ES2909874T3 - Retinoides sintéticos fluorescentes - Google Patents

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Abstract

Un compuesto de fórmula I: **(Ver fórmula)** en el que R1 es hidrógeno, alquilo C1-10 o acilo; R2, R3, R4 y R5, que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno hidrógeno o alquilo C1-4, o juntos un par de R2 y R4 o R3 y R5 representan un enlace; R6 y R7, que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno hidrógeno, alquilo C1-4 o R6 y R7 juntos forman un grupo: =CR11R12; R8 y R9, que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno hidrógeno, alquilo C1-10, arilo, aralquilo, halógeno, trifluoroalquilo, ciano, nitro, -NRaRb, -ORa, -C(O)Ra, -C(O)ORa,-OC(O)Ra, -S(O)RaRb, y - C(O)NRaRb; R11 y R12, que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno hidrógeno o alquilo C1-10; y Ra y Rb, que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno hidrógeno o alquilo C1-10; R10 es un grupo II, III, IV, VII, VIII o IX: **(Ver fórmula)** en el que R13 es hidrógeno o alquilo C1-10; en donde un par de R2 y R4 o R3 y R5 representan un enlace; e isómeros del mismo; en forma libre o de sal.

Description

DESCRIPCIÓN
Retinoides sintéticos fluorescentes
Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevos compuestos.
Más particularmente, la presente invención se refiere a nuevos compuestos retinoides sintéticos fluorescentes y su uso en métodos de seguimiento de la diferenciación celular o apoptosis.
Antecedentes de la invención
La vitamina A (retinol) y sus derivados pertenecen a una clase de compuestos conocidos como retinoides. Los retinoides son una clase importante de moléculas de señalización que están involucradas en el control de muchas vías biológicas importantes desde la embriogénesis hasta la homeostasis adulta y muchos aspectos del desarrollo de células madre, como la proliferación, diferenciación y apoptosis de células madre.
Los retinoides están estructural y/o funcionalmente relacionados con la vitamina A; y muchos poseen actividad biológica que incluye el ácido retinoico todo-trans (ATRA). ATRA es el retinoide endógeno más abundante y se ha estudiado ampliamente durante muchos años; ATRA se isomeriza en condiciones fisiológicas y experimentales, con diferentes isómeros que activan diferentes receptores, lo que explica la variedad de efectos biológicos observados con estas pequeñas moléculas.
Debido a la capacidad de los retinoides para controlar la diferenciación y la apoptosis tanto en células normales como tumorales, tienen el potencial de actuar como agentes quimiopreventivos y quimioterapéuticos, aunque la toxicidad ha impedido su uso generalizado.
Beard y otros, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1997, Vol. 7(18), 2373-2378 describe la síntesis de 1,2,3,4-tetrahidroquinolina y 3,4-(1H)-dihidroquinolin-2-ona análogos del ácido retinoico y analiza su actividad biológica. El documento US6387951 B1 describe los compuestos, algunos de los cuales son derivados del ácido fenilacético o heteroarilacético, y que inhiben la enzima citocromo P450RAI.
El documento US2007/078160 A1 describe los derivados de dihidro-[1H]-quinolin-2-ona como agonistas de RXR para el tratamiento de trastornos mediados por RXR.
Thacher y otros, Current Pharma. Design, 2000, 6(1), 25-58, describe las relaciones estructura-actividad de los retinoides sintéticos, junto con las actividades terapéuticas potenciales y los efectos secundarios.
Sin embargo, ATRA exhibe poca estabilidad, en particular tras la exposición a la luz. Los compuestos ATRA se isomerizan y degradan con la exposición a la luz. Para superar esto, se hacen esfuerzos para almacenar y trabajar con ATRA en la oscuridad, pero tales precauciones aumentan el costo asociado con el trabajo con ATRA, y no mitigan el problema por completo. Además, como ATRA es susceptible de fotoisomerización y degradación durante el almacenamiento, es difícil predecir con precisión la cantidad de compuesto activo administrado en una sola dosis. Se han realizado esfuerzos para superar los problemas asociados con ATRA mediante la síntesis de compuestos retinoides estables. En general, se cree que ATRA es susceptible de fotoisomerización debido a su grupo enlazador conjugado. La solicitud de Patente Internacional No. PCT/GB2007/003237 (el documento WO 2008/025965) describió los nuevos compuestos retinoides que exhibían buena estabilidad e inducían la diferenciación celular. Un compuesto de particular interés fue EC23®, que es/fue comercializado por Reinnervate:
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EC23® presenta generalmente una buena estabilidad expuesto a la luz, así como también una buena estabilidad durante el almacenamiento. EC23® también se encuentra que no es susceptible a la degradación metabólica y, por lo tanto, puede tener una vida media asociada relativamente larga en el cuerpo humano o animal. Sin embargo, EC23® es solo débilmente fluorescente y requiere de la excitación UV, lo que puede dañar las muestras biológicas.
Las imágenes de fluorescencia se han convertido rápidamente en una poderosa herramienta para investigar los procesos biológicos, particularmente en células vivas donde los eventos celulares pueden observarse en sus contextos fisiológicos. El desarrollo de técnicas de visualización de una sola molécula ha mejorado en gran medida la utilidad de la microscopía de fluorescencia para tales aplicaciones, lo que permite el seguimiento de proteínas y moléculas pequeñas en sus entornos endógenos.
La fluorescencia es una forma de luminiscencia en la que una sustancia que ha absorbido luz u otra radiación electromagnética emite luz a partir de estados excitados electrónicamente. En la fluorescencia, la luz emitida suele ser de una longitud de onda más larga (y de menor energía) que la luz absorbida. Este fenómeno se conoce como desplazamiento de Stokes y se atribuye a la pérdida de energía, generalmente mediante la relajación vibratoria al nivel de energía más bajo del primer estado excitado (S1), antes de que se emita un fotón absorbido. El rendimiento cuántico da la eficiencia del proceso de fluorescencia: se define como la relación entre el número de fotones emitidos y el número de fotones absorbidos (valor máximo = 1, es decir, cada fotón absorbido da como resultado un fotón emitido). La pérdida de la fluorescencia es generalmente exponencial y el tiempo de vida de la fluorescencia se refiere a la medida de la vida media de una molécula que permanece en un estado excitado antes de experimentar la relajación de regreso al estado fundamental. En la fosforescencia, se observa un tiempo de vida más prolongado en el estado excitado, seguido de una pérdida radiativa (es decir, emisión de fotones) a partir de un estado triplete excitado.
La doxorrubicina es un fármaco quimioterapéutico usado en el tratamiento de un rango amplio de cánceres, que incluye la leucemia, el linfoma de Hodgkin, el cáncer de vejiga, de mama, de estómago, de pulmón, de ovario y de tiroides. La naturaleza anfifílica y anfótera de la molécula significa que el fármaco puede unirse tanto a las membranas celulares como a las proteínas.
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Debido a la fluorescencia inherente del compuesto, la doxorrubicina también se ha convertido en una herramienta de investigación popular en el campo de la formación de imágenes por fluorescencia y, en consecuencia, su distribución se ha visualizado en varias células y tejidos. Dado que se descubrió que la intensidad de la fluorescencia de la doxorrubicina depende de su concentración y microambiente, la captación intracelular y el tráfico del fármaco en las células de carcinoma de ovario A2780 se pudieron caracterizar que tiene en cuenta su interacción con componentes celulares como el ADN, las histonas, y los fosfolípidos.
En la actualidad, la doxorrubicina es la única molécula pequeña conocida que posee una emisión de fluorescencia intrínseca junto con una actividad biológica significativa. Por lo tanto, si la fluorescencia pudiera incorporarse a una pequeña molécula moduladora del desarrollo de las células madre, esto en sí mismo constituiría una sonda poderosa y anularía la necesidad del uso de colorantes fluorescentes, proteínas y puntos cuánticos. En particular, el uso de técnicas de seguimiento de células vivas proporcionaría información invaluable sobre la captación y localización celular, que ofrece de esta manera nuevos conocimientos sobre la actividad y el metabolismo de los retinoides. Además, dado que ya no sería necesario unir una gran entidad fluorescente a la molécula de interés, esta última puede seguirse en el contexto fisiológico de su entorno natural. Adicionalmente, también puede ser ventajoso generar una sonda fluorescente inerte que pueda tener propiedades fluorescentes útiles.
Por lo tanto, para mejorar la formación de imágenes de fluorescencia, existe la necesidad de un fluoróforo novedoso que muestre una buena estabilidad de almacenamiento y que no sea susceptible a la degradación metabólica, por lo que tiene una vida media asociada relativamente larga en el cuerpo. Así, un objeto de la presente invención es para proporcionar un retinoide fluorescente estable.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona versiones fluorescentes de tipos de moléculas de EC23® mediante la preparación de nuevos sistemas moleculares con un nitrógeno donante de electrones para proporcionar una estructura altamente conjugada.
La invención es según se define en las reivindicaciones adjuntas.
Así, de acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un compuesto de fórmula I:
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en el que
R1 es hidrógeno, alquilo C1-10 o acilo;
R2, R3, R4 y R5, que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno hidrógeno o alquilo C1-4, o juntos un par de R2 y R4 o R3 y R5 representan un enlace;
R6 y R7, que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno hidrógeno, alquilo C1-4 o R6 y R7 juntos forman un grupo:
=CR11R12;
R8 y R9 , que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno hidrógeno, alquilo C1-10, arilo, aralquilo, halógeno, trifluoroalquilo, ciano, nitro, -NRaRb, -ORa, -C(O)Ra, -C(O)ORa,-OC(O)Ra, -S(O)RaRb, y -C(O)NRaRb;
R11 y R12, que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno hidrógeno o alquilo C1-10; y
Ra y Rb, que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno hidrógeno o alquilo C1-10;
R10 es un grupo II, III, IV, Vi
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en el que R13 es hidrógeno o alquilo C1-10; en donde un par de R2yR 4oR3y R5 representan un enlace; e isómeros de los mismos;
en forma libre o de sal.
Como se usa en la presente, el término "alquilo" se refiere a un resto de hidrocarburo completamente saturado, ramificado, no ramificado o cíclico, es decir, alquilo primario, secundario o terciario o, cuando corresponda, cicloalquilo o alquilo sustituido por cicloalquilo, también pueden ser grupos alquilo saturados o insaturados. Cuando no se indique de cualquier otra manera, preferentemente el alquilo comprende de 1 a 10 átomos de carbono, con mayor preferencia de 1 a 7 átomos de carbono, o 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos representativos de alquilo incluyen, entre otros, metilo, etilo, n-propilo, /so-propilo, n-butilo, sec-butilo, /so-butilo, tere-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, 3-metilhexilo, 2,2-dimetilpentilo, 2,3-dimetilpentilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo y similares.
Como se usa en la presente, el término "arilo" se refiere a un sistema de anillo de hidrocarburo monocíclico o multicíclico aromático que consta solo de hidrógeno y carbono y que contiene de 6 a 19 átomos de carbono, preferentemente de 6 a 10 átomos de carbono, donde el sistema de anillo puede estar parcialmente saturado. Los grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como fluorenilo, fenilo, indenilo y naftilo. A menos que se indique específicamente de cualquier otra manera en la especificación, el término "arilo" o el prefijo "ar-" (tal como en "aralquilo") incluye los radicales arilo opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo, alquenilo, alquinilo, halo, haloalquilo, ciano, nitro, amino, amidina, arilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo. Los grupos arilo preferidos son grupos fenilo o naftilo opcionalmente sustituidos.
Un grupo arilo puede ser mono-, bi-, tri- o policíclico, preferentemente mono, bi o tricíclico, con mayor preferencia mono o bicíclico.
En una modalidad de la invención R10 es un grupo II, III o IV como se define en la presente descripción.
En una modalidad de la invención R1 es alquilo C1-10, preferentemente alquilo C1-3.
En una modalidad de la invención R2, R3, R4 y R5 son cada uno hidrógeno.
En el compuesto de fórmula I, un par de R2 y R4 o R3 y R5 representan un enlace.
En una modalidad de la invención R6 y R7 son iguales o diferentes; R6 y R7 cada uno puede representar alquilo C1-4, por ejemplo, metilo.
Como se usa en la presente, el término "halógeno" o "halo" se refiere a flúor, cloro, bromo y yodo.
En otra modalidad de la invención R10 es un grupo II, como se define en la presente descripción.
En otra modalidad de la invención R10 es un grupo III, como se define en la presente descripción.
En otra modalidad de la invención R10 es un grupo IV, como se define en la presente descripción.
En otra modalidad de la invención R10 es un grupo VII, como se define en la presente descripción.
En otra modalidad de la invención R10 es un grupo VIII, como se define en la presente descripción.
En otra modalidad de la invención R10 es un grupo IX, como se define en la presente descripción.
El resto -CO2R13 está preferentemente en la posición 4, es decir, en la posición para con respecto al grupo etinilo. Preferentemente R13 es hidrógeno.
Un compuesto específico de fórmula I que se puede mencionar es:
ácido 4-2-[2,4,4-trimetil-1-(propan-2-il)-1,4-dihidroquinolin-6-il]etinilbenzoico, (17);
e isómeros de los mismos;
en forma libre o de sal.
Los compuestos retinoides como ATRA son inestables durante el almacenamiento. En particular, dichos compuestos son susceptibles de fotoisomerización y degradación tras la exposición a la luz en la región de 300 a 400 nm. Sorprendentemente, los compuestos de fórmula I de la presente invención son estables tras la exposición a la luz y experimentan mucha menos fotoisomerización y degradación que ATRA. Generalmente, los compuestos de fórmula I tienen una estabilidad mucho mejor que los retinoides tales como ATRA, en particular, los compuestos de fórmula I son mucho menos susceptibles a la fotoisomerización. Generalmente, después de 3 días de exposición a la luz que tiene una longitud de onda de 300 a 400 nm, los compuestos de la presente invención experimentan mucha menos isomerización y degradación que ATRA. Típicamente queda al menos un 60 % en peso de los compuestos de la presente invención (en comparación con menos del 40 % en peso de ATRA) después de 3 días de exposición a luz de una longitud de onda de 300 a 400 nm.
Típicamente, los compuestos de la presente invención inducen la diferenciación de células madre, tales como células madre neurales humanas, en subtipos neurales. Generalmente, los compuestos de la presente invención inducen la diferenciación de las células en un grado proporcional o mayor que los retinoides conocidos tales como ATRA.
Después de la exposición de una muestra que comprende células madre, por ejemplo una célula derivada del mesencéfalo ventral de tejido cerebral fetal humano, a medios complementados con los compuestos de la presente invención, el número de células diferenciadas que expresan marcadores neuronales puede aumentar sustancialmente. Típicamente, la muestra se puede exponer a dichos medios durante unos 7 días.
En la presente descripción se describe el uso de un compuesto o composición como se define en la presente descripción en la diferenciación de una célula madre en al menos un tipo de célula diferenciada.
La célula madre puede ser típicamente una célula madre totipotente humana o animal, en particular una célula madre totipotente no humana, por ejemplo, una célula totipotente de un mamífero, por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo.
Alternativamente, la célula madre puede ser una célula madre pluripotente humana o animal, preferentemente una célula madre pluripotente humana.
Dicha célula madre puede ser una célula madre multipotente humana o animal.
Dicha célula madre multipotente puede seleccionarse del grupo que consiste en: célula madre hematopoyética, célula madre neural, célula madre ósea, célula madre muscular, célula madre mesenquimal, célula madre epitelial (derivada de órganos como la piel, mucosa gastrointestinal, riñón, vejiga, glándulas mamarias, útero, próstata y glándulas endocrinas como la hipófisis), células madre ectodérmicas, células madre mesodérmicas o células madre endodérmicas (por ejemplo, derivadas de órganos como el hígado, el páncreas, los pulmones y los vasos sanguíneos).
También se describe en la presente descripción un método para inducir la diferenciación de una célula madre que comprende las etapas de:
(i) formar una preparación de células madre en un medio de cultivo celular adecuado para mantener dichas células madre en donde dicho medio de cultivo comprende un compuesto de acuerdo con la fórmula I; y (ii) cultivar dichas células madre en condiciones que permitan su diferenciación en al menos un tipo celular diferenciado.
Dicha célula madre puede ser una célula madre multipotente o pluripotente. Opcionalmente, la célula madre puede no ser una célula madre totipotente. Preferentemente dicha célula madre es de origen humano.
Dicha célula diferenciada puede seleccionarse del grupo que consiste en un queratinocito, un fibroblasto (por ejemplo, dérmica, corneal, mucosa intestinal, mucosa oral, vejiga, uretra, próstata, hígado), una célula epitelial (por ejemplo, dérmica, corneal, mucosa intestinal, mucosa oral, vejiga, uretra, próstata, hígado), una célula glial neuronal o célula neural, un hepatocito, una célula mesenquimática, una célula muscular (miocardiocito o célula de miotubo), una célula renal, una célula sanguínea (por ejemplo, linfocito CD4+, linfocito CD8+), una célula pancreática o una célula endotelial.
Generalmente el medio tiene una concentración de 0,1 a 20 pM del compuesto de la presente invención; típicamente alrededor de 10 pM.
El método puede tener lugar en presencia de luz visible y/o UV, temperaturas que no excedan los 50 °C y/o reactivos oxidantes, por ejemplo, aire o DMSO. El método puede tener lugar ex vivo, in vivo o in vitro.
Los compuestos de la invención exhiben buena estabilidad y pueden usarse para controlar la diferenciación celular y la apoptosis celular.
Los compuestos de fórmula I exhiben buena estabilidad y experimentan fotoisomerización mucho menos fácilmente que ATRA, mientras que controlan la diferenciación celular y la apoptosis en un grado proporcional o mayor que ATRA.
Como en la presente descripción se describen, los compuestos de la presente invención son inherentemente fluorescentes.
En la presente descripción se describe una sonda que comprende un compuesto de fórmula I como se describe en la presente descripción.
La invención proporciona además un método para monitorear la diferenciación celular o la apoptosis que comprende administrar una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I y detectar la fluorescencia emitida por el compuesto de fórmula I mediante imágenes médicas de fluorescencia.
La invención también proporciona un método para monitorear la diferenciación celular o la apoptosis al generar imágenes de la distribución de un compuesto de fórmula I al detectar la fluorescencia emitida por el compuesto mediante el uso de técnicas que incluyen, pero no se limitan a, microscopía de mapeo de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM).
También se describe en la presente descripción un método para monitorear la diferenciación celular o la apoptosis mediante la formación de imágenes de la distribución de un compuesto de fórmula I mediante la detección de la señal de dispersión Raman estimulada por técnicas que incluyen, pero no se limitan a, dispersión anti-Stokes Raman coherente (CARS) y dispersión Raman estimulada (SRS).
En la presente descripción se describe un método para monitorear la concentración y distribución intracelular o extracelular de un compuesto de fórmula I mediante técnicas que incluyen, pero no se limitan a, resolución de curva multivariada (MCR) y análisis de mínimos cuadrados de señales de dispersión Raman para permitir la creación de un mapa de concentración de un compuesto de fórmula I ex vivo, in vivo o in vitro.
En la presente descripción se describen un método para superponer la fluorescencia emitida por un compuesto de fórmula I con una señal de dispersión Raman estimulada de un compuesto de fórmula I. Este método para superponer la fluorescencia emitida puede ser útil en el método de monitorear la diferenciación celular o la apoptosis descrito en la presente descripción.
De acuerdo con la invención, se proporciona un método para superponer la fluorescencia emitida por un compuesto de fórmula I con un mapa de concentración calculado a partir de las señales de dispersión Raman estimuladas de un compuesto de fórmula I para permitir la creación de un mapa de concentración de fórmula I ex vivo, in vivo o in vitro. Los compuestos de fórmula I también pueden ser ventajosos porque los compuestos pueden usarse selectivamente para diferentes tipos de células, es decir, que pueden usarse imágenes visibles, de fluorescencia y/o Raman para identificar tipos de células que son más sensibles a las moléculas sintéticas de la invención. Esto puede proporcionar un método de identificación de células. La observación del tiempo de vida fluorescente del compuesto de la invención puede proporcionar información sobre el entorno local y, potencialmente, sobre la acción en curso del compuesto. Además, las células tratadas con los compuestos fluorescentes de la invención pueden luego tratarse con otras moléculas, por ejemplo, para "desplazar" los compuestos fluorescentes para dar una medida de afinidad relativa, que puede ser útil para, entre otros, la detección de drogas. Por lo tanto, los compuestos fluorescentes de la invención pueden usarse en combinación con otros compuestos adecuadamente conocidos. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición que comprende uno o más de los compuestos de la presente invención en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
La composición de la presente invención también incluye uno o más portadores, excipientes, adyuvantes o diluyentes farmacéuticamente aceptables. La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente descripción para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones, y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del juicio médico razonable, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos o, en su caso, un animal sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, acorde con una relación razonable de beneficio/riesgo.
Cuando la composición de la invención se prepara para la administración oral, los compuestos descritos anteriormente generalmente se combinan con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para formar una formulación farmacéutica o una forma de dosificación unitaria.
Para la administración oral, la composición puede estar en forma de polvo, formación granular, solución, suspensión, emulsión o en un polímero o resina natural o sintética para la ingestión de los ingredientes activos de una goma de mascar. La composición también puede presentarse en forma de bolo, electuario o pasta. Las composiciones de la invención administradas por vía oral también se pueden formular para la liberación sostenida, por ejemplo, los compuestos descritos anteriormente pueden recubrirse, microencapsular o colocarse de cualquier otra manera dentro de un dispositivo de administración sostenida. Los ingredientes activos totales en tales formulaciones comprenden de 0,1 a 99,9 % en peso de la formulación.
Por lo tanto, una o más formas de dosificación unitaria adecuadas que comprenden los compuestos de la invención pueden administrarse por una variedad de vías que incluyen oral, parenteral (que incluye subcutánea, intravenosa, intramuscular e intraperitoneal), rectal, dérmica, transdérmica, intratorácica, intrapulmonar, mucosal, vías intraocular e intranasal (respiratoria). La composición también se puede formular en una formulación lipídica o para la liberación sostenida, por ejemplo, mediante el uso de la microencapsulación. Las formulaciones pueden, cuando sea apropiado, presentarse convenientemente en formas de dosificación unitaria discreta y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en las técnicas farmacéuticas. Dichos métodos pueden incluir la etapa de mezclar el agente terapéutico con portadores líquidos, matrices sólidas, portadores semisólidos, portadores sólidos finamente divididos o combinaciones de los mismos, y luego, si es necesario, introducir o dar forma al producto en el sistema de suministro deseado.
Las formulaciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención pueden prepararse mediante procedimientos conocidos en la técnica mediante el uso de ingredientes bien conocidos y fácilmente disponibles. Por ejemplo, el compuesto puede formularse con excipientes, diluyentes o portadores comunes y formar tabletas, cápsulas, soluciones, suspensiones, polvos, aerosoles y similares. Los ejemplos de excipientes, diluyentes, y portadores que son adecuados para tales formulaciones incluyen amortiguadores, así como también materiales de relleno y extensores tales como almidón, celulosa, azúcares, manitol y derivados silícicos.
También se pueden incluir agentes aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y otros derivados de la celulosa, alginatos, gelatina y polivinilpirrolidona. Pueden incluirse agentes humectantes como glicerol, agentes disgregantes como carbonato de calcio y bicarbonato de sodio. Pueden incluirse además agentes para retardar la disolución, tales como parafina. Además pueden incluirse los aceleradores de la reabsorción tales como los compuestos de amonio cuaternario. Pueden incluirse los agentes activos de superficie tales como alcohol cetílico y monoestearato de glicerol. Pueden añadirse portadores adsorbentes tales como caolín y bentonita. Pueden incluirse además lubricantes tales como talco, calcio y estearato de magnesio, y polietilenglicoles sólidos. Se pueden añadir además conservantes. Las composiciones de la invención pueden contener además agentes espesantes tales como celulosa y/o derivados de la celulosa. Además pueden contener gomas tales como goma de xantano, goma guar o carbo o goma arábica, o alternativamente polietilenglicoles, bentonas y montmorillonitas, y similares.
Por ejemplo, las tabletas o cápsulas que contienen los compuestos de la invención pueden incluir agentes tamponadores tales como carbonato de calcio, óxido de magnesio y carbonato de magnesio. Los agentes amortiguadores adecuados pueden incluir además ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal. Las cápsulas y tabletas también pueden incluir ingredientes inactivos como celulosa, almidón pregelatinizado, dióxido de silicio, hidroxipropilmetilcelulosa, estearato de magnesio, celulosa microcristalina, almidón, talco, dióxido de titanio, ácido benzoico, ácido cítrico, almidón de maíz, aceite mineral, polipropilenglicol, fosfato de sodio, estearato de zinc y similares. Las cápsulas de gelatina dura o blanda que contienen al menos un compuesto de la invención pueden contener ingredientes inactivos como gelatina, celulosa microcristalina, laurilsulfato de sodio, almidón, talco y dióxido de titanio, y similares, así como también vehículos líquidos como polietilenglicoles (PEG) y aceite vegetal. Además, las cápsulas o tabletas con recubrimiento entérico que contienen uno o más compuestos de la invención están diseñadas para resistir la desintegración en el estómago y disolverse en el entorno más neutro a alcalino del duodeno.
Preferentemente, la composición tiene forma de un solvente o diluyente que comprende uno o más de los compuestos como se describió anteriormente. Los solventes o diluyentes pueden incluir soluciones ácidas, dimetilsulfona, N-(2-mercaptopropionil) glicina, 2-n-nonil-], 3-dioxolano y alcohol etílico. Preferentemente el solvente/diluyente es un solvente ácido, por ejemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido bórico, ácido láctico, ácido propiónico, ácido fosfórico, ácido benzoico, ácido butírico, ácido málico, ácido malónico, ácido oxálico, ácido succínico o ácido tartárico.
En la presente descripción se describe un proceso para la fabricación de un compuesto de fórmula I como se describe en la presente descripción que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula XII:
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en el que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 y R9 son cada uno como se define en la presente descripción; y Z es un grupo lábil, por ejemplo, halógeno, pseudohalógeno, ácido borónico o ésterde boronato;
con un compuesto de fórmula XIII;
R10H XIII
en el que R10 es como se define en la presente descripción.
Alternativamente, un proceso para la fabricación de un compuesto de fórmula I como se describe en la presente descripción puede comprender hacer reaccionar un compuesto de fórmula XV:
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en el que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 y R9 son cada uno como se define en la presente descripción;
con un compuesto de fórmula XIV:
R10Z XIV
en el que Z es un grupo lábil, por ejemplo, halógeno, pseudohalógeno, ácido borónico o éster de boronato.
Compuestos de fórmula I en los que R10 es hidrógeno (no de acuerdo con la invención) puede prepararse por desalquilación de un compuesto de fórmula I en la que R10 es alquilo como se describe en la presente descripción. Los compuestos de fórmula I se pueden preparar mediante el uso de métodos conocidos por los expertos en la técnica o mediante métodos descritos en la presente descripción. Los ejemplos de tales preparaciones se muestran esquemáticamente:
Figure imgf000009_0003
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Los ésteres de naftaleno (compuesto de referencia 11) y los compuestos de éster de ácido acrílico (compuesto de referencia 13) pueden prepararse mediante el acoplamiento del boronato de arilo apropiado con el resto de naftaleno apropiado, por ejemplo, éster metílico del ácido 6-bromo-naftaleno-2-carboxílico; y el éster de ácido cinámico apropiado, por ejemplo, 3-bromo-metilcinamato respectivamente.
Figure imgf000010_0002
Los boronatos de arilo pueden prepararse mediante la borilación de yoduro catalizada por Pd 14 con B2pin2 o B2neop2 en presencia de 5 mol % Pd(dppf)Cl2 catalizador y 2 equivalentes de base KOAc en DMSO dieron los arilboronatos 12 y 10 con buenos rendimientos, para dar un método efectivo para la funcionalización selectiva de la posición para con relación al grupo amino donador de electrones.
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Compuestos derivados de la dihidroquinolina como 17 puede prepararse mediante una metilación inicial de Grignard de amida 3, seguido del acoplamiento y saponificación de Sonogashira.
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La presente invención se describirá ahora a manera de ejemplo únicamente con referencia a las figuras adjuntas en las que:
Figura 1 ilustra los espectros de excitación normalizados de EC23® en un rango de solventes;
Figura 2 ilustra los espectros de emisión normalizados de EC23® en un rango de solventes, con excitación a 300 nm; Figura 3 ilustra los espectros de excitación normalizados del compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3 en un rango de solventes;
Figura 4 ilustra los espectros de emisión normalizados del compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3 en un rango de solventes, con excitación en el rango de 275-300 nm;
Figura 5 ilustra el espectro de excitación normalizado del compuesto 17 del Ejemplo 6 en cloroformo;
Figura 6 ilustra el espectro de emisión normalizado del compuesto 17 del Ejemplo 6 en cloroformo, con excitación a 378 nm;
Figura 7 ilustra un Espectro de RMN H1 del compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3 después del almacenamiento a temperatura ambiente en ausencia de luz;
Figura 8 ilustra un Espectro de RMN H1 del compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3 después del tratamiento con luz típica de laboratorio durante 72 horas a temperatura ambiente;
Tabla 1 ilustra el compuesto de referencia 9 de la actividad del Ejemplo 3 en células madre en comparación con ATRA, EC23®y DMSO teñidos con nestina;
Tabla 2 ilustra el compuesto de referencia 9 de la actividad del Ejemplo 3 en células madre en comparación con ATRA, EC23® y DMSO teñidos con CK8;
Tabla 3 ilustra el compuesto de referencia 9 de la actividad del Ejemplo 3 en células madre en comparación con ATRA, EC23® y DMSO teñidos con TUJ-1;
Tabla 4 ilustra el compuesto de referencia 9 de la actividad del Ejemplo 3 en células madre en comparación con ATRA, EC23® y DMSO teñidos con Oct 4;
Tabla 5 ilustra el compuesto de referencia 9 de la actividad del Ejemplo 3 en células madre en comparación con ATRA, EC23® y DMSO teñidos con Sox 2;
Figura 9 ilustra la evaluación de citometría de flujo del compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3 comparado con ATRA, EC23® y DMSO, se mide la expresión del marcador de células madre SSEA-3;
Figura 10 ilustra la evaluación de citometría de flujo del compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3 comparado con ATRA, EC23® y DMSO, se mide la expresión del marcador de células madre TRA160;
Figura 11 ilustra la evaluación de citometría de flujo del compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3 comparado con ATRA, EC23® y DMSO, se mide la expresión del marcador de células madre A2B5;
Tabla 6 ilustra las imágenes de contraste de fase de poblaciones de células tratadas con el compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3, ATRA, EC23®y DMSO;
Figura 12 ilustra el análisis de la viabilidad de las células MTT del compuesto de referencia 9 del ejemplo 3 en comparación con ATRA, EC23® y DMSO a una concentración de tratamiento de 1 pM;
Figura 13 ilustra el análisis de la viabilidad de las células MTT del compuesto de referencia 9 del ejemplo 3 en comparación con ATRA, EC23® y DMSO a una concentración de tratamiento de 10 pM;
Figura 14 ilustra las células madre TERA-2 tratadas con el compuesto de referencia 9 en un rango de concentraciones, fotografiado mediante el uso de microscopía confocal después de 7 días;
Figura 15 ilustra las células SHSY5Y (neuroblastoma) tratadas con el compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3 (10 pM), y se tomaron imágenes mediante el uso de un microscopio confocal después de 8 horas;
Figura 16 Células de fibroblastos tratadas con el compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3 (10 pM), y se tomaron imágenes mediante el uso de un microscopio confocal después de 24 horas;
Figura 17 ilustra las células madre TERA-2 tratadas con el compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3(10 pM) durante 7 días, fijado con paraformaldehído al 4 % y fotografiado mediante el uso de un microscopio confocal;
Figura 18 ilustra las células cutáneas de queratinocitos HaCat tratadas con el compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3 (10 pM) durante 5 días;
Figura 19 ilustra las células cutáneas de queratinocitos HaCat tratadas con el compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3 (10 pM) durante 5 días yteñido con Involucrin y K14;
Figura 20 ilustra las células cutáneas de queratinocitos HaCat tratadas con el compuesto 17 del Ejemplo 6 (10 pM) durante 5 días;
Figura 21 ilustra las células cutáneas de queratinocitos HaCat tratadas con el compuesto 17 del Ejemplo 6 (10 pM) durante 5 días y teñido con Involucrin y K14; y
Figura 22 ilustra el espectro Raman del compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3. Se observa una banda de acetileno de alta intensidad a 2190 cm-1, esto se encuentra en la región silenciosa celular (1800-2800 cm-1), en donde no se observan señales de origen biológico, como enlaces amida.
En las figuras, cualquier referencia a DC271 es una referencia al compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3.
Las siguientes abreviaturas se usan en los Ejemplos y otras partes de la descripción:
ATRA: Ácido retinoico todo trans
B2pin2: bis(pinacolato)diboro
dCM: diclorometano
DMF: W,A/-dimetilformamida
DMSO: dimetilsulfóxido
dppf: 1,1'-ferrocenediil-bis(difenilfosfina)
EDTA: ácido etilendiaminotetraacético
EtOAc: acetato de etilo
GCMS: cromatografía de gases-espectrometría de masas
h: hora(s)
KOAc: acetato de potasio
RT: temperatura ambiente
THF: tetrahidrofurano
Experimentales generales
Los reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich, Acros Organics, Alfa-Aesar y Fluorochem y se usaron sin purificación adicional a menos que se indique de cualquier otra manera. Los solventes se usaron tal como se suministraron y se secaron antes de su uso con los agentes secantes apropiados, si se indica. Las reacciones se monitorearon in situ mediante TLC o espectroscopia de RMN. La cromatografía en capa fina (TLC) se realizó mediante el uso de placas de vidrio de gel de sílice 60G F25425 de Merck Millipore con visualización mediante lámpara UV. La cromatografía en columna ultrarrápida se realizó mediante el uso de SiO2 de Sigma-Aldrich (malla 230-400, 40-63 pm, 60 A) y monitoreado mediante el uso de TLC. Los espectros de RMN se registraron en espectrómetros Varian VNMRS-700, Varian VNMRS-600, Bruker Avance-400 o Varian Mercury-400 que operan a la temperatura ambiente de la sonda, a menos que se indique de cualquier otra manera. Los espectros de RMN se registraron en CDCh o DMSO-cfe adquirido de Goss Scientific. Los picos de RMN se notifican como singlete (s), doblete (d), triplete (t), cuarteto (q), ancho (br), hepteto (hept), sus combinaciones o como multiplete (m). ES-MS fue realizado por el servicio departamental de la Universidad de Durham mediante el uso de un espectrómetro de masas TQD (Waters UK) y Acquity UPLC (Waters Ltd, UK), y se obtuvieron mediciones de masa precisas mediante el uso de un espectrómetro de masas QTOF Premier y un Acquity UPLC (Waters Ltd, UK). GCMS fue realizado por el servicio departamental de la Universidad de Durham mediante el uso de un Shimadzu QP2010-Ultra. Los espectros IR se registraron en un espectrómetro Perkin Elmer FT-IR. Los puntos de fusión se obtuvieron mediante el uso de un aparato de punto de fusión Gallenkamp. Los análisis elementales fueron obtenidos por el servicio departamental de la Universidad de Durham mediante el uso de un analizador Exeter Analytical CE-440.
Procedimientos de Síntesis
Ejemplo 1
6-yodo-4,4-dimetil-1-(propan-2-il)-1,2,3,4-tetrahidroquinolina (4)
Figure imgf000013_0001
1(a) W-(4-yodofenil)-3-metilbut-2-enamida (1)
A una solución de 4-yodoanilina (25,0 g, 114,0 mmol) en DCM (400 ml) se le añadió cloruro de 3,3-dimetilacroloílo (13,36 ml, 120,0 mmol) y la suspensión blanca resultante se agitó durante 0,5 h, después de lo cual la piridina (9,70 ml, 120 mmol) y la solución se agitó a TA durante 16 h. La solución se inactivó con H2O, se diluyó con DCM, se lavó con NH4O saturado, H2O y salmuera, se secó (MgSO4) y se evaporó para dar un sólido crudo de color marrón claro (33 g). Este se recristalizó en EtOH para dar 1 como un sólido cristalino blanco (31,8 g, 93 %): RMN 1H (700 MHz, CDCla) 81,91 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), 5,68 (s, 1H), 7,01 (s, 1H), 7,33 (m, 2H), 7,60 (d, J = 8,8 Hz, 2H); RMN 13C (101 MHz, CDCla) 820,2, 27,7, 87,2, 118,5, 121,8, 138,0, 138,2, 154,5, 165,2; IR (limpio) Vmáximo/cm'13294 m, 3094, 2964 w, 2890 w, 1666 m, 1586 m, 1430 m, 821 s, 650 m; MS (ES): m/z = 302,0 [M+H]+; HRMS (ES) calculado para Cn Hu NOI [M+H]+: 302,0042, encontrado: 302,0050; Encontrado: C, 43,87; H, 4,02; N 4,64. Calculado para C11H12NOI: C, 43,88; H, 4,02; N 4,65 %; m.p. = 136-138 °C.
1(b) 6-yodo-4,4-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-2-ona (2)
AlCh (7,66 g, 57,5 mmol) se añadió a DCM anhidro (150 ml) y la suspensión resultante se agitó durante 0,5 h. A esto se añadió 1 (11,5 g, 38,3 mmol) y la solución se agitó vigorosamente durante 2,5 h a TA. La reacción se inactivó lentamente con H2O, diluido con DCM, lavado con NaOH al 5 % hasta que la solución se volvió blanca, luego se lavó más con H2O y salmuera, se secó (MgSO4) y se evaporó para dar un sólido crudo amarillo. Este se recristalizó en EtOH para dar 2 como un sólido cristalino blanco (10,2 g, 88 %): RMN 1H (700 MHz, CDCh) 81,32 (s, 6H), 2,47 (s, 2H), 6,62 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,47 (dd, J = 8,3, 1,9 Hz, 1H), 7,56 (d, J =1,8 Hz, 1H), 9,20 (s, 1H); RMN 13C (176 MHz, CDCh) 827,7, 34,2, 45,2, 86,8, 118,1, 133,7, 135,1, 135,9, 136,6, 171,3; IR (limpio) Vmáximo/cm'13164 m, 3102, 3040 w, 2953 m, 1671 s, 1596 m, 1484 m, 817 s; MS (ES): m/z = 302,0 [M+H]+; HRMS (ES) calculado para CnHuNOI [M+H]+: 302,0042, encontrado: 302,0042; Encontrado: C, 43,91; H, 4,02; N 4,63. Calculado para C11H12INO: C, 43,87; H, 4,02; N 4,65 %; m.p. = 199-202 °C.
1(c) 6-yodo-4,4-dimetil-1-(propan-2-il)-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-2-ona (3)
A una solución de 2 (7,05 g, 23,4 mmol) en DMF anhidro (200 ml) se añadió KOH triturado (4,08 g, 70,2 mmol) y la suspensión resultante se agitó durante 1 hora a 50 °C. A esto se le añadió 2-yodopropano (7,00 ml, 70,2 mmol) y la solución se agitó a 50 °C durante 40 h. La reacción se detuvo con H2O, se diluyó con EtOAc, se lavó con NH4Cl saturado, H2O y salmuera, se secó (MgSO4) y se evaporó para dar un aceite crudo claro (7,2 g). Este fue purificado por cromatografía de SO2 (hexano:EtOAc, 9:1, con 1 % EtaN, como eluyente) para dar 3 como un aceite incoloro (3,93 g, 49 %): RMN 1H (700 MHz, CDCh) 81,25 (s, 6H), 1,49 (s, 3H), 1,50 (s, 3H), 2,38 (s, 2H), 4,66 (hept, J = 7,0 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,50 (dd, J = 8,6, 2,1 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 2,1 Hz, 1H); RMN 13C (176 MHz, CDCh) 8 20,3, 26,8, 33,1, 47,2, 48,8, 86,9, 118,9, 133,4, 135,7, 138,9, 139,1, 169,5; IR (limpio) Vmáximo/cm'12961 m, 2934 w, 2870 w, 1667 s, 1582 m, 1482 m, 809 s; MS (ES): m/z = 344,0 [M+H]+; HRMS (ES) calculado para CnH^NOI [M+H]+: 344,0511, encontrado: 344,0512.
1(d) 6-yodo-4,4-dimetil-1-(propan-2-il)-1,2,3,4-tetrahidroquinolina (4)
A una solución de 3 (1,25 g, 3,63 mmol) en tolueno anhidro (15 ml) a 0 °C se añadió gota a gota un complejo de sulfuro de dimetilo de borano (2,0 M en THF, 1,91 ml, 3,81 mmol) y la solución resultante se agitó a reflujo durante 16 h. La solución se enfrió a RT y se añadieron las soluciones acuosas al 10 %. Na2CO3 (25 ml) y la solución se agitó durante 0,5 h, se diluyó con EtOAc, se lavó con H2O y salmuera, se secó (MgSO4) y se evaporó para dar un aceite crudo incoloro (1,12 g). Este fue purificado por cromatografía de SiO2 (hexano:EtOAc, 9:1, con 1 % Et3N, como eluyente) para dar 4 como un aceite incoloro (1,08 g, 90 %): RMN 1H (700 MHz, CDCh) 51,19 (s, 3H), 1,19 (s, 3H), 1,24 (s, 6H), 1,65-1,67 (m, 2H), 3,14-3,17 (m, 2H), 4,06 (hept, J = 6,6 Hz, 1H), 6,46 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,28 (dd, J =8,9, 2,1 Hz, 1H), 7,39 (d, J = 2,2 Hz, 1H); RMN 13C (176 MHz, CDCh) 518,9, 30,3, 32,4, 36,6, 36,8, 47,3, 76,1, 113,4, 134,5, 134,8, 135,6, 144,0; IR (limpio) Vmáximo/cm-1 2957 m, 2927 w, 2863 w, 1580 m, 1489 m, 792 s, 684 w; MS (ES): m/z = 330,1 [M+H]+; HRMS (ES) calculado para C11H13NOI [M+H]+: 330,0719, encontrado: 330,0717.
Ejemplo 2
4-etinilbenzoato de metilo (7)
Figure imgf000014_0001
2(a) 4-yodobenzoato de metilo (5)
4-ácido yodobenzoico (25 g, 100,8 mmol) se suspendió en MeOH (250 ml) y se añadió H2SO4 conc. (5 ml) y la solución resultante se agitó a reflujo durante la noche. A continuación, la solución clara se enfrió lentamente a temperatura ambiente y luego a 0 °C. El sólido resultante se filtró, se lavó con MeOH frío y se secó para dar 5 como un sólido cristalino incoloro (23,7 g, 90 %): RMN 1H (600 MHz, CDCh) 53,90 (s, 3H), 7,73 (d, J =8,6 Hz, 2H), 7,79 (d, J = 8,6 Hz, 2H); RMN 13C (176 MHz, CDCh) 552,5, 100,9, 129,8, 131,2, 137,9, 166,7; IR (limpio) Vmáximo/cm-13040 w, 2996 w, 2946 w, 1709 s, 1596 m, 1436 m, 1269 s, 1114 s, 843 s, 683 m; MS (GC): m/z = 261,9 [M]+; Encontrado: C, 36,54; H, 2,71. Calculado para C8H7IO2: C, 36,67; H, 2,69 %.
2(b) 4-((trimetilsilil)etinil)benzoato de metilo (6)
Se evacuó a presión reducida un matraz Schlenk de 500 ml secado en estufa y se rellenó con Ar, antes de Pd(PPh3)2Cl2 (1,18 g, 1,68 mmol), Cul (1,68 g, 1,68 mmol) y 5 (22,0 g, 83,98 mmol) y el matraz se selló con un septo. Se añadieron trietilamina (200 ml) y trimetilsililacetileno (13,94 ml, 100,8 mmol) y el matraz se evacuó/rellenó de nuevo con Ar (3x). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La solución se diluyó con hexano, se pasó a través de Celite/SiO2 al vacío y se evaporó para dar 6 como un sólido blanquecino (19,8 g). Esto se llevó a la siguiente etapa sin purificación: MS (GC): m/z = 232,1 [M]+; Encontrado: C, 66,90; H, 6,88. Calculado para C13H16O2Si: C, 67,2; H, 6,94 %.
2(c) 4-etinilbenzoato de metilo (7)
A una solución de MeOH:DCM (2:1, 300 ml) se añadió 6 (18,5 g, 79,5 mmol) y K2CO3 (22,0 g, 159 mmol). La mezcla se agitó bajo Ar durante 6 h. Luego, la solución se evaporó a 1/3 del volumen, se diluyó con hexano, se pasó a través de Celite y se evaporó para dar un sólido de color marrón claro, que se purificó por sublimación a presión reducida para dar 7 como un sólido blanco (11,1 g, 83 % en dos etapas): RMN 1H (600 MHz, CDCh) 53,23 (s, 1H), 3,91 (s, 3H), 7,54 (d, J = 8,4 Hz, 2H,), 7,98 (d, J = 8,6 Hz, 2H); RMN 13C (176 MHz, CDCh) 552,5, 80,2, 83,0, 126,9, 129,6, 130,3, 132,3, 166,6; IR (limpio) Vmáximo/cm-13035 w, 3006 w, 2950 w, 2103 w, 1699 s, 1605 m, 1433 m, 1277 s, 1107 s, 859 s; MS (GC): m/z = 160,1 [M]+; Encontrado: C, 74,62; H, 5,01. Calculado para C10H8O2: C, 74,99; H, 5,03 %.
Ejemplo 3 (Ejemplo de referencia)
ácido 4-2-[4,4-Dimetil-1-(propan-2-il)-1,2,3,4-tetrahidroquinolina-6-il]etinilbenzoico (9)
Figure imgf000014_0002
3(a) 4-2-[4,4-Dimetil-1-(propan-2-il)-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il]etinilbenzoato, (8)
Se evacuó un matraz Schlenk secado al horno a presión reducida y se rellenó con Ar, antes de Pd(PPh3)2Cl2 (0,0744 g, 0,106 mmol), Cul (0,0202 g, 0,106 mmol) y 7 (0,219 g, 1,37 mmol) y el matraz se selló con un septo. Una solución de 4 (0,349 g, 1,06 mmol) en trietilamina (6 ml) y el matraz se evacuó/rellenó de nuevo con Ar (3x). La mezcla se agitó a RT durante 72 h. La mezcla se diluyó con Et2O, pasado a través de Celite/SiO2 al vacío y se evaporó para dar un sólido crudo naranja (0,47 g). Este fue purificado por cromatografía de SiO2 (hexano:EtOAc, 8:2 , con 1 % Et3N, como eluyente) para dar 8 como un sólido naranja (0,105 g, 27 %): RMN 1H (700 MHz, CDCh) 51,21/1,23 (s, 6H), 1,28 (s, 6H), 1,66-1,71 (m, 2H), 3,19-3,24 (m, 2H), 3,92 (s, 3H), 4,15 (hept, J = 6,6 Hz, 1H), 6,64 (d, J =8,7 Hz, 1H), 7,24-7,25 (m, 1H), 7,36 (d, J =1,8 Hz, 1H), 7,54 (d, j = 8,3 Hz, 2H), 7,98 (d, J = 8,3 Hz, 2H); RMN 13C (151 MHz, CDCh) 519,1, 30,1, 32,2, 36,7, 36,8, 47,4, 52,3, 86,8, 95,2, 108,0, 110 ,6, 128,5, 129,5, 129,6, 131,1, 131,2, 131,7, 145,0, 167,0; MS (ES):m/z = 362,2 [M H]+; HRMS (ES) calculado para C24H28NO2 [M H]+: 362,2120, encontrado: 362,2114.
ácido 3(b) 4-2-[4,4-Dimetil-1-(propan-2-il)-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il] etinilbenzoico (9) (Ejemplo de referencia)
Figure imgf000015_0001
Se evacuó un matraz Schlenk secado al horno a presión reducida y se rellenó con Ar, antes de Pd(PPh3)2Ch (0,253 g, 0,36 mmol), Cul (0,0686 g, 0,36 mmol) y 7 (0,634 g, 3,96 mmol) y el matraz se selló con un septo. Una solución de 4 (1,185 g, 1,06 mmol) en trietilamina (30 ml) se desgasificó mediante sonicación al vacío y se rellenó con Ar (3x). A continuación, esta solución se añadió al matraz Schlenk, se desgasificó al vacío y se rellenó con Ar una vez más, y la mezcla resultante se agitó a RT durante 72 h. A continuación, la mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad y se eluyó a través de un fino tapón de Celite/SiO2 con hexano y luego hexano:EtOAc (9:1). A continuación, los extractos orgánicos se lavaron con solución NH4Q sat., 3 % ac. EDTA, H2O y salmuera, se secó (MgSO4) y se evaporó para dar un sólido naranja (1,38 g). Este se disolvió en THF (30 ml) y se añadió NaOH ac. al 20 % (3 ml). La solución resultante se agitó a reflujo durante 40 h, con lo cual la mezcla se enfrió y se añadió H2O. La solución se neutralizó con HCl al 5 %, se diluyó con EtOAc, se lavó con solución NaHCO3 sat., H2O y salmuera, se secó (MgSO4) y se evaporó para dar un sólido crudo amarillo (1,0 g). Este se recristalizó dos veces por estratificación con solvente (DCM/hexano) para dar 17 como agujas de color amarillo brillante (0,73 g, 58 % en dos etapas): RMN 1H (700 MHz; (CD3)2SO) 51,16 (s, 3H), 1,17 (s, 3H), 1,22 (s, 6H), 1,60-1,64 (m, 2H), 3,17-3,21 (m, 2H), 4,15 (hept, J = 7,0 Hz), 6,70 (d, J =9,3 Hz, 1H), 7,19 (dd, J = 8,6, 2,1 Hz, 1H), 7,30 (d, J =2,1 Hz, 1H), 7,56 (d, J =8,5 Hz, 2H), 7,92 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 13,02 (s, 1H); RMN 13C (700 MHz, (CD3)2SO) 5 18,6, 29,7, 31,6, 35,8, 36,1, 46,7, 86,5, 94,9, 106,5, 109,5, 110,5, 128,9, 129,4, 130,7, 130,7, 131,2, 144,7, 166,8; MS (ES):m/z = 348,2 [M+H]+; HRMS (ES) calculado para C23H26NO2 [M H]+: 348,1964, encontrado: 348,1965.
Ejemplo 4 (Ejemplo de referencia)
3-[4-(1,4,4-trimetil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)-fenil]-éster metílico del ácido acrílico (13)
Figure imgf000015_0002
En un matraz de fondo redondo de 500 ml, una solución de N-metilanalina (3,24 g, 30,32 mmol), 1-bromo-3-metilbut-2-eno (5,0 g, 33,56 mmol) y K2CO3 (4,63 g, 33,56 mmol) en 160 ml de MeCN se calentó a 85 °C durante 18 h, momento en el que se analizó mediante ES+-MS in situ mostró que la reacción estaba completa. La mezcla se diluyó con Et20 (100 ml) y se lavó con H2O (3 x 100 ml). La capa orgánica se secó con MgSO4, filtrado y se evaporó al vacío para dar un aceite crudo que se filtró a través de una almohadilla de sílice, se eluyó con hexano. Se eliminó el solvente al vacío para dar el compuesto del título como un aceite transparente (3,82 g, 72 %); m/z (ES+-MS) 176 (MH+); RMN 1H (499,76 MHz, CDCls) 57,28 (2H, d, J = 7,0 Hz), 6,79 (2H, d, J =7,0 Hz), 6,75 (1H, tr, J = 7,0 Hz), 5,25 (1H, tr, J = 6,0 Hz), 3,93 (2H d, J = 6,0 Hz), 2,93 (3H, s) 1,76 (6H, s); 13C{1H} RMN (100,61 MHz, CDCls) 5 149,86, 134,54, 129,08, 120,91, 116,42, 112,97, 50,53, 37,91, 25,70. 17,92; HRMS calculado para C12H18N ([M H]+)176,14338, encontrado 176,14336.
4(b) 1,4,4-Trimetil-1,2,3,4-tetrahidroquinolina
En un matraz de fondo redondo de 500 ml, una mezcla de metil-(3-metil-but-2-enil)-fenil-amina (18,0 g, 102,86 mmol) y ácido polifosfórico (75 ml) se calentó a 120 °C durante 18 h, en cuyo momento el análisis de la alícuota purificada de la mezcla a través de la espectroscopia de RMN 1H mostró que la reacción se había completado. La mezcla se diluyó mediante la adición lenta de H2O (100 ml) durante 5 minutos. La solución se basificó cuidadosamente mediante la adición de KOH acuoso y luego se extrajo con Et2O (1 l). La capa orgánica se lavó con H2O (3 x 200 ml), se secó con MgSO4, se filtró y se eliminó el solvente al vacío para dar un aceite crudo que se filtró a través de una almohadilla de sílice, se eluyó con hexano. Se eliminó el solvente al vacío para dar el compuesto del título como un aceite transparente (14,93 g, 83 %); m/z (EI-MS) 175 (50 %, M+), 160 (60 %, M+ - Me); 1H RMN (499,76 MHz, CDCh) 5 7,23 (1H, dd, J = 7,5, 1,5 Hz), 7,11 (1H, triplete de dobletes, J = 7,5, 1,5 Hz), 6,63 (1H, triplete de dobletes, J = 7,5, 1,5 Hz), 6,62 (1H, d, J = 7,5 Hz), 3,25 (2H, tr, J = 6,0 Hz), 2,92 (3H, s), 1,80 (2H, tr, J = 6,0 Hz); 13C{1H} RMN (125,67 MHz, CDCh) 5 145,74, 131,61, 126,94, 126,02, 116,25, 111,09, 47,88, 39,50, 37,50, 32,19, 31,21, HRMS calculado para C12H18N ([M H]+)176,14338, encontrado 176,14332.
4(c) 6-Yodo-1,4,4-trimetil-1,2,3,4-tetrahidroquinolina
A una solución de 1,4,4-trimetil-1,2,3,4-tetrahidro-quinolina (2,10 g, 12,0 mmol) y yodo (3,05 g, 12,0 mmol) en DCM (100 ml) se añadió HgO rojo (2,59 g, 12,0 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente hasta su análisis por RMN 1H mostró que la reacción se había completado (2 h). La mezcla se filtró, se lavó con solución acuosa diluida de Na2S2O3 (100 ml) y H2O (100 ml). La capa orgánica se secó con MgSO4 y el solvente se eliminó al vacío. El residuo se filtró a través de un tapón de alúmina, se eluyó con DCM y el solvente se eliminó al vacío para dar el compuesto del título como un aceite amarillo pálido (2,50 g, 69 %); m/z (EI-MS) 301 (100 %, M+), 286 (80 %, M+ -Me); RMN 1H (499,67 MHz, CDCh) 57,40 (1H, d, J = 2,0 Hz), 7,32 (1H, dd, J = 8,5, 2,0 Hz), 6,35 (1H, d, J = 8,5 Hz), 3,24 (2H, tr, J = 6,0 Hz), 2,89 (3H, s), 1,74 (2H, tr, J = 6,0 Hz) 1,27 (6H, s); 13C{1H} RMN (125,67 MHz, CDCh) 5 144,92, 135,49, 134,34, 127,22, 126,52, 113,35, 47,58, 39,30, 36,87, 32,29, 30,79; HRMS calculado para C12H17NI ([M H]+) 302,04003, encontrado 302,04008.
4(d) 1,4,4-Trimetil-6-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-1,2,3,4-tetrahidroquinolina (12)
En un seco, N2 guantera llena, Pd(dppf)Cl2 (0,126 g, 0,15 mmol), 6-yodo-1,4,4-trimetil-1,2,3,4-tetrahidro-quinolina (0,93 g, 3,09 mmol), B2pin2 (0,78 g, 3,09 mmol) y KOAc (0,61 g, 6,18 mmol) se mezclaron en un tubo de vidrio de pared gruesa equipado con un grifo de Young. Se añadió DMSO desgasificado (10 ml) y la mezcla se calentó a 80 °C durante 18 h, momento en el que el análisis de GCMS mostró que la reacción se había completado. La mezcla se diluyó con Et2O (100 ml) y se lavó con H2O (3 x 100 ml). La capa orgánica se secó con MgSO4, se filtró y se eliminó el solvente al vacío para dar un residuo que se filtró a través de una almohadilla de sílice, se eluyó con DCM/hexano 1:1. La eliminación del solvente al vacío dio un producto bruto que se recristalizó en MeOH a -20 °C para dar 12 como agujas blancas (0,66 g 70 %); mp 140-141 °C; m/z (EI-MS) 301 (100 %, M+), 286 (100 %, M+ - Me); RMN 1H (699,73 MHz, CDCh) 57,63 (1H,s) 7,55 (1H,d, J = 8,0 Hz), 6,56 (1H, d, J = 8,0 Hz), 3,29 (2H, tr, J = 6,0 Hz), 2,94 (3H,s), 1,75 (2H, tr, J = 6,0 Hz), 1,33 (12H, s), 1,31 (6H, s);
13C{1H} RMN (175,73 MHz, CDCh):
5 147,8, 134,4, 132,3, 130,3, 110,1, 83,2, 47,7, 39,2, 37,2, 32,1, 30,7, 25,0, no se observó la resonancia del carbono unido al boro; 11B{1H} RMN (128,38 MHz, CDcl3) 5 31,01; análisis elemental calculado (%) para Ci8H28BNO2: C 71,77, H 9,37, N 4,65; encontrado: C 71,79, H 9,27, N 4,60.
4(e) 3-[4-(1,4,4-trimetil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)-fenil]-éster metílico del ácido acrílico (13) (Ejemplo de referencia)
Figure imgf000016_0001
En un seco, N2 guantera llena, Pd(dppf)Cl2 (25 mg, 0,03 mmol), 1,4,4-trimetil-6-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-1,2,3,4 -tetrahidroquinolina (0,49 g, 1,55 mmol), 3-(4-bromo-fenil)-éster metílico del ácido acrílico (0,37 g, 0,83 mmol) y K3PO42 H2O (0,77 g, 3,10 mmol) se mezclaron en un tubo de vidrio de paredes gruesas equipado con un grifo de Young. Se añadió 'PrOH desgasificado (10 ml) y H2 O (1 ml) y la mezcla se calentó a 80 °C durante 18 h, momento en el que el análisis de GCMS mostró que la reacción se había completado. Se eliminó el solvente al vacío y el residuo se disolvió en DCM (100 ml) y se lavó con H2O (3 * 20 ml). La capa orgánica se secó con MgSO4, se filtró y se eliminó el solvente al vacío para dar un residuo que se filtró a través de una almohadilla de sílice, se eluyó con DCM. Eliminación del solvente al vacío dio un sólido amarillo que se recristalizó en MeOH a -20 °C para dar agujas blancas amarillas de 13 (0,32 g, 62 %); mp 121-123 °C; UV-vis (CHCh) Amáximo (e) 380 nm (23900 l mol-1 cm-1); Aem (CHCh) 536 nm; m/z (ES+-MS) 336 ([M-H]+); RMN 1H (499,77 MHz, CDCh) 57,73 (1H, d, J = 16,0 Hz), 7,58 (2H, d, J =8,5 Hz), 7,56 (2H, d, J =8,5 Hz), 7,48 (1H, s), 7,37 (1H, d, J =8,0 Hz), 6,66 (1H, d, J =8,0 Hz), 6,45 (1H, d, J = 16,0 Hz), 3,83 (3H, s), 3,30 (2H, tr, J =5,5 Hz), 2,97 (3H, s), 1,81 (2H, tr, J =5,5 Hz), 1,35 (6H,s); 13C{1H}RMN (125,67 MHz, CDCh) 5167,87. 145,49, 144,98, 143,89, 131,85 (2 picos solapados), 12,71, 127,45, 126,49, 125,63, 124,56, 116,56, 111,28, 51,79, 47,75, 39,40, 37,24, 32,34, 30,97; HRMS calculado para C22H26NO2 ([M-H]+) 336,19581, encontrado 336,19577.
Ejemplo 5 (Ejemplo de referencia)
6-(1,4,4-Trimetil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)-naftaleno-2-éster metílico del ácido carboxílico (11)
Figure imgf000017_0001
5(a) 6-(5,5-Dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)-1,4,4-trimetil-1,2,3,4-tetrahidroquinolina (10)
En un seco, N2 guantera llena, Pd(dppf)Ch (0,135 g, 0,17 mmol), 6-yodo-1,4,4-trimetil-1,2,3,4-tetrahidro-quinolina (1,0 g, 3,32 mmol), B2pin2 (0,75 g, 3,32 mmol) y KOAc (0,65 g, 6,64 mmol) se mezclaron en un tubo de vidrio de pared gruesa equipado con un grifo de Young. Se añadió DMSO desgasificado (10 ml) y la mezcla se calentó a 80 °C durante 18 h, momento en el que el análisis de GCMS mostró que la reacción se había completado. La mezcla se diluyó con Et2O (100 ml) y se lavó con H2O (3 x 100 ml). La capa orgánica se secó con MgSO4, se filtró y se eliminó el solvente al vacío para dar un residuo que se filtró a través de una almohadilla de sílice, se eluyó con DCM/hexano 1:1. La eliminación del solvente al vacío dio un producto bruto que se recristalizó en MeOH a -20 °C para dar agujas blancas de 10 (0,80 g, 88 %); mp 151-153 °C; m/z (EI-MS) 287 (90 %, M+), 272 (100 %, M+ - Me); RMN 1H (499,77 MHz, CDCh) 57,64 (1H, d, J =1,5 Hz), 7,54 (1H, dd, J = 8,5, 1,5 Hz), 7,27 (1H, s), 6,57 (1H, d, J = 8,5 Hz), 3,75 (4H, s), 3,28 (2H, tr, J = 6,0 Hz), 2,94 (3H, s), 1,76 (2H, tr, j = 6,0 Hz), 1,32 (6H, s), 1,02 (6H, s); 13C{1H} RMN (125,67 MHz, CDCh) 5 147,49, 133,29, 131,42, 130,19, 110,09, 72,33, 47,75, 39,24, 37,29, 32,05, 32,03, 30,83, 20,12, no se observó la resonancia del carbono unido al boro; 11B{1H} RMN (128,38 MHz, CDCh) 527,02; análisis elemental calculado (%) para C17H26BNO2: C 71,09, H 9,12, N 4,88; encontrado: C 71,00, H 9,12, N 4,81.
5(b) 6-(1,4,4-Trimetil-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-6-il)-naftaleno-2-éster metílico del ácido carboxílico, (11)
Figure imgf000017_0002
En un seco, N2 guantera llena, Pd(dppf)Cl2 (13 mg, 0,02 mmol), 6-(5,5-dimetil-[1,3,2]dioxaborinan-2-il)-1,4,4-trimetil-1,2,3,4-tetrahidro-quinolina (0,25 g, 0,87 mmol), éster metílico del ácido 6-bromo-naftaleno-2-carboxílico (0,22 g, 0,83 mmol) y K3PO42H2O (0,43 g, 1,74 mmol) se mezclaron en un tubo de vidrio de paredes gruesas equipado con un grifo de Young. Se añadió DMSO desgasificado (15 ml) y H2O (3 ml) y la mezcla se calentó a 80 °C durante 18 h, momento en el que el análisis de GCMS mostró que la reacción se había completado. La mezcla se diluyó con Et2O (100 ml) y se lavó con H2O (3 x 100 ml). La capa orgánica se secó con MgSO4, se filtró y se eliminó el solvente al vacío para dar un residuo que se filtró a través de una almohadilla de sílice, se eluyó con DCM. La eliminación del solvente al vacío dio un sólido amarillo que se recristalizó en MeOH a -20 °C para dar agujas blancas amarillas de 11 (0,28 g, 94 %); mp 166-167 °C; UV-vis (CHCh) Amáximo (e) 243 nm (53200 l mol' 1 cm' 1); Aem (CHCh) 494 nm; m/z (EI-MS) 359 (100 %, M+), 344 (60 %, M+-Me); RMN 1H (699,73 MHz, CDCh) 58,60 (1H, s), 8,06 (1H, dd, J = 8,5, 1,5 Hz), 7,99 (1H, s), 1,97 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,90 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,81 (1H, dd, J = 8,5, 1,5 Hz), 7,60 (1H, d, J = 2,0 Hz), 7,49 (1H, dd, J = 8,5, 2,0 Hz), 6,71 (1H, d, J = 8,5 Hz), 3,99 (3H, s), 3,32 (2H, tr, J = 6,0 Hz), 2,99 (3H, s), 1,84 (2H, tr, j = 6,0 Hz), 1,39 (6H, s); 13C{1H} RMN (175,73 MHz, CDCh) 5 167,55, 145,49, 141,72, 136,29, 131,99, 131,08, 129,74, 128,74, 128,18, 126,62, 126,31, 126,05, 125,62, 124,97, 123,74, 111,41, 52,29, 47,79, 39,43, 37,31, 32,40, 31,03; HRMS calculado para C24H25NO2-(M+) 359,18798, encontrado 359,18789.
Ejemplo 6
ácido 4-2-[2,4,4-trimetil-1-(propan-2-il)-1,4-dihidroquinolin-6-il]etinilbenzoico, (17)
Figure imgf000018_0001
6(a) 6-yodo-2,4,4-trimetil-1-(propan-2-il)-1,4-dihidroquinolina, (15)
Figure imgf000018_0002
A una solución de 3 (1,17 g, 3,42 mmol) en THF anhidro (50 ml) se añadió MeMgBr (3,0 M en Et2O, 2,28 ml, 6,84 mmol) y la solución resultante se agitó a reflujo durante 16 h. La solución se enfrió, se inactivó con HCl al 20 % (1,14 ml) y H2O, diluido con EtOAc, se lavó con H2O y salmuera, se secó (MgSO4) y se evaporó para dar un aceite crudo incoloro (0,95 g). Este fue inmediatamente purificado por cromatografía de SiO2 (hexano:EtOAc, 97,5:2,5, con 1 % Et3N, como eluyente) para dar 15 como un aceite rosa (0,35 g, 30 %) que se usó inmediatamente en la siguiente reacción: RMN1H (400 MHz, CDCh) 51,20 (s, 6H), 1,45 (s, 3H), 1,46 (s, 3H), 1,98 (d, J =0,9 Hz, 3H), 4,16 (hept, J = 7,1 Hz, 1H), 4,50 (q, J = 1,2 Hz, 1H), 6,73(d, J =8,7 Hz, 1H,), 7,34 (dd, J =8,7, 2,2 Hz, 1H), 7,42(d, J =2,1 Hz, 1H).
6(b) 4-2-[2,4,4-trimetil-1-(propan-2-il)-1,4-dihidroquinolin-6-il]etinil benzoico, (17)
Figure imgf000018_0003
Pd(PPhs)2Cl2 (0,073 g, 0,104 mmol), Cul (0,0198 g, 0,104 mmol) y 7 (0,176 g, 1,10 mmol) se añadieron a un matraz Schlenk bajo Ar. El matraz se evacuó y se rellenó con Ar. Se añadió 15 (0,356 g, 1,04 mmol), disuelto en trietilamina (12 ml), y el matraz se evacuó/rellenó con Ar nuevamente (3x). La mezcla se agitó a RT durante 72 h. La solución se diluyó con Et2O, pasado a través de Celite/SiO2 al vacío y se evaporó para dar un sólido crudo verde (0,4 g). Este fue purificado por cromatografía de SiO2 (hexano:EtOAc, 8:2, con 1 % Et3N, como eluyente) para dar 16 (esquema IV) como un sólido verde pálido (0,12 g, 30 %). 16 (0,073 g, 0,195 mmol) luego se disolvió en THF (10 ml), y a esto se le agregó NaOH ac. al 20 % (2 ml). La solución resultante se agitó a reflujo durante 40 h, con lo cual la mezcla se enfrió y se añadieron H2O y Et2O. La solución se acidificó a pH 7 con HCl al 5 %, se diluyó con Et2O, se lavó con salmuera, se secó (MgSO4~) y se evaporó para dar 17 como un sólido amarillo (0,070 g, 99 %): RMN 1H (400 MHz; CDCh) 51,24 (s, 6H), 1,47 (s, 3H), 1,49 (s, 3H), 2,01 (d, J =0,9 Hz, 3H), 4,23 (hept, J = 7,2 Hz, 1H), 4,53 (d, J =1,1 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,27-7,29 (m, 1H), 7,37 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 8,03 (d, J = 8,4 Hz, 2H).
Ejemplo 7
Caracterización de la fluorescencia inicial del compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3 y el compuesto 17 del Ejemplo 6
Los espectros de absorción y emisión de 9 se obtuvieron en una variedad de solventes (Figura 3 y Figura 4). La comparación de 9 con EC23® (Figura 1 y Figura 2) muestra aumentos significativos en las longitudes de onda máximas de absorción y emisión. La fluorescencia de 9 se detectó fácilmente a concentraciones tan bajas como 1 nM, y se observaron efectos dependientes del solvente, con fluorescencia de alta intensidad detectada en solventes no polares, mientras que se observó una extinción significativa de la fluorescencia en el agua, en particular. La longitud de onda de emisión de fluorescencia también depende en gran medida de la polaridad del solvente, con un desplazamiento hacia el rojo significativo en los solventes polares en comparación con los solventes no polares. Esta caracterización inicial indicó que cuando se aplica a las células, la fluorescencia de 9 podría esperarse que sea discernible en ubicaciones celulares discretas, en dependencia de la polaridad local.
El compuesto 17 exhibe un perfil de emisión similar al compuesto 9 (Figura 6), pero también exhibe una longitud de onda de absorción máxima más larga (Figura 5). Esta banda de absorción alcanza su punto máximo alrededor de 379 nm y se arrastra hacia el índigo/azul (440 nm). Esta banda de absorción de longitud de onda más larga indica que el compuesto 17 será más efectivamente excitado que el compuesto 9 con la fuente de excitación de 405 nm típica de los microscopios de fluorescencia.
Estabilidad a la luz del compuesto de referencia 9 del Ejemplo 3
Un espectro de RMN 1H del compuesto 9 en DMSO-cfe se registró después del almacenamiento a temperatura ambiente en ausencia de luz (Figura 7). La misma muestra del compuesto 9 luego se expuso a la luz estándar de laboratorio a una distancia de 30 cm durante 72 horas, y el espectro de RMN 1H registrado (Figura 8). El compuesto 9 es estable frente a la iluminación típica de laboratorio durante este período de tiempo, aunque una pequeña proporción se convierte en una forma de enamina estructuralmente similar. El compuesto 9 permanece estable hasta alrededor de 16 días de exposición, cuando se hace evidente algún indicio de degradación. Se observa una degradación más significativa después de 22 días de exposición, aunque el compuesto 9 todavía representa el componente principal de la muestra (> 60 %).
Evaluación biológica del compuesto de referencia 9 y el compuesto 17
Las propiedades definitorias de los retinoides son su capacidad para inducir la diferenciación de tipos de células específicos y para inducir la expresión de genes que responden directamente al ácido retinoico al unirse al ADN de secuencias definidas (elementos de respuesta al ácido retinoico, RARE) que se unen a los receptores de ácido retinoico activado por ligando (RAR), lo que permite el reclutamiento de la maquinaria de transcripción de genes a las secuencias reguladoras de genes (promotor) necesarias para que se expresen los transcriptos de ARN mensajero del gen.
Para mostrar que los retinoides fluorescentes exhiben actividad retinoide, las células TERA-2 (una línea celular de carcinoma embrionario) se trataron con 1 y 10 pM de ATRA, EC23® y el compuesto 9, y las muestras resultantes se tiñeron con una variedad de tinciones inmunocitoquímicas. La tabla 1 muestra el resultado del tratamiento de las células TERA-2 con ATRA 1 y 10 pM, EC23® y el compuesto 9, y con el vehículo solvente, DMSO, en presencia de nestina, un filamento intermedio que típicamente se expresa en las células madre neurales. Todas las condiciones fueron positivas para nestina con tinción posiblemente en menor medida en las muestras EC23® 10 pM y el compuesto 9.
La tabla 2 muestra el resultado del tratamiento de células TERA-2 con ATRA 1 y 10 pM, EC23® y el compuesto 9, y con el vehículo solvente, DMSO, sobre la presencia de citoqueratina 8 (CK8), un marcador de diferenciación no neural. La tinción parece menos intensa en muestras de 10 pM de ATRA y EC23®, como es típico con una reducción en la diferenciación no neural, pero ligeramente más brillante con el compuesto 9 en comparación con las muestras de 1 pM. El tratamiento con DMSO muestra una tinción muy brillante para CK8.
La tabla 3 muestra el resultado del tratamiento de las células TERA-2 con ATRA 1 y 10 pM, EC23® y el compuesto 9, y con el vehículo solvente, DMSO, en presencia de TUJ-1, un marcador panneuronal. Las muestras tratadas con ATRA, EC23® y el compuesto 9 muestran una tinción significativa para TUJ-1, con una mayor tinción evidente con un tratamiento de 10 pM. Las células tratadas con DMSO muestran sólo una tinción limitada de TUJ-1.
La Tabla 4 muestra el resultado del tratamiento de las células TERA-2 con ATRA 1 y 10 pM, EC23® y el compuesto 9, y con el vehículo solvente, DMSO, sobre la presencia de Oct 4, un factor de transcripción que es un marcador de pluripotencia. Las células tratadas con DMSO muestran una tinción positiva obvia para el Oct 4, y la tinción también es evidente en el tratamiento con ATRA 1 pM. Todas las demás condiciones no exhiben tinción para el Oct 4, lo que indica que EC23® y el compuesto 9 regulan negativamente los marcadores de pluripotencia mediante la promoción de la diferenciación.
La tabla 5 muestra el resultado del tratamiento de las células TERA-2 con ATRA 1 y 10 pM, EC23® y el compuesto 9, y con el vehículo solvente, DMSO, sobre la presencia de Sox 2, un factor de transcripción que es un marcador de pluripotencia. Las células tratadas con DMSO muestran una tinción positiva obvia para Sox 2, con una tinción significativamente reducida en las células tratadas con ATRA, EC23® y el compuesto 9. Esta observación sugiere que ATRA, EC23® y el compuesto 9 regulan negativamente los marcadores de pluripotencia mediante la promoción de la diferenciación.
La Figura 9 muestra el análisis de citometría de flujo de las células TERA-2 tratadas con ATRA, EC23® y el compuesto 9, y DMSO. Se midió la expresión del marcador de células madre SSEA-3, que generalmente se reduce cuando las células se tratan con retinoides. La citometría de flujo de SSEA-3 muestra que la expresión de SSEA-3 disminuye significativamente en las células tratadas con retinoides en comparación con las células tratadas con DMSO. Las células tratadas con el compuesto 9 mostraron niveles más altos de SSEA-3 que ATRA y EC23® en los tratamientos de 1 y 10 pM.
La Figura 10 muestra el análisis de citometría de flujo de las células TERA-2 tratadas con ATRA, EC23® y el compuesto 9, y DMSO. Se midió la expresión del marcador de células madre TRA160, que generalmente se reduce cuando las células se tratan con retinoides. La citometría de flujo de TRA160 muestra que la expresión de TRA160 disminuye significativamente en las células tratadas con retinoides en comparación con las células tratadas con DMSO. Las células tratadas con el compuesto 9 mostraron niveles ligeramente más altos de TRA160 que ATRA y EC23® en los tratamientos de 1 y 10 pM.
La Figura 11 muestra el análisis de citometría de flujo de las células TERA-2 tratadas con ATRA, EC23® y el compuesto 9, y DMSO. Se midió la expresión del marcador neuronal temprano A2B5, que generalmente aumenta cuando las células se tratan con retinoides. La citometría de flujo de A2B5 muestra que la expresión de A2B5 aumenta significativamente en las células tratadas con retinoides en comparación con las células tratadas con DMSO. Las células tratadas con ATRA expresan niveles más altos de A2B5 seguido de EC23® y el compuesto 9. La Tabla 6 muestra imágenes de contraste de fase de las poblaciones celulares que han sido tratadas con ATRA, EC23® y el compuesto 9, y DMSO. En las poblaciones de células tratadas con DMSO, las células son pequeñas y están densamente empaquetadas. Por el contrario, las poblaciones de células tratadas con ATRA, EC23® y el compuesto 9 son menos densas y las células están mucho más dispersas.
La Figura 12 y la Figura 13 muestran un análisis de viabilidad de las células MTT de los tratamientos 1 y 10 pM de ATRA, EC23® y el compuesto 9, y DMSO. Todos los tratamientos exhiben una viabilidad comparable a la del DMSO, lo que sugiere que las células tratadas con retinoides no experimentan efectos tóxicos significativos.
La figura 14 muestra las células TERA-2 tratadas con el compuesto 9 a concentraciones de 10, 1, 0,1, 0,01 pM y se tomaron imágenes mediante el uso de un microscopio de fluorescencia confocal después de 7 días. Incluso a la concentración de tratamiento más baja, la fluorescencia del compuesto 9 es visible, fácilmente fotografiados con los tratamientos de 0,1-10 pM. El compuesto 9 se localiza principalmente alrededor de la envoltura nuclear y parece estar localizado también alrededor de otras estructuras celulares.
Las Figuras 15, 16 y 17 muestran, respectivamente, las células SHSY5Y (neuroblastoma) y las células de fibroblastos y células TERA-2 tratadas con 10 pM del compuesto 9, y se tomaron imágenes mediante el uso de un microscopio de fluorescencia confocal después de 8 horas (SHSY5Y) y 24 horas (fibroblastos) y 7 días (TERA-2). El compuesto 9 vuelve a ser claramente visible con una localización obvia alrededor de la envoltura nuclear.
La Figura 18 muestra las células cutáneas de queratinocitos HaCat que se trataron con 10 pM del compuesto 9 durante 5 días, se fijaron y luego se fotografiaron con un microscopio de fluorescencia confocal.
La Figura 19 muestra las células de piel de queratinocitos HaCat tratadas con el compuesto 9 (10 pM) durante 5 días. Luego, los cubreobjetos fijados se tiñeron con Involucrin (verde) y K14 (rojo) y se tomaron imágenes mediante el uso de un microscopio confocal. La fluorescencia del compuesto 9 está coloreada en azul. Involucrin tiñe selectivamente la proteína de unión al ácido retinoico celular (CRABP), que transporta los retinoides dentro y alrededor del núcleo. K14 es un marcador prototípico de los queratinocitos basales en división y ayuda a mantener la forma de las células epidérmicas.
La Figura 21 muestra las células de piel de queratinocitos HaCat tratadas con el compuesto 17 (10 pM) durante 5 días. Luego, los cubreobjetos fijados se tiñeron con Involucrin (verde) y K14 (rojo) y se tomaron imágenes mediante el uso de un microscopio confocal. La fluorescencia del compuesto 17 está coloreada en azul. Involucrin tiñe selectivamente la proteína de unión al ácido retinoico celular (CRABP), que transporta los retinoides dentro y alrededor del núcleo. K14 es un marcador prototípico de los queratinocitos basales en división y ayuda a mantener la forma de las células epidérmicas. Como en la Figura 20, la fluorescencia del compuesto 17 es significativamente más intensa que la exhibida por el compuesto 9 en idénticas condiciones (Figura 19).
La Figura 22 muestra el espectro Raman del compuesto 9. Se observa una banda de acetileno de alta intensidad a 2190 cm-1. Esto se encuentra en la región silenciosa celular (1800-2800 cirr1), en donde no se observan señales de origen biológico, como enlaces amida. Esta separación espectral permite que las bandas Raman en la región silenciosa celular se detecten más fácilmente al generar imágenes o analizar muestras celulares mediante el uso de microscopía/espectroscopía Raman.

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    Un compuesto de fórmula I:
    Figure imgf000021_0001
    en el que
    R1 es hidrógeno, alquilo C1-10 o acilo;
    R2, R3, R4 y R5, que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno hidrógeno o alquilo C1-4, o juntos un par de R2 y R4 o R3 y R5 representan un enlace;
    R6 y R7, que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno hidrógeno, alquilo C1-4 o R6 y R7 juntos forman un grupo:
    =CR11R12;
    R8 y R9, que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno hidrógeno, alquilo C1-10, arilo, aralquilo, halógeno, trifluoroalquilo, ciano, nitro, -NRaRb, -ORa, -C(O)Ra, -C(O)ORa,-OC(O)Ra, -S(O)RaRb, y -C(O)NRaRb;
    R11 y R12, que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno hidrógeno o alquilo C1-10; y
    Ra y Rb, que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno hidrógeno o alquilo C1-10;
    R10 es un grupo II, III, IV, VII, VIII o IX:
    Figure imgf000021_0002
    Figure imgf000022_0001
    en el que R13 es hidrógeno o alquilo C1-10; en donde un par de R2 y R4 o R3 y R5 representan un enlace;
    e isómeros del mismo;
    en forma libre o de sal.
  2. 2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el resto -CO2R13 está en la posición 4.
  3. 3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el resto -CO2R13 está en la posición 3.
  4. 4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que se selecciona del grupo que consiste en:
    ácido 4-2-[2,4,4-trimetil-1-(propan-2-il)-1,4-dihidroquinolin-6-il]etinilbenzoico, (17);
    e isómeros del mismo;
    en forma libre o de sal.
  5. 5. Un método para monitorear la diferenciación celular o la apoptosis que comprende administrar una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I y detectar la fluorescencia emitida por el compuesto mediante imágenes médicas de fluorescencia.
  6. 6. Un método para monitorear la diferenciación celular o la apoptosis mediante la formación de imágenes de la distribución de un compuesto de fórmula I mediante la detección de la fluorescencia emitida por el compuesto.
  7. 7. Un método para superponer la fluorescencia emitida por un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, con un mapa de concentración calculado a partir de las señales de dispersión Raman estimuladas de un compuesto de fórmula I para permitir la creación de un mapa de concentración de fórmula I ex vivo, in vivo o in vitro.
  8. 8. Una composición que comprende un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1 en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
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