CN111505343A - 一种基于afm探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法 - Google Patents

一种基于afm探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111505343A
CN111505343A CN202010341903.1A CN202010341903A CN111505343A CN 111505343 A CN111505343 A CN 111505343A CN 202010341903 A CN202010341903 A CN 202010341903A CN 111505343 A CN111505343 A CN 111505343A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
lignin
cleaning
concentration
cellulase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010341903.1A
Other languages
English (en)
Inventor
闵斗勇
李明富
张清桐
罗斌
迟明超
王双飞
覃程荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi University
Original Assignee
Guangxi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi University filed Critical Guangxi University
Priority to CN202010341903.1A priority Critical patent/CN111505343A/zh
Publication of CN111505343A publication Critical patent/CN111505343A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof
    • G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof
    • G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
    • G01Q60/38—Probes, their manufacture, or their related instrumentation, e.g. holders

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于AFM探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法。本发明首先将一端为巯基另一端为羧基的PEG高分子偶联到表面镀金的AFM硅探针上，其次将纤维素酶蛋白本身含有的氨基利用NHS/EDS交联剂与AFM探针表面修饰羧基反应，从而将纤维素酶蛋白修饰到AFM探针上，并将其用于检测纤维素酶蛋白与木质素相互作用的力‑距曲线。本发明方法工艺简单，操作简便，可以实现在单分子水平研究酶蛋白分子与木素之间相互作用力的目标。

Description

一种基于AFM探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法
技术领域
本发明属于微观科学领域，特别是纳米测量。具体是一种基于AFM探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法。特别是涉及一种单分子力谱分析用原子力显微镜探针功能化修饰方法。
背景技术
生物质作为可再生生物资源，使用生物质能源替代化石燃料已经成为必要的发展趋势。生物质具有来源广泛、价格低廉、污染少、可再生等优点，将其制备为乙醇、氢气和生物柴油等燃料及其他化学品，有利于减少化石能源的消耗。我国具有丰富的生物质资源，每年农林废弃物可达7亿多吨，其中甘蔗渣是一种重要的可再生生物质资源，来源集中、量大面广且半纤维素和纤维素含量较高，因此，采用蔗渣生物质资源制备生物乙醇能有效提高蔗渣的附加值。将蔗渣制备成生物乙醇，需要经过预处理、酶解糖化和发酵，在酶解糖化过程中，纤维素原本的结晶度和聚合度以及半纤维素和木素形成的空间障碍效应，导致酶和纤维素分子间的亲和性降低，阻碍酶解的进行。木素与纤维素酶分子之间的相互作用是抑制酶解糖化效率的主要因素，因此阐述木素与纤维素酶之间的相互作用，能为提高酶解糖化效率和生物乙醇产率提供理论研究基础。但目前，缺少采用原子力显微镜研究木素与纤维素酶之间相互作用力的研究，因此采用简单功能化方法将纤维素酶蛋白修饰在AFM探针上，研究木素与酶蛋白之间的相互作用力-距曲线是非常有必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于AFM探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法，该方法步骤简单，操作简便，可以实现酶蛋白与木素之间力-距曲线测定。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：
一种基于AFM探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法包括如下步骤：
1.在二甲基亚砜中清洗镀金的原子力显微镜探针，探针在氮气下干燥，紫外臭氧清洗20分钟，随后用超纯水清洗，二甲基亚砜清洗，氮气干燥，得到清洗干净的探针。
2.将清洗干净的探针浸入到浓度为0.2～0.5mg/mL的二甲基亚砜为溶剂的巯基-聚乙二醇-羧基(HS-PEG-COOH)溶液中，在室温避光条件下反应3～6h，得到表面修饰后的探针。
3.将表面修饰后的探针用二甲基亚砜洗净后，放入45～60℃的热水中0.5～2h，去除探针表面物理吸附的HS-PEG-COOH分子，得到洗净后的探针。
4.将洗净后的探针浸入含有浓度为5～12mg/mL活化剂浓度为5～12mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和浓度为10～20mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDS)pH为7.1～7.5的磷酸盐(PBS)缓冲液中，反应0.5～2h，采用超纯水清洗探针，得到活化后的金探针。
5.将活化后的金探针浸入含有浓度为0.5～1mg/mL纤维素酶的PBS溶液中，在4℃避光条件下反应12～24h，反应后采用缓冲液清洗探针，再用超纯水清洗，最后将探针放入PBS溶液中4℃避光条件下保存备用，得到纤维素酶探针。
6.木素样品的制备：采用贝克曼法从蔗渣中分离得到磨木木素，采用红外压片机将100～300mg木素压成圆形片，压片时间为10～30分钟，然后将木素圆片固定在原子显微镜的圆形样品台上，得到含有木素样品台。
7.纤维素酶探针与木素力曲线的测定：将步骤5得到的纤维素酶探针安装到原子力显微镜装置上，将含有木素样品台安装在原子力显微镜样品台固定装置上，利用原子力显微镜接触模式对木素样品进行检测，获取设定数量的力曲线；在测定力曲线时，选取的点均匀分布在木素样品表面。
与现有技术相比本发明的有益结果：
本发明方法工艺简单，操作简便，可以实现在单分子水平测定纤维素酶与木质纤维组分之间相互作用力的目标。
附图说明
图1为本发明中原子力显微镜探针功能化修饰示意图
图2为本发明功能化修饰原子力显微镜探针的扫描电镜图
图3为本发明实施例1中测试得到的单分子力-距曲线图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施对本发明作进一步描述。
实施例1
一种基于AFM探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法包括如下步骤：
1.在二甲基亚砜中清洗镀金的原子力显微镜探针，探针在氮气下干燥，紫外臭氧清洗20分钟，随后用超纯水清洗，二甲基亚砜清洗，氮气干燥，得到清洗干净的探针。
2.将清洗干净的探针浸入到浓度为0.2mg/mL的二甲基亚砜为溶剂的巯基-聚乙二醇-羧基(HS-PEG-COOH)溶液中，在室温避光条件下反应3h，得到表面修饰后的探针。
3.将表面修饰后的探针用二甲基亚砜洗净后，放入45℃的热水中0.5h，去除探针表面物理吸附的HS-PEG-COOH分子，得到洗净后的探针。
4.将洗净后的探针浸入含有浓度为5mg/mL活化剂浓度为5mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和浓度为10mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDS)pH为7.1的磷酸盐(PBS)缓冲液中，反应30分钟后，采用超纯水清洗探针，得到活化后的金探针。
5.将活化后的金探针浸入含有浓度为0.5mg/mL纤维素酶的PBS溶液中，在4℃避光条件下反应12h，反应后采用缓冲液清洗探针，再用超纯水清洗，最后将探针放入PBS溶液中4℃避光条件下保存备用，得到纤维素酶探针。纤维素酶修饰AFM探针的示意图如附图1所示。纤维素酶修饰AFM探针的表面电镜图如附图2所示。
6.木素样品的制备：采用贝克曼法从蔗渣中分离得到磨木木素，采用红外压片机将100mg木素压成圆形片，压片时间为10分钟，然后将木素圆片固定在原子显微镜的圆形样品台上，得到含有木素样品台。
7.纤维素酶探针与木素力曲线的测定：将步骤5得到的纤维素酶探针安装到原子力显微镜装置上，将含有木素样品台安装在原子力显微镜装置上，利用日立5100N原子力显微镜接触模式对木素样品进行检测，获取设定数量的力曲线；在测定力曲线时，选取的点均匀分布在木素样品表面。纤维素酶探针与木素之间的力-距曲线示意图如附图3所示。
实施例2
一种基于AFM探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法包括如下步骤：
1.在二甲基亚砜中清洗镀金的原子力显微镜探针，探针在氮气下干燥，紫外臭氧清洗20分钟，随后用超纯水清洗，二甲基亚砜清洗，氮气干燥，得到清洗干净的探针。
2.将清洗干净的探针浸入到浓度为0.4mg/mL的二甲基亚砜为溶剂的巯基-聚乙二醇-羧基(HS-PEG-COOH)溶液中，在室温避光条件下反应5h，得到表面修饰后的探针。
3.将表面修饰后的探针用二甲基亚砜洗净后，放入45℃的热水中1h，去除探针表面物理吸附的HS-PEG-COOH分子，得到洗净后的探针。
4.将洗净后的探针浸入含有活化剂浓度为8mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和浓度为15mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDS)pH为7.2的磷酸盐(PBS)缓冲液中，反应1h，采用超纯水清洗探针，得到活化后的金探针。
5.将活化后的金探针浸入含有浓度为0.8mg/mL纤维素酶的PBS溶液中，在4℃避光条件下反应18h，反应后采用缓冲液清洗探针，再用超纯水清洗，最后将探针放入PBS溶液中4℃避光条件下保存备用，得到纤维素酶探针。
6.木素样品的制备：采用贝克曼法从蔗渣中分离得到磨木木素，采用红外压片机将200mg木素压成圆形片，压片时间为20分钟，然后将木素圆片固定在原子显微镜的圆形样品台上，得到含有木素样品台。
7.纤维素酶探针与木素力曲线的测定：将步骤5得到的纤维素酶探针安装到原子力显微镜装置上，将含有木素样品台安装在原子力显微镜装置上，利用原子力显微镜接触模式对木素样品进行检测，获取设定数量的力曲线；在测定力曲线时，选取的点均匀分布在木素样品表面。
实施例3
一种基于AFM探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法包括如下步骤：
1.在二甲基亚砜中清洗镀金的原子力显微镜探针，探针在氮气下干燥，紫外臭氧清洗20分钟，随后用超纯水清洗，二甲基亚砜清洗，氮气干燥，得到清洗干净的探针。
2.将清洗干净的探针浸入到浓度为0.5mg/mL的二甲基亚砜为溶剂的巯基-聚乙二醇-羧基(HS-PEG-COOH)溶液中，在室温避光条件下反应6h，得到表面修饰后的探针。
3.将表面修饰后的探针用二甲基亚砜洗净后，放入60℃的热水中0.5～2h2h，去除探针表面物理吸附的HS-PEG-COOH分子，得到洗净后的探针。
4.将洗净后的探针浸入含有活化剂浓度为12mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和浓度为20mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDS)pH为7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液中，反应2h，采用超纯水清洗探针，得到活化后的金探针。
5.将活化后的金探针浸入含有浓度为1.0mg/mL的纤维素酶的PBS溶液中，在4℃避光条件下反应24h，反应后采用缓冲液清洗探针，再用超纯水清洗，最后将探针放入PBS溶液中4℃避光条件下保存备用，得到纤维素酶探针。
6.木素样品的制备：采用贝克曼法从蔗渣中分离得到磨木木素，采用红外压片机将300mg木素压成圆形片，压片时间为30分钟，然后将木素圆片固定在原子显微镜的圆形样品台上，得到含有木素样品台。
7.纤维素酶探针与木素力曲线的测定：将步骤5得到的纤维素酶的AFM探针安装到原子力显微镜装置上，将含有木素样品台安装在原子力显微镜装置上，利用原子力显微镜接触模式对木素样品进行检测，获取设定数量的力曲线；在测定力曲线时，选取的点均匀分布在木素样品表面。

Claims (1)

1.一种基于AFM探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在二甲基亚砜中清洗镀金的原子力显微镜探针，探针在氮气下干燥，紫外臭氧清洗，随后用超纯水清洗，二甲基亚砜清洗，氮气干燥，得到清洗干净的探针；
(2)将清洗干净的探针浸入到浓度为0.2～0.5mg/mL的二甲基亚砜为溶剂的巯基-聚乙二醇-羧基(HS-PEG-COOH)溶液中，在室温避光条件下反应3～6h，得到表面修饰后的探针；
(3)将表面修饰后的探针用二甲基亚砜洗净后，放入45～60℃的热水中0.5～2h，去除探针表面物理吸附的HS-PEG-COOH分子，得到洗净后的探针；
(4)将洗净后的探针浸入含有浓度为5～12mg/mL活化剂浓度为5～12mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和浓度为10～20mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDS)pH为7.1～7.5的磷酸盐(PBS)缓冲液中，反应0.5～2h，采用超纯水清洗探针，得到活化后的金探针；
(5)将活化后的金探针浸入含有浓度为0.5～1mg/mL纤维素酶的PBS溶液中，在4℃避光条件下反应12～24h，用缓冲液清洗探针，再用超纯水清洗，最后将探针放入PBS溶液中4℃避光条件下保存备用，得到纤维素酶探针；
(6)从蔗渣中采用贝克曼法分离得到磨木木素，采用红外压片机将含量为100～300mg木素压成圆形片，压片时间为10～30分钟，然后用双面胶将木素圆片固定在原子显微镜的圆形样品台上，得到含有木素样品台；
(7)纤维素酶探针与木素力曲线的测定：将步骤(5)得到的纤维素酶探针安装到原子力显微镜装置上，将含有木素样品台安装在原子力显微镜样品台装置上，利用原子力显微镜接触模式测试酶与木素样品的相互作用力曲线；在测定力曲线时，选取的点均匀分布在木素样品表面。
CN202010341903.1A 2020-04-27 2020-04-27 一种基于afm探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法 Pending CN111505343A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010341903.1A CN111505343A (zh) 2020-04-27 2020-04-27 一种基于afm探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010341903.1A CN111505343A (zh) 2020-04-27 2020-04-27 一种基于afm探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111505343A true CN111505343A (zh) 2020-08-07

Family

ID=71878060

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010341903.1A Pending CN111505343A (zh) 2020-04-27 2020-04-27 一种基于afm探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111505343A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114594285A (zh) * 2020-12-07 2022-06-07 赣南医学院 一种原子力显微镜探针及其制备方法和应用
CN115541934A (zh) * 2022-09-20 2022-12-30 南京林业大学 一种表征木质素与纤维素酶相互作用力的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102539733A (zh) * 2011-03-16 2012-07-04 北京师范大学 一种可视化塑料基生物芯片及其制备方法和检测方法
CN103575934A (zh) * 2012-07-24 2014-02-12 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 单分子力谱分析用afm探针和基底功能化修饰方法
CN108398579A (zh) * 2018-04-08 2018-08-14 中国科学院化学研究所 一种化学力显微镜技术探针及其制备方法
CN108474789A (zh) * 2015-10-26 2018-08-31 巴克曼实验室国际公司 聚合物探针和方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102539733A (zh) * 2011-03-16 2012-07-04 北京师范大学 一种可视化塑料基生物芯片及其制备方法和检测方法
CN103575934A (zh) * 2012-07-24 2014-02-12 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 单分子力谱分析用afm探针和基底功能化修饰方法
CN108474789A (zh) * 2015-10-26 2018-08-31 巴克曼实验室国际公司 聚合物探针和方法
CN108398579A (zh) * 2018-04-08 2018-08-14 中国科学院化学研究所 一种化学力显微镜技术探针及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
万广聪等: "木质纤维原料与纤维素酶相互作用的研究进展", 《中国造纸学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114594285A (zh) * 2020-12-07 2022-06-07 赣南医学院 一种原子力显微镜探针及其制备方法和应用
CN115541934A (zh) * 2022-09-20 2022-12-30 南京林业大学 一种表征木质素与纤维素酶相互作用力的方法
CN115541934B (zh) * 2022-09-20 2023-09-15 南京林业大学 一种表征木质素与纤维素酶相互作用力的方法
WO2024060960A1 (zh) * 2022-09-20 2024-03-28 南京林业大学 一种表征木质素与纤维素酶相互作用力的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Karimi et al. A critical review on analysis in pretreatment of lignocelluloses: Degree of polymerization, adsorption/desorption, and accessibility
CN111505343A (zh) 一种基于afm探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法
Qi et al. Enzyme adsorption and recycling during hydrolysis of wheat straw lignocellulose
Bay et al. Structural modification of pine and poplar wood by alkali pretreatment to improve ethanol production
CN110760552A (zh) 一种提高木质纤维素糖化效率的预处理方法
Champagne et al. Enzymatic hydrolysis of cellulosic municipal wastewater treatment process residuals as feedstocks for the recovery of simple sugars
Barman et al. Deconstruction of pine wood (Pinus sylvestris) recalcitrant structure using alkali treatment for enhancing enzymatic saccharification evaluated by Congo red
CN109853086B (zh) 一种木质素/醋酸纤维素基静电纺丝碳纤维及其制备方法与应用
Noori et al. Chemical and structural analysis of alkali pretreated pinewood for efficient ethanol production
Zhang et al. Real-time adsorption of exo-and endoglucanases on cellulose: effect of pH, temperature, and inhibitors
Yao et al. Characteristics of lignin fractions from dilute acid pretreated switchgrass and their effect on cellobiohydrolase from Trichoderma longibrachiatum
US9187571B2 (en) Nano-deaggregated cellulose
Huron et al. Impact of delignification on the morphology and the reactivity of steam exploded wheat straw
CN110438114B (zh) 一种纳米纤维素/光固化树脂制备固定化酶的方法及制得的固定化酶与应用
Carreño-Sayago et al. Eichhornia crassipes (Mart.) Solms: An integrated phytoremediation and bioenergy system
WO2024060960A1 (zh) 一种表征木质素与纤维素酶相互作用力的方法
Li et al. Lignin interaction with cellulase during enzymatic hydrolysis
CN108315354B (zh) 利用秸秆糖化残渣制备生物炭的方法及其制备的生物炭的应用
Moran‐Mirabal et al. Immobilization of cellulose fibrils on solid substrates for cellulase‐binding studies through quantitative fluorescence microscopy
Teghammar et al. Substrate characteristic analysis for anaerobic digestion: a study on rice and triticale straw
CN111154811B (zh) 一种提高木质纤维素生物降解效率的预处理体系及其应用
Shi et al. Direct Saccharification and fermentation for high glucose and ethanol production from non‐detoxified furfural residue without any pretreatment
Sharma et al. Wet air oxidation pretreatment of mixed lignocellulosic biomass to enhance enzymatic convertibility
Tran et al. Fabrication of cellulase protein fibers through concentric electrospinning
CN104289198A (zh) 一种复合材料及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200807