ES2904841T3 - Secuencias para la detección e identificación de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) de tipo AEDM xv - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la detección de la presencia o ausencia de una cepa de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) de tipo xv AEDM caracterizado por que la secuencia del número de identificación secuencial 56 comprende: contactar una muestra para ser analizada sobre la presencia o ausencia de dicha cepa SARM de tipo xv AEDM caracterizada por la secuencia del número de identificación secuencial 56 con un primer cebador que hibrida con una secuencia del número de identificación secuencial 56 de extremidad derecha de un elemento CCEmec y un segundo cebador que hibrida con una secuencia orfX del número de identificación secuencial 56; siendo dichos primero y segundo cebadores de una longitud de al menos 10 nucleótidos; generándose un amplicón de dicha cepa SARM de tipo xv AEDM; y detectándose la presencia o ausencia de dicho amplicón.

Description

DESCRIPCIÓN

Secuencias para la detección e identificación de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) de tipo AEDM xv

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con nuevas secuencias de vinculación de extremidad derecha de SCCmec para la detección de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, y usos de las mismas con fines diagnósticos y/o epidemiológicos.

Descripción del estado de la técnica

La especie Staphylococcus aureus grampositiva productora de coagulasa está bien documentada como un patógeno oportunista humano (Murray et al., Eds., 1999, Manual of Clinical Microbiology, Séptima Edición, ASM Press, Washington, D.C.). Las infecciones hospitalarias causadas por S. aureus son una fuente principal de morbilidad y mortalidad. Algunas de las infecciones más comunes provocadas por S. aureus afectan a la piel, e incluyen forúnculos o diviesos, celulitis, impétigo, e infecciones post operatorias de heridas en diversas zonas. Algunas de las infecciones más serias producidas por S. aureus son bacteriemia, neumonía, osteomielitis, endocarditis aguda, miocarditis, pericarditis, cerebritis, meningitis, síndrome de la piel escaldada, y abscesos variados. El envenenamiento de la comida producido por enterotoxinas estafilocócicas es otro síndrome importante asociado con S. aureus. El síndrome de shock tóxico, una enfermedad comunitaria, ha sido también atribuido a infección o colonización con S. aureus toxigénico.

El Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) surgió en los años 80 como un grave problema clínico y epidemiológico en hospitales (Oliveira et al., 2002, Lancet Infect Dis., 2:180-9). El SARM es resistente a todos los plactamos incluyendo penicilinas, cefalosporinas, carbapenemos, y nonobactamos, que son los antibióticos más comunes usados para curar las infecciones de S. aureus. Las infecciones de SARM pueden ser tratadas solamente con antibióticos más tóxicos y más costosos, que se usan normalmente como un último recurso. En cuanto el SARM se puede extender fácilmente de paciente a paciente por vía del personal, hospitales de todo el mundo se enfrentan al problema de controlar el mismo. En consecuencia, hay necesidad de desarrollar tests de exploración o de diagnóstico rápidos y sencillos para la detección y/o identificación del SARM con objeto de reducir su diseminación y mejorar el diagnóstico y tratamiento de pacientes infectados.

La resistencia a la meticilina en el S. aureus es singular en el sentido en que se debe a la adquisición de ADN de otros estafilococos de coagulosa negativa (ECN), poniendo en cifra una proteína vinculante de penicilina (PVP) resistente al p-lactamo, supernumeraria, que asume las funciones biosintéticas de las PVP normales cuando la célula está expuesta a antibióticos p-lactamo. El S. aureus contiene normalmente 4 PVP, de los cuales las PVP 1,2 y 3 son esenciales. La PVP de baja afinidad en el SARM, denominada PVP 2a (ó PVP 2'), está cifrada por el gen cromosómico mecA y funciona como una transpéptidasa resistente al p-lactamo. El gen mecA está ausente del S. aureus sensible a la meticilina pero está ampliamente diseminado entre otras especies de estafilococos y tiene un nivel alto de reserva (Ubukata et al., 1990, Antimicrob. Agents Chemother. 34:170-172).

La determinación de la secuencia nucleótida de la zona del ADN que rodea el gen mecA desde la cepa N315 del S. aureus (aislada en Japón en 1982), llevó al descubrimiento de que el gen mecA es transportado por un elemento genético novedoso, denominado cromosoma cassette de estafilococo mec (CCEmec), que se inserta en el cromosoma. El CCEmec es un elemento genético móvil caracterizado por la presencia de reiteraciones inversas terminales y directas, un juego de genes de recombinasa específicos del lugar (ccrA y ccrB), y el gen mecA complejo (Ito et al., 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43:1449-1458; Katayama et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother.

44:1549-1555). El CCEmec está sacado precisamente del cromosoma de la cepa N315 del S. aureus y se integra en un lugar cromosómico S. aureus específico en la misma orientación a través de la función de un juego único de genes de recombinasa que comprenden ccrA y ccrB. La clonación y el análisis de secuencia del ADN que rodea el gen mecA de las cepas de SARM NCTC 10442 (habiendo sido aislada la primera cepa de SARM en Inglaterra en 1961) y 85/2082 (una cepa de Nueva Zelanda aislada en 1985) llevaron al descubrimiento de dos elementos genéticos novedosos que compartían características estructurales similares del CCEmec. Los tres CCEmec han sido denominados tipo I (NCTC 10442), tipo II (N315) y tipo III (85/2082) basándose en el año de aislamiento de las cepas (Ito et al., 2001, Antimicrob.Agents Chemother., 45:1323-1336). Hiramatsu et al. han descubierto que los ADN del CCEmec están integrados en un lugar específico en el cromosoma de S. aureus sensible a la meticilina (SASM). Fue analizada la secuencia nucleótida de las zonas que rodean los límites izquierdo y derecho del ADN CCEmec (esto es, attL y attR, respectivamente), además de los de las zonas alrededor del lugar de integración del ADN CCEmec (esto es, attBssc que es el lugar de vinculación cromosómica bacteriana para ADN CCEmec). El análisis secuencial de los lugares attL, attR attBscc revelaron que el attBscc se ubica en el extremo 3' de una novedosa estructura de lectura abierta (ELA), elaX. ElaX cifra un supuesto polipéptido amino ácido 159 que exhibe una homología secuencial con algunos polipéptidos previamente identificados de función desconocida (Ito el al, 1999, Antimicrob.Agents Chemother., 43:1449-1458). Dos tipos nuevos de CCEmec, denominados tipo IV y tipo V fueron recientemente descritos (Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemoter., 46:1147-1152, Ito et al., 2004, Antimicrob Agents Chemother. 48:2637-2651, Oliveira et al., 2001, Microb. Drug Resist., 7:349-360). El análisis secuencial de la extremidad derecha de la nueva CCEmec del tipo IV de cepas de S. aureus CA05 y 8/6-3P reveló que las secuencias eran casi idénticas sobre 2000 nucleótidos a los de la cepa N315 del tipo II CCEmec de S. aureus (Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemoter., 46:1147-1152, Ito et al., 2001, Antimicrob Agents Chemother. 45:1323-1336). A la fecha, no se dispone públicamente de los datos secuenciales de la extremidad derecha de las cepas HDE288 y PL72 del del tipo IV CCEmec de S. aureus (Oliveira et al., 2001, Microb. Drug Resist., 7:349-360).

Se han descrito procedimientos para detectar e identificar SARM, basados en la detección del gen mecA y de secuencias cromosómicas específicas de S. aureus (Saito et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33:2498-2500; Ubukata et al., 1992, J. Clin. Microbiol. 30:1728-1733; Murakami et al., 1991, J. Clin. Microbiol. 29:2240-2244; Hiramatsu et al., 1992, Microbiol. Immunol. 36:445-453). Sin embargo, por estar ampliamente distribuido el gen mecA tanto en S. aureus como en los estafilococos de coagulasa negativa, estos procedimientos no siempre son aptos para discriminar SARM con relación a CNS resistente a la meticilina (Suzuki et al., 1992, Antimicrob. Agents. Chemother. 36:429-434). Para afrontar este problema, Hiramatsu et al. desarrollaron un ensayo basado en RCP (llamado también PCR, por su equivalente en siglas en inglés), específico para SARM, que utiliza cebadores que hibridan hasta las extremidades derechas de los tres tipos de ADNs CCEmec en combinación con cebadores específicos del cromosoma S. aureus, que se corresponden con la secuencia nucleótida en el lado derecho del lugar de integración CCEmec (patente estadounidense 6.156.507, en adelante la “patente 507”). Las secuencias nucleótidas que rodean el lugar de integración CCEmec en otras especies estafilocócicas (por ejemplo, S. epidermidis y S. haemolyticus) son diferentes de las que se encuentran en S. aureus. En consecuencia, este ensayo r Cp es específico para la detección de SARM.

El ensayo RCP descrito en la “patente 507” llevó también al desarrollo de la “tipificación PEDM” (Polimorfismo de Extremidad Derecha Mec) de ADN CCEmec (Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336; Hiramatsu et al., 1996, J. Infect. Chemother. 2:117-129). El procedimiento de tipificación PEDM aprovecha el hecho de que las secuencias nucleótidas de los tres tipos de AEDM difieren en la extremidad derecha de los ADNs CCEmec adyacentes al lugar de integración entre los tres tipos de CCEmec. En comparación con el tipo I, el tipo III tiene una única secuencia nucleótida mientras que el tipo II tiene una inserción de 102 nucleótidos hasta el extremo derecho del CCEmec. El procedimiento de tipificación PEDM descrito por Hiramatsu et al. usa la siguiente nomenclatura: tipo I de CCEmec es tipo i PEDM, tipo II de CCEmec es tipo ii Pe Dm , y tipo III de CCEmec es tipo iii PEDM.

Debido a que los tipos II y IV de CCEmec tienen la misma secuencia nucleótida hasta la extremidad derecha, el procedimiento de tipificación PEDM descrito supra, no puede diferenciar el nuevo tipo IV de CCEmec descrito por Hiramasu el al. (Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152) del tipo II de CCEmec.

La expresión AEDM (también conocida como MREJ, su equivalente en siglas en inglés) se refiere a la articulación de la extremidad derecha de mec “Articulación Extremidad Derecha Mec” (en inglés, “Mec Right Extremity Junction”). Las AEDMs son de aproximadamente 1 kilobase (kb) de longitud e incluyen secuencias de la extremidad derecha de CCEmec además de ADM cromosómico bacteriano hasta la derecha del lugar de integración de CCEmec. Las cepas que fueron clasificadas como de tipos PEDM i-iii se corresponden con los tipos AEDM i-iii. Los tipos AEDM iv, v, vi, vii, viii, ix, y x han sido caracterizados previamente (Huletsky et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42:1875-1884; Solicitud de Patente Internacional PCT/CA02/00824).

Las realizaciones descritas aquí se refieren a la generación de datos secuenciales de la unión de la extremidad derecha de CCEmec que permite la detección de más cepas SARM con objeto de mejorar los ensayos NAT para la detección de SARM. Hay una necesidad de desarrollo de cebadores más omnipresentes y de sondas para la detección de más cepas SARM alrededor del mundo.

Descripción de la invención

La invención se relaciona con las realizaciones descritas en las reivindicaciones.

En esta invención se ponen a disposición procedimientos y composiciones específicas, omnipresentes y sensitivas para la determinación de la presencia y/o cantidad de ácidos nucleicos de todas las cepas de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM). Se divulgan procedimientos, composiciones y herramientas que permiten la detección y cuantificación de AEDM tipos xi-xx novedoso.

Algunos aspectos se refieren a un procedimiento para la detección de la presencia de una bacteria SARM en una muestra que incluye ácidos nucleicos bacterianos. Las cepas SARM tienen añadido ácido nucleico CCEmec que comprende un gen mecA. El CCEmec añadido hace que la bacteria SARM sea resistente a la meticilina. El CCEmec se añade al ADN bacteriano en el extremo 3' de la estructura de lectura abierta orfX, creando una articulación de extremidad derecha polimórfica (AEDM). Se proporciona al menos un cebador y/o sonda específica para cepas SARM, en el que el cebador o sonda se hibrida hasta hacerse un ácido nucleico AEDM polimórfico de AEDM tipos xi a xx. El/Los cebador/es y/o sonda/s son alineados con los ácidos nucleicos de la muestra. El cebador y/o sonda alineada indica la presencia de AEDM. Consecuentemente, en algunas realizaciones, el procedimiento puede incluir la fase de detección de la presencia y/o cantidad de sonda(s) alineada(s), o detectar la cantidad de un producto de amplificación producido por templado de los cebadores a los ácidos nucleicos de la muestra, como indicación de la presencia y/o cantidad de SARM.

En realizaciones preferidas, se proporciona más de un cebador y/o sonda. Los cebadores y/o sondas pueden alinearse con a los ácidos nucleicos AEDM bajo, sustancialmente, las mismas condiciones de templado. Los cebadores y/o sondas pueden ser al menos de 10 nucleótidos, 12 nucleótidos, 14 nucleótidos, 16 nucleótidos, 18 nucleótidos, 20 nucleótidos, 25 nucleótidos, ó 30 nucleótidos, de longitud. Las sondas y cebadores pueden ser usados conjuntamente en el mismo recinto físico o en distintos recintos físicos.

La realización incluye la fase de proporcionar una pluralidad de cebadores y/o sondas que pueden alinearse con al menos un tipo de AEDM seleccionado de los tipos xi, xii, xiii, xiv, xv, xvi, xvii, xviii, xix y xx de AEDM. En algunas realizaciones, la pluralidad de cebadores y/o sondas pueden alinearse con al menos cuatro tipos de AEDM seleccionados del AEDM tipo xi, xii, xiii, xiv, xv, xvi, xvii, xviii, xix y xx. En algunas realizaciones, los cebadores y/o sondas se alinean con cualquiera de los ácidos nucleicos de los números de indicación de secuencia: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 39, 40, 41, 42, 55 y 56. En algunas realizaciones, los cebadores y/o sondas pueden alinearse, en conjunto, con cualquiera de los tipos de AEDM xi a xx, tales como aquellos con los números de indicación de secuencia: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,25, 26, 39, 40, 41,42, 55 y 56. En algunas realizaciones, el al menos un cebador y/o sonda de entre la pluralidad de cebadores y/o sondas es apto para alinearse con cada uno de los números de indicación de secuencia: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 39, 40, 41, 42, 55 y 56. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los cebadores y/o sondas listados en la Tabla 4 se usan para detectar bacterias SARM que comprendan el siguiente ácido nucleico AEDM :

TABLA 4

Cebador/Sonda de Identificación Secuencial n° Para identificar AEDM tipo

30, 31 , 32 , 33 , 34, 44, 45 , 76 xi

30 , 31 , 32 , 33 , 35, 44 , 45, 62 xii

29 , 30 , 31 , 32 , 33, 44 , 45, 76 xiii

29 , 30 , 31 , 32 , 33, 44 , 45, 59 xiv

24 , 30 , 31 , 32 , 33, 44, 45 , 62 xv

36, 44 xvi

4, 30, 31, 32, 33, 44, 45, 62 xvii

7, 30, 31, 32, 33, 44, 45, 59 xviii

9, 30, 31, 32, 33, 44, 45, 59 xix

8, 30, 31, 32, 33, 44, 45, 59 xx

En algunas realizaciones, los cebadores y/o las sondas están expuestos a la alineación bajo condiciones astringentes más que cualquier otra cepa de tipo AEDM. Por ejemplo, en realizaciones preferentes, los números de identificación de secuencia 31, 32, 33 están dispuestos para la detección de AEDM tipos xi a xv y xvii a xx.

En realizaciones ulteriores, los cebadores y/o las sondas están dispuestos en parejas para la detección de al menos un SARM que tenga ADEM de tipos xi a xx. Consecuentemente, en algunas realizaciones, al menos una pareja de oligonucleótidos seleccionados del grupo consistente de los números de identificación secuencial: 34/45, 34/30, 34/76 y 34/44 está dispuesta para la detección del AEDM tipo xi. En otras realizaciones, al menos una pareja de oligonucleótidos seleccionados del grupo consistente de números de identificación secuencial: 35/45, 35/30, 35/62, y 35/44 está dispuesta para la detección del AEDM tipo xii. En realizaciones ulteriores, al menos una pareja de oligonucléotidos seleccionados del grupo consistente de números de identificación secuencial: 29/45, 29/30, 29/76, y 29/44 está dispuesta para la detección del AEDM tipo xiii. En otras realizaciones ulteriores, al menos una pareja de oligonucleótidos seleccionados del grupo consistente de números de identificación secuencial: 29/45, 29/30, 29/59, y 29/44 está dispuesta para la detección del AEDM tipo xiv. En otras realizaciones ulteriores, al menos una pareja de oligonucleótidos seleccionados del grupo consistente de números de identificación secuencial: 24/45, 24/30, 24/62, y 24/44 está dispuesta para la detección del AEDM tipo xv. En otras realizaciones ulteriores, al menos una pareja de oligonucleótidos seleccionados del grupo consistente de números de identificación secuencial: 36 y 44 está dispuesta para la detección del AEDM tipo xvi. En otras realizaciones ulteriores, al menos una pareja de oligonucleótidos seleccionados del grupo consistente de números de identificación secuencial: 4/45, 4/30, 4/62, y 4/44 está dispuesta para la detección del AEDM tipo xvii. En otras realizaciones ulteriores, al menos una pareja de oligonucleótidos seleccionados del grupo consistente de números de identificación secuencial: 7/45, 7/30, 7/59, y 7/44 está dispuesta para la detección del AEDM tipo xviii. En otras realizaciones ulteriores, al menos una pareja de oligonucleótidos seleccionados del grupo consistente de los números de identificación secuencial: 9/45, 9/30, 9/59, y 9/44 está dispuesta para la detección del AEDM tipo xix. En otras realizaciones ulteriores, al menos una pareja de oligonucleótidos seleccionados del grupo consistente de números de identificación secuencial: 8/45, 8/30, 8/59, y 8/44 está dispuesta para la detección del AEDM tipo xx.

En algunas realizaciones, al menos dos parejas de cebadores están dispuestas para la detección de más de un tipo de AEDM.

En otras realizaciones preferidas, los cebadores y/o sondas listados en la Tabla 5 están dispuestos de forma conjunta para detectar bacterias SARM que comprendan el siguiente ácido nucleico AEDM:

TABLA 5

Primario/Sonda de Identificación Secuencial n° Para identificar AEDM tipo

51, 30, 31, 32, 33 xi 52, 30, 31, 32, 33 xii 29, 30, 31, 32, 33 xiii 29, 30, 31, 32, 33 xiv 24, 30, 31, 32, 33 xv 36, 44 xvi 4, 30, 31, 32, 33 xvii 7, 30, 31, 32, 33 xviii 9, 30, 31, 32, 33 xix 8, 30, 31, 32, 33 xx

En realizaciones ulteriores, los procedimientos descritos supra comprenden además, el suministro de cebadores y/o sondas específicos para un tipo de AEDM determinado, y la detección de una sonda o cebador hibridado como indicación de la presencia de un determinado tipo de AEDM.

En aún otras realizaciones, se proporcionan cebadores y/o sondas específicos para los números de identificación secuencial listados en la Tabla 6 para detectar bacterias SARM que comprendan el siguiente ácido nucleico AEDM:

TABLA 6

Cebador/Sonda de Identificación Secuencial n° Para identificar AEDM tipo

17, 18, 19 xi 20 xii 15, 25, 26 xiii 16 xiv 56 xv 21 xvi 55 xvii 39, 40 xviii 41 xix 42 xx

En algunas realizaciones, los cebadores se usan en una reacción de amplificación, tal como en reacción de cadena de polimerasa (RCP) y variantes del mismo, tan como la RCP anidada y la RCP múltiple, la reacción de cadena de ligasa (RCL), la amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (ABSAN), replicación de secuencia auto -sostenida (RSAS), amplificación de desplazamiento de filamento (ADF), amplificación de fase sólida (AFS), amplificación de señal dependiente de nucleasa (ASDN), amplificación de círculo rodante (ACR), ampliación de desplazamiento de filamento anclado (ADFA), amplificación de círculo rodante (inmovilizado) de fase sólida, amplificación de replicasa de beta Q, y otras técnicas medicadas de polimerasa de ARN.

En realizaciones preferidas, se usa la RCP para amplificar los ácidos nucleicos en la muestra.

En otras realizaciones, también se proporcionan oligonucleótidos de al menos 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25 ó 30 nucleótidos de longitud que se hibridan bajo condiciones astringentes con alguno de los ácidos nucleicos de los números de identificación secuencial: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 39, 40, 41, 42, 55 y 56, y que se hibridan con uno o más AEDM de tipos seleccionados de xi a xx.

En otras realizaciones, son proporcionadas parejas de cebadores y/o sondas para la detección de SARM de todos los tipos xi a xx. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, son proporcionadas las parejas de cebadores (o sondas) listados en la Tabla 7:

TABLA 7

Primario/Sonda de Identificación Secuencial n° Para identificar AEDM tipo

34/45, 34/30, 34/76, 34/44 xi

35/45, 35/30, 35/62, 35/44 xii

29/45, 29/30, 29/76, 29/44 xiii

29/45, 29/30, 29/59, 29/44 xiv

24/45, 24/30, 24/62, 24/44 xv

36/44 xvi

4/45, 4/30, 4/62, 4/44 xvii

7/45, 7/30, 7/59, 7/44 xviii

9/45, 9/30, 9/59, 9/44 xix

8/45, 8/30, 8/59, 8/44 xx

En realizaciones ulteriores del procedimiento descrito supra, se proporcionan sondas internas que tienen secuencias nucleótidas definidas en alguno de los números de identificación secuencial: 31, 32 y 33.

En aún otras realizaciones, se usan cebadores y/o sondas usados en la detección de AEDM tipos xi a xx es combinación con cebadores y/o sondas capaces de detectar SARM de tipos i a x de AEDM, tal como por ejemplo aquellos cebadores y/o sondas divulgados en la también pendiente Solicitud de Patente Internacional PCT/CA02/00824.

Otros aspectos de la invención se refieren a secuencias nucleótidas que comprenden al menos uno de los ácidos nucleicos de los números de identificación secuencial: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 39, 40, 41, 42, 55 y 56 o el complemento de los mismos. Otras realizaciones ulteriores se refieren a fragmentos de los ácidos nucleicos de números de identificación secuencial 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 39, 40, 41, 42, 55 y 56, en los cuales los fragmentos comprenden al menos 30, 50, 100, 150, 200, 300 ó 500 nucleótidos consecutivos de los ácidos nucleicos de los números de identificación secuencial 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 39, 40, 41, 42, 55 y 56, o los complementos de los mismos. Aspectos ulteriores se refieren a vectores que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos de números de identificación secuencial: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 39, 40, 41, 42, 55 y 56, además de células huésped, tales como células huésped de Escherichia Coli, comprendiendo vectores que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos de números de identificación secuencial: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,25, 26, 39, 40, 41, 42, 55 y 56.

Aún otros aspectos se refieren a oligonucleótidos que son al menos de 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25 ó 30 nucléotidos de longitud que se alinean con cualquiera de los números de identificación secuencial: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,25, 26, 39, 40, 41, 42, 55 y 56. Por ejemplo, algunas realizaciones son oligonucleótidos que comprenden la secuencia de cualquiera de los números de identificación secuencial: 31, 32 ó 33. Aún otras realizaciones se refieren a oligonucleótidos que son al menos de 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25 ó 30 nucléotidos de longitud que dr alinean con cualquiera de los números de identificación secuencial: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,25, 26, 39, 40, 41, 42, 55 y 56.

Aún otros aspectos se refieren a conjuntos que comprenden cebadores y/o sondas. Los cebadores y/o sondas pueden ser de al menos 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25 ó 30 nucléotidos de longitud y se hibridizan con cualquiera de los ácidos nucleicos de AEDM tipo xi a xx. Realizaciones ulteriores se refieren a conjuntos que comprenden partidores y/o sondas que son de al menos 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25 ó 30 nucléotidos de longitud y se hibridizan con cualquiera de los ácidos nucleicos de números de identificación secuencial: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 39, 40, 41,42, 55 y 56. Algunas realizaciones se refieren a conjuntos que comprenden parejas de partidores. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los conjuntos comprenden las siguientes parejas de partidores:

Partidor/Sonda de identificación Secuencial n° Para identificar AEDM tipo

34/45, 34/30, 34/76, 34/44 xi 35/45, 35/30, 35/62, 35/44 xii 29/45, 29/30, 29/76, 29/44 xiii 29/45, 29/30, 29/59, 29/44 xiv 24/45, 24/30, 24/62, 24/44 xv 36/44 xvi 4/45, 4/30, 4/62, 4/44 xvii 7/45, 7/30, 7/59, 7/44 xviii 9/45, 9/30, 9/59, 9/44 xix 8/45, 8/30, 8/59, 8/44 xx

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra las articulaciones de la extremidad derecha del CCEmec. Aparecen mostradas las posiciones y orientaciones de los partidores utilizados para secuenciar los tipos novedosos de AEM xi a xx. Los números de identificación secuencial: 4, 24, 27-30, 36, 43-45, 50-57, 78-86 fueron usados para secuenciar los tipos AEDM xi, xii, xiii, xiv, xv, xvi, xvii, xviii, xix y xx. Las flechas y los números infra indican las posiciones de los partidores y sus respectivos números de identificación secuencial. La andadura indica las posiciones donde los cebadores de ADN andante - ACP (AA - ACP) del equipo DNA Walking SpeedUp (Seegene, Del Mar California) se han alineado sobre la secuencia CCEmec.

La Figura 2 muestra la articulación de la extremidad derecha del CCEmec y la posición de los cebadores (números de identificación secuencial: 4, 7-9, 24, 29-36, 44, 45, 59, 62, 73) desarrollados en la presente invención para la detección e identificación de tipos novedosos de AEDM xi, xii, xiii, xiv, xv, xvi, xvii, xviii, xix, y xx. Las medidas del amplicón están listadas en la Tabla 11. Los números entre paréntesis bajo los tipos de AEDM indican los números de identificación secuencial de AEDM. Las flechas indican las posiciones de los cebadores y los números infra indican sus respectivos números de identificación secuencial. Las barras oscuras y los números infra indican las posiciones de las sondas y sus números de identificación secuencial respectivos. La deleción en el tipo xvi de AEDM indica la posición de la deleción 269-bp en orfX.

La Figura 3 ilustra un alineamiento de múltiple secuencia de 19 tipos i a ix y xi a xx de AEDM representativo, que incluyen el orfX, la zona de integración, y los primeros 535 nucleótidos de la extremidad derecha del CCEmec. Las secuencias de los tipos i a ix de AEDM son de los números de identificación secuencial de la Solicitud de Patente Internacional pendiente PCT/CA02/00824: 1, 2, 232, 46, 50, 171, 166, 167 y 168, respectivamente. El número de identificación secuencial: 18 se corresponde con AEDM tipo xi, el número de identificación secuencial: 20 se corresponde con AEDM tipo xii, el número de identificación secuencial: 15 se corresponde con AEDM tipo xiii, el número de identificación secuencial: 16 se corresponde con AEDM tipo xiv, el número de identificación secuencial: 56 se corresponde con AEDM tipo xv, el número de identificación secuencial: 21 se corresponde con AEDM tipo xvi, el número de identificación secuencial: 55 se corresponde con AEDM tipo xvii, el número de identificación secuencial: 39 se corresponde con AEDM tipo xviii, el número de identificación secuencial: 41 se corresponde con AEDM tipo xix y el número de identificación secuencial: 42 se corresponde con AEDM tipo xx.

Realización preferente de la invención

El Staphylococcus aureus resistente a la Meticilina (SARM) supone una seria amenaza a la salud para las personas y resulta de evidencia cegadora la necesidad de procedimientos rápidos y sencillos para la detección, identificación y cuantificación del SARM.

Aquí se divulgan secuencias y disposiciones novedosas de ADN presentes en cepas de SARM que permite la detección de SARM que no eran detectables usando los procedimientos previamente disponibles. Las secuencias y disposiciones novedosas de ADN están presentes en la zona de CCEmec del ADN SARM. Las cepas de SARM comprenden una adición de CCEmec que, a su vez, comprende un gen mecA. El CCEmec es añadido en el ADN bacteriano al extremo 3' de la estructura de lectura abierta orfX. La adición del CCEmec en el ADN bacteriano crea una articulación de extremidad derecha polimórfica, llamada en lo sucesivo AEDM, correspondiente a “Articulación de Extremidad Derecha Mec”. Las zonas AEDM incluyen secuencias de la extremidad derecha CCEmec, además de ADN cromosómico adyacente a la zona de integración del CCEmec derecho. Las realizaciones de la invención se refieren a las secuencias y disposiciones novedosas de AEDM descritas en adelante, que pueden ser usadas como secuencias paternales de las cuales se derivan los cebadores y/o sondas útiles para la detección e identificación del SARM descrito infra. Otros aspectos de la invención se refieren a novedosos cebadores y/o sondas derivados de las secuencias AEDM novedosas, además de conjuntos que comprenden cebadores y/o sondas que hibridizan a tipos AEDM xi a xx, para la detección del SARM.

También se divulgan procedimientos que posibilitan la detección de la presencia o ausencia de una cepa SARM en una muestra que incluye ácidos nucleicos. Se proporciona al menos un cebador y/o sonda específico para cepas SARM y que se alinea a un ácido nucleico AEDm de tipos xi a xx, divulgado aquí. El/los cebador(es) y/o sonda(s) pueden ser templados a los ácidos nucleicos de la muestra. La detección de los cebador(es) y/o sonda(s) alineado(s) indica la presencia de un SARM del tipo ADEM que hibridiza a el/los cebador(es) y/ sonda(s).

Cebadores y Sondas

Tal como se usan de aquí en adelante, los términos “partidor” y “sonda” no se limitan a oligonucleótidos o ácidos nucleicos, sino que además abarcan moléculas análogas a nucleótidos, además de nucléotidos. Los nucléotidos y polinucléotidos serán aquí genéricos a los polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-deoxi-D-ribosa), a los poliribonucleótidos (que contienen D-ribosa), a cualquier otro tipo de polinucleótido que es N- o C-glicósido de una base de purina o pirimidina, y a otros polímeros que contienen esencias no nucleotídicas, por ejemplo, poliamida (vgr., ácidos nucleicos péptidos [ANPs] y polimorfolino [disponible en el mercado de Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oreg., como polímeros Neugene®) y otros polímeros de ácido nucleico de secuencia específica sintética, siempre que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita el emparejamiento básico y el apilamiento básico, tal como se halla en el ADN y en el ARN.

Los términos nucleótido y polinucleótido incluyen, por ejemplo, 3'-deoxi-2, 5'-ADN, oligodesoxirribonudeótido N3'-P5' fosforamidatas, ARN 2'-O-alcilosustituido, ADN de doble y de único filamento, además de ARN de doble y de único filamento, híbridos de ADN:ARN, e híbridos entre ANPs y ADN o ARN. Los términos incluyen también tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, marcas que son conocidas en la técnica, metilación, “casquetes”, sustitución de uno o más de los nucleótidos que se dan de forma natural por un análogo, modificaciones internucleótidas tales como, por ejemplo, aquellas con vinculaciones sin cargar (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriesteros, fosforamidatos, carbamatos, etc.), con vinculaciones con cargas negativas (vgr., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), y con vinculaciones con cargas positivas (vgr., aminoaclifoformidatos, aminoalcilfofotriesteros), aquellos que contienen porciones pendientes, tales como, por ejemplo, proteínas (incluyendo nucleadas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (vgr., acridina, psoralen, etc.), aquellos que contienen quelantes (vgr., metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.) , aquellos que contienen alciladores, aquellos con vinculaciones modificadas (vgr., ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), además de formas sin modificar de polinucleótidos u oligonucleótidos.

Se apreciará que los términos “nucleósido” y “nucleótido”, usados aquí, incluirán aquellas porciones que contengan no sólo las bases conocidas de purina y pirimidina, sino también otras bases heterocíclicas que han sido modificadas. Tales modificaciones incluyen purinas o pirimidinas metilatadas, purinas o pirimidinas acilatadas, u otros heterociclos. Los nucleósidos o nucleótidos modificados incluirán también modificaciones sobre la porción de azúcar, vgr., en donde uno o más de los grupos hidróxilos son reemplazados con un halógeno, un grupo alifático, o están funcionarizados como éteres, aminas, o similares. Otras modificaciones a nucleótidos o polinucleótidos implican re - organización, adición, sustitución, o la alteración de otra forma de los grupos funcionales sobre la base de pruina o pirimidina que forma vínculos de hidrógeno con una pirimidina o purina complementaria respectiva. El nucleótido o polinucleótido modificado resultante puede formar una pareja básica con otras tales unidades nucleotídicas modificadas pero no con A, T, C, G ó U. Por ejemplo, la guanosina (2-amino-6-oxi-9-beta-D-ribofuranosil-purina) puede ser modificada para formar isoguanosina (2-oxi-6-amino-9-beta-D-ribofuranosil-purina). Tal modificación resulta en una base nucleósida que no formará ya una pareja básica normalizada con citosina. Sin embargo, la modificación de citosina (1-beta-D-ribofuranosil-2-oxi-4-amino-pirimidina) para formar isocitosina (1-beta-D-ribofuranosil-2-amino-4-oxi-pirimidina) resulta en un nucleótido modificado que no se parificará básicamente con guanosina pero formará una pareja básica con isoguanosina. Las isocitosina está disponible de Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.); la isocitosina puede ser preparada por el procedimiento descrito por Switzer et al. (1993) Biochemistry 32:10489-10496 y las referencias citadas allí; La 2'-deoxi-5-metil-isocitidina puede ser preparada por el procedimiento de Tor et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467 y referencias citadas allí; Y los nucleótidos de isoguanina pueden ser preparados usando el procedimiento descrito por Mantsch et al. (1975) Biochem. 14:5593-5601, o por el procedimiento descrito en la patente estadounidense n° 5.780.610 por Collins et al. Las parejas básicas no naturales referidas como k y n, pueden ser sintetizadas por el procedimiento descrito en Piccirilli et al. (1990) Nature 343:33-37 para la síntesis de 2,6-diaminopirimidina y su complemento (1-metilpirazolo[4,3]-pirimidina-5,7-(4H,6H)-diono. Otras unidades nucleotídicas modificadas de tal manera que forman parejas básicas únicas han sido descritas en Leach et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3675-3683, o serán evidentes a los expertos en la materia.

Los cebadores y/o sondas pueden ser suministrados en cualquier forma adecuada, incluso vinculados a un soporte sólido, líquido y liofilizado, por ejemplo.

El enlace o hibridación específica de los cebadores y/o sondas a secuencias de ácidos nucleicos se lleva a cabo por hibridación específica. Se apreciará por el experto en la materia que la hibridación específica se consigue por la selección de secuencias que son, al menos, sustancialmente complementarias a la secuencia del ácido nucleico de objeto o referencia. Esto incluye el emparejamiento básico de la secuencia de ácido nucleico de objeto oligonucleótido sobre la completa longitud de la secuencia oligonucleótida. Tales secuencias pueden ser referidas como “completamente complementarias” con respecto a cada una de las otras. Mientras que un oligonucleótido es referido aquí como “sustancialmente complementario” con respecto a una secuencia de ácido nucleico, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias, o pueden formar malos emparejamientos en la hibridación, pero mantienen la capacidad de hibridar bajo las condiciones utilizadas para detectar la presencia de los ácidos nucleicos SARM.

Existe una correlación positiva entre la longitud de la sonda, por un lado, y, por otro, tanto la eficiencia y exactitud con la cual una sonda se hibridará a una secuencia objeto. En particular, las secuencias más largas tienen una temperatura de fusión más alta (Tm) que la de las más cortas, y es menos probable que se repitan dentro de una secuencia objeto dada, con lo que se minimiza la hibridación promiscua.

Los términos “Tm” y “temperatura de fusión”, tal como se usan aquí, son términos intercambiables que se refieren a la temperatura a la que el 50 % de la población de moléculas polinucleótidas de doble hebra se disocia en hebras únicas. Las fórmulas para el cálculo del Tm de polinucleótidos son conocidas en el estado de la técnica. Por ejemplo, la Tm puede ser calculada por la siguiente ecuación: Tm=69.3+0.41 x.(G+C)%-6- 50/L, en donde L es la longitud de la sonda en los nucleótidos. La Tm de un polinucleótido híbrido puede ser también estimada usando una fórmula adoptada de los análisis de hibridación en 1 M de sal, y es comúnmente usada para calcular la Tm para cebadores RCP: [(número de A+T) x 2° C (número de G+C) x 4° C]. Ver, por ejemplo, C. R. Newton et al., p Cr , Segunda edición, Springer-Verlag (Nueva York: 1997), p. 24. Otros cálculos más sofisticados existen en la técnica, que toman en cuenta características estructurales además de secuenciales para el cálculo de Tm . Un Tm calculado es meramente una estimación; la temperatura óptima se determina, comúnmente, de forma experimental.

Las secuencias de cebador o sonda con alto contenido en G+C o que comprenden secuencias palindrómicas tienden a auto - hibridarse, como lo hacen sus pretendidas zonas objeto, en cuanto la cinética de la hibridación, unimolecular más que bimolecular, resulta, generalmente, favorecida estando en una solución. Sin embargo, también es importante diseñar una sonda que contenga suficientes números de emparejamientos de nucleótidos G:C en cuanto cada pareja G:C está vinculada por tres vínculos de hidrógenos, más que los dos que se encuentran cuando las parejas básicas A y T (o A y U) se emparejan para vincular la secuencia objeto, y, en consecuencia, forma un vínculo más ajustado y más fuerte. El contenido preferente de G+C es de alrededor del 50 %.

La temperatura de hibridación varía de forma inversa con la eficiencia de la sonda que se hibrida, como lo hace la concentración de solventes orgánicos, por ejemplo, formamida, que podría ser incluida en una mezcla de hibridación, mientras que los incrementos en la concentración de sal facilitan la vinculación. Bajo condiciones rigurosas de hibridación, sondas de hibridación más largas, o cebadores de síntesis, hibridan más eficientemente de que lo hacen las más cortas, que son suficientes en condiciones más flexibles. Preferentemente, la hibridación rigurosa se lleva a cabo en un amortiguador adecuado bajo condiciones que permiten que la secuencia de ácido nucleico de referencia u objeto hibride a las sondas. Las condiciones de hibridación rigurosas pueden variar, por ejemplo, desde concentraciones salinas de menos de alrededor de 1 M, más usualmente menos de alrededor de 500 mM y preferentemente menos que alrededor de 200 mM, y las temperaturas de hibridación pueden estar en el intervalo de, por ejemplo, desde tan bajas como 0° C a más de 22 °C, más de alrededor de 30° C y, más frecuentemente, por encima de alrededor de 37° C, dependiendo de las longitudes y/o la composición de ácido nucleico de las sondas. Los fragmentos más largos pueden exigir unas temperaturas de hibridación más elevadas para la hibridación específica. Como diversos factores afectan a la rigurosidad de la hibridación, la combinación de parámetros es más importante que la medición absoluta de un factor único. “Las condiciones rigurosas de hibridación” se refieren a una o a ambas de las siguientes: a) 6 x SSC a alrededor de 45° C, seguidas de uno o más lavados en 0.2 x SSC, 0.1 % SDS a 65° C, y b) 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50° C ó 70° C durante 12-16 horas, seguidas por lavado.

En los procedimientos descritos aquí, la detección de cebadores y/o sondas hibridados pueden ser directa o indirecta. Por ejemplo, las sondas pueden ser hibridadas a la muestra que está siendo analizada, y directamente detectada. Por otro lado, los cebadores pueden ser hibridados a la muestra que está siendo analizada, seguida por una etapa de amplificación. Los productos amplificados pueden ser detectados directamente, o a través de detección de sondas que hibridan a los productos de amplificación.

En algunas realizaciones, se proporciona más de un cebador y/o sonda. Por ejemplo, algunas realizaciones hacen referencia a procedimientos para detectar una pluralidad de cepas SARM que comprenden tipos AEDM xi a xx. Una pluralidad de cebadores y/o sondas pueden ser usados en las reacciones llevadas a cabo en recintos físicamente separados o en el mismo recinto físico. El análisis de reacciones para una variedad de tipos SARM puede ser llevado a cabo de forma sucesiva o simultánea. En realizaciones donde se proporciona una pluralidad de cebadores en el mismo recinto físico, puede ser llevada a cabo una reacción PCR múltiple, con una pluralidad de oligonucleótidos, más preferentemente aquellos aptos para su hibridación con una zona objeto bajo condiciones comunes.

En algunas realizaciones, se proporciona una pluralidad de cebadores y/o sondas específicos para diferentes tipos AEDM en una reacción RCP múltiple, con tal que el tipo del AEDM pueda ser determinado. Los cebadores y/o sondas usados para la detección pueden tener diferentes marcadores, para permitir distinguir un tipo de AEDM de otro tipo de AEDM. El término “marcador”, usado aquí se refiere a entidades aptas para proporcionar una señal detectable, bien directa o bien indirectamente. Los marcadores incluyen, por ejemplo, radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina y similares.

Aunque las secuencias de los genes orfX y algunos fragmentos de ADN CCEmec están disponibles en bases de datos públicas y se han usado para desarrollar análisis basados en ADN para la detección de SARM, los datos secuenciales novedosos divulgados aquí permiten la detección de SARM de tipos AEDM xi a xx, que, hasta entonces, no habían sido detectados usando los análisis conocidos en el estado de la técnica. Estas secuencias novedosas, listadas en la Tabla 8, podrían no haber sido predichas ni detectadas por análisis RPC desarrollado con base en las secuencias AEDM conocidas de SARM (patente estadounidense 6.156.507 ; Solicitud de Patente Internacional PCT/CA02/00824; Ito el al., 2001, Antimicrob. Agentes Chemother. 45:1323-1336; Huletsky et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42:1875-1884; Ma et al, 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152; Ito el al, Antimicrob Agents Chemother., 2004. 48:2637-2651; Oliveira et al, 2001, Microb. Drug Resist. 7:349-360). En consecuencia, las novedosas secuencias AEDM mejoran los ensayos NAT actuales para el diagnóstico de SARM en cuanto permiten al experto en la materia el diseño de cebadores y sondas para la detección y/o identificación de cepas de SARM con tipos AEDM xi a xx.

Diseño y síntesis de Cebadores y/o Sondas de Oligonucleótidos

Todos los oligonucleótidos, incluyendo las sondas para hibridación y los cebadores para amplificación de ADN, fueron evaluados en cuanto a su adecuación para hibridación o amplificación de RCP por análisis de ordenador utilizando software de ordenador comercialmente disponible, tal como los programas del paquete del Grupo de Genética por Ordenador GGO Wisconsin, y el software de análisis de cebador Oligo® 6 y MFOLD 3.0. La adecuación potencial de las parejas de cebadores RCP fue evaluada también con carácter previo a su síntesis por verificación de la ausencia de características indeseadas como largas extensiones de un nucleótido y una alta proporción de residuos G ó C en el extremo 3' (Persing et al., 1993, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D.C.). Los cebadores de amplificación de nucleótidos fueron sintetizados utilizando un sintetizador automatizado de ADN (Applied Biosystems).

La secuencia de oligonucleótidos de cebadores o sondas puede derivarse de cada hebra del ADN dúplice. Los cebadores o sondas pueden consistir de las bases A, G, C ó T o análogas y pueden degenerar en una o más posiciones dadas de nucleótidos, usando un nucleótido análogo que se empareja con alguno de los cuatro nucleótidos que se dan de forma natural (Nichols et al., 1994, Nature 369:492-493). Los cebadores y las sondas pueden contener también nucleótidos análogos tales como Ácidos Nucleicos Bloqueados (ANB) (Koskin et al., 1998, Tetrahedron 54:3607-3630), y Ácidos Nucleicos Peptídicos (ANP) (Engholm et al., 1993, Nature 365:566-568). Los cebadores o las sondas pueden ser de cualquier longitud adecuada, y pueden ser seleccionados dondequiera que sea dentro de las secuencias de ADN de fragmentos propietarios, o de secuencias de bases de datos seleccionadas aptas para la detección de SARM con tipos de AEDM xi a xx. En realizaciones preferentes, los cebadores y/o sondas son de al menos 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25 o 30 nucleótidos de longitud.

Las variantes de un gen microbial objeto dado se dan de forma natural y son atribuibles a variaciones secuenciales dentro de dicho gen durante la evolución (Watson et al., 1987, Molecular Biology of the Gene, 4th ed., The Benjamin/Cummings Publishing Company, Menlo Park, CA; Lewin, 1989, Genes IV, John Wiley & Sons, New York, NY). Por ejemplo, diferentes cepas de la misma especie microbial pueden tener una sola o más variación/es nucleótida/s en la zona de hibridación oligonucleótida. El experto en la materia apreciará de inmediato la existencia de variantes de ácidos nucleicos y/o secuencias para un gen específico y que la frecuencia de las variaciones de secuencia depende de la presión selectiva durante la evolución sobre un producto genético dado. La detección de una variante de secuencia para una zona entre dos cebadores RCP puede ser conseguida mediante la secuenciación del producto de amplificación. Por otro lado, se exige, para detectar variaciones secuenciales que se superpongan a una zona de hibridación de cebadores, la amplificación y la subsiguiente secuenciación de un ADN objeto más grande con cebadores CRP fuera de dicha zona de hibridación. Puede ser usada una estrategia similar para detectar variaciones en la zona de hibridación de una sonda. Se contempla la posibilidad de otras variantes de secuencias AEDM, como lo son la variante de cebador y/o secuencias de sonda útiles para amplificación o hibridación de la variante de AEDM, siempre que la divergencia de los ácidos nucleicos y/o las secuencias determinadas o una parte de los mismos no afecte de forma significativa la sensitividad y/o especificidad y/o ubicuidad de los cebadores o sondas de amplificación.

Las secuencias de oligonucleótidos diferentes a las explícitamente descritas aquí y que son apropiadas para la detección y/o identificación de SARM pueden derivarse también de las secuencias novedosas de AEDM divulgadas aquí o de secuencias de bases de datos públicas seleccionadas. Por ejemplo, los cebadores o sondas de oligonucleótidos pueden ser más cortos, pero de una longitud de al menos 10 nucleótidos o más largo que las escogidas; pueden ser también seleccionadas de cualquier lugar entre las secuencias de AEDM divulgadas aquí o en las secuencias seleccionadas de bases de datos públicas. Además, pueden ser diseñadas variantes de los oligonucleótidos divulgados aquí. Si el ADN determinado o una variante del mismo se hibrida a un oligonucleótido dado, o si el ADN determinado o una variante del mismo pueden ser amplificada por una pareja cebadora RCP oligonucleótido dada, la inversa es también cierta; un ADN determinado dado puede hibridar a una variante de sonda oligonucleótida o ser amplificada por una variante de cebador RCP oligonucleótido. Alternativamente, los oligonucleótidos pueden ser diseñados a partir de secuencias AEDM para su uso en procedimientos de amplificación diferentes al RCP. Los cebadores y/o sondas divulgados aquí fueron diseñados mediante la determinación de secuencias genómicas de ADN que se usan como una fuente de sondas de oligonucleótidos y/o cebadores de amplificación, específicos y ubicuos, para AEDM de tipos xi a xx. Cuando un fragmento propietario o una secuencia de base de datos pública se seleccionan por su especificidad y ubicuidad, incrementa la probabilidad de que los subconjuntos de los mismos serán también específicos y ubicuos. Consecuentemente, aunque la selección y evaluación de los oligonucleótidos aptos para fines de diagnóstico exige mucho esfuerzo, es bastante posible para el experto en la materia derivar, de los fragmentos de ADN seleccionados, oligonucleótidos distintos a los listados en las Tablas 9, 10 y 11, que son aptos para fines de diagnóstico.

Los equipos de diagnóstico, cebadores y sondas divulgados aquí pueden ser usados para detectar y/o identificar SARM de AEDM tipos xi a xx, tanto en aplicaciones in vitro como in situ. Por ejemplo, se contempla que los equipos pueden ser usados en combinación con cebadores/sondas previamente descritos que detecten SARM de AEDM tipos i a x. Se contempla también que los equipos de diagnóstico, cebadores y sondas divulgados aquí puedan ser usados solos o en combinación con cualquier otro análisis apto para detectar y/o identificar microorganismos, incluyendo, pero no limitados a: cualquier análisis basado en la detección de ácidos nucleicos, cualquier inmunoanálisis, cualquier análisis enzimático, cualquier análisis bioquímico, cualquier análisis lisotípico, cualquier análisis serológico, cualquier medio de cultivo diferencial, cualquier medio de cultivo de enriquecimiento, cualquier medio de cultivo selectivo, cualquier medio de análisis específico, cualquier medio de cultivo de identificación, cualquier medio de cultivo de enumeración, cualquier mancha celular, cualquier cultivo sobre líneas celulares específicas, y cualquier análisis de infectación sobre animales.

Las muestras pueden incluir pero no se limitan a: cualquier muestra clínica, cualquier muestra medioambiental, cualquier cultivo microbiano, cualquier tejido, y cualquier línea celular.

Ampliación de ADN

En algunas realizaciones, una fase de amplificación y/o de detección sigue a la fase de hibridación. Cualquier tipo de tecnología de amplificación de ácido nucleico puede ser usada en los procedimientos descritos aquí. Ejemplos no exhaustivos de reacciones de amplificación que pueden ser usadas en los procedimientos descritos aquí incluyen, pero no se limitan a : reacción en cadena de la polimerasa (RCP), (vid. PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METh Od S AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N. Y. (1990) y PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N. Y. (Innis)), reacción de cadena de ligasa (Rc L), (Vid. Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117), amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (ABSAN), replicación de secuencia auto-sostenida (3SR) (Vid., Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874), amplificación de desplazamiento de hebra (ADH), amplificación de señal de ADN ramificado rADN, amplificación mediada por transcripción (AMT) (Vid., Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173), tecnología de sonda de ciclos (TSC), RCP anidado, RCP múltiple, amplificación de fase sólida (AFS), amplificación de señal dependiente de nucleasa (ASDN), tecnología de amplificación de círculo rodante (ACR), amplificación de desplazamiento de hebra anclada, amplificación de círculo rodante en fase sólida (inmovilizado), amplificación de replicasa Q Beta y otras técnicas de mediadas de polimerasa de ARN (vgr., NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario). Estas y otras técnicas están también descritas en Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook, Ausubel, Mullis (1987) Patentes estadounidenses números 4.683.195 y 4.683.202; Amheim (1990) C&EN 36-47; Lomell J. Clin. Chem., 35:1826 (1989); Van Brunt, Biotechnology, 8:291-294 (1990); Wu (1989) Gene 4:560; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564.

En realizaciones preferidas, se usa el RCP para ampliar los ácidos nucleicos en la muestra. Durante la amplificación de ADN por RCP, se usan dos cebadores oligonucleótidos que se enlazan respectivamente a cada hebra del ADN determinado del genoma microbiano, desnaturalizado por el calor, para ampliar de forma exponencial in vitro el ADN determinado por sucesivos ciclos termales posibilitando la desnaturalización del ADN, hibridando los cebadores y síntesis de nuevas especificaciones en cada ciclo (Persing et al., 1993, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, American Society for Microbiology, Washington, D. C.).

Los protocolos de amplificación normalizados pueden ser modificados para mejorar la eficiencia de la amplificación del ácido nucleico, incluyendo modificaciones a la mezcla reactiva. (Chakrabarti y Schutt, 2002, Biotechniques, 32:866-874; Al-Soud y Radstrom, 2002, J. Clin. Microbiol., 38:4463-4470; Al-Soud y Radstrom, 1998, Appl. Environ. Microbiol.

64:3748-3753; Wilson, 1997, Appl. Environ. Microbiol., 63:3741-3751). Tales modificaciones de la mezcla reactiva de amplificación incluyen, pero no se limitan al uso de polimerasas variadas o la adición de facilitadores de amplificación del ácido nucleico tales como betaína, BSA, sulfoxidas, proteína gp32, detergentes, cationes, y cloruro de tetrametilamonio.

Detección de Acidos Nucleicos

La detección de ácidos nucleicos amplificados puede incluir cualesquiera tecnologías en tiempo real o post -ampliación conocidos por los expertos en la materia. Clásicamente, la detección de productos de ampliación RCP se lleva a cabo por electrofóresis normalizada de gel de agarosa coloreado con bromuro de etidio, sin embargo, el experto en la materia apreciará en seguida que pueden ser usados otros procedimientos para la detección de productos específicos de ampliación, que pueden ser más rápidos y más prácticos para el diagnóstico rutinario, tal como los descritos en la solicitud de patente pendiente WO 01/23604 A2. La detección de Amplicon puede ser llevada a cabo también por soporte sólido o hibridación líquida usando sondas de ADN interno de especie específica que se hibridan a un producto de ampliación. Tales sondas pueden ser generadas de cualquiera de las secuencias del repertorio de ácidos nucleicos AEDM divulgados aquí, y diseñadas para hibridar específicamente a la ampliación de ADN. Alternativamente, los amplicons pueden estar caracterizados por su secuenciación. Vid. la patente pendiente, solicitud WO 01/23604 A2 para ejemplos de procedimientos de detección y secuenciación.

Otros ejemplos no limitativos de tecnologías de detección de ácido nucleico que pueden ser usadas en las realizaciones divulgadas aquí incluyen, pero no se limitan, al uso de procedimientos basados en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (TERF) tales como la hibridación adyacente de sondas (incluyendo los procedimientos sonda - sonda y sonda - cebador) (Vid., J. R. Lakowicz, “Principles of Fluorescence Spectroscopy”, Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York, 1999), tecnología de sonda TaqMan (Vid., Patente Europea Ep 0543942), tecnología de sonda de baliza molecular (Vid. , Tyagi et al., (1996) Nat. Biotech. 14:303-308.), tecnología de sonda Scorpion (Vid. Thewell (2000), Nucl.Acids Res. 28:3752), tecnología de sonda de nanopartícula (Vid., Elghanian et al., (1997) Science 277:1078-1081) y tecnología de sonda Amplifluor (Vid., Patentes Estadounidenses números 5.866.366; 6.090.592; 6.117.635; y 6.117.986).

En realizaciones preferidas, las balizas moleculares son utilizadas en la detección post - ampliación de los ácidos nucleicos determinados. Las balizas moleculares son oligonucleótidos de una sola hebra que, a menos que estén enlazados a su objetivo, existen con una configuración de horquilla. El extremo 5' del oligonucleótido contiene un tinte fluorescente. Un tinte amortiguador está adosado al extremo 3' del oligonucleótido. Cuando la baliza no está enlazada a su objetivo, la estructura de horquilla posiciona el fluoróforo y el amortiguador en una proximidad cercana, de tal manera que no puede ser observada ninguna fluorescencia. Una vez que la baliza se hibrida con su objetivo, sin embargo, la estructura de horquilla se rompe, separándose, en consecuencia, el fluoróforo y el amortiguador y permitiendo la detección de la fluorescencia (Vid., Kramer FR., 1996, Nat Biotechnol 3:303-8). Otros procedimientos de detección incluyen la detección de ácidos nucleicos genéticos específicos por medio de procedimientos inmunológicos, procedimientos de hibridación de fase sólida sobre filtros, microplaquetas o cualquier otro soporte sólido. En estos sistemas, la hibridación puede ser monitorizada por cualquier procedimiento apto conocido por los expertos en la materia, incluyendo fluorescencia, quimiluminiscencia, potentiometría, espectometría masiva, resonancia de plasmón, polarimetría, colorimetría, citometría de flujo o escanometría. La secuenciación nucleótida, incluyendo la secuenciación por terminación de dideóxido o secuenciación por hibridación (por ejemplo, secuenciación utilizando una microplaqueta de ADN) representa otro procedimiento para detectar y caracterizar los ácidos nucleicos de genes determinados.

Ácidos nucleicos AEDM

Los fragmentos de AEDM divulgados aquí fueron obtenidos como un repertorio de secuencias creado por la ampliación de ácidos nucleicos SARM con cebadores novedosos. Los cebadores de ampliación y secuenciación, el repertorio de secuencias de AEDM, y las secuencias de oligonucleótidos derivadas de ahí, para propósitos de diagnóstico, divulgadas en las Tablas 8-11, son ulteriores objetos de esta invención.

Otros aspectos de la invención se relacionan con los ácidos nucleicos, en particular con las secuencias de ácidos nucleicos de fragmentos de ADN de articulación de extremidad derecha CCEmec (AEDM), incluyendo secuencias de extremidad derecha CCEmec y ADN cromosómico a la derecha de la zona de integración de CCEmec en los tipos SARM xi a xx. Algunas realizaciones se relacionan con las secuencias parentales de tipos AEDM xi a xx de los cuales se derivan cebadores y/o sondas específicos para la cepa AEDM tipo xi a xx. Así, algunas realizaciones se relacionan con la secuencia nucleótida de identificación secuencial números: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,25, 26, 39, 40, 41,42, 55 ó 56 o su complemento. Otras realizaciones se relacionan con fragmentos y oligonucleótidos de ADN tales como cebadores y sondas. Por ejemplo, algunas realizaciones se refieren a ácidos nucleicos que comprenden al menos 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700 u 800 nucleótidos consecutivos de los ácidos nucleicos de la identificación secuencial número: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,25, 26, 39, 40, 41, 42, 55 ó 56.

El alcance de esta invención no se limita al uso de la ampliación por RCP, sino que también incluye el uso de cualquier procedimiento de ampliación de ácido nucleico o cualquier otro procedimiento que pueda ser usado para incrementar la sensitividad y/o la rapidez de análisis de diagnóstico basados en el ácido nucleico. El ámbito de la presente invención también incluye el uso de cualquier tecnología de detección y ampliación de ácidos nucleicos que incluya tecnologías de detección en tiempo real o post ampliación, cualquier tecnología de ampliación combinada con detección, cualesquiera microplaquetas (“chips”) de hibridación de ácido nucleico o tecnologías de formación, cualesqui era microplaquetas (“chips”) de ampliación o combinación de tecnologías de microplaquetas (“chips”) de ampliación y de hibridación. La detección e identificación por cualquier procedimiento de secuenciación nucleótida está también bajo el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1: Evaluación de Análisis de Ampliación de Diagnóstico de SARM previamente descrito

Inicialmente, la literatura enseñaba que, entre las cepas de SARM, se encontraban cinco tipos de secuencias de extremidad derecha CCEmec (CCEmec de tipos I-V), basadas en homología de secuencia de ADN (Vid., Ito et al., 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43:1449-1458; Katayama et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44: 1549­ 1555; Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336; Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother.

46:1147-1152; Ito et al, 2004, Antimicrob. Agents Chemother. 48:2637-2651). Los ADNs CCEmec se integran en una zona específica del cromosoma de un Staphylococcus aureus sensible a la meticilina (SASM), llamado orfX. Generalmente, cada tipo de CCEmec tiene una única secuencia nucleótida en la extremidad derecha del cassette CCEmec. La excepción a esta regla se ve con los CCEmec tipos II y IV, que exhiben una secuencia prácticamente idéntica sobre 2000 nucleótidos. Sin embargo, el CCEmec tipo II tiene una inserción de 102 nucleótidos hasta el término derecho del CCEmec tipo I. Las cepas clasificadas como CCEmec tipos I - III se encuentran bajo la categoría de tipos de AEDM tipos i -iii.

Analizamos recientemente las zonas de AEDM de varias cepas SARM. Describimos siete secuencias nuevas en la articulación de la extremidad derecha del CCEmec de SARM a las que llamamos AEDM tipos iv, v, vi, vii, viii, ix y x (Huletsky et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42: 1875-1884; Solicitud de Patente Internacional PCT/CA02/00824).

Diseñamos un análisis RCP múltiple, específico para SARM, en tiempo real, con cebadores que se dirigen a la parte del CCEmec de AEDM tipos i, ii, iii iv, v y vii, con una primer direccionamiento al S. aureus orfX. Fueron usadas tres sondas de baliza molecular (SBMs) específicas para la secuencia orfX para la detección de todos los polimorfismos secuenciales identificados en esta zona de la secuencia orfX (Huletsky et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42:1875-1884). Fueron usados en la reacción RCP el oligonucleótido del número de identificación secuencial: 30, que hibrida al S. aureus orfX y los oligonucleótidos de los números de identificación secuencial: 36, 70, 71, 72 y 74, que hibridan a la parte del CCEmec de AEDM tipos i, ii, iii iv, v y vii. Fueron usados como sondas oligonucleótidos de números de identificación secuencial: 31, 32 y 33, que hibridan al S. aureus orfX. La especificidad y ubicuidad (esto es, la aptitud para detectar todas o la mayor parte de las cepas SARM) del análisis RCP fue verificada usando un panel de 569 cepas de referencia y clínicas de S. aureus sensible a la meticilina (SASM) y 1657 cepas diferentes de SARM de 32 países diferentes y que incluyen renombrados clones epidémicos.

En la Tabla 1 se presenta una lista de las cepas analizadas y utilizadas para construir los repertorios de ácidos nucleicos AEDM y oligonucleótidos derivados de los mismos divulgados aquí. Los aislados clínicos de S. aureus usados en esta invención son parte de la colección del programa SENTRY y las colecciones de diversos suministradores. Estas cepas de referencia o aislados clínicos de S. aureus tienen su origen en 32 países: países africanos (=15), Albania (=2), Argentina (n=50), Australia (n=71), Austria (n=2), Bélgica (n=10), Brasil (n=78), Canadá (n=607), Chile (n=42), China (n=70), Dinamarca (n=33), Egipto (n=1), Finlandia (n=12), Francia (n=50), Alemania (n=47), Grecia (n=7), Irlanda (n=5), Israel (n=19), Italia (n=61), Japón (n=62), México (n=1), Países Bajos (n=179), Polonia (n=33), Portugal (n=24), Singapur (n=20), Eslovenia (n=12), España (n=31), Suecia (n=10), Suiza (n=13), Turquía (n=28), Reino Unido (n=22) y Estados Unidos (n=528). La confirmación de la identificación de las cepas estafilocócicas fue llevada a cabo por medio del uso del sistema del Combo 13 Breakpoint tipo positivo del Panel MicroScan WalkAway® cuando se necesitó (Dade Behring Canada, Inc., Mississauga, Ontario, Canada). Cuando se necesitó, la identidad fue reconfirmada por análisis RCP usando cebadores específicos de S. aureus e cebadores específicos de mecA (números de identificación secuencial: 50, 60, 61,63) (Martineau et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44:231-238). Los datos del análisis se presentan en la Tabla 2.

Entre las 569 cepas SASM analizadas, 26 cepas fueron erróneamente identificadas como SARM, basándose en el análisis RCP. De las 1657 cepas SARM analizadas, 1640 fueron específicamente detectadas con el análisis RCP, mientras que 23 de estas cepas SARM, representando una amplia variedad de orígenes, no fueron detectadas por el análisis. Así, fue verificada la especificidad y ubicuidad (esto es, la aptitud para detectar todas las cepas SARM o la mayoría de las mismas) de este análisis RCP. Se ha demostrado previamente que cuatro de estas 23 cepas SARM, CCRI-9208, CCRI-9770, CCRI-9681, y CCRI-9860, que no fueron detectadas en el análisis supra, albergan AEDM de los tipos vi, viii, ix, y x, respectivamente (Solicitud de Patente Internacional PCT/CA02/00824).

Las 19 cepas SARM restantes que no fueron detectadas en el análisis fueron analizadas posteriormente. Fue llevada a cabo la RCP sobre el ADN genómico de cada cepa, usando un cebador orientado a la secuencia en la extremidad derecha CCEmec del AEDM de los tipos vi, viii ó ix en combinación con un cebador orientado al S. aureus orfX. Específicamente, cada reacción RCP contenía el oligonucleótido del número de identificación secuencial:65, que hibrida al AEDM tipo vi, el oligonucleótido del número de identificación secuencial:75, que hibrida al AEDM tipo viii, el oligonucleótido del número de identificación secuencial:29, que hibrida al AEDM tipo ix, en combinación con el oligonucleótido del número de identificación secuencial:30, que es un cebador específico de S. aureus. El AEDM tipo x había mostrado previamente tener una supresión de orfX completo y una parte de la extremidad derecha del CCEmec tipo II (Solicitud de Patente Internacional PCT/CA02/00824). En consecuencia, el oligonucleótido del número de identificación secuencial:77, que hibrida a ofr22 en el cromosoma S. aureus, y el oligonucleótido del número de identificación secuencial:73, que hibrida al ofr27 ubicado en el CCEmec tipo II fueron usados en una reacción RCP para detectar AEDM tipo x. Dos de las 19 cepas, CCRI-11879 y CCRI-12036 mostraron alojar AEDM tipo ix con estos cebadores RCP. Sin embargo, 17 cepas SARM no fueron detectadas con cebadores orientados a AEDM tipos vi, viii, ix, y x, sugiriendo que estas cepas alojan nuevos tipos AEDM (tablas 2 y 3).

Ejemplo 2: Secuenciación de Tipos Novedosos de AEDM de SARM

Para caracterizar ulteriormente la zona de AEDM de las 17 cepas SARM de las que el ADN no fue amplificado con cebadores que permiten la detección de AEDM tipos i a x, fue determinada la secuencia nucleótida de AEDM para 15 de estas 17 cepas SARM. En primer lugar, fueron usados conjuntamente un cebador que hibrida a mecA (número de identificación secuencial: 50) y un cebador que hibrida el extremo 5' de orfX (número de identificación secuencial: 44) en una reacción RCP para amplificar fragmentos AEDM de SARM. La estrategia usada para seleccionar estos cebadores se ilustra en la Figura 1. Fueron llevadas a cabo cuatro reacciones RCP idénticas, cada una de ellas conteniendo 100 ng de ADN genómico purificado. Cada reacción RCP contenía amortiguador de polimerasa de ADN IX HERCULASA® (Stratagene, La Jolla, CA), 0.8 pM de cada uno de los oligonucleótidos de números de identificación secuencial: 44 y 50, 0.56 mM de cada uno de los cuatro dNTPs y 5 unidades de polimerasa de ADN HERCULASA® (Stratagene, La Jolla, CA) con 1 mM MgCh en un volumen final de 50 pl. Las reacciones de RCP fueron sometidas a ciclaje usando un ciclador térmico normalizado (PTC-200 de MJ Research Inc.), tal como sigue: 2 minutos a 92° C seguidos de 35 ó 40 ciclos de 10 segundos a 92° C para la fase de desnaturalización, 30 segundos a 55° C para la fase de hibridación y 15 minutos a 68° C para la fase de extensión.

Las cuatro reacciones RCP fueron utilizadas de forma conjunta. 10 pL de la reacción RCP fueron redisueltos por electrofóresis en un gel de agarosa al 0.7 % que contenía 0.25 pg/mL de bromuro de etidio. Los amplicones fueron visualizados entonces con un dispositivo Alpha-Imager (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA) mediante la exposición a radiación ultravioleta a 254 nm. La mezcla amplificada por RCP restante (150-200 pl, en total) fue redisuelta también por electrofóresis en un gel de agarosa 0.7 % y visualizada por tintura con azul de metileno (Flores et al., 1992, Biotechniques, 13:203-205).

De las 15 cepas analizadas, las ocho siguientes produjeron resultados de amplificación en el intervalo de 12-20 kb de longitud con números de identificación secuencial: 44 y 50 como cebadores: Cc RI-11976, CCRI-11999, CCRI-12157, CCRI-12198, CCRI-12199, CCRI-12719, CCRI-9887, CCRI-9772. Los productos de amplificación fueron extraídos del gel de agarosa y purificados usando el equipo de extracción de gel QIAquick® (QIAGEn Inc., Valencia, CA). Los fragmentos de ADN purificados de gel fueron usados directamente en reacciones de secuenciación. Ambas cepas de los productos de amplificación AEDM fueron secuenciados por el procedimiento de secuenciación de terminación de la cadena de dideoxinucleótido usando un secuenciador de ADN automatizado de la empresa Applied Biosytems (modelo 377 ó 3730xl) con su equipo de reacción preparado para secuenciación de ciclo terminador Big Dye® (Applied Biosystems, Foster City, CA). Fueron usados 425-495 ng de los amplicones purificados de gel en reacciones de secuenciación con número de identificación secuencial: 44, que fue usado para la reacción de amplificación. Basándose en la información secuencial generada de las reacciones con número de identificación secuencial: 44, los cebadores de secuenciación interna fueron diseñados y usados para obtener datos secuenciales de ambas cepas para una parte más grande de cada preparación de amplicón. Específicamente, los oligonucleótidos de números de identificación secuencial:43 y 45 fueron usados para secuenciar las cepas SARM CCRI-11976 y CCRI-11999; los números de identificación secuencial:43, 45 y 51 fueron usados para secuenciar cepas SARM CCRI-12157, CCRI-12198, y CCRI-12199; los números de identificación secuencial 43, 45 y 52 fueron usados para secuenciar cepa SARM CCRI-12719; el número de identificación secuencial:24 fue usado para secuenciar la cepa SARM CCRI-9887, y los números de identificación secuencial: 4, 45 y 57 fueron usados para secuenciar la cepa SARM CCRI-9772 (Figura 1, Tablas 9 y 11). Las secuencias de las 8 cepas descritas en la Tabla 3 se presentan como números de identificación secuencial: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 55 y 56 (tabla 8).

Para asegurarse de que la secuencia determinada no contenía errores atribuibles a la secuenciación de artefactos de RCP, fueron secuenciadas, como se describe supra, dos preparaciones independientes de los productos de amplificación AEDM purificados de gel, originados de dos amplificaciones independientes RCP. Para fragmentos más específicos, las secuencias determinadas para ambas preparaciones de amplicón fueron idénticas. Adicionalmente, las secuencias de ambas cepas fueron complementarias al 100 %, confirmando en consecuencia la alta exactitud de la secuencia determinada. Las secuencias AEDM determinadas usando la estrategia supra, se describen en el Listado de Secuencias y en la Tabla 8.

Una serie diferente de cebadores oligonucleótidos (descritos en Oliviera et al.) fue usada para analizar ulteriormente las 17 cepas SARM que no produjeron productos de amplificación con cebadores para la detección de AEDM tipos ivii (Oliveira y de Lencastre. 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46:2155-2161). Dos cepas (CCRI-12382 y Cc RI12383), alojaban CCEmec tipo III y contenían secuencias específicas del complejo ^ ccr. Otra cepa, (CCRI-12845), aloja CCEmec tipo II.

Para determinar las secuencias AEDM de las cepas CCRI-12382 y CCRI-12383, se usó un cebador orientado a la secuencia compleja ^ ccr ubicada en el CCEmec tipo III (número identificación secuencial: 27) en combinación con un cebador orientado al 5' extremo de orfX (número identificación secuencial: 44) para amplificar fragmentos AEDM de estas dos cepas SARM (Tabla 10 y Figura 1). Fueron llevadas a cabo cuatro reacciones RCP idénticas, cada una de ellas conteniendo 100 ng de ADN genómico purificado. Cada reacción RCP contenía amortiguador de polimerasa de ADN 1X HERCULASA® (Stratagene, La Jolla, CA), 0.8 pM de cada uno de los dos cebadores (números de identificación secuencial: 27 a 44), 0.56 mM de cada uno de los cuatro dNTPs y 5 unidades de polimerasa de ADN HERCULASA® (Stratagene, La Jolla, CA) con 1 mM MgCh en un volumen final de 50 pl. Las reacciones RCP fueron cicladas utilizando un ciclador térmico normalizado (PTC-200, de MJ Research Inc., Watertown, MA), tal como sigue: 2 minutos a 92° C seguidos por 35 ciclos de 10 segundos a 92° C durante la etapa de desnaturalización, 30 segundos a 55° C durante la etapa de hibridación y 15 minutos a 68° C durante la etapa de extensión.

Las reacciones RCP fueron utilizadas de forma conjunta y 10 pl de la mezcla amplificada por RCP fueron re - disueltos por electrofóresis en un 0.7 % de gel de agarosa conteniendo 0.25 pg/ml de bromuro de etidio. Los amplicones fueron visualizados entonces con un dispositivo Alpha-Imager (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA) mediante la exposición a radiación ultravioleta a 254 nm. La mezcla amplificada por RCP restante (150-200 pl, en total) fue re -disuelta también por electrofóresis en un gel de agarosa 0.7 % y visualizada por tintura con azul de metileno como se describió supra. Para estas dos cepas SARM, se obtuvo un producto de amplificación de 8 kb. Los productos de amplificación de RCP fueron extirpados del gel de agarosa y purificados como se describe supra. El r Cp fue usado entonces directamente en el protocolo de secuenciación tal como se describió supra. El fragmento de ADN purificado de gel fue usado entonces en el protocolo de secuenciación descrito supra. Las reacciones de secuenciación fueron llevadas a cabo con el uso del número de identificación secuencial: 44 (también usado en la reacción de amplificación) y 425-495 mg de los amplicones purificados de gel para cada reacción. Subsiguientemente, fueron usados diferentes conjuntos de cebadores de secuenciación interna para obtener datos secuenciales de ambas cepas y para una parte mayor del amplicón (números de identificación secuencial: 28, 30 y 43) (Figura 1, Tablas 9 y 11). La secuencia de las cepas SARM CCRI-12382 y CCRI-12383 descritas en la Tabla 3 que fueron secuenciadas utilizando esta estrategia son designadas números de identificación secuencial: 25 y 26, respectivamente (Tabla 8).

Para secuenciar el fragmento AEDM de cepa CCRI-12845 (CCEmec tipo II) fue llevada a cabo amplificación RCP utilizando el oligonucleótido de número de identificación secuencial:44, que híbrida el extremo 5' de orfX en combinación con el oligonucleótido de número de identificación secuencial: 53, que hibrida la extremidad derecha CCEmec del AEDM tipo ii. Fue transferido 1 pl de una preparación de ADN genómico purificado directamente al interior de 4 tubos que contenían 39 pl de una mezcla reactiva RCP. Cada reacción RCP contenía 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 0.1 % Triton X-100, 2.5 mM MgCl² , 0,4 pM de cada uno de los nucleótidos de número de identificación secuencial: 44 y 53, 200 pM de cada uno de los cuatro dNTPs, 3.3 pg/ pl de BSA (Sigma-Aldrich Canada Ltd.) y 0.5 unidades de polimerasa de ADN Taq (Promega, Madison, WI) emparejada con anticuerpo TaqStart® (BD Biosciences, San Jose, CA). Las reacciones RCP fueron llevadas a cabo usando un termociclador normalizado (PTC-200, de MJ Research Inc., Watertown, MA), tal como sigue: 3 minutos a 94° C seguidos por 40 ciclos de 5 segundos a 95° C para la etapa de desnaturalización, 1 minuto a 58° C para la etapa de hibridación y 1 minuto a 72° C para la etapa de extensión. Un producto de amplificación de 4.5 kb se obtuvo con esta primera serie.

Los productos de amplificación fueron puestos de forma conjunta y10 pl de la mezcla fueron re - disueltos por electrofóresis en un gel de agarosa al 1.2 % que contenía 0.25 pg/ml de bromuro de etidio. Los amplicones fueron visualizados entonces con el dispositivo Alpha-Imager. El tamaño del amplicón fue estimado por comparación con un 1 kb de peso molecular de escala (Life Technologies, Bethesda, MD). La mezcla amplificada de RCP restante (150 pl, total) fue también re - disuelta por electrofóresis en 1.2 % de gel de agarosa y visualizada por tintura con azul de metileno tal y como se describió supra. La reacción RCP produjo 1.2 kb de producto de amplificación. La parte correspondiente a este producto específico de amplificación fue separada del gel de agarosa y purificada como se describió supra. El fragmento de ADN purificado de gel fue usado entonces directamente en el protocolo de secuenciación tal y como se describió supra. Las reacciones de secuenciación fueron llevadas a cabo usando los oligonucleótidos de números de identificación secuencial: 44 y 53 además de un cebador interno (número identificación secuencial: 54) y 10 ng/100 bp por reacción de los amplicones purificados de gel (Figura 1, Tabla 10). La secuencia AEDM de la cepa CCRI-12845 es designada como número de identificación secuencial:21 (Tabla 8).

Para determinar las secuencias de AEDM de las cuatro últimas cepas SARM (CCRI-12524, CCRI-12535, CCRI-12810 y CCRI-12905), el oligonucleótido de número de identificación secuencial:44 fue usado en combinación con cada uno de los cuatro cebadores ACP de “ADN caminante” (ACP-AC) del equipo de secuenciación DNA WALKING SPEED UP® (Seegene, Del Mar, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante sobre un termociclador PTC-200. El sistema de cebador ACP-AC (Tecnología DW ACP-PCR®) le permite a uno obtener hasta 2 kb de producto genuino de orientación desconocida. Un primer producto de amplificación obtenido con un de los cebadores ACP-AC fue purificado usando el equipo de purificación RCP QIAQUIK® (QIAGEN Inc., Valencia, CA). El producto RCP purificado fue re - amplificado usando el cebador ACP-AC-N en combinación con el oligonucleótido de número de identificación secuencial:30 que hibrida al orfX bajo condiciones RCP recomendadas por el fabricante. Las mezclas de RCP amplificado de 4 diferentes reacciones de 50-pL RCP fueron puestas de forma conjunta y re - disueltas por electrofóresis en un gel de agarosa al 1.2 %. Los amplicones fueron visualizados entonces por tintura con azul de metileno como se describió supra. El tamaño del amplicón fue estimado por comparación con un 1 kb de peso molecular de escala. Se obtuvo un producto de amplificación de 1.5 a 3 kb. El producto de amplificación fue extraído del gel de agarosa y purificado como se describió supra y el ADN fue usado entonces directamente en el protocolo de secuenciación según se describió supra. En las reacciones de secuenciación usando los oligonucleótidos de número de identificación secuencial: 30 y ACP-AC-N fueron usados 10 ng de ADN purificado por cada 100 bp del amplicón. Las secuencias AEDM de cepas SARM CCRI-12524, CCRI-12535, CCRI-12810, y CCRl-12905 (descritas en la Tabla 3) son designadas con números de identificación secuencial: 39, 40, 41 y 42 (Tabla 8).

Las cepas CCRI-12376 y CCRI-12593 descritas en la Tabla 3 no fueron secuenciadas sino caracterizadas usando cebadores RCP y se mostró que contenían AEDM tipo xiii usando cebadores de amplificación específicos.

Ejemplo 3: Análisis Secuencial de Tipos Novedosos xi - xx de AEDM

Las secuencias obtenidas para 15 de las 17 cepas no amplificables por los cebadores específicos de SARM que detectan los tipos de AEDM i a x previamente descritos fueron comparadas con las secuencias disponibles de bases de datos públicas. En todos los casos, excepto en la cepa SARM CCRI-12845, la parte de orfX de la secuencia AEDM tenía una identidad cercana al 100 % a las secuencias disponibles públicamente del orfX. CCRI-12845 tiene una deleción en orfX (número de identificación secuencial: 21) (descrita infra). Mientras que la parte orfX de la mayoría de los fragmentos de AEDM (números de identificación secuencial: 15-20, 25-26, 39-42, 55-56) compartían casi el 100 % de identidad con las secuencias de S. aureus orfX públicamente disponibles, con la excepción de la cepa CCRI-12845, la secuencia de ADN en la extremidad derecha del propio CCEmec mostró ser diferente de los de los tipos de AEDM i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii, ix y x (Solicitud de Patente Internacional PCT/CA02/00824; patente estadounidense 6.156.507). La secuencia de ADN en la extremidad derecha del CCEmec de CCRI-12845 fue similar a la del tipo ii de AEDM (vid. Infra). Así, se informa aquí de diez tipos secuenciales novedosos de AEDM: tipos xi a xx de AEDM.

Las secuencias en la extremidad derecha de CCEmec obtenidas de las cepas CCRI-12157, CCRI-12198, y CCRI-12199 (números de identificación secuencial: 17, 18 y 19) fueron casi idénticas entre sí, y diferentes de aquellas de los tipos de AEDM i, ii, iii, iv, v, vi, vii, viii, ix y x (Ito el al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336; Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152, Huletsky et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42:1875-1884, Solicitud de Patente Internacional PCT/CA02/00824, Patente estadounidense 6.156.507). Estas nuevas secuencias fueron designadas como AEDM tipo xi (números de identificación secuencial: 17-19). Una búsqueda BLAST® reveló que las primeras 86 bp de la parte CCEmec del tipo xi de AEDM exhibió un 87 % de identidad con una secuencia desconocida de Staphylococcus epidermis de cepa SR1 (número de accesión de GenBank AF270046). El resto de la secuencia de AEDM mostró ser única, sin exhibir una homología significativa con ninguna secuencia publicada.

La secuencia obtenida en la extremidad derecha del CCEmec de la cepa CCRI-12719 (número de identificación secuencial: 20) era diferente de los tipos i a x de AEDM, además del AEDM tipo xi. El nuevo tipo AEDM fue designado como AEDM tipo xii. Al compararla con las secuencias GenBank usando BLAST®, la secuencia en la extremidad derecha de CCEmec del tipo xii AEDM exhibió un 100 % de identidad con la secuencia encontrada en la extremidad derecha del CCEmec tipo V recientemente descrita (Ito et al., 2004, Antimicrob. Agents. Chemother. 48:2637-2651; número de accesión de GenBank AB121219). La secuencia también exhibió un 85 % de identidad con una zona 212-nucleótida de la secuencia proteínica vinculante de GTP putativa RP62a de Staphylococcus epidermis.

Las secuencias en la extremidad derecha del CCEmec obtenido de las cepas CCRI-11976, CCRI-12382, y CCRI-12383 (números de identificación secuencial: 15, 25, y 26) fueron en un 100 % idénticas entre sí, diferentes de los tipos i a x de AEDM además de los tipos xi y xii de AEDM. Las nuevas secuencias AEDM fueron designadas como AEDM tipo xiii (números de identificación secuencial: 15, 25, y 26).

La secuencia dentro de la extremidad derecha del CCEmec obtenido de la cepa CCRI-11999 (número de identificación secuencial:16) fue algo diferente de los tipos i a x de ADEM al igual que de los tipos xi, xii y xiii de AEDM, y, en consecuencia, fue designado como AEDM tipo xiv. Una búsqueda BLAST® de las secuencias tipos xiii y xiv de AEDM mostró que una parte del CCEmec de estos dos tipos de AEDM fue idéntico al del tipo ix AEDM. Ciertamente, las partes de CCEmec de los tipos ix y xiv de AEDM fueron precedidas por una y por dos inserciones de 102 bp consecutivas, respectivamente, cuando se las comparó con el tipo xiii de AEDM. El resto de las secuencias tipos ix, xiii, y xiv de AEDM fueron en un 99.9 % idénticas entre sí. Estas secuencias exhibieron identidades en el intervalo del 97 % al 100 % (para los resultados más elevados de BLAST) con las zonas no contiguas (en tamaños que varían de 1535 a 1880 nucleótidos) del cassete SCC sin un mecA que aloje los genes de recombinasa cromosómica de la cepa susceptible a la meticilina S. epidermidis ATCC 12228 (Accesión número BK001539 de GenBank). La secuencia de la inserción de 102-pb fue idéntica en 99-100 % a la encontrada en el tipo ii AEDM.

La secuencia obtenida dentro de la extremidad derecha del CCEmec de la cepa CCRI-9887 fue diferente de los tipos i a x de AEDM además de los tipos xi a xiv de AEDM y, en consecuencia, fue designada como AEDM tipo xv (número de identificación secuencial: 56). Una búsqueda BLASt de la secuencia obtenida dentro de la parte CCEmec del tipo xv de AEDM reveló que este fragmento de ADN exhibió identidades en el intervalo del 92 % al 96 % (para los resultados más altos del BLAST), con secuencias no contiguas (en tamaños que varían de 342 a 618 nucleótidos) del cassette SCC (que no contiene mecA) de la cepa S. aureus susceptible a meticilina M (Accesión número U10927 al GenBank). Aunque la secuencia del tipo xv de AEDM ha sido descrita, la localización de esta secuencia más debajo de orfX en una cepa SARM no ha sido descrita hasta este momento. La secuencia de AEDM CCRI-9887 también exhibió un 94 % de identidad con una zona 306-nucleótida de la cepa Staphylococcus Haemolyticus JCSC1435 ubicada cerca de la secuencia orfX.

La secuencia obtenida para AEDM de la cepa CCRI-12845 (número de identificación secuencial: 21) reveló que el fragmento AEDM de esta cepa tiene una deleción de nucleótidos 165 a 434 de orfX (fragmento 269-bp), mientras que la secuencia en la extremidad derecha de CCEmec (328 nucleótidos) tenía identidades en el intervalo de 99.8 al 100 % con las del tipo ii de AEDM disponible en bases de datos públicas. Aunque la secuencia AEDM obtenida de esta cepa exhibió un alto nivel de identidad con secuencias AEDM conocidas, la presencia de una deleción 269-bp en orfX nunca había sido descrita hasta la fecha. Como uno de los oligonucleótidos usados en el análisis de amplificación RCP inicial descrita supra cae dentro de esta deleción 269 bp, la deleción en orfX explica porqué esta cepa SARM no fue o no pudo haber sido detectada con cebadores y sondas previamente descritos para detectar SARM (Patente Estadounidense 6.156.507 y Solicitud de Patente Internacional PCT/CA02/00824). La secuencia novedosa AEDM de esta cepa fue designada como tipo xvi AEDM.

La secuencia obtenida en la extremidad derecha de CCEmec de la cepa CCRI-9772 era diferente de los tipos i a x de AEDM además de los tipos xi a xvi AEDM. El nuevo tipo AEDM fue designado como AEDM de tipo xvii (número de identificación secuencial:55). Una búsqueda BLAST® en la base de datos GeneBank reveló que la parte de CCEmec de la secuencia tipo xvii AEDM exhibió una identidad del 100 % con la secuencia a la izquierda de la articulación CCEmec de la cepa S. aureus CA05 (JCSC 1968) (número de accesión a GenBank AB063172) alojando CCEmec tipo IV (Ma et al., Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152). La organización genética del tipo xvii AEDM es similar a la de la zona hacia debajo de orfx en MSSA. Aunque la secuencia en sí misma ha sido descrita supra, la ubicación de esta secuencia más hacia debajo de orfX en una cepa SARM nunca había sido descrita hasta la fecha.

Las secuencias obtenidas de la extremidad derecha de CCEmec de las cepas CCRI-12524 y CCRI-12535 fueron casi idénticas entre sí pero fueron diferentes de los tipos i a x AEDM además de los tipos xi a xvii AEDM y fueron designadas, en consecuencia, como AEDM tipo xviii (números de identificación secuencial:39 y 40). Una búsqueda BLAST en las secuencias de GenBank reveló una identidad del 100 % con una zona 487-nucleótida del cassette CCEmec de Staphylococcus haemolyticus JCSC 1435. El resto de la secuencia mostró ser única, sin exhibir una homología significativa con ninguna otra secuencia publicada.

La secuencia obtenida de la cepa CCRI-12810 fue diferente de la de los tipos i a x AEDM además de los tipos xi a xviii y fue designada como AEDM tipo xix (número de identificación secuencial:41). Al ser comparada con secuencias GenBank usando BLAST, la parte CCEmec de la secuencia tipo xix AEDM exhibió un 100 % de identidad con una zona 597-nucleótida de función desconocida de cepa ATCC 25923 que se ubica a la izquierda de CCEmec (número de accesión a GenBank AB047239). Este resultado ha sido observado con cuatro otras cepas SARM para las que han sido publicadas secuencias CCEmec: SARM252, 85/3907, 85/2082, y MR108 (números de accesión a GenBank: BX571856, AB047088, AB037671 y AB096217, respectivamente). La organización genética del tipo xix AEDM es similar a la de la región hacia debajo de orfx en MSSA. Aunque la secuencia ha sido descrita en sí misma, la presencia de este fragmento de ADN por debajo de orfx nunca había sido descrita hasta la fecha.

La secuencia obtenida en la extremidad derecha del CCEmec de la cepa CCRI-12905 fue diferente de los tipos i a x al igual que de los tipos xi a xix de AEDM, y, en consecuencia, fue designado como AEDM tipo xx (número de identificación secuencial:42). Comparado con las secuencias de GenBank, usando BLAST, el CCEmec de la secuencia tipo xx de AEDM exhibió unas identidades de 100 % y 99 % con dos secuencias no contiguas (de longitud de 727 y 307 nucleótidos, respectivamente) por debajo del orfx de la cepa NCTC 8325 S. aureus sensible a la meticilina (accesión a GenBank número AB14440). La organización genética de AEDM tipo xx es similar a la zona por debajo de orfx en MSSA. La localización de esta secuencia por debajo de orfx en una cepa SARM nunca había sido descrita hasta la fecha. Se encontraron niveles de identidad en el intervalo de 98 % al 100 % con fragmentos no contiguos (en tamaños que varían de 91 a 727 nucleótidos) con 11 cepas SARM para las cuales se han publicado las secuencias CCEmec : N315, NCTC 10442, COL, USA300, Mu50, 2314, 85/2235, JCSC 1978, PL72, HDE 288 ( números de acceso a GenBank: BA000018, AB033763, CP000046, CP000255, BA000017, AY271717, AB014428, AB014427, AB063173, AF411936, AF411935, respectivamente). Estos fragmentos idénticos se ubican por debajo del gen mecA hacia (o, incluso, por debajo) del punto de inserción izquierdo de CCEmec.

Ejemplo 4: Comparación secuencial de nuevos tipos xi a xx AEDM

Las secuencias de la primera parte de 500 nucleótidos de la extremidad derecha CCEmec de todos los tipos nuevos de AEDM (xi a xx) fueron comparadas entre sí y con las de los tipos i a ix de AEDM descritos supra, utilizando los programas de software de la casa GCG llamados Pileup y Gap (GCG, Wisconsin). La Tabla 12 muestra las identidades en el nivel nucleótido entre las extremidades derechas CCEmec de los 10 tipos novedosos (xi a xx) con los de los tipos de AEDM previamente descritos (i a ix) usando el programa Gap, de la casa GCG. El tipo x de AEDM fue excluido de esta comparación en cuanto esta secuencia de AEDM está borrada del orfx completo y del lugar de integración CCEmec además de - 4 kb en la extremidad derecha del CCEmec comparado con la extremidad derecha del CCEmec tipo II. La extremidad derecha del CCEmec de los tipos ix, xiii y xiv de AEDM difería solamente en una y dos inserciones 102-bp presentes en los tipos ix y xiv AEDM, respectivamente. Sin embargo, el resto de estas tres secuencias mostraron una identidad de casi el 100 % (Figura 3). Aunque la parte de CCEmec del tipo xiv AEDM es casi idéntica en un 100 % con la del AEDM tipo ii, la deleción de nucleótidos 165 a 434 de orfx en el tipo xvi AEDM nunca había sido descrita previamente. Las extremidades derechas CCEmec de todos los nuevos tipos de AEDM mostraron identidades en el intervalo de 38.2 a 59.5 % entre sí o con los tipos i a ix de AEDM. La variación sustancial entre las secuencias novedosas de AEDM y las secuencias descritas supra, en las cuales se basaban los análisis de detección previos, explica por qué las extremidades derechas de los tipos novedosos xi a xx de AEDM divulgados en la presente invención no podrían haber sido predichos ni detectados con cebadores de AEDM previamente descritos (patente estadounidense 6.156.507; Solicitud de Patente Internacional PCT/CA02/00824; Ito et al., 2001, Antimicrob. Agents Chemother. 45:1323-1336; Huletsky et al., 2004, J. Clin. Microbio!. 42:1875-1884; Ma et al., 2002, Antimicrob. Agents Chemother. 46:1147-1152; Ito et al, Antimicrob Agents Chemother. 2004. 48:2637-2651; Oliveira et al, 2001, Microb. Drug Resist. 7:349-360).

Ejemplo 5: Selección de cebadores de Amplificación de las secuencias de CCEmec/orfx de SARM con tipos xi a xx AEDM

Al analizarse los datos secuenciales de los 10 nuevos tipos xi a xx de AEDM descritos supra, fueron designados los cebadores específicos a cada nueva secuencia de tipo AEDM (Figura 2, Tablas 9 y 11). Los cebadores específicos al tipo xi AEDM (número de identificación secuencial: 34), AEDM tipo xii (número de identificación secuencial: 35), AEDM tipos xiii y xiv (número de identificación secuencial: 29) (también se descubrió tipo ix de AEDM pero cada uno de los tipos xi, xiii, y xiv de AEDM tiene una longitud de amplicón diferente), AEDM tipo xv (número de identificación secuencial: 24), AEDM tipo xvii (número de identificación secuencial: 4), AEDM tipo xviii (número de identificación secuencial: 7), AEDM tipo xix (número de identificación secuencial: 9), AEDM tipo xx (número de identificación secuencial: 8), fueron cada uno de ellos utilizados en combinación con un cebador específico al S. aureus orfX (número de identificación secuencial: 30) y analizados contra su objeto AEDM específico. Para la detección del tipo xvi de AEDM, se usó un cebador cuyo objeto eran los tipos i, ii y xvi de AEDM (Tabla 10) en combinación con un cebador cuyo objeto era el S. aureus orfX (número de identificación secuencial: 44). Los tipos i, ii y xvi de AEDM puede ser distinguidos entre sí por su diferente longitud de amplicón.

Los cebadores oligonucleótidos de los que se descubrió que amplificaban específicamente el ADN de los tipos específicos objeto AEDM SARM fueron subsiguientemente analizados sobre su ubicuidad por amplificación RCP (esto es, los cebadores ubicuos amplificaron eficientemente la mayoría o todos los aislados de SARM del tipo AEDM objeto). La especificidad y ubicuidad de los análisis RCP fueron analizados o bien directamente con cultivos bacterianos o con ADN genómico bacteriano purificado. La especificidad de los cebadores que se orientan a los tipos xi a xx de AEDM fue verificada también por el análisis de ADN de las cepas SARM que contienen todos los otros tipos de AEDM.

Fue amplificado 1 pl de una suspensión bacteriana normalizada tratada o de una preparación de ADN genómico purificado de bacterias en 20 pl de una mezcla reactiva RCP. Cada reacción RCP contenía 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 0.1 % de Tritón X-100, 2.5 mM MgCh, 0.4 pM de cada uno de los cebadores del tipo xi AEDM (número de identificación secuencial: 34), cebador del tipo xii AEDM (número de identificación secuencial: 35), cebador de tipos xiii y xiv AEDM (número de identificación secuencial: 29), cebador de tipo xv AEDM (número de identificación secuencial: 24), tipo xvi AEDM (número de identificación secuencial: 36), cebador de tipo xvii AEDM (número de identificación secuencial: 4), cebador de tipo xviii AEDM (número de identificación secuencial: 7), cebador de tipo xix AEDM (número de identificación secuencial: 9), o cebador de tipo xx AEDM (número de identificación secuencial: 8), cada uno de los cuales fueron usados en combinación con 0.4 pM de un cebador específico de S. aureus (número de identificación secuencial: 30 ó número de identificación secuencial: 44 para el tipo xvi de AEDM), 200 pM de cada uno de los cuatro dNTPs (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 3.3 pg/pl de BSA (SiGMA, St. Louis, MO), y 0.5 U Taq de polimerasa (Promega, Madison, WI) emparejado con Anticuerpo TaqStart® (BD Biosciences, San José, CA).

La reacciones RCP fueron sujetas entonces a ciclado térmico: 3 minutos a 94° C seguidos por 40 ciclos de 60 segundos a 95° C durante la etapa de desnaturalización, 60 segundos a 55° C durante la etapa de hibridación, y 60 segundos a 72° C durante la etapa de extensión, seguida entonces por una extensión final de de 7 minutos a 72° C usando un termociclador normalizado (PTC-200 de MJ Research, Inc., Watertown, MA). La detección de los productos RCP fue realizada por electrofóresis en geles de azarosa (1.2 %) conteniendo 0.25 pg/ml de bromuro de etidio.

Cada una de las cepas SARM que contienen un objeto AEDM específico fue detectada, de forma específica, con sus cebadores AEDM específicos y no hubo detección cruzada con tipos AEDM que no constituían objetivo.

Tabla 1. Cepas Staphvlococcus aureus de referencia utilizadas en la presente invención a

a Todas las cepas S. aureus son resistentes a la meticilina salvo que se indique lo contrario.

b Estas cepas S. aureus son sensibles a la oxacilina (SASM)

c Las informaciones sobre estas cepas y designación de tipo basados en electrofóresis en gel por campos pulsados son de (6)

d Las informaciones sobre estas cepas y designación de tipo basados en electrofóresis en gel por campos pulsados son de (47)

e Las informaciones sobre estas cepas y designación de tipo basados en electrofóresis en gel por campos pulsados están disponibles en http://www.phls.co.uk/inter/harmony/menu.htm.

Tabla 2. Evaluación de los cebadores específicos de SARM que tienen por objetos los tipos i a x AEDM usando ADN de una multitud de cepas Staphylococcus aureus sensibles y resistentes a la meticilina

aSARM = Staphylococcus aureus resistente a la meticilina; SASM, Staphylococcus aureus sensible a la metilicina. Las cepas usadas de S. aureus están listadas en la Tabla 1. El origen de los aislamientos clínicos del S. aureus se describe en el texto.

Tabla 3. Origen de las 17 cepas SARM no amplificables usando cebadores que tienen por objeto los tipos i a x AEDM

a CCRI significa “Colección del Centro de Investigación en Infectiología”

T l : N v n i n l i l AEDM h l r

a AEDM hace referencia a articulación de extremidad derecha mec e incluye secuencias de la extremidad derecha CCEmec y ADN cromosómico a la derecha de la zona de integración del CCEmec.

b “Secuencia” hace referencia al gen objeto

c CCII significa “Colección del Centro de Investigación en Infectiología”

T l . N v r m lifi i n R P rr ll r r i xi - xx AEDM

a “Posición” hace referencia a la posición nucleótida del extremo 5' del cebador.

b El cebador es inversamente complementario de la secuencia objeto.

Tabla 10. Otros cebadores y sondas de amplificación y/o secuenciación encontrados en el listado de secuencias

a La posición hace referencia la posición nucleótida del extremo 5' del cebador (sobre la secuencia objeto). b Números de identificación secuencial de la Solicitud de Patente Internacional PCT/CA02/00824.

c El cebador es el complemento inverso de la secuencia objeto.

d Números de identificación secuencial de la patente WO96/08582.

Tabla 11. Longitud de los amplicones obtenidos con parejas de cebadores para los tipos xi -xx AEDM

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la detección de la presencia o ausencia de una cepa de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) de tipo xv AEDM caracterizado por que la secuencia del número de identificación secuencial 56 comprende: contactar una muestra para ser analizada sobre la presencia o ausencia de dicha cepa SARM de tipo xv AEDM caracterizada por la secuencia del número de identificación secuencial 56 con un primer cebador que hibrida con una secuencia del número de identificación secuencial 56 de extremidad derecha de un elemento CCEmec y un segundo cebador que hibrida con una secuencia orfX del número de identificación secuencial 56; siendo dichos primero y segundo cebadores de una longitud de al menos 10 nucleótidos; generándose un amplicón de dicha cepa SARM de tipo xv AEDM; y detectándose la presencia o ausencia de dicho amplicón.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho primer y segundo cebador están dispuestos en una pareja de cebadores, seleccionada del grupo consistente de los siguientes números de identificación secuencial: 24/45, 24/30, 24/62 y 24/44.

3. El uso de al menos un cebador y/o sonda seleccionados de los siguientes números de identificación secuencial: 24, 30, 31,32, 33, 44, 45 y 59, para la detección del tipo xv AEDM caracterizado por el número de identificación secuencial 56.

4. El ácido nucleico de número de identificación secuencial 56 o el complemento de dicha secuencia.

5. Un fragmento específico de tipo xv AEDM del ácido nucleico de la reivindicación 4 que comprende una secuencia de la extremidad derecha CCEmec, en que la secuencia de dicho fragmento es específica para tipo xv AEDM relativo a las secuencias de AEDM tipos i-xiv y xvi-xx, y donde dicho fragmento es apto para ser usado como cebador o sonda.

6. Una pareja de cebadores para la detección y determinación específica de una SARM de tipo xv AEDM, en la que uno de los cebadores de dicha pareja es el fragmento de la reivindicación 5.

7. La pareja de cebadores de la reivindicación 6 seleccionada del grupo consistente de los números de identificación secuencial 24/45, 24/30, 24/62 y 24/44.

8. Un procedimiento para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico caracterizada por el uso del fragmento de la reivindicación 5 ó la pareja de cebadores de las reivindicaciones 6 ó 7.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha reacción de amplificación del ácido nucleico es PCR.

10. El procedimiento de detección de las reivindicaciones 1 ó 2, comprendiendo una segunda pareja de cebadores para la detección de una segunda SARM de tipo AEDM donde el segundo tipo AEDM se selecciona del grupo consistente en:

a) Tipo xi AEDM caracterizado por la secuencia de número de identificación secuencial 17 ó el complemento de la misma;

b) Tipo xii AEDM caracterizado por la secuencia de número de identificación secuencial 20 ó el complemento de la misma;

c) Tipo xiii AEDM caracterizado por la secuencia de número de identificación secuencial 15, 25 ó 26 ó el complemento de la misma;

d) Tipo xiv AEDM caracterizado por la secuencia de número de identificación secuencial 16 ó el complemento de la misma;

e) Tipo xvi AEDM caracterizado por la secuencia de número de identificación secuencial 21 ó el complemento de la misma;

f) Tipo xvii AEDM caracterizado por la secuencia de número de identificación secuencial 55 ó el complemento de la misma;

g) Tipo xviii AEDM caracterizado por la secuencia de número de identificación secuencial 39 ó 40 ó el complemento de la misma;

h) Tipo xix AEDM caracterizado por la secuencia de número de identificación secuencial 41 ó el complemento de la misma; y

i) Tipo xx AEDM caracterizado por la secuencia de número de identificación secuencial 42 ó el complemento de la misma.