ES2903161T3 - Detección y definición de microorganismos mediante el uso del gen ILV3 - Google Patents

Abstract

Un método para detectar una infección por hongos/levaduras en una muestra, que comprende: a. realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos para amplificar el gen ILV3 de hongos/levaduras b. detectar el producto de amplificación para determinar si la muestra contiene una infección por hongos/levaduras, en donde la muestra comprende una muestra clínica obtenida de un sujeto humano.

Description

DESCRIPCIÓN

Detección y definición de microorganismos mediante el uso del gen ILV3

Campo de la invención

La invención proporciona un blanco novedoso en el contexto de detectar si un hongo o levadura está presente en una muestra. Este blanco, ILV3, codifica una dihidroxiácido deshidratasa y es particularmente útil en aplicaciones de diagnóstico clínico debido a la falta de cualquier identidad de secuencia con el genoma humano. Se proporcionan los cebadores y sondas que permiten determinar la presencia o ausencia de Cándida, Aspergillus y Cryptococcus neoformans en una muestra. Una vez que se determina la presencia de un hongo o levadura, la identidad de esa especie se obtiene de manera útil, por ejemplo, para orientar la terapia. Así como para la detección de todas las Cándida y de todos los Aspergillus mediante el uso de un único conjunto de cebador/sonda, también se proporcionan pares de cebadores específicos de la especie que permiten determinar las especies de Cándida o Aspergillus en la muestra. El análisis de la curva de fusión puede emplearse como un método para determinar qué especie está presente en la muestra. Los métodos pueden combinarse con métodos que determinan si hay bacterias presentes en la muestra y que pueden clasificar esas bacterias como grampositivas o gramnegativas.

Antecedentes de la Invención

El Centro para el Control de Enfermedades de EE . UU. estima que al menos al 30 % de los pacientes se les recetan antibióticos innecesariamente (Journal of the American Medical Association, mayo de 2016). La resistencia a los antibióticos es una amenaza urgente para la salud pública. Cada año en el Reino Unido hay más de 150 000 casos de sepsis que resultan en 44 000 muertes. Muchas de estas muertes se deben a infecciones microbianas resistentes a los antibióticos. La identificación de infecciones microbianas basada en el cultivo toma aproximadamente 5 días como promedio, durante los cuales se administran antibióticos. Sería de gran beneficio si se pudiera desarrollar una prueba más rápida para detectar una infección microbiana en una muestra.

Se conocen algunas pruebas moleculares para identificar ADN o ARN microbiano. Por ejemplo, los documentos US7291724 y US7169555 describen oligonucleótidos que se unen al ADN ribosómico y que pueden usarse en reacciones de PCR. Se conocen otros métodos basados en la amplificación para la detección de hongos/levaduras. Por ejemplo, consulte los documentos W02002/27021, CN105018575, US6872523 y Van Burik y otros, 1998. El documento US2011/081348 describe cebadores que se hibridan con el gen ILV3 de A. fumigatus.

Descripción de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Las infecciones fúngicas (fungemia) de la sangre son muy peligrosas. Los inventores han investigado blancos moleculares que se pueden examinar para identificar rápidamente (resultados en el mismo día) una infección fúngica. La invención proporciona, por tanto, a ILV3 como un blanco novedoso en el contexto de detectar si un hongo o levadura está presente en una muestra. ILV3 codifica una dihidroxiácido deshidratasa que cataliza la tercera etapa en la vía común que conduce a la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada. Los inventores han descubierto que este gen está presente en las especies fúngicas más relevantes clínicamente y puede ser un blanco específico para permitir la detección e identificación de una infección fúngica. Además, este blanco es útil particularmente en aplicaciones de diagnóstico clínico debido a la falta de cualquier identidad de secuencia con el genoma humano. Con más detalle, Liu y otros, 2006 enumera una serie de genes Cándidatos como posibles blancos para el descubrimiento de fármacos antifúngicos. De todos los candidatos que se enumeran, solo ILV3 tiene una identidad del 0 % con humanos a nivel de proteínas. Después de realizar otros análisis, los inventores han encontrado que ILV3 tampoco tiene homología, a nivel genético, con humanos o bacterias (de estado grampositivo o gramnegativo). Esto contrasta con los otros genes Cándidatos descritos en Liu y otros, en los que los inventores encontraron homología genética con humanos. Por ejemplo, ILV5 (2 % de identidad con humanos a nivel de proteína) resultó en dos alineamientos de nucleótidos positivos (82 % de identidad) con el genoma humano. Por tanto, los genes Cándidatos distintos de ILV3 (incluidos Cándidatos ribosómicos, por ejemplo, 18S, 28S o 5.8S) pueden resultar en la detección e identificación de falsos positivos de una infección fúngica en muestras que comprenden material genético humano. Por tanto, en su aspecto más amplio, la invención prevé el uso de ILV3 para identificar una infección fúngica en una muestra.

Debe señalarse que a lo largo de la descripción, el término "que comprende" pretende representar un lenguaje abierto (es decir, que incluye). Sin embargo, para evitar dudas, siempre que se use el término "que comprende", se concibe que la característica correspondiente puede limitarse a lo especificado (es decir, que consiste) según sea necesario.

Los números de acceso y la información relacionada para la secuencia del gen ILV3 en las especies de interés se proporcionan en la Tabla A:

A través de una extensa caracterización y ensayo, los inventores identificaron regiones específicas del gen ILV3 que pueden ser un blanco. En primer lugar, los inventores identificaron regiones del gen ILV3, en 8 especies de Cándida clínicamente prevalentes, que pueden ser comúnmente un blanco, mediante el uso de un único conjunto de cebador y/o sonda. Un único conjunto de cebador y/o sonda hibrida específicamente con el gen ILV3 de estas 8 especies, pero no reacciona de forma cruzada con el gen ILV3 de las especies que no son Cándida. Dichos cebadores/sondas pueden denominarse como "de todas las Cándida”.

En segundo lugar, los inventores identificaron regiones del gen ILV3, en 3 especies de Aspergillus clínicamente prevalentes, que pueden ser comúnmente un blanco, mediante el uso de un único conjunto de cebador y/o sonda. Un único conjunto de cebador y/o sonda hibrida específicamente con estas 3 especies pero no reacciona de forma cruzada con el gen ILV3 de las especies que no son Aspergillus. Dichos cebadores/sondas pueden denominarse como "de todos los Aspergillus”.

En tercer lugar, los inventores identificaron regiones del gen ILV3 en Cryptococcus neoformans que pueden ser un blanco mediante el uso de un conjunto de cebador y/o sonda. Un conjunto de cebador y/o sonda hibrida específicamente con esta especie pero no reacciona de forma cruzada con el gen ILV3 de las especies que no son Cryptococcus.

Colectivamente, la primera, segunda y tercera categoría de regiones blanco se pueden examinar para determinar si hay una infección fúngica en la muestra. Con la discriminación apropiada de los productos de amplificación, se puede determinar qué categoría de infección fúngica está presente.

En cuarto lugar, los inventores identificaron regiones del gen ILV3 que difieren entre 8 especies de Cándida clínicamente prevalentes que pueden, por tanto, cada una ser un blanco independiente mediante el uso de conjuntos de cebadores y/o sondas diseñados adecuadamente. Cada conjunto de cebador y/o sonda hibrida específicamente con una especie de Cándida pero no reacciona de forma cruzada con el gen ILV3 de otras especies de Cándida (o especies que no sean Cándida).

En quinto lugar, los inventores identificaron regiones diferentes del gen ILV3 en 3 especies de Aspergillus clínicamente prevalentes que pueden cada una ser un blanco independiente mediante el uso de conjuntos de cebadores y/o sondas diseñados adecuadamente. Cada conjunto de cebador y/o sonda hibrida específicamente con una especie de Aspergillus pero no reacciona de manera cruzada con el gen ILV3 de otras especies de Aspergillus (o especies que no sean Aspergillus).

La cuarta y quinta categoría de regiones blanco pueden examinarse para identificar más específicamente la naturaleza de una infección fúngica en la muestra. Con la detección apropiada de los productos de amplificación, pueden identificarse las especies responsables de la infección. Esto puede facilitar el tratamiento.

Se proporcionan las secuencias específicas del cebador y la sonda que se dirigen a las regiones respectivas y que también forman un aspecto de la presente invención.

La Tabla B, más abajo, identifica las diversas regiones blanco de ILV3, identificadas con referencia a las secuencias proporcionadas en la Tabla A. La Tabla B también proporciona las secuencias específicas de los cebadores y sondas de la invención que se dirigen a las regiones respectivas, junto con la SEQ ID NO usada en el listado de secuencias para cada secuencia:

{i) Todas las secuencias que se muestran están en la orientación 5’ a 3’

(¡i) La ubicación del cebadotfsonda se basa en la orientación del gen (c=complemento)

En la Tabla B del documento GB1705932.0, las secuencias y ubicaciones del cebador directo e inverso para Aspergillus niger (ILV3) y Aspergillus flavus (ILV3) se intercambiaron incorrectamente y, por tanto, se mencionaron de la siguiente manera:

La designación de los términos cebadores "directo" e "inverso" es con relación a la orientación del gen ILV3 que se establece para cada una de las secuencias de nucleótidos con números de acceso NT_166533.1 (Aspergillus niger) y NW_002477240.1 (Aspergillus flavus). Por tanto, el experto que consulte las secuencias de nucleótidos con números de acceso NT_166533.1 y NW_002477240.1 cuando busque comprender la invención, se daría cuenta inmediatamente y sin ambigüedades de que la secuencia y ubicación del cebador "directo" como se mencionó en la Tabla B del documento GB1705932.0 es, de hecho, la secuencia y ubicación del cebador inverso y viceversa para Aspergillus niger (1LV3) y Aspergillus flavus (ILV3). Esta corrección se aplicó a lo largo de la presente solicitud.

Por tanto, la invención proporciona los cebadores y sondas útiles en la detección de hongos. Como comprendería fácilmente el experto, los cebadores y las sondas hibridan con subregiones particulares dentro del gen de interés (ILV3). Mientras que los cebadores se especifican individualmente en la presente descripción, se apreciaría inmediatamente, en base en particular a la información proporcionada en la Tabla B, qué cebadores se aparean preferentemente de acuerdo con la invención, incluso cuando se definen por referencia a su región blanco. Mediante el uso de la información que se proporciona en la presente descripción, en particular el nuevo blanco y las secuencias blanco específicas, un experto en la técnica puede diseñar los cebadores y sondas. Típicamente, los cebadores tienen entre 15 y 40, como entre 18 y 35, nucleótidos de longitud. Las sondas tienen típicamente entre 15 y 100, como entre 20 y 40, nucleótidos de longitud. Pueden tolerarse alguna falta de apareamiento con las secuencias blanco siempre y cuando se logre la hibridación específica. La hibridación específica es un término de la técnica bien entendido por el experto para excluir la hibridación con secuencias que no sean el blanco. El experto también conoce las condiciones de reacción adecuadas, usadas para realizar la amplificación de ácidos nucleicos, en las que debe producirse una hibridación específica. Además, para los cebadores y/o sondas que hibridan con múltiples secuencias blanco, puede haber alguna degeneración en posiciones específicas. Por ejemplo, un cebador puede incluir cualquier nucleótido de pirimidina (t/u o c) en una posición dada o puede adoptarse una mezcla de cebadores que contiene al menos dos de estos nucleótidos. También se prevén variantes de los cebadores y sondas específicos que se describen en la presente descripción (por ejemplo, por SEQ ID NO). Estos pueden contener adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos siempre y cuando aún se logre la hibridación específica. En algunas circunstancias pueden tolerarse 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 adiciones, deleciones y/o sustituciones. Como se explica más adelante en la presente descripción, los cebadores y/o sondas pueden marcarse de acuerdo con la metodología de detección empleada. Los marcadores típicos son moléculas fluorescentes, que pueden disponerse como fluoróforos y apagadores de fluorescencia en algunos aspectos.

En la presente descripción se describe al menos un par de cebadores para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Cándida siguientes:

i. Cándida albicans

ii. Cándida dubliniensis

iii. Cándida tropicalis

iv. Cándida parapsilosis

v. Cándida glabrata

vi. Cándida krusei

vii. Cándida guilliermondii

viii. Cándida auris

Por "hibridar específicamente", o lenguaje equivalente, se entiende que los cebadores hibridan con el gen ILV3 de estas 8 especies pero no hibridan (o reaccionan de forma cruzada) con el gen ILV3 de las especies que no sean Cándida. Por tanto, solo se generará un producto de amplificación si una especie de Cándida (de esas 8 especies) está presente en la muestra.

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador directo de un par de cebadores hibrida con al menos 3, 4, 5, 6, 7 y preferentemente con todas las secuencias blanco siguientes:

i. posiciones c1169825-1169806 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_032093.1 (Cándida albicans)

ii. posiciones C393798-393779 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_005968.1 (Cándida glabrata)

iii. posiciones C405996-405978 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_003020040.1 (Cándida tropicalis)

iv. posiciones C1218036-1218017 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_012864.1 (Cándida dubliniensis)

v. posiciones C909809-909790 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_001809800.1 (Cándida guilliermondii)

vi. posiciones C24006-23987 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso HE605203.1 (Cándida parapsilosis)

vii. posiciones 61666-61685 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso JQFK01000016.1 (Cándida krusei)

viii. posiciones C32324-32305 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_017263971.1 (Cándida auris).

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador inverso de un par de cebadores hibrida con al menos 3, 4, 5, 6, 7 y preferentemente con todas las secuencias blanco siguientes:

i. posiciones 1169707-1169729 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_032093.1 (Cándida albicans)

ii. posiciones 393680-393702 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_005968.1 (Cándida glabrata)

iii. posiciones 405878-405900 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_003020040.1 (Cándida tropicalis)

iv. posiciones 1217918-1217940 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_012864.1 (Cándida dubliniensis)

v. posiciones 909691-909713 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_001809800.1 (Cándida guilliermondii)

vi. posiciones 23888-23910 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso HE605203.1 (Cándida parapsilosis)

vii. posiciones c61784-61762 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso JQFK01000016.1 (Cándida krusei)

viii. posiciones 32206-32228 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_017263971.1 (Cándida auris).

Por tanto, pueden generarse pares de cebadores a partir de estas regiones blanco particulares para permitir la detección de todas las Cándida. En algunas modalidades esto puede lograrse con un solo par de cebadores.

En modalidades específicas, el cebador directo e inverso hibrida específicamente con el gen de al menos 3, 4, 5, 6, 7 y preferentemente con todas las especies de Cándida

i. Cándida albicans

ii. Cándida dubliniensis

iii. Cándida tropicalis

iv. Cándida parapsilosis

v. Cándida glabrata

vi. Cándida krusei

vii. Cándida guilliermondii

viii. Cándida auris

comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 respectivamente. Este es un par de cebadores de todas las Cándida.

En la presente descripción se describe un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Aspergillus siguientes

i. Aspergillus fumigatus

ii. Aspergillus niger

iii. Aspergillus flavus

Por "hibridar específicamente", o lenguaje equivalente, se entiende que los cebadores hibridan con el gen ILV3 de estas 3 especies pero no hibridan (o reaccionan de forma cruzada) con el gen ILV3 de las especies que no sean Aspergillus. Por tanto, solo se generará un producto de amplificación si una especie de Aspergillus (de esas 3 especies) está presente en la muestra.

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador directo de un par de cebadores hibrida con al menos 2, y preferentemente con las 3, de las secuencias blanco siguientes:

i. posiciones 3721583-3721597 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_007195.1 (Aspergillus fumigatus)

ii. posiciones c541018-541004 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NT_166533.1 (Aspergillus niger)

iii. posiciones c382612-382598 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_002477240.1 (Aspergillus flavus)

o en donde el cebador directo hibrida con al menos 2, y preferentemente con las 3, de las secuencias blanco siguientes:

i. posiciones 3721797-3721816 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_007195.1 (Aspergillus fumigatus)

ii. posiciones C540804-540785 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NT_166533.1 (Aspergillus niger)

iii. posiciones C382398-382379 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_002477240.1 (Aspergillus flavus)

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador inverso de un par de cebadores hibrida con al menos 2 y preferentemente con las 3, de las secuencias blanco siguientes:

i. posiciones c3721887-3721872 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_007195.1 (Aspergillus fumigatus)

ii. posiciones 540714-540729 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NT_166533.1 (Aspergillus niger)

iii. posiciones 382308-382323 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_002477240.1 (Aspergillus flavus)

o en donde el cebador inverso hibrida con al menos 2, y preferentemente con las 3, de las secuencias blanco siguientes:

i. posiciones c3721875-3721894 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_007195.1 (Aspergillus fumigatus)

ii. posiciones 540707-540726 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NT_166533.1 (Aspergillus niger)

iii. posiciones 382301-382320 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_002477240.1 (Aspergillus flavus)

Por tanto, pueden generarse pares de cebadores a partir de estas regiones blanco particulares para permitir la detección de todos los Aspergillus. En algunas modalidades esto puede lograrse con un solo par de cebadores.

En modalidades específicas el cebador directo e inverso hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Aspergillus siguientes:

i. Aspergillus fumigatus

ii. Aspergillus niger

iii. Aspergillus flavus

comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 70 y 71 o de SEQ ID NO: 73 y 74, respectivamente. Por tanto, las SEQ ID NO: 70 y 71 forman un par de cebadores preferido. Las SEQ ID NO: 73 y 74 forman un segundo par de cebadores. Estos son pares de cebadores de todos los Aspergillus.

En la presente descripción se describe un cebador directo e inverso que híbrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida albicans.

Por "hibridar específicamente", o lenguaje equivalente, se entiende que los cebadores hibridan con el gen ILV3 de esta especie pero no hibridan (o reaccionan de forma cruzada) con el gen ILV3 de las especies que no sean Cándida albicans. Por tanto, solo se generará un producto de amplificación si Cándida albicans está presente en la muestra y no se generará si una de las otras 7 especies de Cándida está presente en la muestra (o si una especie que no sea Cándida está presente).

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador directo de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida albicans hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_032093.1:

i. posiciones c1170234-1170217

ii. posiciones C1171213-1171192

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador inverso de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida albicans hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_032093.1:

i. posiciones 1170119-1170140

ii. posiciones 1171120-1171138

En modalidades específicas, el cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida albicans comprende, consiste esencialmente en o consiste en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 y 5 o 6 y 7 respectivamente. Por tanto, las SEQ ID NO: 4 y 5 forman un primer par de cebadores. Las SEQ ID NO: 6 y 7 forman un segundo par de cebadores.

En la presente descripción se describe un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida dubliniensis.

Por "hibridar específicamente", o lenguaje equivalente, se entiende que los cebadores hibridan con el gen ILV3 de esta especie pero no hibridan (o reaccionan de forma cruzada) con el gen ILV3 de las especies que no sean Cándida dubliniensis. Por tanto, solo se generará un producto de amplificación si Cándida dubliniensis está presente en la muestra y no se generará si una de los otras 7 especies de Cándida está presente en la muestra (o si una especie que no sea Cándida está presente).

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador directo de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida dubliniensis hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_012864.1:

i. posiciones C1219181-1219161

ii. posiciones c1218505-1218486

iii. posiciones c1218553-1218534

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador inverso de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida dubliniensis hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_012864.1:

i. posiciones 1219103-1219124

ii. posiciones 1218409-1218429

iii. posiciones 1218419-1218440

En modalidades específicas, el cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida dubliniensis comprende, consiste esencialmente en o consiste en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 y 9, las SEQ ID n O: 10 y 11 o las SEQ ID NO: 12 y 13, respectivamente. Por tanto, las SEQ ID NO: 8 y 9 forman un primer par de cebadores. Las SEQ ID NO: 10 y 11 forman un segundo par de cebadores y así sucesivamente.

En la presente descripción se describe un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida tropicalis.

Por "hibridar específicamente", o lenguaje equivalente, se entiende que los cebadores hibridan con el gen ILV3 de esta especie pero no hibridan (o reaccionan de forma cruzada) con el gen ILV3 de las especies que no sean Cándida tropicalis. Por tanto, solo se generará un producto de amplificación si Cándida tropicalis está presente en la muestra y no se generará si una de los otras 7 especies de Cándida está presente en la muestra (o si una especie que no sea Cándida está presente).

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador directo de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida tropicalis híbrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_003020040.1:

i. posiciones c406146-406127

ii. posiciones c406142-406120

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador inverso de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida tropicalis hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_003020040.1:

i. posiciones 406047-406068

ii. posiciones 406048-406069

En modalidades específicas, el cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida tropicalis comprende, consiste esencialmente en o consiste en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 14 y 15 o las SEQ ID NO: 16 y 17, respectivamente. Por tanto, las SEQ ID NO: 14 y 15 forman un primer par de cebadores. Las SEQ ID NO: 16 y 17 forman un segundo par de cebadores.

En la presente descripción se describe un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida parapsilosis.

Por "hibridar específicamente", o lenguaje equivalente, se entiende que los cebadores hibridan con el gen ILV3 de esta especie pero no hibridan (o reaccionan de forma cruzada) con el gen ILV3 de las especies que no sean Cándida parapsilosis. Por tanto, solo se generará un producto de amplificación si Cándida parapsilosis está presente en la muestra y no se generará si una de los otras 7 especies de Cándida está presente en la muestra (o si una especie que no sea Cándida está presente).

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador directo de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida parapsilosis hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso HE605203.1:

i. posiciones c24951-24931

ii. posiciones c24881-24863

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador inverso de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida parapsilosis hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso HE605203.1:

i. posiciones 24843-24865

ii. posiciones 24774-24795

En modalidades específicas, el cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida parapsilosis comprende, consiste esencialmente en o consiste en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 18 y 19 o las SEQ iD NO: 20 y 21, respectivamente. Por tanto, las SEQ ID NO: 18 y 19 forman un primer par de cebadores. Las SEQ ID NO: 20 y 21 forman un segundo par de cebadores.

En la presente descripción se describe un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida glabrata.

Por "hibridar específicamente", o lenguaje equivalente, se entiende que los cebadores hibridan con el gen ILV3 de esta especie pero no hibridan (o reaccionan de forma cruzada) con el gen ILV3 de las especies que no sean Cándida glabrata. Por tanto, solo se generará un producto de amplificación si Cándida glabrata está presente en la muestra y no se generará si una de los otras 7 especies de Cándida está presente en la muestra (o si una especie que no sea Cándida está presente).

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador directo de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida glabrata hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_005968.1:

i. posiciones C394191-394169

ii. posiciones C393535-393516

iii. posiciones C395076-395055

iv. posiciones C394884-394863

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador inverso de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida glabrata hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_005968.1:

i. posiciones 394080-394101

ii. posiciones 393445-393464

iii. posiciones 394987-395006

iv. posiciones 394783-394803

En modalidades específicas, el cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida glabrata comprende, consiste esencialmente en o consiste en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 22 y 23, las SEQ ID NO: 24 y 25, las SEQ ID NO: 26 y 27 o las SEQ ID NO: 28 y 29, respectivamente. Por tanto, las SEQ ID NO: 22 y 23 forman un primer par de cebadores. Las SEQ ID NO: 24 y 25 forman un segundo par de cebadores y así sucesivamente.

En la presente descripción se describe un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida krusei.

Por "hibridar específicamente", o lenguaje equivalente, se entiende que los cebadores hibridan con el gen ILV3 de esta especie pero no hibridan (o reaccionan de forma cruzada) con el gen ILV3 de las especies que no sean Cándida krusei. Por tanto, solo se generará un producto de amplificación si Cándida krusei está presente en la muestra y no se generará si una de los otras 7 especies de Cándida está presente en la muestra (o si una especie que no sea Cándida está presente).

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador directo de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida krusei hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso JQFK01000016.1:

i. posiciones 61723-61744

ii. posiciones 60940-60961

iii. posiciones 60420-60440

iv. posiciones 61778-61797

v. posiciones 61940-61961

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador inverso de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida krusei hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso JQFK01000016.1:

i. posiciones c61817-61796

ii. posiciones c61030-61011

iii. posiciones C60535-60513

iv. posiciones c61923-61902

v. posiciones c62015-61996

En modalidades específicas, el cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida krusei comprende, consiste esencialmente en o consiste en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 30 y 31, las SEQ ID NO: 32 y 33, las SEQ ID NO: 34 y 35, las SEQ ID NO: 36 y 37 o las SEQ ID NO: 38 y 39, respectivamente. Por tanto, las SEQ ID NO: 30 y 31 forman un primer par de cebadores. Las SEQ ID NO: 32 y 33 forman un segundo par de cebadores y así sucesivamente.

En la presente descripción se describe un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida guilliermondii.

Por "hibridar específicamente", o lenguaje equivalente, se entiende que los cebadores hibridan con el gen ILV3 de esta especie pero no hibridan (o reaccionan de forma cruzada) con el gen ILV3 de las especies que no sean Cándida guilliermondii. Por tanto, solo se generará un producto de amplificación si Cándida guilliermondii está presente en la muestra y no se generará si una de los otras 7 especies de Cándida está presente en la muestra (o si una especie que no sea Cándida está presente).

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador directo de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida guilliermondii hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_001809800.1:

i. posiciones C909629-909608

ii. posiciones c911117-911098

iii. posiciones c911111-911090

iv. posiciones c910941-910920

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador inverso de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida guilliermondii hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_001809800.1:

i. posiciones 909529-909550

ii. posiciones 911002-911023

iii. posiciones 910994-911013

iv. posiciones 910799-910819

En modalidades específicas, el cebador directo e inverso que híbrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida guilliermondii comprende, consiste esencialmente en o consiste en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 40 y 41, las SEQ ID NO: 42 y 43, las SEQ ID NO: 44 y 45 o las SEQ ID NO: 46 y 47, respectivamente. Por tanto, las SEQ ID NO: 40 y 41 forman un primer par de cebadores. Las SEQ ID NO: 42 y 43 forman un segundo par de cebadores y así sucesivamente.

En la presente descripción se describe un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida auris.

Por "hibridar específicamente", o lenguaje equivalente, se entiende que los cebadores hibridan con el gen ILV3 de esta especie pero no hibridan (o reaccionan de forma cruzada) con el gen ILV3 de las especies que no sean Cándida auris. Por tanto, solo se generará un producto de amplificación si Cándida auris está presente en la muestra y no se generará si una de los otras 7 especies de Cándida está presente en la muestra (o si una especie que no sea Cándida está presente).

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador directo de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida auris hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_017263971.1:

i. posiciones C32790-32768

ii. posiciones C32451-32430

iii. posiciones C32654-32633

iv. posiciones C33278-33259

v. posiciones C32603-32580

vi. posiciones C32399-32376

vii. posiciones C33648-33628

viii. posiciones C32240-32219

ix. posiciones C32930-32909

x. posiciones C33228-33206

xi. posiciones c32106-32085

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador inverso de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cándida auris hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_017263971.1:

i. posiciones 32682-32703

ii. posiciones 32368-32389

iii. posiciones 32567-32588

iv. posiciones 33202-33223

v. posiciones 32512-32533

vi. posiciones 32328-32349

vii. posiciones 33566-33587

viii. posiciones 32175-32195

ix. posiciones 32826-32848

x. posiciones 33130-33151

xi. posiciones 32011-32033

En modalidades específicas, el cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida auris comprende, consiste esencialmente en o consiste en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 48 y 49, las SEQ ID NO: 50 y 51, las SEQ ID NO: 52 y 53, las SEQ ID NO: 54 y 55, las SEQ ID NO: 56 y 57, las SEQ ID NO: 58 y 59, las SEQ ID NO: 60 y 61, las SEQ ID NO: 62 y 63, las SEQ ID NO: 64 y 65, las SEQ ID NO: 66 y 67 o las SEQ ID NO: 68 y 69, respectivamente. Por tanto, las SEQ ID NO: 48 y 49 forman un primer par de cebadores. Las SEQ ID NO: 50 y 51 forman un segundo par de cebadores y así sucesivamente.

En la presente descripción se describe un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus fumigatus.

Por "hibridar específicamente", o lenguaje equivalente, se entiende que los cebadores hibridan con el gen ILV3 de esta especie pero no hibridan (o reaccionan de forma cruzada) con el gen ILV3 de las especies que no sean Aspergillus fumigatus. Por tanto, solo se generará un producto de amplificación si Aspergillus fumigatus está presente en la muestra y no se generará si una de los otras 2 especies de Aspergillus está presente en la muestra (o si una especie que no sea Aspergillus está presente).

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador directo de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus fumigatus hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_007195.1:

i. posiciones 3721531-3721552

ii. posiciones 3721618-3721638

iii. posiciones 3721616-3721638

iv. posiciones 3721798-3721818

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador inverso de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus fumigatus hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_007195.1:

i. posiciones c3721653-3721675

ii. posiciones c3721706-3721681

iii. posiciones c3721898-3721878

En modalidades específicas, el cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus fumigatus comprende, consiste esencialmente en o consiste en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 76 y 77, las SEQ ID NO: 79 y 80, las SEQ ID NO: 82 y 80 o las SEQ ID NO: 83 y 84, respectivamente. Por tanto, las S e Q ID NO: 76 y 77 forman un primer par de cebadores. Las SEQ ID NO: 79 y 80 forman un segundo par de cebadores y así sucesivamente.

En la presente descripción se describe un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus niger.

Por "hibridar específicamente", o lenguaje equivalente, se entiende que los cebadores hibridan con el gen ILV3 de esta especie pero no hibridan (o reaccionan de forma cruzada) con el gen ILV3 de las especies que no sean Aspergillus niger. Por tanto, solo se generará un producto de amplificación si Aspergillus niger está presente en la muestra y no se generará si una de los otras 2 especies de Aspergillus está presente en la muestra (o si una especie que no sea Aspergillus está presente).

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador directo de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus niger hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NT_166533.1:

i. posiciones c540219-540199

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador inverso de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus niger hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NT_166533.1:

ii. posiciones 540084-540103

En modalidades específicas, el cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus niger comprende, consiste esencialmente en o consiste en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 87 y 86.

En la presente descripción se describe un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus flavus.

Por "hibridar específicamente", o lenguaje equivalente, se entiende que los cebadores hibridan con el gen ILV3 de esta especie pero no hibridan (o reaccionan de forma cruzada) con el gen ILV3 de las especies que no sean Aspergillus flavus. Por tanto, solo se generará un producto de amplificación si Aspergillus flavus está presente en la muestra y no se generará si una de los otras 2 especies de Aspergillus está presente en la muestra (o si una especie que no sea Aspergillus está presente).

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador directo de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus flavus hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_002477240.1:

i. posiciones C382604-382586

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador inverso de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus flavus hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_002477240.1:

i. posiciones 382519-382541

ii. posiciones 382520-382541

En modalidades específicas, el cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus flavus comprende, consiste esencialmente en o consiste en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 90 y 89 o las SEQ ID NO: 90 y 92, respectivamente. Por tanto, las SEQ ID NO: 90 y 89 forman un primer par de cebadores. Las SEQ ID NO: 90 y 92 forman un segundo par de cebadores.

En la presente descripción se describe un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans.

Por "hibridar específicamente", o lenguaje equivalente, se entiende que los cebadores hibridan con el gen ILV3 de esta especie pero no hibridan (o reaccionan de forma cruzada) con el gen ILV3 de las especies que no sean Cryptococcus neoformans. Por tanto, solo se generará un producto de amplificación si Cryptococcus neoformans está presente en la muestra y no se generará si una especie que no sea Cryptococcus neoformans está presente. De acuerdo con algunas modalidades, el cebador directo de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_006693.1:

i. Posiciones 702696-702717

ii. Posiciones 702499-702520

iii. Posiciones 702736-702757

iv. Posiciones 702384-702403

v. Posiciones 701384-701406

De acuerdo con algunas modalidades, el cebador inverso de un par de cebadores que hibridan específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_006693.1:

i. Posiciones C702796-702777

ii. Posiciones C702602-702582

iii. Posiciones C702850-702831

iv. Posiciones C702521-702500

v. Posiciones C701499-701479

En modalidades específicas, el cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans comprende, consiste esencialmente en o consiste en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 93 y 94, las SEQ ID NO: 96 y 97, las SEQ ID NO: 99 y 100, las SEQ ID NO: 102 y 103 o las SEQ ID NO: 105 y 106, respectivamente. Por tanto, las SEQ ID NO: 93 y 94 forman un primer par de cebadores. Las SEQ ID NO: 95 y 97 forman un segundo par de cebadores y así sucesivamente.

Los pares de cebadores, como se explica en la presente descripción, se usan preferentemente en combinación, por ejemplo, en reacciones múltiples. Se pueden incluir múltiples pares de cebadores en una sola mezcla de reacción (una mezcla maestra). Por tanto, en algunas modalidades, al menos un cebador en cada par de cebadores está marcado diferencialmente en comparación con los otros pares de cebadores. Este es uno de los medios mediante el cual se pueden distinguir los productos de amplificación. Los ejemplos de cebadores marcados que pueden usarse en la presente invención incluyen cebadores AMPLIFLUOR y cebadores LUX. Por tanto, los cebadores pueden incluir modificaciones, marcadores y extensiones de secuencia para incorporar la tecnología de detección relevante. Tales modificaciones de secuencia, marcadores y extensiones están abarcadas por la invención.

Muchos protocolos de amplificación de ácidos nucleicos implican el uso de una sonda. Las variantes de la PCR permiten la detección en tiempo real o en el punto final mediante el uso de tales sondas. Los ejemplos incluyen sondas hidrolíticas (por ejemplo, sondas TAQMAN) y sondas de horquilla (por ejemplo, BALIZAS M OLECULARES). En algunas modalidades las sondas también pueden unirse a los cebadores (por ejemplo, sondas SCORPION). Por tanto, las sondas de la invención pueden incluir modificaciones, marcadores y extensiones de secuencia para incorporar la tecnología de detección relevante. Tales modificaciones de secuencia, marcadores y extensiones están abarcadas por la invención. Preferentemente, las sondas de la invención también se dirigen al gen ILV3 de manera específica de género o especie para complementar la acción de los cebadores. En relación con las sondas de la invención, "hibridar específicamente" se define de manera análoga a las definiciones que se proporcionan para los cebadores correspondientes. Nuevamente, la Tabla B identifica las combinaciones preferidas de las sondas de la invención con pares de cebadores de la invención, incluso cuando se definen por referencia a su secuencia blanco.

En la presente descripción se describe al menos una sonda para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Cándida siguientes

i. Cándida albicans

ii. Cándida dubliniensis

iii. Cándida tropicalis

iv. Cándida parapsilosis

v. Cándida glabrata

vi. Cándida krusei

vii. Cándida guilliermondii

viii. Cándida guilliermondii

De acuerdo con algunos casos, dicha sonda hibrida con al menos 3, 4, 5, 6, 7 y preferentemente con todas las secuencias blanco siguientes:

i. posiciones 1169779-1169804 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_032093.1 (Cándida albicans)

ii. posiciones 393752-393777 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_005968.1 (Cándida glabrata)

iii. posiciones 405950-405975 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_003020040.1 (Cándida tropicalis)

iv. posiciones 1217990-1218015 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_012864.1 (Cándida dubliniensis)

v. posiciones 909763-909788 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_001809800.1 (Cándida guilliermondii)

vi. posiciones 23960-23985 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso HE605203.1 (Cándida parapsilosis)

vii. posiciones C61712-61687 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso JQFK01000016.1 (Cándida krusei)

viii. posiciones 32278-32303 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_017263971.1 (Cándida auris).

En modalidades específicas la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Cándida siguientes

i. Cándida albicans

ii. Cándida dubliniensis

iii. Cándida tropicalis

iv. Cándida parapsilosis

v. Cándida glabrata

vi. Cándida krusei

vii. Cándida guilliermondii

viii. Cándida auris

comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3.

En la presente descripción se describe al menos una sonda para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Aspergillus siguientes

i. Aspergillus fumigatus

ii. Aspergillus niger

iii. Aspergillus flavus

De acuerdo con algunas modalidades al menos una sonda hibrida con al menos 2, y preferentemente con las 3, de las secuencias blanco siguientes:

i. posiciones 3721790-3721814 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_007195.1 (Aspergillus fumigatus)

ii. posiciones c540811-540788 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NT_166533.1 (Aspergillus niger)

iii. posiciones C382405-382381 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_002477240.1 (Aspergillus flavus)

o dicha sonda hibrida con al menos 2, y preferentemente con las 3, de las secuencias blanco siguientes:

i. posiciones 3721848-3721870 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_007195.1 (Aspergillus fumigatus)

ii. posiciones C540753-540731 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NT_166533.1 (Aspergillus niger)

iii. posiciones C382347-382325 de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_002477240.1 (Aspergillus flavus).

En modalidades específicas la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Aspergillus siguientes

i. Aspergillus fumigatus

ii. Aspergillus niger

iii. Aspergillus flavus

comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 72 o 75.

En la presente descripción se describe al menos una sonda para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida albicans.

De acuerdo con algunas modalidades, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida albicans hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_032093.1:

i. posiciones c1170174-1170151

ii. posiciones 1171165-1171192

En modalidades específicas, la sonda que híbrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida albicans comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 116 o 117.

En la presente descripción se describe al menos una sonda para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida dubliniensis.

De acuerdo con algunas modalidades, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida dubliniensis hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_012864.1:

i. posiciones 1219148-1219171

ii. posiciones C1218439-1218416

iii. posiciones c1218505-1218480

En modalidades específicas, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida dubliniensis comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 118, 119 o 120.

En la presente descripción se describe al menos una sonda para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de la especie Cándida tropicalis.

De acuerdo con algunas modalidades, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida tropicalis hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_003020040.1:

i. posiciones c406111-406082

En modalidades específicas, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida tropicalis comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 121.

En la presente descripción se describe al menos una sonda para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida parapsilosis.

De acuerdo con algunas modalidades, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida parapsilosis hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso HE605203.1:

i. posiciones C24907-24883

ii. posiciones C24862-24839

En modalidades específicas, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida parapsilosis comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 122 o 123.

En la presente descripción se describe al menos una sonda para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida glabrata.

De acuerdo con algunas modalidades, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida glabrata hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_005968.1:

i. posiciones C394151-394128

ii. posiciones C393478-393453

iii. posiciones C395030-395007

iv. posiciones C394836-394807

En modalidades específicas, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida glabrata comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 124, 125, 126 o 127.

En la presente descripción se describe al menos una sonda para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida krusei.

De acuerdo con algunas modalidades, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida krusei hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso JQFK01000016.1:

i. posiciones 61770-61793

ii. posiciones C60990-60967

iii. posiciones 60462-60485

iv. posiciones 61815-61838

v. posiciones c61970-61945

En modalidades específicas, la sonda que híbrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida krusei comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 128, 129, 130, 131 o 132. En la presente descripción se describe al menos una sonda para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida guilliermondii. De acuerdo con algunas modalidades, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida guilliermondii hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_001809800.1:

i. posiciones C909577-909552

ii. posiciones c911088-911065

iii. posiciones 910878-910904

En modalidades específicas, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida guilliermondii comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 133, 134 o 135. En la presente descripción se describe al menos una sonda para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida auris.

De acuerdo con algunas modalidades, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida auris hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW 017263971.1:

i. posiciones C32744-32721

ii. posiciones C32421-32398

iii. posiciones C32629-32605

iv. posiciones 33233-33257

v. posiciones 32542-32563

vi. posiciones 32350-32373

vii. posiciones C33627-33606

viii. posiciones c32218-32196

ix. posiciones C32890-32864

x . posiciones C33259-33236

xi. posiciones C32061-32038

En modalidades específicas, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida auris comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 136-146. En la presente descripción se describe al menos una sonda para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus fumigatus. De acuerdo con algunas modalidades, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus fumigatus hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_007195.1:

i. posiciones C3721651-3721628

ii. posiciones 3721658-3721681

iii. posiciones 3721848-3721870

En modalidades específicas, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus fumigatus comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 78, 81 o 85.

En la presente descripción se describe al menos una sonda para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus niger

De acuerdo con algunas modalidades, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus niger hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NT_166533.1:

i. posiciones c540161 -540138.

En modalidades específicas, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus niger comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 88.

En la presente descripción se describe al menos una sonda para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus flavus.

De acuerdo con algunas modalidades, la sonda que híbrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus flavus híbrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NW_002477240.1:

i. posiciones C382572-382549

En modalidades específicas, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus flavus comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 91.

En la presente descripción se describe al menos una sonda para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans.

De acuerdo con algunas modalidades, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans hibrida con una de las secuencias blanco siguientes de la secuencia de nucleótidos con número de acceso NC_006693.1:

i. Posiciones 702724-702747

ii. Posiciones 702526-702549

iii. Posiciones 702805-702829

iv. Posiciones 702423-702446

v. Posiciones 701435-701458

En modalidades específicas, la sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 95, 98, 101, 104 o 107.

Las sondas, como se explica en la presente descripción, se usan preferentemente en combinación, por ejemplo, en reacciones múltiples. La invención proporciona conjuntos de sondas que comprenden al menos dos sondas de la invención y que se pretende usar juntas (por ejemplo, en una reacción múltiple y/o mezcla maestra). Por tanto, en algunas modalidades, cada sonda se marca diferencialmente en comparación con las otras sondas (que se usan en la amplificación). Como ya se comentó, muchos protocolos de amplificación de ácidos nucleicos implican el uso de una sonda. Los ejemplos incluyen sondas hidrolíticas (por ejemplo, sondas TAQMAN) y sondas de horquilla (por ejemplo, BALIZAS M OLECULARES). En algunas modalidades las sondas también pueden unirse a los cebadores (por ejemplo, sondas SCORPION). Tales sondas pueden marcarse diferencialmente como comprendería fácilmente un experto en la técnica. Esto puede implicar la inclusión de diferentes fluoróforos y/o diferentes apagadores de fluorescencia.

Los cebadores y sondas de la invención (que pueden denominarse "componentes de detección") se combinan ventajosamente entre sí para facilitar la detección de hongos en base a la amplificación de ácidos nucleicos, y la caracterización en algunas modalidades. Las combinaciones preferidas de pares de cebadores y sondas se enuncian en la Tabla B. Por tanto, la invención también proporciona un kit para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende al menos un par de cebadores de la invención y/o al menos una sonda de la invención.

Los kits que contienen componentes de detección de todas las Cándida y de todos los Aspergillus pueden combinarse. Estos pueden combinarse además con componentes de detección para detectar Cryptococcus neoformans. Por tanto, el kit puede comprender combinaciones de pares de cebadores que permitan la detección de Cándida, Aspergillus y Cryptococcus neoformans. Los pares de cebadores pueden proporcionarse en la forma de una combinación de mezcla maestra (es decir, una única mezcla maestra que contiene los pares de cebadores en las concentraciones adecuadas). Dichos kits pueden comprender además las sondas relevantes que permitan la detección de Cándida, Aspergillus y Cryptococcus neoformans. Las sondas también pueden incluirse en la combinación de la mezcla maestra (nuevamente a una concentración adecuada). Un kit específico útil de acuerdo con la invención comprende cebadores que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en las secuencias de nucleótidos de s E q ID NO: 1 y 2 (para la detección de todas las Cándida), las SEQ ID NO: 70 y 71 (para la detección pan-Aspergillus) y las SEQ ID NO: 93 y 94 (para la detección de Cryptococcus neoformans). Dicho kit puede comprender además las sondas de SEQ ID NO: 3, 72 y 95 respectivamente.

Otros kits de la invención, que pueden combinarse con los kits descritos anteriormente, son útiles para identificar la especie responsable de una infección por Cándida en una muestra. Estos contienen cebadores apropiados específicos para las especies de Cándida de la invención. Los pares de cebadores pueden proporcionarse en la forma de una combinación de mezcla maestra (es decir, una única mezcla maestra que contiene los pares de cebadores en las concentraciones adecuadas). Un kit específico útil de acuerdo con la invención comprende cebadores que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 48 y 49, 18 y 19, 24 y 25, 40 y 41, 6 y 7, 8 y 9, 16 y 17 y 38 y 39 respectivamente.

Otros kits de la invención, que pueden combinarse con los kits descritos anteriormente, son útiles para identificar la especie responsable de una infección por Aspergillus en una muestra. Estos contienen cebadores apropiados específicos para las especies de Aspergillus de la invención. Los pares de cebadores pueden proporcionarse en la forma de una combinación de mezcla maestra (es decir, una única mezcla maestra que contiene los pares de cebadores en las concentraciones adecuadas). Un kit específico útil de acuerdo con la invención comprende cebadores que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 80 y 82, 86 y 87, 90 y 92.

Los kits de la invención pueden contener diversos componentes adicionales. Por ejemplo, pueden contener reactivos necesarios para la amplificación. Estos pueden contener una o más de una polimerasa, dNTP, MgCh, tampón, etc. En algunas modalidades, los kits pueden incluir reactivos de extracción de ADN. Más específicamente, los kits pueden incluir reactivos para extraer ADN de una muestra de sangre. Los kits pueden incorporar un portador adecuado en el que tienen lugar las reacciones de amplificación. Ventajosamente, dicho portador puede comprender una placa de pocillos múltiples, como una placa de 48 o 96 pocillos, por ejemplo. Dicho portador permite que los métodos de detección se lleven a cabo en volúmenes relativamente pequeños, lo que facilita la ampliación y minimiza el volumen de muestra requerido.

Los kits incorporarán típicamente las instrucciones adecuadas. Estas instrucciones permiten que los métodos de la invención se lleven a cabo de forma fiable mediante el uso de los kits de la invención.

Mientras que los cebadores y sondas particulares se han descrito ampliamente y se aplican de manera útil en los métodos de la invención, pueden diseñarse y aplicarse otros cebadores y sondas para dirigirlos a ILV3. En consecuencia, la invención proporciona un método general para detectar una infección por hongos/levaduras en una muestra, que comprende:

a. realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos para amplificar el gen ILV3 de hongos/levaduras b. detectar el producto de amplificación para determinar si la muestra contiene una infección por hongos/levaduras,

en donde la muestra comprende una muestra clínica obtenida de un sujeto humano.

De acuerdo con todos los aspectos de la invención, ILV3 puede usarse para identificar cualquier hongo/levadura de interés. Sin embargo, por "amplificar el gen ILV3" no se pretende que todo el gen ILV3 deba amplificarse. Como sabría fácilmente el experto, sólo es necesario amplificar una porción del gen de ILV3 para indicar la presencia del gen de ILV3. El tamaño mínimo del producto de amplificación se rige típicamente por la longitud del cebador (y la sonda si se incluye). Los productos de amplificación típicos pueden tener entre 50 y 500 nucleótidos de longitud, como, entre 50 y 250 nucleótidos. "Infección" se refiere simplemente a la presencia del hongo/levadura en una muestra que normalmente no contendría tal hongo o levadura. Por tanto, los métodos de la invención también son sensibles así como también específicos para permitir la determinación incluso de niveles bajos de células fúngicas en la muestra. Una "muestra" en el contexto de la presente invención es una muestra que comprende una muestra clínica obtenida de un sujeto humano. Puede no conocerse, a priori, que la muestra contenga un hongo. La muestra se obtiene de un sujeto humano. Por lo tanto, la muestra puede contener material genético humano (en particular ADN humano). Por tanto, la muestra comprende una muestra clínica, tal como una muestra de sangre. Por muestra de sangre se entiende cualquier muestra que comprenda sangre o un derivado de la misma. Por tanto, el suero y el plasma se incluyen junto con el hemocultivo (es decir, sangre añadida a un medio de cultivo). Los métodos de la invención son particularmente aplicables a la detección e identificación rápidas de la fuente de una infección fúngica. Por tanto, la muestra puede comprender una muestra de hemocultivo de un paciente del que se sospecha que padece, o que es examinado para detectar, una infección en la sangre. La muestra puede tener cualquier volumen adecuado, como de 1 a 10 ml, preferentemente una muestra de hemocultivo de 1 ml.

La muestra puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en tejido o células y puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en un esputo o una muestra de sangre o una muestra de plaquetas, por ejemplo.

Mientras que la invención es aplicable potencialmente a cualquier hongo o levadura, existen hongos particulares de importancia para los diagnósticos clínicos. Por tanto, la invención se ha desarrollado para dirigirla a géneros y especies fúngicas que causan infecciones de transmisión sanguínea con una frecuencia relativamente alta. Por tanto, la invención puede enfocarse en la detección y, opcionalmente, la discriminación de especies de Cándida. La invención puede permitir la detección de todas las especies siguientes:

i. Cándida albicans

ii. Cándida dubliniensis

iii. Cándida tropicalis

iv. Cándida parapsilosis

v. Cándida glabrata

vi. Cándida krusei

vii. Cándida guilliermondii

viii. Cándida auris

Esto puede ser a través de la dirección de todas las Cándida o por dirección específica de especie del gen ILV3 como se explica con más detalle en la presente descripción. La invención puede centrarse adicional o alternativamente en la detección y, opcionalmente, en la discriminación de las especies de Aspergillus. La invención puede permitir la detección de al menos 1, 2 o las 3 especies siguientes:

i. Aspergillus fumigatus

ii. Aspergillus niger

iii. Aspergillus flavus

Esto puede ser a través de la dirección de todos los Aspergillus o por dirección específica de especie del gen ILV3 como se explica con más detalle en la presente descripción. La invención puede adicional, o alternativamente, enfocarse en la detección de Cryptococcus neoformans.

La invención, por tanto, proporciona un método para detectar una infección por hongos/levaduras en una muestra, que comprende:

a. realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos que comprende los siguientes componentes:

i. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Cándida, opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen ILV3 de las especies de Cándida; y

ii. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Aspergillus, opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen ILV3 de las especies de Aspergillus; y/o

iii. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans, opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans

b. detectar los productos de amplificación para determinar si la muestra contiene una infección por hongos/levaduras,

en donde la muestra comprende una muestra clínica obtenida de un sujeto humano.

Los métodos de la invención pueden implicar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos que sea capaz de amplificar, de manera específica, el gen ILV3 de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o las 12 de las especies siguientes:

i. Cándida albicans

ii. Cándida dubliniensis

iii. Cándida tropicalis

iv. Cándida parapsilosis

v. Cándida glabrata

vi. Cándida krusei

vii. Cándida guilliermondii

viii. Cándida auris

ix. Aspergillus fumigatus

x. Aspergillus niger

xi. Aspergillus flavus

xii. Cryptococcus neoformans.

La amplificación usada en los métodos de la invención puede implicar el uso de un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Cándida. Adicional o alternativamente, los métodos pueden implicar el uso de una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Cándida. En algunas modalidades, un cebador directo e inverso común y/o una sonda común hibrida con el gen ILV3 de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 y preferentemente con todas, de las especies de Cándida siguientes:

i. Cándida albicans

ii. Cándida dubliniensis

iii. Cándida tropicalis

iv. Cándida parapsilosis

v. Cándida glabrata

vi. Cándida krusei

vii. Cándida guilliermondii

viii. Cándida auris

Por tanto, en algunas modalidades, se utiliza la amplificación pan-Cándida. Los cebadores y sondas adecuados de la invención para la amplificación pan-Cándida se describen en la presente descripción, incluidas las regiones blanco específicas dentro de iLV3, y pueden utilizarse todos estos cebadores y sondas. En una modalidad, los métodos de la invención comprenden el uso de un cebador directo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1, un cebador inverso que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3.

En otras modalidades, incluidos los métodos para discriminar la fuente de la infección, se adopta la amplificación específica de las especies de Cándida. En tales modalidades, un cebador directo e inverso y/o sonda independiente híbrida con el gen ILV3 de cada una de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 y preferentemente con todas, de las especies de Cándida siguientes:

i. Cándida albicans

ii. Cándida dubliniensis

iii. Cándida tropicalis

iv. Cándida parapsilosis

v. Cándida glabrata

vi. Cándida krusei

vii. Cándida guilliermondii

viii. Cándida auris

Por tanto, hay un par de cebadores y/o una sonda independientes para la detección de cada especie de Cándida. Los cebadores y sondas adecuados de la invención para la amplificación específica de especie de Cándida se describen en la presente descripción, incluidas las regiones blanco específicas dentro de ILV3, y pueden utilizarse todos estos cebadores y sondas.

La amplificación usada en los métodos de la invención puede implicar adicional o alternativamente el uso de un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Aspergillus. Adicional o alternativamente, los métodos pueden implicar el uso de una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Aspergillus. En algunas modalidades, un cebador directo e inverso común y/o una sonda común hibrida con el gen iLV3 de al menos 2, y preferentemente con las 3, de las especies de Aspergillus siguientes:

i. Aspergillus fumigatus

ii. Aspergillus niger

iii. Aspergillus flavus

Por tanto, en algunas modalidades, se utiliza la amplificación de todos los Aspergillus. Los cebadores y sondas adecuados de la invención para la amplificación de todos los Aspergillus se describen en la presente descripción, incluidas las regiones blanco específicas dentro de ILV3, y se pueden utilizar todos estos cebadores y sondas. En una modalidad, los métodos de la invención comprenden el uso de un cebador directo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 70 o 73, un cebador inverso que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 71 o 74 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 72 o 75.

En otras modalidades, incluidos los métodos para discriminar la fuente de la infección, se adopta la amplificación específica de especies de Aspergillus. En dichas modalidades, un cebador directo e inverso y/o sonda independiente hibrida con el gen ILV3 de cada uno de al menos 2, y preferentemente con las 3, de las especies de Aspergillus siguientes:

i. Aspergillus fumigatus

ii. Aspergillus niger

iii. Aspergillus flavus.

Por tanto, hay un par de cebadores y/o una sonda independientes para la detección de cada especie de Aspergillus. Los cebadores y sondas adecuados de la invención para la amplificación específica de especie de Aspergillus se describen en la presente descripción, incluidas las regiones blanco específicas dentro de ILV3, y se pueden utilizar todos estos cebadores y sondas.

La amplificación usada en los métodos de la invención puede implicar adicional o alternativamente el uso de un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans. Adicional o alternativamente, los métodos pueden implicar el uso de una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans. Los cebadores y sondas adecuados de la invención para la amplificación de Cryptococcus neoformans se describen en la presente descripción, incluidas las regiones blanco específicas dentro de ILV3, y se pueden utilizar todos estos cebadores y sondas.

De acuerdo con los métodos de la invención, los productos de amplificación pueden detectarse simplemente para indicar que una especie fúngica está presente en la muestra. Los productos de amplificación pueden detectarse mediante cualquier medio conocido, como apreciaría fácilmente un experto en la técnica. En algunas modalidades, sin embargo, se usa la discriminación de los productos de amplificación para identificar el género y/o la especie del hongo presente en la muestra. Por tanto, los métodos de la invención pueden implicar la detección e identificación de una infección por hongos/levaduras en una muestra. Estos pueden comprender realizar la amplificación de ácidos nucleicos y detectar y distinguir los productos de amplificación para identificar la infección por hongos/levaduras.

La invención, por lo tanto, proporciona un método para detectar e identificar una infección por hongos/levaduras en una muestra, que comprende:

a. realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos que comprende los siguientes componentes:

i. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Cándida, opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen ILV3 de las especies de Cándida; y

ii. un cebador directo e inverso que híbrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Aspergillus, opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen ILV3 de las especies de Aspergillus; y/o

iii. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans, opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans

b. detectar y distinguir los productos de amplificación para identificar la infección por hongos/levaduras, en donde la muestra comprende una muestra clínica obtenida de un sujeto humano.

Los métodos de la invención que permiten identificar la identidad del hongo en la muestra son útiles particularmente para orientar el tratamiento de una manera que es específica para la infección en cuestión. Por tanto, estos son útiles independientemente de los métodos generales de detección de hongos. Por tanto, la invención también se refiere a métodos para identificar la especie responsable de una infección por Cándida en una muestra, que comprende:

a. realizar reacciones de amplificación de ácidos nucleicos mediante el uso de al menos tres, 4, 5, 6, 7 o todos los conjuntos siguientes de componentes:

i. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida albicans ii. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida dubliniensis: iii. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida tropicalis: iv. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida parapsilosis: v. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida glabrata: vi. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida krusei: vii. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida guilliermondii

viii. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida auris: b. detectar y distinguir los productos de amplificación para identificar la especie responsable de la infección por Cándida,

en donde la muestra comprende una muestra clínica obtenida de un sujeto humano.

Estos métodos pueden emplear cualquiera de los cebadores (y sondas) adecuados de la invención que se describen en detalle en la presente descripción.

De manera similar, la invención también proporciona un método para identificar la especie responsable de una infección por Aspergillus en una muestra, que comprende:

a. realizar reacciones de amplificación de ácidos nucleicos mediante el uso de al menos dos o los tres de los conjuntos siguientes de componentes:

i. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus fumigatus ii. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus niger iii. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus flavus b. detectar y distinguir los productos de amplificación para identificar la especie responsable de la infección por Aspergillus,

en donde la muestra comprende una muestra clínica obtenida de un sujeto humano.

Estos métodos pueden emplear cualquiera de los cebadores (y sondas) adecuados de la invención que se describen en detalle en la presente descripción. En algunas modalidades estos métodos pueden emplearse en paralelo con métodos de identificación de Cándida.

La invención proporciona métodos que pueden considerarse un examen general para determinar si una infección fúngica está presente. La invención también proporciona métodos más específicos que permiten identificar la especie responsable de la infección. Estos métodos pueden combinarse ventajosamente. En consecuencia, la invención proporciona además un método para detectar e identificar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende:

a. Realizar un método de la invención para determinar si Cándida, Aspergillus y/o Cryptococcus neoformans está presente en la muestra

b. En el caso de que una especie de Cándida o Aspergillus esté presente en la muestra realizar un método de la invención para determinar qué especie está presente

para, de esta manera, detectar e identificar la infección por levaduras/hongos en la muestra, en donde la muestra comprende una muestra clínica obtenida de un sujeto humano.

En la etapa a, la detección de Cryptococcus neoformans puede eliminar el requisito de realizar la etapa b. Alternativamente, el resultado de la etapa a puede ser simplemente que hay un hongo presente en la muestra. En tales métodos, la etapa b puede comprender adicionalmente la realización de un método de la invención para determinar si específicamente Cryptococcus neoformans está presente en la muestra.

Como se discute en la presente descripción, los métodos de la invención generalmente implican la amplificación del ácido nucleico del gen ILV3. Puede usarse cualquier forma de amplificación de ácidos nucleicos, aunque se prefiere la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Dichos métodos pueden emplear cualquier forma adecuada de tecnología de detección. En algunas modalidades puede usarse la monitorización en tiempo real de la amplificación. En otras modalidades, puede emplearse un método de detección de punto final. En algunas modalidades, la amplificación de ácidos nucleicos se realiza como una reacción de amplificación de ácidos nucleicos múltiple. En otras modalidades, cada amplificación de ácidos nucleicos dirigida a ILV3 de un género o especie diferente se incluye en un área de reacción independiente. Un área de reacción es un sitio definido en el que tiene lugar la amplificación. Puede ser un pocillo en una placa de pocillos múltiples o un tubo de ensayo, por ejemplo. La secuenciación, en particular la secuenciación de próxima generación (NGS), se puede utilizarse para la detección y opcionalmente también para la discriminación. Ejemplos de plataformas NGS incluyen la secuenciación lllumina (como Hi-Seq y Mi-Seq), secuenciación SM RT (Pacific Biosciences), secuenciación Nanopore, secuenciación SoLID, pirosecuenciación (por ejemplo Roche 454), secuenciación de una sola molécula (SeqLL/Helicos) e Ion-Torrent (Thermo Fisher) que son bien conocidos por los expertos y están disponibles comercialmente. Como se describe en la presente descripción, el gen ILV3 de diferentes hongos tiene una secuencia de nucleótidos diferente que puede examinarse mediante el uso de la secuenciación para identificar la fuente de una infección fúngica. La secuenciación puede proporcionar resultados rápidos y cuantitativos.

Para una detección simple, la mera presencia de un producto de amplificación indica que hay un hongo presente en la muestra. Como se discute en la presente descripción, este es típicamente un hongo seleccionado entre Cándida, Aspergillus y Cryptococcus neoformans. Sin embargo, donde se requiera información más detallada sobre la naturaleza del hongo, es necesario que los productos de amplificación puedan distinguirse. En algunas modalidades, distinguir implica un análisis de la curva de fusión.

Se diseñaron diversos pares de cebadores descritos en la presente descripción para que tengan curvas de fusión que no se solapen. Por tanto, cuando se incluye en una amplificación múltiple, la curva de fusión generada permite identificar la especie de Cándida o Aspergillus en la muestra. Esta puede ser una múltiple independiente para Cándida o la múltiple usada para la discriminación de Aspergillus. En la presente descripción se muestra que los métodos de la invención basados en un análisis de la curva de fusión permiten la discriminación de 8 especies diferentes de Cándida y 3 especies diferentes de Aspergillus respectivamente. El análisis de la curva de fusión de acuerdo con la invención puede o no depender del uso de sondas de secuencia específica. En modalidades preferidas, los métodos no requieren el uso de sondas específicas de ILV3. En su lugar, se puede usar un reactivo independiente de la secuencia, como un agente intercalante, un ejemplo del cual es SYB R G REEN , que puede usarse para monitorear la amplificación.

En otras modalidades, los productos de amplificación pueden distinguirse mediante el uso de cebadores y/o sondas marcados diferencialmente. En algunas modalidades, al menos un cebador y/o sonda se marca diferencialmente de acuerdo con el género para permitir la identificación del género de hongo/levadura en la muestra. En algunas modalidades, al menos un cebador y/o sonda se marca diferencialmente de acuerdo con la especie de Cándida y/o Aspergillus para permitir la identificación de la especie de Cándida y/o Aspergillus en la muestra.

En más modalidades, los productos de amplificación pueden distinguirse mediante la determinación del tamaño de los productos de amplificación. Pueden diseñarse pares de cebadores para amplificar, si es necesario, productos de amplificación de diferentes tamaños dentro del gen ILV3 de diferentes géneros y especies.

En otras modalidades, los productos de amplificación pueden distinguirse de acuerdo con la secuencia.

La invención puede implementarse ventajosamente para detectar también bacterias en una muestra. Más específicamente, los métodos pueden permitir además determinar si una bacteria o un hongo está presente en la muestra. En algunas modalidades, los métodos pueden permitir, distinguir si la bacteria es grampositiva o gramnegativa. Los reactivos adecuados para dichos métodos para detectar bacterias se describen en Klaschik y otros (J. Clin. Microbiol. 2002, 40 (11): 4304) y Wu y otros (JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, agosto de 2008, p. 2613-2619)

Dichos métodos pueden depender del uso de una sonda para distinguir las bacterias gramnegativas de las grampositivas. En algunas modalidades, los cebadores amplifican partes específicas de la región 16S del ADN bacteriano. Los cebadores PLK1 (5-TACGGGAGGCAGCAGT-3 - SEQ ID NO: 108) y PLK2 (5-TATTACCGC GGCTGCT-3 - SEQ ID NO: 109) son muy conservados en diferentes grupos de eubacterias. Estos cebadores sintetizan un fragmento de 187 pb. PLK2 puede marcarse internamente con fluoresceína. Las sondas de hibridación marcadas con colorante fluorescente ISN2 (5-CCGCAGAATAAG CACCGGCTAACTCCGT-3 - SEQ ID NO: 110) e ISP2 (5- CCT AAC CAG AAA GCC ACG GOT AAC TAC GTG-3 - SEQ ID NO: 111) emiten luz en diferentes longitudes de onda (640 y 705 nm) y pueden usarse para la detección y la diferenciación por tinción de Gram del ADN bacteriano mediante una señal de fluorescencia. Otros cebadores adecuados pueden comprender la secuencia de nucleótidos CAACGCGAAGAACCTTACC (SEQ ID NO: 112) y ACG TCATCCCCACCTTCC (SEQ ID NO: 113). Una sonda grampositiva adecuada comprende la secuencia de nucleótidos 5'-FAM-ACGACAACCATGCACCACCTG-TAMRA-3'(SEQ ID No : 114). Una sonda gramnegativa adecuada comprende la secuencia de nucleótidos 5'-HEX-ACGACAGCCATGCAGCACCT-TAMRA'3 (SEQ ID NO: 115). Aunque estas sondas se marcan diferencialmente para permitir la detección diferencial, el experto apreciará que pueden adoptarse enfoques alternativos como los descritos en la presente descripción para facilitar la detección.

Por tanto, la invención proporciona además un método para detectar e identificar una infección microbiana en una muestra, que comprende:

a. realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos que comprende los siguientes componentes:

i. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias grampositivas; opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias grampositivas

ii. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias gramnegativas; opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias gramnegativas

iii. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de al menos una especie de hongo/levadura; opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen ILV3 de al menos una especie de hongo/levadura b. detectar y distinguir los productos de amplificación para determinar si la muestra contiene una infección bacteriana gramnegativa, una infección bacteriana grampositiva y/o una infección por hongos/levaduras en donde la muestra comprende una muestra clínica obtenida de un sujeto humano.

Preferentemente, la amplificación se realiza como una múltiple, aunque esto no es esencial como se explica en la presente descripción. La amplificación de ILV3 puede realizarse de acuerdo con cualquier método de la invención o mediante el uso de cualquiera de los cebadores y/o sondas relevantes de la invención.

También se proporcionan los kits correspondientes. Por tanto, la invención proporciona un kit para la discriminación de una infección microbiana en una muestra, que comprende los componentes para realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos múltiple que comprende:

a. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias grampositivas; opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias grampositivas

b. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias gramnegativas; opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias gramnegativas y

c. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de al menos una especie de hongo/levadura; opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen ILV3 de al menos una especie de hongo/levadura;

en donde los componentes a, b y c producen cada uno productos de amplificación distinguibles, lo que permite por tanto una determinación de si la muestra contiene una infección bacteriana gramnegativa, una infección bacteriana grampositiva y/o una infección por hongos/levaduras.

Puede incorporarse cualquier cebador y sonda adecuado de acuerdo con la invención en dichos kits junto con cebadores y sondas para la amplificación del ARNr 16S. Todas las modalidades de la invención que se discuten en la presente descripción se aplican mutatis mutandis a estos aspectos de la invención. Estos métodos pueden ir seguidos de la identificación de las especies fúngicas donde sea necesario. Los kits pueden contener los componentes adecuados para este propósito como se describe en la presente descripción

La invención prevé efectivamente la selección de pacientes para la terapia y, de manera crítica, evita

el tratamiento innecesario con agentes antifúngicos como fungicidas (o antibióticos si también se detectan bacterias). El uso incorrecto de agentes antifúngicos y antibióticos provoca resistencia.

En consecuencia, la invención también se refiere a un método para seleccionar un sujeto para el tratamiento con un agente antifúngico como un fungicida (o un antibiótico si se detectan bacterias) que comprende realizar un método que se describe en la presente descripción y seleccionar al sujeto para el tratamiento donde se detecta, opcionalmente también se identifica, una infección.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona un método para predecir la sensibilidad de un sujeto al tratamiento con un agente antifúngico como un fungicida (o un antibiótico si se detectan bacterias), que comprende realizar un método que se describe en la presente descripción y predecir la sensibilidad de un sujeto al tratamiento donde se detecta, opcionalmente también se identifica, una infección.

En un aspecto adicional que no es parte de la invención, se proporciona un método para tratar una infección que comprende la administración de un agente antifúngico como un fungicida (o un antibiótico si se detectan bacterias) al sujeto que padece la infección, en donde el sujeto se ha seleccionado para el tratamiento mediante la realización de un método que se describe en la presente descripción.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un agente antifúngico como un fungicida para su uso en un método para tratar una infección, en donde el sujeto se ha seleccionado para el tratamiento mediante la realización del método que se describe en la presente descripción.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un agente antifúngico como un fungicida para su uso en un método para tratar una infección, en donde el sujeto presenta, en una muestra, un gen ILV3 detectable, y en donde la muestra comprende una muestra clínica obtenida de un sujeto humano.

La infección puede ser una infección por hongos o levaduras, en particular una infección por Cándida, Aspergillus o Cryptococcus neoformans como se explica en la presente descripción con mayor detalle. Esto puede orientar los detalles específicos del tratamiento proporcionado. Por ejemplo, se ha demostrado que C. auris es resistente a tres clases principales de fármacos antifúngicos, incluidos los azoles (por ejemplo, fluconazol). De manera similar, especies como C. glabrata y C. krusei, pueden tener una susceptibilidad disminuida a los agentes antifúngicos como el fluconazol con relación a otras especies de Cándida (Trick y otros., 2002).

En determinadas modalidades, el agente antifúngico, tal como un fungicida, es un agente de amplio espectro. Esto es particularmente útil si se detecta una infección pero aún no se ha caracterizado la especie responsable de la infección. Una vez que se detecta la infección, la naturaleza de la infección puede caracterizarse para permitir una terapia más dirigida (por ejemplo, las especies de Cándida que causan la infección). Por tanto, pueden emplearse combinaciones de agentes antifúngicos de amplio espectro tal como un fungicida (o un antibiótico si se detectan bacterias) y terapias más específicas como parte de los métodos que se describen en la presente descripción.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra las curvas de amplificación en las que se logró la identificación de 8 especies de Cándida diferentes mediante el uso de un solo conjunto de cebador-sonda que contiene bases degeneradas (conjunto pan-Cándida).

La Figura 2 es una superposición de las curvas de fusión de múltiples especies de Cándida mediante el uso del mejor conjunto único de cebador-sonda para cada especie.

Las figuras 3A (conjunto 1) y 3B (conjunto 2) muestran las curvas de amplificación en las que dos conjuntos de cebador-sonda de todos los Aspergillus produjeron la amplificación para las tres especies de Aspergillus que se ensayaron.

Las Figuras 4A y 4B muestran las curvas de amplificación de los experimentos para determinar qué conjuntos de cebador-sonda tuvieron el máximo rendimiento, en términos de valor de detección de Ct (bajo) y nivel de fluorescencia (alto) al final del protocolo de amplificación.

Descripción detallada (ejemplos experimentales)

El gen ILV3 representa un gen novedoso para la detección de Cándida y otros organismos fúngicos (incluidos Aspergillus spp. y Cryptococcus neoformans). El gen ILV3, que codifica para la dihidroxiácido deshidratasa, una enzima que cataliza la tercera etapa en la vía común que conduce a la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada, es un gen específico de levaduras/hongos con 0 % (cero) de homología con cualquier ADN humano. (Liu y otros, 2006). Los métodos actuales de detección de hongos se enfocan en el ADN ribosómico (ya sea 18S, espaciadores internos transcritos (5.8S) o ARNr 28S), que tienen grandes regiones de homología con genes equivalentes que se encuentran en humanos (referencia: Khot y otros, 2009; y Kan, 1992). Este alto nivel de homología hace que la generación de cebadores específicos y sondas de detección sea un desafío y requiera mucho tiempo, ya que es necesario verificar los conjuntos de cebadores-sondas para determinar su reactividad cruzada con el ADN humano. Además, considerando que los productos y los métodos de la invención se usarán a menudo como lisados de muestra de prueba derivados de muestras de sangre humana, cualquier ADN humano residual se cortará aleatoriamente, lo que puede aumentar la probabilidad de que una secuencia de ADN humano tenga complementariedad y, por tanto, reactividad cruzada, con un conjunto de cebadores de hongos basados en ARNr ribosómico.

Por el contrario, con el uso de un conjunto de cebador-sonda basado en ILV3- este proceso de selección no es necesario y se elimina el riesgo de reactividad cruzada con el ADN humano. En paralelo a dirigirlas a ILV3, también se decidió emplear sondas de hidrólisis (“TAQMAN”) para la detección de muestras. Las sondas TAQMAN permiten lograr una excelente sensibilidad, especificidad y rendimiento del qPCR. Sin embargo, en otras modalidades, pueden usarse tipos de sonda alternativos. Por ejemplo, pueden usarse BALIZAS M OLECULARES O ESCO RPIO N ES para dirigirlas a ILV3 para la detección de levaduras y hongos.

Además de dirigirse a ILV3 para la detección de Cándida, este gen también puede ser un blanco para, pero sin limitarse a, la detección de otros patógenos fúngicos incluidas varias especies de Aspergillus, así como también Cryptococcus neoformans.

Para la identificación de Cándida, el análisis bioinformático del gen ILV3 identificó (a través del alineamiento de secuencias de este gen contra múltiples especies de Cándida) dos regiones que podrían usarse para la detección de las especies de Cándida. Los experimentos demostraron que la identificación de múltiples especies (8) podría lograrse mediante el uso de un solo conjunto de cebador-sonda, que contenía bases degeneradas (un conjunto de cebador-sonda 'de todas las Cándida'; conjunto de cebador-sonda 2 -Ver la Tabla 1 y la Figura 1.

Organismo Cebador-Sonda Organismo Cebador-Sonda Ct|dRf Organismo Cebador-Sonda C.alblcans(#5) Conjunto 1-a/sen « V ít C.albicans(#7) Conjunto 1-a/sen C.parapsilosis Conjunto 1-a/sen C.alblcans(#5) Conjunto 1-a/sen C.albicans(#7) Conjunto 1-a/sen No Ct C.parapsilosls Conjunto 1-a/sen C.albicans(#5) Conjunto 1-a/sen _{« * í¿} C.albicans(#7) Conjunto 1-a/sen C.parapsilosls Conjunto 1-a/sen C.albicans(#5) Conjunto 1-sen C.alb¡cans(#7) Conjunto 1-sen ífe r t C.parapsilosls Conjunto 1-sen C.albicans(#5) Conjunto 1-sen C.albicans(#7) Conjunto 1-sen ■HCCT C.parapsilosls Conjunto 1-sen C.albicans(#5) Conjunto 1-sen

C.albicans(#7) Conjunto 1-sen M i C .parapsilosis Conjunto 1-sen C.albicans(#5) Conjunto 2-a/sen 39.66 C.alb¡cans(#7) Conjunto 2-a/sen 36,4Í C.parapsilosls Conjunto 2-a/sen

C.albicans(#5) Conjunto 2-a/sen 40.04 C.albicans(#7) Conjunto 2-a/sen 37,49' C .parapsilosis Conjunto 2-a/sen 39,05 C.albicans(#5) Conjunto 2-a/sen 39,9 C.alblcans(#7) Conjunto 2-a/sen 37,491 C.parapsilosls Conjunto 2-a/sen 38,74' C.albicans(#5) Conjunto 2-sen 43,79 C.albicans(#7) Conjunto 2-sen 41 C .parapsilosis Conjunto 2-sen 41,99' C.albicans(#5) Conjunto 2-sen 43,07 C.alb¡cans(#7) Conjunto 2-sen 38,79' C .parapsilosis Conjunto 2-sen 41,26' C.albicans(#5) Conjunto 2-sen 43.84 C.albicans(#7) Conjunto 2-sen 38,68' C.parapsilosls Conjunto 2-sen 41,49'

Organismo Cebador-Sonda Organismo Cebador-Sonda Organismo Cebador-Sonda Ct<dR| C.alblcans(#6) Conjunto 1-a/sen C.glabrata Conjunto 1-a/sen ■ ■ NTC. Conjunto 1-sen '-ioCt C.albicans(#6) Conjunto 1-a/sen C. glabrata Conjunto 1-a/sen I^TC Conjunto 1-a/sen C.albicans(#6) Conjunto 1-a/sen C. glabrata Conjunto 1-a/sen r*oCr N Tt Conjunto 2-sen '-■■-Ct C.alblcans(#6) Conjunto 1-sen C. glabrata Conjunto 1-sen --i i; : NTÍ. Conjunto 2-a/sen C.albicans(#6) Conjunto 1-sen C. glabrata Conjunto 1-sen W t*

C.alblcans(#6) Conjunto 1-sen C. glabrata Conjunto 1-sen

C.albicans(#6) Conjunto 2-a/sen C. glabrata Conjunto 2-a/sen 33,95'

C.alblcans(#6) Conjunto 2-a/sen C. glabrata Conjunto 2-a/sen 34,71:

C.albicans(#6) Conjunto 2-a/sen C. glabrata Conjunto 2-a/sen 35,84'

C.alblcans(#6) Conjunto 2-sen C. glabrata Conjunto 2-sen 36,86'

C.albicans(#6) Conjunto 2-sen C. glabrata Conjunto 2-sen 37,8!

C.alblcans(#6) Conjunto 2-sen

C. glabrata Conjunto 2-sen 401

Tabla 1

Para aumentar aún más el rendimiento de la detección de Cándida (para mejorar la sensibilidad y la especificidad) se diseñaron y ensayaron numerosas variantes del conjunto de cebador-sonda original, mediante la sustitución de bases dentro de la secuencia de los cebadores y la sonda. Las modificaciones de la secuencia del cebador inverso y la secuencia de la sonda no tuvieron ningún efecto beneficioso (datos no mostrados). Sin embargo, uno de los cebadores directos rediseñados mejoró la sensibilidad de detección de una especie de Cándida detectable anteriormente (es decir, un valor de Ct (Cp) más bajo con relación al cebador directo original - un aumento en el Delta Ct), así como también, mejorar la especificidad del rendimiento de la detección de Cándida guilliermondii, que anteriormente tenía una detección deficiente con el diseño original del cebador-sonda; ver la Tabla 2. Este nuevo, conjunto actualizado (SEQ ID NO: 1-3) se ha adoptado ahora (secuencias mostradas en la Tabla B).

Tabla 2

Un informe reciente de Public Health England enumera las especies individuales de Cándida asociadas con la candidemia (“Vigilancia de la candidemia en Inglaterra, Gales e Irlanda del Norte, 2014”). A partir de este informe, se decidió dirigirse a las especies siguientes de Cándida cuyos genomas han sido secuenciados y publicados: C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. dubliniensis, y C. guilliermondii. Además de estas especies, Cándida auris, la octava especie, también se agregó a la lista anterior de organismos a los que se dirigirá la identificación específica de especies. La razón de esto es que esta especie se ha identificado por Public Health England (“Cándida auris identificada en Inglaterra”) como un patógeno fúngico emergente significativo con casos esporádicos de C. auris que se identificaron por toda Inglaterra y otros países en todo el mundo. Además, se ha demostrado que C. auris tiene una propensión a la transmisión entre pacientes hospitalarios, así como también de mostrar resistencia a tres clases principales de fármacos antifúngicos, incluidos los azoles (por ejemplo, fluconazol). Datos epidemiológicos longitudinales adicionales mostraron un cambio reciente en la incidencia de infecciones de la sangre causadas por las especies que no son albicans de Cándida (Wisplinghoff y otros, 2014). Estas especies, por ejemplo C. glabrata y C. krusei, tienen una susceptibilidad disminuida a los agentes antifúngicos como el fluconazol con relación a otras especies de Cándida (Trick y otros, 2002). Por lo tanto, existe una necesidad clínica de poder discriminar y diferenciar entre estas ocho especies más prevalentes de Cándida, especialmente C auris.

Para lograr este nivel de diferenciación, el gen ILV3 se analizó de nuevo bioinformáticamente. Se diseñaron múltiples conjuntos de cebadores para cada especie individualmente, con un análisis bioinformático de cada conjunto de cebadores que se realizó para determinar la especificidad de estos conjuntos de cebadores para las especies de interés y garantizar que no se observara homología (reactividad cruzada) con otras especies de Cándida. Los conjuntos de cebadores resultantes se probaron por análisis de la curva de fusión, mediante el uso de la química de SYB R Green. Cada conjunto de cebadores generaría una región amplificada de ADN ('amplicón') de una temperatura de fusión (Tm) precisa. Se llevaron a cabo experimentos mediante el uso de todos los conjuntos de cebadores para determinar el perfil de Tm de cada conjunto de cebadores, para cada especie de Cándida - ver la Tabla 3.

Tabla 3

Una vez completado, se seleccionó el mejor conjunto único de cebador-sonda para cada especie para optimizar la distribución y la separación entre los valores de Tm de cada especie - ver la Tabla 4. Cuando estos conjuntos de cebadores se probaron de nuevo experimentalmente, y se superpuso el trazo de la curva de fusión de cada especie, hubo muy buena resolución entre los ocho trazos, lo que demuestra que este enfoque es una forma válida de discriminar entre las especies de Cándida individuales - ver la Figura 2. Estos conjuntos de cebadores proporcionan una definición de más especies de Cándida que la prueba actual de T2 Biosystems.

Tabla 4

Además de la detección de las especies de Cándida, ILV3 también puede usarse como un blanco para la detección de otros organismos fúngicos como las especies de Aspergillus (particularmente enfocado en Aspergillus fumigatus, Asp. niger, y Asp. flavus) y Cryptococcus neoformans. En un enfoque idéntico, como se esbozó anteriormente para Cándida, el análisis bioinformático y el alineamiento de secuencias, cuando fue aplicable, se usó para identificar las regiones adecuadas dentro del gen ILV3 para el diseño de un conjunto de cebador-sonda de todos los Aspergillus', así como también varios conjuntos de cebador-sonda para la identificación específica de especies de las tres especies de Aspergillus, así como también de C. neoformans.

Los experimentos demostraron que dos conjuntos de cebador-sonda de todos los Aspergillus produjeron amplificación para las tres especies de Aspergillus ensayadas, pero que se prefirió el diseño V1 (SEQ ID NO 70-72; Figura 3A) debido a una mejor fluorescencia entre estas especies - ver las Figuras 3A y 3B. Para la generación de los conjuntos de cebador-sonda específicos de especie, se probaron bioinformáticamente diversas iteraciones de diseño para cada especie para demostrar la especificidad de especie (especialmente importante para la detección de diferentes especies de Aspergillus), así como también de garantizar que no hubiera homología con otros organismos fúngicos o genes humanos. Luego se probaron los conjuntos de cebadores y sondas que pasaron este enfoque de validación. in vitro para determinar qué conjunto tuvo el rendimiento máximo, en términos de valor de detección de Ct (bajo) y nivel de fluorescencia (alto) al final del protocolo de amplificación - ver las Tablas 5-6. La Figura 4A muestra los trazos de la amplificación del conjunto cebador-sonda específico de especie elegido para las tres especies de Aspergillus: (Asp. fumigatus: SEQ ID NO: 79-81; Asp. niger. SEQ ID NO: 86-88; y Asp. flavus: SEQ ID NO: 89-91. Ver la Tabla B para las secuencias). La Figura 4B muestra el trazo de la amplificación del conjunto cebador-sonda elegido para la detección de Cryptococcus neoformans (SEQ ID NO: 93-95).

Tabla 5

Tabla 6

Junto con esto, se probaron conjuntos de cebadores para el análisis de la curva de fusión para diferenciar entre las tres especies de Aspergillus mencionadas anteriormente. Nuevamente, se utilizó el mismo enfoque bioinformático usado para la identificación de los cebadores de fusión de Cándida para encontrar cebadores de fusión adecuados para Aspergillus. Cuando estos cebadores de fusión de Aspergillus se probaron in vitro se logró una buena resolución entre el valor de Tm de cada una de las tres especies de Aspergillus - ver las Tablas 7-8.

Tabla 7

Tabla 8

Cada conjunto individual de cebador-sonda que se describe en la presente descripción y que se muestra en la Tabla B adjunta ha sido probado y validado experimentalmente, sin ninguna reactividad cruzada de los diversos conjuntos de cebador-sonda de ILV3 a un organismo no sea el blanco.

ILV3 representa un gen novedoso para la identificación de levaduras y organismos fúngicos, dentro del contexto de, pero sin limitarse a, confirmar su presencia dentro de muestras de sangre de pacientes sospechosos de tener infecciones en la sangre.

Referencias:

• Kan, V. L. (1993). Polymerase Chain Reaction for the Diagnosis of Candidemia. J. Infect. Dis. 168(3), 779­ 783.

• Khot, P. D., Ko, D. L. & Fredricks, D. N. (2009). Sequencing and Analysis of Fungal rRNA Operons for Development of Broad-Range Fungal PCR Assays. Appl. Environ. Microbiol. 75(6), 1559-1565.

• Liu, M., Healy, M. D., Dougherty, B. A., Esposito, K. M., Maurice, T. C., Mazzucco, C. E., Bruccoleri, R. E., Davison, D. B., Frosco, M., Barrett, J. F. & Wang, Y.-K. (2006). Conserved Fungal Genes as Potential Targets for Broad- Spectrum Antifungal Drug Discovery. Eukaryot. Cell. 5(4), 638-649.

• Public Health England (2015). Surveillance of Cándidaemia in England, Wales and Northern Ireland, 2014. Vol. 9, núm. 33; 18 de septiembre de 2015.

• Public Health England (2016). www.qov.uk/qovernment/publications/Cándida- auris-emergence-in-enqland.

Publicada el 1 de julio de 2016.

Trick, W. E., Fridkin, S. K., Edwards, J . R., Hajjeh, R. A., Gaynes, R. P.,

National Nosocomial Infections Surveillance System Hospitals (2002). Secular trend of hospital-acquired candidemia among intensive care unit patients in the United States during 1989-1999. Clin. Infect. Dis. 35(5), 627-630.

Wisplinghoff, H., Ebbers, J., Geurtz, L., Stefanik, D., Major, Y ., Edmond, M. B., Wenzel, R. P., Seifert, H. (2014). Nosocomial bloodstream infections due to Cándida spp. in the USA: species distribution, clinical features and antifungal susceptibilities. Int. J. Antimicrob. Agents. 43(1), 78-81.

Van BurikJA , Myerson D, Schreckhise RW, Bowden RA(1998). Panfungal PCR assay for detection offungal infection in human blood specimens. J Clin Microbiol. mayo de 1998; 36(5):1169-75. 36(5): 1169-75.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para detectar una infección por hongos/levaduras en una muestra, que comprende:

   a. realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos para amplificar el gen ILV3 de hongos/levaduras

   b. detectar el producto de amplificación para determinar si la muestra contiene una infección por hongos/levaduras,

   en donde la muestra comprende una muestra clínica obtenida de un sujeto humano.

   2 . El método de la reivindicación 1, en donde la reacción de amplificación de ácidos nucleicos comprende los siguientes componentes:

   i. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Cándida, opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen ILV3 de las especies de Cándida; y

   ii. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Aspergillus, opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen ILV3 de las especies de Aspergillus; y/o

   iii. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans,, opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen iLV3 de Cryptococcus neoformans.

   3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la reacción de amplificación de ácidos nucleicos amplifica el gen ILV3 de al menos 3, 4, 5, ⁶ , 7, ⁸ , 9, 10, 11 o las 12 de las especies siguientes:

   i. Cándida albicans

   ii. Cándida dubliniensis

   iii. Cándida tropicalis

   iv. Cándida parapsilosis

   v. Cándida glabrata

   vi. Cándida krusei

   vii. Cándida guilliermondii

   viii. Cándida auris

   ix. Aspergillus fumigatus

   x. Aspergillus niger

   xi. Aspergillus flavus

   xii. Cryptococcus neoformans.

   4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde la etapa a comprender:

   i. uso de un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Cándida, las especies de Aspergillus o Cryptococcus neoformans; y/o

   ii. uso de una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Cándida, las especies de Aspergillus o Cryptococcus neoformans.

   5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde un cebador directo e inverso común y/o una sonda común hibrida con el gen ILV3 de al menos 3, 4, 5, ⁶ , 7 y preferentemente con todas, de las especies de Cándida siguientes:

   i. Cándida albicans

   ii. Cándida dubliniensis

   iii. Cándida tropicalis

   iv. Cándida parapsilosis

   v. Cándida glabrata

   vi. Cándida krusei

   vii. Cándida guilliermondii

   viii. Cándida auris;

   y/o en donde un cebador directo e inverso común y/o una sonda hibrida con el gen ILV3 de al menos 2, y preferentemente con las 3, de las especies de Aspergillus siguientes:

   i. Aspergillus fumigatus

   ii. Aspergillus niger

   iii. Aspergillus flavus

   6 . El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde un cebador directo e inverso y/o sonda independiente hibrida con el gen ILV3 de cada una de al menos 3, 4, 5, ⁶ , 7 y preferentemente con todas, de las especies de Cándida siguientes:

   i. Cándida albicans

   ii. Cándida dubliniensis

   iii. Cándida tropicalis

   iv. Cándida parapsilosis

   v. Cándida glabrata

   vi. Cándida krusei

   vii. Cándida guilliermondii

   viii. Cándida auris;

   y/o en donde un cebador directo e inverso y/o una sonda independiente hibrida con el gen ILV3 de al menos 2, y preferentemente con las 3, de las especies de Aspergillus siguientes:

   i. Aspergillus fumigatus

   ii. Aspergillus niger

   iii. Aspergillus flavus.

   7. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la etapa b comprende distinguir los productos de amplificación para identificar el género y/o especie responsable de la infección.

   ⁸. El método de la reivindicación 7 en donde distinguir comprende:

   i. un análisis de la curva de fusión

   ii. uso de cebadores y/o sondas marcados diferencialmente, opcionalmente en donde a) al menos un cebador y/o sonda está marcado diferencialmente de acuerdo con el género para permitir la identificación del género del hongo/levadura en la muestra; o

   b) en donde al menos un cebador y/o sonda está marcado diferencialmente de acuerdo con la especie de Cándida y/o Aspergillus para permitir la identificación de las especies de Cándida y/o Aspergillus en la muestra; o

   iii. determinar el tamaño de los productos de amplificación.

   9. Una colección de pares de cebadores para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra, en donde la muestra comprende una muestra clínica obtenida de un sujeto humano, que comprende:

   A) a. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Cándida siguientes:

   i. Cándida albicans

   ii. Cándida dubliniensis

   iii. Cándida tropicalis

   iv. Cándida parapsilosis

   v. Cándida glabrata

   vi. Cándida krusei

   vii. Cándida guilliermondii

   viii. Cándida auris

   b. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Aspergillus siguientes:

   i. Aspergillus fumigatus

   ii. Aspergillus niger

   iii. Aspergillus flavus; y

   opcionalmente, un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans-, o

   B) a. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida albicans: b. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida dubliniensis: c. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida tropicalis:

   d. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida parapsilosis: e. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida glabrata:

   f. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida krusei:

   g. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida guilliermondii h. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida auris:

   i. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus fumigatus-, j. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus niger, k. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus flavus-, y opcionalmente

   l. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans; opcionalmente en donde al menos un cebador en cada par de cebadores está marcado diferencialmente en comparación con los otros pares de cebadores.

   10. Una colección de sondas para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra, en donde la muestra comprende una muestra clínica obtenida de un sujeto humano, que comprende:

   A) a. una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Cándida siguientes

   i. Cándida albicans

   ii. Cándida dubliniensis

   iii. Cándida tropicalis

   iv. Cándida parapsilosis

   v. Cándida glabrata

   vi. Cándida krusei

   vii. Cándida guilliermondii

   viii. Cándida auris

   b. una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de las especies de Aspergillus siguientes

   i. Aspergillus fumigatus

   ii. Aspergillus niger

   iii. Aspergillus flavus; y

   opcionalmente, una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans; o B) a. una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida albicans

   b. una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida dubliniensis

   c. una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida tropicalis

   d. una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida parapsilosis

   e. una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida glabrata

   f. una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida krusei

   g. una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida guilliermondii

   h. una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cándida auris

   i. una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus fumigatus

   j. una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus niger

   k. una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Aspergillus flavus; y opcionalmente l. una sonda que hibrida específicamente con el gen ILV3 de Cryptococcus neoformans; opcionalmente en donde la colección de sondas comprende al menos dos sondas en donde cada sonda está marcada diferencialmente.

   11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a ⁸ , en donde el método se realiza mediante el uso de la colección de pares de cebadores como se define en la reivindicación 9 y/o la colección de sondas como se define en la reivindicación ^{1 0}.

   12. Un kit para detectar una infección por levaduras/hongos en una muestra que comprende la colección de pares de cebadores de acuerdo con la reivindicación 9 y/o la colección de sondas de acuerdo con la reivindicación ^{1 0} ; opcionalmente en donde el kit comprende pares de cebadores en una combinación que permite la detección de Cándida, Aspergillus y Cryptococcus neoformans; opcionalmente en donde el kit comprende además que comprende sondas que permiten la detección de Cándida, Aspergillus y Cryptococcus neoformans; opcionalmente, en donde el kit comprende además reactivos para extraer ADN de una muestra de sangre.

   13. Un método para detectar e identificar una infección microbiana en una muestra, que comprende:

   a. realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos que comprende los siguientes componentes:

   i. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias grampositivas; opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias grampositivas ii. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias gramnegativas; opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias gramnegativas

   iii. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de al menos una especie de hongo/levadura, opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen ILV3 de al menos una especie de hongo/levadura

   b. detectar y distinguir los productos de amplificación para determinar si la muestra contiene una infección bacteriana gramnegativa, una infección bacteriana grampositiva y/o una infección por hongos/levaduras;

   en donde la muestra comprende una muestra clínica obtenida de un sujeto humano; opcionalmente en donde la amplificación del gen iLV3 se realiza de acuerdo con un método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones ¹ a ⁸ y/o en donde el método se realiza mediante el uso de la colección de pares de cebadores como se define en la reivindicación 9 y/o en donde el método se realiza mediante el uso de la colección de sondas como se define en la reivindicación ^{1 0}.

   14. Un kit para discriminar una infección microbiana en una muestra, que comprende los componentes para realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos múltiple que comprende:

   a. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias grampositivas; opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias grampositivas;

   b. un cebador directo e inverso que híbrida específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias gramnegativas; opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen del ARNr 16S de bacterias gramnegativas; y

   c. un cebador directo e inverso que hibrida específicamente con el gen ILV3 de al menos una especie de hongo/levadura; opcionalmente junto con una sonda que hibrida entre los sitios de unión del cebador específicamente con el gen ILV3 de al menos una especie de hongo/levadura;

   en donde los componentes a, b y c producen cada uno productos de amplificación distinguibles, lo que permite por tanto una determinación de si la muestra contiene una infección bacteriana gramnegativa, una infección bacteriana grampositiva y/o una infección por hongos/levaduras.

   15. El kit de la reivindicación 14 que comprende la colección de pares de cebadores como se define en la reivindicación 9 y/o la colección de sondas de acuerdo con la reivindicación 10 y/o un kit como se define en la reivindicación 12.

   16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que se realiza como una reacción de amplificación de ácidos nucleicos múltiple.

   17. Un método para:

   a) seleccionar un sujeto humano para el tratamiento con un agente antifúngico como un fungicida; o b) predecir la sensibilidad de un sujeto humano al tratamiento con un agente antifúngico como un fungicida

   que comprende realizar un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y:

   i) seleccionar el sujeto para el tratamiento con un agente antifúngico como un fungicida donde se detecta, opcionalmente también se identifica, una infección; o

   ii) predecir la sensibilidad del sujeto al tratamiento con un agente antifúngico como un fungicida donde se detecta, opcionalmente también se identifica, una infección.

   18. Un agente antifúngico, como un fungicida, para su uso en un método para tratar una infección, que comprende administrar un agente antifúngico, como un fungicida, a un sujeto humano que padece la infección, en donde:

   a) el sujeto se ha seleccionado para el tratamiento mediante la realización de un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 13; o

   b) el sujeto presenta, en una muestra, un gen de ILV3 detectable, y en donde la muestra comprende una muestra clínica obtenida de un sujeto humano.

   19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 11, 13 o 16, la colección de pares de cebadores de acuerdo con la reivindicación 9, la colección de sondas de acuerdo con la reivindicación 10, o el kit de acuerdo con la reivindicación 12, 14 o 15, en donde la muestra comprende una muestra de sangre.