ES2902682T3

ES2902682T3 - Sondas de polímero de lignocelulosa y métodos

Info

Publication number: ES2902682T3
Application number: ES16801069T
Authority: ES
Inventors: Marc Beauregard; Fatma Meddeb-Mouelhi; Yannick Hebert-Ouellet; Bernard Janse; Kevin J Macdonald
Original assignee: Du Quebec A Trois Rivieres, University of; Universite du Quebec a Trois Rivireres; Buckman Laboratories International Inc
Current assignee: Du Quebec A Trois Rivieres, University of; Universite du Quebec a Trois Rivireres; Buckman Laboratories International Inc
Priority date: 2015-10-26
Filing date: 2016-10-24
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2036-10-24
Also published as: MX2018005030A; PT3368898T; US10788477B2; WO2017074865A1; US20200386736A1; ZA201802670B; JP2018537692A; CA3003006A1; EP3368898A1; AU2016347051A1; JP6959930B2; US20170115267A1; CN108474789A; BR112018008356A2; EP3368898B1; CN108474789B

Abstract

Un método para determinar la eficacia de un tratamiento industrial en pulpa o un producto de papel que comprende: poner en contacto una sonda de detección de polímero lignocelulósico que comprende a) un módulo de unión que se une específicamente al menos a un polímero lignocelulósico y b) un módulo indicador que es detectable espectroscópicamente, con pulpa o un producto de papel; detectar la unión específica de la sonda a la pulpa o al producto de papel; calcular la cantidad de al menos un polímero lignocelulósico sobre una superficie de la pulpa o el producto de papel; y determinar la eficacia de un tratamiento industrial sobre la pulpa o el producto de papel basándose en la cantidad del al menos un polímero lignocelulósico detectado.

Description

DESCRIPCIÓN

Sondas de polímero de lignocelulosa y métodos

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la detección, caracterización y cuantificación de polímeros específicos, por ejemplo, polímeros lignocelulósicos tales como polisacáridos, en biomasa, y además se relaciona con la detección de cualquier polímero, tal como los oligosacáridos, por ejemplo, para una variedad de usos como se describe en el presente documento.

En el campo de la pulpa y la fabricación de papel, las industrias dependen de una serie de tratamientos físicos, químicos y biológicos para realzar el valor de su producto. Los tratamientos incluyen, por ejemplo, cizallamiento mecánico (refinado) de las fibras para ayudar a desarrollar las propiedades deseadas del papel. En la actualidad, no existe una forma práctica de predecir el resultado de tales tratamientos sin un análisis exhaustivo de las propiedades de la pulpa y el papel. Dicho análisis implica ensayos a escala piloto o industrial que son costosos y requieren mucho tiempo.

Los métodos actuales para la detección de polímeros y la caracterización de la superficie de la fibra incluyen, por ejemplo, espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS), microscopía electrónica de barrido (SEM); espectrometría de masas de iones secundarios de tiempo de vuelo (ToF-SIMS) e infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR). Estas técnicas involucran equipo especializado, experiencia específica y una larga manipulación e interpretación. Estas técnicas tampoco distinguen entre celulosa y hemicelulosa. Se han desarrollado otros enfoques para la detección indirecta de polímeros basados en el uso de tintes, por ejemplo, naranja de acridina y fenantreno. Se han utilizado con éxito para estudiar la morfología de las células vegetales, pero emplean microscopios sofisticados y no son cuantitativos. Otras técnicas más detectan la hemicelulosa usando anticuerpos producidos contra moléculas representativas. Sin embargo, dichos anticuerpos son costosos y solo detectan un segmento de polímeros que se asemeja a las moléculas utilizadas para la producción de anticuerpos. Si el epítopo exacto reconocido por un anticuerpo en particular no se encuentra o no es accesible, entonces no se detectarán los polímeros. Las técnicas de anticuerpos son largas y también implican el uso de anticuerpos secundarios.

Los módulos de unión de carbohidratos (CBM) son un grupo de moléculas especializadas para la detección de polímeros de biomasa. Los CBM son proteínas optimizadas para la detección específica de diversas dianas, por ejemplo, carbohidratos como celulosa cristalina y xilano. Para detectar la unión de tales CBM a la biomasa, se le puede poner un tinte indicador. Tales técnicas involucran microscopía. Sin embargo, ninguno de estos métodos se ha utilizado con éxito para la caracterización rápida de polímeros de superficie de fibras que permitirían predecir el impacto de varios tratamientos en la pulpa o el papel. Petterson et al.: Nordic Pulp and Paper Research Journal, vol. 03, n.° 03, (1988), páginas 152-155 describe la caracterización de superficies de fibras de pulpa mediante anticuerpos específicos de lignina.

Por consiguiente, existe la necesidad de mejores materiales y métodos para detectar polímeros lignocelulósicos en biomasa, y para la detección, en general, de polímeros, tal como los oligosacáridos, en diversas aplicaciones.

Sumario de la presente invención

Una característica de la presente divulgación es proporcionar materiales y métodos para detectar y medir polímeros lignocelulósicos en biomasa, por ejemplo, de una manera rentable y en tiempo.

Otra característica de la presente divulgación es proporcionar materiales y métodos para determinar la efectividad de los tratamientos industriales en pulpa o papel antes, durante y/o después de la aplicación de un tratamiento en particular.

Una característica adicional de la presente divulgación es proporcionar materiales y métodos para determinar una propiedad física de la pulpa o un producto de papel basándose indirectamente en la presencia y/o contenido de polímeros lignocelulósicos en la pulpa o el producto de papel.

Una característica adicional de la presente divulgación es proporcionar materiales y métodos para medir simultáneamente la presencia y/o cantidades de múltiples, diferentes polímeros lignocelulósicos en biomasa independientes de procedimientos de prueba separados o secuenciales.

Una característica adicional de la presente divulgación es proporcionar materiales y métodos para la detección de cualquier polímero, tal como uno o más oligosacáridos.

Las características y ventajas adicionales de la presente invención en parte se expondrán en la descripción que sigue y en parte resultarán evidentes a partir de la descripción o se pueden aprender mediante la práctica de la presente invención. Los objetivos y otras ventajas de la presente invención se realizarán y obtendrán por medio de los elementos y las combinaciones señalados particularmente en la descripción y las reivindicaciones adjuntas.

A fin de lograr estas y otras ventajas, y de acuerdo con los fines de la presente divulgación, según se realiza y se describe ampliamente en el presente documento, la presente divulgación, en parte, se refiere a una sonda de detección de polímero lignocelulósico que incluye un módulo de unión que une específicamente al menos un polímero lignocelulósico y un módulo indicador que es detectable espectroscópicamente. Cualquiera de los módulos o ambos pueden incluir un polipéptido. El módulo de unión puede ser un módulo de unión a carbohidratos (CBM). El módulo indicador puede ser una proteína fluorescente. La sonda puede contener una pluralidad de sondas con cada sonda específica para un polímero lignocelulósico particular y cada sonda contiene un perfil espectral fluorescente único.

La presente invención se refiere a un método para detectar un polímero lignocelulósico, comprendiendo el método:

poner en contacto con una sonda de detección de polímero lignocelulósico que comprende

a) un módulo de unión que se une específicamente al menos a un polímero lignocelulósico y

b) un módulo indicador que es detectable espectroscópicamente, en donde la sonda de detección de polímero lignocelulósico comprende un polipéptido sonda que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 6, 8, 10 y 12,

o en el que el módulo de unión es un polipéptido del módulo de unión y el módulo indicador es un polipéptido del módulo indicador, en el que el polipéptido del módulo de unión comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 14, 16, 18,20 y 22,

y el polipéptido del módulo indicador comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 24, 26, 28 y 30, con un material de biomasa;

y medir una propiedad asociada con el módulo indicador para determinar la presencia o ausencia de al menos un polímero lignocelulósico en el material de biomasa basándose en la unión específica de la sonda al menos a un polímero lignocelulósico.

La presente invención se refiere además a un método para determinar la eficacia de un tratamiento industrial sobre pulpa o un producto de papel. Una sonda de detección de polímero lignocelulósico puede ponerse en contacto con una pulpa o un producto de papel. Se puede detectar la unión específica de la sonda a la pulpa o al producto de papel. Se puede calcular la cantidad de al menos un polímero lignocelulósico sobre una superficie de la pulpa o el producto de papel. La eficacia o necesidad de un tratamiento industrial sobre la pulpa o el producto de papel se puede determinar basándose en la cantidad del al menos un polímero lignocelulósico detectado.

La presente invención también se refiere a un método para determinar una propiedad física de la pulpa o de un producto de papel. Una sonda de detección de polímero lignocelulósico puede ponerse en contacto con una pulpa o un producto de papel. Se puede detectar la unión específica de la sonda a la pulpa o al producto de papel. Se puede determinar (por ejemplo, calcular) la cantidad de al menos un polímero lignocelulósico sobre una superficie de la pulpa o el producto de papel. La al menos una propiedad física de la pulpa o el producto de papel se puede determinar basándose en la cantidad del al menos un polímero lignocelulósico detectado.

La presente divulgación se refiere además a una sonda de detección de polímero. La sonda puede tener, por ejemplo, una o más características o funciones de las sondas de polímero lignocelulósico descritas en el presente documento, características o funciones superpuestas, o características o funciones diferentes. La sonda de detección de polímero puede incluir, por ejemplo, un módulo de unión que se une específicamente al menos a un polímero (por ejemplo, oligosacáridos u otros polímeros de sacáridos) y un módulo indicador que es detectable espectroscópicamente. Se proporciona un complejo que incluye la sonda unida específicamente a un material que incluye al menos un polímero disponible en la superficie.

La presente divulgación también se refiere a un método para detectar un polímero (por ejemplo, oligosacáridos u otros polímeros sacáridos). Una sonda de la presente divulgación puede ponerse en contacto con un material. Se puede medir una propiedad asociada con el módulo indicador para determinar la presencia o ausencia de al menos un polímero en el material basándose en la unión específica de la sonda al menos a un polímero. La detección o no detección tiene una serie de aplicaciones como se describe en el presente documento.

Los materiales y métodos descritos en el presente documento permiten la detección rápida y simultánea de varios polímeros lignocelulósicos en la superficie de las fibras utilizadas en la pulpa y el papel, por ejemplo, celulosa y hemicelulosa utilizando proteínas de fusión. Los patrones de señales pueden correlacionarse con varios cambios en las propiedades de la pulpa y el papel. Los métodos permiten predecir el impacto de varios tratamientos en las propiedades del papel. Tal predicción permite una elección rápida y precisa del tratamiento, dosis y/u otras condiciones para una diana determinada, por ejemplo, condiciones que conducen a un papel con un índice de rotura más alto, una pulpa con mayor tasa de drenaje y/o la concentración óptima de xilanasa para potenciar el blanqueamiento. Los métodos permiten un uso óptimo de productos químicos, tratamientos enzimáticos o físicos por igual. Los métodos se pueden utilizar en cualquier industria basada en biomasa de madera.

Además, la presente invención tiene muchas aplicaciones. Se puede determinar o predecir el efecto de cualquier tratamiento químico, físico o biológico relevante que tenga un impacto en la exposición o distribución del polímero de fibra o la hidrólisis en las propiedades de la pulpa y el papel. Por ejemplo, se puede determinar o predecir una secuencia enzimática para optimizar el refinado de la pulpa. Se puede optimizar el tratamiento con xilanasa para potenciar el blanqueamiento. Se puede controlar la degradación de las hemicelulosas cuando se hidroliza la biomasa. Las condiciones de producción de materiales celulósicos purificados, por ejemplo, nanocelulosa o filamentos, pueden optimizarse controlando la presencia de celulosa amorfa frente a celulosa cristalina usando los métodos de la presente invención.

Se ha de entender que tanto la anterior descripción general como la siguiente descripción detallada son de ejemplo y explicativas únicamente y están destinadas a proporcionar una explicación adicional de la presente invención, tal como se reivindica.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es una descripción esquemática de un ejemplo de detección de polímeros usando las sondas de la presente invención.

La FIG. 2 es un diagrama esquemático de un vector de expresión de pet11A-eGFP (módulo indicador de eGFP). La FIG. 3 es un diagrama esquemático de un vector de expresión de pet11A-mCherry (módulo indicador de mCherry).

La FIG. 4 es un diagrama esquemático de un vector de expresión del pet11A-mOrange2 (módulo indicador de mOrange2).

La FIG. 5 es un diagrama esquemático de un vector de expresión del pet11A-eCFP (módulo indicador de eCFP). La FIG. 6 es un ejemplo de SDS-PAGE de proteínas de fluorescencia purificadas. La flecha resalta la proteína de interés.

La FIG. 7 es un ejemplo de SDS-PAGE de CBM purificados. La flecha resalta la proteína de interés.

La FIG. 8 es un ejemplo de un gráfico que representa los espectros de emisión de los módulos indicadores (eGFP y mCherry) y de un disco de hoja de pulpa después de la excitación a 549 nm.

La FIG. 9 es un ejemplo de espectros de emisión de FP (eGFP y mCherry) y un disco de hoja de pulpa que utiliza una longitud de onda de excitación de 488 nm.

La FIG. 10 es un ejemplo de un diagrama esquemático de un vector de expresión pET11A-eGFP-CBM3a (Sonda 1).

La FIG. 11 es un ejemplo de un diagrama esquemático de un vector de expresión pET11A-mCherry-CBM4-1 (Sonda 2a).

La FIG. 12 es un ejemplo de un diagrama esquemático de un vector de expresión pET11A-mCherry-CBM17 (Sonda 2b).

La FIG. 13 es un ejemplo de un diagrama esquemático de un vector de expresión pET11A-mOrange2-CBM15 (Sonda 3).

La FIG. 14 es un ejemplo de un diagrama esquemático de un vector de expresión pET11A-eCFP-CBM27 (Sonda 4).

La FIG. 15. es un análisis de ejemplo de SDS-PAGE de las sondas 1 a 4. De izquierda a derecha: Sonda 1, Sonda 2a, Sonda 2b (no se usa aquí, tiene una mayor afinidad por la celulosa amorfa que la Sonda 2a), Sonda 3 y Sonda 4. En el lado izquierdo de los últimos cuatro geles se muestra una escalera de tamaño estándar que permite estimar los tamaños de las proteínas migradas en el mismo gel.

Las FIG. 16A-16D son ejemplos de gráficos de espectros de excitación (discontinua) y emisión (completa) de las proteínas FP-CBM para las sondas 1, 2b, 3 y 4, respectivamente.

La FIG. 17 es un ejemplo de un gráfico de saturación de unión de un ensayo de agotamiento en estado sólido utilizando la sonda 1.

La FIG. 18 es un ejemplo de un diagrama esquemático que describe un experimento de unión de sondas en un disco de papel.

La FIG. 19 es un ejemplo de un gráfico de intensidad de fluorescencia (FI) del módulo indicador (eGFP) solo unido a pulpa no tratada y tratada con celulasa (después de dos niveles de refinado).

La FIG. 20 es un ejemplo de un gráfico de la intensidad de fluorescencia de la sonda 1 unida a pulpa no tratada y tratada con celulasa (después de dos niveles de refinado).

La FIG. 21 es un ejemplo de un gráfico que muestra el impacto del refinamiento de PFI en la cuantificación de celulosa cristalina en la superficie de las hojas de pulpa 1.

La FIG. 22 es un ejemplo de un gráfico que muestra el impacto del tratamiento con celulasa en la cuantificación de celulosa cristalina en la superficie de las hojas de pulpa 1.

La FIG. 23 es un ejemplo de gráfico que representa la cuantificación (pg/mm2) de la Sonda 1 unida a la superficie de hojas de prueba tratadas con xilanasa.

La FIG. 24 es un ejemplo de un gráfico que representa la cuantificación de celulosa cristalina (pg/mm2) en la superficie de una hoja de prueba refinada de PFI producida en dos plantas diferentes.

Las FIG. 25A-25D son ejemplos de gráficos que representan correlaciones entre la cuantificación de celulosa cristalina utilizando la sonda 1 (pg/mm2) y las propiedades físicas de la pulpa 2/papel en función de la energía de refinado (revoluciones PFI) que incluyen, respectivamente, índice de desgarro (mN m2/g), índice de tracción (N m/g), fuerza de unión interna (J/m2), una longitud media de las fibras (mm).

Las FIG. 26A-26D son ejemplos de gráficos que representan correlaciones entre la cuantificación de celulosa cristalina utilizando la sonda 1 (|jg/mm2) y las propiedades físicas de la pulpa 1/papel en función de la energía de refinado (revoluciones PFI) que incluyen, respectivamente, índice de desgarro (mN m2/g), índice de tracción (N m/g), fuerza de unión interna (J/m2), una longitud media de las fibras (mm).

La FIG. 27 es un ejemplo de un gráfico que muestra la intensidad de fluorescencia de la sonda 3 unida a xilano en la superficie de cinco discos de papel diferentes, incluidos, respectivamente, UBKPR: Pulpa Kraft sin blanquear (pulpa 2), UBMP: pulpa mecánica sin blanquear (pulpa 5), BMP: pulpa mecánica blanqueada (pulpa 6), UBKP: pulpa Kraft sin blanquear (pulpa 3) y BKP: pulpa Kraft blanqueada (pulpa 4).

La FIG. 28 es un ejemplo de un gráfico que representa la intensidad de fluorescencia de la Sonda 3 unida a xilano en la superficie de papel Pulpa 4 (BKP) sin tratar y tratado con xilanasa.

La FIG. 29 es un ejemplo de un gráfico que representa la intensidad de fluorescencia de la sonda 4 (eCFP-CBM27) unida al manano en la superficie de dos discos de papel diferentes: pulpa Kraft sin blanquear (Pulpa 3, UBKP) y pulpa Kraft blanqueada (Pulpa 4, BKP).

La FIG. 30 es un ejemplo de un gráfico que representa la intensidad de fluorescencia de la Sonda 4 unida a manano en la superficie de papel Kraft blanqueado tratado con mananasa (Pulpa 4, BKP).

Descripción detallada de la presente invención

La presente divulgación se refiere a una sonda de detección de polímero lignocelulósico que incluye a) un módulo de unión que se une específicamente al menos a un polímero lignocelulósico y b) un módulo indicador que es detectable espectroscópicamente. Puede emplearse cualquier módulo de unión y módulo indicador adecuado. Una sonda determinada puede variar con respecto al número y/o tipo de módulo de unión y módulo indicador. Una sonda puede contener un solo módulo de unión y un solo módulo indicador. Una sonda puede contener más módulos de unión que módulos indicadores, más módulos indicadores que módulos de unión, o un número igual de módulos de unión y módulos indicadores. Una sonda puede contener de uno a tres, de uno a cinco, de uno a diez, o más módulos de unión y/o módulos indicadores. Cada módulo de unión puede unir específicamente un polímero lignocelulósico particular o un subconjunto particular de polímeros lignocelulósicos.

La sonda de detección de polímero lignocelulósico puede incluir al menos un polipéptido sonda. Toda o parte de una sonda se puede construir a partir de un polipéptido o polipéptidos. Se entiende que los polipéptidos contienen proteínas que incluyen los veinte aminoácidos estándar modificados en su totalidad o en parte. Uno o más aminoácidos no estándar pueden reemplazar o usarse además de uno o más aminoácidos estándar. Los polipéptidos se pueden construir mediante síntesis química o utilizando sistemas de expresión biológicos moleculares, ya sea in vitro o in vivo. Puede emplearse cualquier sistema de expresión adecuado, por ejemplo, sistemas de expresión procariotas, sistemas de expresión eucariotas, sistemas de expresión basados en plásmidos, sistemas de expresión integrados cromosómicamente, o cualquier combinación de los mismos. La modificación se puede realizar de forma sintética, mediante modificación postraduccional en un sistema de expresión, o ambos. Puede emplearse cualquier modificación adecuada, por ejemplo, fosforilación, sulfonación, fluoración, acetilación, adición de grupos de carbohidratos, adición de grupos lipídicos, adición de ácidos nucleicos, adición de polinucleótidos, adición de otros aminoácidos, adición de otros polipéptidos, adición de moléculas orgánicas sintéticas, adición de grupos inorgánicos, o cualquier combinación de los mismos.

El módulo de unión puede ser o incluir un polipéptido del módulo de unión. El módulo indicador puede ser o incluir un polipéptido del módulo indicador. El módulo de unión y el polipéptido del módulo indicador pueden conectarse directa o indirectamente entre sí. Por ejemplo, el polipéptido del módulo de unión se puede fusionar directamente con el polipéptido del módulo indicador. El polipéptido del módulo de unión se puede unir al polipéptido indicador de forma covalente, por ejemplo, a través de un polipéptido enlazador. El enlazador puede tener cualquier longitud adecuada, por ejemplo, al menos un aminoácido, de 2 a aproximadamente 2000 aminoácidos (restos), de aproximadamente 5 a aproximadamente 1.000 aminoácidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 aminoácidos, de aproximadamente 25 a aproximadamente 250 aminoácidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 aminoácidos, o más de 2.000 aminoácidos. El enlazador puede incluir una molécula distinta o además de un polipéptido, por ejemplo, un carbohidrato, un polinucleótido, un lípido, una pequeña molécula orgánica sintética, un polímero de origen no natural, un metal o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, el módulo de unión y el módulo indicador se pueden reticular con formaldehído, glutaraldehído, o ambos. La conexión o unión entre el módulo de unión y el módulo indicador puede ser un enlace iónico, enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas, interacciones hidrófilas, interacciones que excluyen el disolvente, o cualquier combinación de las mismas. La conexión o unión puede incluir al menos un enlace covalente para asegurar que el módulo indicador esté atado o unido de forma estable al módulo de unión.

El polipéptido sonda puede ser o incluir, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 6, 8, 10 y 12, o una combinación de los mismos; codificado por una secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 1, 5, 7, 9 y 11, respectivamente. El polipéptido del módulo de unión puede ser o incluir, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ iD NO: 14, 16, 18,20 y 22; codificada por una secuencia de ácido nucleico de 13, 15, 17, 19 y 21, respectivamente. El polipéptido del módulo indicador puede ser o incluir, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 24, 26, 28 y 30; codificado por una secuencia de ácido nucleico de 23, 25, 27 y 29, respectivamente. Las secuencias de marcadores de histidina se pueden omitir de las secuencias de las sondas, módulos de unión y/o módulos indicadores, por ejemplo, si los métodos de purificación no

emplean una columna de níquel.

Las sondas de la presente divulgación son ventajosas ya que pueden funcionar independientemente de, sin incluir o

sin utilizar un anticuerpo o un polipéptido que incluya un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. Ni el

polipéptido del módulo de unión ni el módulo indicador necesitan ser o incluir un anticuerpo o un fragmento del mismo.

El polipéptido del módulo de unión o el módulo indicador pueden ser o incluir un anticuerpo o un fragmento del mismo.

Tanto el polipéptido del módulo de unión como el módulo indicador pueden ser o incluir un anticuerpo o un fragmento

del mismo. Incluso si un módulo de unión no es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, el

módulo de unión todavía puede unirse a una diana con la especificidad de un anticuerpo. La unión del módulo de

unión a su lignocelulósico diana puede ocurrir en condiciones similares o diferentes a la unión de un anticuerpo a su

antígeno. La unión se puede realizar en cualquier condición adecuada que aumente la unión específica de un módulo

de unión a su(s) diana(s) deseada(s) y disminuya, minimice o prevenga la unión no específica del módulo de unión a

no dianas. La unión puede ser asistida por la presencia de uno o más factores adicionales, por ejemplo, concentración

de la sonda, iones, por ejemplo, iones de calcio, fuerza iónica, pH y/o temperatura y similares. Ambos, ninguno, o solo

uno del módulo de unión y el módulo indicador puede ser o incluir un polipéptido de cualquier tipo. Los módulos de

unión y/o los módulos indicadores pueden ser o incluir nucleótidos, carbohidratos, lípidos, grupos orgánicos sintéticos

y/o grupos inorgánicos en lugar de o además de polipéptidos. Por ejemplo, polinucleótidos, polisacáridos, ácidos

grasos, ésteres, se pueden usar esteroles y/o polímeros no naturales. Los módulos de unión y/o los módulos

indicadores y/u otras porciones de una sonda pueden contener cualquier tipo o número adecuado de moléculas, por

ejemplo, moléculas descritas en el presente documento.

En las sondas de la presente descripción y los métodos de la presente invención se puede usar cualquier módulo

indicador adecuado o combinación de módulos indicadores. Por ejemplo, el módulo indicador en su totalidad o en

parte puede ser fluorescente. El módulo indicador puede tener cualquier espectro de emisión y excitación fluorescente

adecuado. El módulo indicador puede tener un espectro de excitación único y/o un pico de excitación máximo. Por

ejemplo, el módulo indicador puede tener un pico de excitación de fluorescencia (máximo) de, por ejemplo, inferior a

proximada proximada proximada proximada

proximada

máximo (± 1 nm o ± 3 nm o ± 5 nm). Por ejemplo, el módulo indicador puede tener un pico de emisión de fluorescencia

350

450

550

650

cualquier intervalo intermedio (por ejemplo, intervalo de 1-3 nm, 5 nm, 10 nm o 25 nm) o valor.

El módulo indicador puede incluir cualquier número o tipo de restos fluorescentes. Por ejemplo, el resto fluorescente

puede ser o incluir un polipéptido, un polinucleótido, un polisacárido, una pequeña molécula orgánica, un metal, un

complejo de coordinación, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, el módulo indicador puede ser o incluir

una proteína fluorescente o una combinación de proteínas fluorescentes. La proteína fluorescente puede ser o incluir

una proteína fluorescente ultravioleta, una proteína azul fluorescente, un proteína fluorescente cian, una proteína

fluorescente verde, una proteína fluorescente amarilla, una proteína fluorescente naranja, una proteína fluorescente

roja, una proteína fluorescente rojo lejano, una proteína fluorescente infrarrojo cercano, una proteína fluorescente

infrarroja, una proteína fluorescente de tipo zafiro, una proteína fluorescente de largo desplazamiento de Stokes, una

proteína fluorescente conmutable, o cualquier combinación de las mismas. La proteína fluorescente puede ser o incluir,

por ejemplo, Sirius, TagBFP, mTagBFP2, Azurite, EBFP2, mKalama1, Sirius, Zafiro, T-Zafiro, ECFP, mAmetrina,

Cerulean, mCerulean3, SCFP3A, CyPet, mTurguoise, mTurquoise2, monomérico Midoriishi-Cyan, Aguamarina, eCFP,

TagCFP, mTFP1, AmCyan1, EGFP, Emerald, Superfolder GFP, Azami verde monomérico, TurboGFP, TagGFP2,

mUKG, mWasabi, Clover, mNeonGreen, eGFP, AcGFP1, ZGreen1, ZsYellow1, mBanana, EYFP, Topaz, Citrina,

Venus, SYFP2, Ypet, IanRFP-deltaS83, mPapaya1, TagYFP, mOrange, mOrange2, Kusabira-naranja monomérico,

mKOk, mKO2, mTangerine, mNectarine, TagRFP, TagRFP-T, mApple, mRuby, mRuby2, DsRed-Express2, DsRed-Express, tdTomato, monómero de DsRed, monómero de DsRed, DsRed2, AsRed2, mStrawberry, mCherry, HcRed1,

FusionRed, mRaspberry, E2-Crimson, mPlum, HcRed-Tandem, mKate2, mNeptune, NirFP, TagRFP657, TagRFP675,

iFP1.4, iRFP(iRFP713), iRFP670, iRFP682, iRFP702, iRFP720, iFP2.0, mIFP, mKeima Red, LSS-mKate1, LSS-mKate2, LSSmOrange, mBeRFP, PA-GFP, PATag RFP, Dendra2, Timer, PAmCherry, Kaede (verde), Kaeda (rojo),

KikGR1 (verde), KikGR1 (rojo), PS-CFP2, mEos2 (verde), mEos2 (rojo), mEos3.2 (verde), mEos3.2(rojo), PSmOrange,

Dropna, o cualquier combinación de los mismos. Pueden emplearse módulos indicadores distintos de los módulos

indicadores fluorescentes además de o como alternativa a los módulos indicadores fluorescentes. Por ejemplo, se

pueden usar anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, radioisótopos, colorantes, moléculas orgánicas sintéticas, moléculas fosforescentes, enzimas, o similares, o cualquier combinación de las mismas. Se pueden usar módulos indicadores descritos en Knox PJ (2012) Methods in Enzymology, Volumen:510, 233-245, que se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad. Las aminas primarias accesibles de los módulos de enlace, por ejemplo, CBM, se pueden marcar con un colorante reactivo que contenga un resto de éster de tetrafluorofenilo (Invitrogen).

Se puede usar cualquier módulo de unión adecuado o combinación de módulos de unión en las sondas de la presente divulgación y los métodos de la presente invención. Por ejemplo, el módulo de unión puede ser o incluir un módulo de unión de carbohidratos (CBM) que incluye CBM1, CBM2, CBM3, CBM3a, CBM4, CBM5, CBM6, CBM7, CBM8, CBM9, CBM10, CBM11, CBM12, CBM13, CBM14, CBM15, CBM16, CBM17, CBM18, CBM19, CBM20, CBM21, CBM22, CBM23, CBM24, CBM25, CBM26, CBM27, CBM28, CBM29, CBM30, CBM31, CBM32, CBM33, CBM34, CBM35, CBM36, CBM37, CBM38, CBM39, CBM40, CBM41, CBM42, CBM43, CBM44, CBM45, CBM46, CBM47, CBM48, CBM49, CBM50, CBM51, CBM52, CBM53, CBM54, CBM55, CBM56, CBM57, CBM58, CBM59, CBM60, CBM61, CBM62, CBM63, CBM64, CBM65, CBM66, CBM67, CBM68, CBM69, CBM70, CBM71, o un miembro de la familia del mismo, o cualquier combinación de los mismos. Las especificidades de unión pueden ser o incluir las de familias CBM particulares o miembros específicos de la familia c Bm , por ejemplo, CBM1 (celulosa), CBM2 (celulosa), CBM3 (celulosa cristalina), CBM4 (celulosa amorfa), CBM5 (quitina), CBM6 (celooligosacáridos, laminarinas, xilooligosacáridos, glucanos betal,4,-betal,3 con enlace mezclado), CBM8 (celulosa), CBM9 (celulosa cristalina), CBM10 (celulosa), CBM11 (celulosa), CBM12 (quitina), CBM13 (celulosa, xilanos, manosa), CBM14 (quitina), CBM15 (xilanos y xilooligosacáridos), CBM16 (celulosa y glucomananos), CBM17 (celulosa amorfa), CBM18 (quitina), CBM19 (quitina), CBM20 (almidón), CBM21 (glucógeno), CBM22 (mezcla de p-1,3/p-1,4-glucanos), Cb M23 (mananos), CBM24 (a-1,3-glucano), CBM25 (alfa-glucooligosacáridos y almidón granular), CBM 26 (almidón), CBM27 (beta-1,4-manooligosacáridos, algarrobo galactomanano y konjac glucomananos, mananos), CBM28 (celulosa amorfa, celooligosacáridos y p-(1,3)(1,4)-glucanos), CBM29 (mananos y glucomananos), CBM30 (celulosa), CBM31 (p-1,3-xilanos), CBM32 (galactosa, lactosa, ácido poligalacturónico y p-D-galactosil-1,4-p-D-N-acetilglucosamina), CBM33 (quitina), CBM34 (almidón granulado), CBM35 (xilanos, mananos y p-galactanos), CBM36 (xilanos y xilooligosacáridos), CBM37 (xilanos, quitina, celulosa microcristalina y celulosa hinchada con ácido fosfórico), CBM38 (inulina), CBM39 (p-1,3-glucano, lipopolisacárido y ácido lipoteicoico) CBM48 (glucógeno), CBM40 (ácido siálico), CBM 41 (a-glucanos, amilosa, amilopectina y pululanos), CBM42 (arabinofuranosa y arabinoxilanos), CBM43 (p-1,3-glucanos), CBM44 (celulosa y xiloglucanos), CBM45 (almidón), CBM46 (celulosa), CBM47 (fucosa), CBM48 (glucógenos), CBM49 (celulosa cristalina), CBM50 (quitina y quitopentaosa), CBM51 (galactosa y antígenos del grupo sanguíneo A/B), CBM52 (p-1,3-glucanos), CBM53 (almidón), CBM54 (xilanos), CBM55 (quitina), CBM56 (p-1,3-glucanos), Cb M58 (maltoheptaosa), CBM59 (mananos, xilanos y celulosa), CBM60 (xilanos), CBM61 (p-1,4-galactanos), CBM62 (galactosa, xiloglucanos, arabinogalactanos y galactomananos), CBM63 (celulosa), CBM64 (celulosa), CBM65 (xiloglucanos), CBM66 (fructanos), CBM67 (L-ramnosa), CBM68 (maltotriosa y maltotetraosa), CBM69 (almidón), CBM70 (ácido hialurónico), CBM71 (lactosa y p-D-galactosil-1,4-p-D-N-acetilglucosamina), o cualquier combinación de los mismos. Puede emplearse cualquier módulo de unión de carbohidratos adecuado, por ejemplo, tal como se describe en Boraston et al., Biochem J., 382: 769-781 (2004), Shoseyov et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews, 70(2): 283-295 (2006) o Christiansen et al., f Eb S Journal, 276:5006-5029 (2009). Los CBM u otros módulos de unión pueden evolucionar sintética o genéticamente o generarse de otro modo para unirse a cualquier diana deseada, ya sean carbohidratos, otros tipos de polímeros o compuestos no polímeros. Se pueden utilizar técnicas tales como, por ejemplo, la presentación en fago. Por ejemplo, se pueden producir CBM que se unen a polímeros, por ejemplo, una poliariletercetona (PAEK), una polieteretercetona (PEEK), un polietileno, un polipropileno, un poliestireno, un politetrfluoroetileno, un cloruro de polivinilo, una poliamida, una para-aramida, un tereftalato de polietileno, una poliimida, un policarbonato, un polipéptido, un polinucleótido, una glucoproteína, una proteína, una proteína fosforilada, una proteína modificada, un lípido, un tensioactivo, lecitina, o un biotensioactivo, o cualquier combinación de los mismos. Los CBM se pueden reemplazar por anticuerpos y el método de detección se puede adaptar a los anticuerpos. Véase, por ejemplo, Knox P.J. (2012) Methods in Enzymology, volumen 510, 233 245.

Un módulo de unión puede unirse específicamente a cualquier polímero deseado (por ejemplo, polímero lignocelulósico o una combinación de los mismos, o cualquier oligosacárido). Por ejemplo, el módulo de unión puede unirse específicamente a la celulosa, hemicelulosa, lignina, xilano, manano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano, xiloglucano, o cualquier combinación de los mismos o un fragmento lineal del mismo, o un fragmento ramificado del mismo, o un oligómero del mismo (por ejemplo, un oligosacárido), o un monómero y/o macrómero del mismo, por ejemplo, glucosa, D-glucosa, manosa, xilosa, galactosa, ramnosa, arabinosa, monolignol, alcohol pcumarílico, alcohol de coniferilo, alcohol sinapílico, p-hidroxifenil fenilpropanoide, guaiacil fenilpropanoide, siringil fenilpropanoide, o una combinación de los mismos. El módulo de unión puede unirse a un polímero lignocelulósico cristalino o amorfo. El módulo de unión puede reconocer tanto una forma amorfa como cristalina de un polímero lignocelulósico particular o ser específico para uno u otro. Por ejemplo, el módulo de unión puede unirse específicamente a la celulosa cristalizada (y no a la celulosa amorfa). Un módulo de unión puede unirse específicamente a la celulosa amorfa (y no a la celulosa cristalizada).

La sonda de detección de polímero lignocelulósico puede incluir una pluralidad de sondas de detección de polímero lignocelulósico, cada sonda de detección de polímero lignocelulósico se une única o esencialmente únicamente a un polímero lignocelulósico diferente. La pluralidad de sondas puede incluir cualquier número o tipo de sondas. Por ejemplo, una pluralidad puede incluir al menos dos sondas, al menos tres sondas, al menos cuatro sondas, al menos cinco sondas, al menos diez sondas, de dos sondas a veinte sondas, de dos sondas a diez sondas, o de dos a cuatro sondas. Puede proporcionarse una pluralidad de sondas como una composición preformulada o combinarse a partir de soluciones madre separadas de sondas individuales. La concentración, por ejemplo, porcentaje en peso, de cada sonda en una composición puede ser la misma o diferir entre tipos de sondas basándose en el peso total de la composición. Por ejemplo, la relación en peso de las sondas en una composición que incluye cuatro tipos diferentes de sondas podría ser 1:1:1:1, o alguna otra relación. Las cantidades relativas, la relación y/o la concentración de las sondas se pueden ajustar basándose en el perfil de polímero lignocelulósico de una biomasa particular.

Una composición de sonda puede incluir varios otros componentes, por ejemplo, uno o más estabilizantes, uno o más conservantes, uno o más emulsionantes, uno o más espesantes, uno o más diluyentes, o cualquier combinación de los mismos.

Cada sonda de detección de polímero lignocelulósico puede incluir un módulo indicador diferente. Por ejemplo, cada módulo indicador puede tener una firma de fluorescencia diferente (o única). Se puede utilizar cualquier combinación de módulos indicadores fluorescentes, por ejemplo, uno o más de eGFP, mCherry, mOrange2 y eCFP. Se puede utilizar cualquier combinación de módulos de unión, por ejemplo, uno o más de CBM3a, CBM4-1, CBM15 y CBM27. Puede proporcionarse una pluralidad de sondas de modo que cada módulo de unión esté emparejado con un módulo indicador único y viceversa. Por ejemplo, la sonda de detección de polímero lignocelulósico puede incluir eGFP-CBM3a, mCherry-CBM4-1, mOrange2-CBM15, eCFP-CBM27, o cualquier combinación de los mismos.

La sonda de detección lignocelulósica o de cualquier polímero de la presente divulgación puede ser detectable a una longitud de onda distinta (± 0,5 nm, ± 1 nm, 3 nm, ± 5 nm). Por consiguiente, una combinación de diferentes sondas se puede utilizar y medir simultáneamente, en lugar de utilizar diferentes sondas por separado o secuencialmente.

La presente divulgación también se refiere a un complejo que incluye cualquier sonda o combinación de las mismas unida a un producto de pulpa o papel que incluye al menos un polímero lignocelulósico disponible en la superficie. La presente invención también se refiere a un producto de pulpa o papel que incluye al menos un polímero lignocelulósico disponible en la superficie y al menos una sonda unida al mismo. La pulpa puede ser de cualquier grado y una pulpa en cualquier etapa de producción de un papel u otro producto de biomasa. La pulpa puede incluir materia prima. La pulpa puede incluir agua blanca. La pulpa puede ser o incluir desperdicio de producto, por ejemplo, lodo de papel. La pulpa puede ser pulpa química, pulpa mecánica, pulpa termomecánica o pulpa química (termo) mecánica o una pulpa Kraft. La pulpa puede ser pulpa de madera dura, madera blanda, o ambos tipos, o puede incluir fibras textiles, pulpa de plantas agrícolas o similares. La pulpa se puede varar, preblanquear o no blanquear. La pulpa puede estar refinada o sin refinar. El producto de papel puede ser un producto de papel intermedio, un producto de papel de muestra útil para realizar pruebas, o un producto de papel terminado. Los productos de papel pueden ser, por ejemplo, hojas de papel imprimibles o entintables, láminas para la construcción de cartón, pañuelo de papel, hojas de higiene y cuidado personal o materiales de revestimiento, o similares.

La presente divulgación también está dirigida a varios métodos que emplean sondas de detección lignocelulósicas o de cualquier polímero. Los métodos pueden utilizar cualquier número o tipo de sondas, por ejemplo, una sola sonda o una pluralidad de sondas. La presente invención se refiere a un método para detectar un polímero lignocelulósico o cualquier polímero. Una sonda puede ponerse en contacto con un material de biomasa. Esto se puede lograr introduciendo, añadiendo, mezclando o combinando de otro modo la sonda con el material de biomasa (por ejemplo, pulpa o producto de papel). El contacto puede incluir y/o dar como resultado la unión de la sonda si está presente su polímero lignocelulósico diana específico o cualquier polímero. Se puede medir una propiedad asociada con el módulo indicador para determinar la presencia o ausencia de al menos un polímero lignocelulósico en el material de biomasa. Por ejemplo, la propiedad medida puede ser o incluir fluorescencia. El método también puede incluir calcular la cantidad de al menos un polímero lignocelulósico, determinar el tipo de al menos un polímero lignocelulósico, o ambos.

El material de biomasa medido puede ser o incluir cualquier material de biomasa adecuado. El material de biomasa puede ser una materia prima, un material parcialmente procesado o un producto terminado. El material de biomasa puede ser o incluir un material de biomasa de madera. El material de biomasa de madera puede ser o incluir pulpa, restos de madera, agua blanca, papel, un producto de papel, lodo de papel, o cualquier combinación de los mismos. El método puede incluir formar al menos una hoja de prueba a partir del producto de biomasa de madera, donde la medición se realiza en la hoja de prueba.

La medición se puede realizar antes del tratamiento, durante el tratamiento y/o después del tratamiento, o cualquier combinación de los mismos del material de biomasa. El tratamiento puede incluir, por ejemplo, un tratamiento enzimático, blanqueamiento, amorfogénesis, molienda o refinado PFI, o cualquier combinación de los mismos. El tratamiento puede ser o incluir, por ejemplo, tratamiento enzimático con al menos una enzima, incluida una celulasa, una xilanasa, una manasa, una lignasa o cualquier combinación de las mismas. El método puede ser o incluir realizar al menos un tratamiento del material de biomasa basado en la cantidad de al menos un polímero lignocelulósico medida, el tipo de polímero lignocelulósico medido, o ambos. La cantidad de polímero lignocelulósico medida puede correlacionarse negativa o positivamente con al menos una propiedad física del producto de biomasa. La al menos una propiedad física puede incluir, por ejemplo, índice de ráfaga, tasa de drenaje, índice de desgarro, índice de tracción, fuerza de unión interna, o cualquier combinación de las mismas. La al menos una propiedad física puede incluir, por ejemplo, densidad, módulo de elasticidad, módulo de corte, módulo de Young, coeficiente de Poisson, tensión de fluencia, estrés final, longitud de fibra, elongación o similares.

La cantidad de polímero lignocelulósico medida, el tipo de polímero lignocelulósico medido o ambos pueden usarse para determinar la cantidad o tipo de tratamiento que se aplicará al material de biomasa. Por ejemplo, el método puede incluir la dosificación de al menos una enzima en función de la cantidad de polímero lignocelulósico medida, el tipo de polímero lignocelulósico medido o ambos. Por ejemplo, si la cantidad de celulosa cristalina es relativamente baja, se puede añadir una mayor cantidad de celulasa. Si la cantidad de lignina es alta, por ejemplo, se puede aumentar la cantidad de lejía. Se puede abordar una gran cantidad de xilano medido, por ejemplo, aumentando la cantidad de xilanasa añadida a la pulpa. Para preblanqueo, por ejemplo, se puede abordar una medición de alto contenido de manano aumentando la cantidad de manasa agregada a la pulpa. El método puede incluir ajustar la velocidad del molino en función de la cantidad de polímero lignocelulósico medida, el tipo de polímero lignocelulósico medido o ambos. Por ejemplo, si la cantidad de celulosa cristalina es relativamente baja, la intensidad del refinamiento (por ejemplo, velocidad del molino, en número de rpm) se puede aumentar. El método puede incluir ajustar el contenido total de agua del material de biomasa en función de la cantidad de polímero lignocelulósico medida, el tipo de polímero lignocelulósico medido o ambos. Por ejemplo, se puede añadir agua a la pulpa si la cantidad de celulosa cristalina es relativamente alta y la cantidad de celulosa amorfa es relativamente baja. Por consiguiente, el método puede usarse para ajustar la concentración de pulpa o uno o más componentes de la misma.

La presente invención se refiere además a un método para determinar la eficacia de un tratamiento industrial sobre pulpa o un producto de papel. Una sonda de detección de polímero lignocelulósico se puede poner en contacto con o unir a una pulpa o un producto de papel. Se puede detectar la unión específica de la sonda a la pulpa o al producto de papel. Se puede determinar (por ejemplo, calcular) la cantidad de al menos un polímero lignocelulósico sobre una superficie de la pulpa o el producto de papel. La eficacia de un tratamiento industrial sobre la pulpa o el producto de papel se puede determinar basándose en la cantidad del al menos un polímero lignocelulósico detectado. Se puede determinar la eficacia de cualquier tratamiento industrial adecuado. El tratamiento industrial puede ser o incluir, por ejemplo, un tratamiento enzimático, un tratamiento químico, un tratamiento físico, o cualquier combinación de los mismos. El método se puede realizar antes del tratamiento industrial, durante el tratamiento industrial, después del tratamiento industrial, o cualquier combinación de los mismos. La sonda de detección de polímero puede detectarse a una longitud de onda distinta como parte del método. El método se puede realizar sobre restos de papel, por ejemplo, lodos de papel, y el tratamiento industrial puede incluir un tratamiento de restos de papel.

La presente invención también se refiere a un método para determinar una propiedad física de la pulpa o de un producto de papel. Se puede poner en contacto una sonda de detección de polímero lignocelulósico con pulpa o un producto de papel. Se puede detectar la unión específica de la sonda a la pulpa o al producto de papel. Se puede calcular la cantidad de al menos un polímero lignocelulósico sobre una superficie de la pulpa o el producto de papel. La al menos una propiedad física de la pulpa o el producto de papel se puede determinar basándose en la cantidad del al menos un polímero lignocelulósico detectado. La al menos una propiedad física puede ser o incluir, por ejemplo, índice de ráfaga, tasa de drenaje, índice de desgarro, índice de tracción o fuerza de unión interna, o cualquier combinación de los mismos. La al menos una propiedad física puede ser o incluir, por ejemplo, densidad, módulo de elasticidad, módulo de corte, módulo de Young, coeficiente de Poisson, tensión de fluencia, estrés final, longitud de fibra, elongación o similares.

Las sondas de la presente divulgación y los métodos de la presente invención son aplicables en aplicaciones distintas del procesamiento de pulpa y papel. Por ejemplo, las sondas y los métodos pueden usarse para el cumplimiento y/o monitoreo ambiental. Las sondas y los métodos se pueden utilizar, por ejemplo, en la industria alimentaria para rastrear los tipos y/o cantidades de carbohidratos presentes durante varias etapas de la producción de alimentos y, posteriormente, para detectar el despojo de alimentos u otras condiciones o propiedades. Las sondas y los métodos se pueden usar para rastrear la presencia y/o cantidades de microbios u otros tipos de células en cualquier material. Las sondas y los métodos se pueden utilizar para detectar marcadores celulares como glucoproteínas, por ejemplo, los característicos de los grupos sanguíneos, cánceres o patógenos. Las sondas y los métodos se pueden utilizar en contextos médicos, por ejemplo, histología. Las sondas de la presente divulgación y los métodos de la presente invención son aplicables a cualquier sector relevante de la producción industrial, producción/prueba de alimentos, aplicaciones agrícolas, plásticos, medicina, diagnósticos, microbiología, biomasa/biocombustible y/o producción/ensayo de petróleo, y similares.

Una sonda de detección de polímeros, en general, se proporciona en la presente divulgación. La sonda puede tener, por ejemplo, una o más características o funciones de las sondas de polímero lignocelulósico descritas en el presente documento, características o funciones superpuestas, o características o funciones diferentes. La sonda de detección de polímero puede incluir, por ejemplo, a) un módulo de unión que se une específicamente al menos a un polímero y b) un módulo indicador que es detectable espectroscópicamente. La sonda de detección de polímero puede ser o incluir, por ejemplo, un polipéptido sonda. El módulo indicador puede ser, por ejemplo, fluorescente. El módulo indicador puede ser o incluir una proteína fluorescente. El módulo de unión puede ser un módulo de unión a carbohidratos (CBM). El módulo de unión se puede enlazar específicamente a, por ejemplo, celulosa, hemicelulosa, lignina, xilano, manano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano, xiloglucano, o cualquier combinación de los mismos o un fragmento lineal del mismo, o un fragmento ramificado del mismo, o un oligómero del mismo, o un monómero y/o macrómero del mismo, por ejemplo, glucosa, D-glucosa, manosa, xilosa, galactosa, ramnosa, arabinosa, monolignol, alcohol p-cumarílico, alcohol de coniferilo, alcohol sinapílico, p-hidroxifenil fenilpropanoide, guaiacil fenilpropanoide o siringil fenilpropanoide, o una combinación de los mismos. El módulo de unión se puede enlazar específicamente a, por ejemplo, una glucoproteína, carbohidratos, o ambos, específico para un antígeno sanguíneo particular, tipo, grupo o subgrupo.

El módulo de unión puede unirse específicamente a cualquier polímero en particular (por ejemplo, oligosacárido u otro polímero de sacárido u otro polímero). El polímero puede ser de origen natural o sintético. El módulo de unión se puede enlazar específicamente a, por ejemplo, una poliariletercetona (PAEK), una polieteretercetona (PEEK), un polietileno, un polipropileno, un poliestireno, un politetrfluoroetileno, un cloruro de polivinilo, una poliamida, una paraaramida, un tereftalato de polietileno, una poliimida, un policarbonato, un polipéptido, un polinucleótido, una glucoproteína, una proteína, una proteína fosforilada, una proteína modificada, un lípido, lecitina, un tensioactivo o un biotensioactivo o cualquier combinación de los mismos o un material que incluya o contenga uno o más de estos polímeros. La sonda de detección de polímeros puede incluir una pluralidad de sondas de detección de polímeros, cada sonda de detección de polímero se une específicamente a un polímero diferente. Cada sonda de detección de polímero puede incluir un módulo indicador diferente. Cada módulo indicador puede tener una firma de fluorescencia diferente. La sonda de detección de polímero puede detectarse a una longitud de onda distinta (± 0,2 nm, ± 0,5 nm, ± 1 nm, ± 3 nm, ± 5nm). Se proporciona un complejo que incluye la sonda unida específicamente a un material que incluye al menos un polímero disponible en la superficie. La manera en que se diseña y usa la sonda de polímero lignocelulósico (como se describe en el presente documento) puede aplicarse igualmente en general a las sondas de polímero más amplias de la presente invención para cualquier polímero y para la detección de ese polímero que se une específicamente a la sonda.

Se proporciona un método para detectar un polímero (como las clases y las específicas descritas anteriormente). Una sonda de la presente divulgación puede ponerse en contacto con un material. Se puede medir una propiedad asociada con el módulo indicador para determinar la presencia o ausencia de al menos un polímero en el material basándose en la unión específica de la sonda al menos a un polímero. La propiedad medida puede ser, por ejemplo, fluorescencia. El método puede incluir calcular la cantidad de al menos un polímero, determinar el tipo de al menos un polímero, o ambos. El material puede ser o incluir una muestra biológica, por ejemplo, una biopsia de cáncer, células, una muestra de tejido, una muestra microbiológica o una muestra de sangre. Se puede determinar la presencia o ausencia de un cáncer y/o la identidad del tipo de cáncer, por ejemplo, mediante el uso de un módulo de unión específico para un marcador de superficie de células cancerosas, como una glucoproteína. Se puede determinar la presencia o ausencia de un microorganismo beneficioso o patógeno y/o una identificación de un microorganismo, como un virus o una bacteria, por ejemplo, mediante el uso de un módulo de unión específico para un marcador de superficie celular de microorganismos, como un polisacárido de la pared celular o una glucoproteína de la superficie celular. Se puede determinar al menos uno de un antígeno sanguíneo, tipo, grupo o subgrupo de la muestra de sangre. Por ejemplo, los tipos A, B, AB y O se pueden distinguir en el sistema de grupos sanguíneos ABO. Un antígeno Rh, como el antígeno D, puede detectarse en el sistema del grupo sanguíneo Rh para determinar si una muestra de sangre es Rh positiva o negativa. Una pluralidad de sondas, por ejemplo, diferentes tipos de sondas, se pueden utilizar en el método. Por consiguiente, las identidades del grupo ABO y del factor Rh de una muestra de sangre, por ejemplo, se puede determinar simultáneamente.

La presente invención se aclarará adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos, que están destinados a ser de ejemplo de la presente invención.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos demuestran la utilidad de la presente invención y sus sorprendentes ventajas sobre las técnicas existentes. Los métodos predictivos, basados en el uso de CBM fusionados con varias proteínas fluorescentes, fueron creados. Usando técnicas y construcciones de biología molecular, se crearon cuatro proteínas de fusión diferentes. Cada una de estas "sondas" se construye con un módulo de unión específico (el resto CBM) y un módulo indicador (la proteína fluorescente). Cada sonda emite fluorescencia a una longitud de onda distinta, permitiendo la detección inequívoca del polímero unido específicamente por el módulo de unión. La FIG. 1 es un diagrama esquemático de detección de polímeros usando una sonda.

Después de la producción y caracterización de las sondas, se ha demostrado que se unen específicamente a los polímeros relevantes y cambian la unión en respuesta al cambio en la disponibilidad de superficie de dichos polímeros. Por consiguiente, estas sondas demuestran que la presente invención permite la detección de cambios y que la señal generada por las sondas puede correlacionarse con las propiedades de la pulpa y el papel medidas de forma independiente, con métodos estándar de la industria. El método se puede utilizar para predecir el impacto de cualquier tratamiento industrial en las propiedades que dependen de la exposición de los polímeros. Como lo demuestran estos ejemplos, la presente invención también se puede usar para controlar polímeros de superficie en cualquier etapa para cualquier proceso que involucre biomasa lignocelulósica.

La Tabla 1 enumera CBM, dianas de unión y fluoróforos asociados. Las longitudes de onda de emisión están separadas por varios nanómetros, permitiendo la detección de sondas individuales incluso cuando se mezclan con otras sondas (deconvolución espectral).

Tabla 1

N.° de Marcador de proteína

CBM Diana _sondafluorescente (Ex/Em)

1 CBM3a Celulosa cristalina eGFP (488/507)

2a CBM4-1 Celulosa amorfa mCherry (587/610)

2b CBM17 Celulosa amorfa mCherry (587/610)

3 CBM15 Xilano mOrange2 (549/565)

4 CBM27 Manano eCFP (434/477)

La sonda 1 detecta, por ejemplo, celulosa cristalina (CBM3a-eGFP) y presenta fluorescencia a 507 nm. La sonda 2a detecta, por ejemplo, celulosa amorfa (CBM4-1-mCherry) y emite fluorescencia a 610 nm. La sonda 2b (CBM17-mCherry) también detecta celulosa amorfa, pero con una mayor afinidad en comparación con la sonda 2a. CBM15 fusionado a mOrange2 detecta xilano (sonda 3) y es visible a 565 nm. La sonda 4 incluye CBM27 fusionado a eCFP y emite luz a 477 nm. Los máximos de emisión de las sondas están separados y pueden ser detectables incluso cuando las sondas se mezclan con otras descritas en el presente documento.

Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra la producción de módulos indicadores (proteínas fluorescentes) de acuerdo con la presente invención. Cuatro módulos indicadores (eCFP, eGFP, mCherry y mOrange2) se clonaron en el vector pET 11 y se expresaron en sistemas procarióticos. Las FIGS. 2-5 muestran los mapas genéticos de los respectivos módulos indicadores (proteínas fluorescentes) clonados en el vector pET 11. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos para los módulos indicadores se muestran en las SEQ ID NO: 23-30, respectivamente. Estas construcciones de vector se utilizan para marcar módulos de unión de genes clonados con los módulos indicadores. Se utilizan proteínas fluorescentes simples (módulos indicadores) para medir la unión de fondo (no específica) a los polímeros pulpares.

Las proteínas se purificaron utilizando la siguiente metodología. Se cultivaron células E. coli BL21 (DE3) GOLD pLysS (ThermoFisher Scientific) que llevaban el plásmido de expresión seleccionado (módulo indicador, módulo de unión o sonda completa) a 37 °C en caldo Luria-Bertani que contenía 100 pg/ml de ampicilina. La inducción de la expresión de proteína recombinante se realizó mediante la adición de IPTG 500 pM (ThermoFisher Scientific) a células de fase logarítmica media (D.O. 600 nm de 0,6-0,8) y la posterior incubación durante 18 horas a 25 °C. Posteriormente, las células se recolectaron y se mantuvieron a -80 °C. Los sedimentos celulares descongelados se resuspendieron en NaPO450 mM a pH 8 que contiene NaCl 300 mM, Imidazol 2 mM y PMSF 1 mM, y luego se lisaron usando seis ciclos de 60 segundos de ultrasonido (Branson Ultrasonics Corporation) a 200 W. La clarificación del lisado se logró mediante centrifugación a 10.000 g durante 30 minutos a 4 °C.

A continuación, la proteína de interés se purificó mediante cromatografía de afinidad sobre una columna HisPrep FF 16/10 (GE Healthcare Life Sciences) equilibrada en tampón de NaPO450 mM a pH 8,0 que contiene NaCl 300 mM e imidazol 10 mM. Después de lavados de tampón de diez volúmenes de columna, la proteína deseada se eluyó siguiendo un gradiente de diez volúmenes de columna de imidazol (10 a 100 mM) en tampón NaPO450 mM a pH 8,0 que contiene NaCl 300 mM. Se realizó una etapa de purificación final sobre una columna SUPERDEX 200 HR 16/50 (GE Healthcare Life Sciences) en tampón Tris-HCl 50 mM a pH 7,5 que contenía NaCl 300 mM para asegurar su purificación homogénea. A continuación, la sonda purificada se dializó en un tampón Tris-HCl 20 pH 7,5 que contenía NaCl 20 mM y CaCb 5 mM a 4 °C y se concentró utilizando un dispositivo centrífugo MACROSEP Advance de 10k (Pall Corporation). Las soluciones de proteína concentrada se almacenaron a -80 °C usando congelación instantánea. La pureza de la proteína se verificó mediante SDS-PAGE. La cantidad de proteína se cuantificó mediante el método de Bradford.

Los módulos indicadores se produjeron y purificaron con éxito mediante cromatografía de afinidad (Figura 6). El rendimiento de la producción fue de alrededor de 25 mg de proteína/l de cultivo. La FIG. 6 es una SDS-PAGE de proteínas de fluorescencia purificadas; la flecha resalta la proteína de interés. La Tabla 2 muestra las propiedades de los módulos indicadores purificados (en el presente documento, proteínas fluorescentes).

Tabla 2

continuación

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra la producción de módulos de unión (CBM) de acuerdo con la presente invención. Se clonaron cinco genes CBM (CBM 3a, 4-1, 15, 17 y 27) en el vector pET 11 y se expresaron en sistemas procariotas. Los CBM se produjeron y purificaron mediante cromatografía de afinidad (FIG. 7). El rendimiento de la producción de CBM fue de alrededor de 10 mg de proteína/l de cultivo. La FIG. 7 es una SDS-PAGE de CBM purificados; la flecha resalta la proteína de interés. La Tabla 3 muestra las propiedades de los módulos de unión purificados (en el presente documento, CBM).

Tabla 3

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra la emisión de fluorescencia por módulos indicadores de acuerdo con la presente invención. Se midieron los espectros de emisión de la pulpa y los módulos indicadores (eGFP, mCherry y mOrange2). Los espectros se adquirieron a 23 °C y las proteínas se diluyeron en un tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,5 que contenía NaCl 20 mM y CaCb 5 mM. Los espectros de las FIG. 8 y 9 muestran que, dependiendo de la longitud de onda de excitación (488 nm frente a 549 nm), el cambio en la intensidad de fluorescencia (FI) (eGFP frente a mCherry) se puede medir independientemente de la autofluorescencia de la pulpa u otras sondas. La FIG. 8 muestra los espectros de emisión de los módulos indicadores (eGFP y mCherry) y de un disco de hoja de pulpa después de la excitación a 549 nm. Con esta longitud de onda de excitación, la fluorescencia de mCherry domina la señal de otros sustratos. La FIG. 9 muestra los espectros de emisión de FP (eGFP y mCherry) y un disco de hoja de pulpa utilizando una longitud de onda de excitación de 488 nm. A esta longitud de onda de excitación, la pulpa y la fluorescencia de mCherry es mucho más débil que eGFP.

Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra la producción de sondas completas (módulo de unión-módulo indicador). Los genes que se utilizaron para la producción de módulos indicadores y módulos de unión se fusionaron para generar las sondas. Las FIG. 10-14 muestran los vectores pET11 y el mapa genético que cubre la secuencia de fusión. Las moléculas resultantes (sondas) incluyen un módulo indicador en el extremo N-terminal, seguido del módulo de unión. La FIG. 10 muestra el vector y mapa para el vector de expresión pET 11A-eGFP-CBM3a (Sonda 1). La FIG. 11 muestra el vector y mapa para el vector de expresión pET11A-mCherry-CBM4-1 (Sonda 2a). La FIG. 12 muestra el vector y mapa para el vector de expresión pET11A-mCherry-CBM17 (Sonda 2b). La FIG. 13 muestra el vector y mapa para el vector de expresión pET11A-mOrange2-CBM15 (Sonda 3). La FIG. 14 muestra el vector y mapa para el vector de expresión pET 11A-eCFP-CBM27 (Sonda 4). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la sonda 1 se incluyen en la lista de secuencias como las SEQ ID NO: 1 y 2 respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para el enlazador (que une eGFP y CBM3a) en la sonda 1 se incluyen en la lista de secuencias como las SEQ ID NO: 3 y 4 respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la sonda 2a se incluyen en la lista de secuencias como las SEQ ID NO: 5 y 6 respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para la sonda 2b se incluyen en la lista de secuencias como las SEQ ID NO: 7 y 8 respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la sonda 3 se incluyen en la lista de secuencias como las SEQ ID NO: 9 y 10 respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la sonda 4 se incluyen en la lista de secuencias como las SEQ ID NO: 11 y 12 respectivamente. Las nuevas moléculas (sondas) comienzan con un módulo indicador N-terminal (proteína fluorescente) seguido del módulo de unión apropiado (CBM). La secuencia que une al indicador con el módulo de unión está compuesta por una glicina, a excepción de la sonda 1, en la que la secuencia de unión es la SEQ ID NO: 3 codificada por la SEQ ID NO: 4 (que incluye un sitio de escisión de trombina).

Los vectores que codifican las sondas se transformaron en células E. coli BL21-Gold (DE3) pLysS competentes. Las células transformadas se seleccionaron en agar LB con ampicilina (100 |jg/ml). Las células E. coli que albergan vectores sonda se cultivaron en caldo Luria-Bertani (LB) que contenía ampicilina (100 jg/m l) a 27 °C hasta una fase exponencial media (A600 nm = 0,5). La expresión de la proteína recombinante se indujo mediante la adición de IPTG 0,5 mM y se incubó adicionalmente durante 16 horas a 27 °C (agitación a 200 rpm). Las células inducidas se centrifugaron a 4 °C durante 30 min a 4000 g y el sedimento se almacenó a -80 °C. Las células se suspendieron en tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 8,0) y se rompieron mediante ultrasonido. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 15.000 rpm durante 15 min. La proteína marcada con 6xHis se purificó en condiciones naturales usando resina de afinidad de níquel Ni-NTA (Qiagen) de acuerdo con la especificación del fabricante a pH 8 usando imidazol para la elución. Se utilizó un segundo pase para aumentar la pureza de la preparación proteica. Para eliminar las sales y el imidazol, las sondas purificadas se dializaron en un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 20 mM y CaCb 5 mM durante 24 horas a 4 °C. La concentración de proteína se determinó usando un ensayo de proteína de Bradford.

La FIG. 15 muestra un análisis SDS PAGE de cada sonda. Las flechas indican la posición de las proteínas fusionadas con sonda. El tamaño de cada sonda corresponde al tamaño esperado basándose en su contenido de restos de aminoácidos. En el lado izquierdo de los últimos cuatro geles se muestra una escalera de tamaño estándar que permite estimar los tamaños de las proteínas migradas en el mismo gel. La Tabla 4 muestra las propiedades de las sondas purificadas (módulo de unión-módulo indicador).

Tabla 4

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra la caracterización espectroscópica de sondas después de la producción de acuerdo con la presente invención. Para verificar que la fusión de los módulos indicadores con los módulos de unión no impidió el plegado natural, se realizó un análisis espectroscópico. Los espectros se adquirieron a 23 °C y las proteínas se diluyeron en un tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,5 que contenía NaCl 20 mM y CaCb 5 mM. Los espectros de absorción y emisión registrados para la sonda 1, sonda 2b, sonda 3 y la sonda 4 se muestran en las FIG. 16A-16D. Son comparables con los espectros documentados en la literatura y sugieren fuertemente que los módulos indicadores no se ven afectados por la presencia de los módulos de unión. En las FIG. 16A-D, los espectros de excitación se muestran como líneas discontinuas y los espectros de emisión como líneas completas para las proteínas FP-CBM. Estos resultados indican claramente que los módulos indicadores (proteínas fluorescentes) se pliegan correctamente después de su recuperación de las bacterias y que la proximidad del módulo de unión no tiene un impacto apreciable en su capacidad de indicar.

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra la unión de las sondas a compuestos modelo de acuerdo con la presente invención. Se realizó un ensayo de agotamiento en estado sólido con la sonda 1 y papel AVICEL o WHATMAn como sustrato. AVICEL es un sustrato comercial hecho de celulosa cristalina disponible en FMC Corporation. El papel WHATMAN es un papel de filtro de celulosa amorfa disponible en GE Healthcare Life Sciences. La FIG. 17 muestra los resultados de un ensayo de agotamiento en estado sólido en el que es evidente la saturación de unión de la sonda 1 a AVICEL.

La afinidad (K^a) de la Sonda 1 para AVICEL se midió utilizando una versión modificada de un ensayo de agotamiento de estado sólido para determinar que la fusión del módulo indicador (eGFP) con el módulo de unión (CBM3a) no afectó negativamente el plegamiento y, por lo tanto, la afinidad de CBM3a para AVICEL. La FIG. 17 muestra que la sonda 1 tiene una constante de afinidad (K^a) de 8 jM para AVICEL, un valor similar al documentado para la construcción comercial de celulosa cristalina (7,7 jM ). Este resultado confirma que el módulo de unión (CBM3a) de la sonda 1 está bien plegado y que se une a la celulosa cristalina con una alta afinidad independientemente de la proximidad del módulo indicador (eGFP).

Unión de isotermas de eGFP-CBM3a a AVICEL (círculo relleno) y papel WHATMAN (círculo abierto) después de una incubación de 1 hora a 23 °C de los distintos soportes de celulosa con eGFP-CBM3a (100 jg/pocillo) en un tampón Tris-HCl 20 mM a pH de 7,5 que contiene NaCl 20 mM y CaCb 5 mM. La constante de afinidad (K^a) se calculó a partir de la regresión no lineal de [P^unido] = N^oK^a[P ^libre] / (1+K^a[P ^libre]). En este ejemplo, K^aes igual a 8 jM para AVICEL y O, 083 para papel WHATMAN.

Ejemplo 7

El Ejemplo 7 establece parámetros para un experimento de unión de sonda típico usado en los siguientes ejemplos. Los materiales y las soluciones incluían tampón filtrado (Tris-CL 20 mM, pH 7,5 NaCl 20 mM CaCb 5 mM; agitación a temperatura ambiente durante 1 hora), leche al 6 % (fresca) en tampón (disuelva 1,2 g de leche en 20 ml de tampón; Centrifugar 2 min, 100 g, RT), leche al 3 % (fresca) en tampón, TWEEN al 0,05 % en tampón, hoja de mano derivada de la pulpa (disco de papel: 3 mm de diámetro) pegado al fondo de la microplaca negra brillante boca abajo. La adquisición de fluorescencia incluyó el criterio de valoración y área de escaneo de 3x3500 pm; longitud de onda de excitación (dependiente del módulo indicador) (9 mm)/longitud de onda de emisión (dependiente del módulo indicador) (9 mm); ganar 50; 75 y 100; y detección superior (4,5 mm). El volumen de la reacción fue de 200 pl. El protocolo FPTM del método de tratamiento con sonda fluorescente (fusión) (o polímero de fibra) fue consistente con el descrito en Knox P. J. (2012) Methods in Enzymology, volumen 510, 233-245, que se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad. Un procedimiento similar se describe en Ding et al. (2006) BioTechniques 41, 435-443, que se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad.

Se midió la fluorescencia de los discos de papel sin tratar. La hoja de prueba se incubó en 200 pl de leche al 3 %, una hora a temperatura ambiente con agitación lenta. Se realizó un lavado 3 (200 pl) x 5 min con tampón a temperatura ambiente con agitación. Se midió la fluorescencia de los discos de papel bloqueados. Se añadieron 200 pl de sonda/leche al 3 % y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora con agitación lenta. Se eliminó el sobrenadante y se midió la fluorescencia total. Se realizó un lavado 3 (200 pl) x 5 min con tampón a temperatura ambiente con agitación. Se midió la fluorescencia residual. Se realizó un lavado 3 (200 pl) x 5 min con TWEEN 0,05 % a temperatura ambiente con agitación. Se midió la fluorescencia residual. Se emplearon microplacas negras de 96 pocillos (Costar, n.° de cat 3631). Se ejecutó un programa SYNERGY Mx (BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont).

La FIG. 18 es un diagrama esquemático que describe los experimentos de unión de la sonda en un disco de papel. Las diversas pulpas utilizadas en los siguientes ejemplos se describen en la Tabla 5 (ND: No disponible; "*" = Composición química de la pulpa (% en peso) medida en CRML). Las pulpas utilizadas procedían de plantas papeleras de América del Norte.

T l : m i i n ími r rí i i ni l if r n l .

Ejemplo 8

Este ejemplo demuestra la comparación de la fluorescencia de una sonda comercial de "unión-indicador" con la fluorescencia de un módulo indicador solo en la superficie del papel de acuerdo con la presente invención. La detección específica de celulosa cristalina en la superficie de pequeños discos de pulpa 1 (~ 0,5 mg) se logró mediante la unión de eGFP-CBM3a comercial (empresa NZYTech). La señal no específica proporcionada por la unión del módulo indicador en los discos pequeños se midió después de la incubación con el módulo indicador solo. El ensayo se realizó en una microplaca de 96 pocillos. El exceso de Sonda 1 (o módulo indicador GFP) se eliminó mediante lavado con Tween 20 (0,05 %).

La fluorescencia del módulo indicador (solo o como componente de la sonda) se midió a una longitud de onda de 511 nm (longitud de onda de excitación 488 nm) usando un lector de microplacas SYNERGY Mx (BioTek Instruments, Inc.). Las intensidades de fluorescencia se presentan en el presente documento en función de la intensidad de refinamiento y los tratamientos con celulasa. La FIG. 19 muestra la intensidad de fluorescencia del módulo indicador (eGFP) solo unido a pulpa no tratada y tratada con celulasa (después de dos niveles de refinamiento). La señal fluorescente no específica obtenida con el módulo indicador solo fue muy baja en comparación con la sonda 1.

La FIG. 20 representa la intensidad de fluorescencia de la sonda 1 unida a pulpa no tratada y tratada con celulasas (después de dos niveles de refinamiento). La FIG. 20 muestra la detección de celulosa cristalina en la superficie de la hoja de prueba tratada con celulasa usando la sonda 1. Los tratamientos con enzimas celulasa de la pulpa vieja aumentaron la señal fluorescente en comparación con la pulpa no tratada en todos los niveles de refinado, lo que indica que los tratamientos con celulasa de la pulpa revelaron regiones adicionales de celulosa cristalina. Por consiguiente, utilizando la sonda 1 de la presente invención, el impacto de los tratamientos con celulasa en la pulpa se puede detectar sin utilizar pruebas clásicas de pulpa y papel.

Ejemplo 9

Este ejemplo demuestra la detección de cambios en la celulosa cristalina superficial después de tratamientos de refinado y celulasa de acuerdo con la presente invención. El método se basa en la intensidad de fluorescencia asociada al reconocimiento de celulosa cristalina por CBM3a-eGFP (Sonda 1) en la superficie de las hojas de mano. Usando una curva de fluorescencia de la sonda 1 estandarizada, la intensidad de fluorescencia medida se puede convertir en una cantidad (|jg) que luego se divide entre la superficie (mm2) de las hojas de mano. Los resultados (jg/mm2) permiten la cuantificación de la celulosa cristalina en la superficie de las hojas de prueba.

La cuantificación de celulosa cristalina en la superficie de las hojas de pulpa 1 se realizó en pequeños discos de ~ 0,5 mg. Las hojas de prueba con un peso base de 60 g/m2 se produjeron a partir de previamente tratadas (celulasas al 0,05 %, 1h, 50 °C, pH 7) y pulpa sin tratar 1. La detección específica de celulosa cristalina en la superficie de las hojas de pulpa 1 se logró con la sonda 1 (250 jg/ml, 1h, a temperatura ambiente, pH 7,4) en una microplaca de 24 pocillos (Gourlay et al., 2012). Después de tres etapas de lavado, la fluorescencia residual verde se midió a 511 nm (longitud de onda de excitación: 488 nm) utilizando un lector de microplacas Synergy Mx (Bioteck). Las intensidades de fluorescencia se promediaron y se presentaron como porcentajes, en función de las revoluciones de PFI (FIG. 21) o tratamientos con celulasa (FIG. 22).

La FIG. 21 representa el impacto del refinamiento de PFI en la cuantificación de celulosa cristalina en la superficie de las hojas de pulpa 1. La intensidad de fluorescencia sin refinar y el valor de CSF correspondiente se establecieron como puntos de referencia (100 %). La FIG. 21 muestra que la fluorescencia residual, que debe indicar la cantidad de celulosa cristalina marcada con la sonda 1 en la superficie de las hojas de mano de la pulpa 1, aumentó de 2,7 % al 28,6 % a medida que las revoluciones de PFI aumentaron de 1500 a 6000. Esta disminución no es lineal y se correlacionó con la disminución del CSF (de 87,9 ml a 71,1 ml), que es un indicador del grado de hidratación de la pulpa. Por consiguiente, el proceso de amorfogénesis (hinchazón de la pulpa con agua), que está asociado al refinado de PFI, es evidentemente responsable de la decristalización o pérdida registrada de celulosa cristalina en la superficie de las hojas de pulpa 1.

La FIG. 22 representa el impacto del tratamiento con celulasa en la cuantificación de celulosa cristalina en la superficie de las hojas de la pulpa 1. Las intensidades de fluorescencia sin tratar a 0, 3000 y 4500 revoluciones se establecieron como valores de referencia (100 %). La FIG. 22 muestra que todos los tratamientos con celulasa aumentaron la detección de celulosas cristalinas marcadas con eGFP. Estos resultados indican que las enzimas exponen celulosas cristalinas previamente enterradas en la superficie de las hojas de mano de la pulpa 1 en comparación con las hojas de mano sin tratar.

El mayor incremento registrado fue para el tratamiento de la pulpa 1 con celulasa C6 sin refinar. Los tratamientos con celulasa C1 y C2 produjeron el menor aumento de celulosa cristalina en la pulpa 1 sin refinar y refinada a 3000 revoluciones (frente a las no tratadas) en comparación con las otras muestras de enzimas. Sin embargo, el uso de un refinado más intenso (4500 revoluciones) en la pulpa tratada 1 con la muestra de celulasa C1, C2 y C3 conducen a un aumento de celulosas cristalinas. Estas observaciones podrían explicarse por las generaciones de microfibrillas después del refinado y, en consecuencia, un aumento de la exposición de celulosa cristalina en la superficie de las fibras. Estos resultados sugieren que los tratamientos con celulasa de la pulpa 1 seguidos de un tratamiento mecánico exponen una mayor cantidad de celulosas cristalinas. En oposición a todas las demás enzimas, el refinado no tuvo impacto en la hoja de prueba tratada con C4.

Ejemplo 10

Este ejemplo demuestra la predicción de la presencia o ausencia de cambios en la celulosa cristalina superficial después de tratamientos de refinado y xilanasa de acuerdo con la presente invención. La digestión de los polímeros de xilano por xilanasas puede descubrir celulosa cristalina y aumentar su detección en las superficies de las hojas de prueba en comparación con los controles no tratados. La sonda 1 se utilizó para detectar cambios en la celulosa cristalina en la superficie del papel después de los tratamientos con xilanasa. La FIG. 23 representa la cuantificación (pg/mm2) de la Sonda 1 unida a la superficie de hojas de prueba tratadas con xilanasa de la planta 2 refinadas a 0, 3000 y 4500 revoluciones PFI. La pulpa 2 se utilizó para la preparación de la hoja. La longitud de onda de excitación fue de 488 nm. Ningún tratamiento con xilanasa utilizado aquí tuvo un impacto significativo en la fluorescencia detectada. La cantidad de celulosa cristalina medida aquí sugiere que las preparaciones de xilanasa utilizadas no tuvieron impacto en la superficie de la fibra de celulosa. Este resultado concuerda completamente con el análisis de las propiedades físicas del papel y la morfología de las fibras después de los tratamientos con xilanasa. Los resultados de la sonda 1 FPTM revelan la ausencia de impacto de xilanasa en mucho menos tiempo que el requerido por los métodos tradicionales de TAPPI, permitiendo así un rápido, protocolo de alto rendimiento.

Ejemplo 11

Este ejemplo demuestra la detección de celulosa cristalina después del refinado de acuerdo con la presente invención. Se determinaron las correlaciones entre la detección de la sonda 1 y las propiedades físicas del papel utilizando dos pulpas diferentes. Se refinaron y analizaron dos pulpas (Pulpa 1 y Pulpa 2) mediante la sonda 1 y los métodos estándar TAPPI. La medición de celulosa cristalina en discos de hojas de prueba (60 g/m2) se realizó incubando los discos de papel con 250 pg/ml de Sonda 1. La fluorescencia de la sonda 1 se utilizó para el reconocimiento de celulosa cristalina en la superficie de las hojas de papel después del refinado (varios niveles de energía). Usando una curva estandarizada, la intensidad de fluorescencia medida se convierte en una cantidad (pg) de celulosa cristalina, que luego se divide entre la superficie (mm2) de las hojas de mano. Los resultados (pg/mm2) permiten la cuantificación de la celulosa cristalina en la superficie de las hojas de prueba.

La FIG. 24 representa la cuantificación de celulosa cristalina (pg/mm2) en la superficie de la hoja de prueba refinada de PFI (Pulpa 1 (planta 1; barra izquierda) frente a Pulpa 2 (planta 2; barra derecha). Estos resultados de FPTM apoyan el concepto de que el refinado de pulpa descristaliza parcialmente la celulosa. En el caso de las hojas de mano de Pulpa 2, se observan al menos tres eventos (o etapas) de descristalización: 0-2000, 3000-4500 y 6000 revoluciones PFI. Este efecto es menos evidente que cuando se utilizan más de 3000 revoluciones.

Las FIG. 25A-25D representan correlaciones entre la cuantificación de celulosa cristalina utilizando la sonda 1 (pg/mm2) y Propiedades físicas de la pulpa 2/papel en función de la energía de refinado (revoluciones PFI). La FIG.

25A representa el índice de desgarro (mN m2/g), La FIG. 25B representa el índice de tracción (N m/g), La FIG. 25C representa la fuerza de unión interna (J/m2) y la FIG. 25D representa la longitud media de las fibras (mm). Las FIG.

25A-25D muestran las correlaciones entre la señal de la sonda 1 y las propiedades físicas del papel correspondiente para las hojas de mano de Pulpa 2. Se observa una correlación inversa con el índice de tracción y la fuerza de unión interna (Figura 25B-25C). En cambio, el índice de desgarro se correlaciona directamente con la cuantificación de celulosa cristalina (Figura 25A). Estas correlaciones se pueden utilizar para predecir el impacto de varios tratamientos de refinado en las propiedades finales del papel en un tiempo muy corto (1 hora frente a días) en comparación con los análisis de papel y pulpa TAPPI. El enlace interno y la longitud de la fibra se modificaron aún más refinando más allá de las 3000 revoluciones, en variación con los índices de desgarro y tracción que se estabilizaron en condiciones similares.

Los cambios en las propiedades y la celulosa cristalina detectados después del tratamiento de la pulpa 1 se muestran en las FIG. 26A-26D. Se representan las correlaciones entre la cuantificación de celulosa cristalina usando la sonda 1 (pg/mm2) y las propiedades físicas de la pulpa 1/papel en función de la energía de refinado (revoluciones de PFI). La FIG. 26A representa el índice de desgarro (mN m2/g), La FIG. 26B representa el índice de tracción (N m/g), La FIG.

26C representa la fuerza de unión interna (J/m2) y la FIG. 26D representa la longitud media de las fibras (mm). La cantidad de celulosa detectada por la sonda 1 disminuyó a medida que aumentaba la energía de refinación en general, con la excepción del valor asociado a 1500 revoluciones. Excepto por este valor particular, todos los paneles sugieren las mismas correlaciones que las observadas con la pulpa 2 (FIG. 25A-25B). El contenido diferente en lignina de cualquiera de las pulpas no pareció afectar las correlaciones generales. Las correlaciones fueron positivas para el índice de desgarro y recíprocas para la unión interna y el índice de tracción.

Las cuatro propiedades monitoreadas continuaron cambiando cuando el refinado se incrementó más allá de las 3000 revoluciones. Por consiguiente, la aplicación del método a diferentes pulpas puede dar como resultado cambios sutiles en las correlaciones a alta energía de refinación. Independientemente de las propiedades físicas y la pulpa aquí estudiadas, el impacto del refinado sobre la celulosa cristalina se observó después de una degradación mínima de la fibra (es decir, cuando el tratamiento excedía las 1500 revoluciones). El impacto de refinar más allá de las 3000 revoluciones ya no está asociado con cambios en la celulosa cristalina en la superficie (no cambia con refinamiento adicional). Consecuentemente, mejorar y desarrollar las propiedades físicas de la pulpa/papel, la intensidad del refinado debería degradar mínimamente la matriz cristalina de la pulpa.

Los resultados demuestran que el método es un indicador de diagnóstico que se puede tener en cuenta a la hora de determinar las condiciones de refinamiento de un conjunto de propiedades determinado. Su simplicidad y alta sensibilidad permiten un diagnóstico rápido y eficiente de las mejores condiciones de refino utilizadas para un conjunto de propiedades físicas. Los resultados muestran que el método se puede utilizar para predecir el impacto de un tratamiento en las propiedades de la pulpa y el papel para el desgarro, resistencia a la tracción y a la unión interna, sin realizar mediciones reales de esas propiedades en hojas de prueba.

Ejemplo 12

Este ejemplo demuestra la detección de xilano en la superficie de discos de papel de acuerdo con la presente invención. La pulpa 5 (pulpa mecánica sin blanquear), la pulpa 6 (pulpa mecánica blanqueada, la pulpa 3 (pulpa Kraft sin blanquear), la Pulpa 4 (pulpa Kraft blanqueada) y la Pulpa 2 (pulpa Kraft sin blanquear) se usaron en este ejemplo (como se describe anteriormente en la Tabla 5). El ensayo se realizó en microplacas de 96 pocillos y cada pocillo contenía un pequeño disco de hoja de prueba (60 g/m2). La detección específica de xilano en la superficie de dichos discos hechos de diferentes pulpas se logró mediante la unión de la sonda 3 (CBM15-mOrange2). La intensidad de la fluorescencia se midió después de incubar los discos de papel con 200 pl de solución de Sonda 3. El exceso de Sonda 3, así como la unión no específica del mismo aducto a cualquier otro resto, se eliminó lavando tres veces con una solución TWEEN 20 (0,05 %). La intensidad de la fluorescencia de la sonda 3 unida se midió a una longitud de onda de 569 nm (longitud de onda de excitación 549 nm) usando un lector de microplacas SYNERGY Mx.

La FIG. 27 representa la intensidad de fluorescencia de la sonda 3 unida a xilano en la superficie de cinco discos de papel diferentes: pulpa Kraft sin blanquear UBKPR (pulpa 2), pulpa mecánica sin blanquear UBMP (Pulpa 5), Pulpa mecánica blanqueada BMP (Pulpa 6), Pulpa kraft sin blanquear UBKP (pulpa 3); y pulpa Kraft blanqueada con b Kp (pulpa 4). Estos resultados muestran que la sonda 3 tiene una mayor afinidad de unión hacia los discos derivados de BKP en comparación con los otros discos de papel. Estos resultados pueden atribuirse al contenido de lignina en la superficie de los discos de papel. En la fabricación de pasta Kraft, se utilizan productos químicos y calor para disolver la lignina, el aglutinante que recubre la celulosa y la hemicelulosa. El contenido de lignina de la pulpa química sin blanquear es aproximadamente del 3-5 % y el proceso de blanqueo elimina prácticamente toda la lignina restante, llevándolo hacia el 0 % del contenido total. Los métodos mecánicos de fabricación de pasta conservan la mayor parte del componente de la madera, de modo que el contenido de lignina es similar al de la madera (20-28 %). El papel Kraft blanqueado que contiene la menor cantidad de lignina ha sido detectado por la sonda de manera mucho más eficiente que los otros discos de papel. Esto puede atribuirse a la mayor exposición de xilano en la superficie de las fibras blanqueadas. Este análisis muestra que la sonda 3 detecta xilano en la superficie de los discos de papel y que puede discriminar entre superficies de papel hechas de diferentes pulpas.

Ejemplo 13

Este ejemplo demuestra la detección de la eliminación de xilano después de tratamientos enzimáticos de acuerdo con la presente invención. También se probó la capacidad de detectar xilano para la pulpa en la que el contenido de xilano se modificó en la superficie de la fibra. Para demostrar la unión de la sonda 3 al xilano de forma inequívoca, se trataron discos de papel (de pulpa Kraft blanqueada (BKP)) con un ensayo de detección previo de xilanasa comercial. Se utilizó xilanasa en dos dosis: 0,1 U por disco de papel y 0,4 U por disco de papel. Los resultados se muestran en la FIG. 28. La FIG. 28 representa la intensidad de fluorescencia de la Sonda 3 unida a xilano en la superficie del papel Pulpa 4 (BKP) sin tratar y tratado con xilanasa. La duración del tratamiento se indica en el eje x. Sin tratamiento indica discos de papel de pulpa 4 sin tratamiento con xilanasa. "O/N" indica papel tratado con xilanasa durante la noche a temperatura ambiente. La unión de la sonda 3 se redujo en casi un 80 % después del tratamiento con xilanasa, estableciendo que el método detecta variaciones de polímeros en la superficie de las fibras.

Ejemplo 14

Este ejemplo demuestra la detección de manano en la superficie de discos de papel de acuerdo con la presente invención. Un alto contenido de manano (y la redeposición en la superficie de la fibra de celulosa durante el despulpado Kraft) puede inhibir el proceso de blanqueo. Por consiguiente, mananasa, además de xilanasa, se utiliza para el preblanqueo. Para optimizar el tratamiento con mananasa, es útil determinar el contenido de manano antes y después del preblanqueo.

Se investigaron dos grados diferentes de pulpa (Pulpa 3: pulpa Kraft sin blanquear (UBKP) y pulpa 4: pulpa Kraft blanqueada (BKP)) con respecto a su contenido de manano. El ensayo se realizó en microplacas de 96 pocillos y cada pocillo contenía un pequeño disco de hoja de prueba (60 g/m2). La detección específica de manano en la superficie de dichos discos hechos de diferentes pulpas se logró uniendo la fusión de proteínas eCFP-CBM27, también llamada Sonda 4. La intensidad de la fluorescencia se midió después de incubar los discos de papel con 200 pl de solución de Sonda 4. El exceso de Sonda 4, así como la unión no específica del mismo aducto a cualquier otro resto, se eliminó lavando 3 veces con una solución TWEEN 20 (0,05 %). La intensidad de la fluorescencia de la sonda 4 unida se midió a una longitud de onda de 477 nm (longitud de onda de excitación 434 nm) usando un lector de microplacas SYNERGY Mx. Las intensidades de fluorescencia de las sondas unidas se presentan en la FIG. 29.

La FIG. 29 representa la intensidad de fluorescencia de la sonda 4 (eCFP-CBM27) unida al manano en la superficie de dos discos de papel diferentes: pulpa Kraft sin blanquear (Pulpa 3, UBKP) y pulpa Kraft blanqueada (Pulpa 4, BKP). Estos resultados muestran que la Sonda 4 tiene una mayor afinidad de unión hacia los discos derivados de Pulpa 4 (BKP) en comparación con los discos de papel de Pulpa 3 (UBKP). Estos resultados pueden atribuirse a la redeposición de las hemicelulosas y al contenido de lignina en la superficie de los discos de papel de pulpa 4 (BKP). En la fabricación de pasta Kraft, se utilizan productos químicos y calor para disolver la lignina, el aglutinante que recubre la celulosa y la hemicelulosa. Por tanto, el contenido de lignina desciende del 3 al 5 % hasta casi cero. De este modo, el manano en papel Kraft blanqueado (que contiene la menor cantidad de lignina) ha sido detectado por la sonda de manera mucho más eficiente que los otros discos de papel. Este resultado refleja la mayor exposición de manano en la superficie de las fibras blanqueadas.

Ejemplo 15

Este ejemplo demuestra la detección de la eliminación de manano después del tratamiento enzimático de acuerdo con la presente invención. Se probó la capacidad de detectar manano en la superficie de las fibras. Para mostrar la unión de la sonda 4 a manano sin ambigüedades, se trataron discos de papel (de pulpa Kraft blanqueada (Pulp 4, BKP)) con una enzima mananasa comercial (MEGAZYME-E-BMANN) antes del ensayo de detección. Los resultados se muestran en la FIG. 30. La FIG. 30 representa la intensidad de fluorescencia de la Sonda 4 unida a manano en la superficie de papel Kraft blanqueado tratado con mananasa (Pulpa 4, BKP). La unión de la sonda 4 se redujo en casi un 44 % después de un tratamiento de 1 hora con mananasa. Estos resultados demuestran claramente que el método detecta variaciones en los polímeros en la superficie de las fibras.

Se ha hecho referencia a las siguientes referencias:

Linder, M. et al. (1996) J Biol Chem 271, 21268-21272.

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Además, cuando una cantidad, una concentración u otro valor o parámetro se da como intervalo, intervalo preferido o lista de valores preferibles superiores y valores preferibles inferiores, se ha de entender que se desvelan específicamente todos los intervalos formados a partir de cualquier par de cualquier límite de intervalo superior o valor preferido y cualquier límite de intervalo inferior o valor preferido, independientemente de si los intervalos se desvelan por separado. En los casos en los que se cita un intervalo de valores numéricos en el presente documento, a menos que se indique de otra manera, el intervalo está destinado a incluir los puntos finales del mismo y todos los números enteros y las fracciones dentro del intervalo. No se pretende que el alcance de la invención se limite a los valores específicos citados cuando se define un intervalo.

LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ ID NO: 1 (ácido nucleico) para eGFP-CBM3a (Sonda 1). El texto subrayado representa el sitio de escisión de trombina que une eGFP a CBM3a.

AT GGGT C ATC ACC AT C ACC ATC ACGGT GT GAGC AAGGGCGAGGAGCT GTT C ACCGG GGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCG TGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATC TGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTAC GGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAG TCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGG C AACT AC AAGACCCGC GCCG AGGT GAAGTT CG AGGGCGAC ACC CT GGT GAACCGC A TCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTG GAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGG CATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCG CCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGAC AACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGA TCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGA GCTGTACAAAAGTTCCGGTCTGGTGCCGCGTGGTAGCACACCGGTATCAGGCAATTT GAAGGTT G AATT CT AC AAC AGC AATCCTT C AGAT ACT ACTAACTC AATC AAT CCT C A GTT C AAGGTTACTAAT ACC GGAAGC AGT GC AATT G ATTT GTCC A AACT C AC ATT G AG ATATT ATT AT AC AGTAGAC GGAC AG A AAGAT C AGACCTT CT GGT GT G ACC AT GCT GC AAT AATC GGC AGT AAC GGC AGCT AC AAC GGAATT ACTT C AA AT GT AAAAGG AAC AT TT GT AAAA AT GAGTT CCT C AAC AAAT AACGC AGAC AC CT AC CTT G A AATT AGCTTT A CAGGCGGAACTCTTGAACCGGGTGCACATGTTCAGATACAAGGTAGATTTGCAAAG

AAT GACT GGAGT AACT ATAC AC AGT C A A AT G ACTACT C ATT C A AGTCT GCTT C AC AG TTT GTT G AAT GGGAT C AGGT AAC AGC ATACTT G AACGGT GTTCTT GTAT GGGGT AA A GAATAA SEQ ID NO: 2 (aminoácido) para eGFP-CBM3a (Sonda 1). El texto subrayado representa el sitio de escisión de trombina que une eGFP a CBM3a.

M GHHHHHHGVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICT

TG K LPV PW PTLV TTLTY G V Q C FSR Y PD H M K Q H D FFK SA M PEG Y V Q ER TIFFK D D G N Y K TR A EV K FEG D TLV N R IELK G ID FK ED G N ILG H K LEY N Y N SH N V Y IM A D K Q K N G IK V N FK IR H N IED G SV Q LA D H YQ Q N TPIG D G PVLLPD N H YLSTQ SA LSK D PN EK R D H M V LLEFV T A A G IT LG M D ELY K S SG L V P R G STP V SG N LK V EF YN SN PSD TTN SIN PO FK VTN TG S S AID L SK LT LR Y Y Y TV D G Q K D Q TFW C D H A A IIG SN G SY N G ITSN V K G T FV K M SSSTN N A D T Y L EISFTG G TLEPG A H V Q IQ G R FA K N D W SN Y TQ SN D Y SFK SA SQ FV EW D Q V TA Y LN G V LV W G K E SEQ ID NO: 3 para el enlazador de la sonda 1.

AGTTCCGGTCTGGTGCCGCGTGGTAGC SEQ ID NO: 4 (aminoácido) para el enlazador de la sonda 1.

SSGLVPRGS SEQ ID NO: 5 (ácido nucleico) para mCherry-CBM4-1 (Sonda 2a). El texto subrayado representa la glicina que une mCherry con CBM4-1.

AT GGGT C AT C ACC AT C ACC ATC ACGGT GT GAGC AAGGGCGAGG AGG AT AAC AT GGC

C ATC AT C AAGG AGTT C AT GCGCTTC AAGGT GC AC AT GG AGGGCTCCGT G AACGGCC

ACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGAC

CGCC AAGCT GAAGGTGACC AAGGGTGGCCCCCT GCCCTTCGCCT GGGAC AT CCT GT C

CCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGA

CT ACTT G AAGCT GTCCTTCCCCGAGGGCTT C AAGTGGGAGCGCGT G AT G AACTT CG A

GGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCA

TCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAG

AAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGC

CCT GAAGGGCGAGAT C AAGC AGAGGCT GAAGCT GAAGG ACGGCGGCC ACT ACG AC

GCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTA

CAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGG

AACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTAC

AAGGGTGCGTCGCCGATCGGGGAGGGAACGTTCGACGACGGGCCCGAGGGGTGGGT

CGCGTACGGCACCGACGGCCCCCTCGACACGAGCACGGGCGCGCTGTGCGTCGCCG

TGCCGGCCGGCTCCGCGCAGTACGGCGTCGGCGTCGTGCTCAACGGCGTCGCGATC

GAGGAAGGGACCACCTACACGCTCCGGTACACCGCGACGGCCTCGACCGACGTCAC

CGTGCGGGCGCTCGTCGGGCAGAACGGCGCCCCCTACGGCACCGTGCTCGACACGA

GCCCGGCCCTGACGTCCGAGCCGCGGCAGGTGACCGAGACGTTCACGGCCTCGGCG

ACGTACCCCGCGACACCCGCCGCCGACGACCCCGAGGGGCAGATCGCCTTCCAGCT

CGGCGGGTTCAGCGCCGACGCGTGGACGTTCTGCCTCGACGACGTCGCGCTCGACTC

CGAGGTCGAGCTCTAA SEQ ID NO: 6 (aminoácido) para mCherry-CBM4-1 (Sonda 2a). El texto subrayado representa la glicina que une mCherry con CBM4-1.

MGHHHHHHGVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAK LKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGG VVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEI

'XZ/^\T>^t r r x T / T \ / ^ n T T \ r r \ ^a 7 x r ' i " i ^ r x r ^at / T / m 7 ^{a t t}*/ ^ ^{a t t a t í}r x T T T / 'T r \ T r r c i T T \ T r ir \ ' í r rr T T r n r w m n ^ar ' o r v v ^ r v j ^ j v i ^ r v i ^ v j r v j n i v r v i i i v y L r u A i i n v j>j i i s j u -UM i o n iM T /J L / i 11 v i RHSTGGMDELYKGASPIGEGTFDDGPEGWVAYGTDGPLDTSTGALCVAVPAGSAQYG V G V VLN G V AIEEGTT YTLRYT ATASTD VT VRAL V GQN GAP Y GT VLDTSP ALTSEPRQ VT ETFTASATYPATPAADDPEGQIAFQLGGFSADAWTFCLDDYALDSEVEL

SEQ ID NO: 7 (ácido nucleico) para mCherry-CBM17 (Sonda 2b). El texto subrayado representa el codón de glicina que une mCherry a CBM17.

AT GGGT C AT C ACC AT C AC C AT C ACGGT GT G AGC AAGGGCGAGGAGGAT AAC AT GGC CATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCC ACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGAC CGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTC CCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGA CTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGA GGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCA TCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAG AAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGC CCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGAC GCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTA CAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGG AACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTAC A AGGGTTT AT GGGC AG AT AAT GAATTA ACC ACTT C AGGT C AAT AT GT ACGT GCT CGT ATTAAGGGAGCTTATTATGCTACACCAGTTGATCCTGTAACAAACCAACCAACAGCA CCGAAAGACTTTTCTTCAGGCTTTTGGGACTTTAATGACGGTACTACACAAGGTTTT GGT GT AA ATCC AG ATAGT CC AATAACT GCT ATT AAT GTT GAAA AT GCT AAC AAT GCT TT AAAAAT C AGC AAT CTT AAT AGT AAGGGTAGT AAT G ATTT AT C T GAAGGA AAC TTT T GGGC C AAT GT CCGC ATTT C AGCT G ATATCT GGGG AC AA AGT AT AAATAT AT AT GG A GACACAAAACTAACAATGGATGTTATAGCTCCAACACCTGTAAATGTATCAATCGCA GCTATCCCACAAAGTAGTACTCACGGTTGGGGAAATCCTACAAGAGCTATACGTGTT T GG AC AAAC AACTTT GT AGC AC AAACT GAT GGAACCT AT AAAGC A ACTTT G ACC ATT TCTACAAACGATAGTCCAAATTTCAATACTATAGCTACAGATGCTGCTGATAGTGTA GT AAC AAATAT GATT GT ATTT GTT GGTT C A AATT C AGAT AAT ATTT CTTT AGAC AAT A T AAAGTTT ACTA AAT AAGG AT C CGGCT GCTAAC AAAGCCCGAA AGGAAGCT G AGTT GGCT GCT GCC ACCGCT G AGC AAT AACT AGC AT AACCCCTT GGGGCCT CT AA

SEQ ID NO: 8 (aminoácido) para mCherry-CBM17 (Sonda 2b). El texto subrayado representa el codón de glicina que une mCherry a CBM17.

MGHHHHHHGVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAK LKVTKGGPLPFAW DILSPQFM YGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKW ERVM NFEDGG YVTVTQDSSLQDGEFIYKYKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEI KQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEG

RHST GGMDEL YK G L WADNELTTSGQ YVRARIKG A Y Y ATP VDP VTN QPT APKDF S S GF WDFNDGTTQGFGVNPDSPITAINVENANNALKISNLNSKGSNDLSEGNFWANVRISADI WGQSINIYGDTKLTMDVIAPTPVNVSIAAIPQSSTHGWGNPTRAIRVWTNNFVAQTDGT YKATLTISTNDSPNFNTIATDAADSVVTNMILFVGSNSDNISLDNIKFTK

SEQ ID NO: 9 (ácido nucleico) para mOrange2-CBM15 (Sonda 3). El texto subrayado representa el codón de glicina que une mOrange2 a CBM15.

A T G G G TC A T C A C C A T C A C C A T C A C G G T G T G A G C A A G G G C G A G G A G A A T A A C A T G G C C A T C A T C A A G G A G T T C A T G C G C T T C A A G G T G C G C A T G G A G G G C T C C G T G A A C G G C C A C G A G T T C G A G A T C G A G G G C G A G G G C G A G G G C C G C C C C T A C G A G G G C T T T C A G A C C G C T A A G C T G A A G G T G A C C A A G G G T G G C C C C C T G C C C T T C G C C T G G G A C A T C C T G T C C CC T C A 1'11 C A C C 'I’A C G G C rC C A A G G C C 1A C G T G A A G C A C C C C G C C G A C A IC C C C G A C

T A C T T C A A G C T G T C C T T C C C C G A G G G C T T C A A G T G G G A G C G C G T G A T G A A C T A C G A G G A C G G C G G C G T G G T G A C C G T G A C C C A G G A C T C C T C C C T G C A G G A C G G C G A G T T C A T C T A C A A G G T G A A G C T G C G C G G C A C C A A C T T C C C C T C C G A C G G C C C C G T G A T G C A G A A G A A G A C C A T G G G C T G G G A G G C C T C C T C C G A G C G G A T G T A C C C C G A G G A C G G T G C C C T G A A G G G C A A G A T C A A G A T G A G G C T G A A G C T G A A G G A C G G C G G C C A C T A C A C C T C C G A G G T C A A G A C C A C C T A C A A G G C C A A G A A G C C C G T G C A G C T G C C C G G C G C C T A C A T C G T C G A C A T C A A G T T G G A C A T C A C C T C C C A C A A C G A G G A C T A C A C C A T C G T G G A A C A G T A C G A A C G C G C C G A G G G C C G C C A C T C C A C C G G C G G C A T G G A C G A G C T G T A C A A G G G T G T C G C T G C C A G C G A G G G C A A T G T T G T T A T A G A G G T G G A C A T G G C A A A T G G C T G G A G A G G C A A C G C A T C A G G C A G T A C C A G C C A T T C C G G T A T T A C C T A C A G T G C C G A T G G C G T T A C C T T T GCCG C A C T G G G C G A T G G C G T G G G C G C T G T T T T T G A T A T T G C C C G A

CC A A C C A C A C T G G A A G A T G C T G T G A T A G C A A T G G T T G T T A A T G T C A G C G C T G A A T T T

A A G G C C A G T G A A G C C A A C T T G C A G A T A T T T GC C C A G T T A A A A G A A G A C T G G T C A A A G G G C G A A T G G G A T T G T C T G G C G G C C A G C A G C G A A C T C A C T G C G G A T A C T G A C C T A A C C C T G A C C T G C A C C A T T G A T G A A G A C G A C G A T A A A T T C A A C C A A A C G G C G C G C G A T G T G C A A G T C G G T A T C C A G G C C A A G G G A A C A C C C G C C G G A A C T A T C A C C A T T A A A A G C G T C A C C A T T A C A C T C G C A C A G G A A G C C T A T T C A G C C A A T T A A

SEQ ID NO: 10 (aminoácido) para mOrange2-CBM15 (Sonda 3). El texto subrayado representa el codón de glicina que une mOrange2 a CBM15.

MGHHHHHHGVSKGEENNMAIIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGFQTAK LKVTKGGPLPFAWDILSPHFTYGSKAYVKHPADIPDYFKLSFPEGFKWERVMNYEDGG V VT VTQD S S LQDGEFIYKVKLRGTNFP SDGP VMQKKTMG W E AS SERM YPED GALKGKI KM RLKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPVQLPGAYIVDIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGR HSTGGMDELYKGVAASEGNVVIEVDMANGWRGNASGSTSHSGITYSADGYTFAALGD G VG A VFDIARPTTLED AVI AM V VN VS AEFK A SE ANLQIF AQLKED W SKGE WD CEAAS S ELTADTDLTLTCTIDEDDDKFNQTARDVQVGIQAKGTPAGTITIKSVTITLAQEAYSAN SEQ ID NO: 11 (ácido nucleico) para eCFP-CBM27 (Sonda 4). El texto subrayado representa el codón de glicina que une eCFP a CBM27.

A T G G G T C A T C A C C A T C A C C A T C A C G G T G T G A G C A A G G G C G A G G A G C T G T T C A C C G G G G TG G TG C C C A TC C T G G T C G A G C T G G A C G G C G A C G T A A A C G G C C A C A A G T TC A G C G TG TC C G G C G A G G G C G A G G G C G A T G C C A C C T A C G G C A A G C T G A C C C T G A A G T T C A T C TG C A C C A C C G G C A A G C TG C C C G TG C C C TG G C C C A C C C TC G TG A C C A C C C TG A C C TG G G G C G T G C A G T G C T T C A G C C G C T A C C C C G A C C A C A T G A A G C A G C A C G A C T T C T T C A A G T C C G C C A TG C C C G A A G G C T A C G T C C A G G A G C G C A C C A T C T T C T T C A A G G A C G A C G G CAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCA TCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTG GAGTACAACTACATCAGCCACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGG CATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCG CCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGAC AACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGA TCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGA GCTGTACAAGGGTAACGAAGCACGGTACGTGCTCGCAGAGGAAGTTGATTTTTCCTC

CACCTGACATTGAATGGAACGGTGAGGTGGGAAATGGAGCACTGCAGCTGAACGTG AAACTGCCCGGAAAGAGCGACTGGGAAGAAGTGAGAGTAGCAAGGAAGTTCGAAA GACTCTCAGAATGTGAGATCCTCGAGTACGACATCTACATTCCAAACGTCGAGGGAC TC AAGGGAAGGTTGAGGCCGT ACGCGGTTCTGAACCCCGGCTGGGT GAAGATAGGC CTCGACATGAACAACGCGAACGTGGAAAGTGCGGAGATCATCACTTTCGGCGGAAA AGAGTACAGAAGATTCCATGTAAGAATTGAGTTCGACAGAACAGCGGGGGTGAAAG AACTTCACATAGGAGTTGTCGGTGATCATCTGAGGTACGATGGACCGATTTTCATCG A T AAT GT G AG ACTTT AT AAAAG AAC AGG AGGT AT GTA A SEQ ID NO: 12 (aminoácido) para eCFP-CBM27 (Sonda 4). El texto subrayado representa el codón de glicina que une eCFP a CBM27.

M GHHHHHHGVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICT TG KLPVPW PTLVTTLTW G VQ CFSRYPD H M KQ H D FFKSAM PEG YVQ ERTIFFKD D G N YK TR A EV K FEG D TL VNRIELKGIDFKEDGNILGHKLE YN YISH N V Y IT ADKQKN GIKANFKI RHNIEDGS V QL ADH Y QQNTPIGDGP VLLPDNH YLSTQ S ALSKD PN EK RD H M V LLEF V TA AGITLGMDEL YKGNE AR Y V L AEEVD FS SPEE VKN W WN S GT WQ A EF GSPDIE WN G EY G N G ALQ LN VKLPG KSDW EEVRVARKFERLSECEILEYDIYIPNVEGLKGRLRPYAVLNPG W YKIGLDM NNANVESAEIITFGGKEYRRFHVRIEFDRTAGYKELHIGYVGDHLRYDGPIF IDNVRLYKRTGGM .

SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico) para CBM3a.

ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTACACCGACCAAGGGAGCAACACCAACAAA

TACAGCTACGCCGACAAAATCAGCTACGGCTACGCCCACCAGGCCATCGGTACCGA

CAAACACACCGACAAACACACCGGCAAATACACCGGTATCAGGCAATTTGAAGGTT

GAATTCTACAACAGCAATCCTTCAGATACTACTAACTCAATCAATCCTCAGTTCAAG

GTTACTAATACCGGAAGCAGTGCAATTGATTTGTCCAAACTCACATTGAGATATTAT

TATACAGTAGACGGACAGAAAGATCAGACCTTCTGGTGTGACCATGCTGCAATAAT

CGGCAGTAACGGCAGCTACAACGGAATTACTTCAAATGTAAAAGGAACATTTGTAA

AAATGAGTTCCTCAACAAATAACGCAGACACCTACCTTGAAATTAGCTTTACAGGCG

GAACTCTTGAACCGGGTGCACATGTTCAGATACAAGGTAGATTTGCAAAGAATGAC

TGGAGTAACTATACACAGTCAAATGACTACTCATTCAAGTCTGCTTCACAGTTTGTT

G AAT GG G AT C AGGT AAC AGC AT ACTTG AACGGT GTT C TT GT AT GGGGT A AAGA AT A

A

SEQ ID NO: 14 (aminoácido) para CBM3a.

MGHHHHHHGTPTKGATPTNTATPTKSATATPTRPSVPTNTPTNTPANTPVSGNLKVEFY

NSNPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGQKDQTFWCDHAAIIGSNGSY

NGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEPGAHVQIQGRFAKNDWSNYTQSND

YSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKE SEQ ID NO: 15 (ácido nucleico) para CBM4-1.

ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTGCGTCGCCGATCGGGGAGGGAACGTTCGA CGACGGGCCCGAGGGGTGGGTCGCGTACGGCACCGACGGCCCCCTCGACACGAGCA CGGGCGCGCTGTGCGTCGCCGTGCCGGCCGGCTCCGCGCAGTACGGCGTCGGCGTC GTGCTCAACGGCGTCGCGATCGAGGAAGGGACCACCTACACGCTCCGGTACACCGC GACGGCCTCGACCGACGTCACCGTGCGGGCGCTCGTCGGGCAGAACGGCGCCCCCT ACGGCACCGTGCTCGACACGAGCCCGGCCCTGACGTCCGAGCCGCGGCAGGTGACC GAGACGTTCACGGCCTCGGCGACGTACCCCGCGACACCCGCCGCCGACGACCCCGA GGGGCAGATCGCCTTCCAGCTCGGCGGGTTCAGCGCCGACGCGTGGACGTTCTGCCT CGACGACGTCGCGCTCGACTCCGAGGTCGAGCTCTAA SEQ ID NO: 16 (aminoácido) para CBM4-1.

M GHHHHHHGASPIGEGTFDDGPEGWVAYGTDGPLDTSTGALCVAVPAGSAQYGVGVV LN G V AIEEGTT Y T L R Y T ATAS TD VT VRALV GQN GAP Y GT VLDTSP ALTSEPRQ V TETFT ASATYPATPAADDPEGQIAFQLGGFSADAW TFCLDDVALDSEVEL SEQ ID NO: 17 (ácido nucleico) para CBM17.

ATGGGTCATCACCATCACCATCACG G TTTATG G G CAG ATAATG AATTAACCACTTCA GGTCAATATGTACGTGCTCGTATTAAGGGAGCTTATTATGCTACACCAGTTGATCCT GTAACAAACCAACCAACAG CACCG AAAG ACTTTTCTTCAG G CTTTTG G G ACTTTAAT

P v j r í A x v P v n »v r j i xT ^í A i v r / T x A r A r A A P A T x T x T x i T v j P v n j T i v P j T i r a x n a u r A j . x T V r / P V A / P P x \ A j r \ T x A n \ P j T x P V / PV / AP x t A x T xA n u r A x v > fT i n P j T v T x A n . T i T ■ A ^ ^ AT ■ GTTGAAAATG CTAACAATG CTTTAAAAATCAG CAATCTTAATAG TAAG GG TAGTAAT GATTTATCTGAAGGAAACTTTTGGGCCAATGTCCGCATTTCAGCTGATATCTGGGGA CAAAG TATAAATATATATG G AG ACACAAAACTAACAATG G ATG TTATAG CTCCAAC

ACCTGTAAATGTATCAATCGCAGCTATCCCACAAAGTAGTACTCACGGTTGGGGAAA TCCT AC AAGAGCTAT ACGT GTTT GG AC A A AC AACTTT GTAGC AC A A ACTGATGG A AC CTATAAAGCAACTTTGACCATTTCTACAAACGATAGTCCAAATTTCAATACTATAGC T AC AGAT GCTGCT GATAGT GTAGT AAC A A AT AT GATTCT A TTT GTT GGTT C A AATTC AG AT A AT ATTTCTTT AG AC AAT A TA AAGTTT ACT AAAT AA

SEQ ID NO: 18 (aminoácido) para CBM17.

M GHHHHHHGLW ADNELTTSGQYVRARIKGAYYATPVDPVTNQPTAPKDFSSGFW DFN DGTTQGFGVNPDSPITAINVENANNALKISNLNSKGSNDLSEGNFW ANVRISADIW GQSI N IY GDTKLTM DVIAPTPVNV SIAAIPQSSTHGW GNPTRAIRVW TNNFVAQTDGTYKATL TISTNDSPNFNTIATDAADSVVTNM ILFYGSNSDNISLDNIKFTK SEQ ID NO: 19 (ácido nucleico) para CBM15.

ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTGTCGCTGCCAGCGAGGGCAATGTTGTTATA GAGGTGGACATGGCAAATGGCTGGAGAGGCAACGCATCAGGCAGTACCAGCCATTC CGGTATTACCTACAGTGCCGATGGCGTTACCTTTGCCGCACTGGGCGATGGCGTGGG

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U U L 1 Lr I 111 i Ü A I A 11 IA A A .L tA LA JA A U L.A LA L .1 LrLrA ALrA 1 LrL.1 Lr 1 LrA 1 A L rU A A 1 LrLr 1 TGTTAATGTCAGCGCTGAATTTAAGGCCAGTGAAGCCAACTTGCAGATATTTGCCCA GTTAAAAGAAGACTGGTCAAAGGGCGAATGGGATTGTCTGGCGGCCAGCAGCGAAC TCACTGCGGATACTGACCTAACCCTGACCTGCACCATTGATGAAGACGACGATAAAT T C AACC AAACGGCGCGCGAT GT AC AAGT CGGTATCC AGGCC AAGGGAACACCCGCC GGAACTATCACCATTAAAAGCGTCACCATTACACTCGCACAGGAAGCCTATTCAGCC AATTAA SEQ ID NO: 20 (aminoácido) para CBM15.

M GHHHHHHGVAASEGNVVIEVDMANGWRGNASGSTSHSGITYSADGVTFAALGDGV GAVFDIARPTTLED AVIAM VVN VSAEFKASEAN LQ IFAQ LKED W SKG EW D CLAASSELT ADTDLTLTCTIDEDDDBCFNQTARDVQVGIQAKGTPAGTITIKSVTITLAQEAYSAN SEQ ID NO: 21 (ácido nucleico) para CBM27.

A T G G G T C A T C A C C A T C A C C A T C A C G G T A A C G A A G C A C G G T A C G T G C T C G C A G A G G A A G T T G A T T T T T C CTCTC C A G A A G A G G T G A A A A A C T G G T GG A A C A G C G G A A C C T G G C AG G C A G A G T T CG G G TC A C C T G A C A T T G A A T GG A A C G G T G A G G T G G G A A A T G G A G C A C T G C A G C T G A A C G T G A A A C T G C C C G G A A A G A G C G A C T G G G A A G A A G T G A G A G T A G C A A G G A A G T T C G A A A G A C T C T C A G A A T G T G A G A T C C T C G A G T A C G A C A T C T A C A T T C C A A A C G T C G A G G G A C T C A A G G G A A G G T T G A G G C C G T A C G C G G T T C T G A A C C C C G G C T G G G T G A A G A T A G G C C T C G A C A T G A A C A A C G C G A A C G T G G A A A G T G C G G A G A T C A T C A C T T T C G G C G G A A A A G A G T A C A G A A G A T T C C A T G T A A G A A T T G A G T T C G A C A G A A C A G C G G G G G T G A A A G A A C T T C A C A T A G G A G T T G T C G G T G A T C A T C T G A G G T A C G A T GG A C C G A T T T T C A T C G A T A A T G T G A G A C T T T A T A A A A G A A C A G G A G G T A T G T A A SEQ ID NO: 22 (aminoácido) para CBM27.

M G H H H H H H G N E A R Y V L A E E V D F S SPEE V K N W W N S G T W Q A E F G SPDIE W N GE V G N G A L Q L N V K L P G K S D W E E V R V A R K F E R L S E C E IL E Y D IY IP N V E G L K G R L R P Y A V L N P G W V K IG L D M N N A N V E S A E IIT F G G K E Y R R F H V R IE F D R T A G V K E L H IG V V G D H L R Y D G P IF ID N V R L Y K R T G G M

SEQ ID NO: 23 (ácido nucleico) para eGFP.

AT GGGTC AT C ACC AT C ACC AT C ACGGT GT GAGC AAGGGCGAGG AGCT GTT C ACCGG GGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCG TGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATC TGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTAC GGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAG TCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGG CAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCA T CG AGCT GAAGGGC AT CGACTT C AAGGAGGACGGC AAC ATCCT GGGGC AC AAGCT G GAGT AC AACTAC AAC AGCC AC AACGT CT ATAT C AT GGCCG AC AAGC AGAAG AACGG C AT C AAGGT G AACTT C AAG ATCCGCC AC AAC ATCGAGG ACGGC AGCGT GC AGCT CG CCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGAC AACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGA TCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGA GCTGTACAAGTAA SEQ ID NO: 24 (aminoácido) para eGFP.

MGHHHHHHGVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICT TGKLPVPW PTLVTTLTYGVQCFSRYPDHM KQHDFFKSAM PEGYVQERTIFFKDDGNYK TRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIM ADKQKNGIKVNFK IRHNIEDGS V QLADH Y QQNTPIGDGP VLLPDNH YLSTQS ALSKDPNEKRDHM VLLEFVT AAGITLGM DELYK SEQ ID NO: 25 (ácido nucleico) para mCherry.

ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGC CATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCC ACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGAC CGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTC CCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGA CTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGA GGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCA TCT AC A AGGT G AAGCT GCGCGGC ACC AACTT CCC CT CCGACGGCCCCGTAAT GC AG AAGAAG ACC AT GGGCT GGGAGGCCT CCT CCGAGCGGAT GT ACCCCGAGG ACGGCGC CCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGAC GCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTA CAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGG AACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTAC AAGTAA SEQ ID NO: 26 (aminoácido) para mCherry.

MGHHHHHHGVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAK LKVTKGGPLPFAW DILSPQFM YGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKW ERVM NFEDGG VVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEI KQRLKLKDGGHYDAEYKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEG RHSTGGMDELYK SEQ ID NO: 27 (ácido nucleico) para mOrange2.

ATGGGTCATCACCATCACCATCACGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGAATAACATGGC CATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCC ACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCTTTCAGACC GCTAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCC CCTCATTTCACCTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGAC TACTTCAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTACGAG GACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCAT CTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTGATGCAGA AGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGTGCC CTGAAGGGCAAGATCAAGATGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACACCTC CGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACA TCGTCGACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAA CAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAA GTAA SEQ ID NO: 28 (aminoácido) para mOrange2.

M G H H H H H H G V SK G E E N N M A IIK E F M R F K V R M E G SV N G H E F E IE G E G E G R P Y E G FQ T A K L K V T K G G P L P F A W D IL S P H F T Y G S K A Y V K H P A D IP D Y F K L S F P E G F K W E R V M N Y E D G G V V T V T Q D S S L Q D G E F IY K V K L R G T N F P S D G P V M Q K K T M G W E A S S E R M Y P E D G A L K G K I K M R L K L K D G G H Y T S E V K T T Y K A K K P V Q L P G A Y IV D IK L D IT S H N E D Y T IV E Q Y E R A E G R H S T G G M D E L Y K SEQ ID NO: 29 (ácido nucleico) para eCFP.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la eficacia de un tratamiento industrial en pulpa o un producto de papel que comprende: poner en contacto una sonda de detección de polímero lignocelulósico que comprende a) un módulo de unión que se une específicamente al menos a un polímero lignocelulósico y b) un módulo indicador que es detectable espectroscópicamente, con pulpa o un producto de papel;

detectar la unión específica de la sonda a la pulpa o al producto de papel;

calcular la cantidad de al menos un polímero lignocelulósico sobre una superficie de la pulpa o el producto de papel; y determinar la eficacia de un tratamiento industrial sobre la pulpa o el producto de papel basándose en la cantidad del al menos un polímero lignocelulósico detectado.

2. El método de la reivindicación 1, donde el tratamiento industrial comprende un tratamiento enzimático, un tratamiento químico, o un tratamiento físico, o cualquier combinación de los mismos.

3. El método de la reivindicación 1, donde el método se realiza antes del tratamiento industrial, durante el tratamiento industrial, o después del tratamiento industrial, o cualquier combinación de los mismos.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la sonda de detección de polímero lignocelulósico es detectable a una longitud de onda distinta.

5. Un método para determinar una propiedad física de la pulpa o un producto de papel que comprende:

poner en contacto una sonda de detección de polímero lignocelulósico que comprende a) un módulo de unión que se une específicamente al menos a un polímero lignocelulósico y b) un módulo indicador que es detectable espectroscópicamente, con pulpa o un producto de papel;

detectar la unión específica de la sonda a la pulpa o al producto de papel;

calcular la cantidad de al menos un polímero lignocelulósico sobre una superficie de la pulpa o el producto de papel; y determinar al menos una propiedad física del producto de pulpa o papel basándose en la cantidad del al menos un polímero lignocelulósico detectado;

en donde la al menos una propiedad física comprende un índice de ráfagas, tasa de drenaje, índice de desgarro, índice de tracción o fuerza de unión interna, o cualquier combinación de los mismos.

6. Un método para detectar un polímero lignocelulósico, comprendiendo el método:

poner en contacto una sonda de detección de polímero lignocelulósico que comprende a) un módulo de unión que se une específicamente al menos a un polímero lignocelulósico y b) un módulo indicador que es detectable espectroscópicamente,

donde la sonda de detección de polímero lignocelulósico comprende un polipéptido sonda que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 6, 8, 10 y 12,

o en el que el módulo de unión es un polipéptido del módulo de unión y el módulo indicador es un polipéptido del módulo indicador, en el que el polipéptido del módulo de unión comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20 y 22, y el polipéptido del módulo indicador comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 24, 26, 28 y 30,

con un material de biomasa; y

medir una propiedad asociada con el módulo indicador para determinar la presencia o ausencia de al menos un polímero lignocelulósico en el material de biomasa basándose en la unión específica de la sonda al menos a un polímero lignocelulósico.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la propiedad medida es la fluorescencia.

8. El método de la reivindicación 6, que comprende además calcular la cantidad de al menos un polímero lignocelulósico, determinar el tipo de al menos un polímero lignocelulósico, o ambos.

9. El método de la reivindicación 6, en donde el material de biomasa comprende un material de biomasa de madera.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el material de biomasa de madera es pulpa, restos de madera, papel, o cualquier combinación de los mismos.

11. El método de la reivindicación 10, que comprende además formar al menos una hoja de prueba del producto de biomasa de madera, donde la medición se realiza en la hoja de prueba.

12. El método de la reivindicación 6, donde la medición se realiza antes del tratamiento, durante el tratamiento, o después del tratamiento, o cualquier combinación de los mismos.

13. El método de la reivindicación 12, donde el tratamiento comprende un tratamiento enzimático, blanqueamiento, amorfogénesis, molienda o refinado PFI, o cualquier combinación de los mismos.

14. El método de la reivindicación 12, donde el tratamiento comprende un tratamiento enzimático con al menos una enzima que comprende una celulasa, una xilanasa, una manasa, una lignasa o cualquier combinación de las mismas.

15. El método de la reivindicación 6, en donde la sonda comprende una pluralidad de sondas.