CN105793275B

CN105793275B - 多-半抗原突变型g6pdh缀合物的制备及其用于检测多种分析物的用途

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Publication number: CN105793275B
Application number: CN201480067608.4A
Authority: CN
Inventors: 郑一枫; Y.杨; L.赫森; N.摩加纳
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2013-12-17
Filing date: 2014-12-10
Publication date: 2020-02-21
Anticipated expiration: 2034-12-10
Also published as: WO2015094852A3; ES2911268T3; EP3083657A4; EP3083657B1; US20160312208A1; EP3083657A2; US10450555B2; CN105793275A; WO2015094852A2; US20190055538A1

Abstract

本发明涉及多‑半抗原突变型G6PDH缀合物、其制备方法及其用于检测多种分析物的用途。本发明的组合物包含固定化至G6PDH中以制备多‑半抗原‑G6PDH缀合物所需的不同类型的半抗原(分子)。G6PDH上的硫醇和胺官能团两者均用于固定化不同的半抗原。

Description

多-半抗原突变型G6PDH缀合物的制备及其用于检测多种分析物的用途

本发明涉及多-半抗原突变型G6PDH缀合物、其制备方法及其用于检测多种分析物的用途。

在体外诊断的领域中，均相免疫测定，诸如酶多重免疫测定技术(EMIT)-测定法用于检测分析物，特别是待测试的受试者的样品中的滥用的药物。例如，文献US6455288、US6033890、US6090567描述了采用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)酶作为标记的分析物的免疫测定的方法。

EMIT®测定法的原理源于分析物类似物与G6PDH的缀合物和患者样品中的游离分析物之间与游离抗体的竞争性结合和相互作用。这导致样品中的分析物和用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)标记的分析物或分析物类似物之间针对抗体结合位点的竞争。酶缀合物活性在结合至抗体后降低。未结合的酶缀合物将抗体试剂中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转化为NADH，并且吸光度的变化可以在340nm分光光度测量。酶活性在结合至抗体后降低，允许在G6PDH活性方面测量样品中的分析物浓度。

已经开发EMIT®免疫测定法用于筛选个别药物或药物类别。

在许多情况下，期望能够用单一测定检测多种分析物。这是相关的，例如当筛选受试者用于使用不同的药物或同时检测药物及其药物代谢物以扩大可以检测药物使用的时间窗口时。

US 7560239公开了这样的组合物，其中在一步反应中将不同的分析物经由G6PDH分子上的胺基缀合至G6PDH。然而，经由胺化学法将两种不同的分析物缀合至G6PDH不允许精确控制两种不同的分析物的比率，并可能导致酶促活性的损失。

发明目标

作为本发明的基础的技术问题是提供改进的G6PDH缀合物、其制备方法及其用于检测多种分析物的用途。

发明概述

在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的方法的具体组分部分或方法步骤，因此此类方法可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不意欲是限制性的。必须注意的是，如说明书和随附权利要求中所使用，单数形式 “一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括单数和/或复数对象，除非上下文另有明确说明。还应当理解，复数形式包括单数和/或复数对象，除非上下文另有明确说明。而且，应当理解，在给出通过数值限定的参数范围的情况下，所述范围被认为包括这些限值。

本发明涉及包含缀合至葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的至少两个独特的特异性结合对(sbp)成员的组合物，其中至少一个第一特异性结合对成员经由硫醇基缀合至G6PDH，并且其中至少一个另外的特异性结合对成员经由氨基缀合至G6PDH。

本发明的组合物可用于在均相免疫测定形式中检测相关或类似的化合物和无关或不同的化合物两者。例如，可以期望检测药物和所述药物的分析物，以扩大其中可以检测受试者中的药物或其代谢物的时间窗口。在另一方面，可以期望在单一测定中同时检测多种无关分析物，例如检测多种药物用于针对药物滥用筛选受试者。因此，第一和另外的结合对可以是结构上类似/相关的或结构上不同/无关的。进一步，第一和另外的结合对可以是血清学上交叉反应的或无交叉反应的。

根据本发明的一个方面，G6PDH是突变型G6PDH，所述突变型G6PDH通过以下衍生自前体G6PDH：与前体G6PDH相比，每个亚基插入至少一个半胱氨酸，或每个亚基至少一个氨基酸被半胱氨酸取代。

根据本发明的一个方面，G6PDH是衍生自细菌属的细菌G6PDH，所述细菌属选自明串珠菌属(Leuconostoc)。

本发明的组合物和方法中可以使用的突变型G6PDH描述于US6455288、US6033890和US6090567，其各自以其整体通过引用并入本文。

根据本发明的一个方面，两个独特的结合对成员在血清学上不交叉反应。

根据本发明的一个方面，所述组合物包含缀合至G6PDH的三个或更多个独特的特异性结合对(sbp)成员。

根据本发明的一个方面，所述组合物包含缀合至分别多个氨基的多个独特的另外的特异性结合对成员。

根据本发明的一个方面，所述组合物包含缀合至分别多个硫醇基的多个独特的第一特异性结合对成员。

根据本发明的一个方面，所述第一和第二特异性结合对成员选自鸦片、阿片样物质镇痛剂类、苯丙胺类、可卡因、美沙酮、生物碱类、儿茶酚胺类、亚甲二氧基苯丙胺(MDMA、MDA和MDEA等)、PCP、丙氧芬、安眠酮、巴比妥类、苯二氮䓬类、三环类抗抑郁药类、镇静剂类、四氢大麻酚、LSD、氯胺酮、GHB和其他滥用的药物，包括氨基酸类、激素类和类固醇类，丁丙诺啡、去甲丁丙诺啡(norbuprenorphine)，及其类似物、代谢物和衍生物。

根据本发明的一个方面，所述组合物包含G6PDH与特异性结合对成员和另外的特异性结合对成员中的任一或两者之间的接头。

所述接头通常包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个原子，例如约3至约8个原子，或者例如约4至约7个原子的链，所述原子各自独立地选自通常由碳、氧、硫、氮、卤素和磷组成的组，等等。连接基团可以是脂族或芳族的。当杂原子存在时，氧通常作为氧代或与碳键合的醚存在；硫通常作为硫醚或对应于类似的氧官能团(functionality)的其他官能团存在；氮通常作为通常与碳键合的硝基、亚硝基或氨基存在；磷通常键合至碳、硫、氧或氮，通常作为膦酸酯和磷酸单酯或磷酸二酯。在接头和待缀合的分子(即，酶或分析物)之间形成共价键中的常用官能团包括烷基胺、脒、硫代酰胺、醚、脲、硫脲、卤素、异硫氰酸酯、胍、氮杂、硫醚和羧酸酯、磺酸酯和磷酸酯、酰胺和硫酯。

本发明进一步涉及用于产生本发明的组合物的方法，其包括以下步骤：

经由硫醇基将第一特异性结合对成员缀合至G6PDH；然后

经由氨基将至少一个另外的特异性结合对成员缀合至G6PDH。

根据本发明的一个方面，缀合的步骤包括提供G6PDH与特异性结合对成员和另外的特异性结合对成员中的任一或两者之间的接头。

本发明进一步涉及检测样品中的第一分析物和另外的分析物的方法，其包括以下步骤：

(i) 在液体介质中组合：

(a)所述样品，

(b)包含G6PDH的组合物，其中第一特异性结合对成员经由硫醇基缀合至G6PDH，且另外的特异性结合对成员经由氨基缀合至G6PDH，

(c)能够结合所述第一特异性结合对成员的第一抗体，

(d)能够结合所述另外的特异性结合对成员的另外的抗体，和

(e)用于所述G6PDH的底物；和

(ii) 测定所述介质中的所述G6PDH的酶促活性。

酶促活性可以通过使用合适的信号产生系统来测定。

感兴趣的分析物包括，但不限于药物、代谢物、杀虫剂、污染物等。感兴趣的药物内包括的是生物碱类。生物碱类内的是吗啡生物碱类，其包括吗啡、可待因、海洛因、右旋苯丙胺、它们的衍生物和代谢物；可卡因生物碱类，其包括可卡因和苯甲酰芽子碱、它们的衍生物和代谢物，麦角生物碱类，其包括麦角酸的二乙基酰胺；类固醇生物碱类；亚胺酰基(iminazoyl)生物碱类；喹唑啉生物碱类，异喹啉生物碱类；喹啉生物碱类，其包括奎宁和奎尼丁；二萜生物碱类，它们的衍生物和代谢物。特别感兴趣的分析物包括鸦片、阿片样物质镇痛剂类、苯丙胺类、可卡因、美沙酮、生物碱类、儿茶酚胺类、亚甲二氧基苯丙胺(MDMA、MDA和MDEA等)、PCP、丙氧芬、安眠酮、巴比妥类、苯二氮类、三环类抗抑郁药类、镇静剂类、四氢大麻酚、LSD、氯胺酮、GHB和其他滥用的药物，包括氨基酸类、激素类和类固醇类，丁丙诺啡、去甲丁丙诺啡和其类似物、代谢物和衍生物。

定义

在进一步进行描述本发明的具体实施方案之前，将定义一些术语。除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

在本发明的上下文中，分析物是待测量的化合物或组合物，感兴趣的材料。所述分析物是特异性结合对(sbp)的成员，并且可以是配体，其为单价或多价的，通常是抗原的或半抗原的，并且是共享至少一个共同表位或决定簇位点的单一化合物或多种化合物。

在本发明的上下文中，合理怀疑含有分析物的样品可以通过本发明的方法进行分析。此类样品可包括人、动物或人造样品。所述样品可以在不干扰测定的任何方便的介质中制备。通常，所述样品是水性溶液或天然流体，优选尿、全血、血清、血浆、脑-脊髓液或唾液，更优选血清。样品来源也可以是毛发或组织。

术语葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或“G6PDH”是指酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，其可以获得自天然来源，诸如酵母、细菌，其呈天然或突变形式或通过重组方法制备。

“前体G6PDH”意指天然存在的G6PDH酶以及具有与天然存在的G6PDH基本相同的序列的重组G6PDH酶。

G6PDH突变体的氨基酸序列通过前体氨基酸序列的一个或多个氨基酸的取代或缺失或将一个或多个氨基酸插入前体氨基酸序列而衍生自前体G6PDH氨基酸序列。此类修饰可通过重组修饰编码前体G6PDH的氨基酸序列的前体DNA序列、而不是操作前体G6PDH酶本身来实现。DNA重组工程改造的技术是本领域中已知的。

在本发明的上下文中，测量分析物的量包括用于测定分析物的定量、半定量和定性方法以及所有其他方法。例如，仅检测怀疑含有分析物的样品中分析物的存在或不存在的方法被认为包括在本发明的范围之内。在本发明的范围内考虑的短语“测量分析物的量”的同义词包括，但不限于，检测、测量或测定分析物；检测、测量或确定分析物的存在；和检测或测定分析物的量。

在本发明的上下文中，特异性结合对的成员(sbp成员)是两种不同的分子之一，其在表面上或在腔中具有这样的区域，其特异性结合至其他分子，并由此被定义为与其他分子的特定空间和极性组构(organization)互补。所述特异性结合对的成员被称为配体和受体(抗配体(antiligand))，sbp成员和sbp伴侣等。这些通常是免疫对诸如抗原-抗体的成员。

配体是对其而言受体天然存在或可以制备的任何有机化合物。例如，在本发明的一个上下文中，所述分析物是配体，并且本发明提供用于测定作为配体的分析物的浓度的方法。

配体、分析物或特异性结合对的成员(sbp成员)的类似物是修饰的配体或配体替代物，修饰的分析物或分析物替代物，或修饰的sbp成员或sbp成员替代物(其可以针对受体、抗配体、sbp伴侣等与类似配体、分析物或sbp成员竞争)，所述修饰提供将配体类似物、分析物类似物或sbp成员类似物接合至另一分子的方式。所述配体类似物、分析物类似物或sbp成员类似物通常与所述配体、分析物或sbp成员不同在于不止用将配体类似物、分析物类似物或sbp成员类似物连接至中心(hub)或标记的键替代氢，但不一定。

受体是能够识别分子的特定空间和极性组构的任何化合物或组合物。这些分子的组织区域被称为表位或决定簇位点。说明性的天然存在的受体包括抗体和酶。

接头或连接基团是连接2个或更多个子结构的结构的部分。连接基团具有在子结构之间延伸的原子的至少1个不间断链。连接基团的原子本身通过化学键连接。

缀合物是由任选通过连接基团键合在一起以形成单一结构的两个或更多个子结构构成的分子。所述结合可以通过亚基之间的直接连接(例如化学键)或通过使用连接基团进行。在本发明的上下文中，缀合物是连接至半抗原、sbp成员或分析物类似物的G6PDH酶。

缀合是其中两个部分、化学结构或分子连接在一起以形成缀合物的任何方法。缀合方法可以由任何数目的步骤构成。

半抗原能够特异性结合至相应抗体，但通常本身不充当用于制备抗体的免疫原。识别半抗原的抗体可以针对由连接至免疫原性载体的半抗原构成的化合物进行制备。

信号产生系统用于针对分析物的测定中，并且可具有一种或多种组分，至少一种组分是突变型G6PDH。所述信号产生系统生成涉及样品中的分析物的存在或量的信号。所述信号产生系统包括产生可测量的信号所需的所有试剂。

所述信号产生系统的其他组分可包括底物、增强物、活化剂、化学发光化合物、辅因子、抑制剂、清除剂、金属离子、结合信号生成物质所需的特异性结合物质、辅酶、与酶产物反应的物质、其他酶和催化剂等。

所述信号产生系统提供通过外部手段，通常通过电磁辐射的测量，理想地通过目视检查可检测的信号。对于大部分，所述信号产生系统包括发色底物和本发明的突变型G6PDH酶，其中将发色底物酶促转化为吸收紫外或可见区域中的光的染料。

各种辅助材料将经常用于根据本发明的测定中。例如，缓冲剂通常将存在于测定介质，以及用于测定介质和测定组分的稳定剂。经常，除了这些添加剂以外，可以包括额外蛋白，诸如白蛋白，或表面活性剂，特别是非离子型表面活性剂，结合增强剂，例如，聚亚烷基二醇等。

通过引用并入

本文引用的所有公开和专利申请通过引用并入，如同各单独的公开或专利申请被具体地并单独地指明通过引用并入。

发明详述

本发明的目标的额外细节、特点、特征和优点进一步公开于以下各实施例的描述和附图中，其以示例性方式显示本发明的优选实施方案。然而，这些实施例决不应理解为限制本发明的范围。

在附图中，

图1图示显示根据本发明的组合物的实施方案的化学结构，

图2显示示例性分析物MDMA、MDA和MDEA的结构，

图3显示用于获得根据本发明的组合物的实施方案的示例性合成方案，其显示MDA/苯丙胺突变型G6PDH缀合物(7)的合成，

图4显示用于获得根据本发明的组合物的实施方案的示例性合成方案，其显示MDA/甲基苯丙胺突变型G6PDH缀合物(9)的合成

图5显示用于获得根据本发明的组合物的实施方案的示例性合成方案，其显示MDA/苯丙胺/甲基苯丙胺突变型G6PDH缀合物(10)的合成，

图6显示用于使用根据本发明的组合物检测摇头丸、MDA、MDEA、甲基苯丙胺和苯丙胺的响应曲线，

图7显示用于使用根据本发明的组合物检测摇头丸、MDA、MDEA、甲基苯丙胺和苯丙胺的响应曲线，

图8显示用于使用根据本发明的组合物检测摇头丸、MDA、MDEA、甲基苯丙胺和苯丙胺的响应曲线，

均相酶免疫测定取决于酶-sbp成员缀合物(其酶活性可在sbp伴侣的结合后被强烈调节)的可用性。本发明提供酶-sbp成员缀合物，其可以结合并检测多种不同的分析物，用于进行在均相免疫测定中有用的测定。

本发明的在EMIT®形式中具有多种检测能力的组合物需要满足一些基本条件：1)不同类型的半抗原(分子)需要固定化至G6PDH中以制备一种多-半抗原-G6PDH缀合物；2)多-半抗原-G6PDH缀合物需要被其相应的一种或多种抗体识别，以生成酶促抑制，因此检测多种药物；3)多-半抗原-G6PDH缀合物应当保留其酶促活性。基于这些条件，选择突变型G6PDH作为优异的模板，以制备新的多-半抗原-G6PDH缀合物。G6PDH上的硫醇和胺官能团两者均用于固定化不同的半抗原。

例如，合适的突变型G6PDH是来自肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)(例如ATCC 12291)的携带一个或几个以下突变的G6PDH：

来自肠膜明串珠菌的野生型G6PDH的整个氨基酸序列在下面和参考文献12、13和14中给出：

类似地，G6PDH的另外合适的突变体形式源自肠膜明串珠菌的其他菌株，源自柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum) (例如，菌株NCIMB 3351)，乳明串珠菌(Leuconostoclactis)(例如，菌株NCDO 546)和葡聚糖明串珠菌(Leuconostoc dextranicum)(例如，菌株ATCC 19255) 的菌株。合适的突变包括，与前体G6PDH相比，每个亚基插入至少一个半胱氨酸，或每个亚基至少一个氨基酸被半胱氨酸取代。具体而言，G6PDH的合适的突变体形式包括这样的突变，其中源自明串珠菌属的前体G6PDH分子中的相应氨基酸在位置45至60中任一处被半胱氨酸取代。

试剂配制是两步反应。首先，使用硫醇化学法以受控方式将二个半抗原附接至G6PDH(方案1-3)。其次，不同类型的半抗原可以使用胺化学法固定化。我们的方法不同于现有的多-半抗原缀合物的方法(参考文献11)，在于仅使用胺化学法。基于现有的数据，使用胺官能团用于半抗原的固定化可以导致酶促活性的降低。这意味着，仅有限的胺基团可以用于附接半抗原以维持良好的酶促活性用于EMIT®形式。因此，仅使用胺化学法用于制备多-半抗原-G6PDH缀合物可以限制缀合物上的半抗原的量，以维持良好的酶促活性。

在我们的方法中，作为第一步骤反应，使用酶上的硫醇官能团制备多-半抗原-突变型G6PDH。所得缀合物保留其酶促活性中的大部分(≥95％)。这可以是优点，因为在第二步骤反应中，更多半抗原可以附接至胺基团，同时仍保持良好的酶促活性。因此，在多-半抗原-G6PDH的制备中应用硫醇和胺化学法两者应当导致产生具有用于检测多种分析物的更大半抗原负载能力的缀合物。不希望受该理论束缚，在本发明的组合物和方法中利用硫醇化学法的有益效果可解释如下：利用硫醇化学法可以导致更稳定。可以使用远离酶e的活性位点的半胱氨酸残基。在那方面，通过半胱氨酸的连接的半抗原缀合对于对酶促活性关键的活性四级结构的稳定性可具有很少影响或没有影响。突变型G6PDH-半抗原缀合物保留非常良好的酶促活性的观察结果支持这一点。

存在许多分析物，例如药物，其可用于制备多-半抗原-G6PDH并测试其性能。选择三种广泛滥用的药物苯丙胺、甲基苯丙胺和摇头丸作为示例性分析物。考虑到这一点，如方案1-3和实验部分中所述制备多-半抗原-G6PDH (7, 9, 10)。两种多-半抗原-G6PDH(7,9)用于研究它们在EMIT®形式中的多药物检测能力。结果在以下部分中进行讨论。

在这些方法中，作为第一步骤反应，使用酶上的硫醇官能团制备多-半抗原-突变型G6PDH。所得缀合物保留其酶促活性中的大部分(≥95％)。这可以是优点，因为在第二步骤反应中，更多半抗原可以附接至胺基团，同时仍保持良好的酶促活性。因此，在多-半抗原-G6PDH的制备中应用硫醇和胺化学法两者应当导致产生具有用于检测多种分析物的更大半抗原负载能力的缀合物。

EMIT®测定原理：

Emit® II Plus测定法是均相酶免疫测定法。其基于样品中的药物和用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)标记的药物之间针对抗体结合位点的竞争。酶缀合物活性在结合至抗体后降低。未结合的酶缀合物将抗体试剂中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)转化为NADH，并且吸光度的变化可以在340nm分光光度测量。酶活性在结合至抗体后降低，允许在G6PDH活性方面测量样品中的分析物浓度。

使用得自Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark DE的SYVA®30-R分析仪Syva-30R , S/N A3562011实施测试。使用EMIT®免疫测定技术利用该仪器。在本文使用和下面更详细讨论的EMIT®方法的实施方案中，利用G6PDH缀合物上的摇头丸和/或苯丙胺/甲基苯丙胺类似物和患者样品中的游离药物之间针对抗体结合位点的竞争，以测定患者样品中的摇头丸和/或苯丙胺/甲基苯丙胺的量。测量游离缀合物的酶促活性，其与患者样品中的药物的量成正比。

EMIT®测定结果：

结论：使用突变型G6PDH以硫醇和胺化学法成功地制备多-半抗原-G6PDH缀合物(7, 9, 10)。多-半抗原缀合物(7,9)用于产生苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA、MDE和MDEA的多分析物的响应曲线。每种药物的响应可以通过改变缀合物比率进行调节。这种概念可以应用于任何多分析物检测形式，包括EMIT®形式。

实验部分：

试剂

1)抗体试剂：通过分别以45 ug.mL、7 ug/mL和(1:250)的浓度掺料而在抗体试剂1稀释剂中配制苯丙胺、甲基苯丙胺和摇头丸抗体。

2) 缀合物试剂2：以750 mA/min的Rmax分别在试剂1稀释剂中配制缀合物批次#7和# 9 (50:50)。以不同比率(Vol:Vol)混合缀合物溶液。

3)标准品/校准物：以0-1000 ng/mL的浓度制备苯丙胺、甲基苯丙胺、摇头丸(MDMA)、MDA和MDEA标准品

4)方案：

抗体试剂1 = 210 uL，

缀合物试剂2 = 90 uL，

样品大小 =5 uL

第一波长： 340 nm

第二波长： 412 nm。

仪器： Syva-30-R分析仪S/N A3562011。

突变型G6PDH (1)的制备

如参考文献1-3中所述发明和制备突变型G6PDH (1)。

突变型MDA-G6PDH缀合物(3)的制备

如参考文献4中所述制备半抗原(2)及其突变型G6PDH缀合物(3)。

MDA/苯丙胺突变型G6PDH缀合物(7)的制备

G6PDH缀合物(3)的官能化

将pH 7.0磷酸钠缓冲液中的MDA-G6PDH缀合物(3)(5 mL，1 mg/mL)在搅拌的超滤单元(10 mL)中用55 mM Tris∙HCl(pH 8.0)缓冲液进行缓冲液交换三次。收集的最终酶是1.0 mL，浓度为5.0 mg/mL。在4℃向缓冲液交换的G6PDH缀合物中添加D-葡萄糖-6-磷酸二钠盐水合物(Sigma，G7250，30 mg)和NADH(β-NADH二钠盐，USB，目录号15345，30 mg)，检查溶液的pH，发现为8。在冰-水浴中，向该溶液中添加50 μL溴乙酸琥珀酰亚胺酯(succinimidyl bromoacetate)(4，Molecular Bioscience，目录号22080，mw:237.0，5 mg/mL，于DMF中)。将酶溶液在冷室中搅拌45分钟，然后用1 L 55 mM Tris HCl(pH 8.0)缓冲液透析，与新鲜缓冲液交换五次，各新鲜缓冲液之间间隔三小时。收集的透析的酶溶液(5)为2.1 mL，浓度为2.45 mg/mL。

用TCEP还原苯丙胺半抗原接头

将30 mL卡必醇(二乙烯二醇单乙醚，Sigma，D1265-1L)和20 mL 20mM乙酸钠(pH4.5)缓冲液通过经由各溶液鼓泡氮气15分钟进行脱气，然后添加苯丙胺半抗原。向小烧瓶中的苯丙胺半抗原(MW 314.47, 10.4 mg)添加脱气的卡必醇(0.4368 ml)和乙酸钠(20mM, pH 4.5, 0.2184 mL)。将反应混合物在氮气气氛下搅拌。将TCEP HCl (Sigma, C4706,MW 286.65, 11.8 mg, 1.24当量的苯丙胺半抗原)添加至苯丙胺半抗原溶液中。反应的进程通过TLC (10.5 ml CH₂Cl₂ / 4 mL MeOH / 0.25 mL乙酸)监测，且产物(6)是极性比苯丙胺半抗原的极性更小的点，且用Ellman氏试剂染色为亮黄色。反应在一小时内完成。

MDA G6PDH与苯丙胺的缀合物

将MDA-G6PDH去活化的缀合物(5)在冰-水浴中用氮气鼓泡30分钟，在冰水浴中，在氮气气氛下通过注射器将苯丙胺-SH半抗原(6, 117 µL)逐滴添加至缀合物。将反应混合物在冷室中搅拌过夜。将MDA-G6PDH苯丙胺缀合物上样至用55 mM Tris HCl缓冲液(0.1%NaN₃, pH 8.0)预平衡的G-50 Sephadex柱上，用相同缓冲液洗脱。合并含有缀合物(7)的级分，且通过在280nm的UV测定蛋白的浓度。缀合物(7)的浓度通过在280nm的吸光度测定为0.43 mg/ml (11.7 mL)。

MDA/甲基苯丙胺突变型G6PDH缀合物(9)的制备：

G6PDH缀合物(3)的官能化

将pH 7.0磷酸钠缓冲液中的MDA-G6PDH缀合物(3)(4.6 mL，1 mg/mL)在搅拌的超滤单元(10 mL)中用55 mM Tris.HCl(pH 8.0)缓冲液进行缓冲液交换三次。收集的最终酶是0.9 mL，浓度为5.0 mg/mL。在4℃向缓冲液交换的G6PDH缀合物中添加D-葡萄糖-6-磷酸二钠盐水合物(Sigma，G7250，27.6 mg)和NADH(β-NADH二钠盐，USB，目录号15345，27.6mg)，检查溶液的pH，发现为约8。在冰-水浴中，向该溶液中添加46.0 μL溴乙酸琥珀酰亚胺酯(4，Molecular Bioscience，目录号22080，mw:237.0，5 mg/mL，于DMF中)。将酶溶液在冷室(4℃)中搅拌45分钟，并用1 L 55 mM Tris HCl(pH 8.0)缓冲液透析，与新鲜缓冲液交换五次，各新鲜缓冲液之间间隔三小时。收集的透析的酶溶液(5)为2.5 mL，浓度为2.44 mg/mL。

用TCEP还原甲基苯丙胺半抗原接头

将30 mL卡必醇(二乙烯二醇单乙醚，Sigma，D1265-1L)和20 mL 20mM乙酸钠(pH4.5)缓冲液通过鼓泡氮气15分钟进行脱气，然后添加甲基苯丙胺半抗原。向小圆底烧瓶中的甲基苯丙胺半抗原(MW 360.58, 11.9 mg)添加脱气的卡必醇(0.4998 ml)和乙酸钠(20mM, pH 4.5, 0.2499 mL)。将反应混合物在氮气气氛下搅拌。将TCEP HCl (Sigma, C4706,MW 286.65, 12.77 mg, 1.35当量的甲基苯丙胺半抗原)添加至甲基苯丙胺半抗原溶液中。反应的进程通过TLC (10.5 ml CH₂Cl₂ / 4 mL MeOH / 0.25 mL乙酸)监测，且产物(8)是极性比甲基苯丙胺半抗原的极性更小的点，且用Ellman氏试剂染色为亮黄色。反应在一小时内完成。

MDA G6PDH与甲基苯丙胺的缀合物

将MDA-G6PDH去活化的缀合物(5, 2.25 mL)在冰-水浴中用氮气鼓泡30分钟，在冰水浴中，在氮气气氛下通过注射器将甲基苯丙胺-SH半抗原(8, 155 µL)逐滴添加至缀合物中。将反应混合物在冷室(4℃)中搅拌过夜。将MDA-G6PDH-甲基苯丙胺缀合物上样至用55mM Tris HCl缓冲液(0.1% NaN₃, pH 8.0)预平衡的G-50 Sephadex柱上，用相同缓冲液洗脱。合并含有缀合物(9)的级分，且通过在280nm的UV将蛋白的浓度测定为0.48 mg/ml(8.88 ml)。

MDA/苯丙胺/甲基苯丙胺突变型G6PDH缀合物(10)的制备：

G6PDH缀合物(3)的官能化

将pH 7.0磷酸钠缓冲液中的MDA-G6PDH缀合物(3)(15 mL，1 mg/mL)在搅拌的超滤单元(50 mL)中用55 mM Tris.HCl(pH 8.0)缓冲液进行缓冲液交换三次。收集的最终酶是3.0 mL，浓度为5.0 mg/mL。在4℃向缓冲液交换的G6PDH缀合物中添加D-葡萄糖-6-磷酸二钠盐水合物(Sigma，G7250，90.2 mg)和NADH(β-NADH二钠盐，USB，目录号15345，90.1 mg)，检查溶液的pH，发现为约8。在冰-水浴中，向该G6PDH缀合物溶液中添加150.0 μL溴乙酸琥珀酰亚胺酯(4，Molecular Bioscience，目录号22080，mw:237.0，5 mg/mL，于DMF中)。将溶液在冷室(4℃)中搅拌45分钟。将酶溶液用1 L 55 mM Tris HCl(pH 8.0)缓冲液透析，与新鲜缓冲液交换五次，各新鲜缓冲液之间间隔三小时。收集的透析的酶溶液(5)为6.7 mL，浓度为4.52 mg/mL。

用TCEP还原甲基苯丙胺/苯丙胺半抗原接头

将30 mL卡必醇(二乙烯二醇单乙醚，Sigma，D1265-1L)和30 mL 20mM乙酸钠(pH4.5)缓冲液通过鼓泡氮气15分钟进行脱气，然后添加半抗原。向小圆底烧瓶中的甲基苯丙胺半抗原(MW 360.58, 10.4 mg)添加脱气的卡必醇(0.4368 ml)和乙酸钠(20 mM, pH4.5, 0.2184 mL)。将反应混合物在氮气气氛下搅拌。将TCEP HCl (Sigma, C4706, MW286.65, 11.16 mg, 1.35当量的甲基苯丙胺半抗原)添加至甲基苯丙胺半抗原溶液中。反应的进程通过TLC (10.5 ml CH₂Cl₂ / 4 mL MeOH / 0.25 mL乙酸)监测，且产物(8)是极性比甲基苯丙胺半抗原的极性更小的点，且用Ellman氏试剂染色为亮黄色。反应在一小时内完成。同时，向小圆底烧瓶中的苯丙胺半抗原(MW 314.47, 7.5 mg)添加脱气的卡必醇(0.3150 mL)和NaOAc (20 mM, pH 4.5, 0.1575 mL)。将溶液在氮气气氛下搅拌；将TCEPHCl (Sigma, C4706, MW 286.65, 9.23 mg, 1.35当量的苯丙胺半抗原)添加至苯丙胺半抗原溶液中。反应的进程通过TLC (10.5 ml CH₂Cl₂ / 4 mL MeOH / 0.25 mL乙酸)监测，且产物(6)是极性比甲基苯丙胺半抗原的极性更小的点，且用Ellman氏试剂染色为亮黄色。反应在一小时内完成。

MDA G6PDH与甲基苯丙胺和苯丙胺的缀合物

将MDA-G6PDH去活化的缀合物(5, 1.8 mL, 4.52 mL)在冰-水浴中用氮气鼓泡30分钟，在冰水浴中，在氮气气氛下通过注射器将甲基苯丙胺-SH半抗原(8, 65.5 µL)和苯丙胺-SH半抗原(6, 57.1 µL)(甲基苯丙胺半抗原和苯丙胺半抗原的摩尔比为1:1)逐滴添加至MDA G6PDH去活化的缀合物中。将反应混合物在冷室中搅拌过夜。将MDA-G6PDH-甲基苯丙胺/甲基苯丙胺缀合物上样至用55 mM Tris HCl缓冲液(0.1% NaN₃, pH 8.0)预平衡的G-50 Sephadex柱上，用相同缓冲液洗脱。合并含有缀合物(10)的级分，且通过在280nm的UV将蛋白的浓度测定为0.44 mg/ml (11.8 ml)。

参考文献：

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3. Jakobovits等人，美国专利号6455288 “Homogeneous immunoassay usingmutant glucose-6-phosphate dehydrogenases”，公布：2002年9月18日。

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10. Hu等人，美国专利号5135863 “Compositions and methods fordetermining the presence of amphetamines in sample suspected of containingamphetamine and/or methamphetamine”，公布：1992年8月4日。

11. Lin等人，美国专利号7560239 “Homogeneous enzyme immunoassay forsimultaneous detection of multiple analytes”，公布：2009年7月14日。

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13. Uniprot, [P11411] RecName: Full=Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase; Short=G6PD; EC=1.1.1.49;

14. Swissprot [P11411] RecName: Full=Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase; Short=G6PD; EC=1.1.1.49。

Claims

1.组合物，其包含缀合至葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的至少两个独特的特异性结合对(sbp)成员，其中至少一个第一特异性结合对成员经由硫醇基缀合至G6PDH，并且其中至少一个另外的特异性结合对成员经由氨基缀合至G6PDH。

2.根据权利要求1的组合物，其中所述G6PDH是突变型G6PDH，所述突变型G6PDH通过以下衍生自前体G6PDH：与前体G6PDH相比，每个亚基插入至少一个半胱氨酸，或每个亚基至少一个氨基酸被半胱氨酸取代。

3.根据权利要求1或2的组合物，其中G6PDH是衍生自细菌属的细菌G6PDH，所述细菌属选自明串珠菌属。

4.根据权利要求1或2的组合物，其中所述两个独特的结合对成员在血清学上不交叉反应。

5.根据权利要求1或2的组合物，其包含缀合至G6PDH的三个或更多个独特的特异性结合对(sbp)成员。

6.根据权利要求1或2的组合物，其包含缀合至分别的多个氨基的多个独特的另外的特异性结合对成员。

7.根据权利要求1或2的组合物，其包含缀合至分别的多个硫醇基的多个独特的第一特异性结合对成员。

8.根据权利要求1或2的组合物，其中所述第一和第二特异性结合对成员选自鸦片、阿片样物质镇痛剂类、苯丙胺类、美沙酮、生物碱类、儿茶酚胺类、亚甲二氧基苯丙胺类、PCP、丙氧芬、安眠酮、巴比妥类、苯二氮䓬类、三环类抗抑郁药类、镇静剂类、四氢大麻酚、LSD、氯胺酮和GHB。

9.根据权利要求1或2的组合物，其中所述第一和第二特异性结合对成员为可卡因。

10.根据权利要求1或2的组合物，其中所述第一和第二特异性结合对成员选自MDMA、MDA和MDEA。

11.根据权利要求1或2的组合物，其中所述第一和第二特异性结合对成员选自氨基酸类、激素类和类固醇类，丁丙诺啡和去甲丁丙诺啡。

12.根据权利要求1或2的组合物，其进一步包含G6PDH与特异性结合对成员和另外的特异性结合对成员中的任一或两者之间的接头。

13.根据权利要求1或2的组合物，其中所述第一结合对成员是MDA；且所述第二结合对成员是苯丙胺或甲基苯丙胺。

14.根据权利要求13的组合物，其中所述第一结合对成员是MDA，且所述第二结合对成员是苯丙胺，且第三结合对成员是甲基苯丙胺。

15.用于产生根据权利要求1至8中任一项的组合物的方法，其包括以下步骤：

经由硫醇基将第一特异性结合对成员缀合至G6PDH；然后

经由氨基将至少一个另外的特异性结合对成员缀合至G6PDH。

16.根据权利要求15的方法，其中缀合的步骤包括提供G6PDH与特异性结合对成员和另外的特异性结合对成员中的任一或两者之间的接头。

17.检测样品中的第一分析物和另外的分析物的方法，其包括以下步骤：

(i) 在液体介质中组合：

(a)所述样品，

(c)能够结合所述第一特异性结合对成员的第一抗体，

(d)能够结合所述另外的特异性结合对成员的另外的抗体，和

(e)用于所述G6PDH的底物；和

(ii) 测定所述介质中的所述G6PDH的酶促活性。