ES2933983T3 - Conjugados oligoméricos de polimixina-alginato - Google Patents

Abstract

La invención proporciona un conjugado de polimixina-oligómero de alginato que comprende un antibiótico de clase polimixina conectado covalentemente a al menos un oligómero de alginato a través de un enlace covalente directo o un enlazador molecular covalente, o una sal, solvato, hidrato, diastereoisómero, tautómero, enantiómero o sustancia activa farmacéuticamente aceptable. metabolito del mismo. También se proporcionan métodos para la preparación de dicho conjugado, composiciones farmacéuticas que comprenden dicho conjugado y el uso de las mismas en un método para el tratamiento o prevención de una infección bacteriana en un sujeto con sospecha de tener o en riesgo de infección bacteriana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Conjugados oligoméricos de polimixina-alginato

La presente invención proporciona una nueva forma modificada de antibióticos de la clase de las polimixinas que tienen propiedades ventajosas. Más especialmente, se ha reconocido que la conjugación covalente de oligómeros de alginato con antibióticos de tipo polimixina reduce la toxicidad del huésped de dichos antibióticos sin reducir significativamente su eficacia antibacteriana y, en algunas realizaciones, incluso prolongando los efectos antibacterianos de los antibióticos. En otras palabras, los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato son una clase de entidades químicas novedosas que tienen una eficacia antibacteriana (que puede ser esencialmente la misma o una eficacia antibacteriana similar a la de los antibióticos de clase polimixina no conjugada), pero menos toxicidad para el huésped e incluso una duración más prolongada de los efectos antibacterianos. Los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato de la invención también pueden ser más efectivos para combatir la biopelícula que la forma no conjugada del mismo antibiótico de clase polimixina. Los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato de la invención representan por lo tanto tratamientos mejorados para infecciones bacterianas en sujetos animales. Por lo tanto, la invención proporciona usos médicos y métodos de tratamiento que reflejan estas propiedades de los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato de la invención, a saber, el uso de los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato de la invención en el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas. La invención proporciona además métodos para preparar los conjugados de la invención.

Los antibióticos de la clase polimixina son una clase bien conocida y bien caracterizada de antibióticos polipeptídicos cíclicos que se unen y dañan las bacterias de la membrana celular, en particular las bacterias Gram-negativas. Se entiende que las polimixinas también pueden unirse a la porción de lípido A de la endotoxina bacteriana y neutralizar los efectos biológicos de esta endotoxina. Las polimixinas se describen en general en Hoeprich, P.D., The Polymyxins, Medical Clinics of North America, p., 1257, 54 (5), septiembre de 1970, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Estos antibióticos se describieron inicialmente como metabolitos secundarios de cepas de bacterias Gram positivas, a saber, Bacillus sp., por ejemplo, Bacillus polymyxa varcolistinus (Minor, R.W., ed.: Antibiotics derived from Bacillus polymyxin. An. N. Y Acad. Sci, 51:853, 1949, que se incorpora aquí como referencia) e incluyen sustancias conocidas como circulinas y colistinas, por ejemplo, polimixinas A1, A2, B1, B1-I, B2, B3, B4, B5, B6, C (circulina A), D1, D2, E1 (colistina A), E2 (colistina B), F, K1, K2, M, P1, P2, S y T (Velkov et al, J, Med. Chem., 2010, 53, 1898­ 1916 y la información de apoyo adjunta, Storm et al, Ann. Rev. Biochem. 46:723-63, 1977 y Srinivasa y Ramachandran, Ind. J. Biophys., 17: 112-118, 1979. Las estructuras de polimixina se divulgan en The Merck Index, 15th Ed. (2013), Principles of Medicinal Chemistry, 2nd Ed. 1981, p. 779.

Las polimixinas pueden describirse en general como decapéptidos cíclicos ramificados catiónicos, más específicamente péptidos heptacíclicos que tienen una cadena lateral tripeptídica, que demuestran eficacia antibacteriana, que se cree que es en virtud de una actividad tensioactiva. Típicamente está presente una cola de ácido graso hidrófobo unida al grupo a-amino del residuo de aminoácido del terminal N del tripéptido. Desde entonces, se han sintetizado con diversos grados de éxito derivados de los mismos, incluidas las formas nonapeptídicas truncadas en las que se ha eliminado el residuo de aminoácido del terminal N del tripéptido.

Funcionalmente, la clase es muy eficaz contra bacterias Gram negativas, especialmente bacilos Gram negativos tales como Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella sp., Enterobactersp., Salmonella sp., Shigella sp., Vibrio sp., Pasteurella sp., Hemophilus sp. y Bordetella sp. Los efectos contra las bacterias Gram-positivas varían y son limitados en la mayoría de los casos. Sin embargo, la clase está plagada de problemas de toxicidad (es decir, toxicidad para el sujeto o “huésped” al que se administra el antibiótico de polimixina, a saber, “toxicidad del huésped”), especialmente nefrotoxicidad y neurotoxicidad. Se han preparado derivados de polimixina que superan este problema en diversos grados mientras conservan las propiedades antibióticas en diversos grados.

Los graves problemas de toxicidad del huésped de los antibióticos de la clase de las polimixinas hicieron que su uso se redujera durante muchos años. Sin embargo, la necesidad reciente de “nuevos” antibióticos que pueden emplearse en el combate de bacterias multirresistentes (los llamados antibióticos de último recurso) ha llevado a un mayor uso de antibióticos de la clase polimixina a pesar de sus problemas de toxicidad para el huésped. En la actualidad, los antibióticos de la clase de las polimixinas que se usan con mayor frecuencia son la colistina (una mezcla de polimixinas E1 y E2) y la polimixina B (una mezcla de polimixinas B1, B1-I, B2, B3 y B6, con predominio de B1 y B2). Si se requiere la administración sistémica, la colistina se usa normalmente en forma sulfometilada (metanosulfonato de colistina), ya que se ha descubierto que la colistina que lleva grupos amina sulfometilados, cuando se administra sistémicamente, es menos tóxica que la colistina no modificada. Sin embargo, es menos potente como agente antibacteriano. Tras la administración, el CMS se hidroliza a derivados parcialmente sulfonmetilados y, por lo tanto, se restaura parte de la actividad antibacteriana. Las formas truncadas de nonapéptidos de las polimixinas también tienen una toxicidad reducida.

En otros enfoques, se han unido moléculas pequeñas de dextrina a moléculas de colistina a través de un conector succinilo y se ha demostrado que tales conjugados tienen una toxicidad reducida para el huésped (documento WO 2012/035310). Sin embargo, estos conjugados tienen efectos antibacterianos debilitados reducidos que pueden restaurarse parcialmente con la digestión catalizada por amilasa de los grupos dextrina a (Tabla 3; Ejemplo 1, página 17). Es notable que la actividad antibiótica completa no se recupera en ninguno de los experimentos informados.

Además, se ha observado que, en un modelo de dos compartimentos de difusión de membrana biológica, estos conjugados no muestran el perfil farmacocinético/farmacodinámico (PK/PD) temprano de la colistina no conjugada (Azzopardi E. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2015, tomo 59(4), 1837-1843). Se sugirió que la colistina no conjugada debería administrarse junto con la forma conjugada para reducir la eficacia reducida de los conjugados de dextrina: colistina.

Por lo tanto, existe una necesidad continua de antibióticos que tendrán los efectos antibacterianos de los antibióticos

de la clase de las polimixinas sin los problemas de toxicidad en el huésped de los antibióticos de la clase de las polimixinas. Dicho de otra manera, existe la necesidad de identificar un medio para reducir los problemas de toxicidad

del huésped de los antibióticos de la clase de las polimixinas sin comprometer la eficacia antibacteriana de esos antibióticos.

Los oligómeros de alginato se han descrito extensamente en la literatura. Brevemente, los alginatos son polímeros

lineales de ácido p-D-manurónico (M) enlazados (1-4) y/o su epímero C-5 ácido a-L-gulurónico (G). La estructura primaria de los alginatos puede variar mucho. Los residuos M y G se pueden organizar como bloques homopoliméricos

de residuos M o G contiguos, como bloques de residuos M y G alternos y residuos M o G individuales que se pueden encontrar intercalados entre estas estructuras de bloques. Una molécula de alginato puede comprender algunas o todas estas estructuras y dichas estructuras pueden no estar uniformemente distribuidas por todo el polímero. En extremo, existe un homopolímero de ácido gulurónico (poliguluronato) o un homopolímero de ácido manurónico (polimanuronato). Los oligómeros de alginato se pueden obtener a partir de polímeros de alginato que normalmente

se aíslan de fuentes naturales como polímeros grandes de alto peso molecular (por ejemplo, un peso molecular medio

en el intervalo de 300.000 a 500.000 Dalton). Dichos polímeros de alginato grandes pueden degradarse o descomponerse, por ejemplo, por hidrólisis química o enzimática para producir estructuras de alginato de menor peso molecular (es decir, oligómeros de alginato).

Como se muestra en los Ejemplos, ahora se ha encontrado que la conjugación covalente de antibióticos de clase polimixina a oligómeros de alginato crea una nueva entidad química con eficacia antibacteriana (que puede ser esencialmente igual o similar, o al menos no significativamente reducida en comparación con la eficacia antibacteriana

del antibiótico de clase de polimixina) pero con una toxicidad del huésped reducida en comparación con la forma no conjugada del antibiótico de clase de polimixina. Se ha descubierto además que los efectos antibacterianos del conjugado oligomérico de polimixina-alginato pueden prolongarse en comparación con la forma no conjugada del antibiótico de la clase de polimixina. También se ha encontrado que se pueden preparar ciertos conjugados oligoméricos de polimixina-alginato que, en ciertos modelos fisiológicos, tienen un perfil PK/PD temprano que es similar a la forma no conjugada del antibiótico de clase polimixina.

De acuerdo con lo anterior, en un primer aspecto, la invención proporciona un conjugado oligomérico de polimixinaalginato que comprende un antibiótico del tipo de las polimixinas conectado covalentemente a al menos un oligómero

de alginato a través de un enlace covalente directo o un enlazador molecular covalente, en el que dicho oligómero de alginato tiene de 2-75 residuos de monómero.

Los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato también se pueden describir mediante la fórmula I:

P-(L-A)ⁿ (I)

en el que P- es un antibiótico de clase polimixina, L es un enlace covalente directo o un enlazador molecular covalente, -A es un oligómero de alginato y n es un número entero de 1 a 10, por ejemplo, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 o 2 o 1.

De acuerdo con la invención, un antibiótico de clase polimixina se define ampliamente como un deca- o nona-péptido

cíclico catiónico que demuestra eficacia antibacteriana en el que dicho péptido consiste en un péptido heptacíclico con

una cadena lateral tri- o di-peptídica. En determinadas realizaciones, una cola de ácido graso hidrófobo está unida al grupo a-amino del residuo de aminoácido del terminal N del tripéptido o dipéptido y que, en algunas realizaciones, puede estar saturado o insaturado (por ejemplo, un alcanoílo, un alquenoílo o un alquinol), ácido graso de cadena

lineal o ramificada, opcionalmente sustituido con uno o más grupos hidroxilo. Los residuos de ácidos grasos pueden

ser C³-C²⁰, por ejemplo, C³-¹⁸, C³-¹⁶, C³-¹⁴, C³-¹², C³-¹⁰, C³-⁸, C³-⁶ , C⁶-²⁰, C⁶-¹⁸, C⁶-¹⁶, C⁶-¹⁴, C⁶-¹² C¹⁰-¹⁸, C¹⁰-¹⁶, C¹⁰-¹⁴ o C¹⁰-¹².

Las polimixinas de origen natural o derivados funcionalmente equivalentes de las mismas que conservan la eficacia antibacteriana, incluidas las formas totalmente y semisintéticas, se contemplan específicamente en el presente documento. Por lo tanto, se incluyen con el término antibiótico de la clase de las polimixinas las polimixinas A1, A2,

B1, B1-I, B2, B3, B4, B5, B6, C (circulina A), D1, D2, E1 (colistina A), E2 (colistina B), F, K1, K2, M, P1, P2, S y T, por ejemplo, como se describe, entre otros, en Velkov et al, J, Storm et al, Srinivasa and Ramachandran, y The Merck

Index, 15th Ed., supra. Los derivados funcionalmente equivalentes se describen, entre otros, en los documentos WO 2010/130007, WO 2008/017734, WO 2010/075416, WO 2012/168820, WO 2009/098357, WO 2014/188178, WO 2015/1359676, WO 2015/072695, WO 2016/083531, WO 2016/100578.

A modo de ejemplo, un antibiótico de clase polimixina puede estar representado por moléculas antibacterianas de Fórmula II

en el que el ácido graso y el residuo de aminoácido 1 son independientemente opcionales, en el que D-Leu es D-leucina; L-Leu es L-leucina; L-Thr es L-treonina y L-Dab es ácido a,Y-diaminobutírico, y en el que ninguno, o uno o más, de los aminoácidos 1 a 10 se reemplaza por otro residuo de aminoácido que puede seleccionarse entre aminoácidos codificados genéticamente natural o no, por ejemplo, leucina, treonina, fenilalanina, arginina, histidina, lisina, asparagina, serina, cisteína, homolisina, ornitina, ácido diaminobutírico (por ejemplo, ácido a,Y-diaminobutírico), ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiónico, homoarginina, trimetilisina, trimetilornitina, ácido 4-aminopiperidina-4-carboxílico, ácido 4-amino-1-carbamimidoilpiperidina-4-carboxílico y 4-guanidinofenilalanina. Las formas sustituidas pueden considerarse derivados equivalentes funcionales de la polimixina E1 y/o E2 (colistina), es decir, derivados que retienen (por ejemplo, tienen al menos el 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de) la eficacia antibacteriana de la polimixina E1 y /o E2.

Preferiblemente, el aminoácido de sustitución es un aminoácido con una cadena lateral catiónica, es decir, un aminoácido que tiene una cadena lateral que tiene una carga neta positiva al pH intracelular de una célula tumoral, por ejemplo, alrededor de pH 7.4. De los aminoácidos codificados genéticamente, esto incluiría la lisina y la arginina, pero se puede usar cualquier aminoácido modificado o no codificado genéticamente que lleve tal carga neta positiva en su cadena lateral, por ejemplo, aquellos aminoácidos que llevan una cadena lateral con un grupo guanidino o un grupo amina u otra fracción catiónica, por ejemplo, derivados de lisina y arginina en los que cualquier hidrógeno en la cadena lateral, excepto el hidrógeno protonador, está sustituido con un átomo de halógeno, por ejemplo, flúor, cloro o bromo, o un grupo alquilo o alcoxi C¹-C⁴ alifático lineal, ramificado, insaturado o saturado, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, tert-butilo, etileno, propileno, butileno, hidroxi, metoxi, etiloxi, propiloxi, isopropiloxi, grupo butiloxi, isobutiloxi, sec -butiloxi, tert-butiloxi o versiones sustituidas con halógeno de los mismos. Los aminoácidos no codificados genéticamente adecuados con cadenas laterales catiónicas incluyen homolisina, ornitina, ácido diaminobutírico, ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiónico y homoarginina, así como trimetilisina y trimetilornitina, ácido 4-aminopiperidina-4-carboxílico, Ácido 4-amino-1-carbamimidoilpiperidina-4-carboxílico y 4-guanidinofenilalanina. Las formas sustituidas de Fórmula II abarcadas por la invención conservarán (por ejemplo, tendrán al menos el 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de) la eficacia antibacteriana de la forma no sustituida de Fórmula II.

El grupo “ácido graso” puede ser cualquiera de los descritos anteriormente, preferiblemente ácido metiloctanoico o ácido metilheptanoico, por ejemplo, Ácido 6-metiloctanoico o ácido 6-metilheptanoico.

Un aminoácido es una molécula que contiene un grupo amina, un grupo ácido carboxílico y al menos un carbono que separa estos dos grupos. Se pueden unir otros grupos a los carbonos de separación. Estos grupos pueden denominarse “cadenas laterales” aunque, en su forma más simple, las cadenas laterales podrían ser hidrógeno (glicina). Los aminoácidos con un solo carbono de separación se denominan “a-aminoácidos” y tienen la fórmula genérica H²NCR¹ R²COOH, donde R¹ y R² son grupos sustituyentes, es decir, son cadenas laterales. El carbono que se separa se conoce como carbono a. Existen otros tipos de aminoácidos en los que los grupos amino y ácido carboxílico están separados por más de un solo átomo de carbono; por ejemplo, en los p-aminoácidos el átomo de carbono al que pertenece el grupo amino está separado del grupo ácido carboxílico por dos átomos de carbono y en los Y-aminoácidos tres átomos de carbono separan los grupos amino y ácido carboxílico. Preferiblemente, los aminoácidos en el antibiótico de clase polimixina de uso en la invención serán a, p o Y-aminoácidos, más preferiblemente a o p-aminoácidos y lo más preferiblemente a-aminoácidos.

Los aminoácidos, con la excepción de la glicina, pueden existir como dos o más estereoisómeros. En particular, el carbono a de un aminoácido distinto de la glicina es un centro quiral y, por lo tanto, da lugar a dos formas enantioméricas de cada aminoácido. Estas formas a menudo se denominan formas D y L, por ejemplo, D-alanina y L-alanina. Los aminoácidos con centros quirales adicionales existirán en cuatro o más estereoisómeros posibles, por ejemplo, la treonina tiene dos centros quirales y, por lo tanto, puede existir en una de cuatro formas estereoisómeras. Cualquier forma estereoisómera de un aminoácido puede estar presente en las moléculas antibióticas de clase polimixina de uso en la invención. A los efectos de describir la presente invención, cuando el término “no codificado genéticamente” se aplica a los aminoácidos, esto no incluye las formas D de los aminoácidos que se encuentran en la naturaleza en la forma L.

En realizaciones preferidas, el antibiótico de clase polimixina se selecciona de polimixina B1, B1-I, B2, B3, B4, B5, B6, E1 o E2, más preferiblemente se selecciona de polimixina B1, B1-I, B2, E1 o E2 y lo más preferiblemente será polimixina E1 o E2 o derivados funcionales equivalentes de cualquiera de los anteriores, es decir, derivados que conservan (por ejemplo, tienen al menos 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de) la eficacia antibacteriana de la polimixina en cuestión.

En determinadas realizaciones, uno o más grupos de amina libres en el antibiótico de la clase de las polimixinas pueden enmascararse mediante modificación, por ejemplo, por sulfometilación.

Como se indicó anteriormente, los alginatos se presentan típicamente como polímeros de una masa molecular promedio de al menos 35.000 Dalton, es decir, aproximadamente 175 a aproximadamente 190 residuos de monómero, aunque típicamente mucho mayor. Un oligómero de alginato para usar de acuerdo con la presente invención, por otro lado, contendrá de 2-75 residuos de monómero y puede contener de 3, 4, 5 o 6 a 75, 2, 3, 4, 5 o 6 a 50, 2, 3, 4, 5 o 6 a 40, 2, 3, 4, 5 o 6 a 35 o 2, 3, 4, 5 o 6 a 30 residuos. Por lo tanto, un oligómero de alginato para usar de acuerdo con la invención tendrá típicamente un peso molecular promedio de 350, 550, 700, 900 o 1000 a 15,000 Dalton, 350, 550, 700, 900 o 1000 a 10,000 Dalton, 350, 550, 700, 900 o 1000 a 8000 Daltons, 350, 550, 700, 900 o 1000 a 7000 Daltons, o 350, 550, 700, 900 o 1000 a 6000 Daltons.

En otras palabras, el oligómero de alginato puede tener un grado de polimerización (DP) o un grado de polimerización promedio en número (DPn) de 2-75, preferiblemente de 2 a 50, más preferiblemente de 2 a 40, de 2 a 35, 2 a 30, 2 a 28, 2 a 25, 2 a 22, 2 a 20, 2 a 18, 2 a 17, 2 a 15 o 2 a 12.

Otros rangos representativos (ya sea para el número de residuos, DP o DPn) incluyen uno cualquiera de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 a cualquiera de 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13 o 12.

Otros rangos representativos (ya sea para el número de residuos, DP o DPn) incluyen uno cualquiera de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 a uno cualquiera de 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17 o 16.

Otros rangos representativos (ya sea para el número de residuos, DP o DPn) incluyen uno cualquiera de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 a uno cualquiera de 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20 o 19.

En la medida permitida por las reivindicaciones, en algunas realizaciones puede ser ventajoso seleccionar un oligómero de alginato más grande para crear un conjugado de mayor tamaño. Los conjugados más grandes pueden ayudar a suministrar los antibióticos de la clase de las polimixinas de forma selectiva a los sitios y ubicaciones de la infección porque la permeabilidad vascular de tales áreas dentro de un sujeto suele ser mayor que en la vasculatura de las áreas no infectadas. En consecuencia, es menos probable que los conjugados más grandes entren en áreas no infectadas desde el torrente sanguíneo, pero podrían ingresar en áreas infectadas más permeables. Un rango de tamaño representativo para un oligómero más grande puede ser, por ejemplo, de 20 a 75 residuos (o DP o DPn de 20 a 75) o uno cualquiera de 21, 22, 23, 24 o 25, a uno cualquiera de 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35 o 30 residuos (o DP o DPn de uno cualquiera de estos rangos) o uno cualquiera de 30, 31, 32, 33, 34 o 35, a uno cualquiera de 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45 o 40 residuos (o DP o DPn de uno cualquiera de estos rangos). Alternativamente, estos resultados también podrían lograrse aumentando el número de oligómeros de alginato, incluso los de menor tamaño, en el conjugado.

Como se indicó anteriormente, un oligómero de alginato contendrá (o comprenderá) residuos o unidades de guluronato o ácido gulurónico (G) y/o manuronato o ácido manurónico (M). Un oligómero de alginato de acuerdo con la invención preferiblemente estará compuesto solo o sustancialmente solo (es decir, consistirá esencialmente en) residuos de uronato/ácido urónico, más particularmente solo o sustancialmente solo de residuos G y/o M. Expresado de manera alternativa, en el oligómero de alginato de uso en la presente invención, al menos el 80 %, más particularmente al menos el 85, 90, 95 o 99 % de los residuos de monómero pueden ser residuos de uronato/ácido urónico, o, más particularmente, residuos G y/o M. En otras palabras, preferiblemente el oligómero de alginato no comprenderá otros residuos o unidades (por ejemplo, otros residuos de sacárido, o más particularmente otros residuos de ácido urónico/uronato).

El oligómero de alginato es preferentemente un oligómero lineal.

Más particularmente, los oligómeros de alginato propuestos para uso de acuerdo con la presente invención contendrán al menos un 70 % de residuos G (es decir, al menos un 70 % de los residuos monoméricos del oligómero de alginato serán residuos G). Por lo tanto, las realizaciones específicas incluyen oligómeros de alginato con (por ejemplo, que contienen) del 70 al 100 % de residuos de G (guluronato).

Preferiblemente al menos el 75 % o el 80 %, más particularmente al menos el 85 % o el 90 %, aún más particularmente al menos el 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de los residuos de monómero son guluronato. En una realización, el oligómero de alginato puede ser un oligoguluronato (es decir, un homooligómero de G o 100 % G).

En otra realización preferida, los alginatos de uso en la invención descritos anteriormente tienen una estructura primaria en la que la mayoría de los residuos G están en los denominados bloques G. Preferiblemente al menos el 50 %, más preferiblemente al menos el 70 o 75 % y lo más preferiblemente al menos el 80, 85, 90, 92 o 95 % de los residuos G están en bloques G. Un bloque G es una secuencia contigua de al menos dos residuos G, preferiblemente al menos 3 residuos G contiguos, más preferiblemente al menos 4 o 5 residuos G contiguos, lo más preferiblemente al menos 7 residuos G contiguos.

En particular, al menos el 90 % de los residuos G están enlazados 1-4 a otro residuo G. Más particularmente, al menos el 95 %, más preferiblemente al menos el 98 % y lo más preferiblemente al menos el 99 % de los residuos G del alginato están enlazados 1-4 a otro residuo G. Más específicamente, al menos el 70 % de los residuos de monómero en el oligómero son residuos G enlazados 1-4 a otro residuo G, o más preferiblemente al menos el 75 %, y lo más preferiblemente al menos 80, 85, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % de los residuos de monómeros del oligómero son residuos G enlazados 1-4 a otro residuo G. Este enlace 1-4 de dos residuos G se puede expresar alternativamente como una unidad gulurónica unida a una unidad gulurónica adyacente.

Los oligómeros de alginato de uso en la invención se denominan comúnmente oligómeros de “alto G” o “bloque G”, es decir, que tienen un alto contenido de residuos G o bloques G (por ejemplo, en los que al menos el 70 % de los residuos monoméricos son G, preferiblemente dispuestos en bloques G).

El oligómero de alginato de uso en la invención es preferiblemente de 3 a 35 meros, más preferiblemente de 3 a 28 meros, en particular de 4 a 25 meros, por ejemplo, una de 5 a 20 meros, especialmente una de 6 a 22 meros, en particular una de 8 a 20 meros, especialmente una de 10 a 15 meros, por ejemplo, que tiene un peso molecular en el rango de 350 a 6400 Dalton o 350 a 6000 Dalton, preferiblemente 550 a 5500 Dalton, preferiblemente 750 a 5000 Dalton, y especialmente 750 a 4500 Dalton o 2000 a 3000 Dalton o 900 a 3500 Dalton. Otros oligómeros de alginato representativos incluyen, como se mencionó anteriormente, oligómeros con 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 a 50, 45, 40, 35, 28, 25, 22 o 20 residuos.

Puede ser un solo compuesto o puede ser una mezcla de compuestos, por ejemplo, de una gama de grados de polimerización. Como se indicó anteriormente, los residuos monoméricos en el oligómero de alginato pueden ser iguales o diferentes y no es necesario que todos lleven grupos cargados eléctricamente, aunque se prefiere que la mayoría tengan (por ejemplo, al menos el 60 %, preferiblemente al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 90 %). Se prefiere que una mayoría sustancial, por ejemplo, al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 90 % de los grupos cargados tengan la misma polaridad. En el oligómero de alginato, la proporción de grupos hidroxilo a grupos cargados es preferiblemente de al menos 2:1, más especialmente de al menos 3:1.

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 3-28, 4-25, 6-22, 8-20 o 10-15, o 5-18 o 7-15 o 8-12, especialmente 10.

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 3-24, 4-23, 5-22, 6-21, 7-20, 8-19, 9-18, 10-17, 11-16, 12-15 o 13-14 (por ejemplo, 13 o 14).

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 4-25, 5-24, 6-23, 7-22, 8-21, 9-20, 10-19, 11-18, 12-17, 13-16, 14-15 (por ejemplo, 14 o 15).

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 5-26, 6-25, 7-24, 8-23, 9-22, 10-21, 11-20, 12-19, 13-18, 14-17 o 15-16 (por ejemplo, 15 o 16).

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 4-50, 4-40, 4-35, 4-30, 4-28, 4-26, 4-22, 4-20, 4-18, 4-16 o 4-14.

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 5-50, 5-40, 5-25, 5-22, 5-20, 5-18, 5-23, 5-20, 5-18, 5-16 o 5-14.

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 6-50, 6-40, 6-35, 6-30, 6-28, 6-26, 6-24, 6-20, 6-19, 6-18, 6-16 o 6-14.

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 8-50, 8-40, 8-35, 8-30, 8-28, 8-25, 8-22, 8-20, 8-18, 8-16 o 8-14.

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 9-50, 9-40, 9-35, 9-30, 9-28, 9-25, 9-22, 9-20, 9-18, 9-16 o 9-14.

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 10-50, 10-40, 10-35, 10-30, 10-28, 10-25, 10-22, 10-20, 10-18, 10-16 o 10- 14.

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 11-50, 11-40, 11-35, 11-30, 11-28, 11-25, 11-22, 11-20, 11-18, 11-16 o 11- 14.

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 12-50, 12-40, 12-35, 12-30, 12-28, 12-25, 12-22, 12-20, 12-18, 12-16 o 12- 14.

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 13-50, 13-40, 13-35, 13-30, 13-28, 13-25, 13-22, 13-20, 13-18, 13-16 o 13- 14 (por ejemplo, 13 o 14).

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 14-50, 14-40, 14-35, 14-30, 14-28, 14-25, 14-22, 14-20, 14-18 o 14-16.

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 15-50, 15-40, 15-35, 15-30, 15-28, 15-25, 15-22, 15-20 o 15-18.

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 18-50, 18-40, 18-35, 18-30, 18-28, 18-25, 18-22 o 18-20.

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 20-75, 20-70, 20-65, 20-60, 20-55, 20-50, 20-45, 20-40, 20-35, 20-30 o 20-25.

El oligómero de alginato de uso en la invención puede tener un grado de polimerización (DP), o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ), de 30-75, 30-70, 30-65, 30-60, 30-55, 30-50, 30-45, 30-40 o 30-35.

Preferiblemente, el oligómero de alginato de uso en la invención está sustancialmente libre, preferiblemente esencialmente libre, de oligómeros de alginato que tienen un grado de polimerización fuera de los intervalos divulgados en el presente documento. Esto puede expresarse en términos de la distribución del peso molecular del oligómero de alginato de la invención, por ejemplo, el porcentaje de cada mol del oligómero de alginato que se usa de acuerdo con la invención que tiene un DP fuera del intervalo relevante. La distribución del peso molecular es preferentemente tal que no más del 10 %, preferentemente no más del 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % en moles tiene un DP de tres, dos o uno más que el límite superior relevante para DPⁿ. Asimismo, se prefiere que no más del 10 %, preferiblemente no más del 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % en moles, tenga un DP por debajo de un número tres, dos o uno más pequeño que el correspondiente límite inferior para DPⁿ.

Los oligómeros de alginato adecuados se describen en los documentos WO2007/039754, WO2007/039760, WO 2008/125828 y WO2009/068841.

Los oligómeros de alginato adecuados representativos tienen un DPⁿ en el rango de 5 a 30, una fracción de guluronato (F^g ) de al menos 0.80, una fracción de manuronato (F^m ) de no más de 0.20, y al menos 95 % en moles de DP no más de 25

Otros oligómeros de alginato adecuados tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 7 a 15 (preferiblemente de 8 a 12), una fracción de guluronato (F^g ) de al menos 0.85 (preferiblemente al menos 0.90), una fracción de manuronato (F^m ) de no más de 0.15 (preferiblemente no más de 0.10), y que tenga al menos 95 % en moles con un grado de polimerización inferior a 17 (preferiblemente inferior a 14).

Otros oligómeros de alginato adecuados tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 5 a 18 (especialmente 7 a 15), una fracción de guluronato (F^g ) de al menos 0.80 (preferiblemente al menos 0.85, especialmente al menos 0.92), una fracción de manuronato (F^m ) de no más de 0.20 (preferiblemente no más de 0.15, especialmente no más de 0.08), y que tenga al menos un 95 % en moles con un grado de polimerización inferior a 20 (preferiblemente inferior a 17).

Otros oligómeros de alginato adecuados tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 5 a 18, una fracción de guluronato (F^g ) de al menos 0.92, una fracción de manuronato (F^m ) de no más de 0.08, y que tiene al menos un 95 % mol con un grado de polimerización inferior a 20.

Los oligómeros de alginato adecuados adicionales tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 5 a 18 (preferiblemente de 7 a 15, más preferiblemente de 8 a 12, especialmente alrededor de 10), una fracción de guluronato (F^g ) de al menos 0.80 (preferiblemente en menos 0.85, más preferiblemente al menos 0.90, especialmente al menos 0.92, más especialmente al menos 0.95), una fracción de manuronato (F^m ) de no más de 0.20 (preferiblemente no más de 0.15, más preferiblemente no más de 0.10, especialmente no más de 0.08, más especialmente no más de 0.05), y que tiene al menos 95 % en moles con un grado de polimerización inferior a 20 (preferiblemente inferior a 17, más preferiblemente inferior a 14).

Otros oligómeros de alginato adecuados tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 7 a 15 (preferiblemente de 8 a 12), una fracción de guluronato (F^g ) de al menos 0.92 (preferiblemente al menos 0.95), una fracción de manuronato (F^m ) de no más de 0.08 (preferiblemente no más de 0.05) y que tenga al menos un 95 % en moles con un grado de polimerización inferior a 17 (preferiblemente inferior a 14).

Otros oligómeros de alginato adecuados tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 5 a 18, una fracción de guluronato (F^g ) de al menos 0.80, una fracción de manuronato (F^m ) de no más de 0.20, y que tienen al menos un 95 % mol con un grado de polimerización inferior a 20.

Otros oligómeros de alginato adecuados tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 7 a 15, una fracción de guluronato (F^g ) de al menos 0.85, una fracción de manuronato (F^m ) de no más de 0.15, y que tiene al menos 95 % mol con un grado de polimerización inferior a 17.

Otros oligómeros de alginato adecuados tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 7 a 15, una fracción de guluronato (F^g ) de al menos 0.92, una fracción de manuronato (F^m ) de no más de 0.08, y que tienen al menos 95 % mol con un grado de polimerización inferior a 17.

Los oligómeros de alginato adecuados adicionales tienen un grado de polimerización promedio numérico en el rango de 5 a 20, una fracción de guluronato (F^g ) de al menos 0.85 y una fracción de manuronato (F^m ) de no más de 0.15.

Otros oligómeros de alginato adecuados tienen un grado de polimerización promedio en número en el rango de 5 a 20, una fracción de guluronato (F^g ) de 0.9 a 0.95 y una fracción de manuronato (F^m ) de 0.05 a 0.1, que puede expresarse como un oligómero de alginato que tiene 90-95 % de residuos G y un peso molecular promedio de 2600 Da. Otros oligómeros de alginato adecuados tienen un grado de polimerización promedio en número de aproximadamente 13 (por ejemplo, 12, 13 o 14), una fracción de guluronato (F^g ) de al menos aproximadamente 0.80, 0.85, 0.87, 0.88, 0.90 o 0.93 (por ejemplo, 0.92, 0.93 o 0.94). y una fracción de manuronato correspondiente (F^m ) de no más de aproximadamente 0.20, 0.15, 0.13, 0.12, 0.10 o 0.07 (por ejemplo, 0.08, 0.07 o 0.06).

Otros oligómeros de alginato adecuados tienen un grado de polimerización promedio en número de aproximadamente 21 (por ejemplo, 20, 21 o 22), una fracción de guluronato (F^g ) de al menos aproximadamente 0.80 (por ejemplo, 0.85, 0.87, 0.88, 0.90, 0.92, 0.94 o 0.95) y una fracción de manuronato correspondiente (F^m ) de no más de aproximadamente 0.20 (por ejemplo, 0.15, 0.13, 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.05).

Otros oligómeros de alginato adecuados tienen un grado de polimerización promedio en número de aproximadamente 6 (por ejemplo, 5, 6 o 7), una fracción de guluronato (F^g ) de al menos aproximadamente 0.80 (por ejemplo, 0.85, 0.87, 0.88, 0.90, 0.92, 0.94 o 0.95) y una fracción de manuronato correspondiente (F^m ) de no más de aproximadamente 0.20 (por ejemplo, 0.15, 0.13, 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.05).

Por lo tanto, se verá que una clase particular de oligómeros de alginato favorecidos para su uso de acuerdo con la presente invención son los oligómeros de alginato definidos como los llamados oligómeros de “alto G” o “bloque G”, es decir, que tienen un alto contenido de residuos G o bloques G (por ejemplo, en los que al menos el 70 % de los residuos de monómero son G, preferiblemente dispuestos en bloques G). Sin embargo, también se pueden usar otros tipos de oligómeros de alginato, incluidos en particular oligómeros de “alto M” o “bloque M” u oligómeros de bloque MG, como se describe más adelante. Por consiguiente, son los oligómeros de alginato con altas proporciones de un solo tipo de monómero, y estando presentes dichos monómeros de este tipo predominantemente en secuencias contiguas de ese tipo de monómero, los que representan oligómeros particularmente preferidos, por ejemplo, oligómeros en los que al menos el 70 % de los residuos de monómero en el oligómero son residuos G enlazados 1-4 a otro residuo G, o más preferiblemente al menos el 75 %, y lo más preferiblemente al menos 80, 85, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % de los residuos de monómeros del oligómero son residuos G unidos 1-4 a otro residuo G. Este enlace 1-4 de dos residuos G se puede expresar alternativamente como una unidad gulurónica unida a una unidad gulurónica adyacente.

En una realización adicional, al menos, o más particularmente más del 50 % de los residuos de monómero del oligómero de alginato pueden ser residuos M (es decir, manuronato o ácido manurónico). En otras palabras, el oligómero de alginato contendrá al menos o alternativamente más del 50 % de residuos de manuronato (o ácido manurónico). Por lo tanto, las realizaciones específicas incluyen oligómeros de alginato con (por ejemplo, que contienen) del 50 al 70 % de residuos de M (manuronato) o por ejemplo, 70 a 100 % de residuos de M (manuronato). Otras realizaciones específicas también incluyen oligómeros que contienen del 71 al 85 % de residuos M o del 85 al 100 % de residuos M. Por lo tanto, un oligómero de alginato representativo para usar de acuerdo con esta realización de la presente invención contendrá más del 70 % de residuos M (es decir, más del 70 % de los residuos de monómero del oligómero de alginato serán residuos M).

En otras realizaciones, al menos el 50 % o el 60 %, más particularmente al menos el 70 % o el 75 %, incluso más particularmente al menos el 80, 85, 90, 95 o 99 % de los residuos de monómero son manuronato. En una realización, el oligómero de alginato puede ser un oligomanuronato (es decir, un homooligómero de M o 100 % M).

En otra realización, los alginatos de uso en la invención descritos anteriormente tienen una estructura primaria en la que la mayoría de los residuos M están en los denominados bloques M. En esta realización, preferiblemente al menos el 50 %, más preferiblemente al menos el 70 o 75 % y lo más preferiblemente al menos el 80, 85, 90 o 95 % de los residuos M están en bloques M. Un bloque M es una secuencia contigua de al menos dos residuos M, preferiblemente al menos 3 residuos M contiguos, más preferiblemente al menos 4 o 5 residuos M contiguos, lo más preferiblemente al menos 7 residuos M contiguos.

En particular, al menos el 90 % de los residuos M están enlazados 1-4 a otro residuo M. Más particularmente, al menos el 95 %, más preferiblemente al menos el 98 % y lo más preferiblemente al menos el 99 % de los residuos M del alginato están enlazados 1-4 a otro residuo M.

Otros oligómeros preferidos son oligómeros de alginato en los que al menos el 70 % de los restos de monómero en el oligómero son residuos M enlazados 1-4 a otro residuo M, o más preferentemente al menos el 75 %, y lo más preferentemente al menos 80, 85, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % de los residuos de monómeros del oligómero son residuos M unidos 1-4 a otro residuo M. Este enlace 1-4 de dos residuos M puede expresarse alternativamente como una unidad manurónica unida a una unidad manurónica adyacente.

En otra realización más, los oligómeros de alginato de uso en la invención comprenden una secuencia de residuos M y G alternos. Una secuencia de al menos tres, preferiblemente al menos cuatro, residuos M y G alternos representa un bloque MG. Preferiblemente, los oligómeros de alginato de la invención comprenden un bloque MG. Expresado más específicamente, un bloque MG es una secuencia de al menos tres residuos contiguos que consta de residuos G y M y en la que cada residuo G no terminal (interno) en la secuencia contigua está unido 1-4 y 4-1 a un residuo M. y cada residuo M no terminal (interno) en la secuencia contigua está unido 1-4 y 4-1 a un residuo G. Preferiblemente, el bloque MG tiene al menos 5 o 6 residuos contiguos, más preferiblemente al menos 7 u 8 residuos contiguos.

En otra realización, el uronato minoritario en el oligómero de alginato (es decir, manuronato o guluronato) se encuentra predominantemente en bloques MG. En esta realización, preferiblemente al menos el 50 %, más preferiblemente al menos el 70 o 75 % y lo más preferiblemente al menos el 80, 85, 90 o 95 % de los monómeros de uronato minoritarios en el oligómero de alginato del bloque MG están presentes en los bloques MG. En otra realización, el oligómero de alginato se dispone de manera que al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 %, por ejemplo, el 100 % de los residuos G y M en el oligómero están dispuestos en bloques MG.

Aunque en su forma más amplia, la invención se extiende a realizaciones en las que al menos el 1 % pero menos del 100 % de los residuos de monómero del oligómero son residuos G (es decir, guluronato o ácido gulurónico), más particularmente, y como se define más adelante, al menos el 30 % de los residuos de monómero son residuos G. Por lo tanto, en su forma más amplia, el bloque MG que contiene oligómero de alginato puede contener al menos un 1 %, pero menos del 100 %, de residuos de Guluronato (o ácido gulurónico), pero en general el bloque MG que contiene oligómero de alginato contendrá al menos un 30 % (o al menos 35, 40 o 45 % o 50 % de G) pero menos de 100 % de G. Las realizaciones específicas incluyen bloques MG que contienen oligómeros de alginato con (por ejemplo, que contienen) 1 a 30 % de residuos de G (guluronato), 30 a 70 % de G (guluronato) residuos o 70 a 99 % de residuos de G (guluronato). Por lo tanto, un bloque MG representativo que contiene oligómero de alginato para usar de acuerdo con la presente invención puede contener más del 30 %, pero menos del 70 %, de residuos G (es decir, más del 30 %, pero menos del 70 %, de los residuos monoméricos del oligómero de alginato de bloque MG será residuos G).

Preferiblemente más del 30 %, más particularmente más del 35 % o 40 %, incluso más particularmente más del 45, 50, 55, 60 o 65 %, pero en cada caso menos del 70 %, de los residuos de monómeros del bloque MG que contiene oligómero de alginato es guluronato. Alternativamente, menos del 70 %, más preferiblemente menos del 65 % o 60 %, incluso más preferiblemente menos del 55, 50, 45, 40 o 35 %, pero en cada caso más del 30 % de los residuos de monómero del bloque MG que contiene oligómero de alginato son guluronato. Puede elegirse cualquier rango formado por cualquier combinación de estos valores. Por lo tanto, por ejemplo, el bloque MG que contiene oligómero de alginato puede tener, por ejemplo, entre 35 % y 65 %, 40 % y 60 % o 45 % y 55 % de residuos de G.

En otra realización, el bloque MG que contiene oligómero de alginato puede tener cantidades aproximadamente iguales de residuos G y M (por ejemplo, proporciones entre 65 % G/35 % M y 35 % G/65 % M, por ejemplo 60 % G/40 % M y 40 % G/60 % M, 55 % G/45 % M y 45 % G/55 % M, 53 % G/47 % M y 47 % G/53 % M, 51 % G/49 % M y 49 % G/51 % M; por ejemplo, aproximadamente 50 % G y aproximadamente 50 % M) y estos residuos están dispuestos predominantemente, preferiblemente en su totalidad o tan completamente como sea posible, en un patrón de MG alternante (por ejemplo, al menos 50 % o al menos 60, 70, 80, 85, 90 o 95 % o 100 % de los residuos M y G están en una secuencia MG alterna).

En ciertas realizaciones, los residuos de ácido urónico terminales de los oligómeros de uso en la invención no tienen un doble enlace, especialmente un doble enlace situado entre el átomo C⁴ y C⁵. Dichos oligómeros pueden describirse como que tienen residuos de ácido urónico terminal saturado. El experto en la materia podría preparar oligómeros con residuos de ácido urónico terminal saturado sin una carga indebida. Esto puede ser mediante el uso de técnicas de producción que producen tales oligómeros, o mediante la conversión (saturación) de oligómeros producidos por procesos que producen oligómeros con residuos de ácido urónico terminal insaturado.

El oligómero de alginato normalmente llevará una carga y, por lo tanto, los contraiones para el oligómero de alginato pueden ser cualquier ion fisiológicamente tolerable, especialmente los que se usan comúnmente para fármacos cargados, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, cloruro, mesilato, meglumina, etc. Iones que promueven la gelificación del alginato, por ejemplo, También se pueden usar iones metálicos del grupo 2.

Mientras que el oligómero de alginato puede ser un material sintético generado a partir de la polimerización de números apropiados de residuos de Guluronato y manuronato, los oligómeros de alginato de uso en la invención pueden obtenerse, producirse o derivarse convenientemente de fuentes naturales como las mencionadas anteriormente, a saber, materiales de origen de alginato natural.

La escisión de polisacárido a oligosacárido para producir el oligómero de alginato utilizable de acuerdo con la presente invención se puede realizar usando técnicas convencionales de lisis de polisacárido tales como digestión enzimática e hidrólisis ácida. En una realización preferida, se usa hidrólisis ácida para preparar los oligómeros de alginato que se usan en la invención. En otras realizaciones, la digestión enzimática se usa con una etapa o pasos de procesamiento adicionales para saturar los ácidos urónicos terminales en los oligómeros.

A continuación, los oligómeros pueden separarse de los productos de degradación de los polisacáridos mediante cromatografía utilizando una resina de intercambio iónico o mediante precipitación fraccionada o solubilización o filtración. Los documentos US 6,121,441 y WO 2008/125828 describen un proceso adecuado para preparar los oligómeros de alginato de uso en la invención. Se puede encontrar más información y discusión, por ejemplo, en “Handbooks of Hydrocolloids”, Ed. Phillips y Williams, CRC, Boca Ratón, Florida, EE. UU., 2000.

Los oligómeros de alginato también pueden modificarse químicamente, incluida, entre otras, la modificación para agregar grupos cargados (tales como glucanos carboxilados o carboximetilados) y oligómeros de alginato modificados para alterar la flexibilidad (por ejemplo, mediante oxidación con peryodato).

Los oligómeros de alginato (por ejemplo, ácidos oligogulurónicos) adecuados para su uso de acuerdo con la invención se pueden producir convenientemente mediante hidrólisis ácida de ácido algínico a partir de, entre otros, Laminaria hyperbora y Lessonia nigrescens, disolución a pH neutro, adición de ácido mineral reducir el pH a 3.4 para precipitar el oligómero de alginato (ácido oligogulurónico), lavar con ácido débil, resuspender a pH neutro y liofilizar.

Los alginatos para la producción de oligómeros de alginato de uso en la invención también se pueden obtener directamente de fuentes bacterianas adecuadas, por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa o Azotobacter vinelandii.

En realizaciones en las que se requieren oligómeros de alginato que tienen estructuras primarias en las que la mayoría de los residuos G están dispuestos en bloques G en lugar de como residuos individuales, se espera que las fuentes de algas sean las más adecuadas debido al hecho de que los alginatos producidos en estos organismos tienden a tener estas estructuras. Las fuentes bacterianas pueden ser más adecuadas para obtener oligómeros de alginato de diferentes estructuras.

El aparato molecular involucrado en la biosíntesis de alginato en Pseudomonas fluorescens y Azotobacter vinelandii ha sido clonado y caracterizado (WO 94/09124; Ertesvág, H., et al, Metabolic Engineering, 1999, Vol 1, 262-269; WO 2004/ 011628, Gimmestad, M., et al (supra), Remminghorst y Rehm, Biotechnology Letters, 2006, Vol 28, 1701-1712, Gimmestad, M. et al, Journal of Bacteriology, 2006, Vol 188(15), 5551- 5560) y los alginatos de estructuras primarias adaptadas se pueden obtener fácilmente mediante la manipulación de estos sistemas.

El contenido de G de los alginatos (por ejemplo, un material de origen de algas) se puede aumentar mediante epimerización, por ejemplo, con manuronato C-5 epimerasas de A. vinelandii u otras enzimas epimerasas. Así, por ejemplo, la epimerización in vitro se puede llevar a cabo con epimerasas aisladas de Pseudomonas o Azotobacter, por ejemplo, AlgG de Pseudomonas fluorescens o Azotobacter vinelandii o las enzimas AlgE (AlgE1 a AlgE7) de Azotobacter vinelandii. También se contempla específicamente el uso de epimerasas de otros organismos que tienen la capacidad de producir alginato, particularmente algas. La epimerización in vitro de alginatos bajos en G con epimerasas AlgE de Azotobacter vinelandii se describe en detalle en Ertesvág et al (supra) y Strugala et al (Guiris and Stabilizers for the Food Industry, 2004, 12, The Royal Society of Chemistry, 84 - 94).

Para obtener alginatos u oligómeros de alginato que contienen bloque G, se prefiere la epimerización con una o más epimerasas AlgE de Azotobacter vinelandii distintas de AlgE4 ya que estas enzimas son capaces de producir estructuras de bloque G. Por otro lado, la epimerasa AlgE4 se puede utilizar para crear alginatos u oligómeros de alginato con tramos alternos de secuencia M/G o estructuras primarias que contienen un único residuo G, ya que se ha descubierto que esta enzima parece epimerizar preferentemente residuos M individuales para producir residuos únicos. Residuos G vinculados a residuos M en lugar de producir bloques G. Se pueden obtener estructuras primarias particulares usando diferentes combinaciones de estas enzimas.

Las versiones mutadas de estas enzimas u homólogos de otros organismos también se contemplan específicamente a partir de su uso. El documento WO 94/09124 describe enzimas manuronano C-5 epimerasa recombinantes o modificadas (enzimas AlgE) codificadas por ejemplo por secuencias de epimerasa en las que las secuencias de ADN que codifican los diferentes dominios o módulos de las epimerasas se han barajado o delecionado y recombinado. Alternativamente, se pueden usar mutantes de enzimas epimerasa de origen natural (AlgG o AlgE), obtenidos por ejemplo mediante mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio de los genes AlgG o AlgE.

Un enfoque diferente es crear organismos de Pseudomonas y Azotobacter que estén mutados en algunos o todos sus genes de epimerasa de tal manera que esos mutantes produzcan alginatos de la estructura requerida para la producción posterior de oligómeros de alginato, o incluso oligómeros de alginato de estructura y tamaño requeridos. (o peso molecular). La generación de una serie de organismos Pseudomonas fluorescens con genes AlgG mutados se describe en detalle en el documento WO 2004/011628 y Gimmestad, M., et al, 2003 (supra). La generación de una serie de organismos Azotobacter vinelandii con genes AlgE mutados se describe en Gimmestad, M., et al, 2006 (supra).

Un enfoque adicional es eliminar o inactivar los genes de epimerasa endógenos de un organismo Azotobacter o Pseudomonas y luego introducir uno o más genes de epimerasa exógenos, que pueden o no estar mutados (es decir, pueden ser de tipo salvaje o modificados) y cuya expresión puede controlarse, por ejemplo, mediante el uso de “promotores controlables” inducibles u otros. Mediante la selección de combinaciones apropiadas de genes, se pueden producir alginatos de estructura primaria predeterminada.

Un enfoque adicional sería introducir parte o toda la maquinaria de biosíntesis de alginato de Pseudomonas y/o Azotobacter en un organismo que no produce alginato (por ejemplo, E. coli) e inducir la producción de alginato a partir de estos organismos modificados genéticamente.

Cuando se usan estos sistemas basados en cultivo, la estructura primaria del alginato o de los productos de oligómero de alginato puede verse influenciada por las condiciones de cultivo. Está dentro de las capacidades del experto ajustar parámetros de cultivo tales como temperatura, osmolaridad, niveles/fuentes de nutrientes y parámetros atmosféricos para manipular la estructura primaria de los alginatos producidos por un organismo particular.

Las referencias a “residuos G/G” y “residuos M/M” o a ácido gulurónico o ácido manurónico, o guluronato o manuronato deben leerse indistintamente como referencias a ácido gulurónico/guluronato y ácido manurónico/manuronato (específicamente ácido a-L-gulurónico/guluronato y ácido p-D-manurónico/manuronato), y además incluyen derivados de los mismos en los que una o más cadenas laterales disponibles o grupos han sido modificados sin resultar en una capacidad para reducir la toxicidad del huésped de dichos antibióticos sin reduciendo significativamente su eficacia antibacteriana, y opcionalmente también una capacidad para prolongar los efectos antibacterianos de los antibióticos, y opcionalmente una capacidad para mantener el perfil PK/PD temprano de dichos antibióticos, que es sustancialmente inferior al del oligómero no modificado. Los grupos modificadores de sacáridos comunes incluirían grupos acetilo, sulfato, amino, desoxi, alcohol, aldehído, cetona, éster y anhidro. Los oligómeros de alginato también se pueden modificar químicamente para agregar grupos cargados (como glucanos carboxilados o carboximetilados) y para alterar la flexibilidad (por ejemplo, mediante oxidación con peryodato). El experto será consciente de otras modificaciones químicas adicionales que se pueden realizar en las subunidades de monosacárido de los oligosacáridos y que se pueden aplicar a los oligómeros de alginato de uso en la invención.

El enlace covalente directo entre el oligómero de alginato y el antibiótico de clase polimixina es un enlace covalente formado por un átomo del oligómero de alginato y un átomo del antibiótico de clase polimixina. Los átomos que contribuyen al enlace pueden ser juntos o independientemente carbono, oxígeno, azufre, nitrógeno y/o fósforo. El enlace puede ser simple, doble o triple. En ciertas realizaciones, el enlace es parte de un grupo funcional orgánico. El experto en la materia estaría completamente familiarizado con las opciones disponibles para grupos funcionales orgánicos adecuados que podrían actuar como enlazadores entre el oligómero de alginato y los antibióticos de la clase de las polimixinas. Los ejemplos no limitantes de los mismos pueden incluir éster, éster de carbonato, ortoéster, cetona, cetal, hemicetal, ceteno, éter, acetal, hemiacteal, peroxi, metilendioxi, carbamato, amida, amina, óxido de amina, ácido hidroxámico, imina, imida, imidato, azida, azo, oxima, carbodiimida, carbazona, hidrozona, sulfuro, disulfuro, sulfinilo, sulfonilo, carbonotioilo, tioamida, tioéster, tioéter, tiacetona, tioketal, éster sulfonato, ditiocarbamato, semicarbazona, fosfina o grupos funcionales fosfodiéster. Como se muestra en los Ejemplos, la formación de enlaces amida y éster puede ser conveniente y ventajosa.

El enlazador molecular covalente puede ser cualquier molécula, típicamente una molécula orgánica, o parte de la misma, que tiene una estructura formada por átomos unidos covalentemente que es capaz de unirse covalentemente con un oligómero de alginato y un antibiótico de clase polimixina. Dentro del conjugado habrá una serie continua de átomos unidos covalentemente desde el oligómero de alginato hasta el antibiótico de clase polimixina a través del enlazador molecular. En realizaciones preferidas, al menos uno de los enlaces covalentes de dicha serie es como se define anteriormente. Sin embargo, el enlazador molecular puede comprender además compuestos no covalentes, por ejemplo, enlaces iónicos, en partes de la molécula que no contribuyen al enlace covalente entre el antibiótico de clase polimixina y el oligómero de alginato.

El enlazador molecular covalente puede ser lineal, circular o ramificado. En determinadas realizaciones, el enlazador molecular tendrá un peso molecular igual o inferior a 1500 Dalton, por ejemplo, igual o inferior a 1250, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 o 100 Daltons.

En ciertas realizaciones, al menos un enlace covalente directo entre el oligómero de alginato y el enlazador molecular covalente es como se define anteriormente. En determinadas realizaciones, al menos un enlace covalente directo entre el antibiótico de la clase de las polimixinas y el enlazador molecular covalente es como se definió anteriormente. Cada enlace puede ser igual o diferente. La molécula de enlace covalente puede comprender al menos un enlace covalente como se define anteriormente, preferiblemente en la parte de esa molécula que contribuye a la serie continua de átomos unidos covalentemente desde el oligómero de alginato hasta el antibiótico de clase polimixina a través del conector molecular.

El enlazador molecular covalente puede ser o comprender un aminoácido o un péptido, por ejemplo, de igual o menos de 15 residuos de aminoácidos, por ejemplo, de igual o menos de 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3 o 2 residuos de aminoácidos. El aminoácido puede ser y el péptido puede comprender cualquiera de los aminoácidos descritos anteriormente. Los ejemplos específicos de conectores peptídicos que pueden usarse incluyen, entre otros, péptidos de residuos Gly y/o Ser (por ejemplo, (Gly)^2-8, (Ser)^2-8, (G^g G^g S)^1-3); (^eA^a AK)^1-3; A(EAAAK)^1-3 A; Leu-Glu; (Xaa-Pro)^1-6 (por ejemplo, (Glu-Pro)^1-6, (Lys-Pro)^1-6, (Ala-Pro)^1-6; VSQTSKLTR^AETVFPDV (escisión sensible al Factor XIa/Factor VIIa); PLG^LWA (escisión sensible a la metaloproteasa-1 de la matriz); RVL^AEA (escisión sensible a la proteasa del VIH-1; EDVVCC^SMSY (escisión sensible a la proteasa NS3; GGIEGR^GS (escisión sensible al factor Xa); TRHRQPR^GWE (escisión sensible a la furina), AGNRVRR^SVG (escisión sensible a furina), GFLG| (escisión sensible a catepsina B).

El enlazador molecular covalente puede ser o comprender un monosacárido o un oligosacárido distinto del guluronato o el manuronato o un polímero formado a partir del mismo, por ejemplo, un sacárido de 12 residuos de aminoácidos o menos, por ejemplo, igual o inferior a 10, 8, 6, 5, 4, 3 o 2 residuos de aminoácidos. Por lo tanto, el enlazador molecular covalente puede ser un monosacárido, disacárido o trisacárido o derivados de azúcar de los mismos tales como ácidos aldónico y urónico, desoxi o amino azúcares, azúcares sulfatados y alcoholes de azúcar. El monosacárido o uno o más de los residuos de monosacárido del disacárido o trisacárido puede ser una triosa, una tetrosa, una pentosa, una hexosa, una heptosa, una octosa, una nonosa o una decosa en forma de piranosa o furanosa y/o L- o forma D en su caso y/o azúcares derivados de los mismos. Se prefieren los sacáridos/residuos de pentosa o hexosa, por ejemplo, manosa (por ejemplo, D-manosa), galactosa (por ejemplo, D-galactosa), glucosa (por ejemplo, D-glucosa), fructosa, fucosa (por ejemplo, L-fucosa), N-acetil-glucosamina, N-acetilgalactosamina, ramnosa, galactosamina, glucosamina (por ejemplo, D-glucosamina), ácido galacturónico, ácido glucurónico, ácido N-acetilneuramínico, metil D-manopiranósido (manósido), a-metil-glucósido, galactósido, ribosa, xilosa, arabinosa, sacarato, manitol, sorbitol, inositol, glicerol y derivados de estos monómeros. El disacárido puede ser un ejemplo de acarviosina, alolactosa, celobiosa, quitobiosa, galactosa-alfa-1,3-galactosa, dentiobiosa, isomalt, isomaltosa, isomaltulosa, kojibiosa, lactitol, ácido lactobiónico, lactosa, lactulosa, laminaribiosa, maltitol, maltosa, manobiosa., melibiosa, melibulosa, neohesperidosa, nigerosa, robinosa, rutinosa, sambubiosa, soforosa, sucralfato, sucralosa, sacarosa, isobutirato acetato de sacarosa, octaacetato de sacarosa, trehalosa, truranosa, xilobiosa o derivados de estos disacáridos.

El enlazador molecular covalente puede ser o comprender un nucleótido o un oligonucleótido, es decir, un ácido nucleico, por ejemplo, un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido.

El enlazador también puede ser o comprender un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido (típicamente C^2-8) o derivado del mismo tal como ácido aminohexanoico o uno de una gama de enlazadores PEG comercialmente disponibles (polietilenglicol).

Otros ejemplos de moléculas enlazadoras covalentes adecuadas incluyen, entre otros, acetilo, succinilo, aconitilo (cis o trans), glutarilo, metilsuccinilo, trimetilil cisteamina, penicilamina, N-(2-mercaptopropionil)glicina, ácido 2-mercaptopropiónico, homocisteína, ácido 3-mercaptopropiónico y grupos desamino-penicilamina.

En ciertas realizaciones, la molécula de enlace covalente puede ser una pluralidad de las moléculas y/o grupos descritos anteriormente.

En determinadas realizaciones, el enlace covalente directo o la molécula de enlace covalente (más específicamente, un enlace covalente dentro de la molécula de enlace, un enlace covalente entre la molécula de enlace, el oligómero de alginato y/o un enlace covalente entre la molécula de enlace y el antibiótico de clase polimixina) se selecciona por su capacidad para ser lisado en condiciones representativas, o ventajosamente esencialmente únicas para, un sitio o ubicación objetivo dentro de un sujeto, por ejemplo, condiciones representativas de una infección bacteriana, el tracto respiratorio (especialmente el tracto respiratorio inferior incluyendo los pulmones, más particularmente los pulmones de un paciente con fibrosis quística) o heridas (en particular heridas crónicas). De esta forma, la administración del antibiótico de clase polimixina puede hacerse más selectiva para el sitio objetivo.

En realizaciones específicas, se puede seleccionar un enlace covalente, un grupo funcional que contiene dicho enlace covalente o molécula de enlace que es sensible a (lábil a, se degrada a, se lisa a) un pH que es inferior al pH fisiológico normal (pH 7.2), es decir, pH ácido, por ejemplo, un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4 o 3.5. Los sitios o ubicaciones de inflamación, especialmente la inflamación causada por una infección, suelen tener un pH en estos rangos. Los grupos funcionales, incluidos los ésteres, el cis-aconitilo, los disulfuros y las hidrozonas, pueden ser sensibles a pH más bajos, es decir, pueden describirse como lábiles a los ácidos.

En realizaciones específicas, se puede seleccionar un enlace covalente, un grupo funcional o una molécula de enlace que sea sensible a especies reactivas de oxígeno. Los sitios o ubicaciones de inflamación, especialmente la inflamación causada por una infección, típicamente tienen altos niveles de especies reactivas de oxígeno. Los grupos funcionales, incluidos los tiocetales y los tioéteres, pueden ser sensibles a las especies reactivas del oxígeno.

En realizaciones específicas adicionales, se puede seleccionar un enlace covalente, un grupo funcional o una molécula de enlace que se lisa mediante enzimas producidas o secretadas solo en el sitio objetivo o sobreproducidas o secretadas en exceso en el sitio objetivo. Esto puede incluir enzimas tales como glicosidasas, nucleasas y peptidasas, en particular aquellas secretadas por bacterias infectantes y aquellas secretadas por células inflamatorias del huésped, por ejemplo, lisozima, alginato liasa, DNasel, endonucleasas de restricción, elastasa de neutrófilos, catepsinas, fosfolipasas y p-lactamasas. Sin embargo, puede ser ventajoso elegir un enlace covalente, un grupo funcional o una molécula de enlace que no sea lisada por enzimas capaces de degradar el oligómero de alginato o el antibiótico de clase de polimixina y, como tal, se producirá la separación del oligómero de alginato del antibiótico de clase de polimixina por separado a la degradación del oligómero de alginato o antibiótico de clase polimixina.

En otras realizaciones, el enlace covalente directo o la molécula de enlace covalente se puede seleccionar por su estabilidad en condiciones representativas, o ventajosamente esencialmente únicas, de un sitio o ubicación objetivo dentro de un sujeto, por ejemplo, la ubicación descrita anteriormente o ubicaciones o sitios que el conjugado puede encontrar en el camino hacia esas ubicaciones y sitios después de la administración y/o que el conjugado puede encontrar durante su distribución corporal. Aquí pueden ser adecuados, por ejemplo, un enlace amida, un enlace tioéter o un enlazador peptídico Gly-Gly.

En realizaciones específicas adicionales, se puede seleccionar un enlace covalente, un grupo funcional o una molécula de enlace que da como resultado un conjugado oligomérico de polimixina-alginato que tiene un perfil de PK/PD temprano que es similar, preferiblemente sustancialmente o esencialmente el mismo que, un perfil PK/PD temprano del antibiótico de clase polimixina. De acuerdo con la invención, el modelo PK/PD puede ser un modelo de dos compartimentos de difusión de membrana biológica, por ejemplo, el descrito en Azzopardi, supra, y/o el Ejemplo 4, y el perfil se determina dentro de 12, por ejemplo, 10, 8, 6 o

4 horas desde la administración del principio activo en estudio. Un enlace éster puede ser adecuado aquí, por ejemplo.

En realizaciones preferidas, el conjugado oligomérico de polimixina-alginato consta de al menos un oligómero de alginato unido covalentemente a un antibiótico de clase polimixina a través de un enlace amida formado por un grupo carboxilo en el alginato y un grupo amina en la polimixina. Preferiblemente, el antibiótico de la clase de las polimixinas es una colistina (por ejemplo, polimixina E1 o E2) o una polimixina B (por ejemplo, polimixina B1, B1-I o B2). El oligómero de alginato contendrá preferiblemente de 2 a 100 residuos de monómero. El oligómero de alginato también puede tener al menos un 70 % de residuos G.

En realizaciones preferidas, el conjugado oligomérico de polimixina-alginato consta de al menos un oligómero de alginato unido covalentemente a un antibiótico de clase polimixina a través de un enlace éster formado por un grupo carboxilo en el alginato y un grupo hidroxilo en la polimixina. Preferiblemente, el antibiótico de la clase de las polimixinas es una colistina (por ejemplo, polimixina E1 o E2) o una polimixina B (por ejemplo, polimixina B1, B1-I o B2). El oligómero de alginato contendrá preferiblemente de 2 a 100 residuos de monómero. El oligómero de alginato también puede tener al menos un 70 % de residuos G.

Se contemplan arreglos multivalentes en los que más de un oligómero de alginato se enlaza covalentemente al antibiótico de clase polimixina. Los oligómeros de alginato pueden ser iguales o diferentes y pueden enlazarse al antibiótico de la clase de las polimixinas a través del mismo tipo de enlace covalente o enlazador molecular covalente. En otras disposiciones, un oligómero de alginato se puede unir covalentemente a una pluralidad de moléculas de polimixina de la manera descrita en este documento. Las moléculas de polimixina pueden ser iguales o diferentes y pueden o no estar enlazadas covalentemente a otros oligómeros de alginato.

Las referencias a los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato de la invención se extienden a sus sales, solvatos o hidratos farmacéuticamente aceptables, diastereoisómeros, tautómeros, enantiómeros y metabolitos activos de los mismos. Las sales adecuadas incluyen sales de adición de ácidos de ácidos inorgánicos como los ácidos clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, carbónico, bórico, sulfámico y bromhídrico, o sales de ácidos orgánicos farmacéuticamente aceptables como el acético, propiónico, butírico, tartárico, maleico, hidroximaleico, fumérico, cítrico, láctico, mucico, glucónico, benzoico, succínico, oxálico, fenilacético, metanosulfónico, toluenosulfónico, bencenosulfónico, salicílico, sulfanílico, aspártico, glutámico, edético esteárico, palmítico, oleico, láurico, pantoténico, tánico, ascórbico, fendizoico, ácido 4-4'-metilenbis-3-hidroxi-2-naftoico, o-(p-hidroxibenzoil)benzoico, 4-4'-dihidroxitrifenilmetano-2- ácido carboxílico y ácidos valéricos. Las sales de bases incluyen, pero no se limitan a, aquellas formadas con cationes farmacéuticamente aceptables, tales como sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, amonio y alquilamonio.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para la preparación de un conjugado oligomérico de polimixinaalginato de la invención, dicho método comprende

(ia) proporcionar un oligómero de alginato, en el que dicho oligómero de alginato tiene de 2-75 residuos de monómero, y un antibiótico de clase polimixina y formar un enlace covalente directo entre dos grupos moleculares del mismo; o

(ib) proporcionar un oligómero de alginato, en el que dicho oligómero de alginato tiene 2-75 residuos de monómero, un antibiótico de clase polimixina y un enlazador molecular covalente y formar un enlace covalente directo entre dos grupos moleculares en el oligómero de alginato y la molécula de enlace y formar un enlace covalente directo entre dos grupos moleculares en el antibiótico de clase polimixina y la molécula de enlace; o

(ic) proporcionar un oligómero de alginato, en el que dicho oligómero de alginato tiene de 2-75 residuos de monómero, y un antibiótico de clase de polimixina en el que uno o ambos llevan una molécula de enlace molecular covalente unida covalentemente al mismo y uniendo covalentemente el oligómero de alginato al antibiótico de clase polimixina a través de al menos una de las moléculas conectoras; y opcionalmente

(ii) separar al menos una parte del conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la mezcla de reacción.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un método para la preparación de un conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la invención, dicho método comprende

(i) proporcionar una solución acuosa de un oligómero de alginato que tiene un grupo carboxilo disponible, en el que dicho oligómero de alginato tiene 2-75 residuos de monómero;

(ii) poner en contacto dicha solución de alginato con clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) en una cantidad y en condiciones suficientes para activar al menos un grupo carboxilo en el oligómero de alginato;

(iii) opcionalmente poner en contacto dicho oligómero de alginato activado con carboxilo con sulfo N-hidroxisuccinimida (sulfo-NHS) en una cantidad y en condiciones suficientes para formar un éster de sulfo-NHS reactivo con amina;

(iv) poner en contacto dicho oligómero de alginato activado por carboxilo de la etapa (ii) o el éster de sulfo-NHS reactivo con amina de la etapa (iii) con un antibiótico de clase polimixina que tiene un grupo amino primario disponible en una cantidad y en condiciones suficientes para formar un enlace amida entre el oligómero de alginato y el antibiótico de clase polimixina; y

(v) separar al menos una parte del conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la mezcla de reacción.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un método para la preparación de un conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la invención, dicho método comprende

(i) proporcionar una solución de un oligómero de alginato que tiene un grupo carboxilo disponible, en el que dicho oligómero de alginato tiene 2-75 residuos de monómero, preferiblemente una solución orgánica (por ejemplo, DMF y/o DMSO);

(ii) poner en contacto dicha solución de alginato con diciclohexilcarbodiimida (DCC) en una cantidad y en condiciones suficientes para formar un intermedio de O-acilisourea;

(iii) poner en contacto dicho intermedio de O-acilisourea con un antibiótico de clase polimixina que tiene un grupo hidroxilo disponible y 4-N,N-dimetilaminopiridina (DMAP) en cantidades y en condiciones suficientes para formar un enlace de éster entre el oligómero de alginato y la antibiótico de clase polimixina; y

(iv) separar al menos una parte del conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la mezcla de reacción;

en el que las etapas (ii) y (iii) pueden realizarse simultáneamente.

Como se mencionó anteriormente, los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato son una clase de entidades químicas novedosas que tienen esencialmente la misma o similar eficacia antibacteriana que los antibióticos de clase polimixina no conjugados, pero menos toxicidad para el huésped y potencialmente una mayor duración de los efectos antibacterianos. La eficacia antibacteriana puede evaluarse, por ejemplo, sobre la base de los valores de concentración inhibitoria mínima (MIC), y un conjugado oligomérico de polimixina-alginato puede considerarse que tiene una eficacia antibacteriana similar si el valor MIC (por ejemplo, calculado en función de la masa del conjugado per se, o calculado sobre la base del contenido de polimixina del conjugado) es menos de 2 veces superior en comparación con el antibiótico no conjugado. Por ejemplo, el conjugado puede tener un valor MIC que sea 1 vez mayor o menor. Además, se puede tolerar una MIC aumentada (por ejemplo, 2 veces más alta o más) y todavía puede dar como resultado un producto beneficioso o útil si el conjugado tiene una toxicidad sustancialmente reducida en comparación con el antibiótico no conjugado. También se ha encontrado que se pueden preparar ciertos conjugados oligoméricos de polimixina-alginato que, en ciertos modelos fisiológicos, por ejemplo, del sistema circulatorio, tienen un perfil PK/PD temprano que es similar a la forma no conjugada del antibiótico de clase polimixina. Esta combinación de propiedades hace que los conjugados de la invención sean ventajosos en el tratamiento (particularmente en el tratamiento sistémico) de infecciones bacterianas, especialmente Gram negativas, en comparación tanto con los antibióticos de clase polimixina per se como con las modificaciones de polimixina propuestas anteriormente en las que se han empleado entidades enmascarantes para reducir la toxicidad del huésped. En particular, se ha propuesto el uso de moléculas pequeñas de dextrina como entidades de enmascaramiento y, aunque la toxicidad para el huésped de dichos conjugados es significativamente menor, los conjugados resultantes muestran una eficacia antibiótica significativamente menor, que solo puede restaurarse parcialmente mediante la eliminación de los grupos dextrina. Además, los perfiles PK/PD tempranos de los conjugados de dextrina-polimixina no se parecen a los perfiles correspondientes de la polimixina no conjugada en modelos bicompartimentales de difusión de membrana biológica y esto puede complicar su uso clínico (Azzopardi, supra).

Por otro lado, como se muestra en los Ejemplos, los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato tienen esencialmente la misma eficacia antibiótica que los antibióticos no modificados. Otra propiedad sorprendente de los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato de la invención es la duración de sus efectos antibióticos, que pueden ser significativamente más largos que la forma no modificada del antibiótico de la clase de polimixina. Además, los Ejemplos muestran que los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato de la invención pueden ser más efectivos para combatir (por ejemplo, romper, reducir, limitar o eliminar) la biopelícula que la forma no conjugada de la misma clase de polimixina. Además, es posible diseñar conjugados oligoméricos de polimixina-alginato que, en determinados modelos fisiológicos, por ejemplo, del sistema circulatorio, tienen un perfil PK/PD temprano que es similar a la forma no conjugada del antibiótico de clase polimixina.

Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado oligomérico de polimixina-alginato como se define en el presente documento y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes, vehículos o diluyentes adecuados se describen y las composiciones farmacéuticas específicas se detallan a continuación.

La invención se refiere además al uso de los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato como se describe en el presente documento y las composiciones farmacéuticas que los comprenden en el combate de la infección bacteriana. El término “combate” como se usa en el presente documento incluye tanto la terapia como la profilaxis (es decir, el tratamiento o la prevención de una infección bacteriana).

Por lo tanto, en este aspecto, la invención proporciona los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato de la invención como se describe en este documento y las composiciones farmacéuticas que los comprenden para uso en terapia, particularmente para uso en el tratamiento o prevención de una infección bacteriana.

La invención proporciona además un conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la invención como se define aquí, para uso en el tratamiento o prevención de una infección bacteriana en un sujeto con sospecha de tener o en riesgo de una infección bacteriana.

Una cantidad “eficaz”, más particularmente una “farmacéuticamente eficaz” del conjugado oligomérico de polimixinaalginato es aquella cantidad de conjugado que proporciona un tratamiento o prevención medible de la infección bacteriana diana. En ciertas realizaciones, los efectos antibacterianos del conjugado son más prolongados (es decir, duran o persisten por más tiempo) que los de la forma no conjugada del antibiótico de la clase de la polimixina y, por lo tanto, se puede requerir menos conjugado, por ejemplo, la cantidad eficaz del conjugado es comparativamente menor que la de la forma no conjugada del antibiótico de la clase de las polimixinas.

En particular, en tales usos, la cantidad eficaz de conjugado oligomérico de polimixina-alginato provoca en el sujeto una toxicidad en el huésped manejable, preferiblemente menor o insignificante, o no apreciable o clínicamente relevante. En cualquier caso, la toxicidad del huésped se reduce en comparación con la polimixina no conjugada correspondiente.

En las realizaciones descritas anteriormente, el resultado fisiológico principal que se logrará es el contacto del sitio de infección (en particular, las bacterias que están presentes en el sitio o ubicación infectados, y que pueden incluir múltiples sitios o ubicaciones de infección en el cuerpo, incluida también una infección sistémica) y/o un sitio (por ejemplo, una superficie) en el que la infección puede ocurrir (o corre el riesgo de ocurrir) con el conjugado oligomérico de polimixina-alginato. El resultado fisiológico secundario de la administración del conjugado de la invención y su posterior contacto con el sitio de la invención es un grado reducido o limitado de toxicidad del huésped en el sujeto que se somete al tratamiento, en comparación con el antibiótico de polimixina no conjugado correspondiente, por ejemplo, manejable, preferiblemente menor o insignificante, o no se encuentra toxicidad apreciable o clínicamente relevante para el huésped.

Trabajar la inventuina puede implicar el uso de un conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la invención como se define en el presente documento para la fabricación de un medicamento para usar en el tratamiento o prevención de una infección bacteriana en un sujeto con sospecha de tener, o en riesgo de una infección bacteriana.

El término “infección bacteriana” (o “infectado por” o “infectado con” y similares) se usa ampliamente aquí para indicar que el sujeto puede comprender, contener o transportar la bacteria en cuestión, es decir, que las bacterias pueden estar simplemente presentes en o sobre el sujeto, y esto puede incluir cualquier sitio o ubicación en o sobre el cuerpo del sujeto. No es necesario que la infección del sujeto se manifieste como una enfermedad clínica (es decir, que la infección dé como resultado síntomas clínicos en el sujeto), aunque esto, por supuesto, está incluido. Un sujeto que se sospecha que está infectado o que está en riesgo de infección puede ser un sujeto que ha estado expuesto a la bacteria o a un sujeto infectado, o un sujeto que presenta signos o síntomas clínicos de infección (en el caso de una sospecha de infección), o un sujeto que es susceptible a la infección, ya sea en general (por ejemplo, debido al estado clínico del sujeto) o en particular a la bacteria en cuestión.

También de acuerdo con ciertos aspectos de la invención, puede haber una etapa anterior de identificar a un sujeto como un sujeto con, sospechoso de tener o en riesgo de una infección bacteriana, o una etapa de diagnosticar a un sujeto como un sujeto con sospecha de tener o en riesgo de una infección bacteriana. En particular, la infección bacteriana puede ser de un tipo que se sabe que se trata, o se puede tratar, en la práctica clínica habitual con un antibiótico del tipo de las polimixinas. En una realización, las bacterias se identifican o se sospecha que son bacterias que responden a (es decir, son sensibles a) un antibiótico de clase polimixina. En ciertas realizaciones, se puede determinar la sensibilidad de esa infección (o más particularmente de las bacterias dentro de la infección) a un antibiótico de clase polimixina.

Alternativamente o además de la etapa descrita anteriormente, de acuerdo con la invención puede haber una etapa siguiente en el que los indicadores clínicos del sujeto de la infección bacteriana se evalúan y preferiblemente se comparan con una evaluación correspondiente realizada antes o antes en dicho tratamiento con el fin de determinar cualquier cambio en el mismo.

El diagnóstico y seguimiento de infecciones bacterianas basado en indicadores fisiológicos fácilmente observables es completamente rutinario para los médicos. Los métodos de biología molecular y microbiológicos también se pueden usar para confirmar más los diagnósticos y proporcionar más información sobre los agentes causales, por ejemplo, información taxonómica, posibles indicios de virulencia y su sensibilidad a los antibióticos.

Alternativamente o además de las etapas anteriores y/o posteriores descritos anteriormente, de acuerdo con la invención puede haber una etapa siguiente en el que los indicadores clínicos de toxicidad de polimixina del sujeto se evalúan y preferiblemente se comparan con una evaluación correspondiente realizada antes de, o antes en dicho tratamiento con el fin de determinar cualquier cambio en el mismo. El seguimiento de la toxicidad de la polimixina en un sujeto en función de indicadores fisiológicos fácilmente observables es completamente rutinario para los médicos. Esto puede incluir la evaluación del estado general del sujeto o marcadores moleculares más específicos, por ejemplo, marcadores inflamatorios (por ejemplo, niveles de citoquinas circulantes o localizados).

La invención abarca el uso de un solo conjugado oligomérico de polimixina-alginato o una mezcla (multiplicidad/pluralidad; dos o más) de diferentes conjugados oligoméricos de polimixina-alginato. Dichas mezclas pueden comprender conjugados que portan diferentes antibióticos de la clase de las polimixinas y el mismo oligómero de alginato. Dichas mezclas pueden comprender conjugados que portan el mismo antibiótico de clase polimixina y diferentes oligómeros de alginato. Dichas mezclas pueden comprender conjugados que portan diferentes antibióticos de la clase de las polimixinas y diferentes oligómeros de alginato.

La infección bacteriana dirigida de acuerdo con la invención puede comprender bacterias de cualquier género o especie de bacterias. Los ejemplos de géneros o especies de bacterias incluyen, entre otros, Abiotrophia, Achromobacter, Acidaminococcus, Acidovorax, Acinetobacter, Actinobacillus, Actinobaculum, Actinomadura, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agrobacterium, Alcaligenes, Alloiococcus, Alteromonas, Amycolata, Amycolatopsis, Anaerobospirillum, Anaerorhabdus, Arachnia, Arcanobacterium, Arcobacter, Arthrobacter, Atopobium, Aureobacterium, Bacteroides, Balneatrix, Bartonella, Bergeyella, Bifidobacterium, Bilophila Branhamella, Borrelia, Bordetella, Brachyspira, Brevibacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Brucella, Burkholderia, Butviauxbrio, Butyri Calymmatobacterium, Campylobacter, Capnocytophaga, Cardiobacterium, Catonella, Cedecea, Cellulomonas, Centipeda, Chlamydia, Chlamydophila, Chromobacterium, Chyseobacterium, Chryseomonas, Citrobacter, Clostridium, Collinsella, Comamonas, Corynebacterium, Coxiella, Cryptobacterium, Delftia, Dermabacter, Dermatophilus, Desulfoviomonas, Dialister, Dichelobacter, Dolosicoccus, Dolosigranulum, Edwardsiella, Eggerthella, Ehrlichia, Eikenella, Empedobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Erysipelothrix, Escherichia, Eubacterium, Ewingella, Exiguobacterium, Facklamia, Filifactor, Flavimonas, Flavobacterium, Francisella, Fusobacterium, Gardnerella, Globicatella, Gemella, Gordona, Haemophilus, Hafnia, Helicobacter, Helococcus, Holdemania, Ignavigranum, Johnsonella, Kingella, Klebsiella, Kocuria, Koserella, Kurthia, Kytococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lautropia, Leclercia, Legionella, Leminorella, Leptospira, Leptotrichia, Leuconostoc, Listeria, Listonella, Megasphaera, Methylobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Mitsuokella, Mobiluncus, Moellerella, Moraxella, Morganella, Mycobacterium, Mycoplasma, Myroides, Neisseria, Nocardia, Nocardiopsis, Ochrobactrum, Oeskovia, Oligella, Orientia, Paenibacillus, Pantoea, Parachlamydia, Pasteurella, Pediococcus, Peptococcus, PeptoStreptococcus, Photobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Porphyrimonas, Prevotella, Propionibacterium, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoramibacter, Psychrobacter, Rahnella, Ralstonia, Rhodococcus, Rickettsia Rochalimaea Roseomonas, Rothia, Ruminococcus, Salmonella, Selenomonas, Serpulina, Serratia, Shewenella, Shigella, Simkania, Slackia, Sphingobacterium, Sphingomonas, Spirillum, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Stomatococcus, Streptobacillus, Streptococcus, Streptomyces, Succinivibrio, Sutterella, Suttonella, Tatumella, Tissierella, Trabulsiella, Treponema, Tropheryma, Tsakamurella, Turicella, Ureaplasma, Vagococcus, Veilloline, Weeksella, Vibrioline, Xanthomonas, Xenorhabdus, Yersinia y Yokenella; por ejemplo, bacterias Gram positivas como Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equi, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Bacillus anthracis, B. subtilis, Nocardia asteroides, Actinomyces israelii, Propionibacterium acnes, Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum y especies de Enterococcus, bacterias Gram negativas como Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Legionella pneumophila, Salmonella typhi, Brucella abortus, Coxiella burnetti, Escherichia coli, Neiserria meningitidis, Neiserria gonorrhea, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Yersinia pestis, Yersinia enterolitica, Escherichia hirae, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, Bacteroides fragilis, Fusobascterium nucleatum, Cowdria ruminantium, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Helicobacter pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi y Acinetobacter baumannii, Acinetobacter Iwoffi, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens y Klebsiella oxytoca, bacterias Gram no sensibles como Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci y micobacterias tales como M. tuberculosis, M. bovis, M. typhimurium, M. bovis cepa BCG, subcepas BCG, M. avium, M. intracellulare, M. africanum, M. kansasii, M. marinum, M. ulcerans, M. avium subespecies paratuberculosis,

Preferiblemente, la infección bacteriana dirigida de acuerdo con la invención comprende bacterias seleccionadas de los siguientes géneros: Achromobacter, Acinetobacter, Actinobacillus, Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Alteromonas, Bacteroides, Bartonella, Borrelia, Bordetella, Brucella, Burkholderia, Campylobacter, Cardiobacterium, Chlamydia, Chlamydophila, Chromobacterium, Chyseobacterium, Chryseomonas, Citrobacter, Clostridium, Comamonas, Corynebacterium, Coxiella, Cryptobacterium, Edwardsiella, Eikenella, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Kingella, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Legionella, Leptospira, Leptotrichia, Leuconostoc, Listeria, Listonella, Mobiluncus, Moraxella, Morganella, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Nocardia, Nocardiopsis, Pantoea, Parachlamydia, Pasteurella, Peptococcus, PeptoStreptococcus, Prevotella, Propionibacterium, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Ralstonia, Rickettsia, Salmonella, Shewenella, Shigella, Sphingobacterium, Sphingomonas, Stap hylococcus, Stenotrophomonas, Streptobacillus, Streptococcus, Streptomyces, Treponem y Yersinia

Por lo tanto, la invención puede usarse contra bacterias Gram positivas o Gram negativas, o incluso bacterias Gram indeterminadas. Las bacterias gramnegativas, por ejemplo, las detalladas anteriormente, son importantes. Dentro de las bacterias Gram negativas destacan las Enterobacteriaceae y las bacterias Gram negativas no fermentadoras.

Las enterobacterias incluyen, entre otras, bacterias de los géneros Alishewanella, Alterococcus, Aquamonas, Aranicola, Azotivirga, Brenneria, Budvicia, Buttiauxella, Cedecea, Citrobacter, Cronobacter, Dickeya, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Grimontella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Phlomobacter, Photorhabdus, Plesiomonas, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Raoultella, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shigella, Sodalis, Tatumella, Trabulsiella, Wigglesworthia, Xenorhabdus, Yersinia, Yokenella. Los géneros preferidos de Enterobacteriaceae incluyen Escherichia, Klebsiella, Salmonella, Shigella, Yersinia y Providencia.

Las bacterias gramnegativas no fermentadoras incluyen, entre otras, bacterias de los géneros Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas y Burkholderia, Achromobacter, Algaligenes, Bordetella, Brevundimonas, Comamonas, Elizabethkingia (anteriormente Chryseobacterium), Methylobacterium, Moraxella, Ochrobactrum, Oligella, Psychrobacter, Ralstonia, Roseomonas, Shewanella, Sphingobacterium, por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia y Burkholderia spp..

Preferiblemente, las bacterias pueden seleccionarse de los géneros Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, Escherichia, Klebsiella, Providencia, Streptococcus, Staphylococcus, por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia spp, E. coli, Klebsiella pneumoniae y Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Acinetobacter Iwoffi, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas, Pseudomonas anguillisépticas o Pseudomonas anguillisépticas plecoglossicida, Pseudomonas luteola y MRSA.

En ciertos aspectos, la infección es una infección nosocomial, una infección en el tracto respiratorio de los pacientes, por ejemplo, en pacientes que padecen fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad obstructiva congestiva de las vías respiratorias/neumonía obstructiva congestiva de las vías respiratorias (COAD/COAP), neumonía, enfisema, bronquitis o sinusitis; una infección en una herida, particularmente una herida crónica (incluidas las quemaduras), una infección relacionada con un dispositivo asociada con dispositivos médicos implantables o protésicos, por ejemplo, endocarditis de válvula protésica o una infección de una línea o un catéter o una articulación artificial o un reemplazo de tejido o un tubo endotraqueal o de traqueotomía. Ejemplos de los tipos de bacterias que comúnmente causan tales infecciones incluyen Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia spp (por ejemplo, B. cepacia), E. coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA), Clostridium difficile, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus y Enterococcus resistentes a la vancomicina y Providencia stuartii. Otras infecciones de importancia de acuerdo con la invención incluyen infecciones por Bartonella (por ejemplo, Bartonella hensela), micobacterias (por ejemplo, Complejo Mycobacterium avium (MAC), M. kansasii, M. marinum, M. ulcerans, M. xenopi), Haemophilus influenzae tipo b (Hib) o Legionella (por ejemplo, Legionella pneumophila; enfermedad del legionario), lepra (M. leprae), anaplasmosis granulocítica humana (Anaplasma phagocytophilum), brucelosis (Brucella melitensis), enfermedad meningocócica (Neisseria meningitides) y ántrax (Bacillus anthracis).

Las bacterias pueden ser resistentes a múltiples fármacos, por ejemplo, bacterias resistentes a antibióticos de al menos 3, o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 clases de antibióticos, por ejemplo, los aminoglucósidos (por ejemplo, amikacina, gentamicina, kanamicina, capreomicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina); los plactámicos (por ejemplo, los carbecefemos (por ejemplo, loracarbef); las cefalosporinas de 1a generación (por ejemplo, cefadroxilo, cefazolina, cefalexina); las cefalosporinas de 2a generación (por ejemplo, cefaclor, cefamandol, cefalexina, cefoxitina, cefprozil, cefuroxima); las cefalosporinas de 3a generación (por ejemplo, cefixima, cefdinir, cefditoren, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona); cefalosporinas de cuarta generación (por ejemplo, cefepima); las monobactámicas (por ejemplo, aztreonam)); los macrólidos (por ejemplo, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, troleandomicina); las monobactámicas (por ejemplo, aztreonam); las penicilinas (por ejemplo, amoxicilina, ampicilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, ticarcilina); los antibióticos polipeptídicos (por ejemplo, bacitracina, colistina y polimixina B, pero en ciertas realizaciones no la polimixina del conjugado oligomérico de polimixina-alginato a usar); las quinolonas (por ejemplo, ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, trovafloxacina); las sulfonamidas (por ejemplo, mafenida, sulfacetamida, sulfametizol, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprim-sulfametoxazol); las tetraciclinas (por ejemplo, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina); las glicilciclinas (por ejemplo, tigeciclina); los carbapenems (por ejemplo, imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, panipenem/betamipron, biapenem, PZ-601); y otros antibióticos, incluido el cloranfenicol; clindamicina, etambutol; fosfomicina; isoniazida; linezolida; metronidazol; nitrofurantoína; pirazinamida; quinupristina/dalfopristina; espectinomicina; fosfomicina y vancomicina.

La susceptibilidad, es decir, la sensibilidad (y, por el contrario, la resistencia y la tolerancia) a un antibiótico se puede medir de cualquier manera conveniente, por ejemplo, con pruebas de susceptibilidad a la dilución y/o pruebas de difusión por disco. Preferiblemente, la susceptibilidad de una cepa bacteriana a un antibiótico se expresa en términos de la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) de ese antibiótico para ese microorganismo (Jorgensen et al., Manual of Clinical Microbiology, 7th ed. Washington, D.C: American Society for Microbiology, 1999; 1526-43), es decir, esa concentración de antibiótico que inhibe completamente el crecimiento de esa cepa bacteriana.

El experto en la materia apreciaría que la extensión de la diferencia en tolerancia/susceptibilidad suficiente para constituir resistencia variará dependiendo del antibiótico y la cepa bacteriana bajo prueba y la prueba utilizada. Muchos organismos reguladores, por ejemplo, El Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST) estableció los llamados “puntos de corte” para antimicrobianos y microorganismos específicos que son concentraciones antimicrobianas discriminatorias utilizadas en la interpretación de los resultados de las pruebas de susceptibilidad para definir los aislamientos como susceptibles, intermedios o resistentes al agente antimicrobiano bajo prueba. El experto en la materia puede utilizar dicha información para determinar si la infección bacteriana que está siendo tratada por la invención es o no resistente al antibiótico en cuestión según estas definiciones.

Como se muestra en los ejemplos, los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato de la invención pueden ser más efectivos para combatir (por ejemplo, romper, reducir, limitar o eliminar) la biopelícula que la forma no conjugada del mismo antibiótico de clase polimixina. En ciertas realizaciones, por lo tanto, la infección diana serán bacterias en una biopelícula. Sin embargo, en otras realizaciones, la bacteria no estará en una biopelícula (por ejemplo, crecerá planctónicamente). Dicho de otra manera, la bacteria estará, o no estará, en un modo de crecimiento de biopelícula; o estará, o no estará, en un modo de crecimiento sin biopelícula.

Por “biopelícula” se entiende una comunidad de microorganismos caracterizada por un predominio de células sésiles que están unidas a un sustrato o interfaz o entre sí (también pueden estar presentes algunas células móviles) y que están incrustadas en una matriz de polímeros extracelulares (más concretamente polímeros extracelulares que han producido) caracterizados porque los microorganismos de esta colonia presentan un fenotipo alterado con respecto a la tasa de crecimiento y la transcripción de genes (por ejemplo en comparación con su “no biopelícula” o de flotación libre o planctónica contrapartes). Por “en una biopelícula” se entiende que la bacteria objetivo del método de la invención está dentro (completamente o en parte), sobre o asociada con la matriz polimérica de una biopelícula. Visto de otra manera, las bacterias que “no están en una biopelícula” son organismos que están aislados, por ejemplo, planctónico, o si en una agregación de una pluralidad de organismos, esa agregación está desorganizada y/o está desprovista de la matriz característica de una biopelícula. En cada caso, las bacterias individuales no exhiben un fenotipo alterado que se observa en sus contrapartes que habitan en biopelículas.

En determinadas realizaciones, la infección bacteriana no contiene bacterias del género Acinetobacter. En ciertas realizaciones, la infección bacteriana a tratar o prevenir de acuerdo con la invención no contiene bacterias resistentes a múltiples fármacos.

En realizaciones particulares, la invención puede proporcionar el tratamiento o la prevención de infecciones respiratorias o afecciones asociadas con las mismas (por ejemplo, fibrosis quística, neumonía, EPOC, COAD, COAP, bronquitis, sinusitis, una infección en una herida crónica (incluidas las quemaduras), una infección relacionada con un dispositivo asociada con dispositivos médicos implantables o protésicos, bacteriemia, septicemia, shock séptico o sepsis.

En una realización preferida, la infección bacteriana es una infección respiratoria en un sujeto que padece un trastorno o afección respiratoria subyacente, que incluye en particular FQ, EPOC/COAD o asma.

“Tratamiento”, cuando se usa en relación con el tratamiento de una infección bacteriana/afección médica en un sujeto de acuerdo con la invención, se usa ampliamente aquí para incluir cualquier efecto terapéutico, es decir, cualquier efecto beneficioso en relación con la infección o sobre la afección. Por lo tanto, no solo se incluye la erradicación o eliminación de la infección, o la curación del sujeto o infección, sino también una mejora en la infección o afección del sujeto. Así se incluye, por ejemplo, una mejora en cualquier síntoma o signo de la infección o afección, o en cualquier indicador clínicamente aceptado de la infección/afección (por ejemplo, una disminución en el tamaño de la herida o una aceleración del tiempo de cicatrización). Por lo tanto, el tratamiento incluye terapia tanto curativa como paliativa, por ejemplo, de una infección/afección preexistente o diagnosticada, es decir, un tratamiento reaccionario.

“Prevención” como se usa en el presente documento se refiere a cualquier efecto profiláctico o preventivo. Por tanto, incluye retrasar, limitar, reducir o prevenir la infección/afección o la aparición de la infección/afección, o uno o más síntomas o indicaciones de la misma, por ejemplo, en relación con la infección/afección o síntoma o indicación previa al tratamiento profiláctico. Por lo tanto, la profilaxis incluye explícitamente tanto la prevención absoluta de la aparición o el desarrollo de la infección/afección, o el síntoma o la indicación de la misma, como cualquier retraso en el inicio o el desarrollo de la infección/afección o el síntoma o la indicación de la misma, o la reducción o limitación del desarrollo o progresión de la infección/afección o síntoma o indicación de la misma.

El sujeto puede ser cualquier sujeto animal humano o no humano, pero más particularmente puede ser un vertebrado humano o no humano, por ejemplo, un mamífero, ave, anfibio, pez o reptil no humano. En una realización preferida, el sujeto es un sujeto mamífero. El animal puede ser un ganado o un animal doméstico o un animal de valor comercial, incluidos los animales de laboratorio o un animal en un zoológico o parque de juegos. Por lo tanto, los animales representativos incluyen perros, gatos, conejos, ratones, cobayas, hámsteres, caballos, cerdos, ovejas, cabras y vacas. Por lo tanto, se cubren los usos veterinarios de la invención. El sujeto puede ser visto como un paciente. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto no es un mamífero rumiante.

El término “en un sujeto” se usa ampliamente aquí para incluir sitios o ubicaciones dentro de un sujeto o sobre un sujeto, por ejemplo, una superficie corporal externa, y puede incluir, en particular, la infección de un dispositivo médico, por ejemplo, un dispositivo médico implantado o “residente”. El término “en un paciente” debe interpretarse de manera consistente con esto.

Por lo tanto, la ubicación de la infección puede ser una superficie en la cavidad oral (por ejemplo, dientes, encía, hendidura gingival, bolsa periodontal), el tracto reproductivo (por ejemplo, cuello uterino, útero, trompas de Falopio), el peritoneo, el oído medio, la próstata, el tracto urinario, la íntima vascular, el ojo, es decir, el tejido ocular (por ejemplo, la conjuntiva, el tejido corneal, el conducto lagrimal, la glándula lagrimal, el párpado), el tracto respiratorio, el tejido pulmonar (por ejemplo, bronquial y alveolar), las válvulas cardíacas, el tracto gastrointestinal, piel, cuero cabelludo, uñas e interior de heridas, particularmente heridas crónicas y heridas quirúrgicas, que pueden ser heridas tópicas o internas. Otras superficies incluyen el exterior de los órganos, en particular los que se someten a un trasplante, por ejemplo, corazón, pulmones, riñón, hígado, válvula cardíaca, páncreas, intestino, tejido corneal, injertos arteriales y venosos y piel.

Por lo tanto, la infección también puede estar presente en fluidos corporales (por ejemplo, sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, contenido del tracto GI, semen, esputo y otras secreciones pulmonares) y tejidos (por ejemplo, suprarrenales, hepáticos, renales, pancreáticos, pituitarios, tiroides, inmune, ovárico, testicular, próstata, endometrial, ocular, mamario, adiposo, epitelial, endotelial, neural, muscular, pulmonar, epidermis, óseo).

La infección se puede encontrar además en cualquier equipo o dispositivo médico o quirúrgico “permanente”. Esto puede incluir cualquier tipo de vía, incluidos catéteres (por ejemplo, catéteres venosos centrales y urinarios), dispositivos protésicos, por ejemplo, válvulas cardíacas, articulaciones artificiales, dientes postizos, coronas dentales, capuchones dentales e implantes de tejidos blandos (por ejemplo, implantes mamarios, glúteos y labiales). Se incluye cualquier tipo de dispositivo médico implantable (por ejemplo, stents, dispositivos intrauterinos, marcapasos, tubos de intubación (por ejemplo, tubos endotraqueales o de traqueotomía), prótesis o dispositivos protésicos, líneas o catéteres). Un dispositivo médico “permanente” puede incluir un dispositivo en el que cualquier parte del mismo está contenida dentro del cuerpo, es decir, el dispositivo puede ser total o parcialmente permanente.

La infección puede ser aguda o, alternativamente, crónica, por ejemplo, una infección que ha persistido durante al menos 5 o al menos 10 días, particularmente al menos 20 días, más particularmente al menos 30 días, más particularmente al menos 40 días.

Una infección bacteriana puede ocurrir en cualquier sujeto, pero algunos sujetos serán más susceptibles a la infección que otros. Los sujetos que son susceptibles a la infección bacteriana incluyen, pero no se limitan a, sujetos cuya barrera epitelial y/o endotelial está debilitada o comprometida, sujetos cuyas defensas contra la infección microbiana basadas en secreciones han sido anuladas, interrumpidas, debilitadas o socavadas, y sujetos que están inmunocomprometidos, inmunodeficientes o inmunodeprimidos (es decir, un sujeto en el que alguna parte del sistema inmunitario no funciona normalmente, o funciona de forma subnormal, en otras palabras, en el que cualquier parte de la respuesta inmunitaria, o una actividad inmunitaria, se reduce o altera, ya sea por enfermedad o intervención clínica u otro tratamiento, o de cualquier forma).

Los ejemplos representativos de sujetos que son susceptibles a la infección bacteriana incluyen, entre otros, sujetos con una infección preestablecida (por ejemplo, con bacterias, virus, hongos o parásitos como protozoos), especialmente sujetos con VIH, sujetos con bacteriemia, sepsis y sujetos con shock séptico; sujetos con inmunodeficiencia, por ejemplo, sujetos que se preparan para, que se someten o se recuperan de quimioterapia y/o radioterapia, sujetos de trasplante de órganos (por ejemplo, médula ósea, hígado, pulmón, corazón, válvula cardíaca, riñón, etc.) (incluidos pacientes de autoinjerto, aloinjerto y xenoinjerto); sujetos con SIDA; sujetos residentes en una institución sanitaria, por ejemplo, hospital, especialmente sujetos en cuidados intensivos o cuidados críticos (es decir, aquellas unidades relacionadas con la provisión de sistemas de soporte vital o soporte de órganos a los pacientes); sujetos con ventiladores respiratorios; sujetos que sufren de trauma; sujetos con quemaduras, sujetos con heridas agudas y/o crónicas; sujetos neonatales; sujetos de edad avanzada; sujetos con cáncer (definido ampliamente en el presente documento para incluir cualquier afección neoplásica; maligna o no maligna), especialmente aquellos con cánceres del sistema inmunitario (por ejemplo, leucemias, linfomas y otros cánceres hematológicos); sujetos que sufren de condiciones autoinmunitarias tales como artritis reumatoide, diabetes mellitus tipo I, enfermedad de Crohn, especialmente aquellos que se someten a tratamiento inmunosupresor para esas enfermedades; sujetos con secreción epitelial o endotelial reducida o anulada (por ejemplo, moco, lágrimas, saliva) y/o eliminación de secreciones (por ejemplo, sujetos con cilios que funcionan mal en el tejido mucoso y/o pacientes con mucosa hiperviscosa (por ejemplo, fumadores y sujetos con EPOC, COAD, COAP, bronquitis, fibrosis quística, enfisema, cáncer de pulmón, asma, neumonía o sinusitis)) y sujetos equipados con un dispositivo médico.

Los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato de la invención se pueden administrar al sujeto en cualquier forma conveniente o por cualquier medio conveniente para suministrar cantidades efectivas a las bacterias de la infección objetivo y/o al sitio que porta la invención o el sitio en riesgo de infección, por ejemplo, por vía parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraespinal, intramuscular, subcutánea), tópica, enteral (por ejemplo, oral, bucal, sublingual, rectal) o por inhalación (incluida la inhalación nasal). La administración puede lograr una distribución sistémica o una distribución localizada, lo que significa que el suministro se efectúa a las bacterias de la infección objetivo y/o al sitio portador de la infección o al sitio con riesgo de infección, pero esencialmente a ninguna otra ubicación en el paciente. El experto en la materia podría seleccionar un medio de administración apropiado para adaptarse a cualquier objetivo de infección y/o sitio particular que lleve la infección o sitio con riesgo de infección.

La toxicidad del huésped comparativamente baja de los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato de la invención hace que estas entidades sean adecuadas para uso sistémico en sujetos, es decir, administración sistémica para tratar una infección sistémica y administración sistémica para tratar infecciones localizadas, por ejemplo, una infección en los pulmones o una herida. Por el contrario, el uso de antibióticos de la clase de las polimixinas en general se restringe a tratamientos tópicos o al menos muy localizados debido a la toxicidad asociada de estos antibióticos en el huésped. El uso sistémico de antibióticos de tipo polimixina está restringido a los casos más graves y graves de infección potencialmente mortal por bacterias multirresistentes porque en estos escenarios los problemas causados por la toxicidad del huésped se ven superados por el riesgo inmediato para la vida del sujeto que plantea la infección. El hallazgo de que ciertos conjugados oligoméricos de polimixina-alginato, por ejemplo, aquellos con un enlazador de enlace éster pueden tener perfiles PK/PD tempranos en ciertos modelos fisiológicos, por ejemplo, aquellos que imitan el sistema circulatorio, que son similares a la forma no conjugada del antibiótico de la clase de polimixina, pueden indicar que dichos conjugados oligoméricos de polimixina-alginato son particularmente adecuados para uso sistémico.

Por lo tanto, en ciertas realizaciones de la invención, el conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la invención como se define en el presente documento se proporciona para su uso en un método para el tratamiento o prevención de una infección bacteriana en un sujeto con sospecha de tener o en riesgo de una infección bacteriana, dicho método comprende administrar sistémicamente a dicho sujeto una cantidad eficaz de un conjugado oligomérico de polimixinaalginato de la invención como se define en el presente documento. En determinadas realizaciones, la infección bacteriana es una infección bacteriana sistémica, por ejemplo, sepsis (septicemia) o una infección que involucra múltiples loci en un sujeto.

El experto será capaz de formular los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato de la invención en composiciones farmacéuticas que se adapten a estas vías de administración y distribución corporal de acuerdo con cualquiera de los métodos convencionales conocidos en la técnica y ampliamente descritos en la literatura.

Más específicamente, los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato de la invención se pueden incorporar, opcionalmente junto con otros agentes activos, con uno o más vehículos, diluyentes y/o excipientes convencionales, para producir preparaciones galénicas convencionales tales como comprimidos, píldoras, gránulos (por ejemplo, en forma libre o en cápsulas), polvos (por ejemplo, polvos inhalables, incluidos los polvos secos inhalables), pastillas para chupar, sobres, sellos, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (en forma sólida o líquida ), aerosoles (por ejemplo, aerosoles nasales), composiciones para uso en nebulizadores, ungüentos, cremas, ungüentos, cápsulas de gelatina blanda y dura, supositorios, pesarios, soluciones inyectables estériles, polvos envasados estériles y similares. Composiciones sólidas o líquidas con recubrimiento entérico, por ejemplo, comprimidos con recubrimiento entérico y gránulos con recubrimiento entérico (que pueden proporcionarse en una cápsula con recubrimiento entérico o en una cápsula sin recubrimiento entérico, es decir, en la que el recubrimiento puede ser o no un recubrimiento entérico); las composiciones inyectables estériles e inhalables estériles son de particular interés.

Ejemplos de vehículos, excipientes y diluyentes adecuados son lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, fosfato de calcio, polímeros de alginato inertes, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua jarabe, agua, agua/etanol, agua/glicol, agua/polietileno, agua salada hipertónica, glicol, propilenglicol, metilcelulosa, metilhidroxibenzoatos, propilhidroxibenzoatos, talco, estearato de magnesio, aceite mineral o sustancias grasas como grasas duras o mezclas adecuadas del mismo. Los excipientes y diluyentes a destacar son el manitol y el agua salada hipertónica (solución salina).

Las composiciones pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes conservantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes y similares.

Formas administrables por vía parenteral, por ejemplo, Las soluciones adecuadas para la administración por vía intravenosa deben ser estériles y libres de agentes fisiológicamente inaceptables, y deben tener una osmolaridad baja para minimizar la irritación u otros efectos adversos tras la administración y, por lo tanto, las soluciones deben ser preferiblemente isotónicas o ligeramente hipertónicas, por ejemplo, agua salada hipertónica (solución salina). Los vehículos adecuados incluyen vehículos acuosos utilizados habitualmente para administrar soluciones parenterales tales como agua estéril para inyección, inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, inyección de Ringer lactato y otras soluciones tales como las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed., Easton: Mack Publishing Co., págs. 1405-1412 y 1461-1487 (1975) y The National Formulary XIV, 14a ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975)). Las soluciones pueden contener conservantes, agentes antimicrobianos, tampones y antioxidantes usados convencionalmente para soluciones parenterales, excipientes y otros aditivos que sean compatibles con los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato y que no interfieran con la fabricación, el almacenamiento o el uso de los productos.

Las soluciones estériles simples de conjugados oligoméricos de polimixina-alginato o las composiciones líquidas estériles simples que comprenden conjugados oligoméricos de polimixina-alginato pueden ser especialmente convenientes para su uso durante procedimientos quirúrgicos y para la administración a los pulmones, por ejemplo, por nebulizador, o a los senos paranasales, por ejemplo, por un dispositivo de pulverización nasal.

Las formulaciones sólidas o líquidas de los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato se pueden proporcionar con un recubrimiento entérico que previene la degradación en el estómago y/u otras partes del tracto GI superior pero permite la degradación en el tracto GI inferior, por ejemplo, el intestino delgado. Dichos revestimientos se preparan habitualmente a partir de polímeros que incluyen ácidos grasos, ceras, goma laca, plásticos y fibras vegetales. Los ejemplos específicos de los mismos incluyen, entre otros, copolímeros de acrilato de metilo y ácido metacrílico, copolímeros de metacrilato de metilo y ácido metacrílico, succinato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulosa (succinato de acetato de hipromelosa), ftalato de acetato de polivinilo (PVAP), acetato de celulosa trimelitato y polímero de alginato de sodio. Los comprimidos con recubrimiento entérico y los gránulos con recubrimiento entérico (que pueden proporcionarse en una cápsula con recubrimiento entérico o en una cápsula sin recubrimiento entérico) son de particular interés. Los gránulos con recubrimiento entérico se pueden preparar de acuerdo con las enseñanzas del documento WO 1989008448 y AlKhedairy, E.B.H, 2006, Iraqi J.Pharm.Sci., Vol.15 (1) 49, aunque el experto conocerá otras técnicas alternativas que se puede utilizar.

Para la administración tópica, los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato se pueden incorporar en cremas, ungüentos, geles, ungüentos, parches transdérmicos y similares. Otros sistemas tópicos que se prevé que sean adecuados son sistemas de administración de fármacos in situ, por ejemplo, geles en los que se forman in situ matrices de gel cristalinas sólidas, semisólidas, amorfas o líquidas y que pueden comprender el oligómero de alginato (que puede ser cualquier oligómero de alginato como se define aquí). Dichas matrices pueden diseñarse convenientemente para controlar la liberación de los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato de la matriz, por ejemplo, la liberación se puede retrasar y/o sostener durante un período de tiempo elegido. Dichos sistemas pueden formar geles solo al entrar en contacto con tejidos o fluidos biológicos, por ejemplo, superficies mucosas. Normalmente, los geles son bioadhesivos y/o mucoadhesivos. El suministro a cualquier sitio del cuerpo que pueda retener o adaptarse para retener la composición de pregel puede ser el objetivo de tal técnica de suministro. Dichos sistemas se describen en el documento WO 2005/023176.

El contenido relativo de los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato en las composiciones de la invención puede variar según la dosis requerida y el régimen de dosificación que se siga, pero será suficiente para lograr una cantidad efectiva en el sitio de tratamiento objetivo, es decir, las bacterias. de la infección objetivo y/o el sitio portador de la infección, o el sitio en riesgo de infección, teniendo en cuenta variables tales como el tamaño físico del sujeto a tratar, la naturaleza de las dolencias particulares del sujeto y la ubicación e identidad del área de tratamiento objetivo. El experto sabrá que las cantidades de los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato se pueden reducir si se sigue o aumenta un régimen de dosificación múltiple para minimizar el número de administraciones o aplicaciones.

Una solución acuosa representativa para la administración del conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la invención mediante inyección (por ejemplo, mediante inyección intravenosa, intraespinal, intramuscular o subcutánea) será estéril y puede contener del 6 al 25 %, por ejemplo, 6 a 20 %, 6 a 15 %, 6 a 10 %, 8 a 25 %, 8 a 20 %, 8 a 15 %, 9 a 25 %, 9 a 20 %, 9 a 15 %, 10 a 15 %, 10 a 20 %, 10 a 25 %, 15 a 20 % o 15 a 25 % p/v del conjugado oligomérico de polimixina-alginato, el resto está compuesto por agua y excipientes farmacéuticamente aceptables y/u otros agentes activos si se utilizan.

Para la administración en la nariz o los senos paranasales, se puede usar una formulación líquida acuosa y/o a base de aceite estéril (por ejemplo, una emulsión); administrado, por ejemplo, mediante un dispositivo de pulverización nasal, por ejemplo, sin propulsor o asistido por propulsor. Una formulación representativa puede contener del 1 al 25 %, del 1 al 20 %, por ejemplo, 1 a 15 %, 1 a 10 %, 1 a 9 %, 1 a 8 %, 1 a 7 % o 1 a 6 %, 5 a 25 %, 5 a 20 %, 5 a 15 %, 5 a 10 %, 5 a 9 %, 5 a 8 %, 5 a 7 %, 5 a 6 %, 8 a 25 %, 8 a 20 %, 8 a 15 %, 8 a 10 %, 9 a 25 %, 9 a 20 %, o 9 a 15 % p/v o p/p del conjugado oligomérico de polimixina-alginato, el resto está compuesto de excipientes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, agua y/u otros agentes activos si se utilizan.

Una solución inhalable representativa que se utilizará para administrar un conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la invención en el tracto respiratorio superior normalmente será estéril y puede contener del 6 al 25 %, por ejemplo, 6 a 20 %, 6 a 15 %, 6 a 10 %, 8 a 25 %, 8 a 20 %, 8 a 15 %, 9 a 25 %, 9 a 20 %, 9 a 15 %, 10 a 15 %, del 10 al 20 %, del 10 al 25 %, del 15 al 20 % o del 15 al 25 % p/v del conjugado oligomérico de polimixina-alginato, el resto está compuesto por excipientes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, agua y/u otros agentes activos si se utilizan.

Un polvo inhalable representativo para usar para administrar un conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la invención en el tracto respiratorio inferior puede contener hasta un 90 %, por ejemplo, hasta el 85 %, 80 %, 75 % o 70 %, por ejemplo, 50 a 90 %, 55 a 90 %, 60 a 90 %, 65 a 90 %, 70 a 90 %, 75 a 90 %, 80 a 90 %, 85 a 90 %, 50 a 85 %, 55 a 85 %, 60 a 85 %, 65 a 85 %, 70 a 85 %, 75 a 85 %, 80 a 85 %, 50 a 80 %, 55 a 80 %, 60 a 80 %, 65 a 80 %, 70 a 80 %, 75 a 80 %, 50 a 70 %, 55 a 70 %, 60 a 70 % o 65 a 70 % p/v o p/p del conjugado oligomérico de polimixinaalginato, el resto está compuesto por excipientes farmacéuticamente aceptables y/o u otros agentes activos si se utilizan en la misma composición.

En otras realizaciones, se pueden usar formulaciones de liberación lenta, retardada o sostenida para suministro, por ejemplo, a la nariz o senos paranasales. Una formulación representativa puede ser un polvo que contenga el conjugado oligomérico de polimixina-alginato o una suspensión de dicho polvo, conteniendo dicho polvo hasta un 90 %, por ejemplo, hasta el 85 %, 80 %, 75 % o 70 %, por ejemplo, 50 a 90 %, 55 a 90 %, 60 a 90 %, 65 a 90 %, 70 a 90 %, 75 a 90 %, 80 a 90 %, 85 a 90 %, 50 a 85 %, 55 a 85 %, 60 a 85 %, 65 a 85 %, 70 a 85 %, 75 a 85 %, 80 a 85 %, 50 a 80 %, 55 a 80 %, 60 a 80 %, 65 a 80 %, 70 a 80 %, 75 a 80 %, 50 a 70 %, 55 a 70 %, 60 a 70 % o 65 a 70 % p/v o p/p del conjugado oligomérico de polimixina-alginato, el resto está compuesto por excipientes farmacéuticamente aceptables y/o u otros agentes activos si se utilizan. El polvo puede comprender un revestimiento que controla la liberación del conjugado oligomérico de polimixina-alginato.

Una formulación tópica representativa, por ejemplo, una crema, ungüento o ungüento, que puede usarse para administrar un conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la invención a la piel o el cuello uterino u otras partes del sistema reproductor femenino inferior puede contener 1 a 25 %, 1 a 20 %, 1 a 15 %, 1 a 10 %, 1 a 9 %, 1 a 8 %, 1 a 7 %, 1 a 6 %, 5 a 25 %, 5 a 20 %, 5 a 15 %, 5 a 10 %, 5 a 9 %, 5 a 8 %, 5 a 7 %, 5 a 6 %, 8 a 25 %, 8 a 20 %, 8 a 15 %, 8 a 10 %, 9 a 25 %, 9 a 20 %, o 9 al 15 % p/v del conjugado oligomérico de polimixina-alginato, el resto está compuesto por excipientes farmacéuticamente aceptables y/u otros agentes activos si se usan. Se conocen dispositivos de suministro diseñados para la aplicación de formulaciones tópicas al sistema reproductivo femenino y pueden emplearse para suministrar las formulaciones antes mencionadas si es conveniente.

Un comprimido representativo para usar para administrar un conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la invención en el tracto gastrointestinal inferior puede contener hasta un 99 %, hasta un 95 %, un 90 %, un 85 % o un 80 %, por ejemplo, 50 a 95 %, 55 a 95 %, 60 a 95 %, 65 a 95 %, 70 a 95 %, 75 a 95 %, 80 a 95 %, 85 a 95 %, 90 a 95 %, 50 a 90 %, 50 a 90 %, 55 a 90 %, 60 a 90 %, 65 a 90 %, 70 a 90 %, 75 a 90 %, 80 a 90 %, 85 a 90 %, 50 a 90 %, 55 a 85 %, 60 a 80 % o 65 a 75 % p/v o p/p del conjugado oligomérico de polimixina-alginato, el resto está compuesto de excipientes farmacéuticamente aceptables y/u otros agentes activos si se usan. El comprimido puede ser un comprimido multicapa.

Un comprimido con recubrimiento entérico también puede ser eficaz en la administración de un conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la invención en el tracto GI inferior. Un comprimido con cubierta entérica representativa puede contener hasta un 95 %, por ejemplo, hasta el 90 %, 85 % u 80 %, por ejemplo, 55 a 90 %, 60 a 90 %, 65 a 90 %, 70 a 90 %, 75 a 90 %, 80 a 90 %, 85 a 90 %, 55 a 85 %, 60 a 85 %, 65 a 85 %, 70 a 85 %, 75 a 85 %, 80 a 85 %, 50 a 80 %, 55 a 80 %, 60 a 80 %, 65 a 80 %, 70 a 80 % o 75 a 80 % p/v o p/p del conjugado oligomérico de polimixinaalginato, el resto está compuesto por excipientes farmacéuticamente aceptables, incluido el recubrimiento entérico (por ejemplo, polímeros que incluyen ácidos grasos, ceras, goma laca, plásticos y fibras vegetales) y/u otros agentes activos si se utilizan. El comprimido puede ser un comprimido multicapa, por ejemplo, como se describió anteriormente.

Los gránulos con recubrimiento entérico también pueden ser eficaces en la administración de un conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la invención en el tracto gastrointestinal inferior. Dichos gránulos se pueden proporcionar en una cápsula que a su vez puede estar provista o no de un recubrimiento entérico. Un gránulo con recubrimiento entérico representativo puede contener hasta un 95 %, por ejemplo, hasta el 90 %, 85 % u 80 %, por ejemplo, 55 a 90 %, 60 a 90 %, 65 a 90 %, 70 a 90 %, 75 a 90 %, 80 a 90 %, 85 a 90 %, 55 a 85 %, 60 a 85 %, 65 a 85 %, 70 a 85 %, 75 a 85 %, 80 a 85 %, 50 a 80 %, 55 a 80 %, 60 a 80 %, 65 a 80 %, 70 a 80 % o 75 a 80 % p/v o p/p del conjugado oligomérico de polimixina-alginato, el resto está compuesto por excipientes farmacéuticamente aceptables, incluido el recubrimiento entérico (por ejemplo, polímeros que incluyen ácidos grasos, ceras, goma laca, plásticos y fibras vegetales) y/u otros agentes activos si se utilizan.

Se puede usar un pesario para administrar un conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la invención en las partes inferiores del tracto reproductivo femenino. Una formulación representativa puede contener del 1 al 25 %, del 1 al 20 %, por ejemplo, 1 a 15 %, 1 a 10 %, 1 a 9 %, 1 a 8 %, 1 a 7 %, 1 a 6 %, 5 a 25 %, 5 a 20 %, 5 a 15 %, 5 a 10 %, 5 a 9 %, 5 a 8 %, 5 a 7 %, 5 a 6 %, 8 a 25 %, 8 a 20 %, 8 a 15 %, 8 a 10 %, 9 a 25 %, 9 a 20 %, o 9 a 15 % p/v o p/p del conjugado oligomérico de polimixina-alginato, el resto está compuesto de excipientes farmacéuticamente aceptables, incluidos excipientes sólidos, y/u otros agentes activos si se usan. Los óvulos rectales pueden formularse de manera similar.

Los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato se pueden usar en una dosis diaria de 0.1 g a 10 g, por ejemplo, 0.5 g a 5 g, 0.8 g a 3 g, 1 g a 2 g, por ejemplo, aproximadamente 2 g, que pueden administrarse una o más veces al día (por ejemplo, dos veces al día) y en una o más formas de dosificación o eventos de administración (por ejemplo, dos comprimidos dos veces al día).

Los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato como se definen en el presente documento se pueden usar junto o en combinación con uno o más agentes terapéuticamente activos adicionales, que pueden incluir otros agentes antimicrobianos (por ejemplo, antibacterianos, antibióticos, antifúngicos y antivirales), agentes inmunoestimuladores, corticosteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), broncodilatadores, agentes reductores de la viscosidad de la mucosidad (es decir, un agente que reduce la viscosidad de la mucosidad y cuyos términos se usan indistintamente con el término “agente mucolítico”) o moduladores de CFTR (también conocidos como “ modificadores CFTR”).

El agente adicional, por ejemplo, antibiótico, puede no estar conjugado con un oligómero de alginato o con cualquier otra fracción de conjugación.

El conjugado oligomérico de polimixina-alginato y el agente terapéuticamente activo adicional pueden, por ejemplo, administrarse juntos, en una única formulación o composición farmacéutica, o por separado (es decir, administración separada, secuencial o simultánea). Por lo tanto, el conjugado oligomérico de polimixina-alginato y el agente terapéuticamente activo adicional pueden combinarse, por ejemplo, en un kit farmacéutico o como un producto combinado (“combinación”).

Por lo tanto, otro aspecto de la invención proporciona un producto (por ejemplo, una combinación farmacéutica o un kit) que comprende un conjugado oligomérico de polimixina-alginato como se define en el presente documento junto con otro agente terapéuticamente activo (por ejemplo, los descritos anteriormente) como preparación combinada para, uso secuencial o simultáneo en el tratamiento o prevención de una infección bacteriana en un sujeto.

Más en general, este aspecto de la invención también proporciona un kit que comprende un conjugado oligomérico de polimixina-alginato como se define en este documento junto con un agente terapéuticamente activo adicional (por ejemplo, los descritos anteriormente).

Se prefieren especialmente las combinaciones que comprenden un conjugado oligomérico de polimixina-alginato como se define en el presente documento y un antibiótico, un antifúngico, un modulador de CFTR y/o un agente reductor de la viscosidad del moco. Dichos productos farmacéuticos y composiciones farmacéuticas están preferiblemente adaptados para su uso en los métodos médicos de la invención.

El agente terapéuticamente activo adicional puede aplicarse convenientemente antes, simultáneamente o después del conjugado oligomérico de polimixina-alginato. Convenientemente, el agente terapéuticamente activo adicional se aplica sustancialmente al mismo tiempo que el conjugado oligomérico de polimixina-alginato o después. En otras realizaciones, el agente terapéuticamente activo adicional puede aplicarse o administrarse convenientemente antes del conjugado oligomérico de polimixina-alginato. El agente terapéuticamente activo adicional también puede administrarse (por ejemplo, administrarse o suministrarse) repetidamente en puntos de tiempo apropiados para el agente utilizado. El experto en la materia es capaz de idear un régimen de dosificación adecuado. En tratamientos a largo plazo, el conjugado oligomérico de polimixina-alginato también se puede usar repetidamente. El conjugado oligomérico de polimixina-alginato se puede aplicar con la misma frecuencia que el agente terapéuticamente activo adicional, o con mayor o menor frecuencia. La frecuencia requerida puede depender del sitio o ubicación en o sobre el paciente al que se administra el conjugado oligomérico de polimixina-alginato y también de la naturaleza general de la condición clínica mostrada por el paciente particular que se somete al tratamiento.

El conjugado oligomérico de polimixina-alginato y el agente terapéuticamente activo adicional pueden, por lo tanto, formularse juntos o por separado, es decir, en la misma o en diferentes formulaciones o composiciones farmacéuticas, y pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes. También se contempla el uso de conjugados oligoméricos de polimixina-alginato como se define en el presente documento para fabricar tales productos farmacéuticos y composiciones farmacéuticas para uso en los métodos médicos de la invención.

Los antibióticos representativos que se pueden usar junto o en combinación con los conjugados oligoméricos de polimixina-alginato como se define aquí incluyen, entre otros, los aminoglucósidos (por ejemplo, amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina); los p-lactámicos (por ejemplo, los carbecefemos (por ejemplo, loracarbef); las cefalosporinas de 1.a generación (por ejemplo, cefadroxilo, cefazolina, cefalexina); las cefalosporinas de 2.a generación (por ejemplo, cefaclor, cefamandol, cefalexina, cefoxitina, cefprozil, cefuroxima); las cefalosporinas de 3.a generación (por ejemplo, cefixima, cefdinir, cefditoren, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona); cefalosporinas de cuarta generación (por ejemplo, cefepima); monobactámicos (por ejemplo, aztreonam); macrólidos (por ejemplo, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, troleandomicina); los monobactámicos (por ejemplo, aztreonam); las penicilinas (por ejemplo, amoxicilina, ampicilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, ticarcilina); los antibióticos polipeptídicos (por ejemplo, bacitracina, colistina, polimixina B, pero en ciertas realizaciones no la polimixina del conjugado oligomérico de polimixina-alginato a utilizar); las quinolonas (por ejemplo, ciprofloxacina, enoxacina, gatif loxacina, levofloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, trovafloxacina); las sulfonamidas (por ejemplo, mafenida, sulfacetamida, sulfametizol, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprim-sulfametoxazol); las tetraciclinas (por ejemplo, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina); las glicilciclinas (por ejemplo, tigeciclina); los carbapenems (por ejemplo, imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, panipenem/betamipron, biapenem, PZ-601); otros antibióticos incluyen cloranfenicol; clindamicina, etambutol; fosfomicina; isoniazida; linezolida; metronidazol; nitrofurantoína; pirazinamida; quinupristina/dalfopristina; rifampicina; espectinomicina; y vancomicina.

Los antifúngicos representativos incluyen, pero no se limitan a, los polienos (por ejemplo, natamicina, rimocidina, filipina, nistatina, anfotericina B, candicina; los imidazoles (por ejemplo, miconazol, ketoconazol, clotrimazol, econazol, bifonazol, butoconazol, fenticonazol, isoconazol, oxiconazol, sertaconazol, sulconazol, tioconazol); los triazoles (por ejemplo, fluconazol, itraconazol, isavuconazol, ravuconazol, posaconazol, voriconazol, terconazol); las alilaminas (por ejemplo, terbinafina, amorolfina, naftifina, butenafina); y las equinocandinas (por ejemplo, anidulafungina, caspofungina, micafungina).

Los antivirales representativos incluyen, entre otros, abacavir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, arbidol, atazanavir, atripla, boceprevir, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, famciclovir, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, interferón tipo III, interferón tipo II, interferón tipo I, lamivudina, lopinavir, loviride, maraviroc, moroxidina, nelfinavir, nevirapina, nexavir, oseltamivir, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, raltegravir, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, estavudina, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir y zidovudina.

Los agentes inmunoestimuladores representativos incluyen, pero no se limitan a, citocinas, por ejemplo, TNF, IL-1, IL-6, IL-8 y alginatos inmunoestimuladores, tales como alginatos con alto contenido de M como se describe, por ejemplo, en los documentos US 5,169,840, WO91/11205 y WO03/045402 que se incorporan explícitamente por referencia en este documento en su totalidad, pero incluyendo cualquier alginato con propiedades inmunoestimuladoras.

Los ejemplos representativos de corticosteroides adecuados incluyen, entre otros, prednisona, flunisolida, triamcinolona, fluticasona, budesonida, mometasona, beclometasona, amcinonida, budesonida, desonida, fluocinonida, fluocinolona, halcinonida, hidrocortisona, cortisona, tixocortol, prednisolona, metilprednisolona, prednisona, betametasona, dexametasona, fluocortolona, aclometasona, prednicarbato, clobetasona, clobetasol y fluprednidene.

Los AINE representativos incluyen, entre otros, los salicilatos (por ejemplo, aspirina (ácido acetilsalicílico), trisalicilato de colina y magnesio, diflunisal, salsalato, los derivados del ácido propiónico (por ejemplo, ibuprofeno, dexibuprofeno, dexketoprofeno, fenoprofeno, flurbiprofeno, ketoprofeno, loxoprofeno, naproxeno, oxaprozina), los derivados del ácido acético (por ejemplo, aceclofenaco, diclofenaco, etodolaco, indometacina, ketorolaco, nabumetona, tolmetina, sulindac), los derivados del ácido enólico (por ejemplo, droxicam, isoxicam, lornoxicam, meloxicam, piroxicam, tenoxicam), el derivados del ácido antranílico (por ejemplo, ácido flufenámico, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, ácido tolfenámico) y los inhibidores selectivos de la COX-2 (Coxibs; por ejemplo, celecoxib, etoricoxib, lumiracoxib, parecoxib, rofecoxib, valdecoxib).Los derivados del ácido propiónico (por ejemplo, ibuprofeno, dexibuprofeno, dexketoprofeno, fenoprofeno, flurbiprofeno, cetoprofeno, loxoprofeno, naproxeno, oxaprozina), siendo el ibuprofeno el más preferido.

Los ejemplos representativos de broncodilatadores adecuados incluyen, entre otros, los agonistas p2 (por ejemplo, los agonistas p2 de acción corta (por ejemplo, pirbuterol, epinefrina, salbutamol, levosalbutamol, clenbuterol, terbutalina, procaterol, metaproterenol, fenoterol, mesilato de bitolterol, ritodrina, isoprenalina); los agonistas p2 de acción prolongada (por ejemplo, salmeterol, formoterol, bambuterol, clenbuterol); y los agonistas p2 de acción ultraprolongada (por ejemplo, indacaterol), los anticolinérgicos (por ejemplo, ipratropio, oxitropio, tiotropio) y la teofilina.

Como se usa en el presente documento, los términos “agente mucolítico” y “agente reductor de la viscosidad del moco” pretenden abarcar agentes que reducen la viscosidad intrínseca del moco y agentes que reducen la unión del moco al epitelio subyacente, en particular agentes que directa o indirectamente interrumpir indirectamente las interacciones moleculares dentro o entre los componentes de la mucosidad, los agentes que afectan la hidratación de la mucosidad y los agentes que modulan el microambiente iónico del epitelio de la mucosa (particularmente los niveles de cationes divalentes, por ejemplo, calcio). Ejemplos representativos de agentes reductores de la viscosidad del moco adecuados incluyen, pero no se limitan a, una enzima de escisión de ácido nucleico (por ejemplo, una DNasa como DNasa I o dornasa alfa), solución salina hipertónica, gelsolina, un agente reductor de tiol, una acetilcisteína, una baja carga sin carga polisacárido de peso molecular (por ejemplo, dextrano, manitol), arginina (u otros precursores del óxido nítrico o estimuladores de la síntesis), un agonista del subtipo P2Y2 de los receptores purinérgicos (por ejemplo, denufosol) o un poliaminoácido aniónico (por ejemplo, poli ASP o poli GLU). Ambroxol, bromhexina, carbocisteína, domiodol, eprazinona, erdosteína, letosteína, mesna, neltenexina, sobrerol, stepronina, tiopronina son mucolíticos específicos a destacar. Se prefieren la ADNasa I y la solución salina hipertónica.

Los moduladores de CFTR son moléculas pequeñas que pueden corregir, al menos parcialmente, una disfunción de CFTR. Los moduladores CFTR actuales se dividen en tres grupos principales: potenciadores CFTR, correctores CFTR y agentes de lectura (Derichs, N., Eur. Respir. Rev., 2013, 22(127), 58-65; Petit, R.S. and Fellner, C., Pharmacy and Therapeutics, 2014, 39(7), 500-511; cuyo contenido se incorpora aquí como referencia). Los potenciadores de CFTR son moduladores de CFTR que aumentan la actividad del canal de iones CFTR presente en la superficie de las células epiteliales. Los correctores de CFTR son moduladores de CFTR que aumentan la cantidad de proteína CFTR administrada o retenida en la superficie de la célula epitelial. Los agentes de lectura (también conocidos como “supresores de codones de terminación prematuros” (supresores de PSC) o “supresores de codones de terminación prematuros” (supresores de PTC, cuyos términos se usan indistintamente en este documento) son moduladores de CFTR que hacen que la maquinaria de traducción de la célula pase por alto cualquier codón de terminación prematura en el ARNm de CFTR aumentando así la cantidad de CFTR sustancialmente de longitud completa y funcional producido.

Los ejemplos representativos de potenciadores de CFTR adecuados incluyen, entre otros, ivacaftor (VX-770; N-(2,4-di-tert-butil-5-hidroxifenil)-1,4-dihidro-4-oxoquinolina -3-carboxamida) y VRT-532 (4-metil-2-(5-fenil-1H-pirazol-3-il)-fenol) de Vertex Pharmaceuticals™).

Los ejemplos representativos de correctores CFTR adecuados incluyen, entre otros, lumacaftor prototípico (VX-809) y VX-661 de Vertex Pharmaceuticals™ y N6022 ácido (3-[1-(4-carbamoil-2-metilfenil)- 5-(4-imidazol-1-ilfenil)pirrol-2-il]propanoico).

Los ejemplos representativos de agentes de lectura adecuados incluyen, entre otros, atalureno (PTC124) de PTC Therapeutics y gentamicina.

La invención se describirá adicionalmente con referencia al siguiente ejemplo no limitativo en el que:

La Figura 1 muestra representaciones gráficas del crecimiento de V2 Pseudomonas aeruginosa bajo concentraciones variables de A: OligoG-A-colistina (MIC media 1 pg/ml); B: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-A-colistina de A); C: alginato de Pronova (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-A-colistina de A); D: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-A-colistina de A) y colistina (a concentraciones equivalentes a la colistina en los conjugados OligoG-A-colistina de A); E OligoG-E-colistina (MIC media 0.5 pg/ml); F: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-E-colistina de E); G: alginato de Pronova (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-E-colistina de E); H: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-E-colistina de E) y colistina (a concentraciones equivalentes a la colistina en los conjugados OligoG-E-colistina de E); I: 2.5k AHG-A-colistina (MIC media 0.5 pg/ml); J: 2.5k AHG-E-colistina (MIC media 0.5 pg/ml); y K: sulfato de colistina (MIC media 0.063 pg/ml).

La Figura 2 muestra representaciones gráficas del crecimiento de V3 Klebsiella pneumoniae bajo concentraciones variables de A: OligoG-A-colistina (MIC media 0.063 pg/ml); B: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-A-colistina de A); C: alginato de Pronova (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-A-colistina de A); D: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-A-colistina de A) y colistina (a concentraciones equivalentes a la colistina en los conjugados OligoG-A-colistina de A); E OligoG-E-colistina (MIC media 0.125 pg/ml); F: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-E-colistina de E); G: alginato de Pronova (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-E-colistina de E); H: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-E-colistina de E) y colistina (a concentraciones equivalentes a la colistina en los conjugados OligoG-E-colistina de E); I: 2.5k AHG-A-colistina (MIC media 0.125 pg/ml); J: 2.5k AHG-E-colistina (MIC media 0.063 pg/ml); y K: sulfato de colistina (MIC media 0.008 pg/ml).

La Figura 3 muestra representaciones gráficas del crecimiento de V19 Acinetobacter baumannii bajo concentraciones variables de A: OligoG-A-colistina (MIC media 0.063 pg/ml); B: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-A-colistina de A); C: alginato de Pronova (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-A-colistina de A); D: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-A-colistina de A) y colistina (a concentraciones equivalentes a la colistina en los conjugados OligoG-A-colistina de A); E OligoG-E-colistina (MIC media 0.125 pg/ml); F: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-E-colistina de E); G: alginato de Pronova (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-E-colistina de E); H: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-E-colistina de E) y colistina (a concentraciones equivalentes a la colistina en los conjugados OligoG-E-colistina de E); I: 2.5k AHG-A-colistina (MIC media 0.125 pg/ml); J: 2.5k AHG-E-colistina (MIC media 0.125 pg/ml); y K: sulfato de colistina (MIC media 0.002 pg/ml).

La Figura 4 muestra representaciones gráficas del crecimiento de Escherichia coli V7 bajo concentraciones variables de A: OligoG-A-colistina (MIC media 0.063 pg/ml); B: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-A-colistina de A); C: alginato de Pronova (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-A-colistina de A); D: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-A-colistina de A) y colistina (a concentraciones equivalentes a la colistina en los conjugados OligoG-A-colistina de A); E OligoG-E-colistina (MIC media 0.125 pg/ml); F: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-E-colistina de E); G: alginato de Pronova (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-E-colistina de E); H: OligoG (a concentraciones equivalentes al OligoG en los conjugados OligoG-E-colistina de E) y colistina (a concentraciones equivalentes a la colistina en los conjugados OligoG-E-colistina de E); I: 2.5k AHG-A-colistina (MIC media 0.5 pg/ml); J: 2.5k AHG-E-colistina (MIC media 0.5 pg/ml); y K: sulfato de colistina (MIC media 0.063 pg/ml).

La Figura 5 muestra representaciones gráficas del crecimiento de A: V2 Pseudomonas aeruginosa, B: V3 Klebsiella pneumonia, C: V19 Acinetobacter baumannii y D: V7 Escherichia coli en presencia de OligoG-A-colistina, OligoG-E-colistina, 2.5 k AHG-A-colistina, 2.5k AHG-E-colistina y sulfato de colistina en la MIC respectiva de cada agente; y E una comparación de los tiempos medios para la iniciación del crecimiento bacteriano para cada cepa en presencia de cada agente en la MIC respectiva de cada agente.

La Figura 6 muestra una representación gráfica del número de UFC frente al tiempo de incubación de Acinetobacter baumanii (V19) en el modelo de difusión de membrana de dos compartimentos del Ejemplo 4 después de la exposición a OligoG-A-colistina en MIC (círculos negros), OligoG-A-colistina en MIC x2 (círculos grises), OligoG-E-colistina en MIC (triángulos), OligoG-E-colistina en MIC x2 (triángulos invertidos), sulfato de colistina en MIC (rombos) o control no tratado (cuadrados).

La Figura 7 muestra representaciones gráficas de la citotoxicidad de concentraciones crecientes de A: OligoG (círculos), OligoG-A-colistina (dos lotes; hexágonos y triángulos invertidos), OligoG-E-colistina (triángulos), metanosulfonato de colistina (CMS; cuadrados) y sulfato de colistina (diamantes); y B: OligoG (círculos vacíos), OligoG-E-polimixina B (cuadrados), OligoG-A-polimixina B (círculos rellenos) y polimixina B (triángulos).

La Figura 8 muestra una representación gráfica de la liberación de TNFa de las células HK2, ajustada para la viabilidad celular, tras la exposición a concentraciones crecientes de polimixina B (triángulos negros), sulfato de colistina (círculos negros), OligoG-E-polimixina B (triángulos grises), OligoG-E-colistina (círculos grises), OligoG-A-colistina (círculos blancos), OligoG-A-polimixina B (triángulos blancos), OligoG. Datos expresados como media ± EEM (n = 6).

La Figura 9 muestra los efectos de concentraciones crecientes de A: OligoG-A-colistina (MIC mediana = 1 pg/ml) y B: sulfato de colistina (MIC mediana = 0.063 pg/ml) sobre la estructura y viabilidad celular dentro de Pseudomonas aeruginosa biopelículas formadas en presencia de dichos agentes.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Preparación de conjugados oligoméricos de polimixina-alginato

Preparación de oligómeros de alginato por hidrólisis ácida

Se disolvió alginato de sodio, que contenía >60 % de monómeros de guluronato (PRONOVA UP MVG), en dH²O (10 mg/ml), la solución se ajustó a HCl 0.01 M y luego se colocó en un baño de agua a 80°C durante hasta a 24 h. Para terminar la hidrólisis, se enfrió el hidrolizado ácido y se aumentó el pH a pH 7 mediante la adición de NaOH 10 M. Las soluciones se liofilizaron y se resuspendieron en una cantidad mínima de dH²O.

Para obtener fragmentos G hidrolizados con ácido (AHG) con un grado de polimerización promedio en número aceptable, así como una distribución del peso molecular, las soluciones se filtraron una vez por diálisis para eliminar los oligómeros y las sales de BPM. Por lo general, se usaron los siguientes tiempos de reacción y cortes de membrana de diálisis para producir AHG con un peso molecular deseado:

Los productos finales se liofilizaron y caracterizaron mediante FT-IR y cromatografía de permeación en gel (GPC). El sistema GPC constaba de dos columnas TSK G5000PWXL y G3000PW^{x l} (Polymer Laboratories, Reino Unido) en serie, fase móvil PBS (pH 7.4) y caudal de 1 ml/min. El peso molecular y la polidispersidad se calcularon en relación con los estándares de pululano. Los estándares de alginato no están disponibles comercialmente, lo que requirió el uso de pululano. Estos estándares de calibración no dan el peso molecular correcto para los alginatos, ya que la GPC se separa según el volumen hidrodinámico, que difiere con la arquitectura macromolecular variable. Los alginatos están más expandidos que los pululanos, lo que resulta en una sobreestimación de seis veces del peso molecular del alginato por GPC con pululano. En consecuencia, se aplicó un factor de escala (dividir por 6) a los pesos moleculares aparentes calculados a partir de la calibración de pululano, para ajustar las diferentes arquitecturas macromoleculares de los estándares de Pm de pululano (Andersen T., et al., 2012, Alginates as biomaterials in tissue engineering. Carbohydrate Chemistry: Chemical and Biological Approaches, Vol. 37, 232-233).

Se prepararon muestras para GPC en PBS (3 mg/ml) y el eluato se onitorizó utilizando un refractómetro diferencial (Optilab t-Rex (Wyatt, Reino Unido)). Para el análisis de datos se utilizó el software PL Caliber Instrument, versión 7.0.4, de Polymer Laboratories (UK).

Se generaron fragmentos G hidrolizados con ácido (AHG) con pesos moleculares entre 2.500 y 26.000 g/mol (polidispersidad 2.5-3.5). Las características típicas de los AHG utilizados en estos estudios se resumen en la siguiente tabla.

continuación

Conjugación de éster ('E')

Brevemente, para la conjugación de 2500 g/mol AHG con colistina, se disolvió el oligómero de alginato (200 mg, 0.08 mmol) con agitación en DMF anhidro (4 ml) (o DMSO anhidro para los lotes 3 y posteriores) en un matraz de fondo redondo de 10 ml. A esto, se añadieron DCC (16.5 mg, 0.08 mmol), DMAP (1.6 mg, 0.01 mmol) y sulfato de colistina (37.5 mg, 0.03 mmol), y se dejó que la reacción prosiguiera a temperatura ambiente durante la noche, con agitación. Para detener la reacción, la mezcla se vertió en exceso de cloroformo (hasta 20 ml), luego el precipitado resultante se recogió por filtración, se volvió a disolver en agua destilada (dH²O, 2 ml) y se purificó por FPLc (ver más abajo). Los otros conjugados enlazados a éster enumerados en este documento se prepararon de manera análoga.

Conjugación amida ('A')

Brevemente, para la conjugación de 2500 g/mol de AHG con colistina, se disolvió el oligómero de alginato (200 mg, 0.08 mmol) con agitación en dH²O (2 ml) en un matraz de fondo redondo de 10 ml. A esto, se añadieron EDC (19.9 mg, 0.1 mmol) y sulfo-NHS (22.6 mg, 0.1 mmol), y la mezcla se dejó en agitación durante 15 min. Posteriormente, se añadió sulfato de colistina (37.5 mg, 0.03 mmol), y la mezcla de reacción se dejó en agitación durante 2 h a temperatura ambiente, luego se almacenó a -20°C hasta la purificación por FPLC (ver más abajo).

Los otros conjugados enlazados a amida enumerados en este documento se prepararon de manera análoga.

Purificación de conjugados por FPLC

Los conjugados se purificaron de la mezcla de reacción mediante cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) (AKTA FPLC; Amersham Pharmacia Biotech, Reino Unido) usando una columna HiLoad Superdex 75 16/600 PG preempaquetada con un detector UV y análisis de datos usando Unicorn Software 4.0 (Amersham Pharmacia Biotech, Reino Unido). Se inyectaron muestras de la mezcla de reacción (2 ml) en un circuito de 2 pl usando PBS (pH 7.4) a 0.5 ml/min como fase móvil. Se recogieron fracciones (5 ml), se dializaron frente a agua desionizada (8 cambios de agua) y se analizó el contenido de proteínas (ensayo BCA) antes de agrupar las fracciones que contenían el conjugado. El conjugado final se liofilizó y almacenó a -20°C.

Ejemplo 2 - Caracterización de conjugados oligoméricos alginato - antibiótico

Pureza, peso molecular y contenido de fármaco

Los conjugados oligoméricos de alginato-antibiótico se caracterizaron mediante FPLC y GPC para evaluar la pureza y estimar el peso molecular, y el contenido total de fármaco del conjugado se determinó mediante el ensayo BCA usando fármaco libre como calibrador.

El sistema de FPLC descrito anteriormente para la purificación se utilizó de nuevo para la caracterización del conjugado final, con una columna Superdex 75 10/300 GL preempaquetada. Las muestras (200 pl) se disolvieron en p Bs (pH 7.4) y se inyectaron en un bucle de 100 ml a 0.5 ml/min. Se volvió a utilizar el sistema GPC descrito anteriormente para la caracterización del conjugado final y se aplicó el mismo factor de escala.

Para los conjugados con enlaces amida se usó un ensayo de ninhidrina para determinar cuántos grupos amina de la colistina se usaron para unirse a los oligómeros de alginato a través de enlaces amida. En primer lugar, se preparó una solución tampón de acetato de litio 4 M disolviendo dihidrato de acetato de litio (40.81 g) en 60 ml de dH²O. Se añadió suficiente ácido acético (glacial) hasta alcanzar un pH de 5.2. El volumen se completó hasta un volumen final de 100 ml con dH²O. A continuación, se disolvieron ninhidrina (0.2 g) e hidrindantina (0.03 g) en 7.5 ml de DMSO y 2.5 ml de tampón de acetato de litio. Se añadió reactivo de ninhidrina tamponada (86 pl) a una cantidad igual de muestra/solución estándar (eppendorf de 1.5 ml) y se calentó en un baño de agua a 100°C durante 15 min. Posteriormente, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se añadieron 130 pl de etanol al 50 % v/v. La solución se mezcló antes de agregar 200 pl de la solución final a los pocillos de una placa de 96 pocillos. El análisis espectrofotométrico se realizó a 570 nm. La calibración del ensayo se logró utilizando etanolamina (0-0.1158 mM).

Estabilidad de oligómeros de alginato y conjugados oligoméricos alginato - antibiótico

Para comparar la tasa de degradación de los oligómeros de alginato, se prepararon soluciones (3 mg/ml) en PBS a pH 7 que contenían alginato liasa bacteriano (0, 1-1000 U/ml)) y se incubaron a 37°C durante hasta a las 48h. Se prepararon soluciones de conjugado de alginato oligómero-antibiótico (3 mg/ml) en i) PBS a pH 5, ii) PBS a pH 7, o iii) PBS a pH 7 que contenía alginato liasa bacteriano (1 U/ml)) y se incubaron a 37°C hasta por 48 h. En varios momentos, se tomaron muestras (300 ml), se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido para detener la reacción y luego se almacenaron a -20°C hasta el análisis por GPC para determinar el cambio en el peso molecular a lo largo del tiempo y por FPLC (conjugados únicamente) para determinar el cambio en la colistina libre a lo largo del tiempo.

Resultados

Utilizando estos oligómeros de alginato, se ha preparado una biblioteca de conjugados, con un rendimiento de reacción típico de -50, con pesos moleculares de 24.000-120.000 g/mol (en relación con los estándares de 59 de peso molecular de pululano); que contiene 1-11 % p/p de carga de fármaco (equivalente a 3-6 AHG: 1 molécula de fármaco).

Lote 1

continuación

Lote 2

continuación

Lote 3

Lote 4

Lote 5

Lote 6

continuación

La incubación de OligoG con concentraciones variables de AlgL dio como resultado una disminución del peso molecular dependiente de la concentración (datos no mostrados). Tanto los conjugados de éster como de amida de oligoG-colistina, 16k AHG-colistina y oligoG-polimixina B incubados en PBS a pH 5 o pH 7 no mostraron una disminución significativa en el PM (datos no mostrados). Los conjugados fueron levemente menos estables a pH 7, en comparación con pH 5. Por el contrario, AlgL activa de forma eficaz la liberación del fármaco (aumento del % de fármaco libre) de estos conjugados a 1 U/ml (datos no mostrados). Hubo poca diferencia en la liberación del fármaco de los conjugados enlazados a amida y éster (excepto el conjugado 16k AHG-colistina donde el conjugado éster mostró una liberación más rápida y una liberación total mayor).

Se espera que, en los sitios de infección bacteriana e inflamación, el pH sea más bajo con aumentos paralelos en la actividad de ROS, esterasas y alginato liasa (en infecciones bacterianas) y por lo tanto liberación de fármaco.

Ejemplo 3 - Actividad antimicrobiana

Cepas y aislados bacterianos:

Las cepas utilizadas para las pruebas de susceptibilidad incluyen tanto cepas de recolección de cultivos como aislados clínicos (Tabla 1). En la medida que se indica a continuación, sus genotipos y orígenes relevantes conocidos han sido descritos por Khan et al. supra.

Tabla 1: Aislados bacterianos utilizados en este estudio

continuación

Determinación de la actividad antimicrobiana

Las MIC se determinaron utilizando el método de microdilución en caldo de acuerdo con las directrices estándar (CLSI 2012). Los organismos de prueba se suspendieron en caldo con ajuste de cationes (MH) de Mueller Hinton (100 pl, 1­ 5 x ¹⁰⁴ UFC/ml) y se incubaron en placas de microtitulación de 96 pocillos en diluciones seriadas dobles de los compuestos de prueba. La MIC se definió como la concentración más baja de compuesto de prueba que no produjo un crecimiento visible después de 16 a 20 horas. A menos que se indique lo contrario, los resultados muestran valores medios de 3 experimentos.

Para investigar si se requiere la degradación del oligómero de alginato para la actividad antimicrobiana, se realizaron ensayos de MIC en presencia de alginato liasa (1, 10 y 50 U/ml), mediante los cuales se añadió alginato liasa al caldo MH durante la configuración de la placa de microtitulación. Además, se incubaron conjugados oligoméricos de alginatocolistina (3 mg/ml) en PBS a pH 7 que contenía alginato liasa bacteriana (1 U/ml) a 37°C durante 24 h, antes de preparar placas de microtitulación como se describió anteriormente.

Finalmente, se usaron las curvas de crecimiento bacteriano, usando la media de los valores MIC previamente determinados para los conjugados de colistina-oligoG (unidos a amida y éster) y sulfato de colistina, para comparar sus perfiles farmacocinéticos in vitro. Para comparación, se midió el crecimiento bacteriano en presencia de i) OligoG, ii) PRONOVA (alginato de alto peso molecular) y iii) OligoG más colistina, ambos en concentraciones correspondientes a las cantidades presentes en los conjugados correspondientes. Se prepararon placas de microtitulación estériles de 96 pocillos para el ensayo MIC como se describió anteriormente (rango: MIC x 16 a MIC/16, 0). Luego, las placas se envolvieron en parafilm y se colocaron en un lector de placas de microtitulación a 37°C, 5 % de CO² y se midió la absorbancia a 600 nm cada hora durante 48 h. Los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados se presentaron como valores medios (n=3).

Resultados

Ninguna de las fracciones de alginato u OligoG mostró ninguna actividad antimicrobiana, mientras que los antibióticos de clase polimixina no conjugados mostraron una alta actividad antimicrobiana. La actividad antibacteriana de la colistina y la polimixina conjugadas con oligómero de alginato se conserva y, en algunos casos, se mejora. Esto contrasta marcadamente con los conjugados de colistina-dextrina descritos anteriormente unidos a través de grupos succinilo en los que los valores de MIC en realidad empeoran.

La actividad antimicrobiana fue máxima para los conjugados que contenían oligómeros de alginato de bajo peso molecular (incluido OligoG) conjugados con el antibiótico a través de un enlace éster. Los conjugados mostraron una variabilidad de lotes reproducible en la actividad antimicrobiana.

Lote 2

Valores de MIC (pg/ml) para cada compuesto probado frente a las bacterias pertinentes (n=3, mediana)

continuación

Lote 3

Valores de MIC (pg/ml) para cada compuesto probado frente a las bacterias pertinentes (n=3, mediana)

Lote 4

Valores de MIC (pg/ml) para cada compuesto probado frente a las bacterias pertinentes (n=3, mediana)

Lote 6

Valores de MIC (pg/ml) para cada compuesto probado frente a las bacterias pertinentes (n=3, mediana)

continuación

Cuando se evaluó la actividad antimicrobiana de los conjugados en presencia de AlgL o después de la preincubación con AlgL (Lote 3), no se observó ningún cambio significativo para los conjugados unidos a amida o éster (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la degradación de OligoG no es necesaria para la actividad antibiótica o que los oligómeros de alginato se descomponen por las enzimas bacterianas o las contenidas en el caldo de cultivo.

Las curvas de crecimiento bacteriano (Figs. 1-5) mostraron que los conjugados oligoméricos de alginato-colistina (Lote 2) retrasaron el crecimiento bacteriano de una manera dependiente de la concentración y ralentizaron la tasa de crecimiento en comparación con las bacterias no tratadas. Por otro lado, el sulfato de colistina solo mostró un nuevo crecimiento bacteriano más rápido. En general, en la mediana de los valores de MIC previamente determinados en todos los lotes, los conjugados de colistina-oligoG en general mostraron la inhibición más prolongada del crecimiento bacteriano, mientras que el sulfato de colistina mostró la inhibición más breve del crecimiento bacteriano (de hecho, equivalente al control sin antibiótico para V3 y V19). Los conjugados de oligoG-colistina inhibieron el crecimiento bacteriano durante un máximo de 48 h a > 2x MIC, mientras que el sulfato de colistina inhibe el crecimiento bacteriano durante un máximo de 48 h a > 8x MIC (es decir, se requirieron concentraciones equivalentes más altas de colistina para inhibir el crecimiento durante tanto tiempo como el conjugado de oligoG-colistina).

No hubo diferencia en el tiempo hasta el inicio del nuevo crecimiento bacteriano entre los conjugados de oligoG-colistina y los conjugados oligoméricos de alginato 2.5k-colistina, ni hubo diferencia entre los conjugados unidos a amida y éster. En conjunto, esto podría sugerir una liberación de colistina más estable y controlada de los conjugados que prolonga los efectos antibacterianos de la colistina.

La combinación de OligoG más colistina a concentraciones equivalentes a OligoG y colistina en los conjugados correspondientes mostró una inhibición del crecimiento dependiente de la concentración. Por lo general, la colistina que se conjugó covalentemente con OligoG mostró una actividad equivalente a la colistina no conjugada más OligoG en concentraciones equivalentes. OligoG o Pronova, a una concentración equivalente al OligoG en los conjugados OligoG-colistina (enlazados con amida y éster), no tuvieron un efecto significativo en la reducción del crecimiento bacteriano.

Ejemplo 4 - Modelado farmacocinético/farmacodinámico de conjugados de oligoG-polimixina

Se llevaron a cabo estudios para investigar los perfiles PK/PD de los conjugados de colistina-oligoG (lote 6) en comparación con la colistina no conjugada in vitro. Esto es particularmente importante en los sistemas de suministro de fármacos a nanoescala donde la incorporación de fármacos convencionales de molécula pequeña en estructuras de tamaño nanométrico se asocia con propiedades PK/PD que se alteran sustancialmente con respecto al fármaco original. Se empleó el sistema modelo previamente descrito en Azzopardi (supra).

Se simuló el desenmascaramiento de los conjugados de oligoG-colistina utilizando el modelo de bolsa de diálisis estática de dos compartimentos de Azzopardi en condiciones de sumidero infinito (volumen total, 20 ml; volumen del compartimento interno, 5 ml). La membrana de diálisis (límite de peso molecular de 10000 g/mol [MWCO]) se remojó previamente durante 15 a 30 min en agua destilada (dH²O), se aseguró con clips de diálisis y se suspendió de un puerto de inyección para separar el compartimento interno (IC) del compartimento exterior (OC) en un vaso de precipitados esterilizado de 25 ml sellado con una membrana estéril de poliuretano de grado médico (Tegaderm).

El sistema modelo se preparó en condiciones asépticas en una cabina de flujo de aire laminar de clase 2 y se transfirió a una incubadora con agitación a 37°C en aire ambiente y agitación orbital constante a 70 rpm durante 48 h. A las 0 h, se transfirió Acinetobacter baumanii (V19) en caldo Mueller-Hinton (5 * 105 UFC/ml) al OC y se cargó el IC con el agente en prueba (Lote 6) en PBS a MIC previamente determinado o al doble de dicho MIC (Ejemplo 3; Lote 6 - MIC de colistina: 0.25 pg/ml; MIC de colistina OligoG-E: 0.125 pg/ml; MIC de colistina OligoG-A: 0.125 pg/ml). Se recogieron muestras del OC en varios momentos y se caracterizaron mediante recuentos de colonias bacterianas (UFC/ml) utilizando el método de Miles y Misra.

Resultados

Los resultados se muestran en la Figura 6. El modelo PK/PD demostró que el sulfato de colistina, en su MIC previamente determinada (0.25 pg/ml) y el conjugado de oligoG-éster-colistina en 2x MIC (0.25 pg/ml) redujeron los recuentos de bacterias viables (~2 veces) después de 4 h y en general, los primeros perfiles PK/PD son esencialmente los mismos. No se observó actividad significativa con los conjugados OligoG-amida-colistina en MIC y 2x MIC. Estos resultados demuestran la capacidad de los conjugados enlazados a éster, pero no los conjugados enlazados a amida, para difundirse a través de la membrana de diálisis y ejercer actividad en el compartimento de la membrana externa en una medida y con un transcurso de tiempo similar a la colistina no conjugada. La falta de actividad observada con los conjugados enlazados de amida más estables sugiere que estos se retienen en el IC, mientras que los conjugados enlazados de éster más lábiles se degradan rápidamente, lo que permite que la colistina desenmascarada se difunda fuera del IC y ejerza sus efectos antibacterianos sobre las bacterias en el Co .

Ejemplo 5 - Medida de citotoxicidad in vitro: ensayo MTT

Se usó un ensayo MTT para evaluar la viabilidad celular en una estirpe celular de riñón humano (HK-2) (72 h de incubación). Las células HK-2 se sembraron en placas de microtitulación estériles de 96 pocillos (1 * 10⁵ células/ml) en 0.1 ml/pocillo de medio (K-SFM) que contenía L-glutamina, EGF y BPE. Se dejaron adherir durante 24 h. A continuación, se retiró el medio y se añadieron a las células una serie de concentraciones de compuestos de ensayo (esterilizados por filtración de 0.2 pm) disueltos en medio de cultivo fresco. Después de una incubación adicional de 67 h, se añadió a cada pocillo MTT, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (20 pl de una solución de 5 mg/ml en PBS) y se las células se incubaron durante 5 h más. A continuación, se eliminó el medio y los cristales de formazán precipitados se solubilizaron mediante la adición de DMSO de calidad óptica (100 pl) durante 30 min. La absorbancia se midió a 540 nm utilizando un lector de placas de microtitulación. La viabilidad celular se expresó como porcentaje de la viabilidad de las células de control no tratadas. Los valores de IC⁵⁰ se expresaron como media (n=18).

Resultados

La conjugación de OligoG disminuyó notablemente la toxicidad de colistina y polimixina B (Fig. 7). Los valores IC⁵⁰ resumidos a continuación representan la concentración del antibiótico (polimixina B, sulfato de colistina o metanosulfonato de colistina (CMS)) o el antibiótico dentro del conjugado requerido para inhibir el crecimiento de células HK2 a la mitad. OligoG se incluye como control.

Ejemplo 6 - Medida de citotoxicidad in vitro: liberación de TNFa de células HK2

Como citocina inflamatoria modelo implicada en la citotoxicidad de la polimixina, se midió mediante ELISA la liberación de TNFa de las células HK2 en respuesta a polimixinas y conjugados de oligoG-polimixina. Las células HK-2 se sembraron en placas de microtitulación estériles de 96 pocilios (1 * 105 células/ml) en 0.1 ml/pocillo de medio (K-SFM) que contenía L-glutamina, EGF y BPE. Se dejaron adherir durante 24 h. A continuación, se retiró el medio y se añadieron a las células una serie de concentraciones de compuestos de ensayo (esterilizados por filtración de 0.2 pm) disueltos en medio de cultivo fresco. Después de 72 h de incubación, las placas de microtitulación se centrifugaron (1500 rpm, 3 min) y el sobrenadante se transfirió a una nueva placa de microtitulación de 96 pocillos.

El ensayo ELISA de TNFa se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Thermo Scientific, ESS0001). Brevemente, se añadieron 100 pl de anticuerpo de recubrimiento (dilución 1:100 en PBS) a cada pocillo de la placa de microtitulación de 96 pocillos. La placa se cubrió con un sello de plástico y se incubó durante la noche a temperatura ambiente (22-25°C). Se aspiró la solución de anticuerpo de recubrimiento y se añadieron 300 pl de tampón de bloqueo (BSA al 4 %, sacarosa al 5 % en PBS) a cada pocillo y luego se incubó durante 1 h a temperatura ambiente (22-25°C) y se aspiró. Los estándares se reconstituyeron con diluyente de reactivo (BSA al 4 % en PBS, pH 7.4) según la etiqueta del vial y se diluyeron 1:2 para preparar la concentración del estándar superior (1000 pg/ml). Se realizaron diluciones dobles en serie por duplicado en las filas A y B de una placa de 96 pocillos (0, 3.9-1000 pg/ml). El sobrenadante de células HK-2 (diluido 1:1 en diluyente de reactivo, 100 pl) se añadió a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos y se incubó durante la noche a temperatura ambiente (22-25°C). La solución se aspiró y la placa se lavó tres veces con tampón de lavado (Tween-20 al 0.05 % en PBS, pH 7.4) utilizando 300 pl/pocillo. Luego, se agregaron a cada pocillo 100 pl de anticuerpo de detección (dilución 1:100 en diluyente de reactivo). La placa se incubó durante 1 h a temperatura ambiente (22-25°C) y se lavó tres veces con tampón de lavado, utilizando 300 pl/pocillo. A continuación, se añadieron 100 pl de Streptavidin-HRP (dilución 1:400 en diluyente de reactivo) a cada pocillo y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente (22-25°C) y luego se lavaron tres veces con tampón de lavado, usando 300 pl/pocillo. Se añadió solución de sustrato (100 pl) a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos y se incubó en la oscuridad durante 20 min a temperatura ambiente (22-25°C). La reacción se detuvo agregando 100 pl de solución de parada a cada pocillo. La absorbancia se midió a 450 nm menos 550 nm.

Las curvas estándar se generaron trazando la absorbancia media obtenida para cada concentración estándar en el eje vertical (Y) frente a la concentración de TNFa humano correspondiente (pg/ml) en el eje horizontal (X). La cantidad de TNFa humano en cada muestra se determinó interpolando desde el valor de absorbancia (eje Y) hasta la concentración de TNFa humano (eje X) usando la curva estándar. El valor interpolado obtenido de la curva estándar se multiplicó por el factor de dilución (x2) y se ajustó a la viabilidad celular para cada concentración de fármaco (resultados del ensayo MTT) para calcular pg/ml de TNFa humano en la muestra.

Resultados

Los resultados se muestran en la Figura 8. Como puede verse, la polimixina B y la colistina indujeron una mayor liberación de TNFa en comparación con los conjugados en los que la liberación de TNFa fue muy baja o indetectable, excepto OligoG-E-polimixina B, que mostró efectos similares a los de la colistina pero menores que los de la polimixina B. En general, OligoG la conjugación disminuyó notablemente la liberación de citocinas inflamatorias por parte de los antibióticos de la clase polimixina.

Ejemplo 7 - Interrupción del desarrollo de biopelículas

Métodos

Estos experimentos investigaron si los conjugados de oligoG-colistina podrían inhibir el desarrollo de biopelículas más eficazmente que las formas no conjugadas de colistina. En primer lugar, se prepararon soluciones madre de los compuestos de prueba a 1 mg/ml en caldo MH y se usaron para preparar un rango de concentraciones de antibiótico (2x MlC - MIC/8) usando diluciones dobles en caldo MH de una placa de 96 pocillos óptica de fondo de vidrio Greiner. (90 pl por pocillo). También se prepararon controles de esterilidad (100 pl de caldo MH) y crecimiento (90 pl de caldo MH más 10 pl de patógeno bacteriano analizado). Durante la noche se cultivaron cultivos bacterianos en caldo TS (TSB) y se diluyeron en caldo MH para lograr una OD625 de 0.5, luego se agregaron 10 pl a los pocillos. Las placas se envolvieron en parafilm y se incubaron durante 24 h en un balancín (20 rpm) a 37°C. Después de una incubación de 24 h, se eliminó cuidadosamente el sobrenadante de todos los pocillos y se agregaron 3 pl de tinción viva/muerta (kit de viabilidad bacteriana Baclight viva/muerta; preparado mezclando 1 pl de los componentes A y B en 1 ml de PBS). La placa se envolvió en papel de aluminio y se mantuvo en la oscuridad durante 15 min. Por último, se agregaron 47 pl de PBS a todos los pocillos analizados. La placa se envolvió en parafilm y se mantuvo en la oscuridad hasta que se analizó mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM), n=2.

Resultados

El conjugado de oligoG-colistina (Lote 5, OligoG-A-colistina (1)) interrumpió notablemente la formación de biopelículas de P. aeruginosa e indujo la muerte bacteriana a 2 * MIC (2 pg/ml) (Fig. 9). Incluso en su MIC (1 pg/ml), el conjugado de oligoG-colistina provocó la acumulación de bacterias y una estructura de biopelícula desorganizada, con presencia de células muertas. El sulfato de colistina, por otro lado, mostró solo un efecto pequeño en las biopelículas de P. aeruginosa, con un cambio muy leve en el espesor de la biopelícula a la concentración más alta, pero con muy poca muerte celular. Estos resultados indican que los conjugados de oligoG-colistina son significativamente más efectivos que la colistina para interrumpir una biopelícula en desarrollo y matar las bacterias residentes. Por lo que podrían ser considerados como agentes antibacterianos de utilidad en el combate de infecciones por biopelículas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un conjugado oligomérico de polimixina-alginato que comprende un antibiótico de clase polimixina conectado covalentemente a al menos un oligómero de alginato a través de un enlace covalente directo o un enlazador molecular covalente, en el que dicho oligómero de alginato tiene de 2-75 residuos de monómero, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato, hidrato, diastereoisómero, tautómero o enantiómero del mismo.

2. El conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la reivindicación 1, en el que dicho antibiótico de clase polimixina es

(i) seleccionados de polimixinas A1, A2, B1, B1-I, B2, B3, B4, B5, B6, C, D1, D2, E1, E2, F, K1, K2, M, P1, P2, S y T y derivados funcionalmente equivalentes de los mismos;

(ii) representado por la Fórmula II

en el que D-Leu es D-leucina; L-Leu es L-leucina; L-Thr es L-treonina y L-Dab es ácido a,Y-diaminobutírico y en el que ninguno, o uno o más, de los mismos se reemplaza por otro residuo de aminoácido que puede seleccionarse entre aminoácidos naturales o no codificados genéticamente, preferiblemente en el que dicho aminoácido natural o no codificado genéticamente se selecciona de leucina, treonina, ácido, fenilalanina, arginina, histidina, lisina, asparagina, serina, cisteína, homolisina, ornitina, ácido diaminobutírico (por ejemplo, ácido a,Y-diaminobutírico), ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiónico, homoarginina, trimetilisina, trimetilornitina, ácido 4-aminopiperidina-4-carboxílico, ácido 4-amino-1-carbamimidoilpiperidina-4-carboxílico y 4-guanidinofenilalanina; y/o

(iii) se selecciona de polimixina B1, B1-I, B2, E1 o E2.

3. El conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el oligómero de alginato tiene un grado de polimerización (DP) o un grado de polimerización promedio en número (DPⁿ) de

(i) 4 a 75, 4 a 50, 4 a 35, 4 a 30, 4 a 25, 4 a 22, 4 a 20, 4 a 18, 4 a 16 o 4 a 14,

(ii) 6 a 50, 6 a 35, 6 a 30, 6 a 25, 6 a 22, 6 a 20, 6 a 18, 6 a 16 o 6 a 14,

(iii) 8 a 50, 8 a 35, 8 a 30, 8 a 25, 10 a 25, 10 a 22, 10 a 20, 10 a 18 o 10 a 15, o

(iv) 20 a 75, 20 a 70, 20 a 65, 20 a 60, 20 a 55, 20 a 50, 20 a 45, 20 a 40, 20 a 35, 20 a 30 o 20 a 25, o

(v) 30 a 75, 30 a 70, 30 a 65, 30 a 60, 30 a 55, 30 a 50, 30 a 45, 30 a 40 o 30 a 35.

4. El conjugado oligomérico de polimixina-alginato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el oligómero de alginato tiene al menos 70 % de residuos G, o al menos 80 %, o al menos 85 %, o al menos 90 %, o al menos 95 % de residuos G, preferiblemente en el que al menos el 80 % de los residuos G están dispuestos en bloques G.

5. El conjugado oligomérico de polimixina-alginato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el oligómero de alginato tiene al menos 70 % de residuos M, o al menos 80 %, o al menos 85 %, o al menos 90 %, o al menos 95 % de residuos M, preferiblemente en el que al menos el 80 % de los residuos M están dispuestos en bloques M.

6. El conjugado oligomérico de polimixina-alginato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho enlace covalente directo es parte de un éster, éster de carbonato, ortoéster, cetal, hemicetal, éter, acetal, hemiacteal, peroxi, metilendioxi, amida, grupo funcional amina, imina, imida, azida, azo, oxima, sulfuro, disulfuro, sulfinilo, sulfonilo, carbonotioilo, tioéster, fosfina o fosfodiéster, preferiblemente en el que dicho enlace covalente directo es parte de un éster o una amida.

7. El conjugado oligomérico de polimixina-alginato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho enlazador covalente es o comprende grupos moleculares seleccionados de:

(i) un aminoácido o un péptido;

(ii) monosacárido o un oligosacárido que no sea guluronato o manuronato o polímeros formados a partir de los mismos; (iii) un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido;

(iv) un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido;

(v) un grupo acetilo, succinilo, aconitilo (cis o trans), glutarilo, metilsuccinilo, trimetilil cisteamina, penicilamina, N-(2-mercaptopropionil)glicina, ácido 2-mercaptopropiónico, homocisteína, ácido 3-mercaptopropiónico o desaminopenicilamina.

8. El conjugado oligomérico de polimixina-alginato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho enlace covalente directo, un grupo funcional que contiene dicho enlace covalente o dicho enlazador molecular covalente es

(i) ácido lábil;

(ii) sensible a especies reactivas de oxígeno; y/o

(iii) degradado por una enzima secretada por una bacteria o una célula inmunitaria.

9. El conjugado oligomérico de polimixina-alginato de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho conjugado consiste en

(i) al menos un oligómero de alginato unido covalentemente a un antibiótico de clase polimixina a través de un enlace éster formado por un grupo carboxilo en el alginato y un grupo hidroxilo en la polimixina, o

(ii) al menos un oligómero de alginato unido covalentemente a un antibiótico de clase polimixina a través de un enlace amida formado por un grupo carboxilo en el alginato y un grupo amina en la polimixina.

10. El conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la reivindicación 9, en el que el antibiótico de clase polimixina es una colistina (por ejemplo, polimixina E1 o E2) o una polimixina B (por ejemplo, polimixina B1, B1-I o B2).

11. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado oligomérico de polimixina-alginato como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

12. Un método para la preparación de un oligómero de polimixina-alginato como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, dicho método comprende

(ia) proporcionar un oligómero de alginato, en el que dicho oligómero de alginato tiene de 2-75 residuos de monómero, y un antibiótico de clase polimixina y formar un enlace covalente directo entre dos grupos moleculares del mismo; o (ib) proporcionar un oligómero de alginato, en el que dicho oligómero de alginato tiene 2-75 restos de monómero, un antibiótico de clase polimixina y un enlazador molecular covalente y formar un enlace covalente directo entre dos grupos moleculares en el oligómero de alginato y la molécula de enlace y formar un enlace covalente directo entre dos grupos moleculares en el antibiótico de clase polimixina y la molécula de enlace; o

(ic) proporcionar un oligómero de alginato, en el que dicho oligómero de alginato tiene de 2-75 residuos de monómero, y un antibiótico de clase polimixina en el que uno o ambos llevan una molécula de enlace molecular covalente unida covalentemente al mismo y enlazadas covalentemente el oligómero de alginato al antibiótico de clase polimixina a través de al menos una de las moléculas de enlace; y opcionalmente

(ii) separar al menos una parte del conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la mezcla de reacción.

13. El método de la reivindicación 12, dicho método comprende

(i) proporcionar una solución acuosa de un oligómero de alginato que tiene un grupo carboxilo disponible, en el que dicho oligómero de alginato tiene de 2-75 residuos de monómero;

(ii) poner en contacto dicha solución de alginato con clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) en una cantidad y en condiciones suficientes para activar al menos un grupo carboxilo en el oligómero de alginato; (iii) opcionalmente poner en contacto dicho oligómero de alginato activado con carboxilo con sulfo N-hidroxisuccinimida (sulfo-NHS) en una cantidad y en condiciones suficientes para formar un éster de sulfo-NHS reactivo con amina; (iv) poner en contacto dicho oligómero de alginato activado con carboxilo de la etapa (ii) o el éster de sulfo-NHS reactivo con amina de la etapa (iii) con un antibiótico de clase polimixina que tiene un grupo amino primario disponible en una cantidad y en condiciones suficientes para formar un enlace amida entre el oligómero de alginato y el antibiótico de clase polimixina; y

(v) separar al menos una parte del conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la mezcla de reacción.

14. El método de la reivindicación 12, dicho método comprende

(i) proporcionar una solución de un oligómero de alginato que tiene un grupo carboxilo disponible, en el que dicho oligómero de alginato tiene de 2-75 residuos de monómero, preferiblemente una solución orgánica (por ejemplo, DMF y/o DMSO);

(ii) poner en contacto dicha solución de alginato con diciclohexilcarbodiimida (DCC) en una cantidad y en condiciones suficientes para formar un intermedio de O-acilisourea;

(iii) poner en contacto dicho intermedio de O-acilisourea con un antibiótico de clase polimixina que tiene un grupo hidroxilo disponible y 4-N,N-dimetilaminopiridina (DMAP) en cantidades y en condiciones suficientes para formar un enlace éster entre el oligómero de alginato y el antibiótico de clase polimixina; y

(iv) separar al menos una parte del conjugado oligomérico de polimixina-alginato de la mezcla de reacción;

en el que las etapas (ii) y (iii) pueden realizarse simultáneamente.

15. Un conjugado oligomérico de polimixina-alginato como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 11 para usar en el tratamiento de prevención de una infección bacteriana, preferiblemente donde la infección bacteriana es

(i) una infección sistémica o una infección de múltiples lugares dentro o sobre el sujeto;

(ii) una infección respiratoria en un sujeto que padece un trastorno o afección respiratoria subyacente, preferentemente seleccionada de FQ, COPD/COAD o asma;

(iii) una infección relacionada con un dispositivo asociada con dispositivos médicos implantables o protésicos;

(iv) en una herida crónica; o

(v) una infección bacteriana Gram negativa.