CN102899387B - 一种原位测定木质纤维生物质酶可及性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境生物能源领域，涉及一种原位测定木质纤维生物质的纤维素酶可及性的方法。包含以下步骤：（1）标记木质纤维生物质样品的总的酶结合位点；（2）原位观测总的酶结合位点分布及数量，计算得样品表面吸附的纤维小体荧光蛋白探针量；（3）释放总的酶结合位点；（4）将（3）的样品用木质素吸附蛋白封闭，标记样品中的纤维素酶结合位点，得到纤维素酶结合位点的分布、数量及样品表面吸附的纤维小体荧光蛋白探针量；（5）比较步骤（4）和（2）的结果评价木质纤维生物质的纤维素酶可及性。本发明提供的方法能够原位观测和计数酶结合位点并实现可视化，从而直观地评价木质纤维生物质的酶可及性。

Description

一种原位测定木质纤维生物质酶可及性的方法

技术领域

本发明属于环境生物能源领域，涉及一种原位测定木质纤维生物质的纤维素酶可及性的方法。

背景技术

随着能源短缺问题的加剧，寻找可替代的新能源十分必要。我国作为农业大国，木质纤维生物质每年固定的太阳能大约是人类能源消耗总量的10倍；因此，在未来的能源结构中木质纤维生物质将占据重要地位。但木质纤维生物质的木质素含量，纤维的聚合度、结晶度以及粒径、孔隙率等物理化学组成和结构很大程度上限制了木质纤维生物质的生物转化利用。木质纤维生物质基质的纤维素酶可及性是指单位量的基质中可以与纤维素酶结合，并且能够被微生物利用或酶解的纤维素酶结合位点的量；它是基于酶水解的生物处理中最根本的限制因素。只有当纤维素表面位点能与酶接触、与酶吸附结合，才有可能进一步被催化水解。因此，需寻找一种准确测定木质纤维生物质酶结合位点的方法，用于评价基质的纤维素酶可及性，为评价各种木质纤维生物质的酶催化水解特性提供方法依据，为不同木质纤维生物质预处理方法及工艺提供理论指导。

已有文献报道，基于比表面检测的氮吸附法（BET）、排阻色谱法（SEC）、小角X射线散射法（SAXS）等用于测定纤维素酶可及性都不能取得满意的结果。一些小分子吸附方法，如BET法、水蒸气吸附、碱溶胀法等测定结果往往高于基质实际的酶可及性；也有学者尝试在低温（4℃）环境下，采用吸附活性纤维素酶的方法定量测定纤维素酶可及性，然而在这样的低温环境下，虽然酶催化水解作用被抑制，但是过低的温度导致纤维素酶的吸附特性与水解温度下的吸附效果相差甚远。

也有采用荧光染料吸附染色法来评估酶可及性，这种方法主要是用各种荧光化学物质（如绿色荧光、黄色荧光、红色荧光等）吸附于纤维素表面，再采用荧光显微镜，如激光共聚焦扫描显微镜（LCSM），观察其染色情况。由于存在染色过度或染色不足的缺点，该方法无法准确测定酶结合位点，且采用荧光染料吸附染色的方法不能区分不能被酶水解的木质素及酶可催化水解的纤维素酶结合位点；而在木质纤维生物质的转化利用中，只有可以被酶催化水解的纤维素才能够被微生物转化成乙醇等生物燃料。

利用微生物细胞分泌的纤维素结合模块蛋白（CBM）并进行荧光标记，可以提高纤维素酶结合位点的特异性识别，但由于CBM不仅可以与纤维素结合且可与木质素结合，导致测定结果同时包含纤维素酶结合位点（及非纤维素酶结合位点。纤维素酶可及性可以用来表征酶可结合催化特性，即有效的酶结合位点。因此，所测的位点尽管可以被酶结合，但是却不能完全被水解酶催化，并不是有效的位点。

此外，目前测定纤维素酶可及性的方法都是基于粉碎的木质纤维生物质，而酶催化水解作用发生在基质表面，因而酶可及性的测定结果与物料的粉碎粒径有密切的关系，因此，上述这些方法不能客观表达基质实际的酶结合位点，所以无法真实地评价木质纤维生物质的酶可及性。

因此，需开发一种原位测定木质纤维生物质酶结合位点的方法，准确评价木质纤维生物质的酶可及性。

发明内容

本发明的目的为克服现有技术的缺陷而提供一种原位测定木质纤维生物质的纤维素酶可及性的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明利用纤维小体荧光蛋白探针及木质素吸附蛋白，分别与暴露在木质纤维生物质表面的纤维素酶结合位点和非纤维素酶结合位点结合，采用荧光显微镜，原位测定木质纤维生物质的有效酶结合位点的方法，该方法实现纤维素的酶可及性的可视化；同时用荧光光度计测定纤维小体荧光蛋白探针与表面纤维素的结合浓度，定量地评价木质纤维生物质的酶可及性。

可及性是指反应试剂抵达某种物质的难易程度；酶可及性是指以酶作为反应试剂，酶抵达反应底物（如：木质纤维生物质）的难易程度；纤维素酶可及性是指纤维素酶抵达纤维素羟基的难易程度。酶可及性可通过酶结合位点的多少来反映。酶结合位点是指木质纤维生物质上能够与酶结合的位点，包括纤维素酶结合位点（可被生物降解的酶结合位点）和非纤维素酶结合位点（不可被生物降解的酶结合位点）。封闭是指通过木质素吸附蛋白与非纤维素酶结合位点结合，将除纤维素酶结合位点之外的酶结合位点与纤维小体荧光蛋白探针隔绝。

一种原位测定木质纤维生物质的纤维素酶可及性的方法，包含以下步骤：

（1）向木质纤维生物质样品中加入初始探针浓度为E_t的纤维小体荧光蛋白探针溶液，标记样品的总的酶结合位点；

（2）用荧光显微镜原位观测和计数木质纤维生物样品上荧光标记的总的酶结合位点的分布及数量，用荧光光度计测定标记溶液的上清液中游离纤维小体荧光蛋白探针浓度E_fa，与初始探针浓度E_t相比较，采用差量法计算得样品表面吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度E_a，并计算单位面积吸附的纤维小体荧光蛋白探针量E_ua；

（3）用洗脱液脱附样品上吸附的纤维小体荧光蛋白探针，释放总的酶结合位点（即，将第一步中与酶结合的所有的位点释放）；

（4）将步骤（3）处理获得的样品用木质素吸附蛋白封闭后，用初始浓度为E_t的纤维小体荧光蛋白探针溶液标记样品中的纤维素酶结合位点，再按照步骤（2）中的操作过程，得到样品的纤维素酶结合位点的分布及数量，游离的纤维小体荧光蛋白探针浓度E_fd，样品表面吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度E_d，以及单位面积吸附的纤维小体荧光蛋白探针量E_ud；

（5）比较步骤（4）和（2）的结果，以二者的结果之差得到不可降解的酶结合位点的数量及单位面积吸附的纤维小体荧光蛋白探针量E_n，结合上述的酶结合位点及可降解的酶结合位点的分布、数量及吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度，评价木质纤维生物质的纤维素酶可及性。

所述的步骤（1）中的总的酶结合位点包括非纤维素酶结合位点（不可降解的酶结合位点）和纤维素酶结合位点（可降解的酶结合位点）。

其中，步骤（1）是为标记木质纤维生物质总的酶结合位点（包括不可降解酶结合位点及可降解的酶结合位点）。步骤（2）是为了获得总的酶结合位点的信息。步骤（3）是为了释放被纤维小体荧光蛋白探针标记的总的酶结合位点。步骤（4）是为了标记并获得可降解的酶结合位点信息。步骤（5）是为了获得不可降解的酶结合位点信息，并综合评价木质纤维生物质的纤维素酶可及性。

所述的纤维小体荧光蛋白探针是一种采用荧光蛋白标记的纤维小体片段，其蛋白序列包括两部分：一端是来自于微生物纤维小体的纤维素结合模块蛋白（CBM），另一端是荧光蛋白（FP），其中CBM可与木质纤维生物质的酶结合位点结合，但不产生荧光信号；与CBM相连的荧光蛋白能够产生荧光信号，而不与位点结合；荧光蛋白可以是：绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、蓝色荧光蛋白（BFP）、蓝绿色荧光蛋白（CFP）中的一种。

所述的步骤（1）中标记是在含有2.0~8.0μM纤维小体荧光蛋白探针/L缓冲液体系中进行，缓冲液体系的pH值为5.0~7.0，体积为200μL~1mL，缓冲液的浓度为50~200mM，标记温度为15~60℃，避光标记0.5~2h；其中所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液中的一种或一种以上。

所述的步骤（2）荧光显微镜原位观测是指测定同一视野范围不同焦面的酶结合位点分布及数量的总和。

荧光显微镜的参数包括：激发波长（400~650nm），最大发射波长（420~700nm）；放大倍数（100~1000）及焦面深度（0~100μm）；其中，激发波长及最大发射波长的具体数值依据用于荧光标记的纤维小体荧光蛋白探针类型确定；优选地：

GFP（激发波长：480~490nm，最大发射波长：505~515nm）；

RFP（激发波长：553~558nm，最大发射波长：570~585nm）；

YFP（激发波长：508~525nm，最大发射波长：524~538nm）；

BFP（激发波长：400~420nm，最大发射波长：450~465nm）；

CFP（激发波长：455~465，最大发射波长：478~488nm）。

所述的步骤（3）的洗脱液是指浓度为0.5~5.0%的十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液，

所述的步骤（3）中脱附的温度为75~95℃，脱附时间为10~60min；用洗脱液脱附后的木质纤维生物质样品，需依次用75%乙醇及蒸馏水各清洗3遍。

所述的步骤（4）木质素吸附蛋白是一类可以与样品中的不可降解的纤维素酶结合位点结合，但不能与纤维素酶结合位点结合的蛋白，从而可排除不可降解的酶结合位点的干扰；木质素吸附蛋白可以采用牛血清蛋白（BSA）；

所述的步骤（4）的封闭是在pH值为4.0~5.5，体积为200μL~1mL，温度为15~60℃的50~200mM缓冲液体系中封闭0.5~2.0h，其中所含木质素吸附蛋白的浓度大于3.0g/L。

所述的步骤（5）评价木质纤维生物质的纤维素酶可及性的依据是：木质纤维生物质吸附的纤维小体荧光蛋白探针量E_d越大，E_n越小，E_u越大，经纤维小体荧光蛋白探针标记后，样品的纤维素酶结合位点的平均荧光值占总的酶结合位点平均荧光值的百分比越大，则木质纤维生物质的纤维素酶可及性越强。

所述的荧光光度计可以采用荧光酶标仪，通过测定系列浓度梯度的标准样品及未知样品（上清液）的荧光强度值，得到未知样品的荧光蛋白探针浓度。样品表面吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度可采用差量法计算：

E_i＝E_t-E_fi,i＝a，d

其中，E_i为已吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度，单位是μM/L或mg/L；

E_t为初始的纤维小体荧光蛋白探针浓度，单位是μM/L或mg/L；

E_fi为游离的纤维小体荧光探针浓度，单位是μM/L或mg/L；

所述的样品表面单位面积吸附的荧光蛋白探针量计算方法如下：

$E_{\mathrm{ui}}=\frac{E_{i}V}{A},$ i＝a，d

其中，E_ui为单位面积吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度，单位是μM/m²或mg/m²；

E_i为已吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度，单位是μM/L或mg/L；

V为缓冲液体系的体积，单位是L；

A为样品的表面积，单位是m²。

所述的木质纤维生物质样品包括原始的（没有用化学药剂处理过的，但是需要用蒸馏水清晰表面的灰尘）、脱蜡后的、预处理的（包括化学预处理、生物预处理、物理预处理、生物化学预处理等）或经生物降解后的木质纤维生物质的小切片，木质纤维生物质包括但不限于：稻草秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣等；切片大小为（5~10）mm×（3~5）mm，厚度为100μm~1mm。

本发明有以下有益效果：

（1）原位观测酶结合位点，能够直观且客观地表达酶可及性；

（2）采用纤维小体荧光蛋白探针与纤维素酶结合位点结合，避免了大分子标记物（如荧光化学物质）无法靠近纤维素酶结合位点而使得结果失真，或是由于标记物对木质素或不可降解酶结合位点的非特异性吸附而使得结果失真；

（3）原位观测与定量测定木质纤维生物质吸附的纤维小体荧光蛋白探针量结合，能够客观真实地评价木质纤维生物质的酶可及性。

附图说明

图1（a）-（f）为本发明实施例中激光共聚焦显微镜原位观测所得脱蜡稻草样品表面的酶结合位点分布：

其中（a）为用BSA封闭后再经GFP-CBM3标记的脱蜡稻草样品；

（b）为经GFP-CBM3标记的脱蜡稻草样品；

（c）为用BSA封闭后再经GFP-CBM3标记的预处理稻草样品；

（d）为经GFP-CBM3标记的预处理稻草样品；

（e）为用BSA封闭后再经YFP-CBM标记的与处理稻草样品；

（f）为经YFP-CBM标记的预处理稻草样品。

图2为本发明实施例中脱蜡稻草表面不同荧光强度的酶结合位点数量分布曲线。

图3为本发明实施例中GFP-CBM3标记的预处理稻草表面不同荧光强度的酶结合位点数量分布曲线。

图4为本分明实施例中YFP-CBM3标记的预处理稻草表面不同荧光强度的酶结合位点数量分布曲线。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合具体实施实例对本发明作进一步阐述。

实施例1

（1）取一个6mm×4mm×1mm的脱蜡稻草小片段于低蛋白吸附管中（脱蜡稻草组分：纤维素38.44，半纤维素33.60，木质素5.73，灰分及其它22.23），加入pH值为6.0，浓度为100mM的磷酸盐缓冲液500μL，其中纤维小体荧光蛋白探针GFP-CBM3的初始浓度Et为4.0μM/L，于55℃的恒温条件下，避光标记1.5h。

（2）利用激光共聚焦显微镜（LCSM，Leica TCS SP5）及荧光酶标仪原位观测和分析脱蜡稻草样品，得到样品的总的酶结合位点分布及纤维小体荧光蛋白探针吸附量；总的酶结合位点分布如图1（b）所示，平均荧光值为34.6；标记溶液的上清液中游离纤维小体荧光蛋白探针浓度E_fa为2.76μM/L，E_a为1.24μM/L（采用差量法计算），单位面积样品的纤维小体荧光蛋白探针吸附量E_ua为2.58×10⁴μM/m²。LCSM参数设置为：激发波长为488nm，发射光波长范围为500~550nm，放大倍数为100倍，焦面深度为30μm。

（3）向上述样品中加入1.0%的十二烷基硫酸钠（SDS）洗脱液，在80℃的条件下，脱附20min。待样品表面被吸附的纤维小体荧光蛋白探针完全脱附后，依次用75%乙醇及蒸馏水各清洗3遍。

（4）向上述酶结合位点被释放的样品中，加入pH值为4.8，体积为1mL，浓度为100mM的磷酸盐缓冲液，其中含木质素吸附蛋白——牛血清蛋白（BSA）的浓度为3.0g/L，于55℃的条件下，封闭1.5h；取出样品，按步骤（1）中所述操作，进行荧光标记；再按照步骤（2）中的操作过程，得到样品的纤维素酶结合位点分布如图1（a）所示，平均荧光值为24.1；标记溶液的上清液中游离纤维小体荧光蛋白探针浓度E_fd为3.15μM/L，E_d为0.85μM/L（采用Langmuir方程计算所得），单位面积样品的纤维小体荧光蛋白探针吸附量E_ud为1.77×10⁴μM/m²；

（5）比较步骤（2）的酶结合位点及步骤（4）的纤维素酶结合位点分布及纤维小体荧光蛋白探针的吸附量，得到脱蜡稻草样品的非纤维素酶结合位点吸附的纤维小体荧光探针浓度E_n为0.81×10⁴μM/m²。不可降解的非纤维素酶结合位点占总的酶结合位点的31.5%，纤维素酶结合位点占68.5%；纤维小体荧光蛋白探针标记的纤维素酶结合位点的平均荧光值占总的酶结合位点平均荧光值的69.6%，不同荧光强度的酶结合位点数量分布曲线如图2所示，BSA封闭后再进行荧光标记所得的纤维素酶结合位点数量较荧光标记所得的总的酶可结合位点数量明显减少。

实施例2

（1）取一个3mm×8mm×200μm的预处理稻草小片段于低蛋白吸附管中（预处理稻草组分：纤维素50.04，半纤维素5.74，木质素14.45，灰分及其它24.77），加入pH值为5.0，浓度为50mM的柠檬酸钠缓冲液1mL，其中纤维小体荧光蛋白探针GFP-CBM3初始浓度为2.0μM/L，于15℃的恒温条件下，避光标记2.0h。

（2）测定方式如同实例1中步骤（2）所述。总的酶结合位点分布如图1（d）所示，平均荧光值为31.8；标记溶液的上清液中游离纤维小体荧光蛋白探针浓度E_fa为0.90μM/L，E^a为1.10μM/L（采用Langmuir方程计算所得），单位面积样品的纤维小体荧光蛋白探针吸附量E_ua为4.58×10⁴μM/m²；

（3）向上述样品中加入0.5%的十二烷基硫酸钠（SDS）洗脱液，在90℃的条件下，脱附10min。待样品表面被吸附的纤维小体荧光蛋白探针完全脱附后，依次用75%乙醇及蒸馏水各清洗3遍。

（4）向上述酶结合位点被释放的样品中，加入pH值为4.0，体积为200μL，浓度为50mM的柠檬酸钠缓冲液，其中含木质素吸附蛋白——牛血清蛋白（BSA）的浓度为5.0g/L，于15℃的条件下，封闭2.0h；取出样品，按步骤（1）中所述操作，进行荧光标记；再按照步骤（2）中的操作过程，得到样品的纤维素酶结合位点分布如图1（c）所示，平均荧光值为25.9；标记溶液的上清液中游离纤维小体荧光蛋白探针浓度E_fd为1.12μM/L，E_d为0.88μM/L（采用Langmuir方程计算所得），单位面积样品的纤维小体荧光蛋白探针吸附量E_ud为3.67×10⁴μM/m²。

（5）比较步骤（2）的酶结合位点及步骤（4）的纤维素酶结合位点分布及纤维小体荧光蛋白探针的吸附量，得到脱蜡稻草样品的非纤维素酶结合位点吸附的纤维小体荧光探针浓度E_n为0.91×10⁴μM/m²。不可降解的非纤维素酶结合位点占总的酶结合位点的19.9%，纤维素酶结合位点占80.1%；纤维小体荧光蛋白探针标记的纤维素酶结合位点的平均荧光值占总的酶结合位点平均荧光值的81.4%。不同荧光强度的酶结合位点数量分布曲线如图3所示，纤维素酶结合位点数量较总的酶结合位点数量略有减小。

实施例3

（1）取一个5mm×5mm×100μm的预处理稻草小片段于低蛋白吸附管中（预处理稻草组分：纤维素69.30，半纤维素21.24，木质素1.52，灰分及其它7.80），加入pH值为7.0，浓度为200mM的磷酸盐缓冲液200μL，其中纤维小体荧光蛋白探针YFP-CBM的初始浓度Et为8.0μM/L，于60℃的恒温条件下，避光标记0.5h。

（2）利用激光共聚焦显微镜（LCSM，Leica TCS SP5）及荧光酶标仪原位观测和分析脱蜡稻草样品，得到样品的总的酶结合位点分布及纤维小体荧光蛋白探针吸附量；总的酶结合位点分布如图1（f）所示，平均荧光值为142.4；标记溶液的上清液中游离纤维小体荧光蛋白探针浓度E_fa为4.85μM/L，E_a为3.15μM/L（采用Langmuir方程计算所得），单位面积样品的纤维小体荧光蛋白探针吸附量E_ua为2.52×10⁴μM/m²。LCSM参数设置为：激发波长为514nm，发射光波长范围为530~600nm，放大倍数为630倍，焦面深度为100μm。

（3）向上述样品中加入5.0%的十二烷基硫酸钠（SDS）洗脱液，在75℃的条件下，脱附60min。待样品表面被吸附的纤维小体荧光蛋白探针完全脱附后，依次用75%乙醇及蒸馏水各清洗3遍。

（4）向上述酶结合位点被释放的样品中，加入pH值为5.5，体积为500μL，浓度为200mM的磷酸盐缓冲液，其中含木质素吸附蛋白——牛血清蛋白（BSA）的浓度为4.0g/L，于60℃的条件下，封闭0.5h；取出样品，按步骤（1）中所述操作，进行荧光标记；再按照步骤（2）中的操作过程，得到样品的纤维素酶结合位点分布如图1（e）所示，平均荧光值为130.6；标记溶液的上清液中游离纤维小体荧光蛋白探针浓度E_f为5.16μM/L，E_d为2.84μM/L（采用Langmuir方程计算所得），单位面积样品的纤维小体荧光蛋白探针吸附量E_ud为2.27×10⁴μM/m²。

（5）比较步骤（2）的酶结合位点及步骤（4）的纤维素酶结合位点分布及纤维小体荧光蛋白探针的吸附量，得到预处理稻草样品的非纤维素酶结合位点吸附的纤维小体荧光探针浓度E_n为0.25×10⁴μM/m²。不可降解的非纤维素酶结合位点占总的酶结合位点的9.9%，纤维素酶结合位点占90.1%；纤维小体荧光蛋白探针标记的纤维素酶结合位点的平均荧光值占总的酶结合位点平均荧光值的91.7%，不同荧光强度的酶结合位点数量分布曲线如图4所示，BSA封闭后再进行荧光标记所得的纤维素酶结合位点数量较荧光标记所得的总的酶可结合位点数量略有减少。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种原位测定木质纤维生物质的纤维素酶可及性的方法，其特征在于：包含以下步骤：

（1）向木质纤维生物质样品中加入初始探针浓度为E_t的纤维小体荧光蛋白探针溶液，标记样品的总的酶结合位点；

（2）用荧光显微镜原位观测和计数木质纤维生物样品上荧光标记的总的酶结合位点的分布及数量，用荧光光度计测定标记溶液的上清液中游离纤维小体荧光蛋白探针浓度E_fa，与初始探针浓度E_t相比较，采用差量法计算得样品表面吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度E_a，并计算单位面积吸附的纤维小体荧光蛋白探针量E_ua；

（3）用洗脱液脱附样品上吸附的纤维小体荧光蛋白探针，释放总的酶结合位点；

（4）将步骤（3）处理获得的样品用木质素吸附蛋白封闭后，用初始浓度为E_t的纤维小体荧光蛋白探针溶液标记样品中的纤维素酶结合位点，再按照步骤（2）的操作过程，得到样品的纤维素酶结合位点的分布及数量，游离的纤维小体荧光蛋白探针浓度E_fd，样品表面吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度E_d，以及单位面积吸附的纤维小体荧光蛋白探针量E_ud；

（5）比较步骤（4）和（2）的结果，以二者的结果之差得到不可降解的酶结合位点的数量及单位面积吸附的纤维小体荧光蛋白探针量E_n，结合上述的酶结合位点及可降解的酶结合位点的分布、数量及吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度，评价木质纤维生物质的纤维素酶可及性；

所述的纤维小体荧光蛋白探针是一种采用荧光蛋白标记的纤维小体片段，其蛋白序列包括两部分：一端是来自于微生物纤维小体的纤维素结合模块蛋白CBM，另一端是荧光蛋白FP，其中CBM可与木质纤维生物质的酶结合位点结合，但不产生荧光信号；与CBM相连的荧光蛋白能够产生荧光信号，而不与位点结合，

其中荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或蓝绿色荧光蛋白；

所述的步骤（4）木质素吸附蛋白是一类可以与样品中的不可降解的纤维素酶结合位点结合，但不能与纤维素酶结合位点结合的蛋白，从而可排除不可降解的酶结合位点的干扰；木质素吸附蛋白可以采用牛血清蛋白；所述的封闭是在pH值为4.0～5.5，体积为200μL～1mL，温度为15～60℃的50～200mM缓冲液体系中封闭0.5～2.0h，其中所含木质素吸附蛋白的浓度大于3.0g/L；

所述的荧光光度计为荧光酶标仪，通过测定系列浓度梯度的标准样品及未知样品的荧光强度值，得到未知样品的荧光蛋白探针浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（1）中的总的酶结合位点包括非纤维素酶结合位点和纤维素酶结合位点。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（1）中标记是在含有2.0～8.0μM纤维小体荧光蛋白探针/L缓冲液体系中进行，缓冲液体系的pH值为5.0～7.0，体积为200μL～1mL，缓冲液的浓度为50～200mM，标记温度为15～60℃，避光标记0.5～2h；其中所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液中的一种或一种以上。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（2）荧光显微镜原位观测是指测定同一视野范围不同焦面的酶结合位点分布及数量的总和，荧光显微镜的参数包括：激发波长400～650nm，最大发射波长420～700nm；放大倍数为100～1000倍及焦面深度0～100μm；

其中，激发波长及最大发射波长的具体数值依据用于荧光标记的纤维小体荧光蛋白探针类型确定。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：GFP的激发波长：480～490nm，最大发射波长：505～515nm；

RFP的激发波长：553～558nm，最大发射波长：570～585nm；

YFP的激发波长：508～525nm，最大发射波长：524～538nm；

BFP的激发波长：400～420nm，最大发射波长：450～465nm；

CFP的激发波长：455～465nm，最大发射波长：478～488nm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（3）的洗脱液是指浓度为0.5～5.0%的十二烷基硫酸钠的水溶液；

或所述的步骤（3）中脱附的温度为75～95℃，脱附时间为10～60min；用洗脱液脱附后的木质纤维生物质样品，需依次用75%乙醇及蒸馏水各清洗3遍。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：样品表面吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度采用差量法：

E_i=E_t-E_fi,i=a,d

其中，E_i为已吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度；

E_t为初始的纤维小体荧光蛋白探针浓度；E_fi为游离的纤维小体荧光探针浓度；

所述的样品表面单位面积吸附的荧光蛋白探针量计算方法如下：

$E_{\mathrm{ui}}=\frac{E_{i}V}{A},i=a,d$

其中，E_ui为单位面积吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度；E_i为已吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度；

V为缓冲液体系的体积；

A为样品的表面积。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的木质纤维生物质样品包括原始的和处理后的木质纤维生物质的小切片，其中所述处理包括脱蜡、化学预处理、生物预处理、物理预处理或生物降解；

或所述的木质纤维生物质选自稻草秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆、玉米芯或甘蔗渣；切片大小为（5～10）mm×（3～5）mm，厚度为100μm～1mm。

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