ES2911268T3 - Preparación de conjugados de G6PDH mutante de múltiples haptenos y su uso para la detección de múltiples analitos - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende al menos dos miembros distintos de un par de unión específica (sbp) conjugados con una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa mutante (G6PDH), donde la G6PDH mutante se ha derivado de una G6PDH precursora mediante la inserción de al menos una cisteína por subunidad, o sustitución de al menos un aminoácido con cisteína por subunidad, en comparación con el precursor G6PDH, y donde al menos un primer miembro del par de unión específica se conjuga con dicha G6PDH mutante a través de un grupo tiol y donde al menos un par del miembro unión específica adicional se conjuga con la G6PDH mutante a través de un grupo amino.

Description

DESCRIPCIÓN

Preparación de conjugados de G6PDH mutante de múltiples haptenos y su uso para la detección de múltiples analitos

La presente invención se refiere a conjugados de G6PDH mutante de múltiples haptenos, métodos para su preparación y su uso para la detección de múltiples analitos.

En el campo del diagnóstico in vitro, los inmunoensayos homogéneos, como los ensayos de la técnica de inmunoensayo multiplicado por enzimas (EMIT por sus siglas en inglés), se utilizan para detectar analitos, en particular, drogas de abuso en muestras de sujetos que se van a analizar. Por ejemplo, los documentos US6455288, US6033890, US6090567 describen métodos para inmunoensayo de analitos que emplean enzimas glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) como marcadores.

El principio del ensayo EMIT® surge de la unión competitiva y la interacción entre un conjugado de análogo de analito con G6PDH y el analito libre en una muestra de paciente con el anticuerpo libre. Esto da como resultado una competencia entre el analito en la muestra y el analito o el análogo del analito marcado con glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) por los sitios de unión del anticuerpo. La actividad del conjugado enzimático disminuye al unirse al anticuerpo. El conjugado enzimático no unido convierte el dinucleótido de adenina nicotinamida oxidado (NAD+) en el reactivo de anticuerpo en NADH y el cambio en la absorbancia se puede medir espectrofotométricamente a 340 nm. La actividad de la enzima disminuye al unirse al anticuerpo, lo que permite medir las concentraciones de analito en una muestra en términos de actividad de G6PDH.

Los inmunoensayos EMIT® se han desarrollado para la detección de un fármaco individual o una clase de fármacos.

En muchos casos, es deseable poder detectar múltiples analitos con un solo ensayo. Esto es relevante, por ejemplo, al examinar sujetos para el uso de diferentes drogas o detectar simultáneamente una droga y sus metabolitos para aumentar la ventana de tiempo donde se puede detectar el uso de drogas.

El documento US 7560239 describe una composición donde diferentes analitos se conjugan con G6PDH a través de grupos amino en la molécula de G6PDH en una reacción de un solo paso. Sin embargo, la conjugación de dos analitos diferentes con G6PDH a través de la química de aminas no permite un control preciso de la proporción de los dos analitos diferentes y puede provocar una pérdida de actividad enzimática.

El documento US 2006/046273 A1 está dirigido a sistemas homogéneos de inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de analitos en muestras de fluidos orales y describe conjugados que comprenden una enzima unida covalentemente o acoplada a un analito. Además, este documento enseña el uso de un enlazador.

El documento US 3975 237 A está dirigido a ligandos unidos a enzimas y describe que el ligando puede estar unido a grupos amino u otros grupos como, por ejemplo, tioles. G6PDH se describe entre muchas otras enzimas posibles.

El documento US 3905 871 está dirigido a un método para determinar la presencia de un material orgánico específico mediante el empleo de una enzima para la amplificación. Según este documento, el compuesto a ensayar (ligando) está unido a una enzima. El análogo de ligando incluirá un ligando que se modifica reemplazando un protón con un grupo de enlace para unirse a la enzima o una falsificación de ligando que es un ligando modificado por algo que no sea el simple reemplazo de un protón. Además, este documento describe que el ligando se puede unir a la enzima a través de un conector que tiene un grupo amino o tiol.

El documento US 3 875 011 está dirigido a composiciones enzimáticas conjugadas para usar en inmunoensayos enzimáticos homogéneos y describe 6GPDH conjugado hapténico que tiene de 1 a 18 ligandos, en donde la mayoría o todos los ligandos están unidos a grupos amino de lisina.

Objeto de la invención

El problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar conjugados de G6PDH mejorados, métodos para su preparación y su uso para la detección de múltiples analitos.

Breve descripción de la invención

Debe señalarse que, como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes singulares y/o plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. También debe entenderse que las formas plurales incluyen referentes singulares y/o plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Además, debe entenderse que, en caso de que se den rangos de parámetros que estén delimitados por valores numéricos, se considera que los rangos incluyen estos valores de limitación.

La invención se refiere a una composición que comprende al menos dos miembros de un par de unión específico (sbp por sus siglas en inglés) distintos conjugados con una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa mutante (G6PDH), donde la G6PDH mutante se deriva de una G6PDH precursora mediante la inserción de al menos una cisteína por subunidad, o sustitución de al menos un aminoácido con cisteína por subunidad, en comparación con el precursor G6PDH, y donde al menos un primer miembro del par de unión específica se conjuga con dicha G6PDH mutante a través de un grupo tiol y donde al menos otro el miembro del par de unión específica se conjuga con la G6PDH mutante a través de un grupo amino.

La composición de la invención puede usarse para detectar tanto compuestos relacionados o similares como compuestos no relacionados o diferentes en un formato de inmunoensayo homogéneo. Por ejemplo, podría desearse detectar un fármaco y un analito de dicho fárma

detectarse en un sujeto. Por otro lado, podría desearse detectar simultáneamente una pluralidad de analitos no relacionados en un solo ensayo, por ejemplo, detección de una variedad de drogas para examinar a un sujeto por abuso de drogas. Por lo tanto, el primer par de unión y el siguiente pueden ser estructuralmente similares/relacionados o estructuralmente diferentes/no relacionados. Además, el primer par de unión y el adicional pueden ser serológicamente reactivos cruzados o no reactivos cruzados.

Según la invención, la G6PDH es una G6PDH mutante, derivándose la G6PDH mutante de una G6PDH precursora mediante la inserción de al menos una cisteína por subunidad, o sustitución de al menos un aminoácido con cisteína por subunidad, en comparación con el precursor G6PDH.

Se describe en el presente documento que la G6PDH es una G6PDH bacteriana derivada del género de bacteria seleccionado del grupo que consiste en Leuconostoc.

La G6PDH mutante que se puede usar en las composiciones y los métodos de la invención se describe en los documentos US6455288, US6033890 y US6090567.

De acuerdo con un aspecto de la invención, los dos miembros del par de unión distintos son serológicamente no reactivos cruzados.

De acuerdo con un aspecto de la invención, la composición comprende tres o más miembros de pares de unión específica (sbp) distintos conjugados con G6PDH.

De acuerdo con un aspecto de la invención, la composición comprende una pluralidad de miembros de pares de unión específica adicionales distintos conjugados con una pluralidad respectiva de grupos amino.

De acuerdo con un aspecto de la invención, la composición comprende una pluralidad de miembros del primer par de unión específica distintos conjugados con una pluralidad respectiva de grupos tiol.

De acuerdo con un aspecto de la invención, los miembros del primer y segundo par de unión específica se seleccionan del grupo que consiste en opio, analgésicos opioides, anfetaminas, cocaína, metadona, alcaloides, catecolaminas, metilendioxianfetaminas (MDMA, MDA y MDEA, etc.), PCP, propoxifeno, metacualona, barbitúricos, benzodiazepinas, antidepresivos tricíclicos, tranquilizantes, tetrahidrocannabinol, l Sd , ketamina, GHB y otras drogas de abuso, incluidos aminoácidos, hormonas y esteroides, buprenorfina y norbuprenorfina.

De acuerdo con un aspecto de la invención, la composición comprende un enlazador entre G6PDH y uno o ambos miembros del par de unión específica y miembros adicionales del par de unión específica.

El enlazador generalmente comprende una cadena de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 átomos, por ejemplo, de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 átomos, o, por ejemplo, de aproximadamente 4 a aproximadamente 7 átomos, cada uno seleccionado independientemente del grupo que normalmente consta de carbono, oxígeno, azufre, nitrógeno, halógeno y fósforo, etc. El grupo de unión puede ser alifático o aromático. Cuando hay heteroátomos presentes, el oxígeno normalmente estará presente como oxo o éter unido al carbono; el azufre suele estar presente como tioéter u otra funcionalidad que corresponde a una funcionalidad de oxígeno análoga; el nitrógeno suele estar presente como nitro, nitroso o amino, normalmente unido al carbono; el fósforo suele estar unido a carbono, azufre, oxígeno o nitrógeno, normalmente como fosfonato y fosfato mono o diéster. Las funcionalidades comunes en la formación de un enlace covalente entre el enlazador y la molécula a conjugar, a saber, enzima o analito, incluyen alquilamina, amidina, tioamida, éter, urea, tiourea, halógeno, isotiocianato, guanidina, azo, tioéter y carboxilato, sulfonato, y ésteres de fosfato, amidas y tioésteres.

La invención además se relaciona con un método para producir una composición de la invención, que comprende los pasos de:

conjugar un primer miembro del par de unión específica a una G6PDH mutante a través de un grupo tiol, donde la G6PDH mutante se deriva de una G6PDH precursora mediante la inserción de al menos una cisteína por subunidad, o la sustitución de al menos un aminoácido con cisteína por subunidad, en comparación con el precursor G6PDH; y luego conjugar al menos otro miembro del par de unión específica a G6PDH a través de un grupo amino.

De acuerdo con un aspecto de la invención, el paso de conjugar incluye proporcionar un enlazador entre G6PDH y uno o ambos miembros del par de unión específica y miembro adicional del par de unión específica.

La invención se refiere además a un método para detectar un primer analito y otro analito en una muestra, que comprende los pasos de:

(i) combinar en un medio líquido:

(a) dicha muestra,

(b) una composición que comprende G6PDH mutante, donde la G6PDH mutante se deriva de una G6PDH precursora mediante la inserción de al menos una cisteína por subunidad, o la sustitución de al menos un aminoácido con cisteína por subunidad, en comparación con la G6PDH precursora, y donde una el primer miembro del par de unión específica se conjuga con la G6PDH mutante a través de un grupo tiol y otro miembro del par de unión específica se conjuga con la G6PDH mutante a través de un grupo amino,

(c) un primer anticuerpo capaz de unirse al primer miembro del par de unión específica,

(d) un anticuerpo adicional capaz de unirse al miembro del par de unión específica adicional, y

(e) un sustrato para dicha G6pDH mutante; y

(ii) determinar la actividad enzimática de dicha G6PDH mutante en dicho medio.

La actividad enzimática se puede determinar utilizando un sistema de producción de señales adecuado.

Los analitos de interés incluyen, pero no se limitan a, fármacos, metabolitos, pesticidas, contaminantes y similares. Entre las drogas de interés se incluyen los alcaloides. Entre los alcaloides se encuentran los alcaloides de morfina, que incluye morfina, codeína, heroína, dextroanfetamina, sus derivados y metabolitos; alcaloides de la cocaína, que incluyen cocaína y benzoil ecgonina, alcaloides del cornezuelo del centeno, que incluyen la dietilamida del ácido lisérgico; alcaloides de esteroides; alcaloides de iminazoilo; alcaloides de quinazolina, alcaloides de isoquinolina; alcaloides de quinolina, que incluyen quinina y alcaloides de quinidina y diterpina. Los analitos de particular interés incluyen opio, analgésicos opioides, anfetaminas, cocaína, metadona, alcaloides, catecolaminas, metilendioxianfetaminas (MDMA, MDA y MDEA, etc.), PCP, propoxifeno, metacualona, barbitúricos, benzodiazepinas, antidepresivos tricíclicos, tranquilizantes, tetrahidrocannabinol, LSD, ketamina, GHB y otras drogas de abuso, incluidos aminoácidos, hormonas y esteroides, buprenorfina, norbuprenorfina.

Definiciones

Antes de continuar con la descripción de las realizaciones específicas de la invención, se definirán una serie de términos. A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención.

En el contexto de la presente invención, un analito es un compuesto o composición a medir, el material de interés. El analito es un miembro de un par de unión específica (sbp) y puede ser un ligando, que es monovalente o polivalente, generalmente antigénico o hapténico, y es un compuesto único o una pluralidad de compuestos que comparten al menos un sitio epitópico o determinante común.

En el contexto de la presente invención, una muestra de la que se sospeche razonablemente que contiene un analito puede analizarse mediante el método de la presente invención. Tales muestras pueden incluir muestras humanas, animales o hechas por el hombre. La muestra se puede preparar en cualquier medio conveniente que no interfiera con el ensayo. Típicamente, la muestra es una solución acuosa o un fluido natural, preferiblemente orina, sangre completa, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo o saliva, más preferiblemente suero. La fuente de muestra también puede ser cabello o tejido.

El término glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o "G6PDH" se refiere a la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que puede obtenerse de fuentes naturales, como levaduras, bacterias, en forma nativa o mutacional o prepararse mediante métodos recombinantes.

Un "precursor G6PDH" significa una enzima G6PDH de origen natural, así como una enzima G6PDH recombinante que tiene una secuencia sustancialmente idéntica a una G6PDH de origen natural.

La secuencia de aminoácidos de un mutante de G6PDH se deriva de la secuencia de aminoácidos de G6PDH precursora mediante la sustitución o eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora o la inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos precursora. Dicha modificación se puede lograr mediante la modificación recombinante de la secuencia de ADN precursora que codifica la secuencia de aminoácidos de la G6PDH precursora en lugar de la manipulación de la enzima G6PDH precursora per se. Las técnicas de ingeniería de ADN recombinante son conocidas en la técnica.

En el contexto de la presente invención, medir la cantidad de un analito comprende métodos cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos, así como todos los demás métodos para determinar el analito. Por ejemplo, se considera que está incluido dentro del alcance de la presente invención un método que simplemente detecta la presencia o ausencia de un analito en una muestra sospechosa de contener un analito. Los sinónimos de la frase "medir la cantidad de analito" que se contemplan dentro del alcance de la presente invención incluyen, entre otros, detección, medición o determinación del analito; detectar, medir o determinar la presencia de analitos; y detectar o determinar la cantidad de analito.

En el contexto de la presente invención, un miembro de un par de unión específica (miembro sbp) es una de dos moléculas diferentes, que tiene un área en la superficie o en una cavidad que se une específicamente y, por lo tanto, se define como complementaria con una organización polar y espacial particular de la otra molécula. Los miembros del par de unión específica se denominan ligando y receptor (antiligando), miembro del sbp y pareja del sbp, o similares. Estos serán normalmente miembros de un par inmunológico tal como antígeno-anticuerpo.

Un ligando es cualquier compuesto orgánico para el que existe de forma natural o puede prepararse un receptor. Por ejemplo, en un contexto de la presente invención, el analito es un ligando y la presente invención proporciona métodos para determinar la concentración del analito que es un ligando.

Un análogo de un ligando, de un analito o de un miembro de un par de unión específica (miembro de sbp) es un ligando modificado o sustituto de ligando, analito modificado o sustituto de analito, o miembro de sbp modificado o sustituto de miembro de sbp que puede competir con el ligando análogo, analito o miembro de sbp para un receptor, antiligando, compañero de sbp o similar, proporcionando la modificación medios para unir un análogo de ligando, análogo de analito o análogo de miembro de sbp a otra molécula. El análogo del ligando, el análogo del analito o el miembro del sbp generalmente diferirá del ligando, analito o miembro del sbp en más que el reemplazo de un hidrógeno con un enlace que une el ligando análogo, el análogo del analito o el miembro del sbp a un concentrador o etiqueta, pero no es necesario.

Un receptor es cualquier compuesto o composición capaz de reconocer una organización espacial y polar particular de una molécula. Estas áreas organizadas de una molécula se denominan sitios epitópicos o determinantes. Los receptores de origen natural ilustrativos incluyen anticuerpos y enzimas.

Un enlazador o un grupo de enlace es una parte de una estructura que conecta 2 o más subestructuras. Un grupo de enlace tiene al menos una cadena ininterrumpida de átomos que se extiende entre las subestructuras. Los átomos de un grupo de enlace están conectados por enlaces químicos.

Un conjugado es una molécula compuesta por dos o más subestructuras unidas entre sí, opcionalmente a través de un grupo de enlace, para formar una sola estructura. La unión se puede realizar mediante una conexión directa (por ejemplo, un enlace químico) entre las subunidades o mediante el uso de un grupo de enlace. Dentro del contexto de la presente invención, un conjugado es una enzima G6PDH unida a un hapteno, miembro de sbp o análogo de analito.

La conjugación es cualquier proceso donde dos fracciones, estructuras químicas o moléculas se unen para formar un conjugado. El proceso de conjugación puede comprender cualquier número de pasos.

Los haptenos son capaces de unirse específicamente a los anticuerpos correspondientes, pero normalmente no actúan por sí mismos como inmunógenos para la preparación de los anticuerpos. Los anticuerpos que reconocen un hapteno se pueden preparar contra compuestos comprendidos por el hapteno unido a un vehículo inmunogénico.

El sistema de producción de señales se utiliza en ensayos de analitos y puede tener uno o más componentes, siendo al menos un componente una G6PDH mutante. El sistema de producción de señales genera una señal que se relaciona con la presencia o cantidad de analito en una muestra. El sistema de producción de señales incluye todos los reactivos necesarios para producir una señal medible.

Otros componentes del sistema productor de señales pueden incluir sustratos, potenciadores, activadores, compuestos quimioluminiscentes, cofactores, inhibidores, secuestrantes, iones metálicos, sustancias de unión específicas requeridas para la unión de sustancias generadoras de señales, coenzimas, sustancias que reaccionan con productos enzimáticos, otras enzimas y catalizadores, y similares.

El sistema de producción de señales proporciona una señal detectable por medios externos, normalmente por medición de radiación electromagnética, deseablemente por examen visual. En su mayor parte, el sistema de producción de señales incluye un sustrato cromóforo y la enzima G6PDH mutante de la invención, donde los sustratos cromóforos se convierten enzimáticamente en colorantes que absorben luz en la región ultravioleta o visible.

Con frecuencia se emplearán varios materiales auxiliares en un ensayo de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, normalmente habrá tampones en el medio de ensayo, así como estabilizadores para el medio de ensayo y los componentes del ensayo. Con frecuencia, además de estos aditivos, se pueden incluir proteínas adicionales, como albúminas o tensioactivos, particularmente tensioactivos no iónicos, potenciadores de la unión, por ejemplo, polialquilenglicoles o similares.

Descripción detallada de la invención

Detalles adicionales, prestaciones, características y ventajas del objeto de la invención se exponen con más detalle en la siguiente descripción y figuras de los respectivos ejemplos, que a modo de ejemplo muestran realizaciones preferentes de la presente invención. Sin embargo, estos ejemplos no deben entenderse en modo alguno como limitantes del alcance de la invención.

En las figuras adjuntas,

La Fig. 1 muestra esquemáticamente la estructura química de realizaciones de composiciones según la invención,

La Fig. 2 muestra la estructura de los analitos ejemplares MDMA, MDA y MDEA,

La Fig. 3 muestra un esquema de síntesis de ejemplo para obtener una realización de una composición de acuerdo con la invención, que muestra la síntesis del conjugado de MDA/anfetamina G6PDH mutante (7),

La Fig. 4 muestra un esquema de síntesis de ejemplo para obtener una realización de una composición de acuerdo con la invención, que muestra la síntesis del conjugado de MDA/ metanfetamina G6PDH mutante (9)

La Fig. 5 muestra un esquema de síntesis de ejemplo para obtener una realización de una composición de acuerdo con la invención, que muestra la síntesis del conjugado de MDA/anfetamina/metanfetamina G6PDH mutante (10),

La Fig. 6 muestra una curva de respuesta para la detección de éxtasis, MDA, MDEA, metanfetamina y anfetamina utilizando una composición según la invención.

La Fig. 7 muestra una curva de respuesta para la detección de éxtasis, MDA, MDEA, metanfetamina y anfetamina utilizando una composición según la invención.

La Fig. 8 muestra una curva de respuesta para la detección de éxtasis, MDA, MDEA, metanfetamina y anfetamina utilizando una composición según la invención.

Los inmunoensayos enzimáticos homogéneos dependen de la disponibilidad de conjugados enzima-miembro del sbp cuya actividad enzimática se puede modular fuertemente con la unión de la pareja del sbp. La presente invención proporciona conjugados enzima-miembro de sbp que pueden unirse y detectar múltiples analitos diferentes para realizar ensayos que son útiles en inmunoensayos homogéneos.

Las composiciones de la invención con capacidad de detección múltiple en formato EMIT® necesitan satisfacer algunas condiciones básicas: 1) es necesario inmovilizar diferentes tipos de haptenos (moléculas) en la G6PDH para formar un conjugado multi-hapteno-G6PDH; 2) el conjugado multi-hapteno-G6PDH necesita ser reconocido por su(s) anticuerpo(s) correspondiente(s) para generar inhibición enzimática y por lo tanto detección de múltiples fármacos; 3) el conjugado multi-hapteno-G6PDH debería conservar su actividad enzimática. Con base en estas condiciones, se seleccionó la G6PDH mutante como una excelente plantilla para hacer el nuevo conjugado multi-hapteno-G6PDH. Los grupos funcionales tiol y amina en G6PDH se utilizan para la inmovilización de diferentes haptenos.

Una G6PDH mutante adecuada, por ejemplo, es la G6PDH de Leuconostoc mesenteroides (por ejemplo, ATCC 12291) que porta una o varias de las siguientes mutaciones:

Ala-45-Cys

Arg-46-Cys

Gln-47-Cys

Ala-48-Cys

Leu-49-Cys

Asn-50-Cys

Asp-51-Cys

Asp-52-Cys

Glu-53-Cys

Phe-54-Cys

Lys-55-Cys

Gln-56-Cys

Leu-57-Cys

Val-58-Cys

Arg-59-Cys

Asp-60-Cys

Lys-128-Cys

Lys-182-Cys

La secuencia completa de aminoácidos de la G6PDH de tipo silvestre de Leuconostoc mesenteroides se proporciona a continuación y en las referencias 12, 13 y 14:

VSEIRTLVTF FGGTGDLAKR KLYPSVFNLY KKGYLQKHFA IVGTARQALN

DDEFKQLVRD SIKDFTDDQA QAEAFIEHFS YRAHDVTDAA SYAVLKEAIE

EAADKFDIDG NRIFYMSVAP RFFGTIAKYL KSEGLLADTG YNRLMIEKPF

GTSYDTAAEL QNDLENAFDD NQLFRIDHYL GKEMVQNIAA LRFGNPIFDA

AWNKDYIKNV QVTLSEVLGV EERAGYYDTA GALLDMIQNH TMQIVGWLAM

EKPESFTDKD IRAAKNAAFN ALKIYDEAEV NKYFVRAQYG AGDSADFKPY

LEELDVPADS KNNTFIAGEL QFDLPRWEGV PFYVRSGKRL AAKQTRVDIV

FKAGTFNFGS EQEAQEAVLS IIIDPKGAIE LKLNAKSVED AFNTRTIDLG

WTVSDEDKKN TPEPYERM1H DTMNGDGSNF ADWNGVSIAW KFVDAISAVY

TADKAPLETY KSGSMGPEAS DKLLAANGDA WVFKG

Por analogía, otras formas mutantes adecuadas de G6PDH se derivan de otras cepas de Leuconostoc mesenteroides, de cepas de Leuconostoc citreum (p. ej., cepa NCIMB 3351), Leuconostoc lactis (p. ej., cepa NCDO 546) y Leuconostoc dextranicum (p. ej., cepa ATCC 19255). Las mutaciones adecuadas incluyen la inserción de al menos una cisteína por subunidad, o la sustitución de al menos un aminoácido con cisteína por subunidad, en comparación con el precursor G6PDH. En particular, las formas mutantes adecuadas de G6PDH incluyen mutaciones donde un aminoácido respectivo en una molécula precursora de G6PDH derivada de Leuconostoc se sustituye por cisteína en cualquiera de las posiciones 45 a 60.

La formulación del reactivo es una reacción de dos pasos. En primer lugar, se unen dos haptenos a la G6PDH (Esquemas 1-3) utilizando la química del tiol de forma controlada. En segundo lugar, se pueden inmovilizar diferentes tipos de haptenos utilizando la química de las aminas. Nuestros enfoques son diferentes de los del conjugado multi-hapteno existente (referencia 11) donde solo se utilizó química de amina. Según los datos existentes, el uso de grupos funcionales de amina para la inmovilización de haptenos podría conducir a una reducción de la actividad enzimática. Esto significa que solo se pueden usar grupos amino limitados para la unión de haptenos a fin de mantener una buena actividad enzimática para el formato EMIT®. En consecuencia, el uso de la química de aminas solo para la preparación del conjugado multi-hapteno-G6PDH podría limitar la cantidad de hapteno en el conjugado para mantener una buena actividad enzimática.

En nuestros enfoques, se preparó G6PDH mutante de múltiples haptenos utilizando los grupos de función tiol en la enzima como el primer paso de la reacción. El conjugado resultante retiene la mayor parte de su actividad enzimática (>95%). Esto podría ser una ventaja ya que se pueden unir más haptenos a los grupos amino en el segundo paso de la reacción, mientras se mantiene una buena actividad enzimática. Por lo tanto, la aplicación de la química de tiol y amina en la preparación de G6PDH de múltiples haptenos debería dar como resultado un conjugado que tenga una mayor capacidad de carga de hapteno para la detección de múltiples analitos. Sin pretender limitarse a esta teoría, el efecto beneficioso de utilizar la química del tiol en estas composiciones y métodos de la invención podría explicarse como sigue: La utilización de la química del tiol para preparar la composición podría dar como resultado una composición más estable. Pueden usarse residuos de cisteína que estén distanciados del sitio activo de la enzima e. En ese sentido, la conjugación de hapteno a través del enlace de cisteína puede tener poco o ningún impacto en la estabilidad de la estructura cuaternaria activa que es crucial para la actividad enzimática. Esto está respaldado por la observación de que los conjugados de G6PDH mutante-hapteno retienen una actividad enzimática muy buena.

Hay muchos analitos, por ejemplo, fármacos, que se pueden usar para preparar G6PDH-multi-hapteno y probar su rendimiento. Se seleccionaron como analitos ejemplares tres drogas de las que se abusa mucho, la anfetamina, la metanfetamina y el éxtasis. Con esto en mente, se preparó G6PDH-multi-hapteno (7, 9, 10) como se describe en los Esquemas 1-3 y la sección experimental. Se utilizaron dos G6PDH-multi-hapteno (7, 9) para investigar su capacidad de detección de múltiples fármacos en el formato EMIT®. Los resultados se discutieron en la siguiente sección.

En estos enfoques, se preparó G6PDH mutante-multi-hapteno utilizando los grupos de función tiol en la enzima como reacción de primer paso. El conjugado resultante retiene la mayor parte de su actividad enzimática (>95%). Esto podría ser una ventaja en el sentido de que se pueden unir más haptenos a los grupos amino en el segundo paso de la reacción, mientras se mantiene una buena actividad enzimática. Por lo tanto, la aplicación de la química de tiol y amina en la preparación de G6PDH-multi-hapteno debería dar como resultado un conjugado que tenga más capacidad de carga de hapteno para la detección de múltiples analitos.

Principio de ensayo EMIT®:

El ensayo Emit® II Plus es un inmunoensayo enzimático homogéneo. Se basa en la competencia entre el fármaco de la muestra y el fármaco marcado con glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) para los sitios de unión del anticuerpo. La actividad del conjugado enzimático disminuye al unirse al anticuerpo. El conjugado enzimático no unido convierte el dinucleótido de nicotinamida (NAD) y adenina oxidado en el reactivo de anticuerpo en NADH y el cambio en la absorbancia se puede medir espectrofotométricamente a 340 nm. La actividad de la enzima disminuye al unirse al anticuerpo, lo que permite medir las concentraciones de analito en una muestra en términos de actividad de G6PDH.

La prueba se lleva a cabo usando el analizador SYVA®30-R Syva-30R, S/N A3562011, disponible de Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark DE. El instrumento se emplea utilizando la tecnología de inmunoensayo EMIT®. En la realización del método EMIT® utilizado en este documento y discutido con más detalle a continuación, la competencia entre el éxtasis y/o los análogos de anfetamina/metanfetamina en los conjugados de G6PDH y las drogas libres en muestras de pacientes por los sitios de unión de anticuerpos se utiliza para determinar la cantidad de éxtasis y/o anfetamina/metanfetamina en muestras de pacientes. La actividad enzimática del conjugado libre se mide y es directamente proporcional a la cantidad de fármacos en la muestra del paciente.

Resultados del ensayo EMIT®:

Conclusión: Se prepararon con éxito conjugados de G6PDH multihapteno (7, 9, 10) usando G6PDH mutante con química de tiol y amina. Los conjugados multihapteno (7, 9) se usaron para producir curvas de respuesta para el multianalito de anfetamina, metanfetamina, MDMA, m De y MDEA. La respuesta de cada fármaco se puede modular cambiando las proporciones de conjugado. Este concepto se puede aplicar a cualquier formato de detección de múltiples analitos, incluido el formato EMIT®.

Sección experimental:

Reactivos

1) Reactivo de anticuerpos: Los anticuerpos de anfetamina, metanfetamina y éxtasis se formularon en el diluyente del reactivo 1 de anticuerpo añadiendo concentraciones de 45 ug/mL, 7 ug/mL y (1:250) respectivamente.

2) Reactivo conjugado 2: Los lotes de conjugado #7 y #9 (50:50) se formularon por separado en el diluyente del reactivo 1 a una Rmax de 750 mA/min. Las soluciones de conjugado se mezclaron en diferentes proporciones (Vol: Vol).

3) Estándares/Calibradores: Se prepararon estándares de anfetaminas, metanfetaminas, éxtasis (MDMA), MDA y MDEA en concentraciones de 0-1000 ng/mL

4) Protocolo:

Reactivo de anticuerpo 1 = 210 uL,

Reactivo conjugado 2 = 90 uL

Tamaño de muestra =5 uL

Primera longitud de onda: 340 nm

Segunda longitud de onda: 412 nm

Instrumento: Analizador Syva-30-R S/N A3562011

Preparación de G6PDH mutante (1)

La G6PDH mutante (1) se inventó y preparó como se describe en las referencias 1-3.

Preparación del conjugado MDA-G6PDH mutante (3)

El hapteno (2) y su conjugado G6PDH mutante (3) se prepararon como se describe en la referencia 4.

Preparación de conjugado de G6PDH mutante MDA/anfetamina (7)

Funcionalización del conjugado G6PDH (3)

El conjugado de MDA-G6PDH (3) en tampón de fosfato de sodio de pH 7,0 (5 ml a 1 mg/ml) se intercambia en tampón tres veces en una celda de ultrafiltración agitada (10 ml) con tampón TrisHCl 55 mM, pH 8,0. La enzima final recolectada es 1,0 mL con una concentración de 5,0 mg/mL. Al conjugado de G6pDH intercambiado en tampón a 4 °C se añaden hidrato de sal disódica de 6-fosfato de D-glucosa (Sigma, G7250, 30 mg) y NADH (sal disódica de p-NADH, USB, cat.

15345, 30 mg), se comprueba el pH de la solución y se encuentra que es 8. A esta solución se le añaden 50 pL de bromoacetato de succinimidilo (4, Molecular Bioscience, Cat. 22080, peso molecular: 237,0, 5 mg/mL en DMF) en un baño de agua con hielo. La solución enzimática se agita en una cámara frigorífica durante 45 minutos y luego se dializa con 1 L de tampón Tris HCl 55 mM, pH 8,0, intercambiado con tampón nuevo cinco veces con tres horas entre cada tampón nuevo. La solución de enzima dializada (5) recogida es de 2,1 ml con una concentración de 2,45 mg/ml.

Reducción del enlazador de hapteno de anfetamina con TCEP

Se desgasifican 30 ml de carbitol (éter monoetílico de dietilenglicol, Sigma, D1265-1L) y 20 ml de tampón de acetato de sodio 20 mM pH 4,5 burbujeando nitrógeno a través de cada solución durante 15 minutos antes de añadir el hapteno de anfetamina. Al hapteno de anfetamina (MW 314,47, 10,4 mg) en un matraz pequeño se le añade carbitol desgasificado (0,4368 ml) y acetato de sodio (20 mM, pH 4,5, 0,2184 ml). La mezcla de reacción se agita en atmósfera de nitrógeno. Se añade TCEP HCl (Sigma, C4706, PM 286,65, 11,8 mg, 1,24 equivalentes de hapteno de anfetamina) a la solución de hapteno de anfetamina. El progreso de la reacción se controla por TLC (10,5 ml de CH2Ch/4 ml de MeOH/0,25 ml de ácido acético) y el producto (6) es una mancha menos polar que la del hapteno de la anfetamina y se tiñe de amarillo brillante con el reactivo de Ellman. La reacción termina en una hora.

Conjugado de MDA G6PDH con anfetamina

El conjugado desactivado de MDA-G6PDH (5) se burbujea con nitrógeno durante 30 minutos en un baño de agua helada, se agrega anfetamina-SH hapteno (6, 117 j l) al conjugado en un baño de agua helada gota a gota a través de una jeringa bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agita en una cámara frigorífica durante la noche. El conjugado de MDA-G6PDH-anfetamina se carga en una columna G-50 Sephadex® preequilibrada con tampón Tris HCl 55 mM (0,1 % NaN3, pH 8,0), eluida con el mismo tampón. Las fracciones que contienen el conjugado (7) se agrupan y la concentración de la proteína se determina mediante UV a 280 nm. Se determina que la concentración del conjugado (7) es de 0,43 mg/ml (11,7 ml) por absorbancia a 280 nm.

Preparación del conjugado de MDA/metanfetamina G6PDH mutante (9):

Funcionalización del conjugado G6PDH (3)

El conjugado de MDA-G6PDH (3) en tampón de fosfato de sodio de pH 7,0 (4,6 ml a 1 mg/ml) se intercambia en tampón tres veces en una celda de ultrafiltración agitada (10 ml) con tampón Tris.HCl 55 mM, pH 8,0. La enzima final recogida es de 0,9 ml con una concentración de 5,0 mg/ml. Al conjugado de G6pDH intercambiado en tampón a 4 °C se añaden hidrato de sal disódica de 6-fosfato de D-glucosa (Sigma, G7250, 27,6 mg) y NADH (sal disódica de p-NADH, USB, cat.

15345, 27,6 mg), se comprueba el pH de la solución y se encuentra alrededor de 8. A esta solución se añaden 46,0 ml de bromoacetato de succinimidilo (4, Molecular Bioscience, Cat. 22080, peso molecular: 237,0, 5 mg/mL en DMF) en un baño de agua con hielo. La solución enzimática se agita en una cámara frigorífica (4 °C) durante 45 minutos y se dializó con 1 L de tampón Tris HCl 55 mM, pH 8,0, intercambiado con tampón nuevo cinco veces con tres horas entre cada tampón nuevo. La solución de enzima dializada (5) recogida es de 2,5 ml con una concentración de 2,44 mg/ml.

Reducción de metilanfetamina hapteno enlazador con TCEP

Se desgasifican 30 ml de carbitol (éter monoetílico de dietilenglicol, Sigma, D1265-1L) y 20 ml de tampón de acetato de sodio 20 mM, pH 4,5, burbujeando nitrógeno durante 15 minutos antes de añadir el hapteno de metil anfetamina. Al hapteno de metilanfetamina (MW 360,58, 11,9 mg) en un matraz pequeño de fondo redondo se añaden carbitol desgasificado (0,4998 ml) y acetato de sodio (20 mM, pH 4,5, 0,2499 ml). La mezcla de reacción se agita en atmósfera de nitrógeno. Se añade TCEP HCl (Sigma, C4706, PM 286,65, 12,77 mg, 1,35 equivalentes de metil anfetamina hapteno) a la solución de metil anfetamina hapteno. El progreso de la reacción se controla por TLC (10,5 ml de CH2Ch/4 ml de MeOH/0,25 ml de ácido acético) y el producto (8) es una mancha menos polar que la del hapteno de metilanfetamina y se tiñe de amarillo brillante con el reactivo de Ellman. La reacción termina en una hora.

Conjugado de MDA G6PDH con metil anfetamina

El conjugado desactivado de MDA-G6PDH (5, 2,25 ml) se burbujea con nitrógeno durante 30 minutos en un baño de agua helada, se agrega metil anfetamina-SH hapteno (8, 155 ml) al conjugado en un baño de agua helada gota a gota a través de una jeringa bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agita en una cámara frigorífica (4 °C) durante la noche. El conjugado de MDA-G6PDH-metil anfetamina se carga en una columna G-50 Sephadex® preequilibrada con tampón Tris HCl 55 mM (0,1% NaN3, pH 8,0), eluida con el mismo tampón. Las fracciones que contienen el conjugado (9) se agrupan y se determina que la concentración de la proteína es de 0,48 mg/ml (8,88 ml) mediante UV a 280 nm.

Preparación de conjugado de MDA/anfetamina/metanfetamina G6PDH mutante (10):

Funcionalización del conjugado G6PDH (3)

El conjugado MDA-G6PDH (3) en tampón de fosfato de sodio pH 7,0 (15 ml a 1 mg/ml) se intercambia en tampón en una celda de ultrafiltración agitada (50 ml) con tampón Tris.HCl 55 mM, pH 8,0 tres veces. La enzima final recolectada es de 3,0 mL con una concentración de 5,0 mg/mL. Al conjugado de G6pDH intercambiado en tampón a 4 °C se añaden hidrato de sal disódica de 6-fosfato de D-glucosa (Sigma, G7250, 90,2 mg) y NADH (sal disódica de p-NADH, USB, cat. 15345, 90,1 mg), se comprueba el pH de la solución y se encuentra alrededor de 8. A esta solución de conjugado de G6PDH se le añaden 150,0 jL de bromoacetato de succinimidilo (4, Molecular Bioscience, Cat. 22080, peso molecular: 237,0, 5 mg/mL en DMF) en un baño de agua con hielo. La solución se agita en cámara frigorífica (4 °C) durante 45 minutos. La solución enzimática se dializa con 1 L de tampón Tris HCl 55 mM, pH 8,0, intercambiado con tampón fresco cinco veces con tres horas entre cada tampón fresco. La solución de enzima dializada (5) recogida es de 6,7 ml con una concentración de 4,52 mg/ml.

Reducción de enlazadores de hapteno de metilanfetamina/ anfetamina con TCEP

Se desgasifican 30 ml de carbitol (éter monoetílico de dietilenglicol, Sigma, D1265-1L) y 30 ml de tampón de acetato de sodio 20 mM, pH 4,5, burbujeando nitrógeno durante 15 minutos antes de añadir el hapteno. Al hapteno de metilanfetamina (MW 360,58, 10,4 mg) en un matraz pequeño de fondo redondo se añaden carbitol desgasificado (0,4368 ml) y acetato de sodio (20 mM, pH 4,5, 0,2184 ml). La mezcla de reacción se agita en atmósfera de nitrógeno. TCEP HCl (Sigma, C4706, PM 286,65, 11,16 mg, 1,35 equivalente de metil anfetamina hapteno) se agrega a una solución de hapteno metil anfetamina. El progreso de la reacción se controla por TLC (10,5 ml de CH2Ch/4 ml de MeOH/0,25 ml de ácido acético) y el producto (8) es una mancha menos polar que la del hapteno de metilanfetamina y se tiñe de amarillo brillante con el reactivo de Ellman. La reacción termina en una hora. Al mismo tiempo, se añade carbitol desgasificado (0,3150 ml) y NaOAc (20 mM, pH 4,5, 0,1575 ml) al hapteno de anfetamina (MW 314,47, 7,5 mg) en un matraz pequeño de fondo redondo. La solución se agita en atmósfera de nitrógeno; se añade TCEP HCl (Sigma, C4706, PM 286,65, 9,23 mg, 1,35 equivalentes de hapteno de anfetamina) a la solución de hapteno de anfetamina. El progreso de la reacción se controla por TLC (10,5 ml de CH2Ch/4 ml de MeOH/0,25 ml de ácido acético) y el producto (6) es una mancha menos polar que la del hapteno de metilanfetamina y se tiñe de amarillo brillante con el reactivo de Ellman. La reacción termina en una hora.

Conjugado de MDA G6PDH con metilanfetamina y anfetamina

El conjugado desactivado de MDA-G6PDH (5, 1,8 ml, 4,52 ml) se burbujea con nitrógeno durante 30 minutos en un baño de agua helada, hapteno de metilanfetamina-SH (8, 65,5 pl) y anfetamina-SH hapteno (6, 57,1 pl) (la proporción molar de hapteno de anfetamina de metilo y hapteno de anfetamina es de 1 a 1) se añaden al conjugado desactivado de MDA G6PDH en un baño de agua helada gota a gota a través de una jeringa en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agita en una cámara frigorífica durante la noche. El conjugado de MDA-G6PDH-metilanfetamina/metilanfetamina se carga en una columna G-50 Sephadex® preequilibrada con tampón Tris HCl 55 mM (0,1% NaN3, pH 8,0), eluido con el mismo tampón. Las fracciones que contienen el conjugado (10) se agrupan y se determina que la concentración de la proteína es de 0,44 mg/ml (11,8 ml) mediante UV a 280 nm.

Referencias:

1. Jakobovits et al. Patente de EE. UU. Núm. 6033890 "Inmunoensayo homogéneo utilizando glucosa-6-fosfato deshidrogenasa mutante" Emitida: 7 de marzo de 2000

2. Jakobovits et al. Patente de EE. UU. Núm. 6090567 "Inmunoensayo homogéneo utilizando glucosa-6-fosfato deshidrogenasa mutante" Emitida: 18 de julio de 2000.

3. Jakobovits et al. Patente de EE. U^u . Núm. 6455288 "Inmunoensayo homogéneo utilizando glucosa-6-fosfato deshidrogenasas mutantes" Emitida: 18 de septiembre de 2002.

4. Zheng, Y. F.; Liu, H. T. "Ensayo para entactógenos" Patente de EE. UU. No. 6991911, 2006.

5. Zheng, Y. F.; Yang, Y. "Ecstasy Haptens And Immunogens" Patente de EE. UU. n.° 7022492, 2006.

6. Zheng, Y. F.; Parrish, FR; Valdez, J.; Liu, H. T. "Ensayos para anfetamina y metanfetamina". Patente europea No.

1732880, 2010.

7. Zheng, Y. F.; Parrish, FR; Valdez, J.; Liu, H. T. "Ensayos para anfetamina y metanfetamina" Patente de EE. UU. No.

7115383, 2006.

8. Zheng, Y. F.; Yamout, A. K.; Berger, E.D.; Hu, WM; Liu, H. T. "Ensayos para anfetamina y metanfetamina usando reactivos estereoespecíficos" Patente de EE. UU. No. 7037669, 2006.

9. Hu et al. Patente de EE. UU. Núm. 5328828 "Composiciones y métodos para determinar la presencia de anfetaminas en muestras sospechosas de contener anfetamina y/o metanfetamina" Emitida: 12 de julio de 1994.

10. Hu et al. Patente de EE. UU. Núm. 5135863 "Composiciones y métodos para determinar la presencia de anfetaminas en muestras sospechosas de contener anfetamina y/o metanfetamina" Emitida: 4 de agosto de 1992.

11. Lin et al. Patente de EE. UU. Núm. 7560239 "Inmunoensayo enzimático homogéneo para la detección simultánea de múltiples analitos" Emitida: 14 de julio de 2009.

12. Lee, WT, et al, "Clonación del gen y la secuencia de aminoácidos para la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa de Leuconostoc mesenteroides". J.Biol.Chem., 266(20),13028-13034(1991)

13. Uniprot, [P11411] RecName: Completo = Glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa; Corto=G6PD; CE=1.1.1.49;

14. Swissprot [P11411] RecNombre: Completo = Glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa; Corto=G6PD; CE=1.1.1.49.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende al menos dos miembros distintos de un par de unión específica (sbp) conjugados con una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa mutante (G6PDH), donde la G6PDH mutante se ha derivado de una G6PDH precursora mediante la inserción de al menos una cisteína por subunidad, o sustitución de al menos un aminoácido con cisteína por subunidad, en comparación con el precursor G6PDH, y donde al menos un primer miembro del par de unión específica se conjuga con dicha G6PDH mutante a través de un grupo tiol y donde al menos un par del miembro unión específica adicional se conjuga con la G6PDH mutante a través de un grupo amino.

2. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la G6PDH mutante es una G6PDH bacteriana derivada del género de bacteria seleccionado del grupo que consiste en Leuconostoc.

3. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los dos miembros del par de unión distintos son serológicamente no reactivos cruzados.

4. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende tres o más miembros de pares de unión específica (sbp) distintos conjugados con G6PDH mutante.

5. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende una pluralidad de miembros de pares de unión específicos adicionales distintos conjugados con una pluralidad respectiva de grupos amino.

6. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende una pluralidad de primeros miembros de un par de unión específica distintos conjugados con una pluralidad respectiva de grupos tiol.

7. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el primer y el segundo par de miembros del par de unión específica se seleccionan del grupo que consiste en opio, analgésicos opioides, anfetaminas, cocaína, metadona, alcaloides, catecolaminas, metilendioxianfetaminas (MDMA, MDA y MDEA, etc.), PCP, propoxifeno, metacualona, barbitúricos, benzodiazepinas, antidepresivos tricíclicos, tranquilizantes, tetrahidrocannabinol, LSD, ketamina, GHB y otras drogas de abuso, incluidos aminoácidos, hormonas y esteroides, buprenorfina, norbuprenorfina.

8. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un enlazador entre la G6PDH mutante y uno o ambos miembros del par de unión específica y miembro del par de unión específica adicional.

9. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el primer miembro del par de unión es MDA o un análogo, metabolitos o derivado del mismo y el segundo miembro del par de unión es anfetamina o un análogo, metabolito o derivado de la misma o metanfetamina.

10. La composición según la reivindicación 9, donde el primer miembro del par de unión es MDA o un análogo, metabolito o derivado de la misma y el segundo miembro del par de unión es anfetamina o un análogo, metabolito o derivado de la misma y un tercer miembro del par de unión es metanfetamina.

11. Un método para producir una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende los pasos de:

conjugar un primer miembro del par de unión específica a una G6PDH mutante a través de un grupo tiol, donde la G6PDH mutante se deriva de una G6PDH precursora mediante la inserción de al menos una cisteína por subunidad, o la sustitución de al menos un aminoácido con cisteína por subunidad, en comparación con el precursor G6PDH;

y luego conjugar al menos otro miembro del par de unión específica a G6PD^h a través de un grupo amino.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde el paso de conjugar incluye proporcionar un enlazador entre G6PDH y uno o ambos miembros del par de unión específica y miembro adicional del par de unión específica.

13. Un método para detectar un primer analito y un analito adicional en una muestra, que comprende los pasos de:

(i) combinar en un medio líquido:

(a) dicha muestra,

(b) una composición que comprende G6PDH mutante, donde la G6PDH mutante se ha derivado de una G6PDH precursora mediante la inserción de al menos una cisteína por subunidad, o la sustitución de al menos un aminoácido con cisteína por subunidad, en comparación con la G6PDH precursora, y donde un primer miembro del par de unión específica se conjuga con la G6PDH mutante a través de un grupo tiol y otro miembro del par de unión específica se conjuga con la G6PDH mutante a través de un grupo amino,

(c) un primer anticuerpo capaz de unirse al primer miembro del par de unión específica,

(d) un anticuerpo adicional capaz de unirse al miembro del par de unión específica adicional, y

(e) un sustrato para dicha G6pDH mutante; y

(ii) determinar la actividad enzimática de dicha G6PDH mutante en dicho medio.