menor peso molecular.
Como se muestra en los Ejemplos, ahora se ha encontrado que la conjugación covalente de antibióticos de la clase bacitracina con oligómeros de alginato crea una nueva entidad química con eficacia antibacteriana contra las bacterias Gram-negativas.
De acuerdo con lo anterior, en un primer aspecto la invención proporciona un conjugado de bacitracina-oligómero de alginato que comprende un antibiótico de la clase bacitracina conectado de forma covalente a al menos un oligómero de alginato a través de un enlace covalente directo o un conector molecular covalente, en el que el oligómero de alginato tiene 2 a 50 residuos de monómero.
También se pude describir los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato por la Fórmula I:
B-(L-A)n (I)
en la que B- es un antibiótico de la clase bacitracina, L es un enlace covalente directo o un conector molecular covalente, -A es un oligómero de alginato y n es un entero de 1 a 10, por ejemplo, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 2 o 1.
De acuerdo con la invención, un antibiótico de la clase de bacitracina se define ampliamente como un dodecapéptido cíclico que demuestra eficacia antibacteriana, en el que dicho péptido consiste en un péptido heptacíclico con una cadena lateral de pentapéptido. Específicamente se contemplan en el presente documento las bacitracinas de origen natural o derivados funcionalmente equivalentes de las mismas que retienen la eficacia antibacteriana, que incluyen las formas totalmente sintéticas y semisintéticas. Por lo tanto, con el término antibiótico de la clase de bacitracina se incluyen la bacitracina A1, A2, B1, B2, B3, C, D1, D2, D3, E, F, G, H1, H2, H3, I1, 12, 13 y X. por ejemplo, como se describe, entre otros, en Ming, L-J., et al., supra, and Economou, NJ. et al, 2013, Vol 110, 14207-14212. Los derivados funcionalmente equivalentes se describen, entre otros, en los documentos WO 97/47313, WO 2011/051073 y WO 2011/051071.
A modo de ejemplo, un antibiótico de la clase de bacitracina se puede representar por la Fórmula II
Figure imgf000003_0001
Asn[121 (II)
Figure imgf000003_0003
en la que Leu es leucina; Glu es ácido glutámico; Lys es lisina; Orn es ornitina; Phe es fenilalanina; His es histidina; Asp es ácido aspártico; Asn es asparagina;
Y es valina, isoleucina, leucina o 5-metileno-isoleucina;
Z es valina, isoleucina, leucina o 5-metileno-isoleucina; y
X es W[1]-Cys[2] o V[1]-Thz[2]; en la que
W es valina, isoleucina, leucina o 5-metileno-isoleucina y Cys es cisteína; y V es
H2 N-C(R)H
en la que R es la cadena lateral a de valina, isoleucina, leucina o 5-metileno-isoleucina; y
Thz es un anillo de tiazolina
Figure imgf000003_0002
que es 2' acoplado a V y 4' acoplado al carbono a de Leu[3].
En la fórmula II, la amina £ de Lys[6] se acopla al grupo carboxilo a de Asn[12] mediante un enlace peptídico.
De acuerdo con la invención, las referencias a los antibióticos de la clase de bacitracina se extienden a los derivados antibacterianos de Fórmula II, es decir, derivados funcionalmente equivalentes que retienen (por ejemplo, tienen al menos el 70%, 80%, 90% o 95% de la) eficacia antibacteriana de la bacitracina A1 y/o A2, en la que uno o más de los aminoácidos Leu[3], Glu[4], Orn[7], Phe[9], His[10] o Asp[11 se reemplaza por otro residuo de aminoácido que se puede seleccionar de aminoácidos naturales o no codificados genéticamente, por ejemplo, leucina, treonina, ácido, fenilalanina, arginina, histidina, lisina, asparagina, serina, cisteína, homolisina, ornitina, ácido diaminobutírico (por ejemplo, ácido a,Y-diaminobutírico), ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiónico, homoarginina, trimetilisina, trimetilornitina, ácido 4-aminopiperidina-4-carboxílico, ácido 4-amino-1-carbamimidoilpiperidina-4-carboxílico y 4-guanidinofenilalanina.
De acuerdo con la invención, las referencias a los antibióticos de la clase de bacitracina se extienden a los equivalentes antibacterianos de fórmula II, es decir, equivalentes funcionales que retienen (por ejemplo, tienen al menos el 70%, 80%, 90% o 95% de) la eficacia antibacteriana de la bacitracina A1 y/o A2, en la que Thz se sustituye con un flúor, cloro o bromo, o un grupo alquilo o alcoxi C1-C4 alifático lineal o ramificado insaturado o saturado, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, tert-butilo, etileno, propileno, butileno, hidroxi, metoxi, etiloxi, propiloxi, iso-propiloxi, grupo butiloxi, iso-butiloxi, sec-butiloxi, tert-butiloxi o versiones sustituidas con halógeno de los mismos.
Preferiblemente, el aminoácido de sustitución es un aminoácido con una cadena lateral catiónica, es decir, un aminoácido que tiene una cadena lateral que tiene una carga neta positiva al pH intracelular de una célula tumoral, por ejemplo, alrededor de pH 7.4. De los aminoácidos codificados genéticamente, esto incluiría la lisina y la arginina, pero se puede utilizar cualquier aminoácido modificado o no codificado genéticamente que lleve dicha carga positiva neta sobre su cadena lateral, por ejemplo, aquellos aminoácidos que lleven una cadena lateral con un grupo guanidino o un grupo amino u otro fracción catiónica, por ejemplo, derivados de la lisina y la arginina, en el que cualquier hidrógeno de la cadena lateral, excepto el hidrógeno de protonación, se sustituye con un átomo de halógeno, por ejemplo, flúor, cloro o bromo, o un grupo alcoxi o alquilo C1-C4 insaturado o saturado alifático lineal, ramificado, por ejemplo, grupo metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, tert-butilo, etileno, propileno, butileno, hidroxi, metoxi, etiloxi, propiloxi, iso-propiloxi, butiloxi, iso-butiloxi, sec-butiloxi, tert-butiloxi o versiones sustituidas con halógeno de los mismos. Los aminoácidos no codificados genéticamente adecuados con cadenas laterales catiónicas incluyen homolisina, ornitina, ácido diaminobutírico, ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiónico y homoarginina, así como trimetilisina y trimetilornitina, ácido 4-aminopiperidina-4-carboxílico, ácido 4-amino-1-carbamimidoilpiperidina-4-carboxílico y 4-guanidinofenilalanina.
Un aminoácido es una molécula que contiene un grupo amina, un grupo ácido carboxílico y al menos un carbono que separa estos dos grupos. Se pueden adherir otros grupos a los carbonos de separación. Estos grupos se pueden denominar “cadenas laterales” aunque, en su forma más simple, las cadenas laterales podrían ser hidrógeno (glicina). Los aminoácidos con un solo carbono de separación se denominan “a-aminoácidos” y tienen la fórmula genérica H2NCR1R2COOH, donde Ri y R2 son grupos sustituyentes, es decir, son cadenas laterales. El carbono que se separa se conoce como carbono a. Existen otros tipos de aminoácidos en los que los grupos amino y ácido carboxílico están separados por más de un solo átomo de carbono; por ejemplo, en los p-aminoácidos el átomo de carbono al que pertenece el grupo amino se separa del grupo ácido carboxílico por dos átomos de carbono y en los Y-aminoácidos tres átomos de carbono separan los grupos amino y ácido carboxílico. Preferiblemente, los aminoácidos en el antibiótico de la clase de bacitracina de uso en la invención serán a, p o Y-aminoácidos, más preferiblemente a o p-aminoácidos y lo más preferiblemente a-aminoácidos.
Los aminoácidos, con la excepción de la glicina, pueden existir como dos o más estereoisómeros. En particular, el carbono a de un aminoácido distinto de la glicina es un centro quiral y, por lo tanto, da lugar a dos formas enantioméricas de cada aminoácido. Estas formas a menudo se denominan formas D y L, por ejemplo, D-alanina y L-alanina. Los aminoácidos con centros quirales adicionales existirán en cuatro o más estereoisómeros posibles, por ejemplo, la treonina tiene dos centros quirales y, por lo tanto, puede existir en una de cuatro formas estereoisómeras. Cualquier forma estereoisómera de un aminoácido puede estar presente en las moléculas antibióticas de la clase de bacitracina de uso en la invención. Para los propósitos de describir la presente invención, cuando el término “no codificado genéticamente” se aplica a los aminoácidos, esto no incluye las formas D de los aminoácidos que se encuentran en la naturaleza en la forma L.
En realizaciones preferidas, el antibiótico de clase de bacitracina se selecciona de bacitracina A i, A2, B1, B2, B3, C, Di, D2, D3, E, F, G, H1, H2, H3, I1, I2, I3, y X, más preferiblemente seleccionados de A1, A2, B1, B2, B3, C, D1, D2, D3 y E, y más preferiblemente de bacitracina A (A1 y/o A2) y bacitracina B (B1 y/o B2). Estas bacitracinas se pueden representar por la Fórmula III:
R'L-Le u-D-Glu-L-Y-L- Lys-D-0 m-L-Z-D-P h e-L- H is-D-As p-L-Asn (II)
Figure imgf000004_0001
en la que
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0002
De acuerdo con la invención, los antibióticos de la clase de bacitracina preferidos son derivados funcionalmente equivalentes de las bacitracinas mencionadas inmediatamente antes, es decir, equivalentes funcionales que retienen (por ejemplo, tienen al menos el 70%, 80%, 90% o 95 % de) la eficacia antibacteriana de la bacitracina en cuestión. En determinadas realizaciones, el antibiótico de la clase de bacitracina puede formar complejos con cationes metálicos divalentes, por ejemplo, Zn2+, Mg2+, Mn2+, y Co2+.
En ciertas realizaciones, uno o más grupos de amina libres en el antibiótico de la clase de bacitracina se pueden enmascarar mediante modificación, por ejemplo, mediante sulfometilación.
Como se indicó anteriormente, los alginatos se presentan normalmente como polímeros de una masa molecular promedio de al menos 35.000 Dalton, es decir, de aproximadamente 175 a aproximadamente 190 residuos de monómero, aunque normalmente mucho mayor. Un oligómero de alginato de acuerdo con la presente invención, por otro lado, contendrá de 2 a 50 residuos de monómero, más normalmente 3, 4, 5 o 6 a 50, y puede contener 2, 3, 4, 5 o 6 a 50, 2, 3, 4, 5 o 6 a 40, 2, 3, 4, 5 o 6 a 35 o 2, 3, 4, 5 o 6 a 30 residuos. Por lo tanto, un oligómero de alginato para uso de acuerdo con la invención tendrá normalmente un peso molecular promedio de 350, 550, 700, 900 o 1000 a 10.000 Dalton, 350, 550, 700, 900 o 1000 a 8000 Dalton, 350, 550, 700, 900 o 1000 a 7000 Daltons, o 350, 550, 700, 900 o 1000 a 6000 Daltons.
Dicho alternativamente, el oligómero de alginato puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn) de 2 a 50, preferiblemente 2 a 40, 2 a 35, 2 a 30, 2 a 28, 2 a 25, 2 a 22, 2 a 20, 2 a 18, 2 a 17, 2 a 15 o 2 a 12.
Otros rangos representativos (ya sea para el número de residuos, DP o DPn) incluyen uno cualquiera de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 11 a uno cualquiera de 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13 o 12.
Otros rangos representativos (ya sea para el número de residuos, DP o DPn) incluyen uno cualquiera de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 a uno cualquiera de 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17 o 16.
Otros rangos representativos (ya sea para el número de residuos, DP o DPn) incluyen uno cualquiera de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 a uno cualquiera de 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21,20 o 19.
En algunas realizaciones, puede ser ventajoso seleccionar un oligómero de alginato más grande para crear un conjugado de mayor tamaño. Los conjugados más grandes pueden ayudar a suministrar los antibióticos de la clase bacitracina de forma selectiva a los sitios y ubicaciones de la infección porque la permeabilidad vascular de dichas áreas dentro de un sujeto es normalmente mayor que en la vasculatura de las áreas no infectadas. En consecuencia, es menos probable que los conjugados más grandes ingresen en áreas no infectadas desde el torrente sanguíneo, pero podrían ingresar en áreas infectadas más permeables. Un rango de tamaño representativo para un oligómero más grande puede ser, por ejemplo, de 20 a 50 residuos (o DP o DPn de 20 a 50) o uno cualquiera de 20, 21, 22, 23, 24 o 25, a uno cualquiera de 50, 45, 40, 35 o 30 residuos (o DP o DPn de cualquiera de estos rangos) o uno cualquiera de 30, 31, 32, 33, 34 o 35, a uno cualquiera de 50, 45 o 40 residuos (o DP o DPn de cualquiera de estos rangos). Alternativamente, estos resultados también se podrían lograr al aumentar el número de oligómeros de alginato, incluso aquellos de menor tamaño, en el conjugado.
Un oligómero de alginato, como se indicó anteriormente, contendrá (o comprenderá) residuos o unidades de guluronato o ácido gulurónico (G) y/o mannuronato o ácido manurónico (M). Un oligómero de alginato de acuerdo con la invención estará compuesto preferiblemente solo o sustancialmente solo (es decir, consistirá esencialmente en) residuos de uronato/ácido urónico, más particularmente solo o sustancialmente solo de residuos G y/o M. Expresado alternativamente, en el oligómero de alginato para uso en la presente invención, al menos el 80%, más particularmente al menos el 85, 90, 95 o 99% de los residuos de monómero pueden ser residuos de uronato/ácido urónico, o, más particularmente, residuos de G y/o o M. En otras palabras, preferiblemente el oligómero de alginato no comprenderá otros residuos o unidades (por ejemplo, otros residuos de sacárido, o más particularmente otros residuos de ácido urónico/uronato).
El oligómero de alginato es preferiblemente un oligómero lineal.
Más particularmente, los oligómeros de alginato propuestos para uso de acuerdo con la presente invención contendrán al menos 70% de los residuos de G (es decir al menos 70% de los residuos de monómero del oligómero de alginato serán residuos de G). Por lo tanto las realizaciones específicas contienen oligómeros de alginato con (por ejemplo, que contienen) 70 a 100% de residuos de G (guluronato).
Preferiblemente al menos 75% o 80%, más particularmente al menos 85% o 90%, incluso más particularmente al menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de los residuos de monómero son guluronato. En una realización el oligómero de alginato puede ser un oligoguluronato (es decir un homooligómero de G, o 100% de G).
En una realización preferida adicional, los alginatos descritos anteriormente de la invención tienen una estructura primaria en la que la mayoría de los residuos de G están en los llamados bloques de G. Preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 70 o 75%, y lo más preferiblemente al menos 80, 85, 90, 92 o 95% de los residuos de G están en bloques de G. Un bloque de G es una secuencia contigua de al menos dos residuos de G, preferiblemente al menos 3 residuos contiguos de G, más preferiblemente al menos 4 o 5 residuos contiguos de G, lo más preferiblemente al menos 7 residuos contiguos de G.
En particular al menos 90% de los residuos de G se conectan 1-4 a otro residuo de G. Más particularmente al menos 95%, más preferiblemente al menos 98%, y lo más preferiblemente al menos 99% de los residuos de G del alginato se conectan 1-4 a otro residuo de G. Más específicamente al menos 70% de los residuos de monómero en el oligómero son residuos de G conectados 1-4 a otro residuo de G, o más preferiblemente al menos 75%, y lo más preferiblemente al menos 80, 85, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de los residuos de monómero del oligómero son residuos de G conectados 1-4 a otro residuo de G. Esta conexión 1-4 de dos residuos de G se puede expresar alternativamente como una unidad gulurónica unida a una unidad gulurónica adyacente.
Los oligómeros de alginato de uso en la invención son comúnmente denominados por el experto como oligómeros de “G altos” o “bloque de G” es decir que tienen un alto contenido de residuos de G o bloques de G (por ejemplo, en los que al menos 70% de los residuos de monómero son G, preferiblemente dispuestos en bloques de G).
El oligómero de alginato de uso en la invención es de preferiblemente uno de 3 a 35 meros, más preferiblemente uno de 3 a 28 meros, en particular uno de 4 a 25 meros, por ejemplo, uno de 5 a 20 meros, especialmente uno de 6 a 22 meros, en particular uno de 8 a 20 meros, especialmente uno de 10 a 15 meros, por ejemplo, que tiene un peso molecular en el rango de 350 a 6400 Daltons o 350 a 6000 Daltons, preferiblemente 550 a 5500 Daltons, preferiblemente 750 a 5000 Daltons, y especialmente 750 a 4500 Daltons o 2000 a 3000 Daltons o 900 a 3500 Daltons. Otros oligómeros de alginato representativo incluye, como se mencionó anteriormente, oligómeros con 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 a 50, 45, 40, 35, 28, 25, 22 o 20 residuos.
Puede ser un solo compuesto o puede ser una mezcla de compuestos, por ejemplo, de un rango de grados de polimerización. Como se señaló anteriormente, los residuos monoméricos en el oligómero de alginato pueden ser iguales o diferentes y no es necesario que todos lleven grupos cargados eléctricamente, aunque se prefiere que la mayoría lo hagan (por ejemplo, al menos 60%, preferiblemente al menos 80% más preferiblemente al menos 90%). Se prefiere que una mayoría sustancial, por ejemplo, al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% de los grupos cargados tengan la misma polaridad. En el oligómero de alginato, la relación de grupos hidroxilo con grupos cargados es preferiblemente al menos 2:1, más especialmente al menos 3:1.
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 3-28, 4-25, 6-22, 8-20 o 10-15, o 5-18 o 7-15 o 8-12, especialmente 10.
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 3-24, 4-23, 5-22, 6-21, 7-20, 8-19, 9-18, 10-17, 11-16, 12-15 o 13-14 (por ejemplo, 13 o 14).
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 4-25, 5-24, 6-23, 7-22, 8-21, 9-20, 10-19, 11-18, 12-17, 13-16, 14-15 (por ejemplo, 14 o 15).
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 5-26, 6-25, 7-24, 8-23, 9-22, 10-21, 11-20, 12-19, 13-18, 14-17 o 15-16 (por ejemplo, 15 o 16).
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 4-50, 4-40, 4-35, 4-30, 4-28, 4-26, 4-22, 4-20, 4-18, 4-16 o 4-14.
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 5-50, 5-40, 5-25, 5-22, 5-20, 5-18, 5-23, 5-20, 5-18, 5-16 o 5-14.
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 6-50, 6-40, 6-35, 6-30, 6-28, 6-26, 6-24, 6-20, 6-19, 6-18, 6-16 o 6-14.
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 8-50, 8-40, 8-35, 8-30, 8-28, 8-25, 8-22, 8-20, 8-18, 8-16 o 8-14.
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 9-50, 9-40, 9-35, 9-30, 9-28, 9-25, 9-22, 9-20, 9-18, 9-16 o 9-14.
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 10-50, 10-40, 10-35, 10-30, 10-28, 10-25, 10-22, 10-20, 10-18, 10-16 o 10-14.
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 11-50, 11-40, 11-35, 11-30, 11-28, 11-25, 11-22, 11-20, 11-18, 11-16 o 11-14.
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 12-50, 12-40, 12-35, 12-30, 12-28, 12-25, 12-22, 12-20, 12-18, 12-16 o 12-14.
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 13-50, 13-40, 13-35, 13-30, 13-28, 13-25, 13-22, 13-20, 13-18, 13-16 o 13-14 (por ejemplo, 13 o 14).
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 14-50, 14-40, 14-35, 14-30, 14-28, 14-25, 14-22, 14-20, 14-18, o 14-16.
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 15-50, 15-40, 15-35, 15-30, 15-28, 15-25, 15-22, 15-20, o 15-18.
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 18-50, 18-40, 18-35, 18-30, 18-28, 18-25, 18-22 o 18-20.
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 20-45, 20-40, 20-35, 20-30 o 20-25.
El oligómero de alginato de la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn), de 30-50, 30-45, 30-40 o 30-35.
Preferiblemente, el oligómero de alginato de la invención está sustancialmente libre, preferiblemente esencialmente libre, de oligómeros de alginato que tienen un grado de polimerización fuera de los rangos divulgados en el presente documento. Esto se puede expresar en términos de la distribución del peso molecular del oligómero de alginato de la invención, por ejemplo, el porcentaje de cada mol del oligómero de alginato que se utiliza de acuerdo con la invención que tiene un DP fuera del rango relevante. La distribución del peso molecular es preferiblemente tal que no más del 10%, preferiblemente no más del 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % en moles tiene un DP de tres, dos o uno más que el límite superior relevante para DPn. Asimismo, se prefiere que no más del 10%, preferiblemente no más del 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % en moles, tenga un DP por debajo de un número tres, dos o uno más pequeño que el límite inferior correspondiente para DPn.
Los oligómeros de alginato adecuados se describen en los documentos WO2007/039754, WO2007/039760, WO 2008/125828 y WO2009/068841, cuyas divulgaciones se citan explícitamente en el presente documento.
Los oligómeros de alginato adecuados representativos tienen un DPn en el rango 5 a 30, una fracción de guluronato (Fg) de al menos 0.80, una fracción de mannuronato (Fm) de no más de 0.20, y al menos 95 % moles de DP no más de 25.
Los oligómeros de alginato adecuados adicionales tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 7 a 15 (preferiblemente 8 a 12), una fracción de guluronato (Fg) de al menos 0.85 (preferiblemente al menos 0.90), una fracción de mannuronato (Fm) de no más de 0.15 (preferiblemente no más de 0.10), y que tiene al menos 95% de moles con un grado de polimerización menor que 17 (preferiblemente menor que 14).
Los oligómeros de alginato adecuados adicionales tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 5 a 18 (especialmente 7 a 15), una fracción de guluronato (Fg) de al menos 0.80 (preferiblemente al menos 0.85, especialmente al menos 0.92), una fracción de mannuronato (Fm) de no más de 0.20 (preferiblemente no más de 0.15, especialmente no más de 0.08), y que tiene al menos 95% de moles con un grado de polimerización menor que 20 (preferiblemente menor que 17).
Los oligómeros de alginato adecuados adicionales tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 5 a 18, una fracción de guluronato (Fg ) de al menos 0.92, una fracción de mannuronato (Fm) de no más de 0.08, y que tiene al menos 95% de moles con un grado de polimerización menor que 20.
Los oligómeros de alginato adecuados adicionales tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 5 a 18 (preferiblemente 7 a 15, más preferiblemente 8 a 12, especialmente alrededor de 10), una fracción de guluronato (Fg) de al menos 0.80 (preferiblemente al menos 0.85, más preferiblemente al menos 0.90, especialmente al menos 0.92, aún más especialmente al menos 0.95), una fracción de mannuronato (Fm) de no más de 0.20 (preferiblemente no más de 0.15, más preferiblemente no más de 0.10, especialmente no más de 0.08, aún más especialmente no más de 0.05), y que tiene al menos 95% de moles con un grado de polimerización menor que 20 (preferiblemente menor que 17, más preferiblemente menor que 14).
Los oligómeros de alginato adecuados adicionales tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 7 a 15 (preferiblemente 8 a 12), una fracción de guluronato (Fg) de al menos 0.92 (preferiblemente al menos 0.95), una fracción de mannuronato (Fm) de no más de 0.08 (preferiblemente no más de 0.05), y que tiene al menos 95% de moles con un grado de polimerización menor que 17 (preferiblemente menor que 14).
Los oligómeros de alginato adecuados adicionales tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 5 a 18, una fracción de guluronato (Fg ) de al menos 0.80, una fracción de mannuronato (Fm) de no más de 0.20, y que tiene al menos 95% de moles con un grado de polimerización menor que 20.
Los oligómeros de alginato adecuados adicionales tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 7 a 15, una fracción de guluronato (Fg ) de al menos 0.85, una fracción de mannuronato (Fm) de no más de 0.15, y que tiene al menos 95% de moles con un grado de polimerización menor que 17.
Los oligómeros de alginato adecuados adicionales tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 7 a 15, una fracción de guluronato (Fg ) de al menos 0.92, una fracción de mannuronato (Fm) de no más de 0.08, y que tiene al menos 95% de moles con un grado de polimerización menor que 17.
Los oligómeros de alginato adecuados adicionales tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 5 a 20, una fracción de guluronato (Fg ) de al menos 0.85 y una fracción de mannuronato (Fm) de no más de 0.15.
Los oligómeros de alginato adecuados adicionales tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 5 a 20, una fracción de guluronato (Fg) de 0.9-0.95 y una fracción de mannuronato (Fm) de 0.05-0.1, que se puede expresar como un oligómero de alginato que tiene 90-95% de los residuos de G y un peso molecular promedio de 2600 Da. Los oligómeros de alginato adecuados adicionales tienen un grado de polimerización promedio en número de aproximadamente 13 (por ejemplo, 12, 13 o 14), una fracción de guluronato (Fg ) de al menos aproximadamente 0.80, 0.85, 0.87, 0.88, 0.90 o 0.93 (por ejemplo, 0.92, 0.93 o 0.94) y una fracción de mannuronato correspondiente (Fm) de no más de aproximadamente 0.20, 0.15, 0.13, 0.12, 0.10, o 0.07 (por ejemplo, 0.08, 0.07 o 0.06).
Los oligómeros de alginato adecuados adicionales tienen un grado de polimerización promedio en número de aproximadamente 21 (por ejemplo, 20, 21 o 22), una fracción de guluronato (Fg) de al menos aproximadamente 0.80 (por ejemplo, 0.85, 0.87, 0.88, 0.90, 0.92, 0.94 o 0.95) y una fracción de mannuronato correspondiente (Fm) de no más de aproximadamente 0.20 (por ejemplo, 0.15, 0.13, 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.05).
Los oligómeros de alginato adecuados adicionales tienen un grado de polimerización promedio en número de aproximadamente 6 (por ejemplo, 5, 6 o 7), una fracción de guluronato (Fg) de al menos aproximadamente 0.80 (por ejemplo, 0.85, 0.87, 0.88, 0.90, 0.92, 0.94 o 0.95) y una fracción de mannuronato correspondiente (Fm) de no más de aproximadamente 0.20 (por ejemplo, 0.15, 0.13, 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.05).
Por lo tanto, se verá que una clase particular de oligómeros de alginato favorecidos de acuerdo con la presente invención son los oligómeros de alginato definidos como los llamados oligómeros de “G alto” o “bloque de G”, es decir, que tienen un alto contenido de residuos G o bloques de G. (por ejemplo, en el que al menos el 70% de los residuos de monómero son G, preferiblemente dispuestos en bloques de G). Sin embargo, también se pueden utilizar otros tipos de oligómeros de alginato, que incluyen en particular oligómeros de “M alto” o “bloque de M” u oligómeros de bloque de MG, como se describe adelante adicionalmente. De acuerdo con lo anterior, son los oligómeros de alginato con altas proporciones de un solo tipo de monómero, y con dichos monómeros de este tipo que están predominantemente en secuencias contiguas de ese tipo de monómero, los que representan oligómeros particularmente preferidos, por ejemplo, oligómeros en los que al menos 70% de los residuos de monómero en el oligómero son residuos de G conectados 1-4 a otro residuo de G, o más preferiblemente al menos 75%, y lo más preferiblemente al menos 80, 85, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de los residuos de monómero del oligómero son residuos de G conectados 1-4 a otro residuo de G. Esta conexión 1-4 de dos residuos de G se puede expresar alternativamente como una unidad gulurónica unida a una unidad gulurónica adyacente.
En una realización adicional al menos, o más particularmente más de, 50% de los residuos de monómero del oligómero de alginato pueden ser residuos de M (es decir mannuronato o ácido manurónico). En otras palabras el oligómero de alginato contendrá al menos o alternativamente más de 50% de residuos de mannuronato (o ácido manurónico). Por lo tanto las realizaciones específicas contienen oligómeros de alginato con (por ejemplo, que contienen) 50 a 70% de residuos de M (mannuronato) o por ejemplo, 70 a 100% de residuos de M (mannuronato). Las realizaciones específicas adicionales también incluyen oligómeros que contienen 71 a 85% de los residuos de M o 85 a 100% de los residuos de M. Por lo tanto, un oligómero de alginato representativo para uso de acuerdo con esta realización de la presente invención contendrá más de 70% de los residuos de M (es decir más de 70% de los residuos de monómero del oligómero de alginato serán residuos de M).
En otras realizaciones al menos 50% o 60%, más particularmente al menos 70% o 75%, incluso más particularmente al menos 80, 85, 90, 95 o 99% de los residuos de monómero are mannuronato. En una realización el oligómero de alginato puede ser un oligomannuronato (es decir un homooligómero de M, o 100% de M).
En una realización adicional, los alginatos descritos anteriormente de la invención tiene una estructura primaria en la que la mayoría de los residuos de M están en los denominados bloques de M. En esta realización preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 70 o 75%, y lo más preferiblemente al menos 80, 85, 90 o 95% de los residuos de M están en bloques de M. Un bloque de M es una secuencia contigua de al menos dos residuos de M, preferiblemente al menos 3 residuos contiguos de M, más preferiblemente al menos 4 o 5 residuos contiguos de M, lo más preferiblemente al menos 7 residuos contiguos de M.
En particular, al menos 90% de los residuos de M se conectan 1-4 a otro residuo de M. Más particularmente al menos 95%, más preferiblemente al menos 98%, y lo más preferiblemente al menos 99% de los residuos de M del alginato se conectan 1-4 a otro residuo de M.
Otros oligómeros preferidos son los oligómeros de alginato en los que al menos 70% de los residuos de monómero en el oligómero son residuos de M conectados 1-4 a otro residuo de M, o más preferiblemente al menos 75%, y lo más preferiblemente al menos 80, 85, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de los residuos de monómero del oligómero son residuos de M conectados 1-4 a otro residuo de M. Esta conexión 1-4 de dos residuos de M se puede expresar alternativamente como una unidad manurónica unida a una unidad manurónica adyacente.
En todavía una realización adicional, los oligómeros de alginato de la invención comprenden una secuencia de residuos de M y G alternativos. Una secuencia de al menos tres, preferiblemente al menos cuatro, residuos de M y G alternativos representa un bloque de MG. Preferiblemente los oligómeros de alginato de la invención comprenden un bloque de MG. Expresado más específicamente, un bloque de MG es una secuencia de al menos tres residuos contiguos que consiste en residuos de G y M y en los que cada residuo de G que no sea terminal (interno) en la secuencia contigua se conecta 1-4 y 4-1 a un residuo de M y cada residuo de M que no sea terminal (interno) en la secuencia contigua se conecta 1-4 y 4-1 a un residuo de G. Preferiblemente el bloque de MG es de al menos 5 o 6 residuos contiguos, más preferiblemente de al menos 7 o 8 residuos contiguos.
En una realización adicional el uronato minoritario en el oligómero de alginato (es decir mannuronato o guluronato) se encuentra predominantemente en los bloques de MG. En esta realización preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 70 o 75% y lo más preferiblemente al menos 80, 85, 90 o 95% de los monómeros de uronato minoritario en el oligómero de alginato del bloque de MG están presentes en los bloques de MG. En otra realización el oligómero de alginato se dispone de tal manera que al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99%, por ejemplo, 100% de los residuos de G y M en el oligómero se disponen en los bloques de MG.
Aunque en su forma más amplia, la invención se extiende a realizaciones en las que al menos 1% pero menos del 100% de los residuos de monómero del oligómero son residuos de G (es decir guluronato o ácido gulurónico), más particularmente, y como se define adicionalmente a continuación, al menos 30% de los residuos de monómero son residuos de G. Por lo tanto, en su forma más amplia el bloque de MG que contiene el oligómero de alginato puede contener al menos 1%, pero menos del 100%, de los residuos de guluronato (o ácido gulurónico), pero generalmente el bloque de MG que contiene el oligómero de alginato contendrá al menos 30% (o al menos 35, 40 o 45% o 50% de G) pero menos del 100% de G. Por lo tanto las realizaciones específicas contienen bloque de MG que contienen oligómeros de alginato con (por ejemplo, que contienen) 1 a 30% de residuos de G (guluronato), 30 a 70% de residuos de G (guluronato) o 70 a 99% de residuos de G (guluronato). Por lo tanto, un bloque de MG representativo que contiene oligómero de alginato para uso de acuerdo con la presente invención puede contener más de 30%, pero menos del 70%, residuos de G (es decir más de 30%, pero menos del 70%, de los residuos de monómero del bloque de MG oligómero de alginato serán residuos de G).
Preferiblemente más de 30%, más particularmente más de 35% o 40%, incluso más particularmente más de 45, 50, 55, 60 o 65%, pero en cada caso menos del 70%, de los residuos de monómero del bloque de MG que contienen oligómero de alginato son guluronato. Alternativamente, menos del 70%, más preferiblemente menos del 65% o 60%, incluso más preferiblemente menos del 55, 50, 45, 40 o 35%, pero en cada caso más del 30% de los residuos de monómero del bloque de MG que contienen oligómero de alginato son guluronato. Se puede elegir cualquier rango formado por cualquier combinación de estos valores. Por lo tanto, por ejemplo, el bloque de MG que contiene el oligómero de alginato puede tener por ejemplo, entre 35% y 65%, 40% y 60% o 45% y 55% de los residuos de G. En otra realización el bloque de MG que contiene el oligómero de alginato puede tener aproximadamente cantidades iguales de residuos de G y M (por ejemplo, relaciones entre 65% de G/35% de M y 35% de G/65% de M, por ejemplo, 60% de G/40% de M y 40% de G/60% de M; 55% de G/45% de M y 45% de G/55% de M; 53% de G/47% de M y 47% de G/53% de M; 51% de G/49% de M y 49% de G/51% de M; por ejemplo, aproximadamente 50% de G y aproximadamente 50% de M) y estos residuos se disponen predominantemente, preferiblemente completamente o lo más completamente posible, en un patrón de MG alterno (por ejemplo, al menos 50% o al menos 60, 70, 80, 85, 90 o 95% o 100% de los residuos de M y G están en una secuencia de MG alterna).
En ciertas realizaciones, los residuos de ácido urónico terminales de los oligómeros de uso en la invención no tienen un doble enlace, especialmente un doble enlace situado entre el átomo C4 y C5. Dichos oligómeros se pueden describir como que tienen residuos de ácido urónico de terminal saturado. El experto podría preparar oligómeros con residuos de ácido urónico de terminal saturado sin una carga indebida. Esto puede ser mediante el uso de técnicas de producción que proporcionan dichos oligómeros, o mediante la conversión (saturación) de oligómeros producidos por procesos que proporcionan oligómeros con residuos de ácido urónico de terminal insaturado.
El oligómero de alginato normalmente llevará una carga y, por lo tanto, los contraiones para el oligómero de alginato pueden ser cualquier ion fisiológicamente tolerable, especialmente los que se utilizan comúnmente para fármacos cargados, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, cloruro, mesilato, meglumina, etc. También se pueden utilizar iones que promuevan la gelificación del alginato, por ejemplo, iones de metales del grupo 2.
Mientras que el oligómero de alginato puede ser un material sintético generado a partir de la polimerización de números apropiados de residuos de guluronato y manuronato, los oligómeros de alginato de uso en la invención se pueden obtener, producir o derivar convenientemente de fuentes naturales como aquellas mencionadas anteriormente, a saber, materiales de origen de alginato natural.
La escisión de polisacárido a oligosacárido para producir el oligómero de alginato utilizable de acuerdo con la presente invención se puede realizar utilizando técnicas convencionales de lisis de polisacárido tales como digestión enzimática e hidrólisis ácida. En una realización preferida, se utiliza hidrólisis ácida para preparar los oligómeros de alginato de la invención. En otras realizaciones, la digestión enzimática se utiliza con un(a) etapa(s) de procesamiento adicionales para saturar los ácidos urónicos terminales en los oligómeros.
A continuación, los oligómeros se pueden separar de los productos de descomposición de los polisacáridos mediante cromatografía utilizando una resina de intercambio iónico o mediante precipitación fraccionada, solubilización o filtración. Los documentos US 6,121,441 y WO 2008/125828, que se citan en el presente documento, describen un proceso adecuado para preparar los oligómeros de alginato de uso en la invención. Se puede encontrar más información y discusión, por ejemplo, en “Handbooks of Hydrocolloids”, Ed. Phillips and Williams, CRC, Boca Ratón, Florida, EE.UU., 2000, cuyo libro de texto se incorpora explícitamente por referencia en este documento en su totalidad.
Los oligómeros de alginato también se pueden modificar químicamente, que incluye pero sin limitarse a la modificación para agregar grupos cargados (tales como glucanos carboxilados o carboximetilados) y oligómeros de alginato modificados para alterar la flexibilidad (por ejemplo, mediante oxidación con peryodato).
Los oligómeros de alginato (por ejemplo, ácidos oligogulurónicos) adecuados para uso de acuerdo con la invención se pueden producir convenientemente mediante hidrólisis ácida de ácido algínico a partir de, pero no limitado a, Laminaria hyperbora y Lessonia nigrescens, disolución a pH neutro, adición de ácido mineral para reducir el pH a 3.4 para precipitar el oligómero de alginato (ácido oligogulurónico), lavado con ácido débil, resuspención a pH neutro y liofilización.
Los alginatos para la producción de oligómeros de alginato de la invención también se pueden obtener directamente de fuentes bacterianas adecuadas, por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa o Azotobacter vinelandii.
En realizaciones en las que se requieren oligómeros de alginato que tienen estructuras primarias en las que la mayoría de los residuos de G se disponen en bloques de G en lugar de como residuos individuales, se espera que las fuentes de algas sean las más adecuadas debido al hecho de que los alginatos producidos en estos organismos tienden a tener estas estructuras. Las fuentes bacterianas pueden ser más adecuadas para obtener oligómeros de alginato de diferentes estructuras.
El aparato molecular involucrado en la biosíntesis de alginato en Pseudomonas fluorescens y Azotobacter vinelandii ha sido clonado y caracterizado (WO 94/09124; Ertesvág, H., et al, Metabolic Engineering, 1999, Vol 1, 262-269; WO 2004/011628; Gimmestad, M., et al (supra); Remminghorst and Rehm, Biotechnology Letters, 2006, Vol 28, 1701­ 1712; Gimmestad, M. et al, Journal of Bacteriology, 2006, Vol 188(15), 5551-5560) y los alginatos de estructuras primarias adaptadas se pueden obtener fácilmente mediante la manipulación de estos sistemas.
El contenido de G de los alginatos (por ejemplo, un material de origen de algas) se puede aumentar mediante epimerización, por ejemplo, con manuronato C-5 epimerasas de A. vinelandii u otras enzimas epimerasas. Por lo tanto, por ejemplo, la epimerización in vitro se puede llevar a cabo con epimerasas aisladas de Pseudomonas o Azotobacter, por ejemplo, AlgG de Pseudomonas fluorescens o Azotobacter vinelandii o las enzimas AlgE (AlgE1 a AlgE7) de Azotobacter vinelandii. También se contempla específicamente el uso de epimerasas de otros organismos que tienen la capacidad de producir alginato, particularmente algas. La epimerización in vitro de alginatos bajos en G con epimerasas AlgE de Azotobacter vinelandii se describe en detalle en Ertesvág et al (supra) and Strugala et al (Gums and Stabilisers for the Food Industry, 2004, 12, The Royal Society of Chemistry, 84 - 94).
Para obtener alginatos u oligómeros de alginato que contienen el bloque de G, se prefiere la epimerización con una o más epimerasas AlgE de Azotobacter vinelandii distintas de AlgE4 ya que estas enzimas son capaces de producir estructuras del bloque de G. Por otro lado, la epimerasa AlgE4 se puede utilizar para crear alginatos u oligómeros de alginato con tramos alternos de secuencia M/G o estructuras primarias que contienen un único residuo de G, ya que se ha descubierto que esta enzima parece epimerizar preferiblemente residuos de M individuales para producir residuos de residuos de G únicos conectados a residuos de M en lugar de producir bloques de G. Se pueden obtener estructuras primarias particulares al utilizar diferentes combinaciones de estas enzimas.
Las versiones mutadas de estas enzimas u homólogos de otros organismos también se contemplan específicamente a partir de uso. El documento WO 94/09124 describe enzimas de manuronano C-5 epimerasa recombinantes o modificadas (enzimas AlgE) codificadas por ejemplo por secuencias de epimerasa en las que las secuencias de ADN que codifican los diferentes dominios o módulos de las epimerasas se han barajado o suprimido y recombinado. Alternativamente, se pueden utilizar mutantes de enzimas epimerasa de origen natural (AlgG o AlgE), obtenidos por ejemplo mediante mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio de los genes AlgG o AlgE.
Un enfoque diferente es crear organismos de Pseudomonas y Azotobacter que se mutan en algunos o todos sus genes de epimerasa de tal manera que esos mutantes produzcan alginatos de la estructura requerida para la producción posterior de oligómeros de alginato, o incluso oligómeros de alginato de la estructura y tamaño requeridos (o peso molecular). La generación de una serie de organismos Pseudomonas fluorescens con genes AlgG mutados se describe en detalle en el documento WO 2004/011628 y Gimmestad, M., et al, 2003 (supra). La generación de una serie de organismos Azotobacter vinelandii con genes AlgE mutados se divulga en Gimmestad, M., et al, 2006 (supra).
Un enfoque adicional es eliminar o inactivar los genes de epimerasa endógenos de un organismo Azotobacter o Pseudomonas y luego introducir uno o más genes de epimerasa exógenos, que pueden o no estar mutados (es decir, pueden ser de tipo silvestre o modificados) y cuya expresión se puede controlar, por ejemplo, mediante el uso de “promotores controlables” inducibles u otros. Al seleccionar combinaciones apropiadas de genes, se pueden producir alginatos de estructura primaria predeterminada.
Un enfoque adicional sería introducir parte o toda la maquinaria de biosíntesis de alginato de Pseudomonas y/o Azotobacter en un organismo que no produce alginato (por ejemplo, E. coli) e inducir la producción de alginato a partir de estos organismos modificados genéticamente.
Cuando se utilizan estos sistemas basados en cultivo, la estructura primaria del alginato o de los productos de oligómero de alginato puede verse influenciada por las condiciones de cultivo.
Está bien dentro de las capacidades del experto ajustar parámetros de cultivo tales como temperatura, osmolaridad, niveles/fuentes de nutrientes y parámetros atmosféricos para manipular la estructura primaria de los alginatos producidos por un organismo particular.
Las referencias a “residuos de G/G” y “residuos de M/M” o a ácido gulurónico o ácido manurónico, o guluronato o manuronato se deben leer indistintamente como referencias a ácido gulurónico/guluronato y ácido manurónico/manuronato (específicamente ácido a-L-gulurónico/guluronato y ácido p-D-manurónico/mannuronato), y adicionalmente incluyen derivados de los mismos en los que se han modificado una o más cadenas laterales disponibles o grupos sin dar como resultado una capacidad para ampliar el espectro de una actividad terapéuticamente útil de bacitracina contra especies de bacterias para incluir bacterias Gram negativas que es sustancialmente menor que la del oligómero no modificado. Los grupos modificadores de sacáridos comunes incluirían grupos acetilo, sulfato, amino, desoxi, alcohol, aldehido, cetona, éster y anhidro. Los oligómeros de alginato también se pueden modificar químicamente para agregar grupos cargados (tales como glucanos carboxilados o carboximetilados) y para alterar la flexibilidad (por ejemplo, mediante oxidación con peryodato). El experto será consciente de aún modificaciones químicas adicionales que se pueden realizar en las subunidades de monosacárido de los oligosacáridos y que se pueden aplicar a los oligómeros de alginato de uso en la invención. El enlace covalente directo entre el oligómero de alginato y el antibiótico de la clase bacitracina es un enlace covalente formado por un átomo del oligómero de alginato y un átomo del antibiótico de la clase bacitracina. Los átomos que contribuyen al enlace pueden ser juntos o independientemente carbono, oxígeno, azufre, nitrógeno y/o fósforo. El enlace puede ser sencillo, doble o triple. En ciertas realizaciones, el enlace es parte de un grupo funcional orgánico. El experto estaría completamente familiarizado con las opciones disponibles para grupos funcionales orgánicos adecuados que podrían actuar como conectores entre el oligómero de alginato y los antibióticos de la clase bacitracina. Ejemplos no limitantes de los mismos pueden incluir grupos funcionales éster, éster de carbonato, ortoéster, cetona, cetal, hemicetal, ceteno, éter, acetal, hemiacteal, peroxi, metilendioxi, carbamato, amida, amina, óxido de amina, ácido hidroxámico, imina, imida, imidato, azida, azo, oxima, carbodiimida, carbazona, hidrozona, sulfuro, disulfuro, sulfinilo, sulfonilo, carbonotioilo, tioamida, tioéster, tioéter, tiocetona, tiocetal, éster sulfonato, ditiocarbamato, semicarbazona, fosfina o fosfodiéster. Como se muestra en los Ejemplos, la formación de enlaces amida y éster puede ser conveniente y ventajosa.
El conector molecular covalente puede ser cualquier molécula, normalmente una molécula orgánica, o parte de la misma, que tenga una estructura formada por átomos unidos covalentemente que sea capaz de unirse covalentemente con un oligómero de alginato y un antibiótico de la clase bacitracina. Dentro del conjugado habrá una serie continua de átomos unidos covalentemente desde el oligómero de alginato hasta el antibiótico de la clase bacitracina a través del conector molecular. En realizaciones preferidas, al menos uno de los enlaces covalentes de dicha serie es como se definió anteriormente. Sin embargo, el conector molecular puede comprender adicionalmente enlaces no covalentes, por ejemplo, enlaces iónicos, en partes de la molécula que no contribuyen a la conexión covalente entre el antibiótico de la clase bacitracina y el oligómero de alginato.
El conector molecular covalente puede ser lineal, circular o ramificado. En ciertas realizaciones, el conector molecular tendrá un peso molecular igual o menor que 1500 Dalton, por ejemplo, igual o menor que 1250, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 o 100 Dalton.
En ciertas realizaciones, al menos un enlace covalente directo entre el oligómero de alginato y el conector molecular covalente es como se definió anteriormente. En ciertas realizaciones, al menos un enlace covalente directo entre el antibiótico de la clase bacitracina y el conector molecular covalente es como se definió anteriormente. Cada enlace puede ser igual o diferente. La molécula conectora covalente puede comprender al menos un enlace covalente como se definió anteriormente, preferiblemente en la parte de esa molécula que contribuye a la serie continua de átomos unidos covalentemente desde el oligómero de alginato hasta el antibiótico de la clase bacitracina a través del conector molecular.
El conector molecular covalente puede ser o comprender un aminoácido o un péptido, por ejemplo, de igual o menor que 15 residuos de aminoácido, por ejemplo, de igual o menor que 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3 o 2 residuos de aminoácido. El aminoácido puede ser y el péptido puede comprender cualquiera de los aminoácidos descritos anteriormente. Ejemplos específicos de conectores de péptido que se pueden utilizar incluyen pero no se limitan a péptidos de residuos de Gly y/o Ser (por ejemplo, (Gly)2-8, (Ser)2-8, (g Gg GS)1-3); (EAAAK)1-3; A(EAAAK)1-3A; Leu-Glu; (Xaa-Pro)1-6 (por ejemplo, (Glu-Pro)1-6, (Lys-Pro)1-6, (Ala-Pro)1-6; VSQTSk Lt R|AEW Fp Dv (escisión sensible a Factor Xla/Factor VIIa); PLG^LWA (escisión sensible a matriz de metaloproteasa-1); RVL^AEA (escisión sensible a proteasa HIV-1; EDVVCC|SMSY (escisión sensible a proteasa NS3; Gg IEGR^GS (escisión sensible al Factor Xa); TRHRQPR^GWE (escisión sensible a furina); AGNRVRR^SVG (escisión sensible a furina); GFLG| (escisión sensible a Catepsina B).
El conector molecular covalente puede ser o comprender un monosacárido o un oligosacárido diferente de guluronato o mannuronato o un polímero formado del mismo, por ejemplo, un sacárido igual o menor de 12 residuos de aminoácido, por ejemplo, igual a o menor de 10, 8, 6, 5, 4, 3 o 2 residuos de aminoácido. Por lo tanto, el conector molecular covalente puede ser un monosacárido, disacárido o trisacárido o derivados de azúcar de los mismos tales como ácidos aldónico y urónico, azúcares desoxi o amino, azúcares sulfatados y alcoholes de azúcar. El monosacárido o uno o más de los residuos de monosacárido del disacárido o trisacárido puede ser una triosa, una tetrosa, una pentosa, una hexosa, una heptosa, una octosa, a nonosa o una decosa en forma de piranosa o furanosa y/o forma L- o D- cuando sea apropiado y/o derivados de azúcar de las mismas. Se prefieren los sacáridos/residuos de pentosa o hexosa, por ejemplo, mannosa (por ejemplo, D-mannosa), galactosa (por ejemplo, D- galactosa), glucosa (por ejemplo, D-glucosa), fructosa, fucosa (por ejemplo, L-fucosa), N-acetil-glucosamina, N-acetilgalactosamina, rhamnosa, galactosamina, glucosamina (por ejemplo, D-glucosamina), ácido galacturónico, ácido glucurónico, ácido N-acetilneuramínico, metil D-mannopiranosida (mannosida), a-metil-glucosida, galactosida, ribosa, xilosa, arabinosa, saccarato, mannitol, sorbitol, inositol, glicerol y derivados de estos monómeros. El disacárido se puede ejemplificar por acarviosina, allolactosa, celobiosa, chitobiosa, galactosa-alfa-1,3-galactosa, dentiobiosa, isomalta, isomaltosa, isomaltulosa, kojibiosa, lactitol, ácido lactobiónico, lactosa, lactulosa, laminaribiosa, maltitol, maltosa, mannobiosa, melibiosa, melibiulosa, neohesperidosa, nigerosa, robinosa, rutinosa, sambubiosa, soforosa, sucralfato, sucralosa, sacarosa, acetato isobutirato de sacarosa, octaacetato de sacarosa, trehalosa, truranosa, xilobiosa o derivados de estos disacáridos.
El conector molecular covalente puede ser o comprender un nucleótido o un oligonucleótido, es decir un ácido nucleico, por ejemplo, un ribonucleótido o un desoxiribonucleótido.
El conector también puede ser o comprender un grupo alquilo, alquenilo o alquino de cadena lineal, ramificada o cíclica, sustituido o no sustituido (normalmente C2-8) o derivado del mismo tal como ácido aminohexanoico o uno de un rango de conectores de PEG (polietilenglicol) disponibles comercialmente.
Ejemplos adicionales de moléculas conectoras covalentes incluyen pero no se limitan a grupos acetilo, succinilo, aconitilo (cis o trans), glutarilo, metilsuccinilo, trimellitil cisteamina, penicillamina, N-(2-mercaptopropionil)glicina, ácido 2-mercaptopropiónico, homocisteína, ácido 3-mercaptopropiónico y deamino-penicillamina.
En ciertas realizaciones, la molécula conectora covalente puede ser una pluralidad de las moléculas y/o grupos descritos anteriormente.
En ciertas realizaciones, el enlace covalente directo o la molécula conectora covalente (más específicamente, un enlace covalente dentro de la molécula conectora, un enlace covalente entre la molécula conectora, el oligómero de alginato y/o un enlace covalente entre la molécula conectora y el antibiótico de la clase bacitracina) se selecciona por su capacidad para ser lisado bajo condiciones representativas, o ventajosamente esencialmente únicas para, un sitio o ubicación objetivo dentro de un sujeto, por ejemplo, condiciones representativas de una infección bacteriana, el tracto respiratorio (especialmente el tracto respiratorio inferior, que incluyen los pulmones, más particularmente los pulmones de un paciente con fibrosis quística) o heridas (en particular heridas crónicas). De esta forma, el suministro del antibiótico de la clase bacitracina se puede hacer más selectivo para el sitio objetivo.
En realizaciones específicas, se puede seleccionar un enlace covalente, un grupo funcional que contiene dicho enlace covalente o molécula conectora que es sensible a (lábil a, se degrada a, se lisa a) un pH que es inferior al pH fisiológico normal (pH 7.2), es decir, pH ácido, por ejemplo, un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4 o 3.5. Los sitios o ubicaciones de inflamación, especialmente la inflamación causada por una infección, normalmente tienen un pH en estos rangos. Los grupos funcionales que incluyen ésteres, cisaconitilo, disulfuros e hidrozonas pueden ser sensibles a pH más bajos, es decir, se pueden describir como lábiles a los ácidos.
En realizaciones específicas, se puede seleccionar un enlace covalente, un grupo funcional o una molécula conectora que sea sensible a las especies reactivas de oxígeno. Los sitios o ubicaciones de inflamación, especialmente la inflamación causada por una infección, normalmente tienen altos niveles de especies reactivas de oxígeno. Los grupos funcionales, que incluyen los tiocetales y los tioéteres, pueden ser sensibles a las especies reactivas del oxígeno.
En realizaciones específicas adicionales, se puede seleccionar un enlace covalente, un grupo funcional o una molécula conectora que se lisa mediante enzimas producidas o secretadas solo en el sitio objetivo o sobreproducidas o secretadas en exceso en el sitio objetivo. Esto puede incluir enzimas tales como glucosidasas, nucleasas y peptidasas, en particular aquellas secretadas por bacterias infectantes y las secretadas por células inflamatorias del anfitrión, por ejemplo, lisozima, alginato liasa, DNasel, endonucleasas de restricción, elastasa de neutrófilos, catepsinas, fosfolipasas y p-lactamasas. Sin embargo, puede ser ventajoso elegir un enlace covalente, un grupo funcional o una molécula conectora que no sea lisada por enzimas capaces de degradar el oligómero de alginato o el antibiótico de la clase bacitracina y, como tal, se producirá la separación del oligómero de alginato del antibiótico de la clase bacitracina por separado a la degradación del oligómero de alginato o antibiótico de la clase bacitracina.
En otras realizaciones, el enlace covalente directo o la molécula conectora covalente se puede seleccionar por su estabilidad en condiciones representativas, o ventajosamente esencialmente únicas, de un sitio o ubicación objetivo dentro de un sujeto, por ejemplo, la ubicación descrita anteriormente o ubicaciones o sitios en los que el conjugado se puede encontrar en la ruta a esos lugares y sitios después de la administración y/o que el conjugado puede encontrar durante su distribución corporal. En el presente documento pueden ser adecuados, por ejemplo, un enlace amida, un enlace tioéter o un conector de péptido Gly-Gly.
En las realizaciones preferidas el conjugado de bacitracina-oligómero de alginato consiste en al menos un oligómero de alginato unido de forma covalente a un antibiótico de la clase bacitracina a través de un enlace de amida formado a partir de un grupo carboxilo sobre el alginato y un grupo amina sobre la molécula de bacitracina. Preferiblemente el antibiótico de la clase bacitracina se selecciona de bacitracina A1, A2, B1, B2, B3, C, D1, D2, D3 y E y, más preferiblemente, de bacitracina A (A1 y/o A2) y bacitracina B (B1 y/o B2). El oligómero de alginato preferiblemente contendrá 2 a 100 residuos de monómero. El oligómero de alginato también puede tener al menos 70% de los residuos de G.
En las realizaciones preferidas el conjugado de bacitracina-oligómero de alginato consiste en al menos un oligómero de alginato unido de forma covalente a un antibiótico de la clase bacitracina a través de un enlace de éster formado a partir de un grupo carboxilo sobre el grupo alginato e hidroxilo sobre la molécula de bacitracina. Preferiblemente el antibiótico de la clase bacitracina se selecciona de bacitracina A1, A2, B1, B2, B3, C, D1, D2, D3 y E y, más preferiblemente, de bacitracina A (A1 y/o A2) y bacitracina B (B1 y/o B2). El oligómero de alginato preferiblemente contendrá 2 a 100 residuos de monómero. El oligómero de alginato también puede tener al menos 70% de los residuos de G.
Se contemplan disposiciones multivalentes en los que más de un oligómero de alginato se conecta covalentemente al antibiótico de la clase bacitracina. Los oligómeros de alginato pueden ser iguales o diferentes y se pueden conectar al antibiótico de la clase bacitracina a través del mismo tipo de enlace covalente o conector molecular covalente. En otras disposiciones, un oligómero de alginato se puede conectar covalentemente a una pluralidad de moléculas de bacitracina de la manera descrita en el presente documento. Las moléculas de bacitracina pueden ser iguales o diferentes y pueden o no estar conectadas covalentemente a otros oligómeros de alginato.
Las referencias a los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato de la invención se extienden a las sales, solvatos o hidratos farmacéuticamente aceptables de los mismos, diastereoisómeros, tautómeros, enantiómeros y metabolitos activos de los mismos. Las sales adecuadas incluyen sales de adición de ácidos de ácidos inorgánicos tales como los ácidos clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, carbónico, bórico, sulfámico y bromhídrico, o sales de ácidos orgánicos farmacéuticamente aceptables tales como acético, propiónico, butírico, tartárico, maleico, hidroximaleico, fumérico, cítrico, láctico, mucico, glucónico, benzoico, succínico, oxálico, fenilacético, metanosulfónico, toluenosulfónico, bencenosulfónico, salicílico, sulfanílico, aspártico, glutámico, edético, esteárico, palmítico, oleico, láurico, pantoténico, tánico, ascórbico, fendizoico, ácido 4-4'-metilenbis-3-hidroxi-2-naftoico, o-(phidroxibenzoil) benzoico, ácido 4-4'-dihidroxitrifenilmetano-2-carboxílico y ácidos valéricos. Las sales de bases incluyen, pero no se limitan a, aquellas formadas con cationes farmacéuticamente aceptables, tales como sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, amonio y alquilamonio.
En un aspecto adicional la invención proporciona un método para la preparación de un conjugado de bacitracinaoligómero de alginato de la invención, dicho método comprende
(ia) proporcionar un oligómero de alginato y un antibiótico de la clase bacitracina y formar un enlace covalente directo entre dos grupos moleculares del mismo; o
(ib) proporcionar un oligómero de alginato, un antibiótico de la clase bacitracina y un conector molecular covalente y formar un enlace covalente directo entre dos grupos moleculares sobre el oligómero de alginato y la molécula conectora y formar un enlace covalente directo entre dos grupos moleculares sobre el antibiótico de la clase bacitracina y la molécula conectora; o
(ic) proporcionar un oligómero de alginato y un antibiótico de la clase bacitracina en el que uno o ambos llevan una molécula conectora molecular covalente unida de forma covalente al mismo y que conecta de forma covalente el oligómero de alginato al antibiótico de la clase bacitracina a través de al menos una de las moléculas conectoras; y opcionalmente (ii) separar al menos una porción del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato a partir de la mezcla de reacción.
En ciertas realizaciones la invención proporciona un método para la preparación de un conjugado de bacitracinaoligómero de alginato de la invención, dicho método comprende
(i) proporcionar una solución acuosa de un oligómero de alginato que tiene un grupo carboxilo disponible;
(ii) poner en contacto dicha solución de alginato con clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) en una cantidad y bajo condiciones suficientes para activar al menos un grupo carboxilo en el oligómero de alginato; (iii) opcionalmente poner en contacto dicho oligómero de alginato activado por carboxilo con sulfo N-hidroxisuccinimida (sulfo-NHS) en una cantidad y bajo condiciones suficientes para formar un éster sulfo-NHS reactivo con amina;
(iv) poner en contacto dicho oligómero de alginato activado por carboxilo de la etapa (ii) o el éster sulfo-NHS reactivo con amina de la etapa (iii) con un antibiótico de la clase bacitracina que tiene una amina de primaria disponible en una cantidad y bajo condiciones suficientes para formar un enlace de amida entre el oligómero de alginato y el antibiótico de la clase bacitracina; y
(v) separar al menos una porción del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato a partir de la mezcla de reacción.
En ciertas realizaciones la invención proporciona un método para la preparación de un conjugado de bacitracinaoligómero de alginato de la invención, dicho método comprende
(i) proporcionar una solución de un oligómero de alginato que tiene un grupo carboxilo disponible, preferiblemente una solución orgánica (por ejemplo, DMF y/o DMSO);
(ii) poner en contacto dicha solución de alginato con diciclohexilcarbodiimida (DCC) en una cantidad y bajo condiciones suficientes para formar un intermedio de O-acilisourea;
(iii) poner en contacto dicho intermedio de O-acilisourea con un antibiótico de la clase bacitracina que tiene un grupo hidroxilo disponible y 4-N,N-dimetilaminopiridina (DMAP) en cantidades y bajo condiciones suficientes para formar un enlace de éster entre el oligómero de alginato y el antibiótico de la clase bacitracina; y
(iv) separar al menos una porción del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato a partir de la mezcla de reacción;
en el que las se pueden realizar de forma simultánea las etapas (ii) y (iii).
Como se mencionó anteriormente y como se muestra en los Ejemplos, los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato son una clase de entidades químicas novedosas que tienen una eficacia antibacteriana terapéuticamente útil contra bacterias Gram negativas y Gram positivas, es decir, un espectro de actividad terapéuticamente útil que es más amplio que los antibióticos no conjugados de la clase bacitracina. Esto hace posible el tratamiento efectivo de infecciones bacterianas (que incluyen infecciones Gram negativas).
Por lo tanto, en un aspecto adicional la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado de bacitracina-oligómero de alginato como se define en el presente documento y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Se describen los excipientes, portadores o diluyentes adecuados y se detallan las composiciones farmacéuticas específicas a continuación.
La invención se refiere adicionalmente al uso de los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato como se describe en el presente documento y las composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos en el combate de infección bacteriana, en particular infección bacteriana Gram negativa. El término “combate” tal como se utiliza en el presente documento incluye tanto la terapia como la profilaxis (es decir, el tratamiento o la prevención de una infección bacteriana).
Por tanto, en este aspecto la invención proporciona los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato de la invención como se describe en el presente documento y composiciones farmacéuticas que los comprenden para uso en terapia, particularmente para uso en el tratamiento o prevención de una infección bacteriana, preferiblemente una infección bacteriana Gram negativa.
Específicamente, en un aspecto adicional la invención proporciona un método para el tratamiento o prevención de una infección bacteriana, preferiblemente una infección bacteriana Gram negativa, en un sujeto con, o se sospecha que tiene, o en riesgo de, una infección bacteriana, dicho método comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un conjugado de bacitracina-oligómero de alginato de la invención como se define en el presente documento.
La invención proporciona adicionalmente un conjugado de bacitracina-oligómero de alginato de la invención como se define en el presente documento, para uso en el tratamiento o prevención de una infección bacteriana, preferiblemente una infección bacteriana Gram negativa, en un sujeto con, o se sospecha que tiene, o en riesgo de, una infección bacteriana.
Una cantidad “eficaz”, más particularmente una “farmacéuticamente eficaz” del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato es aquella cantidad de conjugado que proporciona un tratamiento medible o prevención de la infección bacteriana objetivo, por ejemplo, una infección bacteriana Gram negativa.
En las realizaciones descritas anteriormente, el resultado fisiológico primario que se logrará es el contacto del sitio de infección (en particular, las bacterias que están presentes en el sitio o ubicación infectados, y que pueden incluir múltiples sitios o ubicaciones de infección en el cuerpo, que incluyen también una infección sistémica) y/o un sitio (por ejemplo, una superficie) en el que se puede producir la infección (o se corre el riesgo de que se produzca) con el conjugado de bacitracina-oligómero de alginato.
Expresado alternativamente, la invención proporciona adicionalmente el uso de un conjugado de bacitracinaoligómero de alginato de la invención como se define en el presente documento para la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento o prevención de una infección bacteriana, preferiblemente una infección bacteriana Gram negativa, en un sujeto con, o se sospecha que tiene, o en riesgo de, una infección bacteriana.
El término “infección bacteriana” (o “infectado por” o “infectado con” y similares) se utiliza ampliamente en el presente documento para indicar que el sujeto puede comprender, contener o llevar la bacteria en cuestión, es decir, que las bacterias pueden estar simplemente presentes en o sobre el sujeto, y esto puede incluir cualquier sitio o ubicación en o sobre el cuerpo del sujeto. No es necesario que la infección del sujeto se manifieste como una enfermedad clínica (es decir, que la infección dé como resultado síntomas clínicos en el sujeto), aunque esto, por supuesto, está abarcado. Un sujeto que se sospecha que está infectado o que está en riesgo de infección puede ser un sujeto que ha estado expuesto a la bacteria o a un sujeto infectado, o un sujeto que presenta signos o síntomas clínicos de infección (en el caso de una sospecha de infección), o un sujeto que es susceptible a la infección, ya sea en general (por ejemplo, debido al estado clínico del sujeto) o particularmente a la bacteria en cuestión.
También de acuerdo con ciertos aspectos de la invención, puede haber una etapa anterior de identificar a un sujeto como un sujeto con, sospechoso de tener o en riesgo de una infección bacteriana, o una etapa para diagnosticar a un sujeto como un sujeto con sospecha de tener o en riesgo de una infección bacteriana. En particular, la infección bacteriana puede ser de un tipo que se sabe que es intratable, o al menos difícil de tratar, en la práctica clínica habitual con un antibiótico de la clase bacitracina. En una realización, las bacterias se identifican o se sospecha que son bacterias que no responden a (es decir, son sensibles a) un antibiótico de la clase bacitracina, al menos a dosis terapéuticas. En ciertas realizaciones, se puede determinar la sensibilidad/resistencia de esa infección (o más particularmente las bacterias dentro de la infección) a un antibiótico de la clase bacitracina.
Alternativamente o además de la etapa precedente descrita anteriormente, de acuerdo con la invención puede haber una etapa siguiente en la que los indicadores clínicos del sujeto de la infección bacteriana se evalúan y preferiblemente se comparan con una evaluación correspondiente realizada antes o previa en, dicho tratamiento con el fin de determinar cualquier cambio en el mismo.
El diagnóstico y seguimiento de infecciones bacterianas basado en indicadores fisiológicos fácilmente observables es completamente rutinario para los médicos. Los métodos de biología molecular y microbiológicos también se pueden utilizar para confirmar diagnósticos y proporcionar más información sobre los agentes causales, por ejemplo, información taxonómica, posibles indicaciones de virulencia y su sensibilidad a los antibióticos.
La invención abarca el uso de un solo conjugado de bacitracina-oligómero de alginato o una mezcla (multiplicidad/pluralidad; dos o más) de diferentes conjugados de bacitracina-oligómero de alginato. Dichas mezclas pueden comprender conjugados que llevan diferentes antibióticos de la clase bacitracina y el mismo oligómero de alginato. Dichas mezclas pueden comprender conjugados que llevan el mismo antibiótico de la clase bacitracina y diferentes oligómeros de alginato. Dichas mezclas pueden comprender conjugados que llevan diferentes antibióticos de la clase bacitracina y diferentes oligómeros de alginato.
La infección bacteriana objetivo de acuerdo con la invención puede comprender bacterias de cualquier género o especie de bacterias. Ejemplos de géneros o especies de bacterias incluyen, pero no se limitan a, Abiotrophia, Achromobacter, Acidaminococcus, Acidovorax, Acinetobacter, Actinobacillus, Actinobaculum, Actinomadura, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agrobacterium, Alcaligenes, Alloiococcus, Alteromonas, Amycolata, Amycolatopsis, Anaerobospirillum, Anaerorhabdus, Arachnia, Arcanobacterium, Arcobacter, Arthrobacter, Atopobium, Aureobacterium, Bacteroides, Balneatrix, Bartonella, Bergeyella, Bifidobacterium, Bilophila Branhamella, Borrelia, Bordetella, Brachyspira, Brevibacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Brucella, Burkholderia, Buttiauxella, Butyrivibrio, Calymmatobacterium, Campylobacter, Capnocytophaga, Cardiobacterium, Catonella, Cedecea, Cellulomonas, Centipeda, Chlamydia, Chlamydophila, Chromobacterium, Chyseobacterium, Chryseomonas, Citrobacter, Clostridium, Collinsella, Comamonas, Corynebacterium, Coxiella, Cryptobacterium, Delftia, Dermabacter, Dermatophilus, Desulfomonas, Desulfovibrio, Dialister, Dichelobacter, Dolosicoccus, Dolosigranulum, Edwardsiella, Eggerthella, Ehrlichia, Eikenella, Empedobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Erysipelothrix, Escherichia, Eubacterium, Ewingella, Exiguobacterium, Facklamia, Filifactor, Flavimonas, Flavobacterium, Francisella, Fusobacterium, Gardnerella, Globicatella, Gemella, Gordona, Haemophilus, Hafnia, Helicobacter, Helococcus, Holdemania, Ignavigranum, Johnsonella, Kingella, Klebsiella, Kocuria, Koserella, Kurthia, Kytococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lautropia, Leclercia, Legionella, Leminorella, Leptospira, Leptotrichia, Leuconostoc, Listeria, Listonella, Megasphaera, Methylobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Mitsuokella, Mobiluncus, Moellerella, Moraxella, Morganella, Mycobacterium, Mycoplasma, Myroides, Neisseria, Nocardia, Nocardiopsis, Ochrobactrum, Oeskovia, Oligella, Orientia, Paenibacillus, Pantoea, Parachlamydia, Pasteurella, Pediococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Photobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Porphyrimonas, Prevotella, Propionibacterium, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoramibacter, Psychrobacter, Rahnella, Ralstonia, Rhodococcus, Rickettsia Rochalimaea Roseomonas, Rothia, Ruminococcus, Salmonella, Selenomonas, Serpulina, Serratia, Shewenella, Shigella, Simkania, Slackia, Sphingobacterium, Sphingomonas, Spirillum, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Stomatococcus, Streptobacillus, Streptococcus, Streptomyces, Succinivibrio, Sutterella, Suttonella, Tatumella, Tissierella, Trabulsiella, Treponema, Tropheryma, Tsakamurella, Turicella, Ureaplasma, Vagococcus, Veillonella, Vibrio, Weeksella, Wolinella, Xanthomonas, Xenorhabdus, Yersinia, y Yokenella; por ejemplo, bacterias Gram-positivas que incluyen especies Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equi, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Bacillus anthracis, B. subtilis, Nocardia asteroides, Actinomyces israelii, Propionibacterium acnes, Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, y Enterococcus, bacterias Gram-negativas que incluyen Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Legionella pneumophila, Salmonella typhi, Brucella abortus, Coxiella burnetti, Escherichia coli, Neiserria meningitidis, Neiserria gonorrhea, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Yersinia pestis, Yersinia enterolitica, Escherichia hirae, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, Bacteroides fragilis, Fusobascterium nucleatum, Cowdria ruminantium, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Helicobacter pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi y Acinetobacter baumannii, Acinetobacter Iwoffi, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens y Klebsiella oxytoca, y bacterias Gram no sensibles que incluyen Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci y mycobacteria such as M. tuberculosis, M. bovis, M. typhimurium, M. bovis strain BCG, BCG substrains, M. avium, M. intracellulare, M. africanum, M. kansasii, M. marinum, M. ulcerans, M. avium subspecies paratuberculosis,
Preferiblemente la infección bacteriana objetivo de acuerdo con la invención comprende bacterias seleccionadas de los siguientes géneros: Achromobacter, Acinetobacter, Actinobacillus, Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Alteromonas, Bacteroides, Bartonella, Borrelia, Bordetella, Brucella, Burkholderia, Campylobacter, Cardiobacterium, Chlamydia, Chlamydophila, Chromobacterium, Chyseobacterium, Chryseomonas, Citrobacter, Clostridium, Comamonas, Corynebacterium, Coxiella, Cryptobacterium, Edwardsiella, Eikenella, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Kingella, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Legionella, Leptospira, Leptotrichia, Leuconostoc, Listeria, Listonella, Mobiluncus, Moraxella, Morganella, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Nocardia, Nocardiopsis, Pantoea, Parachlamydia, Pasteurella, Peptococcus, Peptostreptococcus, Prevotella, Propionibacterium, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Ralstonia, Rickettsia, Salmonella, Shewenella, Shigella, Sphingobacterium, Sphingomonas, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streptobacillus, Streptococcus, Streptomyces, Treponem y Yersinia
Por lo tanto, la invención se puede utilizar contra bacterias Gram positivas o Gram negativas, o incluso bacterias Gram indeterminadas, pero se prefiere el uso contra bacterias Gram negativas, por ejemplo, las detalladas anteriormente. Estas incluirían bacterias de los géneros o especies Achromobacter, Acidaminococcus, Acidovorax, Acinetobacter, Actinobacillus, Aeromonas, Afipia, Agrobacterium, Alcaligenes, Alteromonas, Anaerobospirillum, Anaerorhabdus, Arcobacter, Bacteroides, Balneatrix, Bartonella, Bergeyella, Bilophila, Branhamella, Borrelia, Bordetella, Brachyspira, Brevibacillus, Brevundimonas, Brucella, Burkholderia, Buttiauxella, Calymmatobacterium, Campylobacter, Capnocytophaga, Cardiobacterium, Catonella, Cedecea, Centipeda, Chlamydia, Chlamydophila, Chromobacterium, Chyseobacterium, Chryseomonas, Citrobacter, Comamonas, Coxiella, Delftia, Desulfomonas, Desulfovibrio, Dialister, Dichelobacter, Edwardsiella, Ehrlichia, Eikenella, Empedobacter, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Flavimonas, Flavobacterium, Francisella, Fusobacterium, Gardnerella, Haemophilus, Hafnia, Helicobacter, Johnsonella, Kingella, Klebsiella, Koserella, Lautropia, Leclercia, Legionella, Leminorella, Leptospira, Leptotrichia, Listonella, Megasphaera, Methylobacterium, Mitsuokella, Moellerella, Moraxella, Morganella, Mycoplasma, Myroides, Neisseria, Ochrobactrum, Oligella, Orientia, Pantoea, Parachlamydia, Pasteurella, Photobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Porphyrimonas, Prevotella, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Psychrobacter, Rahnella, Ralstonia, Rickettsia, Rochalimaea, Roseomonas, Salmonella, Selenomonas, Serpulina, Serratia, Shewenella, Shigella, Simkania, Sphingobacterium, Sphingomonas, Spirillum, Stenotrophomonas, Streptobacillus, Succinivibrio, Sutterella, Suttonella, Tatumella, Tissierella, Trabulsiella, Treponema, Ureaplasma, Veillonella, Vibrio, Weeksella, Wolinella, Xanthomonas, Xenorhabdus, Yersinia, y Yokenella; por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Legionella pneumophila, Salmonella typhi, Brucella abortus, Coxiella burnetti, Escherichia coli, Neiserria meningitidis, Neiserria gonorrhea, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Yersinia pestis, Yersinia enterolitica, Escherichia hirae, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, Bacteroides fragilis, Fusobascterium nucleatum, Cowdria ruminantium, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Helicobacter pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi y Acinetobacter baumannii, Acinetobacter Iwoffi, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens y Klebsiella oxytoca.
Preferiblemente la bacteria Gram negativa objetivo de acuerdo con la invención se selecciona de los siguientes géneros: Achromobacter, Acinetobacter, Actinobacillus, Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Alteromonas, Bacteroides, Bartonella, Borrelia, Bordetella, Brucella, Burkholderia, Campylobacter, Cardiobacterium, Chlamydia, Chlamydophila, Chromobacterium, Chyseobacterium, Chryseomonas, Citrobacter, Comamonas, Coxiella, Edwardsiella, Eikenella, Enterobacter, Erwinia, Kingella, Klebsiella, Legionella, Leptospira, Leptotrichia, Listonella, Moraxella, Morganella, Mycoplasma, Neisseria, Pantoea, Parachlamydia, Pasteurella, Prevotella, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Ralstonia, Rickettsia, Salmonella, Shewenella, Shigella, Sphingobacterium, Sphingomonas, Stenotrophomonas, Streptobacillus, Treponem y Yersinia.
Dentro de las bacterias Gram-negativas, las Enterobacteríaceae y las bacterias Gram-negativas no fermentadoras son de particular interés.
Las Enterobacteríaceae incluyen, pero no se limitan a, bacterias de los géneros Alishewanella, Alterococcus, Aquamonas, Amnícola, Azotívírga, Brennería, Budvícía, Buttíauxella, Cedecea, Cítrobacter, Cronobacter, Díckeya, Edwardsíella, Enterobacter, Erwínía, Escheríchía, Ewíngella, Grímontella, Hafnía, Klebsíella, Kluyvera, Leclercía, Lemínorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacteríum, Pantoea, Pectobacteríum, Phlomobacter, Photorhabdus, Plesíomonas, Pragía, Proteus, Providencia, Rahnella, Raoultella, Salmonella, Samsonía, Serratía, Shígella, Sodalís, Tatumella, Trabulsíella, Wígglesworthía, Xenorhabdus, Yersínía, Yokenella. Preferred genera of Enterobacteríaceae ínclude Escheríchía, Klebsíella, Salmonella, Shígella, Yersínía y Providencia.
Las bacterias Gram-negativas no fermentadoras bacteria incluyen, pero no se limitan a, bacterias de los géneros Pseudomonas, Acínetobacter, Stenotrophomonas y Burkholdería, Achromobacter, Algalígenes, Bordetella, Brevundímonas, Comamonas, Elízabethkíngía (anteriormente Chryseobacteríum), Metílobacteríum, Moraxella, Ochrobactrum, Olígella, Psychrobacter, Ralstonía, Roseomonas, Shewanella, Sphíngobacteríum, por ejemplo, Pseudomonas aerugínosa, Acínetobacter baumanníí, Stenotrophomonas maltophílía, y Burkholdería spp..
Preferiblemente las bacterias se pueden seleccionar del género Pseudomonas, Acínetobacter, Stenotrophomonas, Burkholdería, Escheríchía, Klebsíella, Providencia, por ejemplo, Pseudomonas aerugínosa, Acínetobacter baumanníí, Stenotrophomonas maltophílía, Burkholdería spp, E. colí, Klebsíella pneumoníae y Burkholdería cepacía, Burkholdería malleí, Burkholdería pseudomalleí, Acínetobacter Iwoffí, Providencia stuartíí, Providencia rettgerí, Provídencía alcalífacíens, Klebsíella oxytoca, Pseudomonas anguíllíseptíca, Pseudomonas oryzíhabítans, Pseudomonas plecoglossícída y Pseudomonas luteola. Más preferiblemente las bacterias se pueden seleccionar de los géneros Pseudomonas, Acínetobacter, Escheríchía y Klebsíella, por ejemplo, Pseudomonas aerugínosa, Acínetobacter baumanníí, E. colí, y Klebsíella pneumoníae.
En ciertos aspectos, la infección es una infección nosocomial, una infección en el tracto respiratorio de los pacientes, por ejemplo, en pacientes que padecen fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad obstructiva congestiva de las vías respiratorias/neumonía obstructiva congestiva de las vías respiratorias (COAD/COAP), neumonía, enfisema, bronquitis o sinusitis; una infección en una herida, particularmente una herida crónica (que incluye quemaduras), una infección relacionada con un dispositivo asociada con dispositivos médicos implantables o protésicos, por ejemplo, endocarditis de una válvula protésica o una infección de una línea o un catéter o una articulación artificial o un reemplazo de tejido o un tubo endotraqueal o de traqueotomía. Ejemplos de los tipos de bacterias que comúnmente causan dichas infecciones incluyen Pseudomonas aerugínosa, Acínetobacter baumanníí, Stenotrophomonas maltophílía, Burkholdería spp (por ejemplo, B. cepacía), E. colí, Klebsíella pneumoníae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), Clostrídíum díffícíle, Mycobacteríum tuberculosis, Enterococcus y Enterococcus resistente a vancomicina y Providencia stuartíí. Otras infecciones de importancia de acuerdo con la invención incluyen infecciones por Bartonella (por ejemplo, Bartonella hensela), micobacterias (por ejemplo, Complejo de Mycobacteríum avíum (MAC), M. kansasíí, M. marínum, M. ulcerans, M. xenopí), influenzae Haemophilus tipo b (Hib) o Legionella (por ejemplo, Legíonella pneumophíla; enfermedad del legionario), lepra (M. leprae), anaplasmosis granulocítica humana (Anaplasma phagocytophílum), brucelosis (Brucella melítensís), enfermedad meningocócica (Neíssería meníngítídes) y ántrax (Bacíllus anthracís).
Las bacterias pueden ser resistentes a múltiples fármacos, por ejemplo, bacterias que son resistentes a antibióticos de al menos 3, o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 clases de antibióticos, por ejemplo, los aminoglucósidos (por ejemplo, amikacina, gentamicina, kanamicina, capreomicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina);; las plactamas (por ejemplo, los carbecepemos (por ejemplo, loracarbef); las cefalosporinas de 1a generación (por ejemplo, cefadroxil, cefazolin, cefalexina); cefalosporinas de 2a generación (por ejemplo, cefaclor, cefamandol, cefalexina, cefoxitin, cefprozil, cefuroxima); cefalosporinas de 3a generación (por ejemplo, cefixima, cefdinir, cefditoren, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona); cefalosporinas de 4a generación (por ejemplo, cefepima);las las monobactamas (por ejemplo, aztreonam)); los macrólidos (por ejemplo, azitromicina, claritromicina, diritromicina, erytromicina, troleandomicina); las monobactamas (por ejemplo, aztreonam); las penicilinas (por ejemplo, amoxicilina, ampicilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, ticarcilina); los antibióticos de polipéptidos (por ejemplo, bacitracina, colistina y polimixina B, pero en ciertas realizaciones no bacitracina); las quinolonas (por ejemplo, ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, trovafloxacina); las sulfonamidas (por ejemplo, mafenida, sulfacetamida, sulfametizol, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprimsulfametoxazol); las tetraciclinas (por ejemplo, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina); las glicilciclinas (por ejemplo, tigeciclina); los carbapenemos (por ejemplo, imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, panipenem/betamipron, biapenem, PZ- 601); y otros antibióticos que incluyen cloramphenicol; clindamicina, etambutol; fosfomicina; isoniazid; linezolid; metronidazol; nitrofurantoin; pirazinamida; quinupristin/dalfopristin; espectinomicina; fosfomicina y vancomicina.
La susceptibilidad, es decir, la sensibilidad (y, por el contrario, la resistencia y la tolerancia) a un antibiótico se puede medir de cualquier manera conveniente, por ejemplo, con pruebas de susceptibilidad por dilución y/o pruebas de difusión en disco. Preferiblemente, la susceptibilidad de una cepa bacteriana a un antibiótico se expresa en términos de la Concentración Inhibitoria Mínima (MIC) de ese antibiótico para ese microorganismo (Jorgensen et al., Manual of Clinical Microbiology, 7th ed. Washington, D.C: American Society for Microbiology, 1999; 1526-43), es decir, aquella concentración de antibiótico que inhibe completamente el crecimiento de esa cepa bacteriana.
El experto apreciaría que la extensión de la diferencia en tolerancia/susceptibilidad suficiente para constituir resistencia variará dependiendo del antibiótico y la cepa bacteriana bajo prueba y la prueba utilizada. Muchos organismos reguladores, por ejemplo, el Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana (EUCAST) establecen los llamados “valores críticos” para antimicrobianos y microorganismos específicos que son concentraciones antimicrobianas discriminatorias utilizadas en la interpretación de los resultados de las pruebas de susceptibilidad para definir aislados como susceptibles, intermedios o resistentes al agente antimicrobiano bajo prueba. El experto puede utilizar dicha información para determinar si la infección bacteriana que está siendo tratada por la invención es o no resistente al antibiótico en cuestión bajo estas definiciones.
En ciertas realizaciones, la infección objetivo serán bacterias en una biopelícula. Sin embargo, en otras realizaciones, la bacteria no estará en una biopelícula (por ejemplo, crecerá planctónicamente). Dicho de otra manera, la bacteria estará, o no estará, en un modo de crecimiento de biopelícula; o estará, o no estará, en un modo de crecimiento sin biopelícula.
Por “biopelícula” se entiende una comunidad de microorganismos caracterizada por un predominio de células sésiles que se adhieren a un sustrato o interfaz o entre sí (también pueden estar presentes algunas células móviles) y que se incrustan en una matriz de polímeros extracelulares (más concretamente polímeros extracelulares que han producido) caracterizados porque los microorganismos de esta colonia exhiben un fenotipo alterado con respecto a la tasa de crecimiento y la transcripción de genes (por ejemplo en comparación con su “no biopelícula” o contrapartes de flotación libre o planctónica). Por “en una biopelícula” se entiende que la bacteria objetivo del método de la invención está dentro (completamente o en parte), sobre o asociada con la matriz polimérica de una biopelícula. Visto de otra manera, las bacterias que “no están en una biopelícula” son organismos que están aislados, por ejemplo, planctónicos, o si están en una agregación de una pluralidad de organismos, esa agregación no está organizada y/o carece de la matriz característica de una biopelícula. En cada caso, las bacterias individuales no exhiben un fenotipo alterado que se observa en sus contrapartes que permanecen en biopelículas.
En ciertas realizaciones, la infección bacteriana no contiene bacterias del género Acinetobacter. En ciertas realizaciones, la infección bacteriana que se va a tratar o prevenir de acuerdo con la invención no contiene bacterias resistentes a múltiples fármacos.
En realizaciones particulares, la invención puede proporcionar el tratamiento o la prevención de infecciones respiratorias o afecciones asociadas con las mismas (por ejemplo, fibrosis quística, neumonía, COPD, COAD, COAP, bronquitis, sinusitis, una infección en una herida crónica (que incluyen las quemaduras), una infección relacionada con un dispositivo asociada con dispositivos médicos implantables o protésicos, bacteriemia, septicemia, choque séptico o sepsis.
En una realización preferida, la infección bacteriana es una infección respiratoria en un sujeto que padece un trastorno o afección respiratoria subyacente, que incluye en particular FQ, COPD/COAD o asma.
“Tratamiento”, cuando se utiliza en relación con el tratamiento de una infección bacteriana/afección médica en un sujeto de acuerdo con la invención, se utiliza ampliamente en el presente documento para incluir cualquier efecto terapéutico, es decir, cualquier efecto beneficioso en relación con la infección o sobre la afección. Por lo tanto, no solo se incluye la erradicación o eliminación de la infección, o la curación del sujeto o infección, sino también una mejora en la infección o afección del sujeto. Así se incluye, por ejemplo, una mejora en cualquier síntoma o signo de la infección o afección, o en cualquier indicador clínicamente aceptado de la infección/afección (por ejemplo, una disminución en el tamaño de la herida o una aceleración del tiempo de cicatrización). Por lo tanto, el tratamiento incluye terapia tanto curativa como paliativa, por ejemplo, de una infección/afección preexistente o diagnosticada, es decir, un tratamiento reaccionario.
“Prevención” como se utiliza en el presente documento se refiere a cualquier efecto profiláctico o preventivo. Por tanto, incluye retardar, limitar, reducir o prevenir la infección/afección o la aparición de la infección/afección, o uno o más síntomas o indicaciones de la misma, por ejemplo en relación con la infección/afección o síntoma o indicación previa al tratamiento profiláctico. Por lo tanto, la profilaxis incluye explícitamente tanto la prevención absoluta de la aparición o el desarrollo de la infección/afección, o el síntoma o la indicación de la misma, como cualquier retardo en el inicio o el desarrollo de la infección/afección o el síntoma o la indicación de la misma, o la reducción o limitación del desarrollo o progresión de la infección/afección o síntoma o indicación de la misma.
El sujeto puede ser cualquier sujeto animal humano o no humano, pero más particularmente puede ser un vertebrado humano o no humano, por ejemplo, un mamífero no humano, ave, anfibio, pez o reptil. En una realización preferida, el sujeto es un sujeto mamífero. El animal puede ser un ganado o un animal doméstico o un animal de valor comercial, que incluye los animales de laboratorio o un animal en un zoológico o parque de juegos. Por lo tanto, los animales representativos incluyen perros, gatos, conejos, ratones, conejillos de india, hámsteres, caballos, cerdos, ovejas, cabras y vacas. Por lo tanto, se cubren los usos veterinarios de la invención. El sujeto puede ser visto como un paciente. Preferiblemente, el sujeto es un humano. En algunas realizaciones, el sujeto no es un mamífero rumiante.
El término “en un sujeto” se utiliza ampliamente en el presente documento para incluir sitios o ubicaciones dentro de un sujeto o sobre un sujeto, por ejemplo, una superficie corporal externa, y puede incluir, en particular, la infección de un dispositivo médico, por ejemplo, un dispositivo médico implantado o “permanente”. El término “en un paciente” se debe interpretar de manera consistente con esto.
Por lo tanto, la ubicación de la infección puede ser una superficie en la cavidad oral (por ejemplo, dientes, encía, hendidura gingival, bolsa periodontal), el tracto reproductivo (por ejemplo, cuello uterino, útero, trompas de Falopio), el peritoneo, el oído medio, la próstata, el tracto urinario, la íntima vascular, el ojo, es decir, el tejido ocular (por ejemplo, la conjuntiva, el tejido corneal, el conducto lagrimal, la glándula lagrimal, el párpado), el tracto respiratorio, el tejido pulmonar (por ejemplo, bronquial y alveolar), las válvulas cardíacas, el tracto gastrointestinal, piel, cuero cabelludo, uñas e interior de heridas, particularmente heridas crónicas y heridas quirúrgicas, que pueden ser heridas tópicas o internas. Otras superficies incluyen el exterior de los órganos, en particular los que se someten a un trasplante, por ejemplo, corazón, pulmones, riñón, hígado, válvula cardíaca, páncreas, intestino, tejido corneal, injertos arteriales y venosos y piel.
Por lo tanto, la infección también puede estar presente en fluidos corporales (por ejemplo, sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, contenido del tracto GI, semen, esputo y otras secreciones pulmonares) y tejidos (por ejemplo, suprarrenales, hepáticos, renales, pancreáticos, pituitarios, tiroides, inmunitarios, ovárico, testicular, próstata, endometrial, ocular, mamario, adiposo, epitelial, endotelial, neural, muscular, pulmonar, epidermis, óseo). La infección se puede encontrar además en cualquier equipo o dispositivo médico o quirúrgico “permanente”. Esto puede incluir cualquier tipo de línea, que incluye catéteres (por ejemplo, catéteres venosos centrales y urinarios), dispositivos protésicos, por ejemplo, válvulas cardíacas, articulaciones artificiales, dientes postizos, coronas dentales, capuchones dentales e implantes de tejidos blandos (por ejemplo, implantes mamarios, de glúteos y labios). Se incluye cualquier tipo de dispositivo médico implantable (por ejemplo, stents, dispositivos intrauterinos, marcapasos, tubos de intubación (por ejemplo, tubos endotraqueales o de traqueotomía), prótesis o dispositivos protésicos, líneas o catéteres). Un dispositivo médico “permanente” puede incluir un dispositivo en el que cualquier parte del mismo está contenida dentro del cuerpo, es decir, el dispositivo puede ser total o parcialmente permanente. La infección puede ser aguda, o alternativamente crónica, por ejemplo, una infección que ha persistido durante al menos 5 o al menos 10 días, particularmente al menos 20 días, más particularmente al menos 30 días, más particularmente al menos 40 días.
Una infección bacteriana puede ocurrir en cualquier sujeto, pero algunos sujetos serán más susceptibles a la infección que otros. Los sujetos que son susceptibles a la infección bacteriana incluyen, pero no se limitan a, sujetos cuya barrera epitelial y/o endotelial está debilitada o comprometida, sujetos cuyas defensas contra la infección microbiana basadas en secreciones han sido anuladas, interrumpidas, debilitadas o socavadas, y sujetos que están inmunocomprometidos, inmunodeficientes o inmunodeprimidos (es decir, un sujeto en el que alguna parte del sistema inmunitario no funciona normalmente o funciona de forma anormal, en otras palabras, en el que cualquier parte de la respuesta inmunitaria, o una actividad inmunitaria, está reducida o alterada, ya sea debido a enfermedad o intervención clínica u otro tratamiento, o de cualquier forma).
Ejemplos representativos de sujetos que son susceptibles a la infección bacteriana incluyen, pero no se limitan a, sujetos con una infección preestablecida (por ejemplo, con bacterias, virus, hongos o parásitos tales como protozoos), especialmente sujetos con VIH, sujetos con bacteriemia, sepsis y sujetos con choque séptico; sujetos con inmunodeficiencia, por ejemplo, sujetos que se preparan para quimioterapia y/o radioterapia, que se someten o se recuperan de ella, sujetos para trasplante de órganos (por ejemplo, médula ósea, hígado, pulmón, corazón, válvula cardíaca, riñón, etc.) (que incluyen pacientes con autoinjerto, aloinjerto y xenoinjerto) ; sujetos con SIDA; sujetos residentes en una institución sanitaria, por ejemplo, un hospital, especialmente sujetos en cuidados intensivos o cuidados críticos (es decir, aquellas unidades relacionadas con la provisión de soporte vital o sistemas de soporte de órganos a los pacientes); sujetos con ventiladores respiratorios; sujetos que sufren de trauma; sujetos con quemaduras, sujetos con heridas agudas y/o crónicas; sujetos neonatales; sujetos de edad avanzada; sujetos con cáncer (definido ampliamente en el presente documento para incluir cualquier afección neoplásica; maligna o no maligna), especialmente aquellos con cánceres del sistema inmunológico (por ejemplo, leucemias, linfomas y otros cánceres hematológicos); sujetos que sufren de afecciones autoinmunitarias tales como artritis reumatoide, diabetes mellitus tipo I, enfermedad de Crohn, especialmente aquellos que se someten a tratamiento inmunosupresor para esas enfermedades; sujetos con secreción epitelial o endotelial reducida o anulada (por ejemplo, moco, lágrimas, saliva) y/o aclaramiento de secreciones (por ejemplo, sujetos con cilios que funcionan mal en el tejido mucoso y/o pacientes con mucosa hiperviscosa (por ejemplo, fumadores y sujetos con COPD, COAD, COAP, bronquitis, fibrosis quística, enfisema, cáncer de pulmón, asma, neumonía o sinusitis)) y sujetos equipados con un dispositivo médico.
Los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato de la invención se pueden administrar al sujeto en cualquier forma conveniente o por cualquier medio conveniente para suministrar cantidades efectivas a las bacterias de la infección objetivo y/o al sitio que porta la invención o el sitio con riesgo de infección, por ejemplo, por rutas tópica, enteral (por ejemplo, oral, bucal, sublingual, rectal), parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraespinal, intramuscular, subcutánea), o por inhalación (que incluye inhalación nasal). La administración puede lograr una distribución sistémica o una distribución localizada, lo que significa que el suministro se efectúa a las bacterias de la infección objetivo y/o al sitio portador de la infección o al sitio con riesgo de infección, pero esencialmente a ninguna otra ubicación en el paciente. El experto podría seleccionar un medio de administración apropiado para adaptarse a cualquier objetivo de infección y/o sitio particular que lleve la infección o sitio con riesgo de infección. Se puede preferir la administración localizada, particularmente lograda mediante administración tópica.
El experto podrá formular los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato de la invención en composiciones farmacéuticas que se adapten a estas rutas de administración y distribución corporal de acuerdo con cualquiera de los métodos convencionales conocidos en la técnica y ampliamente descritos en la literatura.
Más específicamente, los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato de la invención se pueden incorporar, opcionalmente junto con otros agentes activos, con uno o más portadores, diluyentes y/o excipientes convencionales, para producir preparaciones galénicas convencionales tales como comprimidos, píldoras, gránulos (por ejemplo, en forma libre o encerrado en cápsulas), polvos (por ejemplo, polvos inhalables, que incluyen polvos secos inhalables), pastillas para chupar, bolsitas, sellos, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (en forma sólida o líquida), pulverizadores (por ejemplo, pulverizadores nasales), composiciones para uso en nebulizadores, ungüentos, cremas, bálsamos, cápsulas de gelatina dura y blanda, supositorios, pesarios, soluciones inyectables estériles, polvos empacados estériles y similares. Composiciones sólidas o líquidas con recubrimiento entérico, por ejemplo, comprimidos con recubrimiento entérico y gránulos con recubrimiento entérico (que se pueden proporcionar en una cápsula con recubrimiento entérico o en una cápsula sin recubrimiento entérico, es decir, en la que el recubrimiento puede ser o no un recubrimiento entérico); las composiciones inyectables estériles e inhalables estériles son de particular interés.
Ejemplos de portadores, excipientes y diluyentes adecuados son lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, fosfato de calcio, polímeros de alginato inertes, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, jarabe acuoso, agua, agua/etanol, agua/glicol, agua/polietileno, agua salada hipertónica, glicol, propilenglicol, metilcelulosa, metilhidroxibenzoatos, propilhidroxibenzoatos, talco, estearato de magnesio, aceite mineral o sustancias grasas tales como grasas duras o mezclas adecuadas del mismo. Los excipientes y diluyentes a destacar son el manitol y el agua salada hipertónica (solución salina).
Las composiciones pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes conservantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes y similares.
Para la administración tópica, los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato se pueden incorporar en cremas, ungüentos, geles, bálsamos, parches transdérmicos y similares. Otros sistemas tópicos que se prevé que sean adecuados son sistemas de suministro de fármacos in situ, por ejemplo, geles en los que se forman in situ matrices de gel cristalinas sólidas, semisólidas, amorfas o líquidas y que pueden comprender el oligómero de alginato (que puede ser cualquier oligómero de alginato como se define en el presente documento). Dichas matrices se pueden diseñar convenientemente para controlar la liberación de los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato de la matriz, por ejemplo, la liberación se puede retardar y/o mantener durante un período de tiempo elegido. Dichos sistemas pueden formar geles solo al entrar en contacto con tejidos o fluidos biológicos, por ejemplo, superficies mucosas. Normalmente, los geles son bioadhesivos y/o mucoadhesivos. El suministro a cualquier sitio del cuerpo que pueda retener o adaptarse para retener la composición de pregel puede ser el objetivo de dicha técnica de suministro. Dichos sistemas se describen en el documento WO 2005/023176, que se cita explícitamente en el presente documento.
Las formas administrables por vía parenteral, por ejemplo, soluciones adecuadas para el suministro por vía intravenosa, deben ser estériles y libres de agentes fisiológicamente inaceptables, y deben tener una osmolaridad baja para minimizar la irritación u otros efectos adversos tras la administración y, por lo tanto, las soluciones deben ser preferiblemente isotónicas o ligeramente hipertónicas, por ejemplo agua salada hipertónica (solución salina). Los vehículos adecuados incluyen vehículos acuosos utilizados habitualmente para administrar soluciones parenterales tales como agua estéril para inyección, Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa, Inyección de Dextrosa y Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer Lactato y otras soluciones tales como se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed., Easton: Mack Publishing Co., pp. 1405-1412 y 1461-1487 (1975) y The National Formulary XIV, 14a ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975)), que se cita explícitamente en este documento.
Las soluciones pueden contener conservantes, agentes antimicrobianos, tampones y antioxidantes utilizados convencionalmente para soluciones parenterales, excipientes y otros aditivos que son compatibles con los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato y que no interfieren con la fabricación, almacenamiento o uso de productos.
Las soluciones estériles simples de conjugados de bacitracina-oligómero de alginato o las composiciones líquidas estériles simples que comprenden conjugados de bacitracina-oligómero de alginato pueden ser especialmente convenientes para utilizar durante procedimientos quirúrgicos y para suministro a los pulmones, por ejemplo, mediante nebulizador, o a los senos paranasales, por ejemplo, mediante un dispositivo de pulverización nasal. Las formulaciones sólidas o líquidas de los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato se pueden proporcionar con un recubrimiento entérico que previene la degradación en el estómago y/u otras partes del tracto GI superior pero permite la degradación en el tracto GI inferior, por ejemplo, el intestino delgado. Dichos recubrimientos se preparan habitualmente a partir de polímeros que incluyen ácidos grasos, ceras, goma laca, plásticos y fibras vegetales. Ejemplos específicos de los mismos incluyen, pero no se limitan a, copolímeros de acrilato de metilo y ácido metacrílico, copolímeros de metacrilato de metilo y ácido metacrílico, succinato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulosa (succinato de acetato de hipromelosa), ftalato de acetato de polivinilo (PVAP), trimelitato acetato de celulosa y polímero de alginato de sodio. Las tabletas con recubrimiento entérico y los gránulos con recubrimiento entérico (que se pueden proporcionar en una cápsula con recubrimiento entérico o en una cápsula sin recubrimiento entérico) son de particular interés. Los gránulos con recubrimiento entérico se pueden preparar de acuerdo con las enseñanzas del documento WO 1989008448 y Al-Khedairy, E.B.H., 2006, Iraqi J.Pharm.Sci., Vol.15 (1) 49, cuyos contenidos se citan en el presente documento, aunque el experto sería consciente de otras técnicas alternativas que se pueden utilizar.
El contenido relativo de los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato en las composiciones de la invención puede variar dependiendo de la dosificación requerida y el régimen de dosificación que se siga, pero será suficiente para lograr una cantidad efectiva en el sitio de tratamiento objetivo, es decir, las bacterias de la infección objetivo y/o el sitio portador de la infección, o el sitio en riesgo de infección, teniendo en cuenta variables tales como el tamaño físico del sujeto que se va a tratar, la naturaleza de las dolencias particulares del sujeto y la ubicación e identidad del área de tratamiento objetivo. El experto sabrá que las cantidades de los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato se pueden reducir si se sigue o aumenta un régimen de dosificación múltiple para minimizar el número de administraciones o aplicaciones.
Una formulación tópica representativa, por ejemplo, una crema, ungüento o bálsamo, que se puede utilizar para administrar un conjugado de oligómero de alginato de bacitracina de la invención a la piel o el cuello uterino u otras partes del sistema reproductor femenino inferior podría contener de 1 a 25%, 1 a 20%, 1 a 15%, 1 a 10%, 1 a 9%, 1 a 8%, 1 a 7%, 1 a 6%, 5 a 25%, 5 a 20%, 5 a 15%, 5 a 10%, 5 a 9%, 5 a 8%, 5 a 7%, 5 a 6%, 8 a 25%, 8 a 20%, 8 a 15%, 8 a 10%, 9 a 25%, 9 a 20%, o 9 a 15% p/v del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato, el resto se compone de excipientes farmacéuticamente aceptables y/u otros agentes activos si se utilizan. Se conocen dispositivos de suministro diseñados para la aplicación de formulaciones tópicas al sistema reproductivo femenino y se pueden emplear para suministrar las formulaciones mencionadas anteriormente si es conveniente.
Se puede utilizar un pesario para administrar un conjugado de bacitracina-oligómero de alginato de la invención en las partes inferiores del tracto reproductivo femenino. Una formulación representativa puede contener de 1 a 25%, 1 a 20%, por ejemplo, 1 a 15%, 1 a 10%, 1 a 9%, 1 a 8%, 1 a 7%, 1 a 6%, 5 a 25%, 5 a 20%, 5 a 15%, 5 a 10%, 5 a 9%, 5 a 8%, 5 a 7%, 5 a 6%, 8 a 25%, 8 a 20%, 8 a 15%, 8 a 10%, 9 a 25%, 9 a 20%, o 9 a 15% p/v o p/p del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato, del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato, el resto se compone de excipientes farmacéuticamente aceptables, que incluyen excipientes sólidos, y /u otros agentes activos si se utilizan. Los supositorios se pueden formular de manera similar.
Para la administración a la nariz o los senos paranasales, se puede utilizar una formulación líquida estéril acuosa y/o a base de aceite (por ejemplo, una emulsión); administrado, por ejemplo, mediante un dispositivo de pulverización nasal, por ejemplo, sin propulsor o asistido por propulsor. Una formulación representativa puede contener de 1 a 25%, 1 a 20%, por ejemplo, 1 a 15%, 1 a 10%, 1 a 9%, 1 a 8%, 1 a 7% o 1 a 6%, 5 a 25%, 5 a 20%, 5 a 15%, 5 a 10%, 5 a 9%, 5 a 8%, 5 a 7%, 5 a 6%, 8 a 25%, 8 a 20%, 8 a 15%, 8 a 10%, 9 a 25%, 9 a 20%, o 9 a 15% p/v o p/p del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato, el resto se compone de excipientes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, agua, y/ u otros agentes activos si se utilizan.
Una solución inhalable representativa que se utilizará para administrar un conjugado de bacitracina-oligómero de alginato de la invención en el tracto respiratorio superior normalmente será estéril y puede contener del 6 a 25%, por ejemplo, 6 a 20%, 6 a 15%, 6 a 10%, 8 a 25%, 8 a 20%, 8 a 15 %, 9 a 25%, 9 a 20%, 9 a 15 %, 10 a 15%, 10 a 20%, 10 a 25%, 15 a 20% o 15 a 25% p/v del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato,, el resto se compone de excipientes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, agua y/u otros agentes activos si se utilizan.
Un polvo inhalable representativo para utilizar para administrar conjugados de bacitracina-oligómero de alginato de la invención en el tracto respiratorio inferior puede contener hasta un 90%, por ejemplo, hasta 85%, 80%, 75% o 70%, por ejemplo, 50 a 90%, 55 a 90%, 60 a 90%, 65 a 90%, 70 a 90%, 75 a 90%, 80 a 90%, 85 a 90%, 50 a 85%, 55 a 85%, 60 a 85%, 65 a 85%, 70 a 85%, 75 a 85%, 80 a 85%, 50 a 80%, 55 a 80%, 60 a 80%, 65 a 80%, 70 a 80%, 75 a 80%, 50 a 70%, 55 a 70%, 60 a 70%, o 65 a 70% p/v o p/p del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato,, el resto se compone de excipientes farmacéuticamente aceptables y/o otros principios activos si se utilizan en la misma composición.
En otras realizaciones, se pueden utilizar formulaciones de liberación lenta, retardada o sostenida para el suministro, por ejemplo, en la nariz o los senos paranasales. Una formulación representativa puede ser un polvo que contenga el conjugado de bacitracina-oligómero de alginato o una suspensión de dicho polvo, dicho polvo contiene hasta 90%, por ejemplo, hasta 85%, 80%, 75% o 70%, por ejemplo, 50 a 90%, 55 a 90%, 60 a 90%, 65 a 90%, 70 a 90%, 75 a 90%, 80 a 90%, 85 a 90%, 50 a 85%, 55 a 85%, 60 a 85%, 65 a 85%, 70 a 85%, 75 a 85%, 80 a 85%, 50 a 80%, 55 a 80%, 60 a 80%, 65 a 80%, 70 a 80%, 75 a 80%, 50 a 70%, 55 a 70%, 60 a 70%, o 65 a 70% p/v o p/p del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato, el resto se compone de excipientes farmacéuticamente aceptables y/u otros agentes activos si se utilizado. El polvo puede comprender un recubrimiento que controla la liberación del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato.
Un comprimido representativo para utilizar para administrar un conjugado de bacitracina-oligómero de alginato de la invención en el tracto gastrointestinal inferior puede contener hasta 99%, hasta 95%, 90%, 85% o 80%, por ejemplo, 50 a 95%, 55 a 95%, 60 a 95%, 65 a 95%, 70 a 95%, 75 a 95%, 80 a 95%, 85 a 95%, 90 a 95%, 50 a 90%, 50 a 90%, 55 a 90%, 60 a 90%, 65 a 90%, 70 a 90%, 75 a 90%, 80 a 90%, 85 a 90%, 50 a 90%, 55 a 85%, 60 a 80% o, 65 a 75% p/v o p/p del conjugado de bacitracina- oligómero de alginato, el resto se compone de excipientes farmacéuticamente aceptables y/u otros agentes activos si se utilizan. El comprimido puede ser un comprimido de múltiples capas.
Un comprimido con recubrimiento entérico también puede ser eficaz en administrar un conjugado de bacitracinaoligómero de alginato de la invención en el tracto GI inferior. Un comprimido con recubrimiento entérico representativo puede contener hasta un 95%, por ejemplo, hasta 90%, 85% o 80%, por ejemplo, 55 a 90%, 60 a 90%, 65 a 90%, 70 a 90%, 75 a 90%, 80 a 90%, 85 a 90%, 55 a 85%, 60 a 85%, 65 a 85%, 70 a 85%, 75 a 85%, 80 a 85%, 50 a 80%, 55 a 80%, 60 a 80%, 65 a 80%, 70 a 80%, o 75 a 80% p/v o p/p del conjugado de bacitracinaoligómero de alginato, el resto se compone excipientes farmacéuticamente aceptables, que incluye el recubrimiento entérico (por ejemplo, polímeros, que incluyen ácidos grasos, ceras, goma laca, plásticos y fibras vegetales) y/u otros agentes activos si se utilizan. El comprimido puede ser un comprimido de múltiples capas, por ejemplo, como se describió anteriormente.
Los gránulos con recubrimiento entérico también pueden ser eficaces en administrar un conjugado de bacitracinaoligómero de alginato de la invención en el tracto GI inferior. Dichos gránulos se pueden proporcionar en una cápsula que a su vez puede estar provista o no de un recubrimiento entérico. Un gránulo con recubrimiento entérico representativo puede contener hasta un 95 %, por ejemplo, hasta un 90%, 85% o 80%, por ejemplo, 55 a 90%, 60 a 90%, 65 a 90%, 70 a 90%, 75 a 90%, 80 a 90%, 85 a 90%, 55 a 85%, 60 a 85%, 65 a 85%, 70 a 85%, 75 a 85%, 80 a 85%, 50 a 80%, 55 a 80%, 60 a 80%, 65 a 80%, 70 a 80%, o 75 a 80% p/v o p/p del conjugado de bacitracinaoligómero de alginato, el resto se compone de excipientes farmacéuticamente aceptables, que incluyen el recubrimiento entérico (por ejemplo, polímeros, que incluyen ácidos grasos, ceras, goma laca, plásticos y fibras vegetales) y/u otros agentes activos si se utilizan.
Una solución acuosa representativa para el suministro del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato de la invención mediante inyección (por ejemplo, por inyección intravenosa, intraespinal, intramuscular o subcutánea) será estéril y puede contener del 6 a 25%, por ejemplo, 6 a 20%, 6 a 15%, 6 a 10%, 8 a 25%, 8 a 20%, 8 a 15 %, 9 a 25%, 9 a 20%, 9 a 15 %, 10 a 15%, 10 a 20%, 10 a 25%, 15 a 20%, o 15 a 25% p/v del conjugado de bacitracinaoligómero de alginato, el resto se compone de agua y excipientes farmacéuticamente aceptables y/u otros agentes activos si se utilizan.
Los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato se pueden utilizar a una dosis diaria de 0.1 g a 10 g, por ejemplo, 0.5 g a 5 g, 0.8 g a 3 g, 1 g a 2 g, por ejemplo, aproximadamente 2 g, que se pueden administrar en una o más veces por día (por ejemplo, bis al día) y en una o más formas de dosificación o eventos de administración (por ejemplo, dos comprimidos al día).
Los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato como se definen en el presente documento se pueden utilizar junto o en combinación con uno o más agentes terapéuticamente activos adicionales, que pueden incluir otros agentes antimicrobianos (por ejemplo, antibacterianos, antibióticos, antifúngicos y antivirales), agentes inmunoestimuladores, corticosteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID), broncodilatadores, agentes reductores de la viscosidad de la mucosidad (es decir, un agente que reduce la viscosidad de la mucosidad y cuyos términos se utilizan indistintamente con el término “agente mucolítico”) o moduladores de CFTR (también conocidos como “ modificadores CFTR”).
El agente adicional, por ejemplo, un antibiótico, puede no estar conjugado con un oligómero de alginato o con cualquier otra fracción de conjugación.
El conjugado de bacitracina-oligómero de alginato y el agente terapéuticamente activo adicional, por ejemplo, se pueden administrar juntos, en una sola formulación o composición farmacéutica, o por separado (es decir, administración separada, secuencial o simultánea). Por lo tanto, el conjugado de bacitracina-oligómero de alginato y el agente terapéuticamente activo adicional se pueden combinar, por ejemplo, en un kit farmacéutico o como un producto combinado (“combinación”).
Por lo tanto, otro aspecto de la invención proporciona un producto (por ejemplo, una combinación farmacéutica o un kit) que comprende un conjugado de oligómero de alginato-bacitracina como se define en el presente documento junto con un agente terapéuticamente activo (por ejemplo, aquellos descritos anteriormente) como preparación combinada para, uso secuencial o simultáneo en el tratamiento o prevención de una infección bacteriana, preferiblemente una infección bacteriana Gram negativa, en un sujeto.
Más generalmente, este aspecto de la invención también proporciona un kit que comprende un conjugado de oligómero de alginato-bacitracina como se define en este documento junto con un agente terapéuticamente activo adicional (por ejemplo, aquellos descritos anteriormente).
Se prefieren especialmente las combinaciones que comprenden un conjugado de bacitracina-oligómero de alginato como se define en el presente documento y un antibiótico, un antifúngico, un modulador de CFTR y/o un agente reductor de la viscosidad del moco. Dichos productos farmacéuticos y composiciones farmacéuticas preferiblemente se adaptan para uso en los métodos médicos de la invención.
El agente terapéuticamente activo adicional se puede aplicar convenientemente antes, simultáneamente o después del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato. Convenientemente, el agente terapéuticamente activo adicional se aplica sustancialmente al mismo tiempo que el conjugado de bacitracina-oligómero de alginato o después. En otras realizaciones, el agente terapéuticamente activo adicional se puede aplicar o administrar convenientemente antes del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato. El agente terapéuticamente activo adicional también se puede proporcionar (por ejemplo, administrar o suministrar) repetidamente en puntos de tiempo apropiados para el agente utilizado. El experto es capaz de idear un régimen de dosificación adecuado. En tratamientos a largo plazo, el conjugado de bacitracina-oligómero de alginato también se puede utilizar repetidamente. El conjugado de bacitracina-oligómero de alginato se puede aplicar con la misma frecuencia que el agente terapéuticamente activo adicional, o con mayor o menor frecuencia. La frecuencia requerida puede depender del sitio o ubicación en o sobre el paciente al que se administra el conjugado de bacitracina-oligómero de alginato y también de la naturaleza general de la condición clínica mostrada por el paciente particular que se somete al tratamiento.
El conjugado de bacitracina-oligómero de alginato y el agente terapéuticamente activo adicional pueden por lo tanto formularse juntos o por separado, es decir en la misma o en diferentes formulaciones o composiciones farmacéuticas, y se pueden proporcionar para la administración por la misma ruta o por rutas diferentes. También se contempla el uso del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato como se define en el presente documento para fabricar dichos productos farmacéuticos y composiciones farmacéuticas para uso en los métodos médicos de la invención.
Los antibióticos representativos que se pueden utilizar junto o en combinación con los conjugados de bacitracina-alginato oligómero como se define en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, los aminoglucósidos (por ejemplo, amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina); las p-lactamas (por ejemplo, los carbecefemos (por ejemplo, loracarbef); las cefalosporinas de 1a generación (por ejemplo, cefadroxil, cefazolin, cefalexina); cefalosporinas de 2a generación (por ejemplo, cefaclor, cefamandol, cefalexina, cefoxitina, cefprozil, cefuroxima); cefalosporinas de 3a generación (por ejemplo, cefixima, cefdinir, cefditoren, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona); cefalosporinas de 4a generación (por ejemplo, cefepime); las monobactamas (por ejemplo, aztreonam); los macrólidos (por ejemplo, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, troleandomicina); las monobactamas (por ejemplo, aztreonam); las penicilinas (por ejemplo, amoxicilina, ampicilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, ticarcilina); los antibióticos de polipéptidos (por ejemplo, colistin, polimixina B, pero en ciertas realizaciones sin bacitracina); las quinolonas (por ejemplo, ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, trovafloxacina); las sulfonamidas (por ejemplo, mafenida, sulfacetamida, sulfametizol, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprimsulfametoxazol); las tetraciclinas (por ejemplo, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina); las glicilciclinas (por ejemplo, tigeciclina); los carbapenemos (por ejemplo, imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, panipenem/betamipron, biapenem, PZ-601); otros antibióticos incluyen cloramfenicol; clindamicina, etambutol; fosfomicina; isoniazid; linezolid; metronidazol; nitrofurantoína; pirazinamida; quinupristina/dalfopristina; rifampina; espectinomicina; y vancomicina.
Antifúngicos representativos incluyen, pero no se limitan a los polienos (por ejemplo, natamicina, rimocidina, filipina, nistatina, anfotericina B, candicina; los imidazoles (por ejemplo, miconazol, ketoconazol, clotrimazol, econazol, bifonazol, butoconazol, fenticonazol, isoconazol, oxiconazol, sertaconazol, sulconazol, tioconazol); los triazoles (por ejemplo, fluconazol, itraconazol, isavuconazol, ravuconazol, posaconazol, voriconazol, terconazol); las alilaminas (por ejemplo, terbinafina, amorolfina, naftifina, butenafina); y las equinocandinas (por ejemplo, anidulafungina, caspofungina, micafungina).
Antivirales representativos incluyen, pero no se limitan a abacavir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, arbidol, atazanavir, atripla, boceprevir, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtide, entecavir, famciclovir, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, ganciclovir, ibacitabine, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, interferón tipo III, interferón tipo II, interferón tipo I, lamivudina, lopinavir, lovirida, maraviroc, moroxidina, nelfinavir, nevirapina, nexavir, oseltamivir, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, raltegravir, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, estavudina, tenofovir, tenofovir disoproxil, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir, y zidovudina.
Agentes inmunoestimuladores representativos incluyen, pero no se limitan a, citocinas, por ejemplo, TNF, IL-1, IL-6, IL-8 y alginatos inmunoestimuladores, tales como alginatos con alto contenido de M como se describe, por ejemplo, en los documentos US 5,169,840, WO91/11205 y WO03/045402 que se citan explícitamente en el presente documento, pero que incluyen cualquier alginato con propiedades inmunoestimuladoras.
Ejemplos representativos de corticosteroides adecuados incluyen pero no se limitan a prednisona, flunisolida, triamcinolona, fluticasona, budesonida, mometasona, beclometasona, amcinonida, budesonida, desonida, fluocinonida, fluocinolona, halcinonida, hidrocortisona, cortisona, tixocortol, prednisolona, metilprednisolona, prednisona, betametasona, dexametasona, fluocortolona, aclometasona, prednicarbato, clobetasona, clobetasol, y fluprednideno.
Los NSAID representativos incluyen, pero no se limitan a, los salicilatos (por ejemplo, aspirina (ácido acetilsalicílico), trisalicilato de colina y magnesio, diflunisal, salsalato, los derivados del ácido propiónico (por ejemplo, ibuprofeno, dexibuprofeno, dexketoprofeno, fenoprofeno, flurbiprofeno, ketoprofeno, loxoprofeno, naproxeno, oxaprozina), los derivados del ácido acético (por ejemplo, aceclofenaco, diclofenaco, etodolac., indometacina, ketorolaco, nabumetona, tolmetina, sulindac), los derivados del ácido enólico (por ejemplo, droxicam, isoxicam, lornoxicam, meloxicam, piroxicam, tenoxicam), el derivados del ácido antranílico (por ejemplo, ácido flufenámico, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, ácido tolfenámico) y los inhibidores selectivos de la COX-2 (Coxibs; por ejemplo, celecoxib, etoricoxib, lumiracoxib, parecoxib, rofecoxib, valdecoxib). Se prefieren los derivados del ácido propiónico (por ejemplo, ibuprofeno, dexibuprofeno, dexketoprofeno, fenoprofeno, flurbiprofeno, cetoprofeno, loxoprofeno, naproxeno, oxaprozina), el ibuprofeno es el más preferido.
Los ejemplos representativos de broncodilatadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, los agonistas p2 (por ejemplo, los agonistas p2 de acción corta (por ejemplo, pirbuterol, epinefrina, salbutamol, levosalbutamol, clenbuterol, terbutalina, procaterol, metaproterenol, fenoterol, mesilato de bitolterol, ritodrina, isoprenalina); los agonistas p2 de acción prolongada (por ejemplo, salmeterol, formoterol, bambuterol, clenbuterol); y los agonistas p2 de acción ultraprolongada (por ejemplo, indacaterol), los anticolinérgicos (por ejemplo, ipratropio, oxitropio, tiotropio) y la teofilina.
Como se utiliza en el presente documento, los términos “agente mucolítico” y “agente reductor de la viscosidad del moco” pretenden abarcar agentes que reducen la viscosidad intrínseca del moco y agentes que reducen la adhesión del moco al epitelio subyacente, en particular agentes que directa o indirectamente interrumpen indirectamente las interacciones moleculares dentro o entre los componentes de la mucosidad, los agentes que afectan la hidratación de la mucosidad y los agentes que modulan el microambiente iónico del epitelio de la mucosa (particularmente los niveles de cationes divalentes, por ejemplo, calcio). Los ejemplos representativos de agentes reductores de la viscosidad del moco adecuados incluyen, pero no se limitan a, una enzima de escisión de ácido nucleico (por ejemplo, una DNasa como DNasa I o dornasa alfa), solución salina hipertónica, gelsolina, un agente reductor de tiol, una acetilcisteína, un polisacárido de bajo peso molecular sin carga (por ejemplo, dextrano, manitol), arginina (u otros precursores del óxido nítrico o estimuladores de la síntesis), un agonista del subtipo P2Y2 de los receptores purinérgicos (por ejemplo, denufosol) o un poliaminoácido aniónico (por ejemplo, poli ASP o poli GLU). Ambroxol, bromhexina, carbocisteína, domiodol, eprazinona, erdosteína, letosteína, mesna, neltenexina, sobrerol, stepronina, tiopronina son mucolíticos específicos a destacar. Se prefieren la ADNasa I y la solución salina hipertónica.
Los moduladores de CFTR son moléculas pequeñas que pueden corregir, al menos parcialmente, una disfunción de CFTR. Los moduladores CFTR actuales se dividen en tres grupos principales: potenciadores CFTR, correctores CFTR y agentes de lectura a través (Derichs, N., Eur. Respir. Rev., 2013, 22(127), 58-65; Petit, R.S. y Fellner, C., Pharmacy and Therapeutics, 2014, 39(7), 500-511).
Los potenciadores de CFTR son moduladores de CFTR que aumentan la actividad del canal iónico de CFTR presente sobre la superficie de la célula epitelial. Los correctores de CFTR son moduladores de CFTR que aumentan la cantidad de proteína CFTR suministrada o retenida en la superficie de la célula epitelial. Los agentes de lectura a través (también conocidos como “supresores de codones de detención prematuros” (supresores de PSC) o “supresores de codones de terminación prematuros” (supresores de PTC, cuyos términos se utilizan indistintamente en el presente documento) son moduladores de CFTR que hacen que la maquinaria de traducción de la célula pase por alto cualquier codón de terminación prematura en el ARNm de CFTR aumentando de esta manera la cantidad de CFTR sustancialmente de longitud completa y funcional producido.
Ejemplos representativos de potenciadores de CFTC adecuados incluyen, pero no se limitan a, ivacaftor
(Vx -770; N-(2,4- di-tert-butil-5-hidroxifenil)-1,4-dihidro-4-oxoquinolina-3-carboxamida) y VRT-532 (4-metil-2-(5-fenil-1H-pirazol- 3-il)-fenol) de Vertex Pharmaceuticals™).
Ejemplos representativos de correctores de CFTR adecuados incluyen, pero no se limitan a, lumacaftor Prototípico (Vx -809) y Vx -661 de Vertex Pharmaceuticals™ y N6022 (ácido 3-[1-(4-carbamoil-2-metilfenil)-5-(4-imidazol-1-ilfenil) pirrol-2-il]propanoico).
Ejemplos representativos de agente de lectura a través adecuados incluyen, pero no se limitan a, ataluren (PTC124) de PTC Therapeutics y gentamicina.
La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Preparación de conjugados de bacitracina-oligómero de alginato
Preparación de oligómeros de alginato por hidrólisis ácida
Se disolvió alginato de sodio, que contenía >60% de monómeros de guluronato (PRONOVA UP MVG), en dH2O (10 mg/mL), la solución se ajustó a HCl 0.01 M y luego se colocó en un baño de agua a 80 °C durante hasta 24 horas Para terminar la hidrólisis, se enfrió el hidrolizado ácido y se aumentó el pH a pH 7 mediante adición de NaOH 10 M. Las soluciones se liofilizaron y se resuspendieron en una cantidad mínima de dH2O.
Para obtener fragmentos de G hidrolizados con ácido (AHG) con un grado de polimerización promedio en número aceptable, así como una distribución del peso molecular, las soluciones se filtraron una vez por diálisis para eliminar los oligómeros y las sales de LMW. Normalmente, se utilizaron los siguientes tiempos de reacción y cortes de membrana de diálisis para producir AHG con un peso molecular deseado:
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Los productos finales se liofilizaron y caracterizaron por FT-IR y cromatografía de permeación en gel (GPC). El sistema GPC constaba de dos columnas TSK G5000PWxl y G3000PWxl (Polymer Laboratories, Reino Unido) en serie, fase móvil PBS (pH 7.4) y caudal de 1 ml/min. El peso molecular y la polidispersidad se calcularon en relación con los estándares de pululano. Los estándares de alginato no están disponibles comercialmente, lo que requirió el uso de pululano. Estos estándares de calibración no dan el peso molecular correcto para los alginatos, ya que la GPC se separa de acuerdo con el volumen hidrodinámico, que difiere con la arquitectura macromolecular variable. Los alginatos están más expandidos que los pululanos, lo que resulta en una sobreestimación de seis veces del peso molecular del alginato por GPC con pululano. En consecuencia, se aplicó un factor de escala (dividir por 6) a los pesos moleculares aparentes calculados a partir de la calibración de pululano, para ajustar las diferentes arquitecturas macromoleculares de los estándares de MW de pululano (Andersen T., et al., 2012, Alginates as biomaterials in tissue engineering.Carbohydrate Chemistry: Chemical and Biological Approaches, Vol. 37, 232-233). Se prepararon muestras para GPC en PBS (3 mg/ml) y se monitorizó el eluato utilizando un refractómetro diferencial (Optilab t-Rex (Wyatt, Reino Unido)). Para el análisis de datos se utilizó el software PL Caliber Instrument, versión 7.0.4, de Polymer Laboratories (Reino Unido).
Se generaron fragmentos de G hidrolizados con ácido (AHG) con pesos moleculares entre 2.500 y 26.000 g/mol (polidispersidad 2.5-3.5). Las características típicas de los AHG utilizados en estos estudios se resumen en la siguiente tabla.
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continuación
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Se produjo el OligoG CF-5/20 para conjugación como se describió previamente (Khan et al. 2012, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 56(10), 5134-5141). OligoG es un oligómero de alginato de 5-20 meros con al menos 85% de residuos de G.
Conjugación de éster ('E')
Brevemente, para la conjugación de 2500 g/mol de AHG con bacitracina, se disolvió el oligómero de alginato (200 mg, 0.08 mmol) con agitación en DMF anhidro (4 ml) (o DMSO anhidro para los lotes 3 y posteriores) en un matraz de fondo redondo de 10 ml. A esto, se agregaron DCC (16.5 mg, 0.08 mmol), DmAP (1.6 mg, 0.01 mmol) y bacitracina (37.5 mg, 0.03 mmol; Sigma), y se dejó que la reacción prosiguiera a temperatura ambiente durante la noche, bajo agitación. Para detener la reacción, la mezcla se vertió en exceso de cloroformo (hasta 20 ml), luego el precipitado resultante se recogió por filtración, se volvió a disolver en agua destilada (dH2O, 2 ml) y se purificó por FPLC (véase a continuación).
Conjugación de amida ('A')
En resumen, para la conjugación de 2500 g/mol de AHG con bacitracina, se disolvió el oligómero de alginato (200 mg, 0.08 mmol) con agitación en dH2O (2 ml) en un matraz de fondo redondo de 10 ml. A esto, se agregaron EDC (19.9 mg, 0.1 mmol) y sulfo-NHS (22.6 mg, 0.1 mmol), y la mezcla se dejó en agitación durante 15 min. Posteriormente, se agregó bacitracina (37.5 mg, 0.03 mmol) y la mezcla de reacción se dejó en agitación durante 2 h a temperatura ambiente, luego se almacenó a -20 °C hasta la purificación por FPLC (véase a continuación).
Purificación de conjugados por FPLC
Los conjugados se purificaron de la mezcla de reacción mediante cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) (AKTA FPLC; Amersham Pharmacia Biotech, Reino Unido) utilizando una columna HiLoad Superdex 75 16/600 PG preempaquetada con un detector UV y análisis de datos utilizando Unicorn Software 4.0 (Amersham Pharmacia Biotech, Reino Unido). Se inyectaron muestras de la mezcla de reacción (2 ml) en un bucle de 2 pl utilizando PBS (pH 7.4) a 0.5 ml/min como fase móvil. Se recolectaron fracciones (5 ml), se dializaron frente a agua desionizada (8 cambios de agua) y se ensayó el contenido de proteínas (ensayo BCA) antes de agrupar las fracciones que contenían el conjugado. El conjugado final se liofilizó y almacenó a -20 °C.
Ejemplo 2 - Caracterización de conjugados de bacitracina-oligómero de alginato
Pureza, peso molecular y contenido de fármaco
Los conjugados de bacitracina-oligómero de alginato se caracterizaron mediante FPLC y GPC para evaluar la pureza y estimar el peso molecular, y el contenido total de fármaco del conjugado se determinó mediante el ensayo BCA utilizando fármaco libre como calibrador.
El sistema de FPLC descrito anteriormente para la purificación se utilizó de nuevo para la caracterización del conjugado final, con una columna Superdex 7510/300 GL preempaquetada. Las muestras (200 pl) se disolvieron en PBS (pH 7.4) y se inyectaron en un bucle 100 de ml a 0.5 ml/min. Se volvió a utilizar el sistema GPC descrito anteriormente para la caracterización del conjugado final y se aplicó el mismo factor de escala.
Resultados
Utilizando estos oligómeros de alginato, se ha preparado una biblioteca de conjugados de bacitracina-oligómero de alginato, con un rendimiento de reacción típico de -40%, con pesos moleculares de 19.500-83.250 g/mol (en relación con los estándares de peso molecular de pululano); que contiene 1-7% p/p de carga de fármaco (equivalente a 3-5 oligómeros: 1 molécula de bacitracina).
Lote 1
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Lote 2
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Lote 4
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Ejemplo 3 - Actividad antimicrobiana
Cepas y aislados bacterianos:
Las cepas utilizadas para las pruebas de susceptibilidad incluyen tanto las cepas de recolección de cultivos como los aislados clínicos que se enumeran a continuación. Sus genotipos relevantes conocidos y su origen han sido descritos por Khan et al. supra.
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Determinación de la actividad antimicrobiana
Las MIC de oligómeros de alginato, bacitracina y conjugados de oligómero de alginato de los mismos se determinaron para los aislados V2, V3, V5, V19, E68 y E75 utilizando el método de microdilución en caldo de acuerdo con las directrices estándar (CLSI 2012). Los organismos de prueba se suspendieron en caldo con ajuste de cationes (MH) de Mueller Hinton (100 pl, 1-5 x 104 CFU/ml) y se incubaron en placas de microtitulación de 96 pozos en diluciones seriadas dobles de los compuestos de prueba. La MIC se definió como la concentración más baja de compuesto de prueba que no produjo un crecimiento visible después de 16 a 20 horas. A menos que se indique lo contrario, los resultados muestran valores medios de 3 experimentos.
Resultados
Ninguna de las fracciones de alginato u OligoG mostró actividad antimicrobiana, mientras que la bacitracina no conjugada mostró una alta actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (Gram positivo) pero no contra las especies Gram negativas probadas (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonía, Escherichia coli y Acinetobacter baumannii.
Por el contrario, la bacitracina conjugada con oligómero de alginato muestra una buena actividad antimicrobiana frente a (valores de MIC más bajos) contra las cepas Gram negativas (en particular, la cepa E. coli) y las cepas Gram positivas.
La actividad antimicrobiana fue mayor para los conjugados que contenían oligómeros de alginato de bajo peso molecular (que incluye OligoG).
Lote 1
Valores de MIC (pg/ml) para cada compuesto probado contra una variedad de bacterias
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de bacitracina-oligómero de alginato que comprende un antibiótico de la clase bacitracina conectado de forma covalente a al menos un oligómero de alginato a través de un enlace covalente directo o un conector molecular covalente, en el que dicho oligómero de alginato tiene 2 a 50 residuos de monómero, o una sal, solvato, hidrato, diastereoisómero, tautómero o enantiómero farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. El conjugado de bacitracina-oligómero de alginato de la reivindicación 1, en el que dicho antibiótico de la clase bacitracina se
(i) selecciona de bacitracina A1, A2, B1, B2, B3, C, D1, D2, D3 y E y derivados funcionalmente equivalentes de la misma;
(¡i) representa por la Fórmula
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en la que Leu es leucina; Glu es ácido glutámico; Lys es lisina; Orn es ornitina; Phe es fenilalanina; His es histidina; Asp es ácido aspártico; Asn es asparagina;
Y es valina, isoleucina, leucina o 5-metileno-isoleucina;
Z es valina, isoleucina, leucina o 5-metileno-isoleucina; y
X es W[1]-Cys[2] o V[1]-Thz[2]; en el que
W es valina, isoleucina, leucina o 5-metileno-isoleucina y Cys es cisteína; y
V es
H2 N-C(R)H
en la que R es la cadena lateral a de valina, isoleucina, leucina o 5-metileno-isoleucina: y
Thz es un anillo de tiazolina
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que es 2' acoplado a V y 4' acoplado al carbono a de Leu[3], en el que ninguno o uno o más de los aminoácidos Leu[3], Glu[4], Orn5 *[7] *, Phe[9], His[10] o Asp[11 se reemplaza por otro residuo de aminoácido que se puede seleccionar de aminoácidos naturales o no codificados genéticamente, preferiblemente en los que dicho aminoácido natural o no codificado genéticamente se selecciona de leucina, treonina, ácido, fenilalanina, arginina, histidina, lisina, asparagina, serina, cisteína, homolisina, ornitina, ácido diaminobutírico (por ejemplo, ácido a,Y-diaminobutírico), ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiónico, homoarginina, trimetilisina, trimetilornitina, ácido 4-aminopiperidina-4-carboxílico, ácido 4-amino-1-carbamimidoilpiperidina- 4-carboxílico y 4-guanidinofenilalanina;
(iii) selecciona de bacitracina A (A1 y/o A2) y bacitracina B (B1 y/o B2); y/o
(iv) compleja con cationes de metales divalentes, por ejemplo, Zn2+, Mg2+, Mn2+, y Co2+
3. El conjugado de bacitracina-oligómero de alginato de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el oligómero de alginato tiene un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPn) de (i) 4 a 50, 4 a 35, 4 a 30, 4 a 25, 4 a 22, 4 a 20, 4 a 18, 4 a 16 o 4 a 14,
(ii) 6 a 50, 6 a 35, 6 a 30, 6 a 25, 6 a 22, 6 a 20, 6 a 18, 6 a 16 o 6 a 14,
(iii) 8 a 50, 8 a 35, 8 a 30, 8 a 25, 10 a 25, 10 a 22, 10 a 20, 10 a 18, o 10 a 15, o
(iv) 20 a 50, 20 a 45, 20 a 40, 20 a 35, 20 a 30 o 20 a 25, o
(v) 30 a 50, 30 a 45, 30 a 40 o 30 a 35.
4. El conjugado de bacitracina-oligómero de alginato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el oligómero de alginato tiene al menos 70% de los residuos de G, o al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95% de los residuos de G, preferiblemente en el que al menos 80% de los residuos de G se disponen en bloques de G.
5. El conjugado de bacitracina-oligómero de alginato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el oligómero de alginato tiene al menos 70% de los residuos de M, o al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95% de los residuos de M, preferiblemente en el que al menos 80% de los residuos de M se disponen en bloques de M.
6. El conjugado de bacitracina-oligómero de alginato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho enlace covalente directo es parte de un grupo funcional éster, éster de carbonato, ortoéster, cetal, hemicetal, éter, acetal, hemiacteal, peroxi, metilenodioxi, amida, amina, imina, imida, azida, azo, oxima, sulfuro, disulfuro, sulfinilo, sulfonilo, carbonotioilo, tioéster, fosfina o fosfodiéster, preferiblemente parte de un éster o una amida.
7. El conjugado de bacitracina-oligómero de alginato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho conector covalente es o comprende grupos moleculares seleccionados de:
(i) un aminoácido o un péptido;
(ii) un monosacárido o un oligosacárido diferente de guluronato o mannuronato o polímeros formados del mismo; (iii) un ribonucleótido o un desoxiribonucleótido;
(iv) un grupo alquilo, alquenilo o alquino de cadena lineal, ramificada o cíclica, sustituido o no sustituido;
(v) un grupo acetilo, succinilo, aconitilo (cis o trans), glutarilo, metilsuccinilo, trimellitil cisteamina, penicillamina, N-(2-mercaptopropionil)glicina, ácido 2-mercaptopropiónico, homocisteína, ácido 3-mercaptopropiónico o deaminopenicillamina.
8. El conjugado de bacitracina-oligómero de alginato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho enlace covalente directo, un grupo funcional que contiene dicho enlace covalente o dicho conector molecular covalente es/se
(i) ácido lábil;
(ii) sensible a especies reactivas de oxígeno; y/o
(iii) degrada por una enzima secretada por una bacteria o una célula inmunitaria.
9. El conjugado de bacitracina-oligómero de alginato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho conjugado consiste en
(i) al menos un oligómero de alginato unido de forma covalente a un antibiótico de la clase bacitracina a través de un enlace de éster formado a partir de un grupo carboxilo sobre el grupo alginato e hidroxilo sobre la bacitracina, o (ii) al menos un oligómero de alginato unido de forma covalente a un antibiótico de la clase bacitracina a través de un enlace de amida formado a partir de un grupo carboxilo sobre el alginato y un grupo amina sobre la bacitracina.
10. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado de bacitracina-oligómero de alginato como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
11. Un método para la preparación de un bacitracina-oligómero de alginato como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, dicho método comprende
(ia) proporcionar un oligómero de alginato, en el que dicho oligómero de alginato tiene 2 a 50 residuos de monómero, y un antibiótico de la clase bacitracina y formar un enlace covalente directo entre dos grupos moleculares del mismo; o
(ib) proporcionar un oligómero de alginato, un antibiótico de la clase bacitracina y un conector molecular covalente y formar un enlace covalente directo entre dos grupos moleculares sobre el oligómero de alginato y la molécula conectora y formar un enlace covalente directo entre dos grupos moleculares sobre el antibiótico de la clase bacitracina y la molécula conectora; o
(ic) proporcionar un oligómero de alginato y un antibiótico de la clase bacitracina en el que uno o ambos llevan una molécula conectora molecular covalente unida de forma covalente al mismo y que conecta de forma covalente el oligómero de alginato al antibiótico de la clase bacitracina a través de al menos una de las moléculas conectoras; y opcionalmente
(ii) separar al menos una porción del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato a partir de la mezcla de reacción.
12. El método de la reivindicación 11, dicho método comprende
(i) proporcionar una solución acuosa de un oligómero de alginato que tiene un grupo carboxilo disponible en el que dicho oligómero de alginato tiene 2 a 50 residuos de monómero
(ii) poner en contacto dicha solución de alginato con clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) en una cantidad y bajo condiciones suficientes para activar al menos un grupo carboxilo en el oligómero de alginato; (iii) opcionalmente poner en contacto dicho oligómero de alginato activado por carboxilo con sulfo N-hidroxisuccinimida (sulfo-NHS) en una cantidad y bajo condiciones suficientes para formar un éster sulfo-NHS reactivo con amina;
(iv) poner en contacto dicho oligómero de alginato activado por carboxilo de la etapa (ii) o el éster sulfo-NHS reactivo con amina de la etapa (iii) con un antibiótico de la clase bacitracina que tiene una amina de primaria disponible en una cantidad y bajo condiciones suficientes para formar un enlace de amida entre el oligómero de alginato y el antibiótico de la clase bacitracina; y
(v) separar al menos una porción del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato a partir de la mezcla de reacción.
13. El método de la reivindicación 11, dicho método comprende
(i) proporcionar una solución de un oligómero de alginato que tiene un grupo carboxilo disponible, en el que dicho oligómero de alginato tiene 2 a 50 residuos de monómero, preferiblemente una solución orgánica (por ejemplo, DMF y/o DMSO);
(ii) poner en contacto dicha solución de alginato con diciclohexilcarbodiimida (DCC) en una cantidad y bajo condiciones suficientes para formar un intermedio de O-acilisourea;
(iii) poner en contacto dicho intermedio de O-acilisourea con un antibiótico de la clase bacitracina que tiene un grupo hidroxilo disponible y 4-N,N-dimetilaminopiridina (DMAP) en cantidades y bajo condiciones suficientes para formar un enlace de éster entre el oligómero de alginato y el antibiótico de la clase bacitracina; y
(iv) separar al menos una porción del conjugado de bacitracina-oligómero de alginato a partir de la mezcla de reacción;
en el que se pueden realizar de forma simultánea las etapas (ii) y (iii).
14. Un conjugado de bacitracina-oligómero de alginato como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o una composición farmacéutica como se define en reivindicación 10 para uso en el tratamiento de prevención de una infección bacteriana, preferiblemente en el que la infección bacteriana es/está
(i) en una herida, preferiblemente una herida crónica;
(ii) una infección respiratoria en un sujeto que sufre de un trastorno o afección respiratoria subyacente, preferiblemente seleccionada de CF, COPD/COAD, o asma;
(iii) una infección relacionada con el dispositivo asociada con dispositivos médicos implantables o protésicos; o (iv) una infección sistémica o una infección de múltiples loci dentro de o sobre el sujeto.
15. El conjugado de bacitracina-oligómero de alginato o composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 14, en el que la infección es una infección bacteriana Gram negativa.
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