ES2899754T3 - Moduladores de canales iónicos y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de P2X4 humano y modula la actividad del canal, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una VH que comprende: a. una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia: SFAMS; b. una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia: AISGSG GSTYYADSVKG; c. una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia: QFDYWSTYSGPTAFDL; en combinación con una VL que comprende: a. una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia SGDALPRQYAY b. una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia KDSERPS c. una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia QSADSSGTYVV.

Description

DESCRIPCIÓN

Moduladores de canales iónicos y usos de los mismos

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El dolor crónico no sirve para ningún fin beneficioso, sino que surge de alteraciones patológicas en redes neuronales nociceptivas. El dolor neuropático es una forma de dolor crónico que surge tras la lesión nerviosa provocada por traumatismo, infección o patología. El dolor neuropático persiste mucho después tras haberse curado el acontecimiento iniciador. Aunque las neuronas están implicadas en el dolor neuropático, es poco probable que sean el único tipo de célula que medie en este estado. Hay un conjunto de pruebas creciente que apoya un papel de las interacciones glía-neuronas en el establecimiento y el mantenimiento del dolor neuropático. La microglía, en particular, ha surgido como un participante clave en el dolor neuropático. El receptor P2X4 microglial parece ser importante en el desarrollo y el mantenimiento del dolor neuropático.

El canal iónico P2X4 es uno de siete miembros de una familia de canales permeables a cationes, purinérgicos. Cada subunidad de P2X4 tiene dos dominios transmembrana, separados por un dominio extracelular grande de ~280 aminoácidos. Los canales funcionales están formados por una disposición trimérica de subunidades con un poro central. El canal P2X4 se activa mediante la unión del ligando adenosina 5'-trifosfato (ATP) a residuos contenidos dentro de su dominio extracelular. La activación de estos receptores instiga una serie de cambios conformacionales que permiten la entrada de cationes, tales como Ca2+ y Na+, en la célula a través de un canal selectivo de cationes. Se cree que la activación y regulación por incremento de P2X4 es un factor clave que conduce al dolor neuropático. Posteriormente a la activación de P2X4, la microglía libera factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), que actúa sobre neuronas de la lámina I de la médula espinal para reducir la expresión de un transportador de cloruro neuronal KCC2, alterando de ese modo el gradiente electroquímico para el cloruro y haciendo que uno de los principales neurotransmisores inhibitorios, GABA, sea excitatorio. Por tanto, se cree que la liberación de BDNF mediada por P2X4 en la médula espinal es un factor clave que conduce al dolor neuropático.

El dolor neuropático no responde a los analgésicos disponibles actualmente, y se considera que es uno de los estados de dolor crónico más debilitantes. Por consiguiente, se requieren urgentemente métodos mejorados para tratar el dolor neuropático, particularmente el dolor mediado por P2X4.

Young et al. (2008 JBC 283:26241-51) se refiere a la forma molecular, arquitectura y tamaño de los receptores P2X4 determinados utilizando microscopía electrónica y por transferencia de energía por resonancia fluorescente. El documento WO0248395 se refiere a la expresión del receptor P2Y para identificar estados preneoplásicos y neoplásicos. El documento US2005074819 se refiere a un método de cribado para un compuesto útil para el tratamiento del dolor neuropático. El documento US20080287467 se refiere a un agente terapéutico para enfermedades respiratorias, que comprende un compuesto antagonista para el receptor P2X. Gum et al. (2012 Purinergic Signal 8:41-56) analiza antagonistas del receptor P2X para el tratamiento del dolor. Valente et al. (2011 Biochim Biophys Acta 1808:2859-66) se refiere a la expresión, purificación, microscopía electrónica, mutagénesis de N-glicosilación y modelización molecular de P2X4 y P2XA humanos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Tal como se describe a continuación, la presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de P2X4 y modulan la actividad del canal P2X4, polipéptidos de P2X4 recombinantes y métodos para generar tales polipéptidos, así como composiciones y métodos para generar anticuerpos anti-P2X4, y métodos de uso de anticuerpos frente a P2X4 para el tratamiento de dolor neuropático y otras indicaciones.

En un primer aspecto, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de P2X4 humano y modula la actividad del canal, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una VH que comprende: una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia: SFAMS; una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia: AISGSGGSTYYADSVKG; una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia: QFDYWSTYSGPTAFDL; en combinación con una VL que comprende: una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia SGDALPRQYAY; una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia KDSERPS; una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia QSADSSGTYVV

Definiciones

A menos que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Las siguientes referencias le proporcionan al experto en la técnica una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5a Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale y Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Tal como se utilizan en la presente, los siguientes términos tienen los significados que se les atribuye a continuación, a menos que se especifique algo distinto.

Por “polipéptido de receptor de purina P2X 4 (P2RX4 o P2X4)” quiere decirse una proteína de receptor purinérgico o fragmento de la misma que tiene una identidad de aminoácidos de al menos aproximadamente el 85% o mayor con la la secuencia de aminoácidos proporcionada en el n.° de registro de NCBI Q99571 y que tiene actividad biológica de P2X4. La actividad biológica de P2X4 incluye actividad de conducción de Ca2+/Na+ en respuesta a unión a ATP y/o unión a anticuerpo frente a P2X4. Se proporciona a continuación una secuencia de P2X4 humano:

magccaalaa flfeydtpri vlirsrkvgl mnravqllil ayvigwvfvw ekgyqetdsv 61

vssvttkvkg vavtntsklg friwdvadyv ipaqeenslf vmtnviltmn qtqglcpeip 121

dattvcksda sctagsagth sngvstgrcv afngsvktce vaawcpvedd thvpqpaflk 181

aaenftllvk nniwypkfnf skrnilpnit ttylksciyd aktdpfcpif rlgkivenag 241

hsfqdmaveg gimgiqvnwd cnldraaslc lprysfrrld trdvehnvsp gynfrfakyy 301

rdlagneqrt likaygirfd iivfgkagkf diiptminig sglallgmat vlcdiivlyc 361

mkkrlyyrek kykyvedyeq glaseldq

En realizaciones de la invención, un polipéptido de P2X4 humano tiene una identidad de al menos aproximadamente el 65%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o incluso el 100% con el n.° de registro de NCBI Q99571. En otras realizaciones, la invención proporciona polipéptidos de P2X4 que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos en relación con la secuencia de referencia Q99571, incluyendo por ejemplo: E95Q, V105M, G114D, A122V, S131N, A151P, G154R, L303P y N306K.

Se proporciona un receptor de purina P2X 4 murino a modo de ejemplo en el n.° de registro de NCBI Q9JJX6, que tiene la siguiente secuencia:

magccsvlgs flfeydtpri vlirsrkvgl mnrvvqllil ayvigwvfvw ekgyqetdsv 61

vssvttkakg vavtntsqlg friwdvadyv vpaqeenslf imtnmivtvn qtqgtcpeip 121

dktsicdsda nctlgssdth ssgigtgrcv pfnasvktce vaawcpvend agvptpaflk 181

aaenftllvk nniwypkfnf skrnilpnit tsylksciyn artdpfcpif rlgqivadag 241

hsfqemaveg gimgiqikwd cnldraashc lprysfrrld trdlehnvsp gynfrfakyy 301

rdlagneqrt ltkaygirfd iivfgkagkf diiptminvg sglallgvat vlcdvivlyc 361

mkkryyyrdk kykyvedyeq glsgemnq

Se proporciona una secuencia de receptor de purina P2X 4 de rata a modo de ejemplo en el n.° de registro de NCBI P51577, que tiene la siguiente secuencia:

magccsvlgs flfeydtpri vlirsrkvglmnravqllil ayvigwvfvw ekgyqetdsv 61

vssvttkakg vavtntsqlg friwdvadyvipaqeenslf imtnmivtvn qtqstcpeip 121

dktsicnsda dctpgsvdth ssgvatgrcvpfnesvktce vaawcpvend vgvptpaflk 181

aaenftllvk nniwypkfnf skrnilpnittsylksciyn aqtdpfcpif rlgtivedag 241

hsfqemaveg gimgiqikwd cnldraaslclprysfrrld trdlehnvsp gynfrfakyy 301

rdlagkeqrt ltkaygirfd iivfgkagkfdiiptminvg sglallgvat vlcdvivlyc 361

mkkkyyyrdk kykyvedyeq glsgemnq

Una secuencia de receptor de purina P2X 4 de mono cynomolgus a modo de ejemplo (por ejemplo, macaco), que tiene la siguiente secuencia:

magccaalaa flfeydtpri vlirsrkvgl mnravqllil ayvigwvfvw ekgyqetdsv 61

vssvttkvkg vavtntsklg friwdvadyv ipaqqenslf vmtnmiltmn qtqdlcpeip 121

dvttvcksda nctagsagth sngvstgrcv pfnrsvktce vaawcpvedd thvpqpaflk 181

aaenftllvk nniwypkfnf skrnilpnit ttylksciyd aktdpfcpif rlgkivenag 241

hsfqdmaveg gimgiqvnwd cnldraaslc lprysfrrld trdvehnvsp gynfrfakyy 301

rdpagkeqrt likaygirfd iivfgkagkf diiptminig sglallgmat vlcdiivlyc 361

mkkrlyyrek kykyvedyeq glaseldp

Por “molécula de ácido nucleico de P2X4” quiere decirse un polinucleótido que codifica para un polipéptido de P2X4 o fragmento del mismo. Se proporciona una secuencia de polinucleótido de P² X⁴ humano a modo de ejemplo en el n.° de registro de NCBI NM_002560, cuya secuencia sigue:

1 aagtgctggg atgacaggtg tgagccaccg cccccggccc ctcgcccgcc ttttgaagga

61 gcctttcgtc ctcaagggcg aggccactcc ccccccgcga gttccatgcc ccctagaggg

121 tcatcgttcc cgacggggag gtggcgccct cccccgggcc ccgggccccg accgcccgtg

181 ctgcctcctt ccgggccctc ctccgcgatg acggcgccgc cagcaggcca ggcggactgg

241 gcggggctcc gagcggggac tgggacccag accgactagg ggactgggag cgggcggcgc

301 ggccatggcg ggctgctgcg ccgcgctggc ggccttcctg ttcgagtacg acacgccgcg

361 catcgtgctc atccgcagcc gcaaagtggg gctcatgaac cgcgccgtgc aactgctcat

421 cctggcctac gtcatcgggt gggtgtttgt gtgggaaaag ggctaccagg aaactgactc

481 cgtggtcagc tccgttacga ccaaggtcaa gggcgtggct gtgaccaaca cttctaaact

541 tggattccgg atctgggatg tggcggatta tgtgatacca gctcaggagg aaaactccct

601 cttcgtcatg accaacgtga tcctcaccat gaaccagaca cagggcctgt gccccgagat

661 tccagatgcg accactgtgt gtaaatcaga tgccagctgt actgccggct ctgccggcac

721 ccacagcaac ggagtctcaa caggcaggtg cgtagctttc aacgggtctg tcaagacgtg

781 tgaggtggcg gcctggtgcc cggtggagga tgacacacac gtgccacaac ctgctttttt

841 aaaggctgca gaaaacttca ctcttttggt taagaacaac atctggtatc ccaaatttaa

901 tttcagcaag aggaatatcc ttcccaacat caccactact tacctcaagt cgtgcattta

961 tgatgctaaa acagatccct tctgccccat attccgtctt ggcaaaatag tggagaacgc

1021 aggacacagt ttccaggaca tggccgtgga gggaggcatc atgggcatcc aggtcaactg

1081 ggactgcaac ctggacagag ccgcctccct ctgcttgccc aggtactcct tccgccgcct

1141 cgatacacgg gacgttgagc acaacgtatc tcctggctac aatttcaggt ttgccaagta

1201 ctacagagac ctggctggca acgagcagcg cacgctcatc aaggcctatg gcatccgctt

1261 cgacatcatt gtgtttggga aggcagggaa atttgacatc atccccacta tgatcaacat

1321 cggctctggc ctggcactgc taggcatggc gaccgtgctg tgtgacatca tagtcctcta

1381 ctgcatgaag aaaagactct actatcggga gaagaaatat aaatatgtgg aagattacga

1441 gcagggtctt gctagtgagc tggaccagtg aggcctaccc cacacctggg ctctccacag

1501 ccccatcaaa gaacagagag gaggaggagg gagaaatggc caccacatca ccccagagaa

1561 atttctggaa tctgattgag tctccactcc acaagcactc agggttcccc agcagctcct

1621 gtgtgttgtg tgcaggatct gtttgcccac tcggcccagg aggtcagcag tctgttcttg

1681 gctgggtcaa ctctgctttt cccgcaacct ggggttgtcg ggggagcgct ggcccgacgc

1741 agtggcactg ctgtggcttt cagggctgga gctggctttg ctcagaagcc tcctgtctcc

1801 agctctctcc aggacaggcc cagtcctctg aggcacggcg gctctgttca agcactttat

1861 gcggcagggg aggccgcctg gctgcagtca ctagacttgt agcaggcctg ggctgcaggc

1921 ttccccccga ccattccctg cagccatgcg gcagagctgg catttctcct cagagaagcg

1981 ctgtgctaag gtgatcgagg accagacatt aaagcgtgat tttcttaaaa aaaaaaaaaa

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Por “actividad biológica de P2X4” quiere decirse actividad de conducción de canales iónicos o cambios mediados por canales iónicos en los niveles citosólicos de calcio.

Por “mejorar” quiere decirse disminuir, suprimir, atenuar, disminuir, detener o estabilizar el desarrollo o la progresión de una enfermedad.

El término “anticuerpo,” tal como se usa en esta divulgación, se refiere a una inmunoglobulina o un fragmento o un derivado de la misma, y engloba cualquier polipéptido que comprende un sitio de unión a antígeno, independientemente de si se produce in vitro o in vivo. El término incluye, pero no se limita a, anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespecíficos, poliespecíficos, no específicos, humanizados, de cadena sencilla, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados e injertados. A menos que se modifique de otra forma por el término “intacto”, como en “anticuerpos intactos”, para los fines de esta divulgación, el término “anticuerpo” también incluye fragmentos de anticuerpo tales como Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, y otros fragmentos de anticuerpo que conservan la función de unión a antígeno, es decir, la capacidad para unirse a un polipéptido de P2X4 específicamente. Normalmente, tales fragmentos comprenderán un dominio de unión a antígeno.

Los términos “dominio de unión a antígeno”, “fragmento de unión a antígeno” y “fragmento de unión” se refieren a una parte de una molécula de anticuerpo que comprende los aminoácidos responsables de la unión específica entre el anticuerpo y el antígeno. En algunos casos, cuando el antígeno es grande, el dominio de unión a antígeno puede unirse sólo a una parte del antígeno. Una parte de la molécula de antígeno que es responsable de interacciones específicas con el dominio de unión a antígeno se denomina “epítopo” o “determinante antigénico”. En realizaciones particulares, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo (V^l) y una región variable de cadena pesada de anticuerpo (V^h), sin embargo, no tiene que comprender necesariamente ambas. Por ejemplo, un denominado fragmento de anticuerpo Fd consiste sólo en un dominio V^h, pero todavía conserva algo de función de unión a antígeno del anticuerpo intacto.

Los fragmentos de unión de un anticuerpo se producen mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión química o enzimática de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv y anticuerpos de cadena sencilla. Un anticuerpo distinto de un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" se entiende que tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos. La digestión de anticuerpos con la enzima, papaína, da como resultado dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, conocidos también como fragmentos "Fab", y un fragmento "Fc", que no tienen actividad de unión a antígeno pero que tienen la capacidad de cristalizar. La digestión de anticuerpos con la enzima, pepsina, da como resultado un fragmento F(ab')2 en el que los dos brazos de la molécula de anticuerpo permanecen unidos y comprenden dos sitios de unión a antígeno. El fragmento F(ab')2 tiene la capacidad de reticular el antígeno. "Fv" cuando se usa en la presente se refiere al fragmento mínimo de un anticuerpo que conserva tanto los sitios de reconocimiento del antígeno como de unión al antígeno. "Fab" cuando se usa en la presente se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CHI de la cadena pesada.

El término “AcM” se refiere a un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos de la invención comprenden, a título meramente enunciativo, anticuerpos nativos enteros, anticuerpos biespecíficos; anticuerpos quiméricos; Fab, Fab', fragmentos de región V de cadena sencilla (scFv), polipéptidos de fusión y anticuerpos no convencionales.

En esta divulgación, "comprende", "que comprende", "que contiene" y "que tiene" y similares pueden tener el significado atribuido a los mismos en la Ley de Patentes de Estados Unidos y pueden significar "incluye", "que incluye" y similares; "que consiste esencialmente en" o "consiste esencialmente", asimismo, tiene el significado atribuido en la Ley de Patentes de Estados Unidos y la expresión es indefinida, permitiendo la presencia de más de lo que se indica siempre que no se cambien las características básicas o nuevas de lo que se indica mediante la presencia de más de lo que se indica, pero excluye realizaciones de la técnica anterior.

“Detectar” se refiere a identificar la presencia, ausencia o cantidad del analito a detectarse. En una realización, un anticuerpo de la invención o fragmento del mismo se usa para detectar la presencia o el nivel de un polipéptido de P2X4.

Por "marcador detectable" quiere decirse una composición que cuando se une a una molécula de interés hace que esta última pueda detectarse, por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, marcadores útiles incluyen isótopos radiactivos, perlas magnéticas, perlas metálicas, partículas coloidales, tintes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, las que se utilizan comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos.

Por “enfermedad” quiere decirse cualquier estado o trastorno que daña o interfiere con la función normal de una célula, tejido u órgano. Los ejemplos de enfermedades incluyen dolor neuropático, particularmente dolor asociado con la actividad del canal P2X4 o la actividad de una ruta sensible a P2X4.

El término “cantidad eficaz” se refiere a una dosificación o cantidad de un agente que es suficiente para reducir la actividad de un polipéptido de P2X4 para dar como resultado la mejora de síntomas en un paciente o para lograr un desenlace biológico deseado. Los desenlaces biológicos deseados incluyen, por ejemplo, la mejora del dolor crónico o un síntoma del mismo, la modulación de la actividad biológica de P2X4 o la modulación de una ruta sensible a la actividad de P2X4.

El término “aislado” se refiere a una molécula que está sustancialmente libre de otros elementos presentes en su entorno natural. Por ejemplo, una proteína aislada está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas de la fuente celular o tisular de la que se deriva. El término “aislado” también se refiere a preparaciones en las que la proteína aislada está suficientemente pura como para administrarse como una composición farmacéutica, o al menos el 70-80% (p/p) pura, más preferiblemente, al menos el 80-90% (p/p) pura, incluso más preferiblemente el 90-95% pura; y, lo más preferiblemente, al menos el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% (p/p) pura.

Por "fragmento" quiere decirse una parte de una molécula de ácido nucleico o polipéptido. Esta parte contiene, preferiblemente, al menos el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80% o el 90% de toda la longitud del polipéptido o molécula de ácido nucleico de referencia. En una realización particular, un fragmento de un polipéptido de P2X4 puede contener 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 ó 300 aminoácidos.

El término "referencia" se refiere a un estándar de comparación.

Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, un segmento de una secuencia génica o ADNc de longitud completa, o la secuencia génica o ADNc completo. Para polipéptidos, la longitud de la secuencia de polipéptido de referencia será generalmente de al menos aproximadamente 16 aminoácidos, preferiblemente al menos aproximadamente 20 aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 25 aminoácidos, e incluso de manera más preferible aproximadamente 35 aminoácidos, aproximadamente 50 aminoácidos, o aproximadamente 100 aminoácidos. Para ácidos nucleicos, la longitud de la secuencia de ácido nucleico de referencia será generalmente de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 60 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 75 nucleótidos, e incluso de manera más preferible aproximadamente 100 nucleótidos o aproximadamente 300 nucleótidos o cualquier número entero alrededor del mismo o entre medias.

El término “repertorio” se refiere a una colección genéticamente diversa de nucleótidos derivados completa o parcialmente de secuencias que codifican para inmunoglobulinas expresadas. Las secuencias se generan mediante transposición in vivo de, p. ej., los segmentos V, D y J para las cadenas H y, p. ej., los segmentos V y J para las cadenas L. Alternativamente, las secuencias pueden generarse a partir de una línea celular mediante estimulación in vitro, en respuesta a la cual se produce transposición. Alternativamente, parte de o todas las secuencias pueden obtenerse combinando, p. ej., segmentos V no transpuestos con segmentos D y J, mediante síntesis de nucleótidos, mutagénesis aleatorizada y otros métodos, p. ej., tal como se dan a conocer en la patente estadounidense n.° 5.565.332.

Por “se une específicamente” quiere decirse un agente (p. ej., anticuerpo) que reconoce y se une a una molécula (p. ej., polipéptido), pero que no reconoce sustancialmente ni se une a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica. Por ejemplo, dos moléculas que se unen específicamente forman un complejo que es relativamente estable en las condiciones fisiológicas. La unión específica se caracteriza por una alta afinidad y una capacidad de moderada a baja tal como se distingue de la unión no específica que tiene habitualmente una baja afinidad con una capacidad de moderada a alta. Normalmente, la unión se considera específica cuando la constante de afinidad K^a es superior a 107 M-1, o más preferiblemente superior a 108 M-1.

La fuerza de la unión entre P2X4 y un anticuerpo puede medirse usando, por ejemplo, un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) o tecnología basada en la resonancia de plasmón superficial (p. ej., Biacore), todas ellas son técnicas bien conocidas en la técnica. Si es necesario, la unión no específica puede reducirse sin afectar sustancialmente a la unión específica variando las condiciones de unión. Un experto en la técnica, usando técnicas de rutina, puede optimizar las condiciones de unión apropiadas tales como la concentración de anticuerpos, la fuerza iónica de la disolución, la temperatura, el tiempo permitido para la unión, la concentración de un agente de bloqueo (p. ej., albúmina sérica, caseína de leche), etc.

Salvo que se especifique o el contexto claramente dicte lo contrario, debe entenderse que la expresión “aproximadamente”, tal como se utiliza en la presente, hace referencia a un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo, dentro de 2 desviaciones estándares de la media. Puede entenderse que "aproximadamente" hace referencia a un margen del 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% o 0.01% con respecto al valor establecido. Salvo que del contexto surja claramente lo contrario, todos los valores numéricos proporcionados en la presente se encuentran modificados por la expresión "aproximadamente".

La mención de una lista de grupos químicos en cualquier definición de una variable de la presente incluye las definiciones de esa variable como cualquier grupo único o cualquier combinación de grupos enumerados. La mención de una realización para una variable o aspecto en la presente incluye esa realización como cualquier realización individual o en combinación con cualquier otra realización o parte de la misma.

Cualquier composición o método proporcionado en la presente puede combinarse con uno o más de cualquiera de las otras composiciones y métodos proporcionados en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las figuras 1A-1D muestran un análisis de los anticuerpos n.os 1, 11, 29 y 33 que se unen a variantes de P2X4 humano.

La figura 2 proporciona las secuencias de VH y VL de los anticuerpos n.os 1-34, que se identificaron usando tecnología de presentación en fago.

La figura 3 proporciona un resumen de las propiedades unión a ortólogos de P2X4 de anticuerpos identificados usando selección por presentación en fago (anticuerpos 1 a 34) y un resumen de sus efectos funcionales medidos mediante ensayos de electrofisiología y notificados como una fracción de la corriente control. Leyenda: indica que se observó unión en el ensayo de FMAT;

- indica que no se observó unión en el ensayo de FMAT; NT indica que el anticuerpo no se sometió a prueba en el ensayo.

La figura 4 muestra los resultados de los anticuerpos 5, 8, 11, 18, 29 y 33 examinados en ensayos de electrofisiología. Cada de estos anticuerpos se identificó como un antagonista de P2X4. La corriente de entrada pico inducida por agonista en respuesta a ATP 3 |jM en presencia de anticuerpo se indica como una fracción de la corriente control en ausencia de anticuerpo frente a P2X4 humano o de mono cynomolgus (cyno).

La figura 5 proporciona un resumen de las propiedades de unión a ortólogos de P2X4 de anticuerpos aislados a partir de hibridomas (anticuerpos n.os 35-48) y un resumen de sus efectos funcionales medidos mediante ensayos de electrofisiología y notificados como una fracción de la corriente control.

La figura 6 proporciona las secuencias de VH y VL de los anticuerpos n.os 35-48.

La figura 7 proporciona un resumen de los resultados de ensayos de unión para 252 anticuerpos (anticuerpos n.os 35-286) aislados usando tecnología de hibridomas y un resumen de sus efectos funcionales medidos mediante ensayos de electrofisiología y notificados como una fracción de la corriente control.

Las figuras 8A-8F muestran trazos de corriente de células completas obtenidas usando QPatch 16X que muestra la respuesta del agonista (indicada temporalmente por la barra gris) antes (trazo negro) y después (trazo gris) de la adición de anticuerpos. Los trazos se superponen para su comparación. La línea de puntos indica corriente cero. Se indica la especie de P2X4 investigada cuando sea apropiado mediante (m, ratón) (hu, ser humano). Las figuras 8A, 8D, 8E, 8F muestran actividad contra huP2X4. Las figuras 8B y 8C muestran actividad contra mP2X4.

La figura 9 muestra esquemáticamente una vista extracelular de la estructura predicha del complejo trímero de P2X4-Fv de anticuerpo n.° 11. En particular, la figura 9 ilustra la superficie de contacto epítopo-parátopo bipartita - VHCDR de anticuerpo n.° 11 - cabeza de promotor 1 de P2X4 (superficie de contacto principal - círculo de puntos grande); VLCDR de anticuerpo n.° 11 - aleta derecha de promotor 2 de P2X4 (superficie de contacto secundaria - círculo de puntos pequeño). Tres moléculas de anticuerpo n.° 11 pueden unirse potencialmente a la misma molécula de trímero de P2X4. No es probable que los dos brazos Fab del anticuerpo n.° 11 se acoplen a la misma molécula de trímero de P2X4. Se predice que el anticuerpo n.° 11 se une a un heterómero de P2X a través del epítopo formado por dos subunidades de P2X4.

La figura 10 proporciona alineaciones de secuencias de P2X4 de ser humano, mono cynomolgus, ratón y rata. Se indica la región de cabeza de la proteína. También se indican los aminoácidos dentro del epítopo predicho.

La figura 11 muestra el efecto de los anticuerpos n.os 38 y 208 frente a P2X4 y un anticuerpo control de isotipo (NIP228 TM) dosificados por vía intratecal (5 |jg por ratón) sobre la reversión de la hiperalgesia mecánica inducida por ligamiento de nervios periféricos (PNL) tal como se mide mediante la razón ipsilateral/contralateral del umbral de retirada de la pata en respuesta a presión sobre la pata (n = 9-10 por grupo). Los datos se analizaron usando ANOVA de 2 vías con el tiempo y tratamiento como factores dependientes. Se obtuvo la significación estadística posterior usando la prueba a posteriori de Tukey. * P<0.05; *** P<0.001 - Op NIP228 TM frente a Op anticuerpo 208: P<0.05; + P<0.01; ++ P<0.001 -Op Nlp228 TM frente a Op anticuerpo 38

La figura 12 proporciona una alineación de las secuencias de VH y VL de los anticuerpos n.os 287 a 315, que se derivan del anticuerpo 11.

La figura 13 proporciona las secuencias de VH & VL de los anticuerpos n.os 208 y 316 a 321

La figura 14 muestra el efecto de los anticuerpos n.os 11,300 y 312 sobre las corrientes de huP2X4 registradas en Qpatch 16X. El trazo negro indica la respuesta a ATP antes de la adición de IgG mientras que el trazo gris indica la respuesta a ATP tras la incubación con IgG. La línea discontinua indica el nivel de corriente cero y la barra gris indica el momento en el que se añadió ATP a la disolución de baño de células. Se superponen los trazos para su comparación. Se representan gráficamente curvas de respuesta a la dosis con valores de corriente normalizados tal como se describe en el ejemplo 14 y representan la media /- EEM, n = 4.

La figura 15 resume los valores de CI⁵⁰ para versiones optimizadas del anticuerpo 11 en huP2X4 usando o bien FLIPR o bien Qpatch 16X. Los valores son medias geométricas.

La figura 16 resumen los valores de CI⁵⁰ para los anticuerpos 38, 43, 46 y 208 en P2X4 murino y/o huP2X4 expresados en células HEK 293F obtenidos en Qpatch 16X.

La figura 17 resume el efecto de los anticuerpos 38, 43, 46 y 208 sobre las corrientes de P2X4 microgliales de ratón medidas en Qpatch 16X.

La figura 18 muestra trazos de corrientes de electrofisiología a modo de ejemplo de microglía de ratón pretratada con o bien el anticuerpo control NIP 228 o bien el anticuerpo 208 (0.33 mg/ml). La barra gris indica el momento en el que se añadió ATP (30 |jM) a las células y la línea de puntos indica el nivel de corriente cero.

La figura 19 muestra curvas de CI⁵⁰ de ejemplo obtenidas con dos de los anticuerpos anti-P2X4 en el ensayo de respuesta a calcio estimulado con ATP.

La figura 20 muestra curvas de CI⁵⁰ (media /- EEM) para los anticuerpos 46, 38 y 208 obtenidos a partir de microglía de ratón sometida a ensayo en FLIPR. Se presentan a continuación valores de CI⁵⁰ medios.

La figura 21 muestra trazos de corriente de electrofisiología a modo de ejemplo de macrófagos derivados de monocitos humanos. El momento en el que se añadió ATP a las células se indica en el recuadro blanco. La línea de puntos indica corriente cero.

La figura 22 resume la corriente de entrada en estado estacionario de macrófagos derivados de monocitos humanos en respuesta a ATP (30 j M).

La figura 23 resume el efecto de los anticuerpos 319-321 sobre las corrientes de huP2X4.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Tal como se describe a continuación, la presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de P2X4 y modulan la actividad del canal P2X4, polipéptidos de P2X4 recombinantes y métodos para generar tales polipéptidos, así como composiciones y métodos para generar anticuerpos anti-P2X4, y métodos de uso de anticuerpos frente a P2X4 para el tratamiento de dolor neuropático y otras indicaciones.

Expresión recombinante de P2X4

La presente divulgación proporciona polipéptidos de P2X4 recombinantes aislados purificados que forman complejos triméricos estables. La divulgación proporciona además métodos para la producción a gran escala de polipéptidos de P2X4 humano y murino purificados y aislados, que es suficiente para producir cantidades de miligramos de proteína P2X4, en donde las proteínas recombinantes aisladas y purificadas están presentes predominantemente como trímeros estables. Las cantidades totales de P2X4 que se produjeron para los experimentos de selección y examen descritos en la presente incluyeron 6.2 mg de hP2X4 y 3.2 mg de mP2X4. El nivel de producción de proteína purificada fue de 0.2 mg/l de cultivos de células de insecto. Tal como se sometió a ensayo mediante cromatografía de exclusión molecular fluorescente, la preparación de proteína contiene el 50-75% de trímero.

Se han descrito la expresión y purificación de P2X4 humano con una etiqueta de decahistidina C-terminal en células HEK293 (Young et al., J. Biol. Chem. 283 (2008) 26241-26251). La purificación implicó solubilización usando detergente dodecilmaltósido y cromatografía de afinidad metálica con Ni-inmovilizado. Se requirió una etapa de purificación electroforética en gel de poliacrilamida para aislar la forma trimérica. Aunque se reivindicó que se aisló una preparación completamente trimérica de hP2X4, el rendimiento descrito fue de sólo 40 |jg por 2.5x108 células.

Se ha llevado a cabo otro ejemplo de expresión y purificación a pequeña escala de canales P2X de trímero de rata (subtipos 2, 4 y 7) (Antonio et al., Br. J. Pharmacol. 163 (2011) 1069-1077). Se expresaron de manera transitoria receptores P2X4 de rata que tenían una etiqueta de hemaglutinina C-terminal en células tsA 201 (un subclón de células HEK293 que expresan de manera estable el antígeno T grande SV40). Se solubilizaron los receptores en detergente CHAPS y se purificaron por afinidad. En comparación con la expresión de P2X2 y P2X7, la expresión de P2X4 era relativamente baja. Se usaron los receptores purificados en obtención de imágenes de AFM, que mostraron una disposición trimérica de los receptores y también trímeros dobles (dímeros de trímeros).

En otro informe se evaluó el sistema de células de insecto Sf9 para la expresión de P2X4 humano y P2XA de Dictyostelium discoideum (Valente et al., Biochim. Biophys. Acta 1808 (2011) 2859-2866). Aunque pudo obtenerse el P2XA de D. discoideum en una forma estable, purificada y soluble en detergente, se notificó que el P2X4 humano no era propenso a producirse en una forma trimérica.

Los métodos presentes en la técnica anterior no consiguieron de modo uniforme aislar cantidades sustanciales de polipéptidos de P2X4 recombinantes. Además, la técnica anterior no consiguió aislar complejos de P2X4 humano en cantidades de miligramos en donde la mayoría de las proteínas aisladas estaban presentes en forma trimérica. En cambio, los métodos de la invención, que son adecuados para aumento a escala, han permitido la producción a escala de miligramos de polipéptido de P2X4 recombinante purificado. El rendimiento de P2X4 purificado obtenido fue de 0.2 mg/l de medio de cultivo de células de insecto, correspondiente a aproximadamente 8 jg por 1x108 células.

Para la producción a gran escala de P2X4 purificado, se expresaron los receptores P2X4 humano y P2X4 de ratón en células de insecto Sf9 usando un sistema de expresión de baculovirus. La expresión y producción de proteínas no están limitadas a líneas de células de insecto Sf9, otras líneas celulares y células de insecto que soportan la producción de proteínas incluyen células Sf21 de Spodoptera frugiperda o líneas celulares derivadas de Trichoplusia ni Tn-368 y High-Five™ BTI-TN-5B1-4. Para aumentar la producción de proteínas, se monitorizaron los niveles de expresión de P2X4 en el momento de la cosecha, y se evaluó la calidad y homogeneidad de los receptores usando un método de cromatografía de exclusión molecular con detección de fluorescencia modificado (FSEC) tal como se describe por Backmark et al., (Protein Sci. 22 (2013) 1124-1132). Este método es similar al concepto de FSEC básico tal como se describe por Kawate y Gouaux (Structure 14 (2006) 673-681), pero se aplicó una sonda de fluorescencia que interaccionaba específicamente con una etiqueta de histidina en la proteína. Para lograr los sorprendentes rendimientos notificados en la presente, se inocularon las células a una densidad de 1.0x10e6/ml en medio SF900II. Se infectaron las células con una multiplicidad de infección de 2 a una densidad celular de 2 x 10e6 células/ml. Se realizó la expresión de proteínas a 27°C y se recogieron las células 72 horas tras la infección. Estas condiciones permitieron que se produjera una cantidad óptima de la forma trimérica de P2X4. La homogeneidad de la proteína era inesperada. Aunque la cantidad total de proteína P2X4 expresada aumentó con tiempos tras la infección más prolongados, la calidad de la proteína expresada tal como se sometió a ensayo mediante FSEC no aumentó más allá de las 72 horas.

Anticuerpos anti-P2X4

La divulgación proporciona anticuerpos anti-P2X4 que comprenden fragmentos de unión a antígeno novedosos.

En general, pueden prepararse anticuerpos, por ejemplo, usando técnicas de hibridoma tradicionales (Kohler y Milstein (1975) Nature, 256: 495-499), métodos de ADN recombinante (patente estadounidense n.° 4.816.567) o presentación en fago realizada con bibliotecas de anticuerpos (Clackson, T. y Lowman, H.B. Phage Display - A Practical Approach, 2004. Oxford University Press; (2) Thompson, J. et al. J Mol Biol. 256(1):77-88, 1996; (3) Osbourn, J.K. et al. Immunotechnology, 2(3):181-96, 1996). Los anticuerpos 35-48 a modo de ejemplo se obtuvieron usando técnicas de hibridoma tal como se describe en la presente. Los anticuerpos 1-34 a modo de ejemplo se obtuvieron usando presentación en fago tal como se describe en la presente. Para otras técnicas de producción de anticuerpos, véase también Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. La invención no se limita a ninguna fuente, especie de origen o método de producción particular.

Los anticuerpos intactos, también conocidos como inmunoglobulinas, son normalmente proteínas glicosiladas tetraméricas compuestas por dos cadenas ligeras (L) de aproximadamente 25 kDa cada una y dos cadenas pesadas (H) de aproximadamente 50 kDa cada una. En los anticuerpos se encuentran dos tipos de cadena ligera, designadas como cadena A y cadena k. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales: A, D, E, G y M, y varias de éstas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), p. ej., IgG¹, IgG², IgG3, IgG4, IgA¹ e IgA².

Las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien en la técnica. Para una revisión de la estructura de un anticuerpo, véase Harlow et al., citado anteriormente. En resumen, cada cadena ligera se compone de un dominio variable N-terminal (V^l) y un dominio constante (C^l). Cada cadena pesada se compone de un dominio variable N-terminal (V^h), tres o cuatro dominios constantes (C^h) y una región de bisagra. El dominio C^h más proximal a V^h se designa como C^h1. Los dominios V^h y V^l consisten en cuatro regiones de secuencia relativamente conservada denominadas regiones de entramado (FR1, FR2, FR3 y FR4), que forman un armazón para tres regiones de secuencia hipervariable denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las CDR contienen la mayoría de los residuos responsables de interacciones específicas con el antígeno. Las tres CDR se denominan CDR1, c DR2 y CDR3. Los constituyentes de CDR en la cadena pesada se denominan H1, H2 y H3, mientras que los constituyentes de CDR en la cadena ligera se denominan L1, L2 y L3, por consiguiente. CDR3 y, particularmente H3, son la mayor fuente de diversidad molecular dentro del dominio de unión a antígeno. H3, por ejemplo, puede ser tan corto como dos residuos de aminoácido o mayor de 26. En realizaciones particulares, una CDR3 de cadena pesada (H3) comprende entre aproximadamente 4 aminoácidos (véase, por ejemplo, el Ac. n.° 2) y 22 aminoácidos (véase, por ejemplo, los Ac n.os 20 y 34).

El fragmento Fab (fragmento de unión a antígeno) consiste en los dominios V^h-C^h1 y V^l-C^l covalentemente unidos por un enlace disulfuro entre las regiones constantes. Para superar la tendencia de dominios V^h y V^l unidos no covalentemente en el Fv a disociarse cuando se expresan conjuntamente en una célula huésped, puede construirse un denominado fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). En un scFv, un polipéptido flexible y adecuadamente largo une o bien el extremo C-terminal del V^h al extremo N-terminal del V^l o bien el extremo C-terminal del V^l al extremo N-terminal del V^h. Lo más comúnmente, se usa un péptido de 15 residuos (Gly4Ser)3 como ligador, pero otros ligadores también se conocen en la técnica.

La diversidad de anticuerpos es el resultado del ensamblaje combinatorio de múltiples genes de línea germinal que codifican para regiones variables y una variedad de acontecimientos somáticos. Los acontecimientos somáticos incluyen recombinación de segmentos génicos variables con segmentos génicos de diversidad (D) y unión (J) para preparar una región V^h completa y la recombinación de segmentos génicos variables y de unión para preparar una región V^l completa. El propio procedimiento de recombinación es impreciso, dando como resultado la pérdida o la adición de aminoácidos en las uniones V(D)J. Estos mecanismos de diversidad se producen en células B en desarrollo antes de la exposición al antígeno. Tras la estimulación antigénica, los genes de anticuerpos expresados en células B experimentan mutación somática.

Basándose en el número estimado de segmentos génicos de línea germinal, la recombinación al azar de estos segmentos y el apareamiento V^h-V^l al azar, pudieron producirse hasta 1.6*107 anticuerpos diferentes (Fundamental Immunology, 3a ed., ed. Paul, Raven Press, Nueva York, N.Y., 1993). Cuando se tienen en cuenta otros procesos que contribuyen a la diversidad de anticuerpos (tales como mutación somática), se cree que podrían generarse potencialmente por encima de 1 x1010anticuerpos diferentes (Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1995). Debido a los muchos procesos implicados en la diversidad de anticuerpos, es altamente poco probable que los anticuerpos generados independientemente tengan secuencias de aminoácidos idénticas o incluso sustancialmente similares en las CDR.

La divulgación proporciona CDR novedosas derivadas de bibliotecas de genes de inmunoglobulinas humanas. La estructura para portar una CDR será generalmente una cadena pesada o ligera de anticuerpo o una parte de la misma, en la que la CDR se ubica en una ubicación correspondiente a la CDR de V^h y VLque se producen de manera natural. Las estructuras y ubicaciones de dominios variables de inmunoglobulinas pueden determinarse, por ejemplo, tal como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, n.° 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, Md., 1991.

Las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-P2X4 1-48, 208, y 287 a 321, incluyendo sus dominios V^h y V^l se exponen en las figuras y se describen en la presente.

Los anticuerpos anti-P2X4 pueden comprender opcionalmente regiones constantes de anticuerpos o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio V^l puede tener unido, en su extremo C terminal, dominios constantes de cadena ligera de anticuerpos incluyendo cadenas Ck o CA humanas. De manera similar, un dominio de unión a antígeno específico basado en un dominio V^h puede tener unido toda o parte de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de un isotipo de anticuerpo, p. ej., IgG, IgA, IgE e IgM y cualquiera de las subclases de isotipo, que incluyen pero no se limitan a, IgGi e IgG4. Las secuencias de ADN y aminoácidos para el fragmento C-terminal se conocen bien en la técnica (véase, p. ej., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, n.° 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, Md., 1991).

Determinadas realizaciones comprenden un dominio V^h y/o V^l de un fragmento Fv de un anticuerpo frente a P2X4.

En determinadas realizaciones, los dominios V^h y/o V^l pueden volverse de la línea germinal, es decir, las regiones de entramado (FR) de estos dominios se mutan usando técnicas de biología molecular convencionales para que sean iguales a las producidas por células de la línea germinal. En otras realizaciones, las secuencias de entramado siguen siendo divergentes con respecto a las secuencias consenso de la línea germinal.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos se unen específicamente a un epítopo dentro del dominio extracelular de P2X4 humano. En determinadas realizaciones, los anticuerpos se unen específicamente a un epítopo dentro del dominio extracelular de P2X4 humano o de ratón, con una afinidad de más de 106 M-1, más de 107 M-1 o más de 108 M-1.

Se contempla que los anticuerpos de la invención también puedan unirse con otras proteínas, incluyendo, por ejemplo, proteínas recombinantes que comprenden todo o una parte del dominio extracelular de P2X4.

Un experto habitual en la técnica reconocerá que los anticuerpos de esta invención pueden usarse para detectar, medir e inhibir proteínas que difieren algo de P2X4. Se espera que los anticuerpos conserven la especificidad de unión siempre que la proteína diana comprenda una secuencia que es al menos aproximadamente el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, o más idéntica a cualquier secuencia de al menos 100, 80, 60, 40 ó 20 de aminoácidos contiguos de P2X4 (n.° de ref. de NCBI Q99571). El porcentaje de identidad se determina mediante algoritmos de alineación convencionales tales como, por ejemplo, Basic Local Alignment Tool (BLAST) descrito en Altshul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410, el algoritmo de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453, o el algoritmo de Meyers et al. (1988) Comput. . Biosci., 4: 11-17.

Además de los análisis de homología de secuencia, pueden llevarse a cabo mapeo de epítopos (véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols, ed. Morris, Humana Press, 1996) y análisis de estructura secundaria y terciaria para identificar estructuras 3D específicas que asumen los anticuerpos dados a conocer y sus complejos con antígenos. Se proporciona un ejemplo de una estructura 3D de este tipo para el anticuerpo n.° 11. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, cristalografía de rayos X (Engstom (1974) Biochem. Exp. Biol., 11:7-13) y modelado informático de representaciones virtuales de los anticuerpos dados a conocer en el presente documento (Fletterick et al. (1986) Computer Graphics and Molecular Modeling, en Current Communication in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Ácidos nucleicos, clonación y sistemas de expresión

La presente divulgación proporciona la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos dados a conocer. Una vez proporcionada esta información, un experto en la técnica podría obtener fácilmente moléculas de ácido nucleico que codifican para los anticuerpos dados a conocer. Los ácidos nucleicos pueden comprender ADN o ARN y pueden ser completa o parcialmente sintéticos o recombinantes. La referencia a una secuencia de nucleótidos engloba una molécula de ADN con la secuencia especificada, y engloba una molécula de ARN con la secuencia especificada en la que se sustituye T por U, a menos que el contexto requiera otra cosa.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención comprenden una secuencia codificante para una CDR, un dominio V^h y/o un dominio V^l dados a conocer en la presente.

La presente divulgación también proporciona constructos en forma de plásmidos, vectores, fagémidos, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico que codifica para una CDR, un dominio V^h y/o un dominio V^l dados a conocer en la presente.

La divulgación proporciona además una célula huésped que comprende uno o más constructos como anteriormente.

También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican para cualquier CDR (H1, H2, H3, L1, L2 o L3), dominio V^h o V^l, así como métodos de preparación de los productos codificados. El método comprende expresar el producto codificado a partir del ácido nucleico codificante. La expresión puede lograre cultivando en condiciones apropiadas células huésped recombinantes que contienen el ácido nucleico. Tras la producción mediante expresión, puede aislarse o expresarse un dominio V^h o V^l, o miembro de unión específica usando cualquier técnica adecuada, y usarse luego según sea apropiado.

Pueden aislarse y/o purificarse fragmentos de unión a antígeno, dominios V^h y/o V^l y moléculas de ácido nucleico codificante y vectores de su entorno natural, en forma sustancialmente pura u homogénea o, en el caso de ácido nucleico, libre o sustancialmente libre de ácido nucleico o genes de origen distinto de el de la secuencia que codifica para un polipéptido con la función requerida.

Se conocen bien en la técnica sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células huésped. Para células adecuadas para producir anticuerpos, véase Gene Expression Systems, Academic Press, eds. Fernandez et al., 1999. En resumen, las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células vegetales, células de mamífero y sistemas de levaduras y baculovirus. Las líneas celulares de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñón de cría de hámster, células de mieloma de ratón n S0, y muchas otras. Un huésped bacteriano común es E. coli. Puede usarse cualquier sistema de expresión de proteínas compatible con la invención para producir los anticuerpos dados a conocer. Los sistemas de expresión adecuados incluyen animales transgénicos descritos en Gene Expression Systems, Academic Press, eds. Fernandez et al., 1999.

Se pueden escoger o construir vectores adecuados, de modo que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluidas secuencias promotoras, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos o virales, p. ej., fago, o fagémico, según sea apropiado. Para detalles adicionales véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de constructos de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, 2a Edición, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992.

Un aspecto adicional de la divulgación proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico tal como se da a conocer en la presente. Un aspecto todavía adicional proporciona un método que comprende introducir tal ácido nucleico en una célula huésped. La introducción podrá emplear cualquier técnica disponible. Para células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, p. ej., vaccinia o, para células de insecto, baculovirus. Para células bacterianas, las técnicas adecuadas podrán incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección utilizando bacteriófagos. La introducción del ácido nucleico en las células puede seguirse provocando o permitiendo la expresión del ácido nucleico, p. ej., cultivando células huésped en condiciones para la expresión del gen.

Métodos de uso

Los anticuerpos anti-P2X4 dados a conocer pueden modular la actividad electrofisiológica de P2X4. En particular, los anticuerpos proporcionados en la presente pueden usarse para inhibir o potenciar la conductancia de canales P2X4. Tales anticuerpos pueden usarse para tratar trastornos médicos asociados a P2X4 en mamíferos, especialmente, en seres humanos. En particular, los anticuerpos que inhiben la actividad de P2X4 son útiles para el tratamiento de dolor neuropático. Los anticuerpos que potencian la actividad de P2X4 son útiles en otros métodos terapéuticos que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades y trastornos mediados por la microglía y enfermedades y trastornos mediados por macrófagos.

Tal como se demuestra en los ejemplos, la unión de P2X4 con un anticuerpo anti-P2X4 modula la actividad biológica de P2X4 potenciando o reduciendo el paso de iones a través del canal P2X4.

Los anticuerpos o las composiciones de anticuerpos de la presente invención se administran en cantidades terapéuticamente eficaces. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar con la edad , el estado y el sexo del sujeto, así como la gravedad del estado médico del sujeto. La dosis apropiada se elige basándose en las indicaciones clínicas por un médico encargado.

Los anticuerpos pueden administrarse como una dosis de bolo, para maximizar los niveles circulantes de anticuerpos durante la mayor duración de tiempo tras la dosis. También puede usarse infusión continua tras la dosis de bolo.

Composiciones farmacéuticas y métodos de administración

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-P2X4. Es probable que tales composiciones sean adecuadas para uso farmacéutico y administración a pacientes. Las composiciones comprenden normalmente uno o más anticuerpos de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La frase “excipiente farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y agentes antifúngicos, agentes isotónicos y agentes de retardo de la absorción, y similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Las composiciones también pueden contener otros compuestos activos que proporcionan funciones terapéuticas complementarias, adicionales o potenciadas. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluirse en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones para su administración.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los expertos habituales en la técnica conocen métodos para lograr la administración. La administración puede ser, por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidad, subcutánea o transdérmica. En una realización, el dolor neuropático se trata mediante administración intratecal. Puede ser posible obtener composiciones que pueden administrarse por vía tópica o por vía oral, o que pueden transmitirse a través de membranas mucosas.

Las disoluciones o suspensiones usadas para la aplicación intradérmica o subcutánea incluyen normalmente uno o más de los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. Tales preparaciones pueden introducirse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen dispersiones o disoluciones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o disoluciones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado de que exista una fácil jeringabilidad. Deber ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares; polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio en la composición. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y/o mediante el uso de tensioactivos. Puede provocarse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio, y gelatina.

Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden incluirse en cápsulas de gelatina o comprimirse para dar comprimidos. Para administración oral, los anticuerpos pueden combinarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Pueden incluirse agentes de unión farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, las píldoras, las cápsulas, los trociscos, y similares pueden contener cualquiera de los siguientes componentes, o compuestos de una naturaleza similar; un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta verde, salicilato de metilo o aroma de naranja.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan penetrantes apropiados para la barrera que va a permearse en la formulación. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica, e incluyen, por ejemplo, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede lograrse, por ejemplo, a través del uso de pastillas para chupar, pulverizaciones nasales, inhaladores o supositorios. Por ejemplo, en el caso de anticuerpos que comprenden la parte de Fc, las composiciones pueden ser capaces de transmitirse a través de membranas mucosas en el intestino, la boca o los pulmones (p. ej., por medio de la ruta mediada por receptor de FcRn tal como se describe en la patente estadounidense n.° 6.030.613). Para administración transdérmica, los compuestos activos pueden formularse en pomadas, ungüentos, geles o cremas tal como se conoce generalmente en la técnica. Para administración mediante inhalación, los anticuerpos pueden administrarse en forma de una pulverización de aerosol a partir de un dispensador o recipiente a presión, que contiene un propelente adecuado, p. ej., un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos dados a conocer en el presente documento se preparan con portadores que protegerán el compuesto frente a una eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Los polímeros biocompatibles, biodegradables, pueden ser usados, tales como etileno vinil acetato, polianhidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Resultarán evidentes métodos para la preparación de tales formulaciones a los expertos en la técnica. También pueden usarse suspensiones liposómicas que contienen los anticuerpos dados a conocer en el presente documento como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse según métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 4.522.811.

Puede ser ventajoso formular composiciones orales o parenterales en una forma unitaria de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. El término “forma unitaria de dosificación” tal como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que va a tratarse; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido.

La toxicidad y eficacia terapéutica de la composición de la invención puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, p. ej., para determinar la DL⁵⁰ (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE⁵⁰ (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La razón de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la razón DL⁵⁰/DE⁵⁰. Se prefieren composiciones que presentan grandes índices terapéuticos.

Los datos obtenidos a partir de experimentos electrofisiológicos y estudios con animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluye la CI⁵⁰ (es decir, la concentración del anticuerpo que logra la mitad de la inhibición máxima de los síntomas). Los niveles en plasma circulantes pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento. Los efectos de cualquier dosis en particular se pueden monitorizar mediante un bioanálisis apropiado. La dosificación se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada.

Los siguientes ejemplos se facilitan a fin de proporcionarle a los expertos en la técnica divulgación y descripción completas de cómo preparar y utilizar los anticuerpos anti-P2X4 en métodos de ensayo, cribado y terapéuticos de la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Producción y aislamiento de proteínas P2X4 recombinantes

Se diseñaron las proteínas de receptor de purina P2X 4 humano (Q99571), una variante natural del receptor de purina P2X 4 humano con una mutación de S a G en la posición 242 (corresponde a la variante rs25644) y el receptor de purina P2X 4 murino (Q9JJX6) con una etiqueta AVI C-terminal (Avidity LLC) y una etiqueta de histidina C-terminal. Se clonaron los constructos en vectores pFASTBAC1 (Life Technologies). Se generaron bácmidos en células de E. coli DH10Bac (Life Technologies). Posteriormente se transfectaron los bácmidos en células de insecto Sf9 (células Sf9 de Spodoptera frugiperda de Life Technologies, n.° de cat. 11496-015) para la producción de partículas de baculovirus recombinantes, que a su vez se usaron para infectar células Sf9 para la expresión de proteínas.

Se evaluaron los parámetros de expresión monitorizando el nivel de expresión, la calidad de las proteínas y la homogeneidad del receptor usando un método de cromatografía de exclusión molecular con detección de fluorescencia modificado (FSEC) descrito por Backmark et al., (Protein Sci. 22 (2013) 1124-1132). Este método es similar al concepto de FSEC básico descrito por Kawate y Gouaux (Structure 14 (2006) 673-681), pero aplicado a una sonda fluorescente que interacciona específicamente con la etiqueta de histidina en la proteína. Se inocularon normalmente las células a una densidad de 1.0x10e6/ml en medio SF900II. Se infectaron las células con una multiplicidad de infección de 2 a una densidad celular de 2 x 10E6 células/ml. Se realizó la expresión de proteínas a 27°C y se recogieron las células 72 horas tras la infección. Se seleccionaron parámetros de expresión para potenciar la cantidad de trímeros y la homogeneidad de la proteína presente como trímeros. Tal como se somete a ensayo mediante cromatografía de exclusión molecular fluorescente, la preparación de proteína contiene el 50-75% de trímeros. Aunque la cantidad total de receptor aumentó con tiempos tras la infección más prolongados, el análisis de FSEC indicó que la calidad de la proteína disminuía cuando se aumentó el tiempo de expresión más allá de 72 horas.

Se purificaron receptor P2X4 humano y P2X4 de ratón tal como sigue. Se prepararon membranas a partir de células SF9. Se extrajeron proteínas de membrana a partir de las membranas mediante solubilización con detergente, usando combinaciones de detergentes, sales, tampones y aditivos, incluyendo n-dodecil-beta-D-maltósido CAS 69227-93-6 (al 0-2% (p/v)), n-dodeciltio-maltósido CAS 148565-58-6 (al 0-1% (p/v)), sulfonato de (3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propano/hidróxido de N,N-dimetil-3-sulfo-N-[3-[[3a,5p,7a,12a)-3,7,12-trihidroxi-24-oxocolan-24-il]amino]propil]-1-propanaminio abreviado a CHAPS CAS 75621-03-3 (al 0-0,6% (p/v)), y hemisuccinato de colesterilo CAS 102601-49-0 (al 0-0.12% (p/v)). Sin querer restringirse a la teoría, concentraciones superiores de las sustancias indicadas así como detergentes alternativos soportan la extracción de la proteína de las membranas. Las proteínas se sometieron a purificación por cromatografía de exclusión molecular y afinidad convencional. Se formuló la proteína purificada en un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM pH 8.0, NaCl 600 mM, glicerol al 10% (v/v), n-dodecil-beta-D-maltósido al 0.025% (p/v) CAS 69227-93-6, n-dodeciltio-maltósido al 0.0125% (p/v) CAS 148565-58-6, sulfonato de (3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propano/hidróxido de N,N-dimetil-3-sulfo-N-[3-[[3a,5p,7a,12a)-3,7,12-trihidroxi-24-oxocolan-24-il]amino]propil]-1-propanaminio abreviado a CHAPS al 0.0075% (p/v) c As 75621-03-3, y hemisuccinato de colesterilo al 0.0015% (p/v) CAS 102601-49-0.

Se formuló la proteína purificada en condiciones alternativas, incluyendo tampones fosfato y tampones HEPES y tampones ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanosulfónico CAS 7365-45-9. El pH de los diversos tampones ha oscilado entre 7.0-8.0. La sal (NaCl) se ha variado entre 120-600 mM. Puede excluirse el glicerol de la formulación de proteína. Se han usado diversos detergentes en la formulación de proteína, tal como 2,2-didecilpropano-1,3-bis-p-D-maltopiranósidode laurilmaltosaneopentilglicol, 2,2-dioctilpropano-1,3-bis-p-D-maltopiranósido de decilmaltosaneopentilglicol, 2,2-dihexilpropano-1,3-bis-p-D-maltopiranósidode octilmaltosaneopentilglicol, 5-ciclohexil-1-pentil-p-D-maltósido de CYMAL-5 CAS 250692-65-0, n-tetradecilfosfocolina 77733-28-9, n-decil-p-D-maltopiranósido CAS 82494-09-5, n-octil-p-D-glucósido CAS 29836-26-8 y n-nonil-13-D-glucósido CAS 69984-73-2. También son posibles formulaciones en otros detergentes. La concentración de hemisuccinato de colesterilo CAS 102601-49-0 puede variarse y excluirse de la formulación de proteína también.

Ejemplo 2: Purificación de complejos de P2X4 triméricos

In vivo, los receptores P2X forman canales iónicos triméricos funcionales. Las proteínas P2X4 solubilizadas y purificadas están presentes normalmente en una gama de estados oligoméricos, incluyendo monómeros, dímeros, trímeros y hexámeros (es decir, dímeros de trímeros). Esta gama de estados oligoméricos se describe por ejemplo mediante referencias (Backmark et al., Protein Sci. 22 (2013) 1124-1132; Kawate et al., Structure 14 (2006) 673-681; Kawate et al., Nature 460 (2009) 592-598; Nakazawa et al., European Journal of Pharmacology 518 (2005) 107-110; Nicke et al., Mol. Pharmacol. 63 (2003) 243-252). Para obtener una dispersión estable predominantemente trimérica, se ajustaron las condiciones de solubilización.

Se variaron las combinaciones de detergentes, aditivos, tampones y pH. Se seleccionaron condiciones óptimas para aumentar la firma de FSEC del trímero al tiempo que se reducían agregados y disposiciones oligoméricas de mayor orden. Se eluyeron tales formas no deseables del volumen inicial de las columnas de exclusión molecular aplicadas. Las condiciones sometidas a prueba incluyeron KPO4-HCl pH 7.4, NaCl 600 mM y n-dodecil-beta-maltopiranósido al 2% (p/v) CAS 69227-93-6. Se obtuvo una solubilización óptima en tampones que contenían combinaciones de los detergentes incluyendo n-dodecil-beta-D-maltósido CAS 69227-93-6, n-dodeciltio-maltósido CAS 148565-58-6, sulfonato de (3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propano/hidróxido de N,N-dimetil-3-sulfo-N-[3-[[3a,5p,7a,12a)-3,7,12-trihidroxi-24-oxocolan-24-il]amino]propil]-1-propanaminio abreviado a CHAPS CAS 75621-03-3, y el aditivo hemisuccinato de colesterilo CAS 102601-49-0. Se formuló la proteína purificada en un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM pH 8.0, NaCl 600 mM, glicerol al 10% (v/v), n-dodecil-beta-D-maltósido al 0.025% (p/v) CAS 69227-93-6, n-dodeciltio-maltósido al 0.0125% (p/v) CAS 148565-58-6, sulfonato de (3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propano/hidróxido de N,N-dimetil-3-sulfo-N-[3-[[3a,5p,7a,12a)-3,7,12-trihidroxi-24-oxocolan-24-il]amino]propil]-1-propanaminio abreviado a CHAPS al 0.0075% (p/v) CAS 75621-03-3, y hemisuccinato de colesterilo al 0.0015% (p/v) CAS 102601-49-0.

Ejemplo 3: Se aislaron anticuerpos específicos anti-P2X4 usando selección por presentación en fago.

Se usaron para las selecciones bibliotecas de presentación en fago de Fv de cadena sencilla (scFv) humanos sin exposición previa clonados en un vector de fagémido basado en el fago filamentoso M13 (Lloyd (2009) Protein Eng Des Sel 22, 159-168; Vaughan et al., Nature biotechnology 14, 309-314, 1996). Se aislaron anticuerpos específicos anti-P2X4 de las bibliotecas de presentación en fago usando una serie de ciclos de selección en P2X4 humano (hu P2X4) recombinante, esencialmente tal como se describió anteriormente por Vaughan et al (Vaughan et al., citado anteriormente). En resumen, se inmovilizó P2X4 humano en PBS (PBS de Dulbecco, pH 7.4) sobre los pocillos de una placa de microtitulación MaxiSorp® (Nunc) durante la noche a 4°C. Se lavaron los pocillos con PBS, luego se bloquearon durante 1 hora con leche desnatada en polvo PBS-Marvel (al 3% p/v). Se añadieron fagos purificados en PBS-Marvel (al 3% p/v) a los pocillos y se permitió que se unieran al recubrimiento de antígeno durante 1 hora a temperatura ambiente. Se retiró el fago no unido mediante una serie de ciclos de lavado usando PBS. Se eluyeron las partículas de fago unidas con tripsina durante 30 minutos a 37°C, se infectaron en bacterias E.coli TG1 y se rescataron para la siguiente ronda de selección. Alternativamente, se aislaron anticuerpos anti-P2X4 tal como se describió anteriormente excepto por la deselección de la biblioteca de fagos purificados frente al péptido C-terminal huP2X4370-388 (Alomone Labs n.° APR-002) o se realizó cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) con perlas antes de la selección con el antígeno.

Ejemplo 4: Generación de anticuerpos de rata anti-P2X4 murino usando tecnología de hibridoma.

Inm unizaciones

Se usaron proteína P2X4 murina recombinante purificada y células HEK 293F transfectadas con P2X4 murino para inmunizar ratas Sprague Dawley en tres grupos. Para el grupo 1, se inmunizaron las ratas con proteína P2X4 murina; para el grupo 2, se inmunizaron las ratas con células HEK 293F transfectadas con P2X4 murino; y para el grupo 3, se inmunizaron las ratas alternando proteína P2X4 murina y células HEK 293F transfectadas con P2X4 murino.

Se usó un protocolo de inmunización de veintiocho días con una inmunización de sensibilización en el día 0, seguido por cuatro inmunizaciones de refuerzo posteriores en los días 7, 15, 22 y 24. Para el grupo 1, se emulsionaron entre sí volúmenes iguales de adyuvante completo de Freund y proteína P2X4 murina (proteína total: 100 |jg), y se administraron a las ratas por vía subcutánea en dos sitios (200 j l por sitio). Para las tres inyecciones de refuerzo posteriores, se usó la misma cantidad de proteína, emulsionada en adyuvante incompleto de Freund. Para el grupo 2, se resuspendieron células HEK 293F transfectadas con P2X4 murino a 5E7 células por ml en PBS y se emulsionaron con volúmenes iguales de adyuvante completo de Freund. Como anteriormente, se inyectaron las células en ratas en dos sitios (200 j l por sitio). Para las tres inyecciones de refuerzo posteriores, se usó el mismo número de células, emulsionadas en adyuvante incompleto de Freund. Para el grupo 3, la inmunización de sensibilización fue con proteína P2X4 murina como para el grupo 1 anteriormente, seguido por tres inmunizaciones de refuerzo con células HEK 293F transfectadas con P2X4 murino, proteína P2X4 murina y células HEK 293F transfectadas con P2X4 murino.

Los refuerzos finales se administraron por vía intraperitoneal en el día 24, las ratas del grupo 1 y grupo 3 recibieron proteína P2X4 murina (400 j l a 50 jg/m l en tampón Tris), y las ratas del grupo 2 recibieron células HEK 293F transfectadas murinas (400 j l a 5E7/ml).

Se obtuvo sangre de la vena de la cola de las ratas antes de la inmunización, en el día 13 tras la primera inmunización y en el día 20 tras la segunda inmunización. Se determinaron los títulos de IgG frente a anticuerpos anti-P2X4 murino mediante un ensayo DELFIA basado en células (inmunoensayo de fluorescencia de lantánidos potenciado por disociación).

E valuación de la respuesta inm unitaria en ratas a P2X4 m urino usando un ensayo DELFIA basado en células

Se determinaron los títulos de IgG frente a P2X4 murino en sueros mediante un ensayo DELFIA basado en células usando tanto células HEK 293F transfectadas con mP2X4 como células HEK originales. Con el fin de reducir los anticuerpos específicos anti-células HEK 293F en sueros, antes de someterse a ensayo se incubaron con células HEK 293F no transfectadas las muestras de suero de ratas inmunizadas con o bien células solas o bien la estrategia alternante de proteína y células. Se sometieron a ensayo los sueros de ratas inmunizadas con proteína sin esta etapa de adsorción previa.

Se sembraron en placa células HEK 293F transfectadas con P2X4 murino y células HEK originales en medios de cultivo sobre placas de microtitulación de 96 pocillos negras recubiertas con colágeno a una densidad de 30.000 células por pocillo. Tras la incubación durante la noche a 37oC en un incubador con el 5% de CO², se retiró el sobrenadante de cultivo y se fijaron las células con disolución de formaldehído al 3.7% a 50 |jl por pocillo. Se llevaron a cabo todas las incubaciones posteriores a temperatura ambiente. Tras 5 minutos de fijación, se desechó la disolución de formaldehído y se reemplazó por 200 j l de tampón de bloqueo marvel/PBS al 3%. Tras una hora, se retiró el tampón de bloqueo y se añadieron las muestras de suero en una serie de dilución de 3 veces (50 j l por pocillo partiendo de una dilución 1:200). Tras incubar durante una hora, se lavaron los pocillos suavemente tres veces con PBS complementado con Tween 20 al 0.05% (v/v). Se añadió entonces un anticuerpo secundario de cabra policlonal biotinilado específico de Fc gamma anti-IgG de rata (diluido 1:500 en marvel/PBS) a 50 j l por pocillo. Tras una hora adicional de incubación y tres lavados suaves como anteriormente, se añadió estreptadivina marcada con Eu-N1 (Perkin Elmer) a los pocillos (diluida hasta 100 ng/ml en marvel/PBS, 50 j l por pocillo). Tras un tiempo de incubación de 30 minutos, se lavaron suavemente los pocillos cinco veces y se añadió disolución de potenciación de DELFIA. Se permitió que la reacción se desarrollara durante 10 minutos, y entonces se leyó la placa usando un lector de placas multimarcador PerkinElmer EnVision 2103. Se midió la señal de TRF (fluorescencia de resolución temporal) en cada pocillo (excitación 340 nm, emisión 615 nm).

Se representaron gráficamente las curvas de titulación de suero para células HEK 293F transfectadas con P2X4 murino y células HEK 293F originales y se calculó el área bajo las curvas (AUC) respectiva. Para ratas inmunizadas con células HEK 293F transfectadas con P2X4 murino, se derivaron los títulos de IgG frente a mP2X4 específicos restando los valores de AUC de las células HEK originales de los valores de AUC para las células transfectadas con P2X4 murino.

A islam iento de IgG de rata m onoclonal

Cuatro días tras el refuerzo final, se extirparon de manera aséptica ganglios linfáticos y se aislaron las células mediante rotura mecánica y se contaron. Se mezclaron estas células con células de mieloma SP2/0 y se fusionaron usando un aparato de electrofusión. Se mezclaron las fusiones resultantes con un medio semisólido basado en metilcelulosa y se sembraron en placa en placas OmniTray. El medio semisólido comprendía CloneMatrix y DMEM complementados con FCS al 20%, BM Condimed H1 al 10%, piruvato de sodio 1 mM y complemento de medio OPI, hipoxantina-azaserina al 2% y anticuerpo de cabra anti-IgG de rata conjugado con FITC. Se cultivaron las células en el medio semisólido durante 13 días a 37oC en un incubador con el 5% de CO². Durante este periodo de incubación, se forman colonias clonales a partir de una única célula de hibridoma progenitora. Estas colonias secretan IgG que se atrapa en las proximidades de la colonia por el anticuerpo anti-IgG conjugado con FITC presente en el medio semisólido. Puede observarse la formación de complejos inmunitarios resultantes alrededor de la célula como un 'halo' fluorescente cuando se visualiza mediante el instrumento recolector de colonias ClonePix FL (Molecular Devices). Entonces se recogen estas colonias con halo en placas de microtitulación de 96 pocillos.

Tras 3-5 días en cultivo, se cosecharon los sobrenadantes de las colonias recogidas y se examinaron para determinar la especificidad de P2X4 murino comparando la unión a células HEK 293F transfectadas con P2X4 murino y células HEK 293F originales mediante un ensayo de tecnología de ensayo fluorométrico de microvolumen basado en células (FMAT).

S ecuenciación de A D N de IgG de rata

Se extrajo el ARN mensajero (ARNm) de células usando partículas de oligo (dT) magnéticas y se convirtió en ADNc. Se realizó la amplificación por PCR usando poli-C y cebadores de VH/VL de región constante.

P urificaciones de IgG de rata

Antes de la purificación, se sometieron a prueba los hibridomas mediante ELISA usando una placa de microtitulación recubierta con anticuerpo de cabra anti-IgG2a de rata para determinar qué clones secretaban IgG2a de rata, ya que este isotipo se purifica usando una matriz de purificación diferente de los isotipos IgG1, IgG2b e IgG2c de rata.

Se propagaron las células en placas de 24 pocillos y se hicieron crecer en exceso en medio HL-1 libre de suero complementado con HiperZero y glutamina. Tras 10 días, se transfirieron los sobrenadantes a bloques maestros de 96 pocillos y se purificaron los isotipos IgG1, IgG2b e IgG2c de rata en Phytips de 20 |jl que contenía resina ProPlus (Phynexus). Se purificaron anticuerpos IgG2a de rata en Phytips empaquetada a medida que contenía resina con múltiples especies de IgG-Fc CaptureSelect (Lift Technologies) usando el instruemnto Perkin Elmer Minitrack. Se eluyeron las IgG de rata capturadas con 75 |jl de HEPES 100 mM, NaCl 140 mM pH 3.0 luego se neutralizaron con un volumen igual de HEPES 200 mM pH 8.0. Se cuantificaron las IgG purificadas usando una lectura de absorbancia a 280 nm en una placa de 384 pocillos UV-Star.

Reform ación de IgG de rata a IgG1 hum ana

Se reformaron molecularmente clones de IgG de hibridoma de rata para generar constructos quiméricos que expresan dominios VH y VL de rata y dominios constantes de IgG1 humana esencialmente tal como se describe por Persic et al., 1997 (Gene 187, 9-18) con las siguientes modificaciones. Se incluyó un fragmento de OriP en los vectores de expresión para facilitar el uso con células transitorias CHO y para permitir la replicación episomal. Se clonó el dominio VH en un vector (pEU1.4) que contenía los dominios constantes de cadena pesada humana y elementos reguladores para expresar la cadena pesada de IgG1 completa en células de mamífero. Esta región constante contenía las mutaciones triples (TM) L234F/L235E/P331S que dan como resultado una IgG1 humana efectora nula (Oganesyan et al.,(2008) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 700-704). De manera similar, se clonó el dominio VL en un vector (pEU4.4) para la expresión de los dominios constantes de cadena ligera humana (lambda) y elementos reguladores para expresar la cadena ligera de IgG completa en células de mamífero. Para obtener IgG, se transfectaron los vectores que expresan IgG de cadena pesada y ligera en células de mamífero transitorias CHO. Se expresaron las IgG y se secretaron al medio. Se filtraron las cosechas antes de la purificación, luego se purificó IgG usando cromatografía de proteína A. Se cargaron los sobrenadantes de cultivo en una columna de tamaño apropiado de Ceramic Protein A (Pall 20078-036) y se lavaron con Tris-HCl 50 mM pH 8.0, NaCl 250 mM. Se eluyó la IgG unida de la columna utilizando citrato de sodio 0.1 M (pH 3.0) y se neutralizó mediante la adición de Tris-HCl (pH 9.0). Se intercambió el tampón del material eluido a PBS usando columnas Nap10 (GE Lifesciences 17-0854-02) y se determinó la concentración de IgG espectrofotométricamente usando un coeficiente de extinción basado en la secuencia de aminoácidos de la IgG (Pace et al., (1995) Protein Sci. 4, 2411-23). Se analizaron las IgG purificadas para determinar la pureza usando SDS-PAGE.

Ejemplo 5: Identificación de anticuerpos que se unen a P2X4 humano a partir de selecciones de presentación en fago.

Se expresaron en bacterias anticuerpos de ScFv identificados a partir del método de presentación en fago descrito en el ejemplo 3 y se examinaron como extractos periplásmicos bacterianos no purificados (que contenían scFv), preparados en: Tampón HEPES 0.2 M pH7.4, EDTA 0.5 mM y sacarosa 0.5 M. Alternativamente, se amplificaron las regiones variables de cadena pesada y ligera mediante PCR y se clonaron en un vector para su expresión como anticuerpos IgG1 humanos en células HEK293F.

Para el examen de muestras de scFv bacterianas, se añadieron 5 |jl de extracto bacteriano a una placa de ensayo de 384 pocillos (Corning 3655). Se preparó el tampón de ensayo tal como sigue: 1X disolución salina equilibrada de Hanks (HBSS) (Sigma H8264), BSA al 0.1% (v/v) (PAA K05-013), HEPES 20 mM (Gibco 15630) y Apyrase 1 U/ml (Sigma A6535) y se añadieron 5 j l a la placa de ensayo con el extracto de scFv bacteriano. Se diluyeron reactivo de detección anti-myc (Serotec MCA2200) y anticuerpo anti-ratón Dilight649 (Jackson Immuno Research Labs 115-495-071) en tampón de ensayo hasta 15.6 nM y 24 nM respectivamente en la misma disolución y se añadieron 5 j l a la placa de ensayo con la muestra de scFv. Se diluyeron células HEK293F que expresan P2X4 humano (huP2X4) (Q99571, ENSP00000336607) hasta 2.6e5 células/ml en tampón de ensayo y se añadieron 15 j l a la placa de ensayo. En paralelo también se sometieron a prueba muestras de scFv para determinar la unión a células HEK293F que no expresaban huP2X4.

Para el examen de las muestras de IgG expresadas en HEK293F, se añadieron 2.5 j l de sobrenadante de cultivo celular a la placa de ensayo de 384 pocillos (Corning 3655). Se preparó tampón de ensayo tal como se describió anteriormente y se añadieron 7.5 j l a la placa de ensayo con la muestra de IgG. Se diluyó anticuerpo anti-ser humano AlexaFluor 647 (Life Technologies A21445) en tampón de ensayo hasta 6 nM y se añadieron 10 j l a la placa de ensayo con la muestra de IgG. Se diluyeron células HEK293F que expresan huP2X4 (Q99571, ENSP00000336607) hasta 4e5células/ml en tampón de ensayo y se añadieron 10 j l a la placa de ensayo. En paralelo también se sometieron a prueba muestras de IgG para determinar la unión a células HEK293F que no expresaban huP2X4. Se sellaron placas de ensayo dispuestas para examinar ambos tipos de muestras con un sellante de placas Topseal (Perkin Elmer 6005250) y se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 4 horas antes de la lectura en una tecnología de ensayo de microvolumen de fluorescencia (FMAT), una plataforma basada en fluorescencia que detecta la fluorescencia localizada en perlas o células sedimentadas en el fondo de un micropocillo (Dietz et al., Cytometry 23:177-186 (1996), Miraglia et al., J. Biomol. Screening 4:193-204 (1999)). Se analizaron los datos usando el software de análisis de FMAT y se separaron los acontecimientos basándose en fluorescencia de 0-10.000 recuentos de FL1, color normalmente de 0.15 a 0.40 y tamaño de 10-60. Se fijó un recuento mínimo de 20 acontecimientos como umbral antes de notificar los datos para cada pocillo. Se seleccionaron ScFv que mostraban unión a las células HEK293F huP2X4, pero no a las células HEK293F control para pruebas adicionales si el recuento de FL1 estaba por encima de 1000 en las células huP2X4, se identificaron muestras de IgG que mostraban una señal de unión a huP2X4 específica de más de 200 recuentos de FL1 como aciertos y se caracterizaron adicionalmente.

Se sometieron muestras de ScFv o IgG que mostraban una señal de unión específica a células HEK293F huP2X4 como muestras no purificadas a secuenciación de ADN (Vaughan et al. Citado anteriormente, Nature Biotechnology 14: 309­ 314), (Osbourn 1996; Immunotechnology. 2, 181-196). Se expresaron scFv únicos en bacterias y se purificaron mediante cromatografía de afinidad (tal como se describe por Bannister et al (2006) Biotechnology and bioengineering, 94. 931­ 937). Los scFv que confirmaban la unión a P2X4 humano se generaron como IgG completas y se expresaron y purificaron tal como se describió en el ejemplo 4. Se sometieron a prueba anticuerpos IgG purificados para determinar la actividad funcional en el ensayo de electrofisiología y para detectar la unión a células que expresan P2X4 de ratón y mono cynomolgus usando el mismo método descrito para las células con P2X4 humano descritas anteriormente excepto porque se usó una titulación de la muestra de IgG purificada. Los resultados de los ensayos de electrofisiología se proporcionan en las figuras 3 y 4.

Ejemplo 6: Identificación de IgG de hibridoma que se unen específicamente a P2X4 murino

Se examinaron sobrenadantes generados a partir de las inmunizaciones para identificar IgG con unión específica a mP2X4. En resumen, se diluyeron los sobrenadantes 10 veces en tampón de ensayo (HBSS, BSA al 0.1% (v/v), HEPES 20 mM y Apyrase 1 U/ml) y se añadieron 5 |jl a la placa de ensayo. Se diluyó anticuerpo de detección anti-rata marcado con Alexa Fluor 647 (Jackson Immuno Research labs) hasta 6 nM y se añadieron 10 j l a la placa de ensayo. Se diluyeron células HEK293F que expresan mP2X4 hasta 2.6e5/ml y se añadieron 15 j l a la placa de ensayo. También se sometieron a prueba muestras de IgG para determinar la unión no específica en paralelo sometiendo a prueba las muestras para determinar la unión a células HEK293F. Se identificaron como aciertos IgG que demostraban unión específica a mP2X4 y ausencia de unión a células HEK293F y se seleccionaron para la purificación de anticuerpos y el análisis mediante electrofisiología. En la figura 7 se proporcionan los resultados del examen de electrofisiología junto con los resultados de unión para estas muestras frente a líneas celulares que expresan P2X4 de ser humano y mono cynomolgus usando el mismo ensayo descrito anteriormente.

Ejemplo 7: Generación de variantes de P2X4 humano y expresión mediante transfección transitoria en células HEK293F

Para determinar el epítopo al que se unen los anticuerpos funcionales frente a P2X4, se generaron las siguientes mutaciones en P2X4 humano; E95Q, V105M, G114D, A122V, S131N, A151P, G154R, L303P, N306K. Se generaron vectores de ADN que contenían secuencias de huP2X4 con estos cambios usando técnicas de biología molecular convencionales. Se transfectaron vectores de ADN en células HEK293F usando 293-fectin (Life Technologies 12347019) siguiendo las directrices de los fabricantes. Se incubaron células que expresan las variantes de huP2X4 con los anticuerpos n.os 1, 11, 29 y 33 junto con el reactivo de detección de anticuerpo anti-ser humano AlexaFluor 647 (Life Technologies A21445). Se midió la unión usando el lector de placas de FMAT. Se mostró que la variante S131N era importante para la unión de los anticuerpos n.os 11, 29 y 33. Las figuras 1A-1D muestran los resultados de ensayos de FMAT que caracterizan la unión de anticuerpos frente a P2X4 a células HEK293F que expresan variantes de P2X4 humano.

Ejemplo 8: Caracterización electrofisiológica de anticuerpos monoclonales frente aP2X4.

M étodos p ara A cM derivados de presentación en fago:- F iguras 3 y 4

Se cosecharon células HEK 293F que expresan de manera estable P2X4 humano, P2X4 de ratón o P2X4 de mono cynomolgus al 50% de confluencia usando Accutase. Entonces se resuspendieron las células en 10 ml de medio Freestyle 293F complementado con HEPES (10 mM) Apyrase (1 U/ml, actividad ATPasa/ADPasa = 1) a una densidad de 2-3e6 células/ml. Se sometió a ensayo la función de P2X4 usando la plataforma de electrofisiología automatizada QPatch 16X (Sophion) en configuración de registro de población. La composición del tampón extracelular QPatch (QEB) era (en mM) NaCl (140), KCl (2), MgCh (1) CaCl² (2), HEPES (10). La composición final del tampón extracelular de la placa de compuestos (CPEB1) era NaCl (137.6), KCl (2.2), MgCh (0.66), CaCl² (1.3), HEPES (6.6), KH²PO⁴ (0.49), NaH2PO4 (2.66). Se ajustó el pH de los tampones extracelulares a 7.4 con NaOH (1 M), se ajustó la osmolaridad a 300 mOsm con sacarosa y se filtraron las disoluciones a través de 0.2 jm . Se complementó el tampón extracelular de la placa de compuestos con albúmina sérica bovina al 0.1%. El tampón intracelular QPatch contenía (en mM) CsF (140), NaCl (10), EGTA (1), HEPES (10). Se ajustó el pH del tampón intracelular a 7.3 con CsOH (1 M) y se filtró la disolución a través de 0.2 jm . Se titularon las IgG a pH 7.4 con NaOH (1 M).

Tras obtener la configuración de célula completa, se sometieron las células a fijación de voltaje a -50 mV empleándose una compensación de resistencia de serie del 70%. Se aplicó el agonista de ligando sal de disodio de adenosina 5-trifosfato (ATP, 3 jM ) en CPEB1 durante 3 segundos cada 5 minutos durante 20 minutos dando como resultado 4 respuestas de agonista control. Se eliminó por lavado cada agonista con CPEB1 Apyrase (1 U/ml). Entonces se midieron 4 respuestas de agonista adicionales cada 5 minutos en presencia continua de la IgG de prueba o una IgG control de isotipo (NIP 228). En la figura 8A pueden observarse trazos a modo de ejemplo que muestran el efecto de IgG inhibidoras 5 min tras la aplicación de IgG mientras que en la figura 8D puede observarse un ejemplo de una IgG de potenciación. Se realizó la sustracción de fugas de los datos de electrofisiología presentados en la figura 3 y la figura 4 sustrayendo la corriente en ausencia de ligando y la magnitud de la respuesta de P2X4 medida como la corriente de entrada pico en presencia de ligando. Se expresó la corriente de entrada pico en presencia de IgG+ATP tras 5 minutos de incubación de IgG como una fracción de la 4a respuesta de ATP control. Posteriormente se normalizaron los datos a una respuesta de anticuerpo control de isotipo de tiempo y concentración coincidentes usando la ecuación Inorm = IIgG*(1/Iisotipo) en la que hgG = fracción de corriente control para la IgG de prueba e Iisotipo = fracción de corriente control para la IgG control de isotipo. Se encontraron seis IgG que inhibían significativamente las corrientes de P2X4 humano; anticuerpos n.os 5, 8, 11, 18, 29 y 33 (figuras 3, 4, 8A). La inhibición de las corrientes de P2X4 era rápida, produciéndose en el primer punto de tiempo tras la adición de IgG, mientras que la IgG control de isotipo NIP 228 no tenía ningún efecto significativo. Se sometieron a prueba posteriormente las IgG para determinar la función frente a P2X4 de ratón y mono cynomolgus (figuras 3, 4) y se notificaron los datos como una media de n = 3-4 experimentos.

En la figura 2 se proporcionan las secuencias para anticuerpos de presentación en fago. En la figura 3 se proporcionan los resultados de reactividad cruzada para anticuerpos de presentación en fago entre ser humano, mono cynomolgus y ratón. La figura 9 proporciona un análisis estructural de la superficie de contacto epítopo/parátopo. La figura 10 proporciona la secuencia del epítopo de P2X4 predicho.

M étodos para A cM derivados de h ibridom a.- F iguras 5, 7 y 8

Se cosecharon células HEK 293F que expresan de manera estable o bien P2X4 de ratón (Uniprot n.° Q9JJX6) o bien P2X4 humano (Uniprot n.° Q99571) al 50% de confluencia usando Accutase. Entonces se resuspendieron las células en 10 ml de medio Freestyle 293F complementado con HEPES (10 mM) Apyrase (1 U/ml, actividad ATPasa/ADPasa = 1) a una densidad de 2-3e6 células/ml. Se sometió a ensayo la función de P2X4 usando la plataforma de electrofisiología automatizada QPatch 16X (Sophion) en configuración de registro de población. La composición del tampón extracelular QPatch (QEB) era (en mM) NaCl (140), KCl (2), MgCh (1) CaCh (2), HEPES (10). La composición final del tampón extracelular de la placa de compuestos (CPEB2) era NaCl (115.5), KCl (1.3), MgCh (0.66), CaCh (1.32), HEPES (56.1). Se ajustó el pH de los tampones extracelulares a 7.4 con NaOH (1 M) y se filtraron las disoluciones a través de 0.2 |jm. El tampón intracelular QPatch contenía (en mM) CsF (140), NaCl (10), EGTA (1), HEPES (10). Se ajustó el pH del tampón intracelular a 7.3 con CsOH (1 M) y se filtró la disolución a través de 0.2 jm . Se titularon las IgG a pH 7.4 con NaOH (1 M). Tras obtener la configuración de célula completa, se sometieron las células a fijación de voltaje a -50 mV empleándose una compensación de resistencia de serie del 70%. Se aplicó el agonista de ligando sal de disodio de adenosina 5'-trifosfato (ATP) (6 jM para P2X4 de ratón, 3 jM para P2X4 humano) en QEB durante 3 segundos, luego se eliminó por lavado con QEB Apyrase (1 U/ml). Entonces se incubó CPEB2 IgG durante 3 minutos seguido por una segunda adición de ATP. Se realizó la sustracción de fugas de los datos sustrayendo la corriente en ausencia de ligando y la magnitud de la respuesta de P2X4 medida como la corriente de entrada pico en presencia de ligando. Se expresó la respuesta de ATP tras la adición de IgG como una fracción de la respuesta de ATP antes de la adición de IgG. Se usó la hIgG1 NIP 228 TM como anticuerpo control para determinar el punto de corte para la definición de anticuerpos funcionales. Se examinaron inicialmente las IgG por duplicado (figura 5, primer examen y figura 7) en mP2X4 y se expresaron como media de n = 1-2 experimentos. El anticuerpo control NIP 228 TM tenía una fracción de la corriente control de 1.08 /-0.27 (media /- D.E.), n = 49. A partir de estos datos, se fijó el punto de corte para la definición de anticuerpos inhibidores funcionales a <0.5 (>~ 2 desviaciones estándar con respecto a la media). Se repitieron los anticuerpos funcionales del primer examen con un conjunto de muestra mayor (n = 3-4) y se notificaron los datos como media /- D.E. (figura 5).

En las figuras 5 y 7 se proporcionan los resultados de la reactividad cruzada para anticuerpos de hibridoma entre ser humano y ratón. En las figuras 6 y 13 se proporcionan las secuencias para los anticuerpos de hibridoma.

Ejemplo 9: Pruebas in vivo de anticuerpos monoclonales frente a P2X4 en modelo de Seltzer de dolor neuropático

Se usaron 50 ratones C57BL/6 hembra para los estudios. Se sometieron todos los ratones a inserción de transpondedores para fines de identificación al menos 5 días antes del comienzo de estudio. Se determinó la hiperalgesia mecánica usando un analgesímetro (Randall & Selitto 1957) (Ugo Basile). Se aplicó una fuerza creciente a la superficie dorsal de cada extremidad trasera por turno hasta que se observó una respuesta de retirada. Se detuvo la aplicación de fuerza en este punto y se registró el peso en gramos. Se expresaron los datos como umbral de retirada en gramos para las extremidades ipsilateral y contralateral. Tras el establecimiento de lecturas de nivel inicial, se dividieron los ratones en 2 grupos con razones ipsilateral/contralateral aproximadamente iguales que se sometieron a cirugía para ligar parcialmente el nervio ciático o sirvieron como controles operados de manera simulada. Se anestesiaron los ratones operados con isoflurano. Tras esto, se expuso aproximadamente 1 cm del nervio ciático izquierdo mediante disección roma a través de una incisión al nivel del muslo medio. Entonces se hizo pasar una sutura (9/0 Virgin Silk: Eticon) a través del tercer nervio dorsal y se ató firmemente. Entonces se cerró la incisión usando pegamento y se permitió que los ratones se recuperaran durante al menos seis días antes del comienzo de las pruebas. Se sometieron los ratones operados de manera simulada al mismo protocolo pero tras la exposición del nervio se suturaron los ratones y se permitió que se recuperaran.

Se sometieron a prueba los ratones para determinar el comienzo de la hiperalgesia en los días 7 y 10 tras la cirugía. Cualquier ratón que mostrara una razón ipsilateral/contralateral de más del 80% se clasificó como que no respondía y se retiró del estudio. Tras las pruebas en el día 10, se subdividieron adicionalmente los ratones en grupos dando los grupos de tratamiento finales;

A. Grupo 1: Operado de manera simulada NIP 228 TM 5 jg por ratón por vía intratecal (N=10)

B. Grupo 2: Nervio ligado NIP 228 TM 5 jg por ratón por vía intratecal (N=10)

C. Grupo 3: Nervio ligado anticuerpo n.° 2085 jg por ratón por vía intratecal (N=10)

D. Grupo 4: Nervio ligado anticuerpo n.° 385 jg por ratón por vía intratecal (N=10)

Se les administró a los ratones NIP 228 TM (control de isotipo) o moléculas de prueba en el día 13 y volvieron a someterse a prueba para detectar cambios en hiperalgesia mecánica a las 4 h tras la dosis y también en los días 1, 2, 4 y 7 tras la dosis. Para la dosificación, se anestesiaron los ratones con isoflurano. Se llevó a cabo la administración intratecal de NIP 228 TM manualmente en la zona L4-L6 de la médula espinal y se suministraron todos los compuestos de prueba como 1.02 mg/ml = disoluciones =1 |jg por |jl = 5 |jg por ratón.

Se tomaron lecturas ipsilaterales y contralaterales para cada animal a cada tiempo de prueba y se introdujeron en EXCEL para el cálculo de las razones ipsilateral/contralateral. Se transfirieron los datos de resumen a PRISM para el análisis gráfico y estadístico. Se analizaron los resultados usando ANOVA de dos vías. Se realizaron comparaciones por parejas cuando era apropiado usando la prueba de Tukey.

El análisis de los resultados mostró que la ligación parcial del nervio ciático provocó una hiperalgesia mecánica que se manifestó como una reducción significativa en la razón ipsilateral/contralateral en el día 7 y 10 en comparación con los controles operados de manera simulada. Tras el tratamiento con NIP228, los ratones operados no mostraron ningún cambio en el nivel de hiperalgesia mecánica con respecto a los niveles antes de la dosis, lo que indica una falta de efecto del control de isotipo sobre la hiperalgesia mecánica. La administración del anticuerpo n.° 208 produjo una reversión significativa durante hasta 4 días tras la dosis después de lo cual la respuesta regresó a los niveles iniciales. Se observaron efectos similares con el anticuerpo n.° 38 (figura 13).

Ejemplo 10: Generación de anticuerpos de ratón anti-P2X4 humano mediante tecnología de hibridoma

Se llevaron a cabo métodos para la generación de anticuerpos de ratón anti-P2X4 humano del mismo modo que se describió en la sección anterior de generación de anticuerpos de rata anti-P2X4 murino, excepto las siguientes diferencias:

Inm unizaciones

Se usaron células HEK 293F y XS63 transfectadas con P2X4 humano (hP2X4) para inmunizar ratones CD1 en tres grupos. En el grupo 1, se inmunizaron los ratones con células HEK 293F transfectadas con hP2X4, se inmunizaron los ratones del grupo 2 con células XS63 transfectadas con hP2X4, y se inmunizaron los ratones del grupo 3 alternando células XS63 transfectadas con hP2X4 y células HEK 293F transfectadas con hP2X4.

Se resuspendieron las células transfectadas con hP2X4 a 1 E8/ml y se emulsionaron con volúmenes iguales de adyuvante completo de Freund, y se inyectaron en los ratones en dos sitio, 100 |jl por sitio. Para las 3 inyecciones posteriores, se emulsionó el mismo número de células en adyuvante incompleto de Freund y se realizaron las inyecciones como anteriormente. Se llevó a cabo el último refuerzo en el día 24, inyectando 200 j l de células transfectadas a 1E8/ml por vía intraperitoneal.

Evaluación de la respuesta inm unitaria en ratones a hP2X4 usando un ensayo DELFIA basado en células

Se determinaron los títulos de IgG en suero frente a hP2X4 mediante ensayos de fluorescencia de resolución temporal basados en células (DELFIA) usando células HEK 293F originales y células HEK 293F transfectadas con hP2X4.

A islam iento de IgG de ratón m onoclonal

Se fusionaron células linfoides aisladas de los bazos y ganglios linfáticos con células de mieloma SP2/0 usando un método de electrofusión. Se sembraron en placa las fusiones en medio de selección semisólido que contenía anticuerpos de cabra anti-IgG de ratón conjugado con FITC.

Ensayo de unión celu lar para IgG de ratón

Se examinaron inicialmente los sobrenadantes para detectar IgG que se unían específicamente a hP2X4 usando tanto las células HEK 293F como las XS63 que expresan hP2X4, y células HEK 293F originales. Se seleccionaron las IgG que mostraban unión específica a hP2X4, y ausencia de unión a células HEK293F originales, para pruebas de especificidad adicionales en células HEK 293F con P2X4 de ratón (mP2X4). Se seleccionaron IgG que se unían específicamente a hP2X4 o a tanto hP2X4 como mP2X4 para análisis funcionales y de purificación de anticuerpos mediante electrofisiología.

S ecuenciación de A D N y purificación de IgG de ratón

Se extrajo el ARN mensajero (ARNm) de células de hibridoma usando partículas de oligo (dT) magnéticas y se transcribió de manera inversa para dar ADNc. Se realizó amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores de VH o Vl de poli-C y regiones constantes para todas las subclases de IgG de ratón.

Se purificaron IgG de ratón de todas las subclases (IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3) a partir de los sobrenadantes de cultivo celular hechos crecer en exceso sobre resina ProPlus (Phynexus).

E xam en funcional m ediante electrofisio logía

Se cosecharon células HEK 293F que expresan de manera estable P2X4 humano (Uniprot n.° Q99571) al 50% de confluencia usando Accutase. Entonces se resuspendieron las células en 10 ml de medio Freestyle 293F complementado con HEPES (10 mM) Apyrase (1 U/ml, actividad ATPasa/ADPasa = 1) a una densidad de 2-3e6 células/ml. Se sometió a ensayo la función de P2X4 usando la plataforma de electrofisiología automatizada QPatch 16X (Sophion) en configuración de registro de población. La composición del tampón extracelular QPatch (QEB) era (en mM) NaCl (140), KCl (2), MgCl² (1) CaCl² (2), He PES (10). La composición final del tampón extracelular de la placa de compuestos (CPEB2) era NaCl (115.5), KCl (1.3), MgCh (0.66), CaCh (132), HEPES (56.1). Se ajustó el pH de los tampones extracelulares a 7.4 con NaOH (1 M) y se filtraron las disoluciones a través de 0.2 |jm. El tampón intracelular QPatch contenía (en mM) CsF (140), NaCl (10), EGTA (1), HEPES (10). Se ajustó el pH del tampón intracelular a 7.3 con CsOH (1 M) y se filtró la disolución a través de 0.2 jm . Se titularon las IgG a pH 7.4 con NaOH (1 M). Tras obtener la configuración de célula completa, se sometieron las células a fijación de voltaje a -50 mV empleándose una compensación de resistencia de serie del 70%. Se aplicó el agonista de ligando sal de disodio de adenosina 5'-trifosfato (ATP, 3 jM ) en QEB durante 3 segundos, luego se eliminó por lavado con QEB apyrase (1 U/ml). Entonces se incubó CPEB2 IgG durante 3 minutos seguido por una segunda adición de ATP. Se realizó la sustracción de fugas de los datos sustrayendo la corriente en ausencia de ligando y la magnitud de la respuesta de P2X4 medida como la corriente de entrada pico en presencia de ligando. Se expresó la respuesta de ATP tras la adición de IgG como una fracción de la respuesta de ATP antes de la adición de IgG. Se usó la hIgG1 NIP 228 TM como anticuerpo control para determinar el punto de corte para la definición de anticuerpos funcionales. En la figura 23 se proporcionan los resultados. En la figura 13 se proporcionan secuencias de anticuerpos.

Ejemplo 11: Maduración por afinidad del anticuerpo 11

Se optimizó el anticuerpo n.° 11 por afinidad por medio de dos enfoques cualquiera; mutagénesis al azar o dirigida seguido por selecciones de presentación en fago basadas en afinidad. En el enfoque dirigido, se crearon bibliotecas de scFv-fagos grandes derivadas del clon líder mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótidos de las regiones determinantes de complementariedad 3 (CDR3) de cadena pesada variable y CDR3 de cadena ligera (VL) usando técnicas de biología molecular convencionales tal como se describe (Clackson, T. y Lowman, H.B. Phage Display - A Practical Approach, 2004. Oxford University Press). Se sometieron las bibliotecas a selecciones de presentación en fago basadas en afinidad con el fin de seleccionar variantes con afinidad superior por P2X4 humano. Se realizaron las selecciones esencialmente tal como se describió anteriormente en el ejemplo 3 con la excepción de la reducción de la concentración de P2X4 humano inmovilizado a lo largo de cuatro rondas de selección (10 |jg/ml-1.25 |jg/ml). Se identificaron anticuerpos con afinidad mejorada en un ensayo de competición basado en la unión del anticuerpo 11 a células que expresan huP2X4 (descrito en el ejemplo 12). Para generar una mejora de afinidad adicional, se recombinaron mutaciones de CDR de anticuerpos mejorados en nuevos scFv usando técnicas de biología molecular convencionales.

También se optimizó el anticuerpo 11 usando un enfoque de mutagénesis al azar para identificar residuos clave dentro de todo el dominio variable que pueden mejorar la unión a P2X4 humano. Se describe una técnica de este tipo por Gram et al. [Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580], que usaron PCR propensa a errores. En algunas realizaciones se realizan uno o dos sustituciones de aminoácidos dentro de la totalidad de un dominio variable o un conjunto de CDR. Se sometió la biblioteca generada a selecciones basadas en afinidad tal como se describió para las selecciones dirigidas explicadas de manera resumida anteriormente.

Se dan a conocer anticuerpos a modo de ejemplo a partir de este método de selección en la presente como anticuerpos 287 a 315, y en la figura 12 se muestra una alineación de sus secuencias.

Ejemplo 12: Identificación de anticuerpos de afinidad superior frente a P2X4 humano

Se examinaron los resultados de la selección de presentación en fago descritos en el ejemplo 11 para determinar la actividad en un ensayo de competición basado en la unión del anticuerpo 11 a células que expresan huP2X4. En resumen, se marcó la IgG de anticuerpo 11 con Dylight ® 650 usando un kit de conjugación Lightning-Link® Rapid Dylight ® 650 siguiendo las instrucciones del fabricante (Innova Biosciences Ltd). Se recogieron scFv expresados de manera bacteriana en tampón HEPES 0.2 M pH 7.4, EDTA 0.5 mM y sacarosa 0.5 M como extractos periplásmicos y se añadieron a la placa de ensayo (Corning ® 3655) junto con tampón de ensayo (HBSS, BSA al 0.1%, apyrase 1 U/ml, o bien con o bien sin HEPES 20 mM). Se añadió el anticuerpo 11 -Dylight® 650 a cada pocillo excepto los pocillos usados para definir la unión de fondo, hasta una concentración final de 2 nM. Se añadieron células HEK293F huP2X4 a cada pocillo a una densidad final de aproximadamente 2000 células por pocillo. Se cubrieron las placas y se incubaron a temperatura ambiente durante de 2 a 3 horas antes de la lectura en un lector de placas mirrorball® (TTP Labtech, Ltd) y la determinación de la fluorescencia de FL3 total por pocillo (mediana de fluorescencia (intensidad media) multiplicada por el número de objetos). Se separaron acontecimientos individuales por tamaño y fluorescencia y se usó un número de objetos mínimo de más de 25 para determinar los pocillos con suficientes acontecimientos para notificar un valor total de FL3. Se calculó el % de unión específica para cada pocillo usando la siguiente ecuación, se definieron los valores totales de FL3 máximos a partir de los pocillos que no recibieron ningún scFv pero que recibieron tampón de muestra periplásmica:

FL3 de muestra total — FL3 de fondo total

% de unión específica =

FL3 máximo total — FL3 de fondo total ^X100

Se seleccionaron muestras en las que la señal de unión era inferior al 85% de la unión específica para la secuenciación y se generaron aciertos únicos de secuencia como scFv purificado.

Para confirmar la inhibición de estos anticuerpos de scFv, se diluyeron anticuerpos de scFv purificados en tampón de ensayo descrito anteriormente para generar una serie de dilución y se añadieron las muestras diluidas a la placa de ensayo antes de la adición de anticuerpo 11-Dylight® 650 hasta una concentración final de 2 nM, seguido por aproximadamente 2000 células HEK293F huP2X4 por pocillo. Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante de 2 a 3 horas antes de leerse en el lector de placas mirrorball®. Se analizaron los datos tal como se describió anteriormente y se generaron clones de scFv que muestran inhibición como anticuerpos IgG completos.

Ejemplo 13: Identificación de anticuerpos con potencia mejorada frente a P2X4 humano usando el ensayo FLIPR® de línea celular 1321N1 con P2X4 humano

Se generaron los anticuerpos identificados en el ensayo de competición del anticuerpo 11 descrito en el ejemplo 12 como IgG purificada y se titularon para generar una serie de dilución. Se diluyeron estos anticuerpos en tampón de ensayo que contenía HBSS y BSA al 0.1% y se preincubaron con células 1321N1 que expresan huP2X4 durante 30 min en donde las células se habían cargado previamente con colorante de calcio Fluo-4 NW (Molecular ProbesTM, Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se activó P2X4 mediante la adición de ATP 1 |jM diluido en tampón de ensayo y se detectó la elevación resultante en el calcio intracelular mediante el colorante de calcio y se midió mediante un aumento en la fluorescencia usando el lector de placas FLIPR® Tetra (Molecular Devices, LLC). Se calcularon los datos para determinar la fluorescencia máxima observada con respecto a la fluorescencia de fondo durante la duración del ensayo. Entonces se analizaron estos datos para determinar el % de respuesta máxima con respecto a la respuesta de tampón solo observada en pocillos en los que se omitió el ATP, usando la siguiente ecuación:

, respuesta de muestra — respuesta de tampón

% de respuesta máxima = ------------------------- --------------------------------- -------X 100 _{respuesta total — respuesta de tampón}

Se analizaron los datos en Prism (GraphPad Software, Inc) para determinar los valores de CI⁵⁰ usando la siguiente ecuación:

Y = Fondo (Tope-Fondo)/(1 10A((LogCI50-X)*pendiente))

Para permitir la clasificación de anticuerpos se restringieron el tope y el fondo de las curvas a 100 y 0 respectivamente. Se enumeran en la figura 15 las medias geométricas de los valores de CI⁵⁰ para los anticuerpos sometidos a prueba y en la figura 19 se muestra un ejemplo de las curvas de CI⁵⁰ para dos anticuerpos junto con un anticuerpo control de isotipo.

Ejemplo 14: Identificación de anticuerpos con potencia mejorada frente a P2X4 humano usando la línea celular HEK 293F huP2X4 en la plataforma de electrofisiología automatizada Qpatch 16X.

Se cosecharon células HEK 293F que expresan de manera estable P2X4 humano al 50% de confluencia usando Accutase. Entonces se resuspendieron las células en 10 ml de medio Freestyle 293F complementado con HEPES (10 mM) Apyrase (1 U/ml, actividad ATPasa/ADPasa = 1) a una densidad de 2-3e6 células/ml. Se sometió a ensayo la función de P2X4 usando la plataforma de electrofisiología automatizada QPatch 16X (Sophion) en configuración de registro de población. La composición del tampón extracelular QPatch (QEB) era (en mM) NaCl (140), KCl (2), MgCh (1) CaCh (2), HEPES (10). Se ajustó el pH de los tampones extracelulares a 7.4 con NaOH (1 M), se ajustó la osmolaridad a 300 mOsm con sacarosa y se filtraron las disoluciones a través de 0.2 jm . El tampón intracelular QPatch (QIB) contenía (en mM) CsF (140), NaCl (10), EGTA (1), HEPES (10). Se ajustó el pH del tampón intracelular a 7.3 con CsOH (1 M) y se filtró la disolución a través de 0.2 jm . Se titularon las IgG a pH 7.4 con NaOH (1 M).

Para la determinación de la potencia de las variantes optimizadas del anticuerpo 11, se diluyeron en serie las IgG en QEB albúmina sérica bovina al 0.1% y se sometieron a prueba para determinar la función en Qpatch 16X en configuración de registro de población. El tampón extracelular era QEB, el tampón intracelular era QIB y el tampón de lavado de ATP era QEB apyrase (1 U/ml). En este ensayo, se aplicó ATP (3 jM ) cada 10 min durante 3 s con un total de 5 aplicaciones por experimento. Las dos primeras adiciones de ATP (ATP 1 y ATP 2) estuvieron precedidas por preincubación durante 5 min con tampón QEB BSA al 0.1% mientras que las siguientes tres adiciones de ATP estuvieron precedidas por 5 min de incubación con dosis ascendentes de IgG. Se intercalaron dosis logarítmicas y semilogarítmicas de IgG en el análisis posterior para generar curvas de respuesta a la dosis de 6 puntos (intervalo de dosis de 100 - 0.3 nM). Se realizó la sustracción de fugas de los datos sustrayendo la corriente en ausencia de ligando y la magnitud de la respuesta de P2X4 medida como la corriente de entrada pico en presencia de ligando. Se expresó la corriente de entrada pico en respuesta a ATP como una fracción de la corriente control (ATP2) y se marcó como I/Ibasal. Se ajustaron los datos en Prism usando una ecuación logarítmica (inhibidor) frente a respuesta - pendiente variable (cuatro parámetros). Y = Fondo (Tope-Fondo)/(1 10A((LogCI50-X)*pendiente)) Se definió el tope de las curvas de respuesta a la dosis de IgG mediante la respuesta a NIP 2280.3 nM y se restringió a este valor. Se restringió el fondo de la curva de manera que era mayor de cero. Véase las figuras 14-15.

Ejemplo 15 Determinación de la potencia de anticuerpos derivados de hibridoma en P2X4 humano y de ratón. Se manipularon células HEK 293F que expresan P2X4 como en el ejemplo 8. Se sometió a ensayo la potencia de IgG derivadas de hibridoma en Qpatch 16X en configuración de registro de población. Para la determinación de la potencia de IgG, se diluyeron en serie las IgG en PBS albúmina sérica bovina al 0.1% y se sometieron a prueba para determinar la función en Qpatch 16X en configuración de registro de población. Entonces se diluyeron las IgG 1:3 en QEB BSA al 0.1% dando como resultado una composición de tampón final de NaCl (137.6), KCl (2.2), MgCh (0.66), CaCh (1.3), HEPES (6.6), KH²PO⁴ (0.49), NaH2PO4 (2.66), BSA (0.1%) equivalente a c Pe B1. El tampón extracelular era QEB, el tampón intracelular era QIB y el tampón de lavado de ATP era QEB apyrase (1 U/ml). En este ensayo, se aplicó ATP (3 |^j M) cada 10 min durante 3 s con un total de 5 aplicaciones por experimento. Las dos primeras adiciones de ATP (ATP 1 y ATP 2) estuvieron precedidas por preincubación durante 5 min con CPEB1 BSA al 0.1% mientras que las siguientes tres adiciones de ATP estuvieron precedidas por 5 min de incubación con dosis ascendentes de IgG. Se intercalaron dosis logarítmicas y semilogarítmicas en el análisis posterior para generar curvas de respuesta a la dosis de 6 puntos. Se realizó la sustracción de fugas de los datos sustrayendo la corriente en ausencia de ligando y la magnitud de la respuesta de P2X4 medida como la corriente de entrada pico en presencia de ligando. Se expresó la corriente de entrada pico en respuesta a ATP como una fracción de la corriente control (ATP2). Se ajustaron los datos en Prism usando una ecuación logarítmica (inhibidor) frente a respuesta - pendiente variable (cuatro parámetros). Y = Fondo (Tope-Fondo)/(1 10A((LogCI50-X)*pendiente)) Se restringió el tope de las curvas de respuesta a IgG a 1 mientras que se restringió el fondo de la curva de manera que era mayor de cero. Véase la figura 16.

Ejemplo 16 Eficacia de anticuerpos reactivos de ratón en P2X4 microglial de ratón nativo

Cultivo de microglía de ratón:

Se cultivó microglía de ratón primaria a partir de crías neonatales C57, P2. Se retiraron los cerebros de las calaveras de ratones y se mantuvieron en medio (DMEm FCS al 10% pen/estrep). Se hicieron rodar por papel de filtro para eliminar las meninges y la vasculatura pegajosas antes de colocarlos en 20 ml de medio nuevo y triturarlos para dar una suspensión de células individuales. Entonces se esterilizaron por filtración las células a través de un colador de células de 40 jm , luego se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 min. Entonces se resuspendieron las células en 40 ml de medio por frasco a 4 cerebros por frasco T175 y se cultivaron durante 1 semana. Después de esto, se complementó el medio con GM-CSF (5 ng/ml) y se cultivaron las células durante una semana adicional. Se retiró la microglía mediante agitación durante la noche en un incubador con agitador orbital (sin CO²) con medio complementado con HEPES (20 mM). Se centrifugó la microglía purificada a 1200 rpm durante 5 min y se resuspendió en 20 ml de medio de crecimiento DMEM FCS al 10% pen/estrep. Se contaron las células y se sembraron en frascos de cultivo celular T75 de unión ultra baja (Corning) a 7e6 células/frasco. Entonces se mantuvo la microglía en cultivo durante 1-7 días antes de usarse para los ensayos de electrofisiología Qpatch 16X o ensayos de obtención de imágenes de calcio FLIPR.

Qpatch de manipulación celular:

Se lavó un frasco T75 1 x dos veces con dPBS y se cosecharon las células usando tratamiento con Accutase durante 5­ 10 min. Entonces se resuspendieron las células en medio 293F Freestyle HEPES 20 mM Accutase 1 U/ml (10 ml) y se centrifugaron a 800 rpm durante 5 min. Entonces se resuspendieron las células en 3 ml de medio 293F Freestyle HEPES 20 mM Accutase 1 U/ml y se usó 1 ml de suspensión celular por experimento.

Se usó Qpatch 16X en configuración de registro de población y se sometieron las células a fijación de voltaje a -70 mV. Se perfundieron las células con o bien un anticuerpo control o bien anticuerpo de prueba durante 5 minutos antes de aplicarse ATP (30 j M). Se sustrajo la corriente en ausencia de ATP de todos los datos. Se midió la corriente de entrada en respuesta a ATP (véase la figura 15). El tampón externo era QEB y el tampón interno era QIB. Véanse las figuras 17 y 18.

FLIPR:

Se sembró en placa la microglía en placas de 384 pocillos recubiertas con poli-D-lisina Cell Coat (negras, no transparentes) con 30 j l por pocillo y se cultivaron en un incubador humidificado a 37 °C durante 48 horas.

Se retiró el medio y se reemplazó por 20 ul por pocillo de tampón HBSS HEPES 20 mM BSA al 0.1%, complementado con el kit de ensayo de calcio Screen Quest™ Fluo-8 No Wash (AAT Bioquest, Inc.) según las instrucciones de los fabricantes. Entonces se incubaron las células a 37°C durante 30 min, luego se devolvieron a temperatura ambiente durante 15 min antes de someterlas a ensayo en FLIPR (Molecular Devices). Se constituyó ivermectina (12 j M) en una placa de compuestos de 384 pocillos adicional (placa de compuestos 1). Se constituyeron las IgG en PBS BSA al 0.1% (placa de compuestos 2). Se constituyó ATP (30 uM) en Hb SS HEPES 20 mM BSA al 0.1% en una placa de compuestos de 384 pocillos separada (placa de compuestos 3). Se excitó Fluo-8 a una longitud de onda de 470-495 nm y se midió la luz emitida a una longitud de onda de 515-575 nm. Se ajustó la ganancia de la cámara para dar 1000 recuentos en reposo con una exposición de 0.4 s. Se añadieron 10 ul de disolución a partir de la placa de compuestos 1 a las células y se midió la fluorescencia. Tras 5 min de incubación, se añadieron 10 ul de disolución a partir de la placa de compuestos 2. 15 min más tarde, se añadió ATP (5 uM final) y se midió la fluorescencia final pico entre 200-300 s tras la adición de ATP. Se normalizaron los recuentos de fluorescencia a la respuesta de ATP en ausencia de anticuerpo (menos la fluorescencia del fondo) y se representaron gráficamente como % de respuesta de ATP (véase la figura 21).

Se construyeron curvas de respuesta a la dosis de 10 puntos para cada IgG a partir de los pocilios por duplicado y el ajuste de datos en Prism usando una ecuación logarítmica (inhibidor) frente a respuesta - pendiente variable (cuatro parámetros). Y = Fondo (Tope-Fondo)/(1 10A((LogCI50-X)*pendiente)) Véase la figura 20.

Ejemplo 17: Efecto funcional de anticuerpos frente a P2X4 sobre macrófagos derivados de monocitos humanos.

Cultivo de células

Se aislaron monocitos humanos a partir de la fracción mononuclear de sangre periférica mediante centrifugación en un gradiente de Ficoll-Paque. Entonces se purificaron las células mediante incubación en un frasco de cultivo celular T175 en medio de cultivo celular en ausencia de suero durante 1 hora. Se eliminaron las células no adherentes y se hicieron crecer las células restantes en medio RPMI Glutamax I complementado con FCS al 10% (HI/GI) P/S al 1% M-CSF 100 ng/ml durante 7 días. Se alimentaron las células en el día 2-3 añadiendo 10 ml adicionales de medio. Se cosecharon los macrófagos mediante tratamiento con Accutase durante 10 min seguido por raspado de las células y siembra en placa de nuevo en frascos T75 de unión ultra baja a 6e6 células por frasco. Entonces se cultivaron las células durante 1-10 días adicionales antes de usarse para el registro electrofisiológico.

En el día del experimento, se cosecharon las células con Accutase y se resuspendieron en 3 ml medio CHO ACF HEPES 20 mM. Se usó 1 ml de la suspensión celular por experimento en Qpatch 16X en configuración de registro de población. Los parámetros del ensayo Qpatch 16X fueron los descritos para el ejemplo 16. Antagonista japonés se refiere a 1H-nafto[1,2-b][1,4]diazepin-2,4(3H,5H)-diona (descrita en las patentes WO-2010/093061 y EP2397480A1. Véanse las figuras 21 y 22.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de P2X4 humano y modula la actividad del canal, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una VH que comprende:

a. una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia: SFAMS;

b. una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia: AISGSG GSTYYADSVKG;

c. una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia: QFDYWSTYSGPTAFDL; en combinación con una VL que comprende:

a. una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia SGDALPRQYAY b. una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia KDSERPS

c. una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia QSADSSGTYVV.

2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, que comprende una VH de secuencia:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSW VRQAPGKGLEW VSAISGSGGSTY YAD SVKG RFTISRDNSKNTLYLQ M NSLRAEDTAVYYCSRQ FDYW STYSG PTAFDLW G R GTLVTVSS;

y una VL de secuencia

S Y E L AQPP S V S V SPGQT AR IT C SGD ALPRQ Y A Y W Y QQKPGQ A P LL V IY K D SERP SGIPER FSGSGSG TTVTLTISG VQ AEDEADYYCQ SADSSG TYVVFG G G TKVTVL.

3. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv), un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2.

4. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Un vector que comprende el polinucleótido según la reivindicación 4.

6. Una célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 5.

7. Una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

8. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento de dolor neuropático en un mamífero.