ES2910024T3

ES2910024T3 - Inhibidores de la enolasa y procedimientos de tratamiento con los mismos

Info

Publication number: ES2910024T3
Application number: ES16712592T
Authority: ES
Inventors: Florian Muller; David S Maxwell; William G Bornmann; Yu-Hsi Lin; Basvoju A Bhanu Prasad; Zhenghong Peng; duoli Sun; Nikuni Satani; M Emilia Difransesco; Ronald A Depinho; Barbara Czako; Federica Pisaneschi
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2015-03-09
Filing date: 2016-03-09
Publication date: 2022-05-11
Anticipated expiration: 2036-03-09
Also published as: HUE058190T2; PT3268376T; WO2016145113A1; EP4011890A1; EP4011890B1; EP3268376A1; EP3268376B1; PL3268376T3; US10363261B2; US20180147219A1

Abstract

Un compuesto de la fórmula: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que: R1 es hidrógeno, acilo(C<=12) o acilo(C<=12) sustituido, preferentemente hidrógeno, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -SH, - OCH3, -OCH2CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -OC(O)CH3, o -S(O)2NH2; R2 es hidrógeno, aciloxi(C<=12), o aciloxi(C<=12) sustituido, preferentemente R2 es aciloxi(C<=8) o aciloxi(C<=8) sustituido, donde para la versión sustituida uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por - OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -OC(O)CH3, o -S(O)2NH2; X1 y X2 son cada uno independientemente O, S, o NRa, preferentemente X1 y X2 son cada uno O, donde: Ra es hidrógeno, alquilo(C<=6), o alquilo(C<=6) sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -OC(O)CH3, o -S(O)2NH2; R3 y R4 son cada uno independientemente: hidrógeno; alquilo(C<=12), arilo(C<=12), aralquilo(C<=12), heteroarilo(C<=12), heteroaralquilo(C<=12), o una versión sustituida de estos grupos, donde para las versiones sustituidas uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, - OC(O)CH3, o -S(O)2NH2; un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiilo(C<=6)-aciloxi(C<=12) o alcanodiilo(C<=6)-aciloxi(C<=12) sustituido, en el que para las versiones sustituidas, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, - OC(O)CH3, o -S(O)2NH2; R3 y R4 se toman juntos y son alcanodiilo(C<=8) o alcanodiilo(C<=8) sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -SH, - OCH3, -OCH2CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -OC(O)CH3, o -S(O)2NH2, o -X3-R5, donde: X3 es un enlace covalente,alcanodiilo(C<=8), o alcanodiilo(C<=8) sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -OC(O)CH3, o -S(O)2NH2; y R5 es acilo(C<=18), alcoxi(C<=18), -C(O)-alcoxi(C<=18), aciloxi(C<=18), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos, donde para las versiones sustituidas uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -OC(O)CH3, o -S(O)2NH2; A1 es alcanodiilo(C<=8), alcanodiilo(C<=8) sustituido, alquilaminodiilo(C<=8), o alquilaminodiilo(C<=8) sustituido, donde para las versiones sustituidas uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, - Cl, -Br, -I, -NH2, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -OC(O)CH3, o -S(O)2NH2; y Y1 es hidrógeno, amino, halo, hidroxi, fosfato, alquilo(C<=12), o alquilo (C<=12) sustituido, donde para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -SH, - OCH3, -OCH2CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -OC(O)CH3, o -S(O)2NH2.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de la enolasa y procedimientos de tratamiento con los mismos

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Campo de la invención

La presente divulgación se refiere en general al campo de la terapéutica, la quimioterapia y la química. En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a compuestos que pueden utilizarse como inhibidores de la enolasa o agentes quimioterapéuticos.

2. Descripción del arte relacionado

La enolasa es la penúltima enzima de la vía de la glicólisis. Convierte el 2-fosfoglicerato en fosfoenolpiruvato y, por tanto, es muy importante en la producción de ATP. Por ello, esta enzima ha surgido como diana para el desarrollo quimioterapéutico (Capello, et al., 2011). Se sabe que existen tres formas principales de enolasa en los seres humanos, siendo la enolasa 1 (alfa-enolasa) la forma dominante presente en la mayoría de los tejidos. La enolasa 2 está presente en el tejido cerebral y en las neuronas.

Varios subtipos de cáncer presentan mutaciones o deleciones en genes que afectan a la actividad de la enolasa 1 (Muller, et al., 2012; US 2014/0378529 WO 2013/0909732). Los compuestos y las composiciones que pueden explotar estas diferencias pueden ser útiles como agentes quimioterapéuticos. Las propiedades deseables incluyen la reducción de la toxicidad para las células normales frente a las cancerosas y/o la inhibición preferente de la enolasa 2. En vista de las continuas necesidades médicas no satisfechas relacionadas con el cáncer y otras enfermedades proliferativas de las células, los nuevos compuestos y composiciones que tienen estas propiedades deseables, así como otros perfiles de actividad beneficiosos, tienen el potencial de ser muy prometedores.

El documento JP S60-224493 A divulga el antibiótico que contiene fósforo SF-2312.

La publicación de Hanaya, Tadashi et al., "An efficient synthesis of antibiotic SF-2312 (3-dihydroxyphosphoryl-1,5-dihydroxy-2-pyrrolidone)", Heterocycles (2011), 82(2), pp. 1675-1683 divulga ácido fosfónico, P-[5-hidroxi-2-oxo-1-(fenilmetoxi)-3-pirrolidinil]-, éster dietílico, ácido fosfónico, P-[5-metoxi-2-oxo-1-(fenilmetoxi)-3-pirrolidinil)-, éster dietílico, ácido fosfónico, P-(1-hidroxi-5-metoxi-2-oxo-3-pirrolidinilo)-, éster dietílico y N-benciloxi-2-(dietoxifosfonilo)pent-4-enamida. No se divulga un uso farmacéutico de estos compuestos.

Kurz, Thomas et al "Synthesis of 1-Hydroxypyrrolidin-2,5-dione Derivatives of the Phosphonic-Hydroxamic Acid Antibiotic SF -2312", Aust. J. Chem. 2006, 59, 283-288 divulga análogos del antibiótico SF-2312 con una fracción de 1-hidroxipirrolidina sustituida. No se divulga el uso para la prevención del tratamiento del cáncer.

La publicación Jung Da-Woon et al, "A Unique Small Molecule Inhibitor of Enolase Clarifies Its Role in Fundamental Biological Processes", ACS Chem. Biol. 2013, 8, 1271-1282 divulga un inhibidor de la Enolasa, que posee actividad anticancerígena en un entorno hipóxico. El compuesto tiene una estructura de 2,4,6-triaminotriazina en la que los tres grupos -NH2 están sustituidos una vez.

El documento WO 2016/014539 divulga antibióticos de ácido fosfónico. Son ejemplos de pequeñas moléculas en las que los grupos de ácido fosfónico están unidos a grupos alifáticos de cadena corta con varios sustituyentes, por ejemplo, el ácido aminometilfosfónico, el ácido 2,3-dihidroxipropilfosfónico, el 2,4-dihidroxi-1,2oxafosfolano-2-óxido y el ácido 2-hidroxi-3-fosfonopropanoico.

La publicación Copalan, Aravamudan S. et al., "A new approach to cyclic hydroxamic acids: intramolecular cyclization of N-benzoyl carbamates with carbon nucleophiles", Tetrahedron 67 (2011) 2206-2214 divulga una síntesis para la preparación de ácidos hidroxámicos cíclicos, que pueden estar protegidos con un grupo bencílico en el grupo N-OH y sustituidos en la posición 3.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona compuestos de la fórmula:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que:

Rⁱes hidrógeno, acilo^(c<12)o acilo^(c<12)sustituido, preferentemente hidrógeno, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCHs, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

R²es hidrógeno, aciloxi^{(C<12 )}, o aciloxi^{(C<12 )}sustituido, preferentemente R²es aciloxi^(C<8)o aciloxi^(C<8)sustituido, donde para la versión sustituida uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o-S(O)²NH²;

X ¹y X²son cada uno independientemente O, S, o NR^a, preferentemente X ¹y X²son cada uno O, donde: R^aes hidrógeno, alquilo^(c<6), o alquilo^(c<6)sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

R³y R⁴son cada uno independientemente:

hidrógeno;

alquilo^{(C<12 )}, arilo^{(C<12 )}, aralquilo^{(C<12 )}, heteroarilo^{(C<12 )}, heteroaralquilo^{(C<12 )}, o una versión sustituida de estos grupos, donde para las versiones sustituidas uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o-S(O)²NH²;

un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiilo^(C<6)-aciloxi^{(C<12 )}o alcanodiilo^(C<6)-aciloxi^{(C<12 )}sustituido, en el que para las versiones sustituidas, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o-S(O)²NH²;

R³y R⁴se toman juntos y son alcanodiilo^(C<8)o alcanodiilo^(C<8)sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²; o

-X³-R⁵; donde:

X³es un enlace covalente,alcanodiilo^(C<8), o alcanodiilo^(C<8)sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²; y

R⁵es acilo^(c<18), alcoxi^(c<18), -C(O)-alcoxi^(c<18), aciloxi^(c<18), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos, donde para las versiones sustituidas uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o-S(O)²NH²;

A ¹es alcanodiilo^(c<8), alcanodiilo^(c<8)sustituido, alquilaminodiilo^(c<8), o alquilaminodiilo^(c<8)sustituido, donde para las versiones sustituidas uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²; y

Y ¹es hidrógeno, amino, halo, hidroxi, fosfato, alquilo^{(C<12 )}, o alquilo ^{(C<12 )}sustituido, donde para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH². En algunas realizaciones, el compuesto se define además como:

en el que:

R2 es hidrógeno, aciloxi(C<12), o aciloxi(C<12) sustituido, preferentemente R2 es aciloxi(C<8) o aciloxi(C<8) sustituido;

R³y R⁴son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo(c<¹²), alquilo (c<¹²) sustituido, o un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiilo(c<⁶)-aciloxi(c<¹²) o alcanodiilo(c<⁶)-aciloxi(c<¹²) sub-sustituido; y Ai es alcanodiilo(C<8), alcanodiilo(C<8) sustituido, alquilaminodiilo(C<8) o alquilaminodiilo(C<8) sustituido; o

en el que:

R¹es acilo^{(C<12 )}o acilo^{(C<12 )}sustituido;

R²es aciloxi^(C<12), o aciloxi^{(C<12 )}sustituido;

R³es alquilo^{(C<12 )}, alquilo ^{(C<12 )}sustituido, o un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiil^(C<6)-aciloxi^{(C<12 )}o alcanodiilo^(C<6)-aciloxi^{(C<12 )}sustituido;

R⁴es hidrógeno, alquilo^(C<12), alquilo ^(c<12)sustituido, o un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiil^(c<6)-aciloxi^(c<12)o alcanodiilo^(C<6)-aciloxi^(C<12)sustituido; y

A ¹esalcanodiilo^(C<8),alcanodiilo^(C<8)sustituido, alquilaminodiilo^(C<8)o alquilaminodiilo^(C<8)sustituido;

o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de las fórmulas. En algunas realizaciones, el compuesto se define además como:

en el que:

R²es hidrógeno;

R³y R⁴son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo^(C<12), alquilo ^{(C<12 )}sustituido, o un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiil^(C<6)-aciloxi^{(C<12 )}o alcanodiilo^(C<6)-aciloxi^(C<12)sustituido; y

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En algunas realizaciones, R¹es hidrógeno. En otras realizaciones, R¹es acilo^(c<8)o acilo^(c<8)sustituido, como acetilo, carbonilo de etilo (-C(O)CH²CH³), o carbonilo de 2-metilpropilo (-C(O)CH²CH(CH³)CH³), donde para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH². En otras realizaciones, R²es aciloxi^(c<8)o aciloxi^(C<8)sustituido como acetoxy, propionate, o 3-methylbutanoate. En otras realizaciones, R²es hidrógeno.

En algunas realizaciones, R³es hidrógeno. En otras realizaciones, R³es alquilo^(C<12)o alquilo ^(C<12)sustituido como el metil carboximetilo. En otras realizaciones, R³es un grupo protector de fosfato tal como un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiil^(C<6)-aciloxi^(C<12)o alcanodiilo^(C<6)-aciloxi^(C<12)sustituido. En algunas realizaciones, R³es-CH ²-aciloxi^(C<12)como pivaloiloximetilo. En otras realizaciones, R³es arilo^(C<8)o arilo^(C<8)sustituido, como fenilo, 2-metilfenilo o 4-metilfenilo. En otras realizaciones, R³es aralquilo^(C<8)o aralquilo^(C<8)sustituido, como el bencilo. En otras realizaciones, R³es -X³-R⁵; en las que:

X³es un enlace covalente,alcanodiilo^(C<8), o alcanodiilo^(C<8)sustituido; y

R⁵es acilo^(C<18), alcoxi^(C<18), -C(O)-alcoxi^(C<18), aciloxi^(C<18), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos.

En algunas realizaciones, Xb es alcanodiilo^(C<8)o alcanodiilo^(C<8)sustituido. En algunas realizaciones, R⁵es alcoxi^(C<18)o un alcoxi^(C<18)sustituido, como el pentadecanoxi. En otras realizaciones, R⁵es -C(O)-alcoxi^(C<18)o -C(O)-alcoxi^(C<18)sustituido, como -C(O)OCH(CH³)².

En algunas realizaciones, X¹es O. En otras realizaciones, X ¹es NH En algunas realizaciones, X²es O. En otras realizaciones, X²es NH

En algunas realizaciones, R4 es hidrógeno. En otras realizaciones, R4 es alquilo(C<12) o alquilo (C<12) sustituido como el metilo carboximetilo. En otras realizaciones, R4 es un grupo protector de fosfato tal como un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiil(C<6)-aciloxi(C<12) o alcanodiilo(C<6)-aciloxi(C<12) sustituido. En algunas realizaciones, R4 es -CH2-aciloxi(Cs12) como pivaloiloximetilo. En otras realizaciones, R4 es arilo(C<8) o arilo(C<8) sustituido, como fenilo, 2-metilfenilo o 4-metilfenilo.

En algunas realizaciones,Ai es alcanodiilo(c<⁴) o alcanodiilo(c<⁴) sustituido como -CH²-, -CH²CH²-, o -CH²CH²CH²-. En algunas realizaciones, Yi es hidrógeno. En otras realizaciones, Yi es un halo, como por ejemplo un fluoro. En otras realizaciones, Y1 es alquilo(C<6) o alquilo(C<6) sustituido como el metilo.

En algunas realizaciones, el compuesto se define además como

o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de estas fórmulas. En algunas realizaciones, el compuesto se define además como:

o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de estas fórmulas.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden:

(A) un compuesto de la presente divulgación; y

(B) un excipiente.

En algunas realizaciones, la composición está formulada para su administración por vía oral, intraadiposa, intraarterial, intraarticular, intracraneal, intradérmica, intralesional, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrarrectal, intratecal, intratumoral, intraumbilical, intravaginal, intravenosa, intravesicular, por vía intravítrea, por vía liposomal, por vía local, por vía mucosa, por vía parenteral, por vía rectal, por vía subconjuntival, por vía subcutánea, por vía sublingual, por vía tópica, por vía transbucal, por vía transdérmica, por vía vaginal, en cremas, en composiciones lipídicas, por vía de catéter, por vía de lavado, por vía de infusión continua, por vía de infusión, por vía de inhalación, por vía de inyección, por vía de administración local o por vía de perfusión localizada.

En otro aspecto más, la presente divulgación se refiere a un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso como medicamento para tratar o prevenir el cáncer:

en el que:

Rⁱes hidrógeno, acilo^{(C<12 )}o acilo^{(C<12 )}sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

R²es hidrógeno, hidroxi, alcoxi^{(C<12 )}, alcoxi^{(C<12 )}sustituido, aciloxi^{(C<12 )}, o aciloxi^{(C<12 )}sustituido, donde para la versión sustituida uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

X ¹y X²son cada uno independientemente O, S, o NR^a, donde:

R^aes hidrógeno, alquilo^(C<6), o alquilo^(C<6)sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

R³y R⁴son cada uno independientemente:

hidrógeno;

alquilo^{(C<12 )}, arilo^{(C<12 )}, aralquilo^{(C<12 )}, heteroarilo^{(C<12 )}, heteroaralquilo^{(C<12 )}, o una versión sustituida de estos grupos, donde para la versión sustituida uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -as bee², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

un grupo protector de fosfato, en el que el grupo protector de fosfato es pivaloiloximetilo;

R³y R⁴se toman juntos y son alcanodiilo^(C<8)o alcanodiilo^(C<8)sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -Oh , -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²; o

-X³-R⁵; donde:

X³es un enlace covalente,alcanodiilo^(C<8), o alcanodiilo^(C<8)sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²; y

R⁵es acilo^(C<18), alcoxi^(C<18), -C(O)-alcoxi^(C<18), aciloxi^(C<18), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos, donde para las versiones sustituidas uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

A ¹es alcanodiilo^(C<8), alcanodiilo^(C<8)sustituido, alquilaminodiilo^(C<8), o alquilaminodiilo^(C<8)sustituido, donde para las versiones sustituidas uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o-S(O)²NH²; y

Y ¹es hidrógeno, amino, halo, hidroxi, fosfato, alquilo^{(C<12 )}, o alquilo ^{(C<12 )}sustituido, donde para las versiones sustituidas, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

En algunas realizaciones, el compuesto para uso como medicamento para tratar o prevenir el cáncer se define además como:

en el que:

R¹es hidrógeno, hidroxi, alcoxi^{(C<12 )}, alcoxi^{(C<12 )}sustituido, aciloxi^{(C<12 )}, o aciloxi^{(C<12 )}sustituido;

R²y R³son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo^(C<12), alquilo ^(C<12)sustituido, o un grupo protector de fosfato, donde el grupo protector de fosfato es pivaloiloximetilo;

R⁴es hidrógeno, acilo^{(C<12 )}, o acilo^{(C<12 )}sustituido; y

A ¹esalcanodiilo^(C<8),alcanodiilo^(C<8)sustituido, alquilaminodiilo^(C<8)o alquilaminodiilo^(C<8)sustituido; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto para uso como medicamento para tratar o prevenir el cáncer se define además como:

en el que:

Ri es hidrógeno, hidroxi, alcoxi(c<i²), o alcoxi(c<i²) sustituido;

R²y R³son hidrógeno, alquilo(c<i²), alquilo (C<i²) sustituido, o un grupo protector de fosfato, donde el grupo protector de fosfato es pivaloiloximetilo; y

A1 esalcanodiilo(C<8),alcanodiilo(C<8) sustituido, alquilaminodiilo(C<8) o alquilaminodiilo(C<8) sustituido;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto para uso como medicamento para tratar o prevenir el cáncer se define además como:

o

o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de estas fórmulas. En algunas realizaciones, el compuesto para uso como medicamento para tratar o prevenir el cáncer se define además como:

o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de estas fórmulas.

En algunas realizaciones, el cáncer es un carcinoma, sarcoma, linfoma, leucemia, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple o seminoma. En algunas realizaciones, el cáncer es de vejiga, sangre, hueso, cerebro, mama, sistema nervioso central, cuello uterino, colon, endometrio, esófago, vesícula biliar, tracto gastrointestinal, genitales, el tracto genitourinario, la cabeza, el riñón, la laringe, el hígado, el pulmón, el tejido muscular, el cuello, la mucosa oral o nasal, el ovario, el páncreas, la próstata, la piel, el bazo, el intestino delgado, el intestino grueso, el estómago, el testículo o la tiroides. En algunas realizaciones, el cáncer tiene una deleción de ENO1. En algunas realizaciones, el cáncer tiene una deleción homocigota de ENO1 . En algunas realizaciones, el cáncer es un glioblastoma, un carcinoma hepatocelular o un colangiocarcinoma. En algunas realizaciones, el cáncer tiene una deleción heterocigota de ENO1 . En algunas realizaciones, el cáncer es un neuroblastoma, un tumor del estroma gastrointestinal, un ependimoma o un oligodendroglioma. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de cerebro, de hígado o de riñón. En algunas realizaciones, el cáncer cerebral es un glioblastoma multiforme. En algunas realizaciones, el cáncer de hígado es un carcinoma hepatocelular. En algunas realizaciones, el cáncer de riñón es un cáncer de riñón con deficiencia de VHL.

En algunas realizaciones, el cáncer comprende células que tienen un gen ENO1 mutado. En algunas realizaciones, el cáncer comprende células que tienen una mutación heterocigota en el gen ENO1. En algunas realizaciones, el cáncer comprende células que tienen una mutación homocigota en el gen ENO1 . En algunas realizaciones, el gen ENO1 mutado da lugar a una proteína enolasa 1 que presenta una disminución mayor del 25 % en la actividad catalítica en relación con una proteína enolasa 1 de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la proteína presenta una disminución de la actividad catalítica superior al 50 %. En algunas realizaciones, el cáncer comprende células con una deleción del gen ENO1 . En algunas realizaciones, el cáncer comprende células con una deleción del gen 1p36. En algunas realizaciones, la deleción del gen ENO1 da como resultado una célula cancerosa que presenta menos del 25 % de la actividad de tipo salvaje de la enolasa 1. En algunas realizaciones, las células cancerosas presentan menos del 10 % de la actividad de tipo salvaje de la enolasa 1. En algunas realizaciones, el cáncer comprende células con una deleción homocigota del gen ENO1. En algunas realizaciones, el cáncer comprende células con una deleción heterocigota del gen ENO 1. En algunas realizaciones, el cáncer es de una célula que sobreexpresa la enolasa 2.

En otras realizaciones, el cáncer comprende una célula que tiene una mutación en la succinato deshidrogenasa o fumarato hidratasa mitocondrial. En algunas realizaciones, el cáncer comprende células con una mutación en la succinato deshidrogenasa mitocondrial. En algunas realizaciones, el cáncer comprende células con una mutación en la fumarato hidratasa mitocondrial. En algunas realizaciones, el cáncer es un tumor del estroma gastrointestinal, un paraganglioma, un feocromocitoma, un leiomioma, un leiomiosarcoma o un carcinoma de células renales.

En algunas realizaciones, el grupo protector de fosfato es pivaloiloximetilo. En algunas realizaciones, la administración de la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto da lugar a una reducción del riesgo de anemia hemolítica en comparación con la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la enolasa diferente.

En algunas realizaciones, el compuesto se administra junto con una segunda modalidad terapéutica. En algunas realizaciones, la segunda modalidad terapéutica es un agente quimioterapéutico, cirugía, radioterapia o inmunoterapia. En algunas realizaciones, el paciente es un mamífero. En algunas realizaciones, el paciente es un humano.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento.

FIG. 1 muestra la actividad enzimática de la enolasa medida espectrofluorimétricamente in vitro tras la conversión de 2-PG en PEP por ENO1 y ENO2 humanas. Se sobreexpresaron ENO1 y ENO2 humanas en la línea celular D423 humana y se utilizaron para ensayos enzimáticos. Los inhibidores (PhAH (no de la presente invención), SF2312 (que sólo forma parte de la reivindicación 13 anexa) y DesoxiSF2312, Hex, Hepta y Fosmidomicina (no de la presente invención)) se incubaron con la enzima antes de añadir el sustrato 5mM 2-PG. La actividad enzimática se normalizó con respecto a la actividad en ausencia del inhibidor (fijada en 1) y se representó en función de la concentración del inhibidor.

FIGS. 2A Y 2B: La inhibición de ENO1 y ENO2 cuando la enzima es preincubada con los inhibidores, PhAH y SF2312, antes de la introducción del sustrato se muestra en la FIG.2A. La preincubación de PhAH (rombos) o SF2312 (cuadrados) con ENO1 o ENO2 humana antes de la adición del sustrato 2-PG dio lugar a una profunda inhibición de la actividad enzimática (IC ~20 nM); la inhibición de ENO2 con SF2312 fue más profunda y más duradera para que ENO1 (IC⁸⁰para SF2312 es 10 veces menor para ENO2 que para ENO1) mientras que PhAH causó una inhibición más o menos igual de ENO1 y ENO2. La FIG. 2B muestra la inhibición de ENO1 (símbolos gris claro y gris) y ENO2 (símbolos gris oscuro y negro) cuando la enzima es tratada con el sustrato y los inhibidores, PhAH (triángulos) y SF2312 (círculos). La adición concomitante de SF2312/PhAH y 2-PG dio lugar a una inhibición mucho más débil que si los inhibidores se preincubaban antes de la adición del sustrato; este comportamiento se describió previamente para la inhibición por PhAH de la enolasa de levadura (Anderson, et al., 1984), es decir, PhAH actúa como un inhibidor de kactivo "lento". En realidad, SF2312 fue menos potente que PhAH cuando se ensayó en estas condiciones, lo que indica que muestra un kactivo aún más lento que PhAH

FIG. 3 muestra el análisis cinético de Michealis-Menten de SF2312 con ENO1 y ENO2 utilizando varias concentraciones del sustrato de ENO1 y ENO2, 2-fosfoglicerato. El análisis cinético de Michealis-Menten de SF2312 con ENO1 y ENO2, se tituló en el sustrato, 2-PG (se muestran las curvas de 1,25, 2,5, 5, 10 mM para ENO1 y ENO2, según se indica). SF2312 mostró una cinética de inhibición mixta dependiente del sustrato muy inusual. En concreto, a una inhibición del 50 % (IC⁵⁰) de la actividad de la enolasa, el SF2312 se comportó como un inhibidor clásico no competitivo, no viéndose afectado esencialmente por la concentración de sustrato (2-PG). Sin embargo, con una inhibición superior al 75 % de la actividad inicial (IC⁷⁵), se observó una clara dependencia de la concentración de sustrato. Mientras que ENO1 y ENO2 muestran esencialmente el mismo IC⁵⁰para SF2312, los compuestos difieren sustancialmente en el IC⁷⁵y en la forma en que el 2-PG compite con el inhibidor, siendo mucho más difícil que el inhibidor compita con el sustrato en ENO2 que en ENO¹.

FIGS. 4A-4D muestran que la eliminación del grupo 5-OH da lugar a un inhibidor con un IC⁵⁰sustancialmente mayor. Además, mientras que el SF2312 muestra una cinética de inhibición mixta, el desoxi-SF2312 y sus derivados anillados de mayor tamaño muestran una cinética competitiva típica de Michaelis-Menten. La actividad enzimática de SF2312 y desoxi-SF2312 se muestra en función de la concentración del compuesto en la FIG. 4A. Lineweaver-Burke para ENO1 (FIG. 4B) y para ENO2 (FIG. 4C) y los gráficos de Lineweaver-Burke se utilizaron para derivar las pendientes utilizadas en el gráfico recíproco doble (Dixon) y los gráficos de Dixon (FIG. 4D) utilizados para calcular el Ki de los inhibidores y se muestran aquí para Hex. Hex mostró un Ki considerablemente menor para ENO2 que para ENO1.

FIGS. 5A y 5B muestran una comparación directa de PhAH y SF2312 en la eliminación de células de glioma suprimidas por ENO1. Se comparó el SF2312 con el PhAH en cuanto a su efecto sobre la proliferación celular (número total de células, Hoechst 33342) y la apoptosis (células positivas al yoduro de propidio) tras 2 semanas de tratamiento. Tanto PhAH como SF2312 muestran una toxicidad preferente para En O1 suprimido (gris claro) en comparación con el isogénico ENO1-rescatado (símbolos negros). Sin embargo, el SF2312 (FIG. 5B) resultó ser unas 6 veces más potente que el PhAH (FIG. 5A) para inhibir el crecimiento de las células suprimidas por ENO1 (gris claro) y 10 veces más potente para inducir la muerte celular. La reexpresión de ENO2 restauró la resistencia al inhibidor de la enolasa (gris medio), pero la sensibilidad residual a SF2312 fue al menos 4 veces mayor que la de PhAH, lo que concuerda con que SF2312 muestra preferencia por ENO2 sobre ENO1.

FIGS. 6A-6C muestran la cuantificación de los intermedios y productos a través de la ¹³C RMN tras el tratamiento de las células con los inhibidores PhAH y SF2312. Se realizó un rastreo metabólico utilizando ¹³C RMN con ¹³C-glucosa marcada individualmente en el átomo de carbono 1 (C-1) en líneas celulares homocigóticamente suprimidas o genómicamente intactas para ENO1 en presencia o ausencia de 10|jM SF2312. Los medios se recogieron al cabo de cuatro días y los metabolitos se cuantificaron por RMN. En las líneas celulares suprimidas de ENO1 (Gli56, D423), el tratamiento con SF2312 provocó una drástica disminución de las conversiones de ¹³C-1 glucosa a ¹³C-3 lactato, lo que indica una interrupción del flujo a través de la glicólisis. De forma similar, la interrupción de la producción de ¹³C-3 glicerato también pone de manifiesto la interrupción de la glicólisis (FIG. 6C).

FIGS. 7A y 7B muestran el efecto de la protección del fosfato con grupos protectores pivaloiloximetilos sobre su actividad de inhibición en ENO1 (FIG. 7A) y ENO2 (FIG. 7B). Se determinó in vitro la actividad inhibitoria directa de Pom-Hex frente a ENO1 y ENO2 en comparación con su compuesto madre, Hex . Como se describe en la FIG. 2, los datos se obtuvieron utilizando ENO1 y ENO2 humanas que se sobreexpresaron en la línea celular humana D423 y se utilizaron para los ensayos enzimáticos. Los inhibidores (Hex y Pom-Hex) se incubaron con la enzima antes de añadir el sustrato 2-PG 5 mM. La actividad enzimática se normalizó con respecto a la actividad en ausencia del inhibidor (fijada en 1) y se representó en función de la concentración del inhibidor. El Pom-Hex resultó ser un inhibidor de la enolasa mucho más débil que su compuesto original, el Hex. Sin embargo, Pom-Hex sigue conservando cierta actividad inhibidora de la enolasa (~100 j M IC⁵⁰),

FIG.8 muestra el efecto de tratar una célula en condiciones de crecimiento con Pom-Hex utilizando imágenes en vivo con Incucyte. Se comprobó la sensibilidad de varias líneas celulares de glioma, incluida la D423-MG suprimida por ENO1, a Pom-Hex en condiciones de crecimiento convencionales. Había una clara jerarquía de sensibilidad, siendo los astrocitos humanos normales muy resistentes mientras que las células de glioma D423 suprimidas por ENO1 eran sensibles incluso a niveles bajos de nM del inhibidor. Las líneas celulares que eran heterocigotas para ENO1, que había demostrado previamente que tenían una sensibilidad intermedia a la PhAH, también mostraron una sensibilidad intermedia a Pom-Hex.

FIG. 9 muestra el efecto de tratar una célula en condiciones de crecimiento con Pom-Hex después de la fijación terminal y la tinción con violeta de cristal. Se comprobó la sensibilidad de varias líneas celulares de glioma, incluida la D423-MG suprimida por ENO1, a Pom-Hex en condiciones de crecimiento convencionales. Había una clara jerarquía de sensibilidad, siendo los astrocitos humanos normales muy resistentes mientras que las células de glioma D423 suprimidas por ENO1 eran sensibles incluso a niveles bajos de nM del inhibidor. Las líneas celulares que eran heterocigotas para ENO1, que había demostrado previamente que tenían una sensibilidad intermedia a la PhAH, también mostraron una sensibilidad intermedia a Pom-Hex.

FIGS. 10A y 10B muestran los efectos de Hex (FIG. 10A) y Pom-Hex (FIG. 10B) en células de glioma de neurosfera de 3 dimensiones. Para modelar los tumores con mayor precisión, se cultivaron células de glioma en condiciones de neuroesfera de 3 dimensiones y se visualizaron con 100 nM de tetrametilrhodamina, que es captada activamente por las células vivas pero no por las muertas. La relación superficie/volumen es considerablemente menor que en las condiciones convencionales de cultivo celular y, por tanto, los compuestos con escasa penetración celular, como los fosfonatos, tienen una eficacia considerablemente menor que en el cultivo celular convencional. Por lo tanto, en estas condiciones, incluso las células suprimidas de ENO1 sólo fueron ligeramente sensibles al fosfonato libre parental, Hex (FIG. 10A). Sin embargo, en las mismas condiciones, el pro-fármaco permeable a la célula, Pomhex, fue altamente tóxico para las células de glioma suprimidas de e No 1 (FIG. 10B).

FIGS. 11A-D muestran el rastreo de un tumor de glioma a través de RMN T2 en ausencia de tratamiento con crecimiento continuo (FIGS. 11Ay 11B), con la inyección IV de Pom-Hex a 10 mg/kg que mostró la detención del crecimiento del tumor y erradicó completamente el tumor como se observó por la desaparición del área de alto contraste (FIG. 11C), y 3 meses después de la interrupción del tratamiento, ya que el animal permanecía sano y libre de tumores (FIG. 11D). Se inyectaron ratones lampiños con células de glioma D423-MG que llevan la deleción 1p36 que abarca ENO1. Los tumores se formaron alrededor de 30 días después de la inyección y el crecimiento se siguió de forma no invasiva mediante resonancia magnética T2. En ausencia de tratamiento, los tumores crecían de forma continua y acababan matando al animal. El área del tumor (lado derecho del cerebro) se distingue del cerebro normal del ratón por el alto contraste.

FIG. 12 muestra los efectos inhibitorios de dosis crecientes de Pom-Hex en células de cáncer de riñón suprimidas por VHL y en células de cáncer de riñón rescatadas por VHL. En dos líneas celulares independientes de cáncer de riñón con deleción de VHL, RCC4 (par inferior) y 786-O (par superior), el inhibidor de la enolasa Pom-Hex fue 4-8 veces más tóxico para la deleción de VHL (paneles superiores), en comparación con los controles isogénicos rescatados, que expresan VHL a partir de un locus ectópico (paneles inferiores, cursiva). Las células se midieron mediante imágenes de crecimiento en vivo utilizando Incucyte.

FIGS. 13A-D muestran los residuos de aminoácidos implicados en la unión del inhibidor según los estudios de modelización de los derivados cíclicos estabilizados en la columna vertebral de PhAH acoplados a ENO2.

Se muestran los residuos (numeración del ENO2 humano) que están a menos de 4Á de los inhibidores acoplados, y se señalan con líneas los que forman interacciones directas. La mayor parte de estos residuos están muy conservados, lo que es coherente con la estrecha interacción con el sustrato de la enzima. Las principales interacciones con los átomos de Mg siguen siendo esencialmente las mismas que con el PhAH. El aumento del tamaño del anillo no proporciona interacciones adicionales (FIGS. 13B-D, respectivamente). Sin estar limitado por la teoría, la adición del grupo hidroxi en SF2312 (FIG. 13A) da lugar a un fuerte enlace de hidrógeno con un residuo altamente conservado. Sin estar limitado por la teoría, se cree que un estereoisómero de SF2312 y de los otros inhibidores era compatible con la unión preferente en el sitio activo.

FIG. 14 muestra la estabilidad de Pom-SF2312 en medios de cultivo celular (DMEM con 10 % de suero bovino fetal) a lo largo del tiempo se midió por³¹P RMN desacoplada de protones. En 12 horas, más de la mitad de Pom-SF2312 se hidrolizó a Hemi-Pom-SF2312. Sin embargo, el Hemi-Pom-SF2312 no se hidrolizó apreciablemente a SF2312 en 24 horas.

FIGS. 15A y 15B muestran la mayor estabilidad de Pom-Hex (FIG. 15A) muestra una estabilidad considerablemente mayor que Pom-SF2312 (FIG. 15B) en los medios. Mientras que más de la mitad del Pom-SF2312 se había hidrolizado a las 12 horas, la mitad del Pom-Hex inicial tardó más de 24 horas en hidrolizarse. Las vidas medias estimadas son de 8 horas para Pom-SF2312 y 36 horas para Pom-Hex. La hidrólisis no prosiguió, y ni el SF2312, ni el Hex, fueron detectables incluso después de 72 horas de incubación.

FIGS. 16A y 16B muestran que Pom-SF2312 (FIG. 16A) y Diacetil-Pom-SF2312 (FIG. 16B) son selectivamente tóxicos para las células de glioma con eliminación de ENOl. Los IC⁵⁰aproximados para la inhibición del crecimiento de las células de glioma nulo ENO1 son <75 nM para Pom-SF2312 y ~150 nM para Diacetil-Pom-SF2312, mientras que Pom-Hex tiene un IC⁵⁰de alrededor de 35 nM.

FIG. 17 muestra animales (ratones inmunocomprometidos NUDE) inyectados intracranealmente con la línea celular de glioblastoma suprimida por ENO1, Gli56. Después de 30 días, los tumores se hicieron fácilmente visibles por IRM (T², las regiones blancas hiperintensas son el tumor sobre el fondo gris del cerebro normal). En ausencia de tratamiento, los tumores Gli56 crecen de forma continua (Ratón #1, y Ratón #3, desde el día 30 hasta el día 40). El tratamiento con Pom-SF2312 no ralentizó significativamente el crecimiento del tumor (Ratón #2), incluso a 4 MPK (mg/kg), que era la dosis máxima tolerada. Sin embargo, el tratamiento con Pom-Hex no sólo detuvo el crecimiento del tumor, sino que en realidad condujo a una profunda regresión del mismo, y a su eventual desaparición. Los tumores no han reaparecido ni siquiera tras la interrupción del tratamiento.

FIG. 18A-18D muestran la estructura cristalina con PhAh (FIG. 18A), SF2312 (FIG. 18B), Hex (FIG. 18C), y Hepta (FIG. 18D) unido al sitio activo de la enzima enolasa.

FIG. 19A-19F muestran la actividad en POMHex (FIG. 19A), POMSF (FIG. 19B), Diacetil POMSF (FIG. 19C), 115-36 (FIG. 19D), MetilSF2312 (FIG. 19E), y FluoroSF2312 (FIG. 19F) para D423-MG (ENOl nulo), D423-MG pCMV ENO1 que es ENO1 rescatado, y LN319 que es de tipo salvaje para ENO1

FIG. 20 muestra la separación cromatográfica quiral del intermedio 15. El intermedio 15, que consiste en una mezcla de isómeros cis/trans en una relación de 65:35, se analizó por HPLC quiral. El cromatograma mostró 4 picos, dos mayores y dos menores, en una relación de 65:35. Basándose en la abundancia relativa, se asignaron a los isómeros cis y trans ; esto se confirmó mediante RMN (véase la FIG.21). Los cuatro isómeros se separaron y cada uno se volvió a analizar en el mismo HPLC quiral para confirmar la pureza quiral. Las condiciones de la HPLC fueron las siguientes: Fase móvil, isocrática 76 % Hexano, 18 % Etanol, 4 % Isopropanol, 2 % acetonitrilo, 0,1 % TFA; caudal: 20 ml/minuto. Columna: Fase normal Lux Cell-1 21,2 * 150 mm (Phenomenex®, Torrence, CA).

FIGS. 21Ay 21B muestran la caracterización por RMN de las entidades purificadas por cromatografía quiral. La RMN de los enantiómeros purificados por cromatografía quiral se realizó a medida que los enantiómeros salían de la columna. Para minimizar el tiempo entre la purificación y el registro de RMN (para evitar la racemización), no se evaporaron los disolventes de la fase móvil, sino que se añadió un volumen equivalente de acetonitrilo deuterado para el bloqueo de la señal. Debido a la presencia de disolventes de la fase móvil (hexano, etanol, isopropanol, acetonitrilo, TFA), el espectro de ¹H hasta 4 ppm está ofuscado. Sin embargo, los protones hemiaminal y bencílico son fácilmente identificables (FIG. 21A). El intermedio inicial 15, se caracteriza por dos conjuntos de protones hemiamínicos (multiplete, 5,08-5,06 ppm) y bencilmetileno(cis: sistema ab 4,99 ppm; trans: 4,94) protones en relación 65:35 de acuerdo con Hanaya e Itoh (2011). En el espectro de ³¹P RMN (FIG. 21B), se evidencian dos picos, previamente identificados como los isómeros cis y trans (campo abajo a 24,5 ppm y campo arriba a 23,5 ppm, respectivamente como se señala en Hanaya e Itoh, 2011), presentes en relación 65:35. Cada enantiómero purificado mostró un único pico en la RMN de ³¹P (trans: 24,5 ppm; cis: 23,5 ppm), así como un conjunto de protones de hemiamina y bencilmetileno (Hanaya e Itoh, 2011).

FIGS. 22A y 22B muestran la pérdida de enantiopureza tras un tratamiento acuoso alcalino suave. Inmediatamente después de la cromatografía quiral, cada enantiómero se lavó con NaHCO³saturado (para neutralizar el TFA) y se extrajo con acetato de etilo; la fase orgánica se secó sobre MgSO⁴y se evaporó. El análisis de HPLC quiral mostró la presencia de los cuatro picos iniciales distintos, demostrando la inestabilidad quiral de este intermedio (trazo superior en la FIG. 22A; el trazo central muestra el pico del enantiómero purificado 2 antes de la racemización, mientras que el trazo inferior muestra la mezcla racémica inicial del intermedio 15). La racemización se confirmó mediante ³¹P RMN (FIG. 22B): sólo se detecta un diastereómero cis en el pico 2 aislado (trazo central), mientras que los diastereómeros cis y trans son evidentes tras el tratamiento acuoso (trazo superior). El experimento se repitió con los picos 1, 3 y 4 purificados, con idénticos resultados.

FIG. 23 muestra que el SF2312 es un potente inhibidor de la enolasa humana. La actividad enzimática de la enolasa se midió por espectrofluorimetría in vitro siguiendo la conversión de 2-PGA en PEP. Se sobreexpresaron ENO1 y ENO2 en la línea celular humana D423 y se utilizaron sus lisados para los ensayos enzimáticos. Los inhibidores (PhAH, SF2312 y DesoxiSF2312) se incubaron con la enzima antes de añadir el sustrato 2-PGA 5 mM. La actividad enzimática se normalizó con respecto a la actividad en ausencia del inhibidor (fijada en 1, eje y) y se representó en función de la concentración del inhibidor (serie de diluciones de 2 veces, en nM, eje x). SF2312 fue el inhibidor más potente, especialmente contra ENO2 (inhibición de ENOl con SF2312, trazo gris claro con símbolos cuadrados; ENO2 trazo gris oscuro con símbolos negros).

FIGS. 24A y 24B muestran el SF2312 con una cinética mixta competitiva y no competitiva. La actividad de la enolasa (lisados de la línea celular D423 que sobreexpresa ENO2) se midió en función del sustrato (2-PGA) y del inhibidor (SF2312, FIG. 24A, Desoxi-SF2312, FiG. 24B) concentración. SF2312 mostró una cinética de inhibición mixta dependiente del sustrato muy inusual. Con una inhibición del 50 % (IC⁵⁰) de la actividad de la enolasa, el SF2312 se comportó como un inhibidor clásico no competitivo, no viéndose afectado esencialmente por la concentración de sustrato (2-PGA). Sin embargo, con una inhibición superior al 75 % de la actividad inicial (IC⁷⁵), se observó una clara dependencia de la concentración de sustrato. Esta inhibición mixta es muy inusual y puede estar relacionada con las interacciones conocidas entre los monómeros del dímero de la enolasa, por lo que la unión de una molécula inhibidora a un dímero, altera la conformación y la afinidad de unión del otro dímero. La desoxi-SF2312 mostró una cinética competitiva de sustrato típica (Qin, et al., 2012).

FIGS. 25A y 25B muestran que el SF2312 es un inhibidor de unión lenta con un k^inactivomás bajo para ENO2 que para ENO1. La FIG. 25A Pre-incubación de PhAH (diamantes) o SF2312 (cuadrados) con ENO1 (gris claro, gris) o ENO2 (gris oscuro, negro) como se describe en la f Ig . 23 y FIG. 24 antes de la adición del sustrato 2-PGA dio lugar a una profunda inhibición de la actividad enzimática (IC ~20 nM); la inhibición de ENO2 con SF2312 fue más profunda y más duradera para que ENO1 (IC⁸⁰para SF2312 es 10 veces menor para ENO2 que ENO1) mientras que PhAH causó una inhibición más o menos igual de ENO1 y ENO2. FIG.

25B La adición de SF2312/PhAH antes de la 2-PGA dio lugar a una inhibición mucho más débil que si los inhibidores se preincubaban antes de la adición del sustrato; este comportamiento se describió previamente para la inhibición por PhAH de la enolasa de levadura, es decir, la PhAH actúa como un inhibidor de kactivo "lento" (Anderson, et al., 1984). El SF2312 fue menos potente que el PhAH cuando se ensayó en estas condiciones, lo que indica que muestra un kactivo aún más lento que el PhAH. Dado que el SF2312 es más potente que el PhAH cuando se preincuba antes de añadir el sustrato, esto indica que el SF2312 tiene un kinactivo mucho más lento que el PhAH y que la mayor potencia inhibitoria del SF2312 contra la ENO2 respecto a la ENO1 se debe a las diferencias en el kinactivo y no en el kactivo . SF2312, al igual que PhAH, se une a la forma di-Mg de la enzima. ENO2 tiene una mayor afinidad por el segundo ion magnesio (Mg^b) y una estabilidad general mucho mayor que ENO1 (Marangos, et al., 1978; Marangos y Schmechel, 1980; Marangos, et al., 1979). Dado que la Mg^bdebe disociarse primero antes de que el inhibidor pueda salir del sitio activo, sin querer estar atado a ninguna teoría, se cree que la mayor afinidad de ENO2 por la Mg^bpuede explicar el kinactivo más lento para el SF2312 en ENO2 frente a ENO1.

FIGS. 26A y 26B muestran que el SF2312 estabiliza la enolasa 2 contra la desnaturalización térmica. Los lisados de las células D423 que sobreexpresan ENO2 se incubaron con vehículo, PhAH o SF2312. La desnaturalización térmica se realizó con una máquina de PCR de gradiente de temperatura, seguida de centrifugación e inmunotransferencia del sobrenadante. Las proteínas desnaturalizadas precipitan y se pierden del sobrenadante. La inmunotransferencia del sobrenadante frente a ENO2 mostró que la adición de 1 |jM de SF2312 desplazó la curva de desnaturalización térmica en 7,5 °C (flechas), mientras que el PhAH la desplazó en unos mucho más modestos 2,5 °C. La desnaturalización térmica de la vinculina y la trifosfato isomerasa (TPI) no se vio afectada por ninguno de los dos inhibidores. El panel inferior muestra la cuantificación de la intensidad de las bandas (eje y) frente a la temperatura (eje x), siendo el trazo en triángulos el vehículo, en diamantes el PhAH y en cuadrados los grupos de tratamiento con SF2312.

FIGS. 27A y 27B muestran que PhAH y SF2312 interactúan con ENO2 a través de una compleja red de interacciones electrostáticas, de coordinación metálica y de enlaces de hidrógeno. Presentación estereoscópica de PhAH (FIG. 27A) y SF2312 (FIG. 27B) en el sitio activo de ENO2. La columna vertebral de la proteína se muestra utilizando la representación de dibujos animados con aminoácidos clave para la unión del magnesio o del ligando resaltados utilizando la representación de varas. Los iones de magnesio y las moléculas de agua se muestran como esferas respectivamente. Los enlaces de hidrógeno y los enlaces de coordinación metálicos están representados por líneas negras discontinuas. El mapa de densidad electrónica de omisión imparcial de 2Fo-Fc para cada ligando, en contorno a 1,5a, se muestra como una malla gris alrededor del ligando. Las coordenadas se depositaron en PDB (ENO2:PhAH, 4ZAO; ENO2:SF2312, 4ZCW).

FIGS. 28A y 28B muestran que SF2312 estabiliza la Enolasa 2 humana recombinante contra la desnaturalización térmica. La ENO2 expresada por E. coli purificada se incubó con 10 pM de SF2312, PhAH o vehículo y se sometió a desnaturalización térmica con separación del sobrenadante como se describe en los Ejemplos. El sobrenadante se sometió a inmunotransferencia contra ENO2 (FIG. 28A) y la intensidad de la banda en función de la temperatura (FIG. 28B). El tratamiento con SF2312 desplazó la curva de desnaturalización térmica en ~15 °C, considerablemente más que la observada con la misma concentración de PhAH

FIG. 29 muestra estructuras de fosfonatos con similitud a SF2312 pero que carecen de actividad inhibidora de la enolasa. La fosmidomicina, la fosfomicina y el foscanet fueron sometidos a pruebas de actividad inhibidora de la enolasa en lisados de células que expresan D423 ENO1 y ENO2, como se describe en las FIGS. 23 & 24. A pesar de la similitud con el SF2312 y el desoxi-SF2312, no se observó ninguna actividad inhibidora a partir de 10 mM.

FIGS. 30A-30F muestran que SF2312 es más potente que PhAH contra las células de glioma con supresión de ENO1. El SF2312 se comparó con el PhAH en cuanto a su efecto sobre la proliferación celular (número total de células, Hoechst 33342) y la apoptosis. Los controles isogénicos D423 con supresión de ENO1 (gris claro), D423 que expresan ENOl (gris oscuro) o que sobreexpresan ENO2 (gris claro) se trataron con concentraciones variables de inhibidores, según se indica en pM, y la primera y la última columna sirvieron como controles del vehículo. Después de 2 semanas de tratamiento, se analizó el número de células en las placas (número total de células, Hoechst 33342) y la apoptosis (células positivas a YO-PRO®-1) utilizando el sistema de imágenes de alto contenido Operetta®. Los paneles de la izquierda muestran placas de 96 pocillos tratadas con SF2312 (FIG. 30A) y PhAH (FIG. 30B) teñidas con Hoechst; la extensión del color claro indica el número de células. Los resultados cuantificados del número de células y de la apoptosis en función de la concentración del inhibidor se presentan en los paneles FIGS.30C y 30D y FIGS.30E y 30F respectivamente; cada punto de datos representa la media de dos réplicas, expresada en función del control del vehículo (N=4). El SF2312 resultó ser considerablemente más tóxico para las células con supresión de ENO1 que el PhAH, especialmente en lo que respecta a su capacidad para inducir la apoptosis.

FIGS. 31A-31D muestran que SF2312 inhibe selectivamente la proliferación de las células de glioma suprimidas por ENO1. Las líneas celulares Gli56 y D423 ENO1 suprimidas y no suprimidas (U373, NB1) fueron tratadas con dosis variables de SF2312 (FiG.31B) o PhAH (FiG.31A) durante un total de diez días. La proliferación celular se midió utilizando el Incucyte con curvas de crecimiento mostradas en trazos grises oscuros (eje Y, confluencia celular, eje X, tiempo). Las curvas ascendentes pronunciadas indican un aumento de la confluencia y la proliferación. Las curvas planas indican una confluencia estable y una proliferación inhibida, mientras que las curvas descendentes indican la muerte celular. En la FIG. 31C (PhAH) y FIG. 31D, para cada línea celular, se cuantificó la proliferación (N=2 réplicas) y se expresó en relación con los controles del vehículo (N=4) en función de la concentración del inhibidor. Mientras que tanto PhAH como SF2312 mostraron una inhibición selectiva de la proliferación de las líneas celulares con supresión de ENO1, SF2312 fue más potente que PhAH

FIGS. 32A-32D muestra que SF2312 inhibe selectivamente la glicólisis en las células de glioma suprimidas por ENO1. Las células d 423 suprimidas por ENO1 y las isogénicas rescatadas fueron suplementadas con glucosa marcada con 13C-1 ytratadas con 10 pM de SF2312 o PhAH durante 72 horas. El medio condicionado se extrajo con metanol frío al 80 % y se cribó mediante 13C RMN en modo desacoplado de protones. Los picos a ~97 y 93 ppm corresponden a los isómeros de la glucosa, mientras que los picos a ~20 ppm corresponden al C3 del lactato, y a 64 ppm corresponden al C3 del glicerato (FIG. 4 l ). Los picos se cuantificaron por integración (eje y, unidades integrales). Las barras representan mediciones individuales de muestras tratadas, extraídas y medidas independientemente. Se indican las diferencias estadísticamente significativas mediante una prueba t no apareada de dos colas con corrección de Bonferroni; para las comparaciones estadísticamente significativas, la varianza fue similar. El tratamiento con SF2312 dio lugar a una drástica reducción de 13C3-lactato, con un aumento concomitante de la producción de 13C3-glicerato, selectivamente en las células D423 con supresión de ENO1 y no en las células isogénicas rescatadas. El tratamiento con PhAH produjo efectos similares, pero de menor magnitud. El experimento se realizó una sola vez, pero las conclusiones fueron confirmadas por un experimento independiente utilizando glucosa marcada con 13C uniforme (FIG. 34)

FIG. 33 muestra que el SF2312 inhibe selectivamente la glicólisis en las células de glioma con supresión de ENOl. Las células Gli56 y D423 suprimidas por ENO1 y las no suprimidas (U373, NB1) se complementaron con glucosa marcada con 13C-1 (indicada con un asterisco*) tratadas con 10 pM de SF2312 durante cuatro días. El medio condicionado se recogió al cabo de cuatro días y se extrajo y cribó mediante 13C RMN en modo desacoplado de protones. Los grandes picos a ~97 y 93 ppm corresponden a los isómeros de la glucosa y a ~20 ppm al C3 del lactato. En ausencia de tratamiento, los picos de glucosa desaparecieron con la aparición concomitante de picos de lactato. El tratamiento con SF2312 inhibió la desaparición de la glucosa y la aparición de los picos de lactato, pero sólo en las células suprimidas de D423 y Gli56 ENO1, lo que indica una inhibición selectiva de la glicólisis en estas líneas celulares.

FIGS. 34A-34C muestran que SF2312 inhibe selectivamente la conversión de 13C-glucosa marcada uniformemente a 13C-lactato en células de glioma suprimidas por ENO1. Las células D423 suprimidas por ENO1 (rombos) y las células D423 rescatadas ectópicamente (D423 ENO1; cuadrados) fueron tratadas con dosis variables de SF2312 y PhAH en medios que contenían 10 mM de glucosa marcada con 13C uniforme. Cuarenta y ocho horas más tarde, se recogió el medio y se cribó la 13C-RMN. El panel de la derecha muestra las trazas de los medios de las células suprimidas de D423 ENO1 tratadas con diferentes concentraciones de SF2312. Los picos correspondientes a la glucosa (de 100 a 50 ppm, FIG. 34C) están entre corchetes, mientras que los picos correspondientes a los átomos C1, C2y C3 del lactato se señalan con flechas negras. Se muestra una ampliación del pico de lactato C3. Se determinó la relación entre la integral del lactato y la integral de la glucosa, se normalizó con respecto al control tratado con vehículo y se representó gráficamente en función de la concentración de PhAH o SF2312 (FIGS. 34A Y 34B). Concentraciones de SF2312tan bajas como 6,25 pM fueron suficientes para disminuir la relación de 13C Lactato/13C glucosa en un 70 %, mientras que 50 pM de PhAH fueron necesarios para un nivel similar de inhibición en las células de glioma suprimidas por ENOl. Por el contrario, incluso a 200 pM, ni el PhAH ni el SF2312 disminuyeron el lactato/glucosa en las células de glioma D423 rescatadas de ENO1.

FIGS. 35A-35F muestra que el SF2312 agota selectivamente el ATP en las células de glioma con supresión de ENOl. Las células de glioma D423 con supresión de ENO1 (rombos) y el control isogénico con supresión de ENO1 (cuadrados) fueron tratados durante 8 horas con PhAH (FIgS.35A, 35C y 35F) o SF2312 (FIGS.

35B, 35D y 35F) a las concentraciones indicadas en el eje x y los efectos sobre el ATP (FIGS.35A y 35B), el número de células (FIGS. 35C y 35D) y la muerte celular (FiGS.35E y 35F). El ATP se midió mediante el ensayo Cell-Titer Glow. Cada punto de datos representa la media de dos réplicas expresadas en función del control tratado con vehículo. Número de células como núcleos medidos a través de Hoechst 33342 utilizando el Operetta®. Cada dato representa la media de dos pocillos repetidos con nueve campos cuantificados por pocillo y expresados en relación con los controles no tratados (FlGS. 35C Y 35D). La extensión de la muerte celular (FIGS.35E y 35F) se expresó como la fracción de núcleos positivos al yoduro de propidio. Cada punto de datos representa la media de dos réplicas de nueve campos de observación cada una. A las 8 horas de tratamiento, el tratamiento con SF2312 provocó un agotamiento de ATP dependiente de la dosis en las células de glioma suprimidas por ENO1, pero no en las rescatadas.

FIGS. 36A-36H muestra el efecto de SF2312 y PhAH sobre la muerte celular y el número de células en células de glioma suprimidas por ENO1 y rescatadas isogénicamente. Las células de glioma D423 con supresión de ENO1 (rombos) y el control isogénico con supresión de ENO1 (cuadrados) fueron tratados durante 24 horas (FIGS. 36A, 36B, 36E y 36F) o 48 horas (FIGS. 36C, 36D, 36G y 36H) con PhAH (FIGS.

36A, 36C, 36E y 36G) o SF2312 (FIGS. 36B, 36D, 36F y 36H) a las concentraciones indicadas en el eje x y los efectos sobre el número de células (FIGS. 36A, 36B, 36C y 36D) y la muerte celular (FIGS. 36E, 36F, 36G y 36H). Número de células como núcleos medidos a través de Hoechst 33342 utilizando el Operetta®. Cada dato representa la media de dos pocillos repetidos con nueve campos cuantificados por pocillo y expresados en relación con los controles no tratados (FIGS.36A, 36B, 36C Y 36D). La extensión de la muerte celular (FIGS. 36E, 36F, 36G y 36H) se expresó como la fracción de núcleos positivos al yoduro de propidio. Cada punto de datos representa la media de dos réplicas de nueve campos de observación cada una. El tratamiento con SF2312 provocó una inducción de la muerte celular dependiente del tiempo y de la dosis en las células suprimidas por ENO1, pero no en las rescatadas. La muerte celular en respuesta a la PhAH fue considerablemente más débil.

FIGS.37Ay 37B muestran que el tratamiento con SF2312 conduce a la acumulación de metabolitos corriente arriba de la reacción de la enolasa y al agotamiento del fosfato de alta energía. Las células de glioma D423 con supresión de ENO1 y las de control isogénico fueron tratadas con vehículo, 10 pM y 25 pM de SF2312 durante 72 horas. Los metabolitos polares fueron extraídos y cuantificados por espectroscopia de masas como se describe en los ejemplos. Las barras representan mediciones individuales de células tratadas, extraídas y medidas independientemente. Barras gris claro, células de glioma D423 suprimidas por ENO1 CT (N=6); barras gris claro medio, células suprimidas por ENO1 tratadas con 10 pM de SF2312 (N=3); barras gris medio, células suprimidas por ENO1 con 25 pM de SF2312 (N=3); barras grises oscuras, células D423 rescatadas de ENO1CT (N=6); barras grises claras, rescatadas de ENO1 tratadas con 10 pM SF2312 (N=3); barras grises, rescatadasde ENO1 con 25 pM SF2312 tratadas (N=3), gris oscuro. Se indican las comparaciones estadísticamente significativas, por medio de una prueba t no emparejada, de 2 colas, con corrección de Bonferroni; para las comparaciones significativas, la varianza fue similar. En las células de glioma suprimidas por ENOl, el tratamiento con SF2312 condujo a un aumento de la relación entre 3-PGA y PEP (FIG. 37A), metabolitos inmediatamente corriente arriba y corriente abajo a la reacción de la enolasa, lo que concuerda con la inhibición de la enolasa. Una tendencia similar surgió en las células rescatadas por ENO1, pero no alcanzó significación estadística (P<0,06). El tratamiento con SF2312 condujo a una depleción selectiva de fosfo-creatina en las células suprimidas por ENO1 pero no en las rescatadas (FIG. 37B).

FIG. 38 muestra el efecto diferencial de las células de tipo salvaje de ENO1 y de las células nulas de ENO1 cuando son tratadas con un inhibidor de ENO en la supervivencia celular como consecuencia de la inhibición de ENO1 y ENO2.

FIG. 39A y 39B muestran que las células de glioma con supresión de ENO1 tienen una menor actividad de enolasa. Las células de glioma D423 y Gli56 llevan deleciones homocigóticas 1p36 que abarcan ENO1 (Muller, et al., 2012). La ausencia de expresión de ENO1 en las células D423 y Gli56 se verificó mediante inmunotransferencia weetern (FIG. 39A); a pesar de la ausencia total de ENO1, los niveles de ENO2 se mantuvieron similares a los de las otras líneas celulares. Como resultado, las células D423 y Gli56 con supresión de ENOIson profundamente deficientes en la actividad de la enolasa en comparación con las células intactas con ENO1 (FIG. 39B). Los lisados nativos de las células de glioma D423 (gris claro) y Gli56 (gris claro) suprimidas por ENO1 y de las células de glioma U373 (gris oscuro) y NB1 (gris oscuro,) intactas por ENO1, así como de los astrocitos humanos normales (gris oscuro), se igualaron en cuanto a proteínas y se midió la actividad de la enolasa mediante el ensayo ligado a NADH (eje y, medido con fluorescencia de 340 nm de excitación/460 nm de emisión; véanse los ejemplos). La pendiente de cada trazo refleja el nivel de actividad de la enolasa; los NB1, U373 y los astrocitos intactos con ENO1 tienen pendientes ~10 más altas que los D423 y Gli56 suprimidos con ENO1, lo que confirma que estos últimos son profundamente deficientes en la actividad de la enolasa.

FIGS. 40Ay 40B muestran la expresión de Enolasa en células de glioma suprimidas por ENO1, rescatadas por ENO1 y rescatadas por ENO2. La expresión de ENO1, ENO2 y enolasa total (Pan-ENO) se determinó por inmunotransferencia en un panel de líneas celulares de glioma (FIG. 40A) y en las células de glioma D423 suprimidas por ENO1, rescatadas por la reexpresión de e NO1 (D423 ENO1, gris oscuro) o la sobreexpresión de ENO2 (D423 ENO2, gris claro) con referencia a la línea de glioma LN319 intacta por ENO1 (FIG. 40B). El TPI se utilizó como control de carga. ENO1 era indetectable en la línea celular D423 con supresión de ENO1 (FIG. 40A), mientras que la expresión de ENO2 fue similar a la de las otras líneas celulares del panel. La expresión total de la enolasa, determinada por el anticuerpo pan-ENO, se redujo en las células d 423 con supresión de ENO1. La expresión ectópica de ENO1 (D423 ENO1, FIG. 40B) o la sobreexpresión de ENO2 (D423 ENO2), restauraron la expresión total de enolasa (Pan-ENO, FIG. 40B) a niveles similares a los de la línea celular de glioma LN319 intacta con ENO1.

FIG. 41 muestra que el tratamiento con SF2312 conduce a una acumulación de productos intermedios corriente arriba de la enolasa. Las células de glioma con ENO1 intacto (U373, NB1) y con ENO1 suprimido (D423, Gli56) se cultivaron en medio de glucosa 13C-1 y se trataron con 10 pM de SF2312. El medio se extrajo y se cribó mediante 13C RMN desacoplada por protones. En las líneas celulares con supresión de ENO1, pero no en las que están intactas, el tratamiento con SF2312 provocó la aparición de un pico distinto a 64 ppm. Este pico es consistente con la secreción de glicerato en el medio, que puede formar 3-fosfoglicerato por la acción de la glicerato quinasa (GLYCTK) o por hidrólisis espontánea como resultado de la acumulación de sustratos (fosfoglicerato) corriente arriba de la enolasa.

FIGS. 42A y 42B muestran la estabilización térmica de ENO2 por SF2312 y PhAH en células de glioma intactas. Los ensayos de desplazamiento (Martínez Molina, et al., 2013) en células D423 que sobreexpresan ENO2 se realizaron como se detalla en los procedimientos. Las células de glioma intactas se trataron con 100 pM de PhAH, SF2312 o vehículo y se calentaron alícuotas individuales entre 50 y 90 °C, como se indica. Se generaron lisados y el sobrenadante se sometió a inmunotransferencia para ENO2 y Vinculina (FIG. 42A). La intensidad relativa de las bandas de ENO2 se representó en función de la temperatura (FIG. 42B). Tanto el PhAH como el SF2312 produjeron una drástica estabilización de la ENO2, siendo el efecto más drástico en el caso del último.

FIG. 43 muestra la separación de los diferentes diastereómeros de un derivado totalmente protegido del metil SF2312. Los picos se analizaron y separaron mediante HPLC quiral.

FIG. 44 muestra el material de partida racemizado, enantiopurificado y racémico del metil SF2312 y la correspondiente ampliación de los espectros 1H y 31P de RMN.

FIG. 45 muestra los espectros de 1RMN y los espectros de 31P RMN del metil SF2312 desprotegido y enantiopuro. El pico 1 representa la estructura más a la derecha.

FIG. 46 muestra que el compuesto correspondiente al pico 2 de Metil SF2312 muestra una actividad 1000 veces mayor que el compuesto del pico 1 de Metil SF2312.

FIG. 47 muestra las interacciones de unión de PhAH, SF2312 y Metil SF2312 dentro del sitio activo de la enzima enolasa.

FIG. 48 muestra las interacciones de unión así como las estructuras cristalinas para SF2312 y Hex con el sitio activo de la enzima enolasa.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona compuestos que pueden utilizarse como inhibidores de la enolasa. Los compuestos y las composiciones que se proporcionan en el presente documento pueden utilizarse para el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es deficiente en la enzima enolasa 1. Por ejemplo, la inhibición de la enolasa puede utilizarse para bloquear la glicólisis y provocar la apoptosis celular. En algunas realizaciones, los compuestos y las composiciones aquí proporcionadas inhiben preferentemente la enolasa 2 sobre la enolasa 1.

I. Compuestos y procedimientos sintéticos

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona compuestos de la fórmula:

en el que:

Rⁱes hidrógeno, acilo^(C<i2)o acilo^(C<i2)sustituido, preferentemente hidrógeno en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH^a, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

R²es hidrógeno, aciloxi^(C<i2), o aciloxi^(C<i2)sustituido, preferentemente R²es aciloxi^(C<8)o aciloxi^(C<8)sustituido, donde para la versión sustituida uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

X ⁱy X²son cada uno independientemente O, S, o NR^a, preferentemente X ⁱy X²son cada uno O, donde: R^aes hidrógeno, alquilo^(C<6), o alquilo^(C<6)sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

R³y R⁴son cada uno independientemente:

hidrógeno;

alquilo^{(C<i2 )}, arilo^{(C<i2 )}, aralquilo^{(C<i2 )}, heteroarilo^{(C<i2 )}, heteroaralquilo^{(C<i2 )}, o una versión sustituida de estos grupos, donde para la versión sustituida uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiilo^(C<6)-aciloxi^{(C<i2 )}o alcanodiilo^(C<6)-aciloxi^{(C<i2 )}sustituido, en el que para las versiones sustituidas, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

-X3-R5; donde:

X³es un enlace covalente, alcanodiilo^(C<8), o alcanodiilo^(C<8)sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²; y

R⁵es acilo^(C<i8), alcoxi^(C<i8), -C(O)-alcoxi^(C<i8), aciloxi^(C<i8), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos, donde para la versión sustituida uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

i7

A ¹es alcanodiilo^(C<8), alcanodiilo^(C<8)sustituido, alquilaminodiilo^(C<8), o alquilaminodiilo^(C<8)sustituido, donde para la versión sustituida uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²; y

Y ¹es hidrógeno, amino, halo, hidroxi, fosfato, alquilo^{(C<12 )}, o alquilo ^{(C<12 )}sustituido, donde para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En algunas realizaciones, el compuesto se define además como:

en el que: R1 es hidrógeno, aciloxi(C<12), o aciloxi(C<12) sustituido; R2 y R3 son hidrógeno, alquilo(C<12), alquilo(C<12) sustituido, o un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiil(C<6)-aciloxi(C<12) o alcanodiilo(C<6)-aciloxi(C<12) sustituido; y A1 esalcanodiilo(C<8),alcanodiilo(C<8) sustituido, alquilaminodiil(C<8) o alquilaminodiil(C<8) sustituido; o un compuesto de la fórmula:

en el que: R⁴es acilo^{(C<12 )}o acilo^{(C<12 )}sustituido; R⁵es aciloxi^{(C<12 )}, o aciloxi sustituido^(C<12); R⁶es alquilo^{(C<12 )}, alquilo (c<12) sustituido, o un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiilo^(C<6)-aciloxi^(C<12)o alcanodiilo^(C<6)-aciloxi^(C<12)sustituido; R⁷es hidrógeno, alquilo^(C<12), alquilo^(C<12)sustituido, o un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiil^(C<6)-aciloxi^(C<12)o alcanodiilo^(C<6)-aciloxi^(C<12)sustituido; y A²esalcanodiilo^(C<8),alcanodiilo^(C<8)sustituido, alquilaminodiil^(C<8)o alquilaminodiil^(C<8)sustituido; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En la Tabla 1 (a continuación), así como en las secciones de Resumen de la invención, Ejemplos y Reivindicaciones, se muestran ejemplos de los compuestos proporcionados en el presente documento.

Tabla 1: Ejemplos de compuestos proporcionados en este documento

continuación

continuación

Los compuestos proporcionados en el presente documento pueden hacerse, por ejemplo, utilizando los procedimientos descritos en la sección de Ejemplos. Estos procedimientos pueden modificarse y optimizarse aún más utilizando los principios y técnicas de la química orgánica aplicados por un experto en la materia. Estos principios y técnicas se enseñan, por ejemplo, en March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure (2007).

Los compuestos de la invención pueden contener uno o más átomos de carbono o nitrógeno asimétricamente sustituidos, y pueden aislarse en forma ópticamente activa o racémica. Por lo tanto, se entienden todas las formas quirales, diastereoméricas, racémicas, epiméricas y todas las formas geométricas isoméricas de una fórmula química, a menos que se indique específicamente la estereoquímica o la forma isomérica. Los compuestos pueden presentarse como racematos y mezclas racémicas, enantiómeros simples, mezclas diastereoméricas y diastereómeros individuales. En algunas realizaciones, se obtiene un único diastereómero. Los centros quirales de los compuestos de la presente invención pueden tener cada uno independientemente una configuración S o R . A la vista de los resultados del modelado y de la cristalografía de rayos X presentados en las FIGS. 13A-D y FIGS. 27A y 27B, en algunas realizaciones, los enantiómeros S de los compuestos proporcionados en el presente documento pueden utilizarse para lograr la inhibición de la enolasa a una concentración más baja que los correspondientes enantiómeros R.

En algunos aspectos, los compuestos de la presente divulgación están presentes en una forma enantioméricamente pura. La pureza enantiomérica del compuesto puede describirse mediante el exceso enantiomérico o ee. El exceso enantiomérico se calcula mediante la fórmula

en la que la concentración de cada uno de los isómeros ópticos se mide mediante procedimientos conocidos en la técnica, como la HPLC quiral o mediante RMN utilizando reactivos de desplazamiento quiral. En algunas realizaciones, el compuesto está sustancialmente purificado de otros isómeros ópticos. En algunas realizaciones, el término "sustancialmente purificado" significa que el compuesto está presente en un ee superior al 90 %. En algunas realizaciones, el ee es superior al 95 %. En algunas realizaciones, el ee es superior al 98 %. En algunos aspectos, los compuestos descritos en el presente documento pueden prepararse como un único isómero óptico utilizando técnicas de síntesis asimétricas que incluyen, pero no se limitan a, el uso de un catalizador enantioselectivo o un auxiliar quiral, de manera que se produce un isómero óptico en la reacción. En otros aspectos, las mezclas de los isómeros ópticos pueden separarse utilizando la resolución quiral para separar los isómeros ópticos de una mezcla racémica mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Algunos procedimientos de resolución quiral no limitantes incluyen la cromatografía quiral, la precipitación diferencial o la cristalización, o los agentes de resolución quiral.

Las fórmulas químicas utilizadas para representar los compuestos de la invención típicamente sólo mostrarán uno de los posibles tautómeros diferentes. Por ejemplo, se sabe que muchos tipos de grupos cetónicos existen en equilibrio con los correspondientes grupos enol. Del mismo modo, muchos tipos de grupos imina existen en equilibrio con los grupos enamina. Independientemente de qué tautómero se represente para un determinado compuesto, y de cuál sea el más frecuente, todos los tautómeros de una determinada fórmula química están previstos.

Los compuestos de la invención también pueden tener la ventaja de que pueden ser más eficaces que, ser menos tóxicos que, tener una acción más prolongada que, ser más potentes que, producir menos efectos secundarios que, ser más fácilmente absorbidos que, y/o tener un mejor perfil farmacocinético (porrejemplo, una mayor biodisponibilidad oral y/o un menor aclaramiento) que, y/o tener otras propiedades farmacológicas, físicas o químicas útiles sobre los compuestos conocidos en la técnica anterior, para su uso en las indicaciones indicadas en el presente documento.

Además, los átomos que componen los compuestos de la presente invención incluyen todas las formas isotópicas de dichos átomos. Los isótopos, tal y como se utilizan aquí, incluyen aquellos átomos que tienen el mismo número atómico pero diferentes números de masa. A modo de ejemplo general y sin limitación, los isótopos del hidrógeno incluyen el tritio y el deuterio, y los isótopos del carbono incluyen el ¹³C y el ¹⁴C.

Los compuestos de la presente invención divulgados en las reivindicaciones pueden ser profármacos. Se sabe que los profármacos mejoran numerosas cualidades deseables de los productos farmacéuticos (por rejemplo, solubilidad, biodisponibilidad, fabricación, etc.). Los profármacos pueden prepararse modificando los grupos funcionales presentes en el compuesto de manera que las modificaciones se escindan, ya sea en la manipulación rutinaria o in vivo, al compuesto original. En consecuencia, los profármacos incluyen, por ejemplo, los compuestos descritos en el presente documento en los que un grupo hidroxi, amino, fósforo o carboxi se une a cualquier grupo que, cuando el profármaco se administra a un sujeto, se escinde para formar un hidroxi, amino, fosfato o ácido carboxílico, respectivamente. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona formas pro-fármaco (sólo en la medida en que están cubiertas por las reivindicaciones anexas) de los compuestos (según están cubiertas por las reivindicaciones anexas). Además, las formas pro-fármaco de SF2312 (sólo en la medida en que están cubiertas por las reivindicaciones 13 y 14 adjuntas) pueden utilizarse en las composiciones farmacéuticas o procedimientos descritos en el presente documento.

En algunos aspectos, la forma pro-fármaco de los compuestos instantáneos comprende proteger el grupo fosfato con un grupo protector de fosfato. En algunas realizaciones, el grupo fosfato es un grupo protector de fosfato. Algunos ejemplos no limitantes de grupos protectores de fosfato incluyen, pero no se limitan a: alquilo, arilo, aralquilo, acilo, aciloxi, aciloxi-alcanodiilo, o la versión sustituida de cualquiera de estos grupos. En algunas realizaciones, el grupo protector de fosfato es acilo^{(c< i2)}, aciloxi^{(c< i2)}, o -alcanodiilo^(c<6)-aciloxi^{(c< i2)}, o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos. En algunas realizaciones, el grupo protector de fosfato es -alcanodiilo^(c<6)-aciloxi^(c<i2)o un -alcanodiilo^(c<6)-aciloxi^(c<i2)sustituido. En algunas realizaciones, el grupo protector de fosfato es un grupo pivaloiloximetilo (POM). El grupo pivaloiloximetilo tiene la estructura -cH ²O c(O )c(cH ³)³. En algunas realizaciones, el grupo protector de fosfato es escindible in vivo por una esterasa. En otras realizaciones, el grupo protector de fosfato es alquilo^{(c< i2)}, arilo^(c<i2)o aralquilo^{(c< i2)}. En algunas realizaciones, el grupo protector de fosfato es fenilo, bencilo o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos. Otros grupos protectores de fosfato son enseñados al menos por Wuts, Greene's Protecting Groups in Organic Synthesis, 5a ed., 20 i4 y Schultz, 2003.

En algunas realizaciones, las formas pro-fármaco de los compuestos de la presente invención han disminuido la actividad hemolítica en comparación con los compuestos que no están en la forma pro-fármaco. Por ejemplo, SF23i2, Hex y PhAH, cuando se administran a i00 mg/kg por vía intravenosa durante más de una semana, provocan un descenso del hematocrito del 45 % al 29 %. Puede observarse una anemia hemolítica leve a concentraciones tan bajas como 50 mg/kg con estos compuestos. Pom-Hex es al menos ~200 veces más potente que Hex, (FIG. 10A y 10B), por lo que cabría esperar una anemia hemolítica con dosis superiores a 0,5 mg/kg. En realidad, dosis tan altas como i0 mg/kg por vía intravenosa durante un mes, no causan un descenso estadísticamente significativo del hematocrito. Por lo tanto, a pesar de la potencia dramáticamente mejorada contra las células de glioma suprimidas por ENO1, no hay un aumento proporcional de los efectos secundarios tóxicos de la anemia hemolítica. La forma pro fármaco de un compuesto de la presente divulgación puede utilizarse para reducir el riesgo de que el paciente desarrolle una anemia hemolítica, que sin embargo no forma parte de la presente invención. Los eritrocitos son sensibles a las interrupciones del ciclo glucolítico, ya que la glicólisis es la única fuente de energía de la célula en forma de ATP. Por ejemplo, cuando se utiliza un profármaco que protege el fosfato con un éster, ya que los eritrocitos carecen de enzimas esterasa y estas células no pueden generar la forma activa de los compuestos. Dado que las células no pueden formar la forma activa del compuesto, pueden observarse menos efectos secundarios hemolíticos.

Debe reconocerse que el anión o catión particular que forma parte de cualquier forma de sal de un compuesto proporcionado en el presente documento no es crítico, siempre y cuando la sal, en su conjunto, sea farmacológicamente aceptable. Otros ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables y sus procedimientos de preparación y uso se presentan en Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (2002).

Se apreciará que muchos compuestos orgánicos pueden formar complejos con los disolventes en los que reaccionan o de los que se precipitan o cristalizan. Estos complejos se conocen como "solvatos" cuando el disolvente es el agua, el complejo se conoce como "hidrato" También se apreciará que muchos compuestos orgánicos pueden existir en más de una forma sólida, incluyendo formas cristalinas y amorfas. Todas las formas sólidas de los compuestos proporcionados aquí, incluyendo cualquier solvato de los mismos, están dentro del ámbito de la presente invención.

II. Tratamiento

2 i

En un aspecto, la presente divulgación proporciona compuestos y composiciones que pueden utilizarse como inhibidores de las enzimas enolasa. Tales compuestos son los compuestos como los indicados en las reivindicaciones. SF2312, que no forma parte del ámbito reivindicado tiene la fórmula

SF2312 fue descrito por primera vez como un nuevo antibiótico de ácido fosfónico en Watanabe et al., Science Reports of Meiji Seika Kaisha, 25:12-17, 1986.

Se sabe que tres subunidades de enolasa (a, p y y) se ensamblan como cinco isoenzimas de enolasa diferentes. Algunas isoenzimas no limitantes son la enolasa 1 (a), la enolasa 2 (y) y la enolasa 3 (P). La enolasa 2 se expresa a niveles bajos en muchos tipos de células, pero a niveles altos en las neuronas y los tejidos neurales, mientras que la enolasa 3 se encuentra principalmente en el tejido muscular, y la enolasa 1 se expresa a niveles variables en todos los tejidos. Como se ha señalado anteriormente, las enolasas catalizan la conversión de 2-fosfoglicerato en fosfoenolpiruvato en la glicólisis. Aunque la secuencia de la enzima enolasa y sus subunidades están muy conservadas, en algunas realizaciones, los inhibidores pueden inhibir preferentemente una o más subunidad o isoenzima de la enolasa.

A. Cáncer

En otro aspecto, los compuestos y las composiciones aquí divulgados pueden utilizarse para tratar el cáncer. Uno de los elementos del cáncer es que el ciclo apoptótico normal de la célula se interrumpe. Por ello, los agentes que interrumpen el crecimiento de las células son importantes como agentes terapéuticos para tratar estas enfermedades. En esta divulgación, los compuestos de la presente divulgación pueden ser utilizados para conducir a la disminución de los recuentos de células y pueden ser utilizados para tratar una variedad de tipos de líneas de cáncer. En algunas realizaciones, los compuestos de la presente divulgación inhiben la enolasa y, por tanto, la glicólisis. En algunas realizaciones, los compuestos son eficaces contra los cánceres que contienen una mutación o deleción de uno o más genes de enolasa, como el gen que codifica para la enolasa 1.

Las células cancerosas que pueden trlimitarse con los compuestos de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, células de vejiga, sangre, hueso, médula ósea, cerebro, mama, colon, esófago, gastrointestino, encías, cabeza, riñón, hígado, pulmón, nasofaringe, cuello, ovario, próstata, piel, estómago, páncreas, testículos, lengua, cuello uterino y útero.

En ciertas realizaciones relativas al tratamiento del cáncer en un sujeto, que comprenden la administración al sujeto de una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto de la presente divulgación, la cantidad farmacéuticamente eficaz es de 0,1 - 1000 mg/kg. En ciertas realizaciones, la cantidad farmacéuticamente eficaz se administra en una sola dosis al día. En ciertas realizaciones, la cantidad farmacéuticamente eficaz se administra en dos o más dosis al día. El compuesto puede administrarse poniéndose en contacto con una célula tumoral durante la purga ex vivo, por ejemplo. El tratamiento puede comprender una o más de las siguientes acciones: a) inducir citotoxicidad en una célula tumoral; b) matar una célula tumoral; c) inducir apoptosis en una célula tumoral; d) inducir diferenciación en una célula tumoral; o e) inhibir el crecimiento de una célula tumoral. La célula tumoral puede ser cualquier tipo de célula tumoral, como una célula cerebral. Otros tipos de células incluyen, por ejemplo, una célula de cáncer de vejiga, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer de páncreas, una célula de cáncer de estómago, una célula de cáncer testicular, una célula de cáncer de cerebro, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer linfático, una célula de cáncer de piel, una célula de cáncer de cerebro, una célula de cáncer de hueso o una célula de cáncer de tejidos blandos.

MI. Composiciones farmacéuticas y vías de administración

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden como ingrediente activo un compuesto como se indica en las reivindicaciones y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición está adaptada para ser administrada por una ruta seleccionada del grupo que consiste en oralmente, intraadiposalmente, intraarterialmente, intraarticularmente, intracranealmente, intradérmicamente, intralesionalmente, intramuscularmente, intranasalmente, intraocularmente, intrapericardialmente, intraperitonealmente, intrapleuralmente, intraprostaticalmente, intrarectalmente, intratecalmente, intratraquealmente, intratumoralmente, intraumbilmente, intravaginalmente, por vía intravenosa, intravesicular, intravítrea, liposomal, local, mucosa, oral, parenteral, rectal, subconjuntival, subcutánea, sublingual, tópica, transbucal, transdérmica, vaginal, en cremas, en composiciones lipídicas, a través de un catéter, a través de un lavado, a través de una infusión continua, a través de una infusión, a través de una inhalación, a través de una inyección, a través de una administración local, a través de una perfusión localizada, bañando directamente las células objetivo, y cualquier combinación de las mismas.

La cantidad de dosificación de un compuesto de la presente divulgación o de una composición que comprenda un compuesto de la presente divulgación administrada a un sujeto puede determinarse en función de factores físicos y fisiológicos como la edad, el sexo, el peso corporal, la gravedad de la afección, el tipo de enfermedad que se está tratando, las intervenciones terapéuticas previas o concurrentes, la idiopatía del sujeto y la vía de administración. Estos factores pueden ser determinados por un artesano experto. El profesional responsable de la administración suele determinar la concentración de ingrediente(s) activo(s) en una composición y la(s) dosis apropiada(s) para el sujeto individual. La dosificación puede ser ajustada por el médico individual en caso de cualquier complicación.

IV. Definiciones

Cuando se utiliza en el contexto de un grupo químico: "hidrógeno" significa -H; "hidroxi" significa -OH; "oxo" significa =O; "carbonilo" significa -C(=O)-; "carboxi" significa -C(=O)OH (también escrito como -COOH o -CO²H); "halo" significa independientemente -F, -Cl, -Br o -I; "amino" significa -NH²; "hidroxiamino" significa -NHOH; "nitro" significa -NO²; imino significa =NH; "ciano" significa -CN; "isocianato" significa -N=C=O; "azido" significa -N³; en un contexto monovalente "fosfato" significa -OP(O)(OH)²o una forma desprotonada del mismo; en un contexto divalente "fosfato" significa -OP(O)(OH)O- o una forma desprotonada del mismo; "mercapto" significa -SH; y "tio" significa =S; "sulfonilo" significa -S(O)²-; y "sulfinilo" significa -S(O)-.

En el contexto de las fórmulas químicas, el símbolo "-" significa un enlace simple, "=" significa un enlace doble y "=" significa un enlace triple. El símbolo "— " representa un enlace opcional, que si está presente es simple o doble. El símbolo "— " representa un enlace simple o un enlace doble. Así, por ejemplo, la fórmula

incluye

Y se entiende que ningún átomo de anillo de este tipo forma parte de más de un doble enlace. Además, se observa que el símbolo de enlace covalente al conectar uno o dos átomos estereogénicos, no indica ninguna estereoquímica preferida. En cambio, abarca todos los estereoisómeros, así como sus mezclas. El símbolo " i / w v , cuando se dibuja perpendicularmente a través de un enlace (por ejemplo, -CH³para el metilo) indica un punto de unión del grupo. Cabe señalar que el punto de unión sólo se suele identificar de esta manera para los grupos más grandes con el fin de ayudar al lector a identificar inequívocamente un punto de unión. El símbolo significa un enlace simple donde el grupo unido al extremo grueso de la cuña está "fuera de la página" El símbolo..... significa una unión simple en la que el grupo unido al extremo grueso de la cuña está "dentro de la página". El símbolo significa un enlace simple en el que la geometría alrededor de un doble enlace (por rejemplo, E o Z) no está definida. Por lo tanto, están previstas ambas opciones, así como sus combinaciones. Cualquier valencia indefinida en un átomo de una estructura mostrada en esta aplicación representa implícitamente un átomo de hidrógeno unido a ese átomo. Un punto en negrita en un átomo de carbono indica que el hidrógeno unido a ese carbono está orientado fuera del plano del papel.

Los hidrógenos reemplazables incluyen hidrógenos representados (por rejemplo, el hidrógeno unido al nitrógeno en la fórmula anterior), hidrógenos implícitos (por rejemplo, un hidrógeno de la fórmula anterior que no se muestra pero que se entiende que está presente), hidrógenos definidos expresamente e hidrógenos opcionales cuya presencia depende de la identidad de un átomo del anillo (por rejemplo, un hidrógeno unido al grupo X, cuando X es igual a -CH-), siempre que se forme una estructura estable. En el ejemplo representado, R puede residir en el anillo de 5 o 6 miembros del sistema de anillos fusionados. En la fórmula anterior, la letra de subíndice "y" que sigue inmediatamente al grupo "R" encerrado entre paréntesis, representa una variable numérica. A menos que se especifique lo contrario, esta variable puede ser 0, 1, 2o cualquier número entero mayor que 2, sólo limitado por el número máximo de átomos de hidrógeno reemplazables del anillo o sistema de anillos.

Para los grupos y clases que se indican a continuación, el número de átomos de carbono en el grupo es el que se indica a continuación: "Cn" define el número exacto (n) de átomos de carbono en el grupo/clase. "C<n" define el número máximo (n) de átomos de carbono que puede haber en el grupo/clase, siendo el número mínimo lo más pequeño posible para el grupo en cuestión, por ejemplo, se entiende que el número mínimo de átomos de carbono en el grupo "alquenilo^(C<8)" o la clase "alqueno^(C<8)" es dos. Compárese con "alcoxi^(C<io)", que designa a los grupos alcoxi que tienen de 1 a 1o átomos de carbono. "Cn-n'" define tanto el número mínimo (n) como el máximo (n') de átomos de carbono en el grupo. Así, "alquilo^(C2-io)" designa aquellos grupos alquilo que tienen de 2 a 10 átomos de carbono.

Por lo general, el indicador del número de carbono sigue al grupo que modifica, está encerrado entre paréntesis y se escribe completamente en subíndice; sin embargo, el indicador también puede preceder al grupo, o escribirse sin paréntesis, sin que ello signifique un cambio de significado. Así, los términos "olefina C5", "olefina C5", "olefina^(C5)" y "olefina^C5" son todos sinónimos.

El término "saturado", tal y como se utiliza aquí, significa que el compuesto o grupo así modificado no tiene dobles enlaces carbono-carbono ni triples enlaces carbono-carbono, excepto como se indica a continuación. En el caso de las versiones sustituidas de los grupos saturados, pueden estar presentes uno o más dobles enlaces carbono-oxígeno o un doble enlace carbono-nitrógeno. Y cuando dicho enlace está presente, no se excluyen los dobles enlaces carbono-carbono que pueden ocurrir como parte del tautomerismo ceto-enol o del tautomerismo imina/enamina.

El término "alifático" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" significa que el compuesto/grupo así modificado es un compuesto o grupo de hidrocarburo acíclico o cíclico, pero no aromático. En los compuestos/grupos alifáticos, los átomos de carbono pueden unirse en cadenas rectas, cadenas ramificadas o anillos no aromáticos (alicíclicos). Los compuestos/grupos alifáticos pueden ser saturados, es decir, unidos por enlaces simples (alcanos/alquilos), o insaturados, con uno o más enlaces dobles (alquenos/alquenilos) o con uno o más enlaces triples (alquinos/alquilos).

El término "alquilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo alifático saturado monovalente con un átomo de carbono como punto de unión, una estructura acíclica lineal o ramificada, y ningún átomo distinto del carbono y el hidrógeno. Los grupos -CH³(Me), -CH²CH³(Et), -CH²CH²CH³(n-Pro propilo), -CH(CH³) 2 (i-Pr, P r o isopropilo), -CH²CH²CHCH ³ (n-Bu), -CH(CH³)CH²CH³(sec-buti/o), -CH²CH(CH³) 2 (isobutilo), -C(CH) 3 (terc-butilo, t-buti/o, t-Bu o Bu), y -CH2C(Ch 3)3 (neo-penti/o) son ejemplos no limitativos de grupos alquilo. El término "alcanodiilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo alifático saturado divalente, con uno o dos átomos de carbono saturados como punto(s) de unión, una estructura acíclica lineal o ramificada, sin dobles o triples enlaces carbono-carbono y sin átomos distintos del carbono y el hidrógeno. Los grupos -CH²-(metileno), -CH²CH²-, -CH²C(CH³)²CH²-, y -CH²CH²CH²- son ejemplos no limitativos de gruposalcanodiilo. Un "alcano" se refiere al compuesto H-R, en el que R es un alquilo tal y como se define este término anteriormente. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido" uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH². Los siguientes grupos son ejemplos no limitantes de grupos alquilos sustituidos: -CH²OH, -CH²Cl, -CF³, -CH²OCH³, -CH²OC(O)CH³, -CH²NH², -CH²N(CH³)², y -CH²CH²CL

El término "arilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo aromático monovalente insaturado con un átomo de carbono aromático como punto de unión, formando dicho átomo de carbono parte de una o más estructuras de anillo aromático de seis miembros, en el que los átomos del anillo son todos de carbono, y en el que el grupo no consta de más átomos que el carbono y el hidrógeno. Si hay más de un anillo, los anillos pueden estar fusionados o no. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo o aralquilo (si la limitación del número de carbonos lo permite) unidos al primer anillo aromático o a cualquier anillo aromático adicional presente. Ejemplos no limitantes de grupos arilo incluyen fenilo (Ph), metilfenilo, (dimetil)fenilo, -C⁶H⁴CH²CH³(etilfenilo), naftilo y un grupo monovalente derivado del bifenilo. El término "arenodiilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo aromático divalente con dos átomos de carbono aromáticos como puntos de unión, formando dichos átomos de carbono parte de una o más estructuras de anillos aromáticos de seis miembros en los que los átomos del anillo son todos de carbono, y en los que el grupo monovalente no consta de más átomos que el carbono y el hidrógeno. Tal y como se utiliza aquí, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo, arilo o aralquilo (si la limitación del número de carbonos lo permite) unidos al primer anillo aromático o a cualquier otro anillo aromático presente. Si hay más de un anillo, los anillos pueden estar fusionados o no. Los anillos no fusionados pueden estar conectados a través de uno o más de los siguientes: un enlace covalente, gruposalcanodiilo o alquenodiilo (si la limitación del número de carbonos lo permite). Ejemplos no limitantes de grupos arenodiilo incluyen:

Un "areno" se refiere al compuesto H-R, en el que R es arilo tal y como se ha definido anteriormente. El benceno y el tolueno son ejemplos no limitativos de arenos. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido" uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH².

El término "aralquilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere al grupo monovalente -alcanodiiloarilo, en el que los términos alcanodiilo y arilo se utilizan cada uno de manera coherente con las definiciones proporcionadas anteriormente. Ejemplos no limitantes son: el fenilmetilo (bencilo, Bn) y el 2-fenil-etilo. Cuando el término aralquilo se utiliza con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno del alquenodiilo y/o del grupo arilo han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH². Ejemplos no limitantes de aralquilos sustituidos son: (3-clorofenil)-metilo, y 2-cloro-2-fenil-et-1-il.

El término "acilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere al grupo -C(O)R, en el que R es un hidrógeno, un alquilo, un cicloalquilo, un alquenilo, un arilo, un aralquilo o un heteroarilo, tal como se definen estos términos en el presente documento o, si no se definen en el presente documento, basándose en la nomenclatura estándar de la IUPAC. Los grupos -CHO, -C(O)CH³(acetilo, Ac), -C(O)CH²CH³, -C(O)CH²CH³, -C(O)CH(CH³)², -C(O)CH(CH²)², -C(O)C^aH⁵, -C(O)C⁶H⁴CH³, -C(o )c H²C⁶H⁵, -C(O)(imidazolilo) son ejemplos no limitativos de grupos acilo. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno (incluyendo un átomo de hidrógeno directamente unido al átomo de carbono del grupo carbonilo o tiocarbonilo, si lo hay) han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH². Los grupos -C(O)CH²CF³, -CO²H (carboxilo), -CO²CH³(metilcarboxilo), -CO²CH²CH³, -C(O)NH²(carbamoil), y -CON(CH³)², son ejemplos no limitantes de grupos acílicos sustituidos.

El término "alcoxi", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere al grupo -OR, en el que R es un alquilo, tal como se ha definido anteriormente. Algunos ejemplos no limitantes son: -OCH³(metoxi), -OCH²CH³(etoxi), -OCH²CH²CH³, -OCH(CH³)²(isopropoxi), -OC(CH³)³(terc-butoxi), -OCH(CH²)², -O-ciclopentilo y -O-ciclohexilo. Los términos "ariloxi", "aralcoxi" y"aciloxi", cuando se utilizan sin el modificador "sustituido", se refieren a grupos, definidos como -OR, en los que R es arilo, aralquilo y acilo, respectivamente. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido" uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH².

El término "alquilamino", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere al grupo -NHR, en el que R es un alquilo, tal como se ha definido anteriormente. Algunos ejemplos no limitantes son: -NHCH³y -NHCH²CH³. El término "dialquilamino", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere al grupo -NRR', en el que R y R' pueden ser el mismo o diferentes grupos alquilo, o R y R' pueden tomarse juntos para representar unalcanodiilo. Ejemplos no limitantes de grupos dialquilamino incluyen: -N(CH³)², -N(CH³)(c H²CH³), y N-pirrolidinilo. El término "alquilaminodiilo" se refiere a un grupo divalente seleccionado entre: -NH-alcanodiil-, -alcanodiil-NH-, -NH-alcanodiil-NH-, o -alcanodiil-NH-alcanodiil-, donde elalcanodiilo es como se ha definido anteriormente. En algunas realizaciones particulares, el "alquilaminodiilo" contiene sólo un átomo de nitrógeno. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno unidos a un átomo de carbono han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH². Los grupos -NHC(O)OCH³y -NHC(O)NHCH³son ejemplos no limitantes de grupos amido sustituidos.

El uso de la palabra "un" o "una, uno", cuando se utiliza junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar "uno", pero también es coherente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno"

A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, el procedimiento que se emplea para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos del estudio.

Los términos "comprender", "tener" e "incluir" son verbos de enlace abiertos. Cualquier forma o tiempo de uno o más de estos verbos, como "comprende", "abarca", "tiene", "tienen", "incluye" e "incluye", también son abiertos. Por ejemplo, cualquier procedimiento que "comprenda", "tenga" o "incluya" uno o más pasos no se limita a poseer sólo esos pasos y también abarca otros pasos no enumerados.

El término "eficaz", tal como se utiliza en la memoria descriptiva y/o las reivindicaciones, significa adecuado para lograr un resultado deseado, esperado o previsto. "Cantidad efectiva", "cantidad terapéutica efectiva" o "cantidad farmacéutica efectiva" cuando se utilizan en el contexto del tratamiento de un paciente o sujeto con un compuesto, significa aquella cantidad del compuesto que, cuando se administra a un sujeto o paciente para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar dicho tratamiento para la enfermedad.

Tal como se utiliza aquí, el término "IC⁵⁰" se refiere a una dosis inhibitoria que es el 50 % de la respuesta máxima obtenida. Esta medida cuantitativa indica qué cantidad de un fármaco u otra sustancia (inhibidor) es necesaria para inhibir un proceso biológico, bioquímico o químico determinado (o un componente de un proceso, es decir, una enzima, una célula, un receptor celular o un microorganismo) a la mitad.

Un "isómero" de un primer compuesto es un compuesto separado en el que cada molécula contiene los mismos átomos constituyentes que el primer compuesto, pero en el que la configuración de esos átomos en tres dimensiones difiere.

Tal como se utiliza aquí, el término "paciente" o "sujeto" se refiere a un organismo mamífero vivo, como un ser humano, un mono, una vaca, un caballo, una oveja, una cabra, un perro, un gato, un ratón, una rata, un conejillo de indias o una especie transgénica del mismo. En ciertas realizaciones, el paciente o sujeto es un primate. Ejemplos no limitativos de sujetos humanos son los adultos, los jóvenes, los bebés y los fetos.

Tal y como se utiliza generalmente en el presente documento, "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del ámbito del buen juicio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos, órganos y/o fluidos corporales de los seres humanos y los animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones acordes con una relación beneficio/riesgo razonable.

Por "sales farmacéuticamente aceptables" se entiende las sales de los compuestos de la presente invención que son farmacéuticamente aceptables, como se ha definido anteriormente, y que poseen la actividad farmacológica deseada. Dichas sales incluyen sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos como el ácido clorhídrico, el ácido bromhídrico, el ácido sulfúrico, el ácido nítrico, el ácido fosfórico y similares; o con ácidos orgánicos tales como el ácido 1,2-etanodisulfónico, el ácido 2-hidroxietanosulfónico, el ácido 2-naftalenosulfónico, el ácido 3-fenilpropiónico, el ácido 4,4'-metilenbis(3-hidroxi-2-eno-1-carboxílico), el 4-metilbiciclo[2.2.2]oct-2-ene-1-carboxílico, ácido acético, ácidos mono y dicarboxílicos alifáticos, ácidos sulfúricos alifáticos, ácidos sulfúricos aromáticos, ácido bencenosulfónico, ácido benzoico, ácido alcanfor sulfónico, ácido carbónico ácido cinámico, ácido cítrico, ácido ciclopentanopropiónico, ácido etanosulfónico, ácido fumárico, ácido glucoheptónico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido glicólico, ácido heptanoico, ácido hexanoico, ácido hidroxinaftoico, ácido láctico, ácido laurilsulfúrico, ácido maleico, ácido málico, ácido malónico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido mucónico, ácido o-(4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido oxálico, ácido p-clorobencenosulfónico, ácido alcanoico sustituido por fenilo, ácido propiónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido terciariobutilacético, ácido trimetilacético y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables también incluyen sales de adición de bases que pueden formarse cuando los protones ácidos presentes son capaces de reaccionar con bases inorgánicas u orgánicas. Las bases inorgánicas aceptables son el hidróxido de sodio, el carbonato de sodio, el hidróxido de potasio, el hidróxido de aluminio y el hidróxido de calcio. Las bases orgánicas aceptables incluyen la etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina y similares. Debe reconocerse que el anión o catión particular que forma parte de cualquier sal de esta invención no es crítico, siempre y cuando la sal, en su conjunto, sea farmacológicamente aceptable. Otros ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables y sus procedimientos de preparación y uso se presentan en Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002).

El término "portador farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza aquí, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, como un agente de relleno líquido o sólido, un diluyente, un excipiente, un disolvente o un material de encapsulación, que participa en llevar o transportar un agente químico.

La "prevención" o "prevenir" incluye: (1) inhibir la aparición de una enfermedad en un sujeto o paciente que puede estar en riesgo y/o predispuesto a la enfermedad pero que todavía no experimenta o muestra alguna o toda la patología o sintomatología de la enfermedad, y/o (2) retrasar la aparición de la patología o sintomatología de una enfermedad en un sujeto o paciente que puede estar en riesgo y/o predispuesto a la enfermedad pero que todavía no experimenta o muestra alguna o toda la patología o sintomatología de la enfermedad.

Un "estereoisómero" o "isómero óptico" es un isómero de un compuesto dado en el que los mismos átomos están unidos a los mismos otros átomos, pero en el que la configuración de esos átomos en tres dimensiones difiere. Los "enantiómeros" son estereoisómeros de un determinado compuesto que son imágenes especulares entre sí, como las manos izquierda y derecha. los "diastereómeros" son estereoisómeros de un determinado compuesto que no son enantiómeros. Las moléculas quirales contienen un centro quiral, también llamado estereocentro o centro estereogénico, que es cualquier punto, aunque no necesariamente un átomo, en una molécula que lleva grupos tales que un intercambio de dos grupos cualesquiera conduce a un estereoisómero. En los compuestos orgánicos, el centro quiral suele ser un átomo de carbono, fósforo o azufre, aunque también es posible que otros átomos sean estereocentros en compuestos orgánicos e inorgánicos. Una molécula puede tener múltiples estereocentros, lo que le confiere muchos estereoisómeros. En los compuestos cuyo estereoisomerismo se debe a los centros estereogénicos tetraédricos (por ejemplo, el carbono tetraédrico), el número total de estereoisómeros hipotéticamente posibles no superará 2n, donde n es el número de estereocentros tetraédricos. Las moléculas con simetría suelen tener menos del máximo número posible de estereoisómeros. Una mezcla 50:50 de enantiómeros se denomina mezcla racémica. Alternativamente, una mezcla de enantiómeros puede estar enriquecida enantioméricamente de manera que un enantiómero esté presente en una cantidad superior al 50 %. Normalmente, los enantiómeros y/o diastereómeros pueden resolverse o separarse mediante técnicas conocidas en la técnica. Se contempla que para cualquier estereocentro o eje de quiralidad para el que no se haya definido la estereoquímica, ese estereocentro o eje de quiralidad puede estar presente en su forma R, en su forma S, o como una mezcla de las formas R y S, incluyendo mezclas racémicas y no racémicas. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "sustancialmente libre de otros estereoisómeros" significa que la composición contiene < 15 %, más preferentemente < 10 %, aún más preferentemente < 5 %, o más preferentemente < 1 % de otro(s) estereoisómero(s).

"Tratamiento" o "tratar" incluye (1) inhibir una enfermedad en un sujeto o paciente que experimenta o muestra la patología o sintomatología de la enfermedad (por ejemplo, detener el desarrollo posterior de la patología y/o sintomatología), (2) mejorar una enfermedad en un sujeto o paciente que experimenta o muestra la patología o sintomatología de la enfermedad (po rejemplo, revertir la patología y/o sintomatología) y/o (3) efectuar cualquier disminución medible en una enfermedad en un sujeto o paciente que experimenta o muestra la patología o sintomatología de la enfermedad.por ejemplo, revertir la patología y/o la sintomatología), y/o (3) efectuar cualquier disminución medible de una enfermedad en un sujeto o paciente que experimenta o muestra la patología o la sintomatología de la enfermedad.

En algunos aspectos, las presentes divulgaciones utilizan una o más abreviaturas o acrónimos. Estas abreviaturas o acrónimos incluyen ENO1, enolasa 1, ya sea el gen o la proteína; ENO2, enolasa 2, ya sea el gen o la proteína; ENO3, enolasa 3, ya sea el gen o la proteína. En cada uno de estos casos, la enolasa es el gen o la proteína, dependiendo del contexto y como sería obvio para un experto en la materia. Otras abreviaturas o acrónimos son ATP, trifosfato de adenosina; Bn, bencilo; BPS, 3-bromopropilfenil sulfona; DCM, diclorometano; DMAP, 4-dimetilaminopiridina; EDC, 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)-carbodiimida; Et, etilo; IC, concentración inhibitoria; LiHMDS, hexametildisilazida de litio; Me, metilo; MeCN, acetonitrilo; IRM, resonancia magnética; RMN, resonancia magnética nuclear; PEP, fosfoenolpiruvato o ácido fosfoenolpirúvico; 2-PG, 2-fosfoglicerato o ácido 2-fosfoglicérico; PhAH, fosfonoacetohidroxamato; POM, pivaloiloximetilo; ARNhc, ARN de horquilla corta; IRM T2, resonancia magnética de relajación de giro-giro; THF, tetrahidrofurano; y VHL, Von Hippel-Lindau.

V. EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la materia deben entender que las técnicas que se exponen en los ejemplos que siguen representan técnicas que el inventor ha descubierto que funcionan bien en la práctica de la invención y, por lo tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la materia deberían, a la luz de la presente divulgación, apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las realizaciones específicas que se divulgan y seguir obteniendo un resultado igual o similar.

Ejemplo 1 - Procedimientos y materiales

A. Determinación de la inhibición espectrofluorimétrica de ENO1 y ENO2

Se sobreexpresaron ENO1 y ENO2 humanas en la línea celular D423 humana y se utilizaron para ensayos enzimáticos. Los inhibidores (PhAH, SF2312 y Desoxi-SF2312, Hex, Hepta, Pom-Hex y Fosmidomicina) se incubaron con la enzima antes de añadir el sustrato 5mM 2-PG. La actividad enzimática se midió monitorizando la fluorescencia del NADH a 340nm de Exitación/460nm de emisión utilizando un ensayo vinculado a la Lactato deshidrogenasa/Piruvato quinasa que relaciona la formación de PEP con la oxidación del NADH a NAD+, como hemos descrito en un trabajo publicado (Muller et al., 2012). La actividad enzimática se normalizó con respecto a la actividad en ausencia del inhibidor (fijada en 1) y se representó en función de la concentración del inhibidor.

B. Análisis cinético de Michaelis-Menten

El análisis cinético de Michaelis-Menten se realizó utilizando procedimientos estándar en la materia como los enseñados por Voet y Voet, 2011. La actividad enzimática de la Enolasa 1 o 2 v se determinó en un intervalo de concentración de 10 mM a 0,5 mM de 2-PG [S], en presencia de concentraciones crecientes de inhibidor [I]. Estos datos se han representado en forma de gráficos de Lineweaver-Burke, con 1/[S] en el eje x y 1/v en el eje y. La pendiente de estas líneas se graficó en función de la concentración del inhibidor [I] para obtener las gráficas de Dixon, cuya pendiente e intercepción arrojaron el Ki competitivo.

C. Rastreo metabólico por RMN y espectros de masas

La glucosa marcada con 13C pesado, no radiactivo, en el carbono C-1 y 13C en todos los átomos de carbono se adquirió de Cambridge Isotopes (CLM-420-1 y CLM-1396, respectivamente). El medio DMEM sin glucosa se complementó con 10 mM de glucosa marcada con 13C-1 o 13C-todo. El rastreo metabólico por RMN se realizó sustituyendo el medio DMEM convencional por un medio DMEM sin glucosa, al que se complementó glucosa 13C-1 (Cambridge Isotopes) a 10 mM. Las células se cultivaron en este medio durante 4 días con o sin la adición de SF2312. Después de 4 días, el medio acondicionado se extrajo con metanol al 80 % a -80 °C, se liofilizó y se resuspendió en D²O. Los espectros de 13C RMN desacoplados por protones se adquirieron utilizando un instrumento Bruker de 500 MHZ en la instalación central de M.D. Anderson n Mr .

Los metabolitos de pequeñas moléculas de las células en cultivo se extrajeron con metanol al 80 % a -80°C (Yuan, et al. , 2012), siguiendo nuestra metodología publicada (Ying, et al., 2012). La extracción con metanol recupera los compuestos polares, como la mayoría de los ácidos carboxílicos, los alcoholes y los azúcares, pero no los lípidos. Tras la extracción y el centrifugado, las muestras se secaron por medio de una aspiración rápida. Las muestras secadas se analizaron mediante cromatografía líquida microcapilar y espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) utilizando la monitorización de reacción seleccionada (SRM) con cambio de polaridad positiva/negativa en un espectrómetro de masas híbrido 5500 QTRAP (AB/SCEX). 300 transiciones s Rm se dirigen a >260 metabolitos polares (Yuan, et al., 2012) La cuantificación de los picos MS se realizó utilizando el software MultiQuant 2.1 y los niveles relativos de cada metabolito en unidades de área de pico Q3 a través de las muestras.

D. Recuento total de células o proliferación celular y apoptosis celular (células positivas al yoduro de propidio)

El número total de células se cuantificó mediante Hoechst 33342 (Cat# H3570; Invitrogen). Las células apoptóticas se contaron mediante tinción con yoduro de propidio. Las células apoptóticas se vuelven permeables al yoduro de propidio mientras que las células vivas no se tiñen. El día del estudio de apoptosis, se eliminó el medio antiguo y se llenó cada pocillo hasta 100 pl con medio fresco. Se mezclaron Hoechst y yoduro de propidio en PBS 1:100 y se añadieron 10 pl de la mezcla en cada pocillo suavemente sin tocar las células para una dilución final de 1:1000 de la reserva. A continuación, las placas se incubaron a 37°C durante 2 horas. La captura de imágenes y la cuantificación se realizaron con el sistema de cribado de alto contenido Operetta (Perkin Elmer).

La proliferación celular de las líneas celulares de glioma se ensayó mediante tinción con violeta de cristal o mediante mediciones de confluencia de células vivas con el IncuCyte (Essen BioScience). Las curvas de crecimiento utilizando el IncuCyte se generaron mediante imágenes de confluencia cada 4 horas con réplicas duplicadas con una siembra inicial de 1500 células/pocillo en placas de 96 pocillos. En el momento indicado, las células se fijaron con formalina al 10 % y se tiñeron con violeta de cristal. La extracción del colorante se realizó con una solución de ácido acético al 10 % y la absorbancia se leyó a 595 nm. Las células apoptóticas se contaron mediante tinción con yoduro YO-PRO®-1 (491/509, Life Technologies, Y^{3 60 3}). Las células apoptóticas se vuelven permeables a YO-PRO®-1 mientras que las células vivas no se tiñen. Como alternativa, se empleó yoduro de propidio (Life Technologies) en lugar de YO-PRO. El número total de células se cuantificó con Hoechst 33342 (Cat# H3570 Invitrogen). Las células se sembraron en 2 *103 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se trataron en presencia o ausencia de doxiciclina. El día del estudio de apoptosis, se eliminó el medio antiguo y se llenó cada pocillo hasta 100 pl con medio fresco. Se mezclaron Hoechst y YO-PRO®-1 en PBS 1:100 y se añadieron 10 pl de la mezcla en cada pocillo suavemente sin tocar las células para una dilución final de 1:1000 de la reserva. A continuación, las placas se incubaron a 37°C durante 2 horas. La captura de imágenes y la cuantificación se realizaron con el sistema de cribado de alto contenido Operetta (Perkin Elmer). El contenido de ATP se midió con el ensayo CellTiter-Glo® de luciferasa/luciferina. En resumen, se añadieron 100 pl de medios de ensayo CellTiter-Glo® a placas de 96 pocillos que contenían 100 pl de medios y células. La lisis se logró mediante el ácido perclórico en el tampón y el pipeteo vigoroso, y la luminiscencia se determinó utilizando un lector de placas de luminiscencia Omega (BMG Labtech). Los resultados se expresaron en relación con el control tratado con vehículo.

E. Viabilidad celular (FIG. 10A Y 10B)

Los estudios de viabilidad celular de las tumoesferas tridimensionales se realizaron utilizando el colorante vital, éster etílico de tetrametilrhomdamina (TMRE). Se añadió TMRE a 10 nM a las esferas; las células vivas absorben TMRE en respuesta a gradientes iónicos activos, las células muertas no. Como referencia, también se tomó una imagen de campo claro.

F. Imágenes en vivo con Incucyte (FIG. 8 y FIG. 12)

Los efectos de los inhibidores fueron seguidos por mediciones de confluencia de células vivas con el IncuCyte (Essen BioScience) como sde describió anteriormente (Muller et al., 2012). Las curvas de crecimiento utilizando el IncuCyte se generaron mediante imágenes de confluencia cada 2 horas con réplicas cuádruples con una siembra inicial de103 células/pocillo en placas de 96 pocillos.

G. Tinción con violeta de cristal y visualización de las células tumorales (FIG. 9)

En el punto de tiempo indicado (normalmente 2 semanas), las células se fijaron con formalina al 10 % y se tiñeron con una solución de violeta de cristal al 0,1 % durante 1 h, como se ha descrito anteriormente (Muller et al., 2012). La extracción del colorante se realizó con una solución de ácido acético al 10 % y la absorbancia se leyó a 595 nm.

H. Visualización de tumores por IRM T2 (FIG. 11A-11D)

Se inyectaron ratones lampiños con células de glioma D423-MG que llevan la deleción 1p36 que abarca ENO1. Los tumores se formaron alrededor de 30 días después de la inyección y el crecimiento se siguió de forma no invasiva mediante IRM T2. En ausencia de tratamiento, los tumores crecían de forma continua y acababan matando al animal. El área del tumor (lado derecho del cerebro) se distingue del cerebro normal del ratón por el alto contraste. Las mediciones de IRM se realizaron en un Biospec USR47/40 de 4,7 T (Bruker Biospin MRI, Billerica, MA) en la instalación de imágenes de pequeños animales del M.D. Anderson (SAIF). En resumen, los animales fueron mantenidos bajo anestesia profunda con isoflurano con la temperatura corporal mantenida por una manta de calor. Los ratones anestesiados fueron sujetados con la cabeza en un soporte estereotáctico. La respiración fue monitorizada y sincronizada con el instrumento. La detección rutinaria del tumor se realizó mediante imágenes ponderadas en T2. En primer lugar, se realiza un cribado axial de baja resolución para centrar correctamente el campo, tras lo cual se registra una serie de cribados axiales y coronales de alta resolución.

I. Cultivo de células

La línea celular D423-MG (referida como D423 en todo el documento) fue amablemente proporcionada por el Dr. Bigner (Duncan, et al., 2010). La deleción homocigota de 1p36 en D423-MG incluye los genes CAMTA1, VAMP3, PER³, UTS2, TNFRSF9, PARK7, ERRFI1, SLC45A1, RERE, ENO1, CA6, SLC2A5, GPR157, MIR34A, H6PD, SPSB1 y SLC25A33 . La línea celular Gli56 1p36 con deleción homocigótica fue compartida por D. Louis, la deleción abarca los genes UTS2, TNFRSF9, PARK7, ERRFI1,SLC45A1, RERE, ENO1, CA6, SLC2A5, GPR157, MIR34A, H6PD, SPSB1, SLC25A33, TMEM201, C1orf200, PIK3CD, CLSTN1, CTNNBIP1, LZIC, NMNAT1, RBP7 y UBE4B . La generación de líneas isogénicas de ENO1 y ENO2 rescatadas ectópicamente fue descrita previamente; (clon pCMV ENO1 5X y clon pCMV ENO2 1X, (Muller, et al., 2012)). El D423-MG y sus subclones, así como el Gli56, fueron depositados en el Departamento de Medicina Genómica/Banco de Células del M.D. Anderson y autentificados mediante pruebas de repetición corta en tándem (STR). La línea celular Gli56 no tiene un perfil de STR publicado, por lo que no pudo ser autentificada, pero al mismo tiempo, su perfil de STR no coincidía con ninguna línea celular conocida, lo que confirma la ausencia de contaminación. De forma crítica para los experimentos, la ausencia de ENO1 fue confirmada por inmunotransferencia weetern (FIGS. 36 & 39). Se utilizó una serie de líneas celulares intactas con ENO1 como controles para las inmunotransferencias western , la actividad de la enolasa y la sensibilidad a los inhibidores de la enolasa. Estos incluyen D502 (Duncan, et al., 2010), astrocitos humanos primarios (ScienCell), TS543, TS561, TS576 (Cameron Brennan, (Stommel, et al., 2007)), HCC1957, COV504, NB1, U343, LN319, y U373 (Dept. Genomic Medicine/IACS Cell Bank, MDACC). Las líneas celulares se autentificaron mediante pruebas de STR. LN319 es un subclon de LN-992 (Bady, et al., 2012), mientras que U373 es un subclon de U251 (Torsvik, et al., 2014); para el presente trabajo, esto es aceptable ya que estas líneas celulares se utilizaron como controles no homocigotos de ENO1. Su identidad exacta es irrelevante mientras se exprese ENO1. La expresión de ENO1 se verificó mediante inmunotransferencia weetern (FIGS. 36 & 39). Todas las líneas celulares se confirmaron como negativas a los micoplasmas mediante ELISA utilizando el kit de detección MycoAlert PLUS (Lonza, Basilea, Suiza). Las células se cultivaron de forma rutinaria en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con un 10 % de suero bovino fetal (FBS).

J. Cristalización y adquisición de estructuras de rayos X

El ADN que codifica la Enolasa 2 Humana de longitud completa se clonó en el vector de expresión del plásmido pJL-H6 utilizando el procedimiento de clonación independiente de la ligadura (Lee y Kim, 2009) y se expresó en 1 L de medio de autoinducción a 20 °C después de la transformación en E. coli BL21 (DE3). Tras recoger las células de E. coli por centrifugación, las células se volvieron a suspender en 50 mM de HEPES, 300 mM de NaCl, 5 mM de MgCh, 5 mM de imidazol, 0,5 mM de Tris-(carboxietil) fosfina, 10 % (v/v) de glicerol a pH 7,5. Se añadieron 20 |jg ml-1 de DNasa y 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo a la suspensión celular antes de la sonicación a 4 °C. Los restos celulares insolubles se eliminaron por centrifugación antes de la purificación de la proteína por cromatografía de afinidad con etiqueta His. La proteína enolasa 2 purificada se purificó aún más utilizando una columna de filtración en gel Superdex75 en 20 mM h Ep ES, 150 mM NaCl, 5 mM MgCh, 2 mM 2-mercaptoetanol a pH 7,5.

Se prepararon cristales de apo de la Enolasa 2 Humana utilizando el procedimiento de difusión de vapor de gota colgante a 20 °C, suspendiendo una gota que contenía 0,5 jL de 9,1 mg ml-1 de Enolasa 2 y 0,5 jL de solución de depósito sobre un depósito de 500 jL que contenía 200 mM de acetato de amonio, 100 mM de Bis-Tris y 18-22 % (p/v) de PEG 3350. La siembra de rayas en las mismas condiciones de la solución hizo crecer cristales más grandes. Los cristales se empaparon durante la noche en gotas de 1 jL que contenían 100 mM de Bis-Tis, 200 mM de acetato de amonio, 32 % (p/v) de PEG 3350 a pH 65, complementado con 1-4 mM de compuesto antes de la congelación instantánea en nitrógeno líquido. Se recogió un conjunto de datos de difracción de rayos X a 100 K utilizando la línea de luz avanzada 8.3.1 equipada con el detector ADSC Q315r a una longitud de onda de 1,11587 A. Para ambos cristales, el algoritmo de la estrategia MOSFLM predijo reflexiones superpuestas significativas cuando el detector se situó lo suficientemente cerca del cristal para recoger las reflexiones de mayor resolución visibles en la imagen de difracción. Por ello, el detector se alejó del cristal para evitar estos solapamientos de reflexión.

Las imágenes de difracción fueron indexadas e integradas usando iMOSFLM (Battye, et al., 2010) y escaladas usando AIMLESS (Evans y Murshudov, 2013). Las estructuras de rayos X se resolvieron mediante sustitución molecular utilizando Phenix 1.9-1692 (Adams, et a l., 2010) con la proteína humana Enolase 2 (código PDB 3UCC) como modelo de búsqueda, seguido de un refinamiento iterativo utilizando Coot (Emsley, et al., 2010) y phenix.refine (Afonine, et al., 2012).

K. Productos químicos y procedimientos de caracterización (ejemplos 2 y 3)

Los productos químicos utilizados en el presente documento se compraron a Sigma-Aldrich. Los inhibidores se caracterizaron mediante RMN y espectroscopia de masas de alta resolución. Los espectros de RMN de 1H, 13C y 31P se recogieron utilizando un RMN Bruker de 500 MHZ en la instalación central de M.D. Anderson NMR..

L. Ensayo de desplazamiento térmico

Los ensayos de desplazamiento térmico se realizaron como se describe en Martínez Molina, et al. (2013), en lisados de la línea celular d 423 que sobreexpresa ENO1 y ENO2, en ENO1 y ENO2 humanas recombinantes purificadas de E. c o li, así como en células de glioma intactas que sobreexpresan ENO2 D423. Lisados: Los lisados se prepararon en Tris-HCl 20 mM, EDTA 1 mM y p-mercaptoetanol 1 mM a pH 7,4 y se homogeneizaron utilizando un homogeneizador Polytron tres veces durante un periodo de 10 s seguido de sonicación, tras lo cual los lisados se limpiaron por centrifugación a 20.000g durante 10 minutos. Los lisados se diluyeron (1:100) en el tampón de actividad enzimática de la Enolasa, como se ha mencionado anteriormente. Los lisados diluidos se trataron con SF2312, PhAH o vehículo y se calentaron en un termociclador C1000 (Bio-rad) con un gradiente de temperatura lineal (50 a 82,5 ° C en incrementos de 2,5 ° C) durante 3 minutos (FIG.24). A continuación, los lisados se centrifugaron a 20.000 g durante 10 minutos. A continuación se separaron el sobrenadante y las pellas y se añadió el tampón de muestras NuPage LDS (Life Technologies # NP0007). Las inmunotransferencias Western se realizaron como se ha descrito anteriormente (Muller, etal., 2012). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: ENO1 (Abcam # ab155102), ENO2 (Dako # M087301-2), Vinculina (EMD Millipore # 05-386), pan-ENO (Santa Cruz Biotechnology, sc-7455) y TpI (Proteintech # 10713-1-AP). ENO2 humano recombinante: El mismo procedimiento se llevó a cabo con la ENO2 recombinante purificada de E. coli, utilizando la proteína purificada generada para los estudios de cristalografía de rayos X. Las existencias de la proteína recombinante ENO2 se diluyeron en una relación de 1:10.000 y se trataron con PhAH, SF2312 o un vehículo en un tampón de actividad enzimática de Enolasa, seguido de desnaturalización térmica, centrifugación e inmunobloting como se detalla para los lisados. Líneas celulares de glioma intactas: Las líneas celulares de glioma D423 que sobreexpresan ENO1 y ENO2 se cultivaron en DMEM al 10 %. Las líneas celulares fueron tratadas con fármacos (100 pM PhaH, 100 pM SF2312) o vehículo y, al cabo de un día, las células fueron tripsinizadas y lavadas con PBS. Estas células se resuspendieron en PBS a una concentración de 0,5 *10® células/ml. Un volumen igual de células vivas resuspendidas se calentó en un termociclador C1000 (Bio-rad) con un gradiente de temperatura variable (de 50 °C a 90 °C). Se añadió a las células vivas sometidas a choque térmico el doble de volumen de tampón de lisis (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA y 1 mM p-mercaptoetanol a pH 7,4). Estas células se lisaron además mediante una ronda de ciclos de congelación y descongelación en hielo seco. A continuación, los lisados se centrifugaron a 20,000 g durante 10 minutos. Se recogió el sobrenadante y se añadió el tampón de muestras NuPage LDS (Life Technologies # NP0007). Las inmunotransferencias Western se realizaron como se ha descrito anteriormente (Muller, et al., 2012).

Se prepararon lisados nativos de tejidos de ratón y líneas celulares humanas utilizando 20 mM de Tris HCl, 1 mM de EDTA y 1 mM de p-mercaptoetanol a pH 7,4 y se homogeneizaron utilizando un homogeneizador Polytron tres veces durante un periodo de 10 s seguido de sonicación, tras lo cual los lisados se limpiaron mediante centrifugación a 20.000 g durante 10 minutos. La actividad de la enolasa se midió mediante dos procedimientos diferentes, bien mediante un ensayo fluorométrico ligado a NADH o bien mediante un ensayo espectrofotométrico directo a través de la formación de PEP. En el ensayo de fluorescencia, la actividad de la enolasa se midió a través de la oxidación de NADH en un ensayo acoplado de piruvato quinasa-lactato deshidrogenasa como se describió previamente (Muller, et al., 2012). El ensayo se realiza en 10 mM de KCl, 5 mM de MgSO⁴, 100 mM de trietanolamina a pH 7,4, con 400 pM de NADH y 2 mM de ADP. El 2-fosfoglicerato (2-PGA), la piruvato quinasa (PK) y la lactato deshidrogenasa (LDH) se suministran en exceso, siendo la conversión de 2-PGA a PEP por la enolasa la que limita la tasa. El PEP (con el ADP) es sustrato de la PK; el piruvato formado por esta reacción está vinculado a la oxidación del NADH por la LDH. La actividad de la enolasa se determina midiendo la oxidación del NADH de forma fluorescente mediante excitación a 340 nm y emisión a 460 nm. La concentración de sustrato, si no se indica lo contrario, fue de 5 mM de 2-PGA. La fluorescencia se midió con el lector de placas de fluorescencia Omega (BMG Labtech). Alternativamente, la actividad de la Enolasa se midió directamente por la aparición de PEP a partir de 2-PGA mediante la absorción a 240 nm (Marangos, et al., 1978). El medio de ensayo fue el mismo, salvo que se omiten todos los reactivos auxiliares (PK/LDH, NADH, ADP). Ambos ensayos se llevaron a cabo en un formato de placas de 96 pocillos con el ensayo directo realizado en placas transmisoras de UV.

Ejemplo 2 - Síntesis de inhibidores de la enolasa

El compuesto SF-2312 (que forma parte únicamente de la reivindicación 13 anexa) puede sintetizarse según el procedimiento descrito en el esquema 1. La adición nucleofílica de un haluro de alilo al etil dietil fosfoetano-2-oato de partida en condiciones básicas dio lugar al intermedio alquilado. El éster etílico se hidrolizó y el ácido carboxílico resultante se hizo reaccionar con una hidroxilamina protegida para obtener la hidroxilamida resultante. La hidroxilamida resultante se sometió a condiciones de oxidación para obtener el producto ciclizado. A continuación, se desprotegió el fosfato y se desprotegió la hidroxilamida para obtener el producto final, el SF-2312

SF2312 se obtuvo como una mezcla racémica de los diastereómeros cis y trans (los dos estereocentros en las posiciones 3 y 5 se señalan en el Esquema I). La separación quiral para generar el SF2312 enantioméricamente puro se realizó pasando por una columna de HPLC quiral de Phenomenex® (Torrence, CA). Sí, aunque el propio SF2312 resultó poco práctico de separar debido a su alta polaridad y a la falta de grupos detectables por la luz ultravioleta, el intermedio 15 (Esquema I) se separó con éxito en sus cuatro isómeros enantiopuros (FIGS. 21 y 22). Sin embargo, las reacciones de desprotección (Pasos 5 y 6, en el Esquema III) llevadas a cabo en los intermedios enantioméricamente puros 15 dieron lugar a un SF2312 totalmente racémico. De hecho, ambos estereocentros sufrieron una epimerización espontánea en solución acuosa (FIG. 23). Lamentablemente, esto se esperaba debido a la naturaleza de los dos estereocentros, siendo el C-5 un centro anomérico y el 3-H un protón a altamente ácido. Así, estos resultados sugieren que la síntesis de SF2312 enatioméricamente puro puede no ser técnicamente factible.

Se realizó un análisis similar con el metil SF2312. Una mezcla racémica de metil SF2312 totalmente protegida se fraccionó mediante HPLC quiral, dando lugar a cuatro picos cuya pureza enantiomérica se verificó volviendo a pasar por la misma columna. En base a esta evaluación, el pico 1 mostró una pureza enantiomérica del 99,9 %, el pico 2 del 96 %, el pico 3 del 95 % y el pico 4 del 97 %. Cada pico se evaluó mediante RMN, que no puede indicar la estereoquímica absoluta, pero puede distinguir fácilmente los isómeros cis/trans. Así, mientras que la mezcla racémica de partida dio dos picos por ³¹P RMN , correspondientes a los isómeros cis y trans en relación 1,5:1, cada fracción enantiopura dio un solo pico principal de ³¹P RMN . Los picos 1 y 2, por un lado, y los picos 3 y 4, por otro, eran idénticos por RMN. Según la NOESY, los picos 1 2 corresponden a los isómeros cis, mientras que los 3 4 corresponden a los isómeros trans (FIG. 43). Cuando las fracciones enantiopuras se extrajeron con condiciones básicas suaves, los picos simples se convirtieron en dos. La racemización del pico 1 dio lugar a los picos 1 y 4, mientras que la racemización del pico 2 dio lugar a los picos 2 y 3, la racemización del pico 3 dio lugar a los picos 3 y 2, mientras que la racemización del pico 4 dio lugar a los picos 4 y 1. La interpretación más sencilla de este resultado es que el tratamiento alcalino suave racemiza el hemiaminal anomérico en la posición 5 y que los picos 1 y 4 tienen la misma estereoquímica en la posición 2, que es la opuesta a los picos 2 y 3, que a su vez tienen la misma estereoquímica en la posición 2 (FIG. 44). Las fracciones enantiopuras se sometieron a reacciones de desprotección para eliminar los grupos protectores éster etílico y bencílico y, posteriormente, se comprobó la actividad inhibidora de la Enolasa. A pesar de tener espectros de RMN idénticos (FIG. 46), el pico 2 mostró un IC⁵⁰de alrededor de 3 nM para la inhibición de la Enolasa, mientras que el pico 1 fue ~1000 veces menos potente (FIG. 45). Dado que la pureza quiral es inferior al 100 %, sin querer limitarse a ninguna teoría, se cree que la interpretación más sencilla de estos datos es que el pico 1 es inactivo con respecto a la inhibición de la Enolasa y que la actividad inhibidora residual corresponde a las impurezas enantioméricas de los picos 2 y 3. Según las estructuras de rayos X, los picos 2 y 3 corresponden al enantiómero S activo en la posición 3, mientras que los picos 1 y 4 corresponden al enantiómero R relativamente inactivo en la posición 3. El centro quiral en la posición 5 es anomérico y se racemiza fácilmente en un disolvente acuoso.

En algunas realizaciones, los análogos desoxi de SF-2312 se prepararon como se muestra en el Esquema 2. El fosfato de trietilo y un dihalo alcano se hicieron reaccionar a reflujo. El haloalquilfosfonato resultante se hizo reaccionar con hidroxilamino carbamato de etilo en condiciones básicas para generar el compuesto lineal objetivo 6. El compuesto se hizo reaccionar con una base fuerte para obtener el compuesto cíclico protegido. A continuación, el compuesto se desprotegió para obtener los análogos desoxi deseados del SF-2312

En algunas realizaciones, las versiones protegidas por POM de los inhibidores se prepararon tomando el producto final protegido y desprotegiendo selectivamente el fosfonato. A continuación, el fosfonato se hizo reaccionar con pivalato de halometilo. A continuación, la hidroxilamina se desprotegió en condiciones de reducción, como se muestra en el esquema 3

Esquema 4: Preparación de ((1-benciloxi)-5-hidroxi-2-oxopirrolidin-3-il)fosforil)bis(oxi)) bis(metilen) bis(2,2-dimetilpropanoato) (POMSF) y ((1,5-diacetoxi-2-oxopirrohdm-3-il)fosforil)

bis(oxi))bis(metilen) bis(2,2-dimetilpropanoato) (DiAcPOMSF)

Ejemplo 3 - Caracterización de los inhibidores de la enolasa

En este ejemplo, el SF2312 se preparó en una secuencia de cinco pasos como la descrita por Hanaya e Itoh (2011) con ligeras modificaciones. La eliminación del grupo protector bencílico en el último paso proporcionó el compuesto deseado SF2312. El dietoxifosforilacetato de etilo sirvió como material de partida para la preparación del 2-(dietoxifosforil)pent-4-enoato de etilo. Así, el dietoxifosforilacetato de etilo se desprotonó primero con hidruro de sodio a temperatura ambiente en THF y luego se acopló con una ligera cantidad en exceso de bromuro de alilo durante la noche para dar 2-(dietoxifosforil)pent-4-enoato de etilo con un rendimiento del 58 %. La hidrólisis quimioselectiva del 2-(dietoxifosforil)pent-4-enoato de etilo en etanol acuoso que contiene KOH proporcionó el correspondiente ácido pent-4-enoico en un rendimiento cuantitativo. La condensación del ácido 2-(dietoxifosforil)pent-4-enoico con la O-bencilhidroamina en presencia de 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) dio lugar a la W-benc/lox/-2-(dietoxifosforil)pent-4-enamida en un 66 % de rendimiento. La formación del anillo de 1,5-dihidroxi-2-pirrolidona de la A/-Benc/lox/-2-(dietoxifosforil)pent-4-enamida se llevó a cabo mediante la hemiacetalización intermolecular del hidroxamato con el aldehido terminal. En concreto, la escisión oxidativa de la olefina terminal de la W-Benc/lox/-2-(dietoxifosforil)pent-4-enamida con tetraóxido de osmio y peryodato de sodio dio lugar al intermedio aldehido, que se cicló inmediatamente para dar una mezcla diastereométrica (c/s/trans=1:1) de 1-Benciloxi-3-dietoxifosforil-5-hidroxi-2-pirrolidona (95 %). La eliminación del grupo protector etílico del éster fosfórico se facilitó mediante el tratamiento con bromuro de trimetilsililo para dar con algunas impurezas no identificadas. El grupo bencílico se eliminó por hidrogenólisis con Pd/C como catalizador para dar SF-2312(c/s/trans=1:1 por 1H RMN). 1H RMN (D²O, 600 MHz) ó 5,26 (dd, J = 6,8, 2,8 Hz, 1H), 5,10 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 2,86 (m, 2H), 2,66 (dd, J = 17,6, 7,4 Hz, 1H), 2,52 (m, 2H), 2,05 (m, 2H); 13C RMN (D²O, 500 MHz) ó 171,0, 170,3, 82,4, 81,5, 39,5 (d, 121 MHz), 38,1 (d, 129 MHz), 28,6 (d, 3,3 Hz), 27,7 (d, 2,9 Hz); 31P RMN (D²O, 500 MHz) ó 15,62, 13,95.

Síntesis y caracterización de Desoxi-SF2312, Hex y Hepta: Los procedimientos aquí descritos se adaptaron a partir de los reportados en la literatura (Hanaya e Itoh, 2011; Liu, et al., 2011). En primer lugar, se sintetizó el 3-bromopropilfosfonato de dietilo mediante la reacción de Arbuzov. El fosfito de trietilo en un exceso de diez veces de dibromopropano (n=1 para el Desoxi-SF2312, n=2 para el Hex y n=3 para el Hepta) se calentó a reflujo durante 1 hora para obtener el 3-bromopropilfosfonato de dietilo en un rendimiento del 95 % tras la destilación a presión reducida. Una mezcla de cloruro de O-benc/lh/drox/lam/na, cloroformato en piridina se agitó a temperatura ambiente bajo N²durante 2 h para obtener el éster etílico. Se añadió carbonato de potasio a una solución de 4 y 3-bromopropilfenil sulfona en MeCN y la mezcla se agitó a reflujo durante la noche para obtener el dietilfosfato lineal. Mediante la ciclización con LiHMDS se obtuvo el dietilfosfato ciclizado. La hidrólisis con MeaSiBr en DCM y la hidrogenación para eliminar el grupo bencílico obtuvieron desoxi-SF2312 final (n=1) o tamaños de anillo mayores (n=2 o 3). Para el desoxi-SF2312 (n=1), 1H RMN (MeOD) ó 3,65(m, 1H), 3,56 (m, 1H), 2,92(m, 1H), 2,35 (m, 2H). 13C RMN (MeOD) ó 166,10, 47,73, 38,04(d, J=141,3Hz), 16,73(d, 3,8 Hz). 31P RMN (MeOD) ó 22,32. HRMS: C⁴H⁸NO⁵P [M+H]+ = 182,0187 (calculado 182,0214). Para Hex(n=2), 1H RMN (MeOD) ó 3,65-3,54 (m, 2H); 2,75 (m, 1H); 2,22 (m, 1H); 2,12-2,03 (m, 2H); 1,82 (m, 1H). MS (ES+) C5H10NO5P requiere: 195, encontrado 196 [M+H]+. MS (ES-) C5H10NO5P requiere: 195, encontrado 194 [M-H]-. Para Hepta (n=3), 1H RMN (MeOD) ó 4,07 (m, 1H), 3,78 (m, 1H), 2,83 (m, 1H), 2,01-1,97 (m, 2H), 1,80 (m, 1H), 1,62- 1,59 (m, 3H), 13C RMN (MeOD) ó 172,7, 63,0, 52,2, 40,7, 26,1, 13,8, 31P RMN (MeOD) ó 15,75 HRMS: C⁴H⁸NO⁵P [M+H]+ = 182,0187 (calculado 182,0214).

Síntesis y caracterización de Pom-Hex: El Hex se sintetizó como se describe en el Esquema 2. En el sexto paso, el éster de pivoxilo se añadió por una reacción SN¹a partir del cloro-intermedio. 1H RMN (500 MHz, CDCh) ó 5,70 (ddd, J = 15,8, 12,0, 5,0, 2H), 5,63 (t, J = 9,3, 2H), 3,59 (s, 2H), 3,08 (d, J = 26,2, 1H), 2,13 (s, 1H), 2,04 (d, J = 7,1, 2H), 1,83 (s, 1H), 1,16 (d, J = 2,3, 18H). 13C RMN (126 MHz, CDCI³) 5176,94, 176,93, 82,61, 82,56, 81,65, 81,60, 48,90, 41,68, 40,54, 38,74, 26,97, 26,86, 26,84, 26,74, 22,29, 21,55, 21,47. 31P RMN (202 MHz, CDCI³) 522,92. HRMS:

[M+H]+ calc. 424,1731 expt. 424,1734.

Síntesis y caracterización de (((1-(benciloxi)-5-hidroxi-2-oxopirrolidin-3-il)fosforil)bis(oxi))bis(metileno) bis(2,2-dimetilpropanoato): A una solución de ácido (1-(benciloxi)-5-hidroxi-2-oxopirrolidin-3-il)fosfónico (Hanaya e Itoh, 2011), (650 mg, 2,2 mmol) en agua (5,6 ml) se añadió NaOH (181 mg, 4,5 mmol) y la mezcla resultante se agitó a 25°C durante 1 h. A esta solución se añadió una solución de AgNO³(1,1 g, 6,7 mmol) en agua (0,8 ml) y la mezcla resultante se agitó a 25°C durante 2 h. La suspensión resultante se almacenó a 0°C durante 24 h. El sólido se recogió por filtración al vacío y se lavó con agua fría (10 ml) y Et²O (5 ml) y se secó al vacío durante una noche. El sólido resultante se añadió a una solución de pivalato de yodometilo (753 pl, 4,9 mmol) en tolueno (5,6 ml), y la mezcla resultante se agitó a 25°C durante ⁶h. El sólido se filtró y el filtrante se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (20 - 100 % EtOAc en hexanos para dar (((1-(benciloxi)-5-hidroxi-2-oxopirrolidin-3-il)fosforil)bis(oxi))bis(metileno) bis(2,2-dimetilpropanoato) (252 mg, 0,49 mmol, 21 % de rendimiento) como un líquido incoloro. 1H RMN (600 MHz, DMSO-d⁶) 5 ppm (mezcla de diastereómeros): 7,48-7,44 (m, 2H), 7,42-7,36 (m, 3H), 6,79 y 6,69 (2d, J = 6,4 Hz, 6,4 Hz, 1H), 5,73-5,56 (m, 4H), 52 y 5,1 (2m, 1H), 4,96, 4,92 (2s, 2H) 3,49-3,26 (m, 1H), 2,53 2,24 (m, 1H), 2,00-1,79 (m, 1H), 1,17 (s, 18H). Se requiere MS (ES+) C²³H³⁴NO¹⁰P: 515,1, encontrado 538,2 [M+Na]+.

Síntesis y caracterización de (((1-(benciloxi)-5-hidroxi-2-oxopirrolidin-3-il)fosforil)bis(oxi))bis(metileno) bis(2,2-dimetilpropanoato) (POMSF): Se cargó un recipiente de reacción con (((1-(benciloxi)-5-hidroxi-2-oxopirrolidin-3-il)fosforil)bis(oxi))bis(metileno) bis(2,2-dimetilpropanoato) (252 mg, 0,48 mmol), Pd al 5 % sobre BaSO⁴(104 mg, 0,05 mmol) y MeOH (4,8 ml) bajo una atmósfera de N². La suspensión se desgasificó con N²durante 2 minutos y se purgó con H²durante 2 minutos. La mezcla de reacción se agitó bajo una atmósfera de H²a 3447 hPa (50 psi) durante 4 h. La mezcla de reacción se purgó con N², y se filtró a través de Celite® y se concentró a presión reducida para dar (((1,5-dihidroxi-2-oxopirrolidin-3-il)fosforil)bis(oxi))bis(metileno)bis(2,2-dimetilpropanoato) (162 mg, 0,38 mmol, 78 % de rendimiento) como un aceite naranja. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 5 ppm (mezcla de diastereómeros): 9,79 (s, 1H), 6,65, 6,58 (2d, J = 5,7 Hz, 6,7 Hz 1H), 5,72-5,52 (m, 4H), 5,0 (m, 1H), 3,42-3,19 (m, 1H), 2,48-2,27 (m, 1H), 1,97-1,68 (m, 1H), 1,17 (s, 18H). 31P RMN (500 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 24,81, 24,59. Se requiere MS (e S+) C¹⁶H²⁸NO¹⁰P: 425,15, encontrado: 448,0 [M+Na]+.

Síntesis y caracterización de (((1,5-diacetoxi-2-oxopirrolidin-3-il)fosforil)bis(oxi))bis(metileno) bis(2,2-dimetilpropanoato) (DiAcPOMSF): A una solución de (((1,5-dihidroxi-2-oxopirrolidin-3-il)fosforil)bis(oxi))bis(metileno) bis(2,2-dimetilpropanoato) (5 mg, 0,012 mmol) en piridina (0,2 ml) se añadió Ac²O ^{( 6}pl, 0,06 mmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. Los volátiles se eliminaron a presión reducida y el residuo se secó a presión reducida durante 18 h para dar (((1,5-diacetoxi-2-oxopirrolidin-3-il)fosforil)bis(oxi))bis(metileno)bis(2,2-dimetilpropanoato) (5,4 mg, 10,6 pmol, rendimiento del 90 %) como un líquido de color marrón. 1H RMN (500 m Hz , CDCh) 5 ppm (mezcla de diastereómeros): 6,29 (m, 1H) 5,83-5,62 (m, 4H), 3,47 3,13 (m, 1H), 2,91-2,75 (m, 1H), 2,51-1,21 (m, 1H), 2,20, 2,18, 2,13, 2,07 (4s, ⁶H, diastereómeros y rotámeros) y 1,24 (s, 18H). 31P RMN (500 MHz, CDCh) 5 ppm (mezcla de diastereómeros): 20,03, 19,95. MS (ES+) C²⁰H³²NO¹²P requiere: 509,1, encontrado: 532,0 [M+Na]+.

Preparación de (((2-oxo-1,5-bis(propioniloxi)pirrolidin-3-il)fosforil)bis(oxi))bis(metileno) bis(2,2-dimetilpropanoato) (DiPrPOMSF). El compuesto del título se preparó por el procedimiento descrito para el DiAcPOMSF. 1H RMN (500 MHz, CDCh) 5 ppm (mezcla de diastereómeros): 6,29 (m, 1H) 5,83-5,62 (m, 4H), 3,47 3,13 (m, 1H), 2,91-2,75 (m, 1H), 2,53-2,32 (m, 5H), 2,21-2,12 (4s, ⁶H, diastereómeros y rotámeros) y 1,24 (s, 18H).

31P RMN (500 MHz, CDCh) 5 ppm (mezcla de diastereómeros): 20,19, 20,06. MS (ES+) C²⁰H³²NO¹²P requiere: 537,2, encontrado: 560,3 [M+Na]+.

Preparación de (((5-(isobutiriloxi)-1-((3-metilbutanoil)oxi)-2-oxopirrolidin-3-il)fosforil)bis(oxi))bis(metileno) bis(2,2-dimetilpropanoato). El compuesto del título se preparó por el procedimiento descrito para el DiAcPOMSF. 1H RMN (500 MHz, CDCh) 5 ppm (mezcla de diastereómeros): 6,29 (m, 1H) 5,83-5,62 (m, 4H), 3,47-3,13 (m, 1H), 2,91 2,75 (m, 1H), 2,53-2,32 (m, 5H), 2,21-2,12 (m, ⁶H, diastereómeros y rotámeros) y 1,24 (s, 18H). 31P RMN (500 MHz, CDCh) 5 ppm (mezcla de diastereómeros): 20,19, 20,06. MS (ES+) C²⁰H³²NO¹²P requiere: 593,2, encontrado: 616,5 [M+Na]+.

4-(bis((pivaloiloxi)metoxi)fosforil)-5-oxopirrolidin-1,2-diil bis(3-metilbutanoato). El compuesto del título se preparó por el procedimiento descrito para el DiAcPOMSF. 1H RMN (500 MHz, CDCh) 5 ppm (mezcla de diastereómeros): 6,25 (m, 1H) 5,74-5,59 (m, 4H), 3,36-3,10 (m, 1H), 2,83-2,71 (m, 1H), 2,53-2,32 (m, 5H), 2,26-2,02 (m, 7H), 1,16 (s, 18H), 0,97-0,84 (m, ^{1 2}H). 31P Rm N (500 MHz, cD ch) 5 ppm (mezcla de diastereómeros): 20,25, ^{2 0},^{1 1}. Se requiere m S (ES+) C²⁶H⁴⁴NO¹²P: 593,26, encontrado: 616,5 [M+Na]+

Paso 1: dicloruro (1-(benciloxi)-2-oxopiperidin-3-il)fosfónico A una solución de ácido (1-(benciloxi)-2-oxopiperidin-3-il)fosfónico (150 mg, 0,526 mmol) en DCM (2629 pl) se añadieron COCl²(921 pl, 10,5 mmol) y cloruro de N-(dorometileno)-N-metilmetanaminio (1,3 mg, 10 pmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2h. La mezcla se concentró cuidadosamente y se secó en el liofilizador. El producto crudo se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional. MS (ES+) C i⁴H²⁰NO5P requiere: 311,1 , encontrado: 336,0 [M+H]+ (aducto metoxi).

Paso 2: 2-((1-(benciloxi)-2-oxopiperidma-3-il)fp-to/u/7ox/)fosforil)oxi) acetato de metilo. Se añadió una solución de dicloruro fosfónico de (1-(benciloxi)-2-oxopiperidina-3-il) (25 mg, 0,078 mmol) en DCM (776 pl) a una solución de p-cresol (10,07 mg, 0,093 mmol), clorhidrato de metiléster de glicina (11 mg, 0,093 mmol) y DIp Ea (67 pl, 0,38 mmol) en DCM (776 pl). La mezcla resultante se agitó a ta durante 18 h. El disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (0 -100 % EtOAc en hexanos para dar2-(((1-(benciloxi)-2-oxopiperidin-3-il)(p-folu/7ox/)fosforil)amino)acetato de metilo (^{6 , 8}mg, 0,015 mmol, 19,63 % de rendimiento) como un líquido incoloro. (El hidrocloruro de éster metílico de p-Cresol y glicina se sometió azeotropía antes de su uso). 1H RMN (500 MHz, CDCls) 5 ppm: 7,42-7,35 (m, 2H), 7,31-7,28 (m, 3H), 7,22 (d, 4H, 2,1 Hz) 4,93 (dd, 2H, J=11,4, 12,0), 4,53-4,49 (m, 1H), 3,84-3,69 (m, 1H), 3,69-3,55 (m, 1H), 3,59 (s, 3H), 3,38-3,25 (m, 2H), 2,10 (s, 3H), 2,10-1,92 (m, 2H), 1,74-2,52 (m, 3H). 31P RMN (500 MHz, CDCls) 5 ppm: 27,61. MS (ES+) C²²H²⁷N²O⁶P requiere: 446,4 , encontrado: 347,4 [M+H]

Paso 3: 2-(((1-hidroxi-2-oxopiperidm-3-il)(p-folu/7ox/)fosforil)ammo)acetato de metilo Se cargó un recipiente de reacción con 2-(((1-(benciloxi)-2-oxopiperidin-3-il)(p-folu/7ox/)fosforil)amino)acetato de metilo (6,8 mg, 0,015 mmol), paladio al 5 % sobre sulfato de bario (3,24 mg, 1,523 pmol) y MeoH (1 ml) bajo una atmósfera de N2. La suspensión se desgasificó con N2 durante 2 minutos y se purgó con H2 durante 2 minutos. La mezcla de reacción se agitó bajo una atmósfera de H2 a 3447 hPa (50 psi) durante 4 h. La mezcla de reacción se purgó con N2 y se filtró a través de Celite® y se concentró a presión reducida para dar 2-(((1-hidroxi-2-oxopiperidin-3-il)(p-folu/7ox/)fosforil)amino)acetato de metilo (3 mg, 8,42 pmol, 55,3 % de rendimiento) como un aceite incoloro. 1H Rm N (500 MHz, CDCl3) 5 ppm: 6,98 (dd, 4H, 8,01,20,0Hz) 4,44 (m, 1H), 3,94-3,85 (m, 1H), 3,7-3,55 (m, 3H), 3,60 (s, 3H), 3,28 (dd, 1H, J=6,23, 2,27Hz), 2,23 (s, 3H), 2,14-2,00 (m, 2H), 1,99 (m, 1H), 1,89-1,94 (m,2H). 31P RMN (500 MHz, CDCh) 5 ppm: 26,52. MS (ES+) C¹⁵H²¹N²O⁶P requiere: 356,11, encontrado: 357,3 [M+H]+

Met S F 2312

Paso 1: 2-(dietoxifosforil)-2-metilpent-4-enoato de etilo: A una solución de 2-(dietoxifosforil)propanoato de etilo (10,0 g, 42 mmol) en THF (100 ml) a 0 °C se añadió NaH (2 g, 50 mmol). La mezcla se agitó a 0 °C durante 1 h. Se añadió el 3-bromoprop-1-eno (6,1 g, 50 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió NH4Cl acuoso (50 ml) a 0 °C y se eliminó el disolvente, se extrajo con DCM (3 * 200 ml), las capas orgánicas combinadas se secaron sobre anhidro-MgSO4, se filtraron y se concentraron para dar un aceite de color amarillo (12 g, crudo). Se requiere MS (ES+) C12H23O5P: 278, encontrado: 279 [M+H]+.

Paso 2: ácido 2-(dietoxifosforil)-2-metilpent-4-enoico A una solución de 2-(dietoxifosforil)-2-metilpent-4-enoato de etilo (12 g, 43 mmol) en EtOH (100 ml) se añadió 10 M aq. KOH (6,5 ml, 65 mmol). La mezcla se agitó a TA durante 48 h. A continuación, la mezcla se calentó a 50 °C durante 48 h. Se eliminó el disolvente, se diluyó con agua (50 ml) y se extrajo con DCM (2 * 100 ml). Luego se ajustó el pH con HCl 1M, se extrajo con DCM (3 * 100 ml), las capas orgánicas combinadas se secaron sobre anhídrido-MgSO⁴, se filtraron y se concentraron para obtener el compuesto del título como un aceite de color amarillo (8 g, crudo). MS (ES+) C¹⁰H¹⁹O⁵P requiere: 250, encontrado: 251 [M+H]⁺.

Paso 3: 1-(benciloxiamino)-2-metil-1-oxopent-4-en-2-ilfosfonato de dietilo: A una solución de ácido 2-(dietoxifosforil)-2-metilpent-4-enoico (8,0 g, 32 mmol) y clorhidrato de O-bencilhidroxilamina (4,3 g, 35,2 mmol) en DCM (200 ml) se añadió DMAP (5,9 g, 48 mmol) y clorhidrato de EDC (6,2 g, 48 mmol). Tras agitar durante 36 h a temperatura ambiente, la mezcla se lavó con HCl 1M (2 * 50 ml) y salmuera (50 ml). La capa orgánica se secó sobre MgSO⁴anhidro y se evaporó al vacío para obtener un aceite de color amarillo (9 g, crudo). Se requiere MS (ES+) C¹⁷H²⁶NO⁵P: 355, encontrado: 356[M+H]⁺.

Paso 4: 1-(benciloxi)-5-hidroxi-3-metil-2-oxopirrolidin-3-ilfosfonato de dietilo: A la solución de 1-(benciloxiamino)-2-metil-1-oxopent-4-en-2-ilfosfonato de dietilo (5,0 g, 14,1 mmol) en dioxano/H²O (300 ml/300 ml) se añadió OsO⁴(286 mg, 1,13 mmol). La mezcla se agitó a TA durante 30 minutos, después se añadió NaIO⁴(9 g, 8,42,2 mmol) por partes, la mezcla se agitó a TA durante 1 h, y se diluyó con agua (1000 ml), se extrajo con DCM (3 * 500 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (300 ml) y salmuera (300 ml), se secaron con MgSO⁴anhidro, se filtraron y se concentraron para obtener el compuesto del título como un aceite de color amarillo claro (5 g, crudo). Se requiere MS (ES+) C¹⁶H²⁴NO⁶P: 357, encontrado: 358[M+H]⁺.

Paso 5: ácido 1-(benciloxi)-5-hidroxi-3-metil-2-oxopirrolidin-3-ilfosfónico (Metil SF2312 protegido): A la solución de 1-(benciloxi)-5-hidroxi-3-metil-2-oxopirrolidin-3-ilfosfonato de dietilo (5 g, crudo) en DCM (250 ml) se añadió TMS-I (8,4 g, 42 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Una vez completada la reacción, se concentró y se disolvió en DCM (50 ml) y agua (20 ml), la fase acuosa se extrajo con EA (50 ml * 5), luego la fase acuosa se purificó por columna de fase inversa para obtener el compuesto del título como un sólido blanco (1,5 g, 40 %). Se requiere MS (ES+) C-^H-^iaNO^aP: 301, encontrado: 302 [M+H]⁺y283 [M-H²O+H]⁺.¹H RMN (500 MHz, D²O) 87,68 -6,89 (m, 5H), 5 ,27-4,80 (m, 3H), 2,20 (dddd, J = 224,7, 210,2, 20,7, 9,8 Hz, 2H), 1,46-0,81 (m, 3H).

Paso 6: ácido 1,5-dihidroxi-3-metil-2-oxopirrolidin-3-ilfosfónico (Metil SF2312): A una solución de ácido 1-(benciloxi)-5-hidroxi-3-metil-2-oxopirrolidin-3-ilfosfónico (100 mg) en agua (10 ml), se añadió Pd(OH)²(20 mg), la mezcla se agitó bajo atmósfera de H²durante 4 h a TA. Una vez completada la reacción, se filtró y liofilizó para obtener el producto puro como sólido blanco (50 mg, 75 %). MS (ES+) C⁵H¹⁰NO⁶P, requiere: 211, encontrado: 210[M-H]^{- 1}H RMN-³¹P dec (500 MHz, D²O) 85,22 (dd, J = 6,9, 4,3 Hz, 1H), 5,10 (dd, J = 6,6, 1,8 Hz, 1H), 2,76 (dd, J = 14,2, 7,0 Hz, 1H), 229 (dd, J = 14,4, 1,8 Hz, 1H), 2,19 (dd, J = 14,3, 6,6 Hz, 1H), 1,62 (dd, J = 14,2, 4,4 Hz, 1H), 1,35 (s, 3H), 1,28 (s, 3H). ¹H RMN (500 MHz, D²O) 85,22 (dd, J = 6,9, 4,4 Hz, 1H), 5,10 (dm, J = 6,3, 1H), 2,76 (ddd, J =17,5, 14,2, 7,0 Hz, 1H), 2 ,33-2,14 (m, 2H), 1,62 (td, J =14,4, 4,4 Hz, 1H). ³¹P RMN - ¹H dec (202 MHz, D²O) 820,89, 19,81. ³¹P RMN (202 MHz, D²O) 820,88 (q, J =15,7 Hz), 19,80 (q, J =15,8 Hz).

Síntesis y caracterización del ácido 3-fluoro-1,5-dihidroxi--2-oxopirrolidin-3-il)fosfónico (FluoroSF2312): ácido (3-fluoro-1,5-dihidroxi-2-oxopirrolidin-3-il)fosfónico se preparó en una secuencia de cinco pasos como la descrita por Hanaya e Itoh (2011) con ligeras modificaciones. El 2-(dietoxifosforil)-2-fluoroacetato de etilo se obtuvo comercialmente y sirvió como material de partida para la preparación del 2-(dietoxifosforil)-2-fluoropent-4-enoato de etilo. Así, el 2-(dietoxifosforil)-2-fluoroacetato de etilo se desprotonó primero con hidruro de sodio en THF y luego se acopló con una cantidad excesiva de bromuro de alilo durante la noche para dar 2-(dietoxifosforil)-2-fluoropent-4-enoato de etilo con un rendimiento de >80 %. La hidrólisis quimioselectiva del 2-(dietoxifosforil)-2-fluoropent-4-enoato de etilo en etanol acuoso con LiOH proporcionó el correspondiente ácido pent-4-enoico en un rendimiento cuantitativo. La condensación del ácido 2-(dietoxifosforil)-2-fluoropent-4-enoico con la O-bencilhidroamina en presencia de 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) produjo fosfonato de dietilo (1-((benciloxi)amino)-2-fluoro-1-oxopent-4-en-2-il) en un rendimiento del 70 %. La formación del anillo de 1,5-dihidroxi-3-fluoro-2-pirrolidona del fosfonato de dietilo (1-(benciloxi)-3-fluoro-5-hidroxi-2-oxopirrolidin-3-il) se llevó a cabo mediante la hemiacetalización intermolecular del hidroxamato con el aldehído terminal. En concreto, la escisión oxidativa de la olefina terminal del dietil

El (1-((benciloxi)amino)-2-fluoro-1-oxopent-4-en-2-il)fosfonato con tetraóxido de osmio y peryodato de sodio proporcionó el intermedio aldehídico, que se cicló inmediatamente para dar una mezcla diastereométrica (cis/trans=1:1) de (1-((benciloxi)amino)-2-fluoro-1-oxopent-4-en-2-il)fosfonato de dietilo (95 %). La eliminación del grupo protector etílico del éster fosfórico se llevó a cabo mediante el tratamiento con bromuro de trimetilsililo y el grupo bencílico se eliminó por hidrogenólisis con Pd/C como catalizador para dar ácido (3-fluoro-1,5-dihidroxi-2-oxopirrolidin-3-il)fosfónico (Fluoro SF2312) (cis/trans=1:1 por ¹H RMN). ¹H RMN (600 MHz, D²O) 85,33 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 5,23 (td, J = 6,4, 4,3 Hz, 2H), 3 ,18-3,05 (m, 2H), 2,79-2,55 (m, 3H), 2,13 (dddd, J = 29,9, 15,3, 11,0, 4,3 Hz, 2H). MS (+ c ESI): m/z (%) 216 [MH⁺] (100) MS (- c ESI): m/z (%) 214 [M-H⁺] (35).

Ejemplo 4 - Actividad biológica de los compuestos e inhibición de la actividad de la enolasa

Como puede verse en la FIG. 1, SF2312 (que forma parte únicamente de la reivindicación 13 adjunta) fue más potente que PhAH (no de la presente invención) contra ENO². La inhibición mostró un patrón bifásico, por lo que la principal diferencia entre ENO2 y ENO2 se produjo después de alcanzar el IC⁵⁰. El grupo hidroxilo del SF2312 puede desempeñar un papel en esta diferencia, ya que el desoxi-SF2312 muestra una diferencia mínima en la eficacia inhibidora entre ENO2 y ENO1. En las variantes deshidroxi de SF2312, el aumento del tamaño del anillo disminuyó progresivamente la potencia, pero incluso el inhibidor de siete miembros conservó la actividad inhibidora. El anillo de seis miembros, Hex, también mostró una actividad aproximadamente 6 veces mayor contra ENO2 frente a ENO1. La fosmidomicina, que tiene la misma fórmula empírica que el Hex, resultó ser completamente inactiva como inhibidor de la enolasa, incluso a concentraciones de >10.000.000 nM. El efecto de SF2312, desoxi-SF2312 y PhAH sobre la actividad enzimática de la enolasa in vitro también se determinó mediante un ensayo indirecto, vinculado a la piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa (fluorescencia de NADH) o directamente midiendo la aparición de PEP (absorción a 240 nm). La actividad inhibidora de la enolasa se midió en lisados de órganos de ratón, líneas celulares de cáncer humano que sobreexpresan ENO1 y ENO2, así como en ENO1 y ENO2 humanos purificados y expresados en E. coli (Tabla 3). Dependiendo de la fuente, el IC⁵⁰de SF2312 osciló entre 10 nM y 50 nM y en comparaciones paralelas fue más potente que PhAH (FIG. 23). SF2312 mostró una IC⁵⁰similar hacia e NO1 y e NO2, pero curiosamente, la IC⁷⁵y la superior fueron mucho menores para ENO2 que para ENO1 (FIG. 23). En el IC⁵⁰, el SF2312 mostró una cinética no competitiva con respecto al sustrato 2-PGA (FlG. 24). El IC⁵⁰de SF2312 es aproximadamente un 50 % más bajo que el de PhAH y el IC⁷⁵es mucho más bajo aún (FIG. 23) en el ensayo enzimático aislado. La forma de la curva de valoración del inhibidor es inusual. Sin querer ceñirse a ninguna teoría, se cree que la forma de la curva de valoración del inhibidor puede estar relacionada con el comportamiento de unión anti-cooperativa del dímero de la enolasa, por el cual la unión del inhibidor a un sitio activo del dímero disminuye la afinidad de unión del inhibidor en el otro sitio activo (Qin, et al., 2012). Se probó la actividad inhibidora de la enolasa de varios fosfonatos naturales y análogos de fosfonatos. Los antibióticos fosfonatos Fosfomicina y Fosmidomicina, así como el antiviral Foscarnet, no mostraron actividad inhibidora de la enolasa ni siquiera a 10 mM (FIG. 29) a pesar de tener una similitud estructural con SF2312. Además, el último intermedio y el producto hidrogenado de 15 carecían de actividad inhibidora de la Enolasa hasta 1 mM.

Tabla 3 - Estadísticas de recolección y refinamiento de datos de difracción de rayos X para la Enolasa 2 unida a un inhibidor

(continuación)

En algunos casos, la potencia inhibitoria de SF2312 contra la enolasa fue influenciada por si el inhibidor o el sustrato fue agregado primero en el sistema de ensayo. La preincubación de PhAH (rombos) o SF2312 (cuadrados) con ENO1 o ENO2 humana antes de la adición del sustrato 2-PG dio lugar a la inhibición de la actividad enzimática (IC⁵⁰~20 nM); la inhibición de ENO2 con SF2312 fue más profunda y más duradera que la de ENO1 (el IC⁸⁰de SF2312 es 10 veces menor para ENO2 que para ENO1), mientras que PhAH causó una inhibición más o menos igual de ENO1 y ENO2, como puede verse en la FIG. 2A. La adición concomitante de SF2312/PhAH y 2-PG dio lugar a una inhibición más débil que si los inhibidores se preincubaban antes de la adición del sustrato, como se muestra en la FIG. 2B; este comportamiento se describió anteriormente para la inhibición por PhAH de la enolasa de levadura (Anderson, et al., 1984), es decir, PhAH actúa como un inhibidor de kactvo "lento". El SF2312 fue menos potente que el PhAH cuando se ensayó en estas condiciones, lo que indica que muestra un kactvo aún más lento que el PhAH. Dado que el SF2312 es más potente que el PhAH cuando se preincuba antes de añadir el sustrato, esta observación indica que el SF2312 tiene un k^nactivo mucho más lento que el PhAH y que la mayor potencia inhibitoria del SF2312 contra la ENO2 respecto a la ENO1 se debe a las diferencias en el k^nactivo más que en el k^activo . La diferencia entre ENO2 y ENO1 fue más pronunciada para la tasa de desactivación, ya que las diferencias entre las isozimas fueron pronunciadas cuando los inhibidores fueron preincubados con la enzima (FIG. 23 y FIG. 25A), pero no fueron diferentes cuando el sustrato se añadió antes de los inhibidores (FIG. 25B). El desoxi-SF2312 fue mucho menos potente como inhibidor de la enolasa, con un IC⁵⁰de ~2000 nM, que fue similar para ENO1 y ENO2. A diferencia del SF2312, el desoxi-SF2312 mostró una clara cinética competitiva con respecto al sustrato 2-PGA (FIG. 24). Sin querer ceñirse a ninguna teoría, se cree que la diferencia de actividad entre el SF2312 y el desoxi-SF2312 puede atribuirse al grupo hidroxilo del SF2312, ya que el desoxi-SF2312 muestra una diferencia mínima en la eficacia inhibidora entre ENO2 y ENO1. SF2312, al igual que PhAH, se unió a la forma di-Mg de la enzima. ENO2 mostró una mayor afinidad por el segundo ion de magnesio (Mg^b) y una estabilidad general mucho mayor que ENO1 (Marangos y Schmechel, 1980; Marango, et al., 1978; Marango, et al., 1979). Dado que la Mg^bdebe disociarse primero antes de que el inhibidor pueda salir del sitio activo, sin querer limitarse a ninguna teoría, la mayor afinidad de ENO2 por la Mg^bpuede explicar el k^inactvo más lento para el SF2312 en ENO2 frente a ENO1. Sin querer ceñirse a ninguna teoría, se cree que una diferencia en la unión de SF2312 a la enolasa frente a la unión de PhAH se debe a los enlaces de hidrógeno adicionales con los residuos del sitio activo que participan en la reacción de deshidratación.

Como prueba adicional de la unión de SF2312 a la proteína enolasa, se realizaron ensayos de desplazamiento térmico inducido por el ligando en lisados celulares en las mismas condiciones en las que se realizó el ensayo enzimático (Martínez Molina, et al., 2013). El principio del ensayo es que las proteínas desnaturalizadas por el calor se precipitan fuera de la solución cuando su núcleo hidrófobo queda expuesto. Como resultado, las proteínas desnaturalizadas por el calor desaparecen del lisado después de la centrifugación, mientras que las proteínas nativas correctamente plegadas permanecen en la solución. Los niveles de proteínas específicas en el sobrenadante, como las proteínas no desnaturalizadas, se siguen mediante inmunotransferencia en función del aumento de la temperatura. La incubación de lisados celulares con 1 pM de SF2312, desplazó la temperatura de fusión de ENO2 de ~67,5 °C a >75 °C, lo que representa un desplazamiento de >7,5 °C en la desnaturalización térmica de ENO2 (FIG. 26). Por el contrario, la misma concentración de PhAH condujo a una estabilización mucho más modesta de ~2,5 °C de la proteína. Esta estabilización emitida por SF2312 podría estar relacionada con los enlaces de hidrógeno formados entre el 5-OH y el sitio activo (FIG. 27), lo que puede ayudar a bloquear la enzima en la configuración más ajustada (de A. S. Navarro, et al., 2007; Brewer y Wampler, 2001; Zhang, et al., 1997). Se obtuvieron resultados similares para ENO1, excepto que la proteína era en general menos estable térmicamente que ENO2 (Marangos, et al., 1978). Es importante destacar que ni el PhAH ni el SF2312 tuvieron ningún efecto sobre la estabilidad térmica de los controles internos, la vinculina o la triosa-fosfato isomerasa (FIG. 26). Como validación adicional, se repitió el ensayo de desplazamiento térmico utilizando la proteína ENO2 humana recombinante expresada en E. coli. Estas proteínas recombinantes también se utilizaron en los experimentos de cristalografía de rayos X. Los resultados fueron consistentes con los obtenidos en lisados celulares, con SF2312 causando una estabilización de ~15 °C de la proteína (FIG. 28), que era mucho mayor que la inducida por la PhAH (~5 °C).

Se realizó un análisis cinético de Michealis-Menten de SF2312 con ENO1 y ENO2, valorando el sustrato, 2-PG (se muestran curvas de 1,25, 2,5, 5, 10 mM para ENO1 y ENO2, como se indica) como se muestra en la FIG. 3. SF2312 mostró una cinética de inhibición mixta dependiente del sustrato muy inusual. En concreto, a una inhibición del 50 % (IC⁵⁰) de la actividad de la enolasa, el SF2312 se comportó como un inhibidor clásico no competitivo, no viéndose afectado esencialmente por la concentración de sustrato (2-PG). Sin embargo, con una inhibición superior al 75 % de la actividad inicial (IC⁷⁵), se observó una clara dependencia de la concentración de sustrato. Esta inhibición mixta es muy inusual y puede estar relacionada con las interacciones conocidas entre los monómeros del dímero de la enolasa, por lo que la unión de una molécula inhibidora a un dímero, altera la conformación y la afinidad de unión del otro dímero. Mientras que ENO1 y ENO2 mostraron esencialmente el mismo IC⁵⁰para SF2312, las dos enzimas diferían sustancialmente en el IC⁷⁵y en la forma en que el 2-PG compite con el inhibidor, siendo mucho más difícil que el inhibidor compita con el sustrato en ENO2 que en ENO1.

La eliminación del grupo 5-OH da lugar a un inhibidor con un IC⁵⁰sustancialmente mayor, que se muestra en la FIG.

4A. Además, mientras que el SF2312 muestra una cinética de inhibición mixta, el desoxi-SF2312 y sus derivados anillados de mayor tamaño muestran una cinética competitiva típica de Michaelis-Menten. Así, la diferencia relativa en el IC⁵⁰entre SF2312 y desoxi-SF2312 fue mayor con mayores concentraciones de sustrato 2-PG. En las FIGS. 4B y 4C, los gráficos de Lineweaver-Burke se utilizaron para derivar las pendientes utilizadas en el gráfico recíproco doble (Dixon) (FIG. 4D), cuya pendiente e intercepción se utilizaron para calcular el Kⁱ (mostrado en la figura para Hex). Hex mostró un Kⁱ considerablemente menor para ENO2 que para ENO1.

Se ha demostrado que PhAH inhibe selectivamente la proliferación de las células de glioma D423 con supresión de ENO1 en mayor medida que los controles isogénicos rescatados (Muller, et al., 2012). El SF2312 se comparó con el PhAH en cuanto a su efecto sobre la proliferación celular (número total de células, Hoechst 33342) y la apoptosis (células positivas al yoduro de propidio) tras 2 semanas de tratamiento y se muestra en las FIGS. 5A Y 5B. SF2312 fue aproximadamente 8 veces más potente en la inhibición de la proliferación de las células de glioma suprimidas por ENOlen comparación con PhAH (FIG. 30). El efecto sobre la inducción de la muerte celular fue más acentuado: SF2312 fue al menos 16 veces más potente que PhAH en la inducción de la muerte celular en las células de glioma con supresión de ENO1 (FIG. 30). El SF2312 puede ser hasta 4 veces más potente de lo que sugieren estos datos, ya que la estructura de rayos X sugiere que sólo un isómero del SF2312 de una mezcla de cuatro es probable que sea activo. La sensibilidad a SF2312 de las células de glioma suprimidas por ENO1 se revirtió completamente por la reexpresión ectópica de ENO1 y, en menor medida, por la sobreexpresión de la expresión de ENO2 (FIG. 30), un hallazgo consistente con que SF2312 tiene una preferencia por inhibir la ENO2 (FIG.23; FIG.24), al menos por encima de IC⁷⁵. SF2312 también fue más potente que PhAH en otra línea celular de glioma suprimida por ENO1, Gli56 (FIG.

31). SF2312 fue hasta 128 veces más potente en la inhibición de la proliferación de las células de glioma Gli56 suprimidas por EMO1 en comparación con las líneas de glioma intactas por ENO1 (FIG. 31). Sin querer ceñirse a ninguna teoría, se cree que el aumento de la toxicidad selectiva para las células de glioma suprimidas por EMO1 se deriva de la preferencia inhibitoria que SF2312 muestra por ENO² sobre ENO1 (FIG. 23). Una de las razones de la mayor sensibilidad de las células con supresión de ENO1 a los inhibidores de enolasa es que estas células sólo conservan el 10 % de la actividad enzimática normal, ya que ENO1 es la isoforma principal, de modo que incluso niveles bajos de un inhibidor de panenolasa son suficientes para inhibir la actividad enzimática restante por debajo del umbral tóxico (FIG. 38, FIG. 36, y FIG. 39) (Muller, et al., 2012). Así, la restauración de la expresión de ENO1 o la sobreexpresión de ENO2 es capaz de restaurar la resistencia a PhAH y SF2312 (FIG. 30) (Muller, et al., 2012). Según estos resultados, ENO1 es más eficaz que ENO2 para restaurar la resistencia a SF2312 (FIG. 30), lo que concuerda con la preferencia de ese inhibidor por la ENO2. Por lo tanto, aunque no es estrictamente necesario para la muerte selectiva, un inhibidor con preferencia por ENO2 sobre ENO1 dará lugar a una selectividad aún mayor para las células suprimidas por ENO1, ya que su toxicidad para las células intactas por ENO1 se reduciría. Mientras que el IC⁵⁰de SF2312 no difirió notablemente entre ENO1 y ENO2 en el ensayo enzimático in vitro (FIG. 23), el IC⁷⁵de SF2312 fue menor para ENO2. Sin querer limitarse a ninguna teoría, se cree que los datos indican que el complejo inhibidorenzima es más estable para ENO2 que para ENO1.

Las investigaciones han demostrado que el PhAH y el ARNhc contra ENO2 pueden inhibir selectivamente la glicólisis y conducir a una acumulación de productos intermedios corriente arriba de la enolasa bloqueada en las células de glioma suprimidas por ENO1 (Muller, et al US 2014/0378529 WO 2013/0909732). En las FIGS. 6Ay 6B, se realizó un rastreo metabólico utilizando ¹³C RMN con ¹³C-glucosa marcada individualmente en el átomo de carbono 1 (C-1) en líneas celulares homocigóticamente suprimidas o genómicamente intactas para ENO1 en presencia o ausencia de 10 |jM de SF2312. Los medios se recolectaron al cabo de cuatro días y los metabolitos se cuantificaron por RMN. En las líneas celulares suprimidas de ENO1 (Gli56, D423), el tratamiento con SF2312 provocó una drástica disminución de las conversiones de ¹³C-1 glucosa a ¹³C-3 lactato, lo que indica una interrupción del flujo a través de la glicólisis. El SF2312 redujo de forma dependiente de la dosis la conversión de ¹³C glucosa a ¹³C lactato de forma selectiva para las células de glioma con eliminación de ENO1 respecto a las rescatadas o intactas con ENO1 (FIG. 32; FIG.33); esto se mantuvo independientemente de si el ¹³C-1 (FIG. 32; FIG. 33) o se empleó glucosa marcada uniformemente con ¹³C (FIG. 34). Se observaron tendencias similares con la PhAH, pero de magnitud más modesta. Apoyando que el tratamiento con SF2312 causó esta interrupción en el paso de la enolasa, hubo una profunda acumulación de glicerato mostrada en la FIG. 6C cuando la enolasa residual en la célula suprimida de ENO1 es inhibida por ARNhc contra ENO2 o 25 jM de PhAH (US 2014/0378529 WO 2013/0909732).

Los niveles de ATP y la muerte celular se midieron en función del tiempo y la concentración de SF2312 y PhAH en los controles suprimidos por ENO1 y rescatados isogénicamente (FIGS. 35 & 36). Tan pronto como 8 horas después de iniciar el tratamiento, tanto el PhAH como el SF2312 disminuyeron de forma dependiente de la dosis los niveles de ATP en las células de glioma suprimidas por ENO1, pero no en las rescatadas por ENO1 (FIG. 35). SF2312 fue ~8 veces más potente que PhAH, con una concentración de SF2312 tan baja como 12,5 jM que redujo los niveles de ATP en >40 % en las células suprimidas porENOI, mientras que se necesitaron concentraciones de PhAH superiores a 100 jM para lograr el mismo nivel de supresión de ATP. Las alteraciones del ATP no fueron causadas por la muerte de las células o por cambios en su número, ya que estos parámetros no cambiaron hasta las 24 horas de tratamiento (FIG. 36). En una serie de experimentos relacionados, se comprobó que el tratamiento con SF2312 (así como con PhAH en menor medida) de las células suprimidas de ENO1 también conducía a una disminución drástica de la relación entre la fosfocreatina y la creatina (FIG. 37B), lo que indica un grave agotamiento de la reserva de fosfato de alta energía que coincide plenamente con el agotamiento del ATP.

Se realizaron mediciones de espectroscopia de masas de los niveles de 3-PGA (2-PGA está por debajo del límite de detección) y PEP, los metabolitos inmediatamente corriente arriba y corriente abajo a la reacción de la enolasa en respuesta a SF2312 tanto en las células de glioma intactas con ENO¹ como en las suprimidas de ENO1 (FIG. 37A).

En consonancia con la inhibición específica de la enolasa, se observó un aumento drástico de la relación 3-PGA/PEP en respuesta al tratamiento con SF2312 (FIG. 37A); mientras que tanto las células suprimidas por ENO1 como las rescatadas por ENO1 experimentaron una elevación de la relación 3-PGA/PEP, esta relación fue mayor en las células suprimidas por ENO1, en comparación con los controles isogénicos rescatados, lo que concuerda con la disminución de la actividad enolásica en un ~90 % en las células de glioma suprimidas frente a las rescatadas (FIGS. 38-40).

El tratamiento de rastreo de glucosa¹³C-1 por RMN se realizó con una concentración de SF2312 (10 jM ) que no es tóxica para las células de glioma intactas con ENO1-durante cuatro días, condujo a una profunda inhibición del consumo de glucosa (picos isoméricos a 97 y 93 ppm) y de la producción de lactato (pico único a 20 ppm) en los medios de las células de glioma D423 y Gli56 ENO1 suprimidas, pero no de las células de glioma intactas con ENO1 (FIG. 33). Al mismo tiempo, un único pico a 64 ppm se hizo visible en las células D423 y Gli56 con supresión de ENO1 tratadas con SF2312. El origen más probable de este pico es el átomo C-3 del glicerato, que tiene un pico de ¹³Cde 64 ppm (Spectral Database of Organic Compounds, SDBS No. 18695) y es el átomo en el que se espera la etiqueta de ¹³Cderivada del átomo C-1 de la glucosa. La metabolómica basada en espectros de masas demostró que el glicerato se acumula tanto a nivel intracelular como en el medio en respuesta a la inhibición de la enolasa por medios farmacológicos (PhAH) así como genéticos (ARNhc contra ENO2) en las células D423 suprimidas de ENO1 (WO 2013/090732 o US 2012/069767). Es probable que el glicerato se forme en respuesta a la inhibición de la enolasa a medida que el 2-PGA o el 3-PGA se acumulan y (los sustratos de la enzima) se hidrolizan espontáneamente, o alternativamente, son desfosforilados por la acción de la glicerato quinasa (GLYCTK, FIG. 41). Estos experimentos se repitieron con células de glioma D423 suprimidas porENOI y con células de control isogénicas rescatadas por ENO1, tanto con PhAH como con SF2312 (FIGS. 32C Y 32D). En primer lugar, se encontró que el tratamiento con SF2312 (y en menor medida con PhAH) aumentaba drásticamente la conversión de ¹³C-glucosa en ¹³C-glicerato (FIG. 32C).

Este efecto es especialmente notable cuando se expresa como una relación de ¹³C-glicerato a ¹³C-lactato, metabolitos corriente arriba y corriente abajo a la reacción de la enolasa, respectivamente (FIG. 32D). Es importante destacar que la producción de glicerato fue completamente abrogada por la restauración de ENO1 (D423 ENO1 en la FIG. 32), mostrando una estricta dependencia de la ENO1 suprimida.

Por último, se utilizaron ensayos de desplazamiento térmico para demostrar la unión directa de SF2312 y PhAH a la enolasa 2, en el entorno de células de glioma intactas (Martínez Molina, et al., 2013). Para facilitar este ensayo, se utilizaron células de glioma que sobreexpresan ENO2 (D423 ENO2); ya que las células que eliminan ENO1 mueren con demasiada facilidad por los tratamientos con inhibidores. De forma similar a los resultados obtenidos en lisados celulares, en ausencia de inhibidores, la ENO2 experimentó una desnaturalización térmica en células de glioma intactas a ~65 °C (FIG. 42). El tratamiento con 100 pM de SF2312 produjo un desplazamiento de la curva de fusión térmica de ~15 °C, mientras que el tratamiento con la misma concentración de PhAH produjo un desplazamiento mucho más modesto, de ~5 °C. Estos resultados son totalmente coherentes con los obtenidos en lisados celulares (FIG. 26) y proporcionan pruebas directas de la unión del inhibidor a la enzima en el entorno de las células intactas.

La actividad inhibitoria directa de Pom-Hex contra ENO1 y ENO2 en comparación con su compuesto madre, Hex, se determinó in vitro utilizando los mismos procedimientos descritos en las FIGS. 7A Y 7B. En presencia de esterasas celulares, el compuesto Pom-Hex se cubrió en el compuesto parental activo, Hex. El Pom-Hex resultó ser un inhibidor de la enolasa mucho más débil que su compuesto original, el Hex. Sin embargo, Pom-Hex seguía conservando cierta actividad inhibidora de la enolasa (~100pM IC⁵⁰). Sin embargo, es difícil descartar contaminaciones de <5 % de Hex sin reaccionar, por lo tanto, sigue sin estar claro si la inhibición residual se debe en realidad a la molécula Pom-Hex intacta o al Hex contaminante. En una hipótesis, la hidrólisis espontánea de Pom-Hex a Hex liberado era responsable de la inhibición. Sin embargo, al aumentar el tiempo de incubación a 1 hora, sólo aumentó marginalmente la inhibición por parte de Pom-Hex, lo que sugiere que la molécula pro-fármaco intacta ejerció alguna actividad inhibidora.

Varias líneas celulares de glioma, incluyendo la D423-MG suprimida por ENOl, fueron probadas para la sensibilidad a Pom-Hex bajo condiciones de crecimiento convencionales. Se siguió la proliferación celular utilizando imágenes en vivo con el Incucyte (FIG. 8) o por fijación terminal y tinción con violeta de cristal (FIG. 9). Había una clara jerarquía de sensibilidad, siendo los astrocitos humanos normales muy resistentes mientras que las células de glioma D423 suprimidas por ENO1 eran sensibles incluso a niveles bajos de nM del inhibidor. Las líneas celulares que fueron suprimidas heterocigamente para ENO1, que ha demostrado previamente tener una sensibilidad intermedia a la PhAH (Muller, et al., 2012), también mostraron una sensibilidad intermedia a Pom-Hex.

Para modelar los tumores con mayor precisión, se cultivaron células de glioma en condiciones de neuroesfera de 3 dimensiones. La relación superficie/volumen de la neuroesfera era considerablemente menor que en las condiciones convencionales de cultivo celular y, por tanto, los compuestos con escasa penetración celular, como los fosfonatos, tienen una eficacia considerablemente menor que en el cultivo celular convencional. Por lo tanto, en estas condiciones, incluso las células suprimidas de ENO1 sólo fueron ligeramente sensibles al fosfonato libre parental, Hex (FIG. 10A).

Sin embargo, en las mismas condiciones, el profármaco permeable a la célula, Pom-Hex, fue altamente tóxico para las células de glioma suprimidas de ENO1 (FIG. 10B). La viabilidad de las células en las esferas se monitorizó utilizando 100 nM de tetrametilrhodamina, que es captada activamente por las células vivas pero no por las muertas.

Se inyectaron ratones lampiños con células de glioma D423-MG que llevan la deleción 1p36 que abarca ENO1. Los tumores se formaron alrededor de 30 días después de la inyección y el crecimiento se siguió de forma no invasiva mediante IRM T2. En ausencia de tratamiento, los tumores crecían de forma continua y acababan matando al animal. El área del tumor (lado derecho del cerebro) se distinguió del cerebro normal del ratón por el alto contraste. Nótese que el crecimiento continuo (de las FIGS 11A y 11B) se observó en ausencia de tratamiento. Inyección intravenosa de 10 mg/kg de Pom-Hex durante 11 días (FIG. 11C) no sólo detuvo el crecimiento del tumor sino que lo erradicó por completo (desaparición del área de alto contraste). El animal permaneció sano y libre de tumores durante al menos 3 meses tras la interrupción del tratamiento (FIG. 11D).

VHL es un evento común en el carcinoma renal de células claras. La supresión de la VHL activa la vía HIF, suprimiendo la respiración y haciendo que las células cancerosas sean altamente dependientes de la glicólisis. Por ello, se han realizado esfuerzos para dirigirse a la glicólisis con el fin de lograr una toxicidad selectiva para el cáncer de riñón con deficiencia de VHL. Por ello, se probó el inhibidor de la enolasa Pom-Hex en líneas celulares de cáncer de riñón detectadas por VHL. En dos líneas celulares independientes de cáncer de riñón con deleción de VHL, RCC4 (abajo) y 786-O (panel superior), el inhibidor de la enolasa, Pom-Hex, fue de 4 a 8 veces más tóxico para la deleción de VHL (arriba), en comparación con los controles isogénicos rescatados, que expresan VHL desde un locus ectópico (paneles inferiores, cursiva). Como en la FIG. 12, el crecimiento en respuesta a dosis crecientes de Pom-Hex se midió mediante imágenes de crecimiento en vivo utilizando el Incucyte.

La estabilidad de Pom-SF2312 en medios de cultivo celular (DMEM con 10 % de suero bovino fetal) se midió mediante ³¹P RMN desacoplada por protones en un Brucker 500 MHZ en el núcleo de RMN del M.D. Anderson (FIG. 14). Pom-SF2312, Hemi-Pom-SF2312 y SF2312 aparecen dobletes que reflejan los isómeros cis-trans. En 12 horas, más de la mitad de Pom-SF2312 se hidrolizó a Hemi-Pom-SF2312. Sin embargo, el Hemi-Pom-SF2312 no se hidrolizó apreciablemente a SF2312 en 24 horas.

Además, POMHEX muestra una estabilidad considerablemente mayor que Pom-SF2312 en medios (FIG. 15A Y15B).

Se disolvieron 1,5 mM de Pom-Hex y 1,5 mM de Pom-SF2312 en un medio de cultivo celular estándar (medio DMEM que contiene 10 % de FBS con la adición de 10 % de D²O para bloquear la señal de RMN). Se tomaron exploraciones de ³¹P RMN desacoplada de protones a intervalos repetidos. El experimento se realizó a temperatura ambiente. Mientras que más de la mitad del Pom-SF2312 se había hidrolizado a las 12 horas, la mitad del Pom-Hex inicial tardó más de 24 horas en hidrolizarse. Las semividas estimadas son de 8 horas para Pom-SF2312 y 36 horas para Pom-Hex. La hidrólisis no prosiguió, y ni el SF2312, ni el Hex, fueron detectables incluso después de 72 horas de incubación.

El Pom-SF2312 y el Diacetil-Pom-SF2312 son selectivamente tóxicos para las células de glioma con supresión de ENO1 (FIGS. 16A Y 16B). El eje x muestra el tiempo (3 días en total) comparado con la confluencia. Las pendientes representan las tasas de crecimiento. La pendiente plana indica un crecimiento inhibido, la pendiente negativa indica que las células mueren. Los IC⁵⁰aproximados para la inhibición del crecimiento de las células de glioma nulo ENO1 son <75 nM para Pom-SF2312 y ~150 nM para Diacetil-Pom-SF2312. Estos IC⁵⁰son algo menos potentes que los de Pom-Hex, con un IC⁵⁰de unos 35nM.

Animales (ratones inmunocomprometidos NUDE) inyectados intracranealmente con la línea celular de glioblastoma suprimida por ENO1, Gli56. Después de 30 días, los tumores se hicieron fácilmente visibles por IRM (T2, las regiones blancas hiperintensas son el tumor sobre el fondo gris del cerebro normal). En ausencia de tratamiento, los tumores Gli56 crecen de forma continua (ratón n° 1, y ratón n° 3, desde el día 30 hasta el día 40). El tratamiento con Pom-SF2312 no redujo significativamente el crecimiento del tumor (Ratón #2), incluso a 4 MPK (mg/kg), que era la dosis máxima tolerada (FIG. 17). Sin embargo, el tratamiento con Pom-Hex no sólo detuvo el crecimiento del tumor, sino que en realidad condujo a una profunda regresión del mismo, y a su eventual desaparición. Los tumores no han reaparecido tras la interrupción del tratamiento.

La estructura de rayos X de la enolasa se ha resuelto con SF2312, Hex y Hepta unidos en el sitio activo (FIG. 18A-18D). Se generaron cristales de ENO2 humana utilizando la proteína recombinante expresada en E. coli. A continuación, se co-cristalizaron con PhAH y SF2312 sumergiéndolos durante 16 horas en un crioprotector que contenía una solución de 2 mM de PhAH o una solución de 4 mM de SF2312, respectivamente. La estructura de los complejos diméricos ENO2:PhAH (4ZAü; Tabla 4) y ENO2:SF2312 (4ZCW; Tabla 5) se analizó mediante cristalografía de rayos X y se resolvió a una resolución de 2,31 A y 1,99 A, con R^librepara las estructuras refinadas de 0,195 y 0,202 respectivamente (Tablas 4 y 5 para las estructuras de PhAH y SF2312, respectivamente). La PhAH se une a la ENO2 humana de forma similar a lo que se había informado anteriormente en la enolasa de levadura y de tripanosoma (de A.S. Navarro, et al., 2007; Wedekind, et al., 1994; Zhang, et al., 1994), con el ligando interactuando con dos iones de magnesio en el bolsillo del sitio activo. La estructura de unión del SF2312 reveló la unión preferente del estereoisómero S,S , adoptando el compuesto un modo de unión similar al del PhAH. Tanto para el PhAH como para el SF2312, el grupo fosfónico coordina el magnesio catalítico, Mg^(B), y forma interacciones de puente salino con R371 (FIG. 27). El carbonilo de PhAH y SF2312 interactúa tanto con Mg^(A)como con Mg^(B)para completar la coordinación octaédrica de estos iones y el enlace de hidrógeno del grupo hidroxilamina se conserva para ambos inhibidores. En la estructura unida al PhAH, el hidrógeno de la hidroxilamina se une a través de una molécula de agua enterrada a E209, E166 y H370. E209, E166 y H370 actúan conjuntamente para eliminar el hidroxilo del sustrato 2-PGA durante el ciclo catalítico y son críticos para la actividad de la enolasa (Qin, et al., 2012). En la estructura unida al SF2312, el grupo 5'-hidroxilo del SF2312 sustituye a la molécula de agua y se une directamente a E166 y H370. El SF2312 se une al E209 a través de un enlace de hidrógeno mediado por agua y al esqueleto de N151 y G396 a través de una segunda molécula de agua. La posición de estas dos moléculas de agua se conserva en el complejo ENO2:PhAH, donde estas moléculas desempeñan un papel indirecto en la unión de PhAH al estabilizar la posición y orientación de E209, E167 y H370 (FIG. 27). Los parámetros de cristalización para el PhAH y el SF2312 unidos a la enolasa 2 se muestran en las tablas 4 y 5, respectivamente.

Sesolvieron estructuras de rayos X de ENO2 humana con PhAH (PDB ID:4ZAü), SF2312 (que forma parte únicamente de la reivindicación 13 anexa) (PDB ID:4ZAü), Metil SF2312 (Pd B ID: 5EU9), Hex (PDB: 5 lD Z). Todos los inhibidores quirales (SF2312, Metil SF2312, Hex) sólo se unieron en el enantiómero S en la posición 3, y en el enantiómero S en la posición 5 (para SF2312 y Metil s F2312). PhAH, SF2312 y Metil SF2312 se unen a la enzima con dos átomos de magnesio con la fracción de fosfonohidroxamato formando un puente di-oxo (FIG. 47). Además, estos inhibidores forman fuertes interacciones con residuos catalíticos conservados, directamente para SF2312 y Metil SF2312, e indirectamente, para PhAH. Hex se une de forma bastante diferente a este último con un solo átomo de Mg y no tiene esencialmente enlaces H con los residuos del sitio activo, lo que explica por qué es un inhibidor competitivo, a diferencia de PhAH y SF2312 que no son competitivos con 2-PG (FIG. 48).

Tabla 4: Recolección de datos de cristalización y estadísticas de refinamiento para la PhAH unida a la Enolasa 2

Tabla 5: Parámetros de cristalización y propiedades de SF2312 unido a la Enolasa 2

Todos los compuestos, composiciones y procedimientos divulgados y reivindicados en el presente documento pueden hacerse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente divulgación.

REFERENCIAS

Las siguientes referencias proporcionan detalles de procedimiento ejemplares u otros detalles complementarios a los expuestos aquí.

US 2014/0378529

WO 2013/0909732

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de la fórmula:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que:

Rⁱes hidrógeno, a c ilo ^ ^ ⁾o a c ilo ^ ^ ⁾sustituido, preferentemente hidrógeno, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

R²es hidrógeno, aciloxi^{(C<12 )}, o aciloxi^{(C<12 )}sustituido, preferentemente R²es aciloxi^(C<8)o aciloxi^(C<8)sustituido, donde para la versión sustituida uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²; X ¹y X²son cada uno independientemente O, S, o NR^a, preferentemente X ¹y X²son cada uno O, donde:

R^aes hidrógeno, a lq u ilo ^ ⁾, o a lq u ilo ^ ⁾sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o-S(O)²NH²;

R³y R⁴son cada uno independientemente:

hidrógeno;

alquilo^{(C<12 )}, arilo^{(C<12 )}, aralquilo^{(C<12 )}, heteroarilo^{(C<12 )}, heteroaralquilo^{(C<12 )}, o una versión sustituida de estos grupos, donde para las versiones sustituidas uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiilo^(C<6)-aciloxi^(C<12)o alcanodiilo^(C<6)-aciloxi^(C<12)sustituido, en el que para las versiones sustituidas, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

R³y R⁴se toman juntos y son a lcanod iilo ^ ⁾o alcanodiilo^{^ )}sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH², o

-X³-R⁵, donde:

X³es un enlace covalente,alcanodiilo^(C<8), o alcanodiilo^{^ )}sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²; y

A ¹es alcanodiilo^(C<8), alcanodiilo^{^ )}sustituido, alquilaminodiilo^{^ )}, o alquilaminodiilo^{^ )}sustituido, donde para las versiones sustituidas uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²; y

Y ¹es hidrógeno, amino, halo, hidroxi, fosfato, alquilo^(o<12), o alquilo ^{^ < 12 )}sustituido, donde para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH².

2. El compuesto de la reivindicación 1 se define además como:

en el que:

R²es hidrógeno, aciloxi^(C<12), o aciloxi^(C<12)sustituido, preferentemente R²es aciloxi^(C<8)o aciloxi^(C<8)sustituido; R3 y R4 son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo(C<12), alquilo (C<12) sustituido, o un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiilo(C<6)-aciloxi(C<12) o alcanodiilo(C<6)-aciloxi(C<12) sustituido; y

A1 es alcanodiilo(C<8), alcanodiilo(C<8) sustituido, alquilaminodiilo(C<8) o alquilaminodiilo(C<8) sustituido; o

en el que:

R¹es acilo(c<¹²) o acilo(c<¹²) sustituido);

R²es aciloxi(c<¹²), o aciloxi(c<¹²) sustituido;

R³es alquilo(c<¹²), alquilo (c<¹²) sustituido, o un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiil(c<⁶)-aciloxi(c<¹²) o alcanodiilo(c<⁶)-aciloxi(c<¹²) sustituido;

R⁴es hidrógeno, alquilo(c<¹²), alquilo (c<¹²) sustituido, o un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiil(c<6)-aciloxi(c<¹²) o alcanodiilo(c<⁶)-aciloxi(c<¹²) sustituido; y

A ¹esalcanodiilo(c<8),alcanodiilo(c<8) sustituido, alquilaminodiilo(c<8) o alquilaminodiilo(c<8) sustituido;

o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de las fórmulas.

3. El compuesto de la reivindicación 2 se define además como:

en el que:

R²es hidrógeno;

R³y R⁴son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo(C<12), alquilo (C<12) sustituido, o un grupo protector de fosfato de la fórmula: -alcanodiil(C<⁶)-aciloxi(C<12) o alcanodiilo(C<⁶)-aciloxi(C<12) sustituido; y

A ¹esalcanodiilo(c<⁸),alcanodiilo(c<⁸) sustituido, alquilaminodiilo(c<⁸) o alquilaminodiilo(c<⁸) sustituido;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

4. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R²es hidrógeno.

5. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que R³es hidrógeno.

⁶. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que R³es pivaloiloximetilo.

7. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que R4 es hidrógeno.

8. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que R4 es pivaloiloximetilo.

9. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que A¹esalcanodiilo(c<⁴) o alcanodiilo(C<4) sustituido.

10. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que A ¹es -CH²-, -CH²CH²-, o -CH²CH²CH²-.

11. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que Y1 es hidrógeno.

12. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el compuesto se define además como

preferentemente,

o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de estas fórmulas.

13. Compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso como medicamento para tratar o prevenir el cáncer:

en el que:

Rⁱes hidrógeno, acilo^{(C<12 )}o acilo^{(C<12 )}sustituido, en el que para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

R²es hidrógeno, hidroxi, alcoxi^{(C<12 )}, alcoxi^{(C<12 )}sustituido, aciloxi^{(C<12 )}, o aciloxi^{(C<12 )}sustituido, donde para las versiones sustituidas uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

X ¹y X ²son cada uno independientemente O, S, o NR^a, donde:

R³y R⁴son cada uno independientemente:

hidrógeno;

alquilo^(C<12), arilo^(C<12), aralquilo^(C<12), heteroarilo^(C<12), heteroaralquilo^(C<12), o una versión sustituida de estos grupos, donde para la versión sustituida uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²;

-X³-R⁵; donde:

A ⁱes alcanodiilo^(C<8), alcanodiilo^(C<8)sustituido, alquilaminodiilo^(C<8), o alquilaminodiilo^(C<8)sustituido, donde para las versiones sustituidas uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por-OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH²; y

Y ¹es hidrógeno, amino, halo, hidroxi, fosfato, alquilo^{(C<12 )}, o alquilo ^{(C<12 )}sustituido, donde para la versión sustituida, uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH², -SH, -OCH³, -OCH²CH³, -NHCH³, -NHCH²CH³, -N(CH³)², -OC(O)CH³, o -S(O)²NH².

14. El compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso como medicamento para tratar o prevenir el cáncer de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el compuesto es de la fórmula