ES2899121T3 - Producción de manool - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir (+)-manool que comprende: a) poner en contacto geranilgeranil difosfato (GGPP) con una copalil difosfato sintasa (CPP) para formar un copalil difosfato, en donde la CPP sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15; o b) poner en contacto el CPP con una esclareol sintasa para formar (+)-manool; y en el que el polipéptido que tiene actividad de esclareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; y c) opcionalmente aislar el (+)-manool.

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de manool

Campo técnico

Se proporcionan en la presente procedimientos bioquímicos para producir (+)-manool usando una copalil difosfato sintasa y una esclareol sintasa como se define en las reivindicaciones adjuntas

Antecedentes

Los terpenos se encuentran en la mayoría de los organismos (microorganismos, animales y plantas). Estos compuestos son elaborados de cinco unidades de carbono llamadas unidades de isopreno y son clasificados por el número de estas unidades presentes en su estructura. De este modo, monoterpenos, sesquiterpenos y diterpenos son terpenos que contienen 10, 15 y 20 átomos de carbono, respectivamente. Los sesquiterpenos, por ejemplo, son ampliamente encontrados en el reino vegetal. Muchas moléculas de sesquiterpeno se conocen por sus propiedades de sabor y fragancia y sus efectos cosméticos, medicinales y antimicrobianos. Numerosos hidrocarburos de sesquiterpeno y sesquiterpenoides han sido identificados.

La producción biosintética de terpenos involucra enzimas llamadas terpeno sintasas. Estas enzimas convierten un precursor de terpeno acíclico en uno o más productos de terpeno. En particular, las diterpeno sintasas producen diterpenos por ciclización del precursor geranilgeranil difosfato (GGPP, por sus siglas en inglés). La ciclización de GGPP a menudo requiere dos polipéptidos enzimáticos, una diterpeno sintasa tipo I y tipo II que trabaja en combinación en dos reacciones enzimáticas sucesivas. Las diterpeno sintasas tipo II catalizan una ciclización/reacomodo de GGPP iniciado por la protonación del doble enlace terminal de GGPP que conduce a un intermediario cíclico de diterpeno difosfato. Este intermediario es entonces además convertido por una diterpeno sintasa tipo I que cataliza una ciclización iniciada por ionización.

Las diterpeno sintasas están presentes en las plantas y otros organismos y usan sustratos tales como GGPP pero tienen diferentes perfiles de producto. Los genes y ADNc que codifican las diterpeno sintasas han sido clonados y las enzimas recombinantes correspondientes caracterizadas.

Las enzimas copalil difosfato sintasa (CPP, por sus siglas en inglés) y enzimas esclareol sintasa son enzimas que ocurren en plantas. Por lo tanto, es deseable descubrir y usar estas enzimas y variantes en procesos bioquímicos para generar (+)-manool.

El documento WO2015197075 describe el uso de diterpeno sintasas (diTPS) derivadas de dos clases, clase I y clase II, para la producción de diterpenos in vitro proporcionando un organismo huésped que comprende ambos diTPS.

El documento WO2015113570 describe el uso de diterpeno sintasas (diTPS) derivadas de dos clases, clase I y clase II, para la producción de diterpenos in vitro proporcionando un organismo huésped que comprende ambos diTPS.

Yisheng Wu et al (2012) Phytochemistry volumen 84 páginas 40-46 describe la caracterización funcional de copailil difosfato sintasas de trigo TaCPS1, 2, 3, 4 y 5. TaCPS2 es el más homólogo a la sintasa syn-CPPdiferenciada estereoquímicamente de forma similar del arroz (OsCPS4). TaCPS2 produce únicamente CPP normal, en lugar de ent, y proporciona evidencia directa de que el trigo puede producir diterpenoides relacionados con el labdano distintos de las giberelinas.

Tomonobu Toyomasu et al (200) Bioscience Biotechnology Biochemistry vol. 73 páginas 772-775 describe la identificación de los genes de ent-CPP sintasa de trigo: TaCPS1, TaCPS2 y TaCPS3. El trabajo experimental llevó a los autores a concluir que TaCPS3 es responsable de la biosíntesis de giberelinas, mientras que TaCPS1 y TaCPS2 son posibles homólogos funcionales de genes de diterpeno ciclasa OsCPS2 y OsCPS4 implicados en la biosíntesis de fitoalexina en arroz. El documento WO2014022434 describe la producción de ambróxido a partir de esclareol usando polipéptidos de labdendiol difosfato sintasa (LPP) y polipéptidos de escareol sintasa.

Zerbe et al (2014) Plant Journal volumen 79, páginas 914-927 describe la caracterización funcional de Marrubium vulgare (marrubio blanco) (+) - copailil difosfato sintasa MvCP3. MvCPS está más estrechamente relacionado con los CCP de Salvia milithiorrhiza y Coleus forskohlii que participan en la biosíntesis de diterpenoides especializada. MvCP3 expresado solo en N. benthamiana produce copalol (CPP desfosforilado) y un diterpeno no identificado.

Brückner et al (2014) Phytochemistry vol. 101, páginas 52-64 describe la caracterización funcional de la a copailil difosfato sintasa (RoCPS1) de Rosmarinus officinalis. Se demostró que RoCPS1 convierte GGDP en CDP de estereoquímica normal.

Sumario

En la presente se proporciona un procedimiento para producir (+)-manool que comprende:

a) poner en contacto geranilgeranil difosfato (GGPP) con una copalil difosfato sintasa (CPP) para formar un copalil difosfato, en donde la CPP sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15; o

b) poner en contacto el CPP con una esclareol sintasa para formar (+)-manool; en el que el polipéptido que tiene actividad de clareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; y

c) opcionalmente aislar el (+)-manool.

En la presente se proporciona el procedimiento anterior que comprende además procesar adicionalmente el (+)-manool a un derivado de (+)-manool.

También en la presente se proporciona un ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito anteriormente.

También se proporciona una célula u organismo huésped no humano que comprende los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria o que comprende el vector de expresión, células u organismos huésped no humanos capaz de producir GGPP, procedimientos para transformar una célula u organismo huésped no humano, y procedimientos para cultivar las células u organismos huésped no humanos para producir (+)-manool.

Descripción de los dibujos

Figura 1. Trayectoria enzimática de geranilgeranil difosfato (GGPP) a (+)-manool.

Figura 2. Trayectorias enzimáticas de geranilgeranil difosfato (GGPP) a (+)-manool y esclareol.

Figuras 3A-3C. Análisis de GCMS de la conversión enzimática in vitro de GGPP. Figura 3A. Usando la enzima SmCPS recombinante. Figura 3B. Usando la enzima ScScS recombinante. Figura 3C. Combinando la SmCPS con enzimas ScScS en un ensayo único.

Figuras 4A-4D. Análisis de GCMS de (+)-manool producido usando células de Escherichia coli que expresan SmCPS, ScScS y enzimas de la trayectoria de mevalonato. Figura 4A. Cromatograma de ion total de un extracto del medio de cultivo de E. coli. Figura 4B. Cromatograma de ion total de un estándar de (+)-manool. Figura 4C. Espectro de masas del pico mayor (tiempo de retención de 14,55 min) en el cromatograma A. Figura 4D. Espectro de masas del estándar auténtico de (+)-manool.

Figura 5. Análisis de GCMS de (+)-manool producido usando células de E. coli que expresan enzimas de la trayectoria de mevalonato, una GGPP sintasa, ScSCS y cinco CPP sintasas diferentes: SmCPS2 de Salvia miltiorrhiza, CfCPS1 de Coleus forskohlii, TaTps1 de Triticum aestivum, MvCps3 de Marrubium vulgare y RoCPS1 de Rosmarinus officinalis.

Figura 6. Análisis de GCMS de (+)-manool producido usando células de E. coli que expresan, enzimas de la trayectoria de mevalonato, una GGPP sintasa, SmCPS2 y una diterpeno sintasas clase I: NgSCS-del29 de Nicotiana glutinosa o SsScS de Salvia sclarea.

Figura 7. Se construyeron plásmidos de expresión de Saccharomyces cerevisiae in vivo por cotransformación de levadura con seis fragmentos de ADN: a) marcador de levadura LEU2, b) marcador de E. coli AmpR, c) Origen de replicación de levadura, d) Origen de replicación de E. coli, e) un fragmento para co­ expresión de CrtE y una de las esclareol sintasas que codifican secuencias probadas, y f) un fragmento para expresión de una de las copalil difosfato (CPP) sintasas que codifican secuencias probadas.

Figura 8. Análisis de GCMS de (+)-manool producidas usando la cepa modificada de S. cerevisiae YST045 que expresa una GGPP sintasa, ScSCS y cinco diferentes versiones truncadas de CPP sintasas: SmCPS2 de Salvia miltiorrhiza, CfCPS1 de Coleus forskohlii, TaTps1 de Triticum aestivum, MvCps3 de Marrubium vulgare y RoCPS1 de Rosmarinus officinalis.

Descripción Detallada

Definiciones

Para las descripciones de la presente y las reivindicaciones adjuntas, el uso de “o” significa “y/o” a menos que se declare de otro modo.

De manera similar, “comprenden”, “comprende”, “que comprende”, “ incluyen”, “ incluye”, y “que incluye” son intercambiables y no pretenden ser limitantes.

Se entiende además que donde las descripciones de varias realizaciones usan el término “que comprende”, aquellos expertos en la técnica entenderán que en algunos casos específicos, una realización puede ser alternativamente descrita usando el lenguaje “que consiste esencialmente de” o “que consiste de”.

Los siguientes términos tienen los significados adscritos a ellos a menos que se especifique de otro modo.

El término “polipéptido” significa una secuencia de aminoácidos de residuos de aminoácidos consecutivamente polimerizados, por ejemplo, al menos 15 residuos, al menos 30 residuos, al menos 50 residuos. En algunas realizaciones proporcionadas en la presente, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es una enzima, o un fragmento, o una variante de los mismos.

El término polipéptido “aislado” se refiere a una secuencia de aminoácidos que es removida de su ambiente natural por un procedimiento o combinación de procedimientos conocidos en la técnica e incluye procedimientos recombinantes, bioquímicos y sintéticos.

El término “proteína” se refiere una secuencia de aminoácidos de cualquier longitud en donde los aminoácidos están ligados por enlaces peptídicos covalentes, e incluye oligopéptido, péptido, polipéptido y proteína de longitud completa sea que se origina naturalmente o sintética.

Los términos “función biológica”, “función”, “actividad biológica” o “actividad” se refiere a la capacidad de la CPP sintasa y la actividad esclareol sintasa para catalizar la formación de (+)-manool.

Los términos “secuencia de ácido nucleico”, “ácido nucleico”, y “polinucleótido” son usados intercambiablemente significando una secuencia de nucleótidos. Una secuencia de ácido nucleico puede ser un desoxirribonucleótido de una sola hebra o de doble hebra, o ribonucleótido de cualquier longitud, e incluye secuencias codificantes y no codificantes de un gen, exones, intrones, secuencias complementarias sentido y anti-sentido, ADN genómico, ADNc, ARNmi, ARNsi, ARNm, ARNr, ARNt, secuencias de ácido nucleico recombinante, secuencias de ADN y/o ARN aisladas y purificadas que se originan naturalmente, secuencias de ADN y ARN sintéticas, fragmentos, cebadores y sondas de ácido nucleico; y el complemento de tales secuencias. El experto en la técnica está consciente de que las secuencias de ácido nucleico de ARN son idénticas a las secuencias de ADN con la diferencia de timina (T) siendo reemplazadas por uracilo (U).

Un ácido nucleico aislado o secuencia de ácido nucleico aislada se refiere a un ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico que es un ambiente diferente de aquella en la cual el ácido nucleico o la secuencia de ácido nucleico ocurre naturalmente. El término “que se origina naturalmente” como se usa en la presente como se aplica a un ácido nucleico se refiere a un ácido nucleico que se encuentra en una célula en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que está presente en un organismo, por ejemplo en las células de un organismo, que puede ser aislado a partir de una fuente en la naturaleza y la cual no ha sido intencionalmente modificada por un humano en el laboratorio, está ocurriendo naturalmente.

Los términos “purificado”, “sustancialmente purificado” y “aislado”, son usados en la presente para referirse al estado de ser libre de otros compuestos distintos con los cuales el compuesto de la invención está normalmente asociado en su estado natural, de manera que el sujeto “purificado”, “sustancialmente purificado” y “aislado comprende al menos 0,5%, 1%, 5%, 10%, o 20%, o al menos 50% o 75% o de la masa, en pes, de una muestra dada. En una realización particular, estos términos se refieren al compuesto de la invención que comprende al menos 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de la masa, en peso, de una muestra dada. Como se usa en la presente, los términos “purificado”, “sustancialmente purificado” y “aislado”, cuando se refiere a un ácido nucleico o proteína, de ácidos nucleicos o proteínas, también se refiere a un estado de purificación o concentración diferente de aquel el cual ocurre naturalmente en una célula u organismo. Cualquier grado de purificación o concentración mayor que aquel el cual ocurre naturalmente en una célula u organismo, que incluye (1) la purificación de otras estructuras o compuestos asociados o (2) la asociación con estructuras o compuestos a los cuales no está normalmente asociado en la célula u organismo, están dentro del significado de “aislado”. El ácido nucleico o proteína o clases de ácidos nucleicos o proteínas, descritos en la presente, pueden ser aislados, o de otro modo asociados con estructuras o compuestos a los cuales no están normalmente asociados en la naturaleza, de conformidad con una variedad de procedimientos y procesos conocidos por aquellos de habilidad en la técnica.

Como se usa en la presente, los términos “amplificar” y “amplificación” se refieren al uso de cualquier metodología de amplificación adecuada para generar o detectar ácidos nucleicos recombinantes que se expresan naturalmente, como se describe en detalle abajo. Por ejemplo, la invención proporciona procedimientos y reactivos (por ejemplo, pares cebadores de oligonucleótidos degenerados específicos, cebador de dT oligo) para amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, por reacción en cadena de la polimerasa, PCR) expresados naturalmente (por ejemplo, ADN o ARNm genómico) o recombinantes (por ejemplo, ADNc) de la invención in vivo, ex vivo o in vitro.

“Secuencia de ácido nucleico recombinante” son secuencias de ácido nucleico que resultan del uso de procedimientos de laboratorio (clonación molecular) para llevar en conjunto el material genético a partir de más de una fuente, creando una secuencia de ácido nucleico que no ocurre naturalmente y de otro modo no podría encontrarse en organismos biológicos.

“Tecnología de ADN recombinante” se refiere a procedimientos de biología molecular para preparar una secuencia de ácido nucleico recombinante como se describe, por ejemplo, en Manuales de Laboratorio editado por Weigel and Glazebrook, 2002 Cold Spring Harbor Lab Press; y Sambrook et al., 1989 Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

El término “gen” significa una secuencia de ADN que comprende una región, la cual es transcrita en una molécula de ARN, por ejemplo, un ARNm en una célula, operablemente ligada a regiones reguladoras adecuadas, por ejemplo, un promotor. Un gen puede de este modo, comprender varias secuencias operablemente ligadas, tales como un promotor, una secuencia líder al 5' que comprende, por ejemplo, secuencias involucradas en el inicio de la traducción, una región codificante de ADNc o ADN genómico, intrones, exones, y/o una secuencia no traducida al 3' que comprende, por ejemplo, sitios de terminación de la transcripción.

Un “gen quimérico” se refiere a cualquier gen, el cual no se encuentra normalmente en la naturaleza en una especie, en particular, un gen en el cual una o más partes de la secuencia de ácido nucleico están presentes que no están asociados entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el promotor no está asociado en la naturaleza con parte o toda la región transcrita o con otra región regulador. El término “gen quimérico” se entiende por incluir los constructos de expresión en los cuales una secuencia reguladora de la transcripción o promotora está operablemente ligada a una o más secuencias codificantes o a un antisentido, es decir, el complemento inverso de la hebra sentido, o secuencia de repetición invertida (sentido y antisentido, de este modo el transcripto de ARN forma ARN de doble hebra después de la transcripción). El término “gen quimérico” también incluye genes obtenidos a través de la combinación de porciones de una o más secuencias codificantes para producir un nuevo gen.

Una “UTR al 3'” o “secuencia no traducida al 3'” (también referida como “región no traducida al 3'”, o “extremo al 3'”) se refiere a la secuencia de ácido nucleico encontrada corriente abajo de la secuencia codificante de un gel, la cual comprende por ejemplo, un sitio de terminación de la transcripción y (en la mayoría, pero no en todos los ARNms eucarióticos) una señal de poliadenilación tal como AAUAAA o variantes de los mismos. Después de la terminación de la transcripción, el transcripto de ARNm puede ser escindido corriente abajo de la señal de poliadenilación y una cola poli(A) puede ser agregada, la cual está involucrada en el transporte del ARNm al sitio de la traducción, por ejemplo, citoplasma.

“Expresión de un gen” involucra la transcripción del gen y la traducción del ARNm en una proteína. La sobre expresión se refiere a la producción del producto del gen como se mide por niveles de ARNm, polipéptido y/o actividad enzimática en células transgénicas u organismos que exceden los niveles de producción en células no transformadas u organismos de un antecedente genético similar.

“Vector de expresión”, como se usa en la presente significa una molécula de ácido nucleico diseñado por ingeniería usando procedimientos de biología molecular y tecnología de ADN recombinante para suministro de ADN extraño o exógeno en una célula huésped. El vector de expresión incluye típicamente secuencias requeridas para la transcripción apropiada de la secuencia de nucleótido. La región codificante usualmente codifica una proteína de interés pero también puede codificar un ARN, por ejemplo, un ARN antisentido, ARNsi y similares.

Un “vector de expresión” como se usa en la presente incluye cualquier vector recombinante lineal o circular que incluye pero no se limita a vectores virales, bacteriófagos y plásmidos. La persona experta es capaz de seleccionar un vector adecuado de conformidad con el sistema de expresión. En una realización, el vector de expresión incluye el ácido nucleico de una realización en la presente operablemente ligado con al menos una secuencia reguladora, la cual controla la transcripción, traducción, inicio y terminación, tal como un promotor transcripcional, operador o potenciador, o un sitio de unión ribosomal de ARNm y, opcionalmente, que incluye al menos un marcador de selección. Las secuencias de nucleótido son “operablemente ligadas” cuando la secuencia reguladora se refiere funcionalmente al ácido nucleico de una realización de la presente. “Secuencia reguladora” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que determina el nivel de expresión de la secuencia de ácido nucleico de una realización de la presente y es capaz de regular la velocidad de transcripción de la secuencia de ácido nucleico operablemente ligada a la secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras comprenden promotores, potenciadores, factores de transcripción, elementos promotores y similares.

“Promotor” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que controla la expresión de una secuencia codificante proporcionando un sitio de unión para polimerasa de ARN y otros factores requeridos para la transcripción apropiada que incluyen sin limitación sitios de unión al factor de transcripción, sitios de unión a la proteína activadora y represora. El significado del término promotor también incluye el término “secuencia reguladora promotora”. Las secuencias reguladoras promotoras pueden incluir elementos corriente arriba y corriente abajo que pueden influenciar la transcripción, procesamiento de ARN o estabilidad de la secuencia de ácido nucleico codificante asociada. Los promotores incluyen secuencias sintéticas y derivadas naturalmente. Las secuencias de ácido nucleico codificante son usualmente localizadas corriente abajo del promotor con respecto a la dirección de la transcripción que inicia en el sitio de inicio de la transcripción.

El término “promotor constitutivo” se refiere a un promotor no regulado que permite la transcripción continua de la secuencia de ácido nucleico que es operablemente ligada a este.

Como se usa en la presente, el término “operablemente ligado” se refiere a un enlace de elementos de polinucleótido en una relación funcional. Un ácido nucleico está “operablemente ligado” cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor, o preferentemente una secuencia reguladora de la transcripción, está operablemente ligada a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia codificante. Operablemente ligado significa que las secuencias de ADN que son ligadas son típicamente contiguas. La secuencia de nucleótido asociada con la secuencia promotora puede ser de origen homólogo o no homólogo con respecto a la célula u organismo, por ejemplo, célula huésped, célula de planta, planta, o microorganismo, que será transformado. La secuencia también puede ser completamente o parcialmente sintética. Con respecto del origen, la secuencia de ácido nucleico asociada con la secuencia promotora será expresada o silenciada de conformidad con propiedades promotoras a las cuales está ligada. El ácido nucleico asociado puede codificar una proteína que se desea sea expresada o suprimida a través del organismo en todas las veces o, alternativamente, en un tiempo específico o en tejidos específicos, células o compartimiento celular. Tales secuencias de nucleótido particularmente codifican proteínas que confieren rasgos fenotípicos deseables a las células huésped u organismo alterado o trasformado con estas. Más particularmente, la secuencia de nucleótido asociada conduce a la producción de una (+)-manool sintasa en la célula huésped u organismo.

“Péptido objetivo” se refiere a una secuencia de aminoácidos la cual se dirige a una proteína, o polipéptido a organelos intracelulares, es decir, mitocondria, o plástidos, o al espacio extracelular (péptido de señal de secreción). Una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido objetivo puede ser fusionado a la secuencia de ácido nucleico que codifica el extremo terminal amino, por ejemplo, extremo N-terminal, de la proteína o polipéptido, o puede ser usado para reemplazar un polipéptido objetivo nativo.

El término “cebador” se refiere a una secuencia de ácido nucleico corta que es hibridizada a una secuencia de ácido nucleico de plantilla y se usa para polimerización de una secuencia de ácido nucleico complementaria a la plantilla.

Como se usa en la presente, el término “célula huésped” o “célula transformada” se refiere a una célula (u organismo) alterada o que alberga al menos una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un gen recombinante que codifica una secuencia de proteína o ácido nucleico deseada la cual después de la transcripción proporciona una proteína CPP sintasa y/o una proteína esclareol sintasa o la cual en conjunto produce (+)-manool.

La célula huésped es particularmente una célula bacteriana, una célula fúngica o una célula vegetal. La célula huésped puede contener un gen recombinante el cual ha sido integrado en los genomas nucleares u organelos de la célula huésped. Alternativamente, el huésped puede contener el gen recombinante extra-cromosomalmente. Las secuencias homólogas incluyen secuencias ortólogas o parálogas. Los procedimientos para identificar ortólogos o parálogos que incluyen procedimientos filogenéticos, procedimientos de hibridización y similitud se conocen en la técnica y se describen en la presente.

Los parálogos resultan de la duplicación del gen que da origen a dos o más genes con secuencias similares y funciones similares. Los parálogos típicamente se agrupan en conjunto y se forman por duplicaciones de genes dentro de las especies de plantas relacionadas. Los parálogos se encuentran en grupos de genes similares usando análisis Blast en forma de par o durante el análisis filogenético de familias de gen usando programas tales como CLUSTAL. En parálogos, las secuencias consenso pueden ser características identificadas a secuencias con genes relacionados y que tienen funciones similares de los genes.

Los ortólogos, o secuencias ortólogas, son secuencias similares entre sí debido a que se encuentran en especies que descienden de un ancestro común. Por ejemplo, las especies de plantas que tienen ancestros comunes se conocen por contener muchas enzimas que tienen secuencias y funciones similares. El experto en la técnica puede identificar secuencias ortólogas y predecir las funciones de los ortólogos, por ejemplo, construyendo un árbol poligénico para una familia de gen de una especie usando por ejemplo, programas CLUSTAL o BLAST.

El término “marcador seleccionable” se refiere a cualquier gen el cual después de la expresión puede ser usado para seleccionar una célula o células que incluyen el marcador seleccionable. Ejemplos de marcadores seleccionables se describen abajo. El experto en la técnica sabrá que diferentes antibióticos, fungicidas, marcadores seleccionables herbicidas o auxotróficos son aplicables a diferentes especies de objetivo.

El término “organismo” se refiere a cualquiera de los organismos unicelulares o multicelulares no humanos tales como una planta, o un microorganismo. Particularmente, un microorganismo es una bacteria, una levadura, un alga o un hongo.

El término “planta” es usado intercambiablemente para incluir células que incluyen protoplastos de plantas, tejidos de plantas, cultivos de tejidos de células de plantas que dan origen a plantas regeneradas, o partes de plantas, u órganos de planta tales como raíces, troncos, hojas, brotes, flores, peciolos, pétalos, polen, óvulo, embriones, tubérculos, frutos, semilla, progenie de los mismos y similares. Cualquier planta puede ser usada para llevar a cabo los procedimientos de una realización de la presente.

Realizaciones Particulares

En una realización en la presente se proporciona un procedimiento para transformar una célula huésped o un organismo no humano que comprende transformar una célula huésped o un organismo no humano con un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de copalil difosfato sintasa y con un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de esclareol sintasa, en donde el polipéptido que tiene la actividad de copalil difosfato comprende

una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15;

y el polipéptido que tiene la actividad de esclareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5.

En una realización en la presente se proporciona un procedimiento que comprende cultivar una célula u organismo huésped no humano capaz de producir un geranilgeranil fosfato (GGPP) y transformada para expresar un polipéptido que tiene una actividad de copalil difosfato sintasa en donde el polipéptido que tiene la actividad de copalil difosfato sintasa comprende

una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15; además transformada para expresar un polipéptido que tiene una actividad de esclareol sintasa en donde, el polipéptido que tiene la actividad de esclareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5.

Además en la presente se divulga un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una CPP sintasa en donde la CPP sintasa comprende un polipéptido que comprende

a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15; y además el vector de expresión comprende un ácido nucleico que codifica una enzima de esclareol sintasa, la esclareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5

En una realización particular, las dos enzimas, es decir, la CPP sintasa y la esclareol sintasa, podrían ser en dos diferentes vectores o plásmidos transformados en la misma célula. En una realización adicional, estas dos enzimas podrían estar en dos diferentes vectores o plásmidos transformados en dos diferentes células.

Además en la presente se proporciona una célula u un organismo huésped no humano que comprende o se transforma para albergar al menos un ácido nucleico que codifica una CPP sintasa en donde la c Pp sintasa comprende

un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15;

y al menos un ácido nucleico que codifica una enzima esclareol,

en donde la esclareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5.

En una realización, el ácido nucleico que codifica una CPP sintasa proporcionada en la presente comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 30.

En una realización, el ácido nucleico que codifica una CPP sintasa proporcionada en la presente comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 30.

En una realización, el ácido nucleico que codifica una CPP sintasa proporcionada en la presente comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos 98% %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 30.

En una realización, el ácido nucleico que codifica una CPP sintasa proporcionada en la presente comprende una secuencia de nucleótido que tiene 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 30.

En una realización, el ácido nucleico que codifica una CPP sintasa proporcionada en la presente comprende la secuencia de nucleótido como se expone en la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 30.

En una realización, la CPP sintasa comprende un polipéptido que comprende

a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15;

En una realización, la CPP sintasa comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la s Eq ID NO: 14.

En una realización, la CPP sintasa comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ iD NO: 14.

En una realización, la CPP sintasa comprende un polipéptido que comprende secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 14.

En una realización, la CPP sintasa comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 15.

En una realización, la CPP sintasa comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ iD NO: 15.

En una realización, la CPP sintasa comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 15.

En una realización, la esclareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4.

En una realización, la esclareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4.

En una realización, la esclareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4.

En una realización, la esclareol sintasa comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 4.

En una realización, la esclareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5.

En una realización, la esclareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5.

En una realización, la esclareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5.

En una realización, la esclareol sintasa comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 5.

En otra realización, en la presente se proporciona un vector de expresión que comprende al menos uno de los ácidos nucleicos descritos en la presente.

En otra realización, en la presente se proporciona una célula u organismo huésped no humano que comprende uno o más vectores de expresión que comprenden un ácido nucleico que codifica una CPP sintasa como se describe en la presente y un ácido nucleico que codifica una esclareol sintasa como se describe en la presente.

En otra realización, en la presente se proporciona una célula u organismo huésped no humano que comprende o transforma para albergar al menos un ácido nucleico descrito en la presente para así expresar o sobre-expresar heterólogamente al menos un polipéptido descrito en la presente.

En una realización, la presente invención proporciona una célula u organismo transformado, en la cual los péptidos son expresados en cantidad superior que en la misma célula u organismo no así transformado.

Existen varios procedimientos conocidos en la técnica para la creación de organismos huésped transgénicos o células tales como plantas, hongo, procariotas, o cultivos de células eucarióticas superiores. Los vectores de expresión y clonación apropiados para uso con huésped celulares bacterianos, fúngicos, levadura, vegetales y mamíferos se describen, por ejemplo, en Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, Elsevier, New York and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los vectores de expresión y clonación para plantas superiores y/o células vegetales en particular son disponibles a la persona experta. Véase por ejemplo, Schardl et al., Gene, 1987, 61: 1-11.

Los procedimientos para transformar organismos o células huésped para albergar ácidos nucleicos transgénicos son familiares para la persona experta. Para la creación de plantas transgénicas, por ejemplo, los procedimientos actuales incluyen: electroporación de protoplastos de planta, transformación mediada por liposoma, transformación mediada por agrobacteria, transformación mediada por polietilenglicol, bombardeo de partículas, microinyección de células vegetales, y transformación usando virus.

En una realización, el ADN transformado está integrado en un cromosoma de una célula y/u organismo huésped no humano de manera que resulta en un sistema recombinante estable. Cualquier procedimiento de integración cromosomal conocido en la técnica puede ser usado en la práctica de la invención, que incluye pero no se limita a intercambio de casete mediado por recombinasa (RMCE), inserción cromosomal específica del sitio viral, adenovirus e inyección pronuclear.

En una realización para llevar a cabo el procedimiento para producir (+)-manool, en la presente se proporciona un procedimiento para elaborar al menos un polipéptido que tiene una actividad de CPP sintasa y al menos un polipéptido que tiene una actividad de esclareol sintasa como se describe en cualquier realización de la invención.

Una realización proporciona un procedimiento para producir manool que comprende

a) poner en contacto geranilgeranil difosfato (GGPP) con una copalil difosfato sintasa (CPP) como se describe en la presente para formar un copalil difosfato; y

b) poner en contacto el CPP con una esclareol sintasa como se describe en la presente para formar (+)-manool;

en donde la etapa a) comprende cultivar una célula huésped u organismo huésped no humano capaz de producir GGPP y ser transformada con uno o más ácidos nucleicos como se describe en la presente o con uno o más vectores de expresión como se describe en la presente, de manera que la célula huésped u organismo huésped no humano albergan un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de CPP sintasa como se describe en la presente y un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de esclareol sintasa como se describe en la presente y expresan o sobre-expresan los péptidos.

Una realización proporciona el procedimiento anterior para producir manool que comprende además previo a la etapa a), transformar una célula huésped u organismo huésped no humano capaz de producir GGPP con

a) al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15;

b) al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de esclareol sintasa como se describe en la presente, de manera que tal organismo o célula expresa tal polipéptido que tiene una actividad de esclareol sintasa.

En una realización, la célula huésped u organismo huésped no humano capaz de producir GGPP comprende un ácido nucleico que codifica una CPP sintasa que comprende la SEQ ID NO: 15 y un ácido nucleico que codifica una esclareol sintasa que comprende la SEQ ID NO: 5;

en donde las combinaciones anteriores de las secuencias de ácido nucleico y/o sintasas también comprenden las variantes y varios porcentajes de identidades con la SEQ ID NO enumerados como se describe en la presente. En una realización, el organismo huésped no humano proporcionado en la presente es una planta, un procariota o un hongo.

En una realización, el huésped no humano proporcionado en la presente es un microorganismo, particularmente bacteria o levadura.

En una realización, la bacteria proporcionada en la presente es Escherichia coli y la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

En una realización, el organismo no humano proporcionado en la presente es Saccharomyces cerevisiae.

En una realización, la célula es una célula procariótica.

En otra realización, la célula es una célula bacteriana.

En una realización, la célula es una célula ecuariótica.

En una realización, la célula eucariótica es una célula de levadura o una célula de planta.

En una realización, el manool puede ser producido cultivando la bacteria o levadura transformada descrita en la presente, que incluye hasta la fermentación, por ejemplo, como se describe en Paddon et al., Nature, 2013, 496:528-532.

En una realización, el proceso para producir (+)-manool produce el (+)-manool a una pureza de al menos 98,5%. En otra realización, un procedimiento proporcionado en la presente comprende procesar además el (+)-manool a un derivado usando una síntesis química o bioquímica o una combinación de ambos usando procedimientos comúnmente conocidos en la técnica.

En una realización, el derivado de (+)-manool es seleccionado a partir del grupo que consiste en un hidrocarburo, un alcohol, acetal, aldehído, ácido, éter, cetona, lactona, acetato y un éster.

De conformidad con cualquier realización de la invención, tal derivado de (+)-manool es un compuesto C10 a C25 que comprende opcionalmente uno, dos, o tres átomos de oxígeno.

En una realización adicional, el derivado es seleccionado a partir del grupo que consiste en acetato de manool (acetato de (3R)-3-metil-5-[(1S,4aS,8aS)-5,5,8a-trimetil-2-metilendecahidro-1-naftalenil]-1-penten-3-ilo), copalol ((2E)-3-metil-5-[(1S,4aS,8aS)-5,5,8a-trimetil-2-metilendecahidro-1-naftalenil]-2-penten-1-ol), acetato de copalol (acetato de (2E)-3-metil-5-[(1S,4aS,8aS)-5,5,8a-trimetil-2-metilendecahidro-1-naftalenil]-2-penten-1-ilo), copalal ((2E)-3-metil-5-[(1S,4aS,8aS)-5,5,8a-trimetil-2-metilendecahidro-1-naftalenil]-2-pentenal), (+)-manooloxi (4-[(1S,4aS,8aS)-5,5,8atrimetil-2-metilendecahidro-1-naftalenil]-2-butanona), Z-11 ((3S,5aR,7aS,11aS,11bR)-3,8,8,11atetrametildodecahidro-3,5a-epoxinafto[2,1-c]oxepina), gamma-ambrol (2-[(1S,4aS,8aS)-5,5,8a-trimetil-2-metilendecahidro-1-naftalenil]etanol) y Ambrox® (3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9a-tetrametildodecahidronafto[2,1-b]furano).

En otra realización, un procedimiento proporcionado en la presente comprende además poner en contacto el (+)-manool con un sistema de reacción adecuado para convertir tal (+)-manool en un derivado de (+)-manool adecuado. Tal sistema de reacción adecuado puede ser de naturaleza enzimática (por ejemplo, que requieren una o más enzimas) o de naturaleza química (por ejemplo, que requieren uno o más químicos sintéticos).

Por ejemplo, el (+)-manool puede ser enzimáticamente convertido a manooloxi o gamma-ambrol usando un proceso descrito en la literatura, por ejemplo, como se expone en la Patente Estadounidense No. 7.294.492.

En aún otra realización, el derivado de (+)-manool es copalol y sus ésteres con ácidos carboxílicos C1-C5.

En aún otra realización, el derivado de (+)-manool es un éster de (+)-manool con ácidos carboxílicos C1-C5.

En una realización, el derivado de (+)-manool es copalal.

En una realización, el derivado de (+)-manool es manooloxi.

En aún otra realización, el derivado de (+)-manool es Z-11.

En una realización, el derivado de (+)-manool es un ambrol o es una mezcla del mismo y sus ésteres con ácidos carboxílicos C1-C5, y en particular gamma-ambrol y sus ésteres.

En una realización adicional, el derivado de (+)-manool es Ambrox® , esclareólido (también conocido como 3a,6,6,9atetrametildecahidronafto[2,1-b]furan-2(1H)-ona y todos sus diastereoisómeros y estereoisómeros), 3,4a,7,7,10apentametildodecahidro-1H-benzo[f]cromen-3-ol o 3,4a,7,7,10a-pentametil-4a,5,6,6a,7,8,9,10,10a,10b-decahidro-1H-benzo[f]cromeno y todos sus diastereoisómeros y estereoisómeros cíclicos de cetona y forma abierta (1R,2R,4aS,8aS)-1-(2-hidroxietil)-2,5,5,8a-tetrametildecahidronaftalen-2-ol DOL, gamma-ambrol.

Ejemplos específicos de cómo tales derivados (por ejemplo, un hidrocarburo de trieno, un acetato o copalol) se pueden obtener, se detallan en los Ejemplos.

Por ejemplo, el manool obtenido de conformidad con la invención puede ser procesado en Manooloxi (una cetona, como por los procedimientos conocidos) y después en ambrol (un alcohol) y ambrox (un éter), de conformidad con el documento e P 212254.

La capacidad de un polipéptido para catalizar la síntesis de un sesquiterpeno particular puede ser confirmada realizando el ensayo enzimático como se detalla en los Ejemplos proporcionados en la presente.

Los polipéptidos también significan incluir polipéptidos truncados siempre que mantengan su actividad de sintasa de (+)-manool y su actividad de esclareol sintasa.

Como se pretende en la presente abajo, una secuencia de nucleótido obtenida modificando las secuencias descritas en la presente puede ser realizada usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, introduciendo cualquier tipo de mutaciones tales como mutaciones por supresión, inserción o sustitución. Ejemplos de tales procedimientos se citan en la parte de la descripción con relación a los péptidos variantes y los procedimientos para prepararlos.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de péptido o nucleótido es una función del número de aminoácidos o residuos de nucleótidos que son idénticos en las dos secuencias cuando una alineación de estas dos secuencias ha sido generada. Los residuos idénticos son definidos como residuos que son los mismos en las dos secuencias en una posición dada de tal alineación. El porcentaje de identidad de secuencia, como se usa en la presente, se calcula a partir de la alineación óptima tomando el número de residuos idénticos entre dos secuencias dividiéndolos por el número total de residuos en la secuencia más corta y multiplicando por 100. La alineación óptima es la alineación en la cual el porcentaje de identidad es el más alto posible. Los huecos pueden ser introducidos en una o ambas secuencias en una o más posiciones de la alineación para obtener la alineación óptima. Estos huecos son entonces tomados en cuenta como residuos no idénticos para el cálculo del porcentaje de identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos o ácido nucleico se puede lograr en varias formas usando programas de computadora y por ejemplo, programas de computadora públicamente disponibles que se encuentran disponibles en la amplia red mundial. Preferentemente, el programa BLAST (Tatiana et al., FEMS Microbiol Lett., 1999, 174:247-250) se ajusta a los parámetros de omisión, disponible del National Center for Biotechnology Information (NCBI) en el http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi, se puede usar para obtener una alineación óptima de secuencias de ácido nucleico o proteína y para calcular el porcentaje de identidad de secuencia.

El polipéptido que será puesto en contacto con GGPP in vitro se puede obtener por extracción a partir de cualquier organismo que lo expresa, usando tecnologías estándares de extracción de enzima o proteína. Si el organismo huésped es un organismo unicelular o célula que libera el polipéptido de una realización de la presente en el medio de cultivo, el polipéptido puede ser recolectado simplemente a partir del medio de cultivo, por ejemplo, por centrifugación, opcionalmente seguido por etapas de lavado y re-suspensión en soluciones amortiguadoras adecuadas. En otra realización, el GGPP puede ser puesto en contacto con el polipéptido en el medio de cultivo donde el polipéptido puede ser liberado a partir del organismo huésped, organismo unicelular o célula. Si el organismo o célula acumula el polipéptido dentro de sus células, el polipéptido se puede obtener por rompimiento o lisis de las células. El GGPP puede ser puesto en contacto con el polipéptido después de la extracción adicional del polipéptido a partir del lisado celular o a través del contacto con el lisado celular sin conducir necesariamente tal extracción.

De conformidad con otra realización particular, el procedimiento de cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente se lleva a cabo in vivo. Estas realizaciones se proporcionan en la presente, particularmente ventajosas, puesto que es posible llevar a cabo el procedimiento in vivo sin aislar previamente el péptido. La reacción ocurre directamente dentro del organismo o célula transformada para expresar tal polipéptido.

El organismo o célula significa “expresar” un polipéptido, siempre que el organismo o célula se transforme para albergar un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, este ácido nucleico es transcrito a ARNm y el polipéptido se encuentra en la célula u organismo huésped. El término “expresa” abarca “expresa heterólogamente” y “sobre­ expresa”, el último con referencia a niveles de ARNm, polipéptido y/o actividad enzimática sobre y arriba de lo que se mide en una célula u organismo no transformado. Una descripción más detallada de procedimientos adecuados para transformar una célula u organismo huésped no humano se describirá después en la parte de la especificación que está dedicada a tales células u organismos huésped no humanos transformados.

Una célula u organismo particular significa ser “capaz de producir GGPP” cuando produce GGPP naturalmente o cuando no produce GPPP naturalmente pero es transformado para producir GGPP, ya sea previo a la transformación con un ácido nucleico como se describe en la presente o en conjunto con tal ácido nucleico. Los organismos o células transformados para producir una cantidad superior de GGPP que el organismo o célula que se origina naturalmente también están abarcados por los “organismos o células capaces de producir GGPP”. Se conocen varios procedimientos para transformar organismos, por ejemplo, microorganismos, de manera que producen GGPP, por ejemplo, en Schalk et al., J. Am. Chem. Soc, 2013, 134: 18900-18903.

Los organismos huésped no humanos adecuados para llevar a cabo el procedimiento de una realización de la presente in vivo pueden ser cualquiera de los organismos unicelulares o multicelulares no humanos. En una realización particular, el organismo huésped no humano usado para llevar a cabo una realización de la presente in vivo es una planta, un procariota o un hongo. Cualquier planta, procariota u hongo puede ser usada. Plantas particularmente útiles son aquellas que producen naturalmente altas cantidades de terpenos. En una realización más particular, el organismo huésped no humano usado para llevar a cabo el procedimiento de una realización de la presente in vivo es un microorganismo. Cualquier microorganismo puede ser usado pero de conformidad con una realización aún más particular tal microorganismo es una bacteria o levadura. Muy particularmente, tal bacteria es E. coli y tal levadura es Saccharomyces cerevisiae.

Algunos de estos organismos no producen GGPP naturalmente o solamente en pequeñas cantidades. Para ser adecuado para llevar a cabo el procedimiento de una realización de la presente, estos organismos tienen que ser transformados para producir tal precursor o diseñado por ingeniería genética para producir tal precursor en cantidades más grandes. Pueden así ser transformados ya sea antes de la modificación con el ácido nucleico descrito de conformidad con cualquiera de las realizaciones anteriores o simultáneamente, como se explica anteriormente.

En una realización, el organismo huésped no humano o célula capaz de producir GGPP es transformado con un ácido nucleico que codifica una CPP sintasa o variante de la misma como se describe en la presente y un ácido nucleico que codifica una esclareol sintasa o variante de la misma como se describe en la presente, en donde el organismo huésped no humano o célula capaz de producir GGPP ha sido diseñado por ingeniería genética para sobre-expresar una GGPP sintasa o transformada con un ácido nucleico que codifica una GGPP sintasa.

En una realización, el organismo huésped no humano o célula comprende un ácido nucleico que codifica una GGPP sintasa, un ácido nucleico que codifica una CPP sintasa o variante de la misma como se describe en la presente, y un ácido nucleico que codifica una esclareol sintasa o variante de la misma como se describe en la presente, en donde al menos uno de tales ácidos nucleicos es heterólogo al organismo huésped no humano o célula.

Las células eucarióticas superiores aisladas también pueden ser usadas, en lugar de organismos completos, como huésped para llevar a cabo el procedimiento de una realización de la presente in vivo. Las células eucarióticas adecuadas pueden ser cualquier célula no humana, pero son particularmente células de plantas o fúngicas.

De conformidad con otra realización, los polipéptidos que tienen una actividad de CPP sintasa usados en cualquiera de las realizaciones descritas en la presente o codificadas por los ácidos nucleicos descritos en la presente pueden ser variantes obtenidas por ingeniería genética, siempre que tal variante mantenga su actividad de CPP sintasa.

De conformidad con otra realización, los polipéptidos que tienen una actividad de esclareol sintasa usada en cualquiera de las realizaciones descritas en la presente o codificados por los ácidos nucleicos descritos en la presente pueden ser variantes obtenidas por ingeniería genética, siempre que tal variante mantenga su actividad de esclareol sintasa o tiene actividad de manool sintasa.

Como se usa en la presente, el polipéptido es propuesto como un polipéptido o fragmento peptídico que abarca las secuencias de aminoácido identificadas en la presente, así como también polipéptidos truncados o variantes, siempre que mantengan su actividad de CPP sintasa y su actividad de esclareol sintasa y/o actividad de manool sintasa.

Ejemplos de polipéptidos variantes son proteínas que se originan naturalmente que resultan de eventos de empalme de ARNm alternos o a partir de escisión proteolítica de los polipéptidos descritos en la presente. Las variaciones atribuibles a proteólisis incluyen, por ejemplo, diferencias en el N- o C-terminales después de la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la remoción proteolítica de uno o más aminoácidos terminales a partir de polipéptidos de una realización de la presente. Los polipéptidos codificados por un ácido nucleico obtenido por mutación natural o artificial de un ácido nucleico de una realización de la presente, como se describe posteriormente, también están abarcados por una realización de la presente.

Las variantes de polipéptido que resultan de una fusión de secuencias peptídicas adicionales en los extremos amino y carboxilo terminal también pueden ser usadas en los procedimientos de una realización de la presente. En particular, tal fusión puede mejorar la expresión de los polipéptidos, ser útil en la purificación de la proteína o mejorar la actividad enzimática del polipéptido en un ambiente o sistema de expresión deseado. Tales secuencias peptídicas adicionales pueden ser péptidos señal, por ejemplo. Por consiguiente, están abarcados en la presente procedimientos usando polipéptidos variantes, tales como aquellos obtenidos por fusión con otros oligo- o polipéptidos y/o aquellos los cuales están ligados a péptidos señal. Los péptidos que resultan de una fusión con otra proteína funcional, tal como otra proteína a partir de la trayectoria de biosíntesis de terpeno, también pueden ser ventajosamente usados en los procedimientos de una realización de la presente.

Una variante también puede diferir del polipéptido de una realización de la presente por unión de grupos modificantes los cuales son covalentemente o no covalentemente ligados al esqueleto del polipéptido.

La variante también incluye un polipéptido el cual difiere del polipéptido descrito en la presente por sitios de glicosilación N-ligados u O-ligados, y/o una adición de residuos de cisteína. El experto en la técnica reconocerá como modificar una secuencia de aminoácidos y preservar la actividad biológica.

Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar un polipéptido variante que tiene una actividad de CPP sintasa o una actividad de esclareol sintasa o una actividad de manool sintasa, como se describe en cualquiera de las realizaciones anteriores, y que comprende las etapas de:

(a) seleccionar un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las realizaciones expuestas anteriormente;

(b) modificar el ácido nucleico seleccionado para obtener al menos un ácido nucleico mutante;

(c) transformar las células huésped u organismos unicelulares con la secuencia de ácido nucleico mutante para expresar un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico mutante;

(d) seleccionar el polipéptido por al menos una propiedad modificada; y,

(e) opcionalmente, si el polipéptido no tiene actividad de CPP sintasa variante deseada, actividad de esclareol sintasa, o actividad de manool sintasa se repiten las etapas de proceso (a) a (d) hasta que se obtiene un polipéptido con una actividad sintasa CPP variante deseada, actividad de esclareol sintasa, o actividad de manool sintasa;

(f) opcionalmente, si un polipéptido que tiene una actividad de CPP sintasa deseada o una actividad de esclareol sintasa o actividad de manool sintasa se identificó en la etapa (d), se aísla el ácido nucleico mutante correspondiente obtenido en la etapa (c).

De conformidad con una realización, el polipéptido variante preparado cuando está en combinación con ya sea un polipéptido con actividad de CPP sintasa o una actividad de esclareol sintasa es capaz de producir (+)-manool.

En la etapa (b), un número más grande de secuencias de ácido nucleico mutantes puede ser creado, por ejemplo, por mutagénesis aleatoria, mutagénesis específica del sitio, o transposición de ADN. Los procedimientos detallados de transposición de gen se encuentran en Stemmer, DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution (Proc Natl Acad Sci EE.UU.., 1994, 91(22): 10747-1075). En breve, transposición de ADN se refiere a un proceso de recombinación aleatoria de secuencias conocidas in vitro, involucrando al menos dos ácidos nucleicos seleccionados para recombinación. Por ejemplo, las mutaciones pueden ser introducidas en un loci particular para sintetización de oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Después de la ligación, las secuencias reconstruidas resultantes codifican un análogo que tiene la inserción, sustitución, o supresión de aminoácido deseado. Alternativamente, los procedimientos de mutagénesis específica del sitio dirigidas a oligonucleótidos pueden ser empleados para proporcionar un gen alterado en donde los cordones predeterminados pueden ser alterados por sustitución, supresión o inserción.

Los ácidos nucleicos mutantes pueden ser obtenidos y separados, los cuales pueden ser usados para transformar una célula huésped de conformidad con los procedimientos estándares, por ejemplo, tal como se describe en los presentes ejemplos.

En la etapa (d), el polipéptido obtenido en la etapa (c) es seleccionado para al menos una propiedad modificada, por ejemplo, una actividad enzimática modificada deseada. Ejemplos de actividades enzimáticas deseadas, para las cuales un polipéptido expresado puede ser seleccionado, incluyen la actividad enzimática mejorada o reducida, como se mide por el valor Km o Vmáx, regio-química o estereoquímica modificada y distribución de producto o utilización de sustrato alterado. La selección de la actividad enzimática puede ser realizada de conformidad con procedimientos familiares para la persona experta y aquellos descritos en los presentes ejemplos.

La etapa (e) proporciona repetición de las etapas (a)-(d) del proceso, las cuales pueden ser realizadas preferentemente en paralelo. Por consiguiente, creando un número significante de ácidos nucleicos mutantes, muchas células huésped pueden ser transformadas con diferentes ácidos nucleicos mutantes al mismo tiempo, permitiendo la selección subsecuente de un número elevado de polipéptidos. Las oportunidades de obtener un polipéptido variante deseado pueden ser este modo, incrementadas a la discreción de la persona experta.

Además de las secuencias de gen mostradas en las secuencias descritas en la presente, será aparente para la persona experta en la técnica, que los polimorfismos de secuencia de ADN pueden existir dentro de una población dada, lo cual puede conducir a cambios en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos descritos en la presente. Tales polimorfismos genéticos pueden existir en células a partir de diferentes poblaciones o dentro de una población debido a la variación alélica natural. Las variantes alélicas también pueden incluir equivalentes funcionales.

Realizaciones adicionales también se refieren a las moléculas derivadas por tales polimorfismos de secuencia a partir de los ácidos nucleicos concretamente descritos. Estas variaciones naturales usualmente provocan una varianza de aproximadamente 1 hasta 5% en la secuencia de nucleótido de un gen o en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos descritos en la presente. Como se mencionó anteriormente, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de una realización de la presente es una herramienta útil para modificar organismos huésped no humanos o células propuestas para ser usadas cuando el procedimiento se lleva a cabo in vivo.

Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de conformidad con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente por lo tanto, también se proporciona en la presente.

El ácido nucleico de una realización de la presente puede ser definido como que incluye polímeros de ribonucleótido o desoxirribonucleótido en ya sea forma de hebra única o de doble hebra (ADN y/o ARN). Los términos “secuencia de nucleótido” también deben ser entendidos como que comprende una secuencia de polinucleótido o una molécula de oligonucleótido en la forma de un fragmento separado o como un componente de un ácido nucleico más grande. Los ácidos nucleicos de una realización de la presente también abarcan ciertas secuencias de nucleótido aisladas que incluyen aquellas que son sustancialmente libres de material endógeno contaminante. El ácido nucleico de una realización de la presente puede ser truncado, siempre que codifique un polipéptido abarcado en la presente, como se describe anteriormente.

Las mutaciones pueden ser cualquier tipo de mutaciones de estos ácidos nucleicos, tales como mutaciones de punto, mutaciones de supresión, mutaciones de inserción y/o mutaciones de cambio de marco. Un ácido nucleico variante puede ser preparado con el fin de adaptar su secuencia de nucleótido a un sistema de expresión específico. Por ejemplo, los sistemas de expresión bacteriana se conocen por ser polipéptidos más eficientemente expresados si los aminoácidos son codificados por codones particulares.

Debido a la degeneración del código genético, más de un codón pueden codificar la misma secuencia de aminoácido, secuencias de ácido nucleico múltiples pueden codificar la misma proteína o polipéptidos, todas estas secuencias de ADN están abarcadas por una realización de la presente. Donde sea apropiado, las secuencias de ácido nucleico que codifican la CPP sintasa y la esclareol sintasa pueden ser optimizadas para expresión incrementada en la célula huésped. Por ejemplo, los nucleótidos de una realización de la presente pueden ser sintetizados usando codones particulares a un huésped para expresión mejorada.

Otra herramienta importante para transformar los organismos huésped o células adecuadas para llevar a cabo el procedimiento de una realización de la presente in vivo es un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de conformidad con cualquier realización de una realización de la presente. Tal vector por lo tanto, también se proporciona en la presente.

Los organismos huésped no humanos recombinantes y células transformadas para albergar al menos un ácido nucleico de una realización de la presente de manera que lo expresan heterólogamente o sobre-expresan al menos un polipéptido de una realización de la presente, son también herramientas muy útiles para llevar a cabo el procedimiento de una realización de la presente. Tales organismos huésped no humanos y células por lo tanto también se proporcionan en la presente.

Un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente puede ser usado para transformar el organismo huésped no humano y células y el polipéptido expresado puede ser cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente.

Los organismos huésped no humanos de una realización de la presente pueden ser cualquiera de los organismos unicelulares o multicelulares no humanos. En una realización particular, el organismo huésped no humano es una planta, un procariota o un hongo. Cualquier planta, procariota u hongo es adecuado para ser transformado de conformidad con los procedimientos proporcionados en la presente. Las plantas particularmente útiles son aquellas que producen naturalmente altas cantidades de terpenos.

En una realización más particular el organismo huésped no humano es un microorganismo. Cualquier microorganismo es adecuado para ser usado en la presente, pero de conformidad con una realización aún más particular tal microorganismo es una bacteria o levadura. Más particularmente, tal bacteria es E. coli y tal levadura es Saccharomyces cerevisiae.

Las células eucarióticas aisladas también pueden ser transformadas, en lugar de organismos completos. Como células eucarióticas superiores, significa aquí cualquier célula eucariótica no humana excepto células de levadura. Las células eucarióticas superiores particulares son células de planta o células fúngicas.

Las realizaciones proporcionadas en la presente incluyen, pero no se limitan a secuencias de ADNc, ADN genómico y ARN.

Los genes, que incluyen los polinucleótidos de una realización de la presente, pueden ser clonados con base en la información de secuencia de nucleótido disponible, tal como se encuentra en el listado de secuencias adjunto y por procedimientos conocidos en la técnica. Estas incluyen por ejemplo, el diseño de cebadores de ADN que representan las secuencias de flanqueo de tal gen del cual uno es generado en orientaciones sentido y el cual inicia la síntesis de la hebra sentido y el otro es creado en forma complementaria inversa y genera la hebra antisentido. Las polimerasas de ADN termoestables tales como aquellas usadas en reacción en cadena de la polimerasa son comúnmente usadas para llevar a cabo tales experimentos. Alternativamente, las secuencias de ADN que representan genes pueden ser químicamente sintetizadas y subsecuentemente introducidas en moléculas de vector de ADN que pueden ser multiplicadas mediante por ejemplo, bacterias compatibles tales como por ejemplo, E. coli.

Las secuencias de ácido nucleico de una realización de la presente que codifica a CPP sintasa y las proteínas de esclareol sintasa pueden ser insertadas en vectores de expresión y/o estar contenidas en genes quiméricos insertados en vectores de expresión, para producir CPP sintasa y esclareol sintasa en una célula u organismo huésped. Los vectores para insertar transgenes en el genoma de las células huésped son bien conocidos en la técnica e incluyen plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. Los vectores de co-integración o binarios en los cuales un gen es insertado también se usan para transformar células huésped.

Una realización proporcionada en la presente proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico que codifica una CPP sintasa y una esclareol sintasa cada una, separadamente, son operablemente ligadas a secuencias de ácido nucleico asociadas tales como, por ejemplo, secuencias promotoras.

Alternativamente, la secuencia promotora puede ya estar presente en un vector de manera que la secuencia de ácido nucleico la cual está siendo transcrita es insertada en el vector corriente abajo de la secuencia promotora. Los vectores son diseñados por ingeniería típicamente para tener un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple, y un marcador seleccionable.

Ejemplo 1

Genes de Diterpeno Sintasa

Dos diterpeno sintasa son necesarias para la conversión de geranilgeranil difosfato (GGPP) a manool; una diterpeno sintasa tipo I y tipo II. En los siguientes ejemplos, varios tipos de combinaciones de diterpeno sintasa tipo I y tipo II se seleccionaron y evaluaron para la producción de manool. Para las sintasas tipo II, se seleccionaron cinco copalil difosfato (CPP) sintasas:

- SmCPS, NCBI acceso No ABV57835.1, de Salvia miltiorrhiza.

- CfCPS1, NCBI acceso No AHW04046.1, de Coleus forskohlii.

- TaTps1, NCBI acceso No BAH56559.1, de Triticum aestivum.

- MvCps3, NCBI acceso No AIE77092.1, de Marrubium vulgare.

- RoCPS1, NCBI acceso No AHL67261.1, de Rosmarinus officinalis.

Los empleos de codón del ADNc que codifica las cinco CPP sintasas se modificaron para la expresión óptima en E. coli (DNA 2.0, Menlo Park, CA 94025) y los sitios de restricción NdeI y Kpnl se agregaron al extremo 5' y 3', respectivamente. Además, los ADNc se diseñaron para expresar la CPP sintasa recombinante con supresión de la señal peptídica predicha (aminoácidos 58, 63, 59, 63 y 67 para SmCPS, CfCPS1, TaTps1, MvCps3 y RoCPS1, respectivamente).

Para la diterpeno sintasa tipo I, se usó la esclareol sintasa de Salvia sclarea (SsScS) (NCBI acceso No AET21246.1, WO2009095366). El empleo de codón del ADNc se optimizó para expresión de E. coli (DNA 2.0, Menlo Park, CA 94025), los primeros 50 codones N-terminales se removieron y los sitios de restricción NdeI y KpnI se agregaron al extremo 5' y extremo 3', respectivamente. Todos los ADNc se sintetizaron in vitro y se clonaron en el plásmido pJ208 o pJ401 (DNA 2.0, Menlo Park, CA 94025, EE.UU.).

Ejemplo 2

Plásmidos de expresión

El ADNc que codifica a SmCPs modificado (SmCPS2) y ADNc que codifica a esclareol sintasa (SsScS) (1132-2-5_opt) se digirieron con NdeI y KpnI y se ligaron en el plásmido pETDuet-1 proporcionando los plásmidos de expresión pETDuet-SmCPS2 y pETDuet-1132opt, respectivamente.

Se construyó otro plásmido para co-expresión de las enzimas SmCPS2 y SsScS junto con una geranilgeranil difosfato (GGPP) sintasa. Para la GGPP sintasa, se usó el gen CrtE de Pantoea agglomerans (NCBI acceso M38424.1) que codifica una GGPP sintasa (NCBI número de acceso AAA24819.1). El gen CrtE se sintetizó con optimización del codón y adición de los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción NcoI y BamHI en los extremos 3' y 5' (DNA 2.0, Menlo Park, CA 94025, EE.UU.) y se ligó entre el sitio NcoI y BamHI del plásmido pETDuet-1 para obtener el plásmido pETDuet-CrtE. El ADNc que codifica a SmCPS2 se digirió con NdeI y KpnI y se ligó en el plásmido pETDuet-1-CrtE proporcionando de este modo el constructo pETDuet-CrtE-SmCPS2. El ADNc optimizado (1132-2-5_opt) que codifica el SsScS truncado entonces se introdujo en el plásmido pETDuet-CrtE-SmCPS2 usando la técnica In-Fusion® (Clontech, Takara Bio Europe). Para esta clonación, el pETDuet-1132opt se usó como plantilla en una amplificación de PCR usando el cebador directo SmCPS2-1 132Inf_F1 5'-CTGTTTGAGCCGGTCGCCTAAGGTACCAGAAGGAGATAAATAATGGCGAAAATG AAGGAGAACTTTAAACG-3 ' (SEQ ID NO: 9) y el cebador inverso 1132-pET_Inf_R1 5'-GCAGCGGTTTCTTTACCAGACTCGAGGTCAGAACACGAAGCTCTTCATGTCCTCT-3' (SEQ ID NO: 10). El producto de PCR se ligó en el plásmido pETDuet-CrtE-SmCPS2 se digirió con las enzimas de restricción KpnI y XhoI y usando el Kit de Clonación de PCR Dry-Down In-Fusion® (Clontech, Takara Bio Europe), proporcionando el nuevo plásmido pETDuet-CrtE-SmCPS2-SsScS. En este plásmido, el gen CrtE bajo el control del primer promotor T7 del plásmido pETDuet y los ADNcs que codifican a CPP sintasa y esclareol sintasa se organizaron en un constructo bicistrónico bajo el control del segundo promotor T7.

El plásmido pETDuet-CrtE-SmCPS2-SsScS se usó como plantilla para construcción de nuevos plásmidos de expresión que llevan las cuatro otras enzimas que codifican a CPP sintasas. El ADNc de SmCPS2 se reemplazó por uno del ADNc que codifica las cuatro nuevas CPP sintasa usando un procedimiento de digestión-ligación de restricción de NdeI-KpnI proporcionando los nuevos plásmidos pETDuet-CrtE-CfCPS1del63-SsScS, pETDuet-CrtE-TaTps1del59-SsScS, pETDuet-CrtE-MvCps3del63-SsScS y pETDuet-CrtE-RoCPS1del67-SsScS.

Ejemplo 3

Expresión heteróloga en E. coli y actividades enzimáticas

Se usaron plásmidos de expresión (pETDuet-SmCPS2 o pETDuet-1132opt) para transformar células de E. coli Bi21(DE) (Novagene, Madison, WI). Colonias únicas de células transformadas se usaron para inocular 25 ml de medio LB. Después de 5 a 6 horas de incubación a 37°C, los cultivos se transfirieron a una incubadora a 20°C y se dejaron 1 hora para equilibrio. La expresión de la proteína se indujo entonces por la adición de 0,1 mM de IPTG y el cultivo se incubó durante la noche a 20° C. Al siguiente día, las células se recolectaron por centrifugación, se resuspendieron en 0,1 volumen de 50 mM de MOPSO (sal sódica de ácido 3-morfolino-2-hidroxipropansulfónico, sal sódica de ácido 3-(N-morfolinil)-2-hidroxipropansulfónico) amortiguador a pH 7, 10% de glicerol, 1 mM de DTT y se lisó por sonicación. Los extractos se separaron por centrifugación (30 min a 20,000 g) y los sobrenadantes que contienen las proteínas solubles se usaron para experimentos adicionales.

Ejemplo 4

Ensayos de actividad de diterpeno sintasa in vitro

Se realizaron ensayos enzimáticos en tubos de vidrio sellados con Teflón usando 50 a 100 pl de extracto de proteína en un volumen final de 1 mL de 50 mM de MPSO a pH 7, 10% de glicerol suplementado con 20 mM de MgCh y 50 hasta 200 pM de geranilgeranil difosfato (GGPP) purificado (preparado como se describe por Keller and Thompson, J. Chromatogr, 1993, 645(1): 161-167). Los tubos se incubaron 5 hasta 48 horas a 30°C y los productos enzimáticos se extrajeron dos veces con un volumen de pentano. Después de la concentración bajo un flujo de nitrógeno, los extractos se analizaron por GC-MS y se compararon con extractos de proteínas de control (obtenidas de células transformadas con el plásmido vacío). Los análisis de GC-MS se realizaron en un sistema GC series Agilent 6890 equipado con una columna DB1 (grosor de película (30m x 0,25mm x 0,25mm; Agilent) y se acoplaron con un espectrómetro de masas series 5975. El gas portador fue helio a una velocidad constante de 1 ml/min. La inyección fue en modo menos dividido con la temperatura del inyector ajustada a 260°C y la temperatura del horno se programó de 100°C hasta 225°C a 10°C/min y a 280°C a 30°C/min. Las identidades de los productos se confirmaron con base en la concordancia de los índices de retención y espectro de masas de estándares auténticos.

En estas condiciones y con la proteína recombinante de células E. coli transformadas con los plásmidos pETDuet-SmCPS2 o pETDuet-1132opt (que expresan heterólogamente las enzimas SmCPS o ScScS, respectivamente) no se detectó producción de moléculas de diterpeno en los extractos de solvente (los diterpenos que contienen difosfato no se detectaron en estas condiciones). Se realizaron entonces ensayos similares pero combinando los 2 extractos de proteína que contienen las SmCPS y SsScS recombinantes en un ensayo único. En estos ensayos, un producto mayor se formó y se identificó por ser (+)-manool igualando el espectro de masas e índice de retención con estándares auténticos (Figura 3). Este experimento demostró que una esclareol sintasa puede ser usada en conjunto con una CPP sintasa para producir manool.

Ejemplo 5

Producción de manool in vivo usando células E. coli

La producción in vivo de manool usando cultivos de células completas se evaluó usando células de E. coli. El gen CrtE insertado en los plásmidos de co-expresión descrito en el Ejemplo 2 codifica una enzima que tiene actividad de GGPP sintasa que usa farnesil-difosfato (FPP) para producir geranilgeranil difosfato (GGPP). Para incrementar el nivel de la combinación de GGPP endógeno y por lo tanto, la productividad en diterpeno de las células, una trayectoria completa heteróloga de mevalonato que conduce a FPP se co-expresó en las mismas células. Las enzimas de esta trayectoria se expresaron usando un plásmido único que contiene todos los genes organizados en dos operones bajo el control de dos promotores. La construcción de este plásmido de expresión se describe en la solicitud de patente WO2013064411 o en Schalk et al., (J. Am. Chem. Soc, 2013, 134: 18900-18903). Brevemente, un primer operón sintético que consiste de genes de acetoacetil-CoA tiolasa de E. coli (atoB), HMG-CoA sintasa de Staphylococcus aureus (mvaS), HMG-CoA reductasa de Staphylococcus aureus (mvaA) y FPP sintasa de Saccharomyces cerevisiae (ERG20) se sintetizó in vitro (DNA2.0, Menlo Park, CA, EE.UU.) y se ligó en el vector pACYCDuet-1 digerido con Ncol-BamHI (Invitrogen) proporcionando pACYC-29258. Un segundo gen que contiene una mevalonato cinasa (MvaK1), una fosfomevalonato cinasa (MvaK2), una mevalonato difosfato descarboxilasa (MvaD), y una isopentenil difosfato isomerasa (idi) se amplificó a partir de ADN genómico de Streptococcus pneumoniae (ATCC BAA-334) y se ligó en el segundo sitio de multiclonación de pACYC-29258 proporcionando el plásmido pACYC-29258-4506. Este plásmido de este modo contiene los genes que codifican todas las enzimas de la trayectoria biosintética que conduce de acetilcoenzima A a FPP.

Células E. coli KRX (Promega) se co-transformaron con el plásmido pACYC-29258-4506 y un plásmido se seleccionó a partir de pETDuet-CrtE-SmCPS2-SsSc, pETDuet-CrtE-CfCPS1del63-SsScS, pETDuet-CrtE-TaTps1del59-SsScS, pETDuet-CrtE-MvCps3del63-SsScS, o pETDuet-CrtE-RoCPS1del67-SsScS. Las células transformadas se seleccionaron en placas de LB-agarosa con carbenicilina (50 pg/ml) y cloranfenicol (34 pg/ml). Las colonias únicas se usaron para inocular 5 mL de medio LB líquido suplementado con los mismos antibióticos. Los cultivos se incubaron durante la noche a 37°C. Al siguiente día 2 mL de medio TB suplementado con los mismos antibióticos se inocularon con 0,2 mL del cultivo de la noche. Después de 6 horas de incubación a 37°C, el cultivo se enfrió a 28°C y 0,1 mM de IPTG, 0,2% de ramnosa y un volumen 1:10 de decano se agregaron a cada tubo. Los cultivos se incubaron por 48 horas a 28°C. Los cultivos entonces se extrajeron dos veces con 2 volúmenes de MTBE (metil terc-butil éter), las fases orgánicas se concentraron a 500 y se analizaron por GC-MS como se describe anteriormente en el Ejemplo 4 excepto para la temperatura del horno la cual fue 1 minuto de retención a 100°C, seguido por un gradiente de temperatura de 10°C/min a 220°C y 20°C/min y a 3000°C.

Bajo estas condiciones de cultivo, se produjo manool con cada combinación de diterpeno sintasa tipo II y la esclareol sintasa de Salvia sclarea (SsScS) (Figuras 4 y 5). Las cantidades de compuestos de diterpeno producidos se cuantificaron usando un estándar interno (alfa-longipineno). La tabla abajo muestra las cantidades manool producidas con relación a la combinación SmCPS/SsScS, cuando la ScScS se combina con varias diterpeno sintasa tipo II (bajo estas condiciones experimentales, la concentración de manool producido por las células que expresan la SmCPS y la SsScS fue 300 a 500 mg/L (Figura 4)). Bajo estas condiciones, la cantidad relativa más alta de manool producido fue con la combinación TaTps1del59.

Ejemplo 6

Producción de (+)-manool usando células recombinantes, producción y análisis de RMN.

Un litro de cultivo de E. coli se preparó en las condiciones descritas en el Ejemplo 5, usando la combinación de enzima SmCPS/SsScS, excepto que la fase orgánica de decano se reemplazó por 50g/L de Amberlite XAD-4 por extracción de fase sólida. El medio de cultivo se filtró para recuperar la resina. La resina entonces se lavó con 3 volúmenes de columna de agua, y se eluyó usando 3 volúmenes de columna de MTBE. El producto entonces se purificó además por cromatografía instantánea en gel de sílice usando una fase móvil compuesta de heptano:MTBE 8:2 (v/v). La estructura de manool se confirmó por 1H- y RMN-¹³C usando un espectrómetro Bruker Avance de 500 MHz. La rotación óptica se midió usando un polarímetro Perkin-Elmer 241 y el valor de [a]D2o = 26,9° (0,3%, de CHCl3) confirmó la producción de (+)-manool.

Ejemplo 7

Producción de manool in vivo en células E. coli usando esclareol sintasas a partir de Nicotiana glutinosa.

Las esclareol sintasas a partir de la planta Nicotiana glutinosa se describen en el documento WO 2014/022434 y se muestran por producir esclareol a partir de labdendiol difosfato (LPP). Se evaluaron dos de las esclareol sintasas descritas en el documento WO 2014/022434, NgSCS-del29 (que corresponde a la SEQ ID NO: 78 en el documento WO 2014/0224) y NgSCS-del38 (que corresponde a la SEQ ID NO: 40 delo documento WO 2014/022434) para la producción de (+)-manool bajo condiciones similares al Ejemplo 5.

Un ADNc que codifica NgSCS-del29 se diseñó como un empleo de codón óptimo para expresión de E. coli y que incluye los sitios Kpnl y XhoI en el extremo 5' y extremo 3' respectivamente. Este ADN se sintetizó por DNA 2.0 (Newark, CA 94560).

El plásmido pETDuet-CrtE-SmCPS2-SsScS (Ejemplo 2) se usó como plantilla para construcción de un nuevo plásmido de expresión. El plásmido pETDuet-CrtE-SmCPS2-SsScS se digirió con los sitios de restricción Kpnl y XhoI para reemplazar el ADNc de SsScS con el ADNc de NgSCS-del29, proporcionando el nuevo plásmido pETDuet-CrtE-SmCPS2-del29.

Células E. coli XRK (Promega) se co-transformaron con el plásmido pACYC-29258-4506 (Ejemplo 5) y el plásmido pETDuet-CrtE-SmCPS2-del29. Las células transformadas se seleccionaron y cultivaron en condiciones para producción de diterpeno como se describe en el Ejemplo 5. La producción de diterpenos se evaluó usando análisis de GC-MS y los compuestos de diterpeno producidos se cuantificaron usando un estándar interno (alfa-longipineno). Con la nueva combinación de las diterpeno sintasas SmCPS2 y NgSCS-del29, se produjo manool por células E. coli transformadas (Figura 6). La combinación de diterpeno sintasas SmCPS2y NgSCS-del38 no produce manool bajo las condiciones experimentales usadas. De este modo, al menos una de la esclareol sintasa de Nicotiana glutinosa también puede ser usada para producir manool a partir de CPP. Sin embargo, las cantidades producidas usando la sintasa de Nicotiana glutinosa fueron muy inferiores que con la sintasa de SsSCS (véase tabla siguiente).

Ejemplo 8

El manool obtenido en los ejemplos anteriores se convirtió en sus ésteres de conformidad con la siguiente parte experimental (en la presente abajo como ejemplo en su acetato):

Siguiendo la literatura (G. Ohloff, Helv. Chim. Acta 41, 845 (1958)), 32,0g (0,11 moles) de (+)-Manool puro cristalino se trataron por 20,0g (0,25 moles) de cloruro de acetilo en 100 ml de dimetil anilina por 5 días a temperatura ambiente. La mezcla se calentó adicionalmente por 7 horas a 50°C para alcanzar 100% de conversión. Después del enfriamiento, la mezcla de reacción se diluyó con éter, se lavó sucesivamente con 10% de H2SO4, NaHCO3 acuoso y agua para neutralidad. Después del secado (Na2SO4) y concentración, el producto se destiló (balón a balón, B.p. = 160°, 0,1 mbar) para dar 20,01g (79,4%) de acetato de manool el cual se usó sin purificación adicional.

MS: M+ 332 (0); m/e: 272 (27), 257 (83), 137 (62), 95 (90), 81 (100).

RMN-¹H(CDCl3): 0,67, 0,80, 0,87, 1,54y 2,01 (5s, 3H cada uno), 4,49 (s, 1H), 4,80 (s, 1H), 5,11 (m, 1H), 5,13 (m, 1H), 5,95 (m, 1H).

RMN-¹³C (CDCl3): 14,5 (q), 17,4 (t), 19,4 (t), 21,7 (q), 22,2 (q), 23,5 (q), 24,2 (t), 33,5 (s), 33,6 (t), 38,3 (t), 39,0 (t), 39,3 (t), 39,8 (s), 42,2 (t), 55,6 (d), 57,2 (t), 83,4 (s), 106,4 (t), 113,0 (t), 142,0 (d), 148,6 (s), 169,9 (s).

Ejemplo 9

El acetato de manool obtenido en los ejemplos anteriores se convirtió en sus trienos de conformidad con la siguiente parte experimental (en la presente abajo como ejemplo en su Esclareno y (Z+E)-Biformeno):

A una solución de 0,4g de Acetato de Manool en 4ml de ciclohexano a temperatura ambiente se añadió 0,029g (0,05 eq.) de complejo de BF3.AcOH. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, la reacción se apagó con NaHCO3 acuoso y se lavó con agua para neutralidad. El análisis de GC-MS mostró solamente hidrocarburos los cuales se identificaron como Esclareno, (Z) y (E)-biformeno. No se detectó acetato de copalol.

Otro ensayo con más catalizador (0,15 eq) proporcionó el mismo resultado.

• Esclareno: MS: M+272 (18); m/e: 257 (100), 149 (15), 105 (15).

• (Z) y (E)-Biformeno (espectro idéntico): MS: M+272 (29); m/e: 257 (100), 187 (27), 161 (33), 105 (37).

Ejemplo 10

El manool obtenido en los ejemplos anteriores se convirtió en ésteres de copalilo de conformidad con la siguiente parte experimental (en la presente abajo como ejemplo en el acetato):

^Manool Acetato de Copahlo-(Z) Acetato de Copahlo-(E)

A una solución de 0,474 g (0,826 mmoles, 0,27eq.) de BF3.AcOH en 100 ml de ciclohexano a temperatura ambiente se añadió 4,4 g de anhídrido acético y 12,1g de ácido acético. A temperatura ambiente, se agregaron 10,0g (33 moles) de manool cristalino puro en 15 ml de ciclohexano (sl. Exotérmico) y la temperatura se mantuvo a temperatura ambiente usando un baño de agua. Después de 30 minutos de agitación a temperatura ambiente, un control GC no mostró material de partida. La mezcla de reacción se apagó con 300ml de NaHCO3 acuoso saturado y se trató como usualmente. La mezcla cruda (9,9g) se purificó por cromatografía instantánea (SiO², pentano/éter 95:5) y destilación balón a balón (Eb.= 130°, 0,1 mbar) para dar 4,34g (37,1%) de una mezcla 27/73 de Acetato de copalilo (Z) y (E). • Acetato de Copalilo-(Z):

MS: M+ 332 (0); m/e: 317 (2), 272 (35)=, 257 (100), 137 (48), 95 (68), 81 (70).

RMN-¹H (CDCb): 0,67, 0,80, 0,871,76 y 2,04 (5s, 3H cada uno), 4,86 (s, 1H), 5,35 (t: J = 6Hz, 1H).

• Acetato de Copalilo-(E):

MS: M+ 332 (0); m/e: 317 (2), 272 (33)= 257 (100), 137 (54), 95 (67), 81 (74).

RMN-¹H (CDCb): 0,68, 0,80, 0,871,70 y 2,06 (5s, 3H cada uno), 4,82 (s, 1H), 5,31 (t: J = 6Hz, 1H).

RMN-¹³C (CDCl³): (Espectro registrado en una mezcla (Z/E), solamente se proporcionan señales significantes): 61,4 (t), 106,2 (t), 117,9 (d), 143,1 (s), 148,6 (s), 171,1 (s).

Ejemplo 11

El acetato de copalilo obtenido en los ejemplos anteriores se convirtió en Copalol de conformidad con la siguiente parte experimental:

Acetato de copalilo (4,17g, 12,5 mmol), pelotillas de KOH (3,35g, 59,7mmoles), agua (1,5g) y EtOH (9,5ml) se mezclaron en conjunto y se agitó por 3 horas a 50°. Después de la preparación usual, 3,7g de (Z+E)-Copalol crudo se obtuvieron y se purificó por cromatografía instantánea (SiO2, pentano/éter 7:2. Después de la evaporación del solvente, una destilación de balón a balón (Eb = 170°, 0,1 mbar) proporcionó 3,25g (92%) de una mezcla 27/73 de (Z) y (E)-Copalol.

• (Z)-Copalol

MS: M+290 (3); m/e: 275 (18), 272 (27), 257 (82), 137 (71), 95 (93), 81 (100), 69 (70).

RMN-1H (CDCb): 0,67, 0,80, 0,87 y 1,74 (4s, 3H cada uno); 4,06 (m, 2H), 4,55 (s, 1H), 4,86 (s, 1H), 5,42 (t: J = 6Hz, 1H).

• (E)-Copalol

MS: M+290 (3); m/e: 275 (27), 272 (22), 257 (75), 137 (75), 95 (91), 81 (100), 69 (68).

RMN-1H (CDCla): 0,68, 0,80, 0,87 y 1,67 (4s, 3H cada uno); 4,15 (m, 2H), 4,51 (s, 1H), 4,83 (s, 1H), 5,39 (t, J = 6Hz, 1H)

RMN-13C (CDCh): (Espectro registrado en mezcla (Z/E), solamente se proporcionan señales significantes): 59,4 (t), 106,2 (t), 123,0 (d), 140,6 (s), 148,6 (s).

Ejemplo 12

Producción de manool in vivo en células de Saccharomyces cerevisiae usando diferentes combinaciones de CPP sintasas y esclareol sintasas.

Se evaluaron diferentes combinaciones de diterpeno sintasas clase I y clase II para la producción de manool en células de S. cerevisiae.

Para la diterpeno sintasa clase II, se seleccionaron cinco CPP sintasas:

- SmCPS, NCBI acceso No ABV57835.1, de Salvia miltiorrhiza.

- CfCPS1, NCBI acceso No AHW04046.1, de Coleus forskohlii.

- TaTps1, NCBI acceso No BAH56559.1, de Triticum aestivum.

- MvCps3, NCBI acceso No AIE77092.1, de Marrubium vulgare.

- RoCPS1, NCBI acceso No AHL67261.1, de Rosmarinus officinalis

Para la clase I, se seleccionaron dos esclareol sintasas putativas de Nicotiana glutinosa y una de Salvia sclarea: - NgSCS-del38 (que corresponde a la SEQ ID NO: 40 del documento WO 2014/022434).

- NgSCS-del29 (que corresponde a la SEQ ID NO: 78 del documento WO 2014/022434).

- SsScS, NCBI acceso No AET21246.1, de Salvia sclarea.

El empleo de codón del ADN que codifica diferentes CPP sintasas se modificó para expresión óptima en S. cervisiae. Además, las secuencias de a Dn se diseñaron para expresar la CPP sintasa recombinante con supresión de la señal peptídica predicha (aminoácidos 58, 63, 59, 63 y 67 para SmCPS, CfCPS1, TaTps1, MvCps3 y RoCPS1, respectivamente). Las secuencias de ADN de NgSCS-del38, NgSCS-del29 y SaSCS también se optimizaron de codón para expresión de S. cerevisiae.

Para la expresión de diferentes genes en S. cerevisiae, se construyeron una serie de plásmidos in vivo usando recombinación homóloga endógena de levadura como se describe previamente en Kuijpers et al., Microb Cell Fact., 2013, 12:47. Cada plásmido se compone de seis fragmentos de ADN los cuales se usaron para co-transformación de S. cerevisiae. Los fragmentos fueron:

a) marcador de levadura LEU2: construido por PCR usando los cebadores 5'AGGTGCAGTTCGCGTGCAATTATAACGTCGTGGCAACTGTTATCAGTCGTACCGCGCCATTCGACTAC GTCGTAAGGCC-3' (SEQ ID NO: 44) y 5' TCGTGGTC AAGGCGTGCAATTCTCAACACGAGAGTGATTCTTCGGCGTTGTTGCTGACCATCGACGGTCGAGGAGA ACTT-3' (SEQ ID NO: 45) con el plásmido pESC-LEU (Agilent Technologies, California, EE.UU.) como plantilla;

b) Marcador de E. coli AmpR, construido por PCR usando los cebadores 5'-TGGTCAGCAACAACGCCGAAGAATCACTCTCGTGTTGAGAATTGCACGCCTTGACCACGACACGTTAA GGGATTTTGGTCATGAG-3' (SEQ ID NO: 37) y 5'-AACGCGTACCCTAAGTACGGCACCACAGTGACTATGCAGTCCGCACTTTGCCAATGCCAAAAATGTGC GCGGAACCCCTA-3' (SEQ ID NO: 38) con el plásmido pESC-URA como plantilla;

c) Origen de replicación de levadura, obtenido por PCR usando los cebadores 5'-TTGGCATTGGCAAAGTGCGGACTGCATAGTCACTGTGGTGCCGTACTTAGGGTACGCGTTCCTGAACG AAGCATCTGTGCTTCA-3' (SEQ ID NO: 39) y 5'-CCGAGATGCCAAAGGATAGGTGCTATGTTGATGACTACGACACAGAACTGCGGGTGACATAATGATAG CATTGAAGGATGAGACT-3' (SEQ ID NO: 40) con pESC-URA como plantilla;

d) Origen de replicación de E. coli, obtenido por PCR usando los cebadores 5' ATGTCACCCGCAGTTCTGTGTCGTAGTCATCAACATAGCACCTATCCTTTGGCATCTCGGTGAGCAAAA GGCCAGCAAAAGG-3' (SEQ ID NO: 41) y 5'-CTCAGATGTACGGTGATCGCCACCATGTGACGGAAGCTATCCTGACAGTGTAGCAAGTGCTGAGCGTC AGACCCCGTAGAA-3' (SEQ ID NO: 42) con el plásmido pESC-URA como plantilla;

e) un fragmento compuesto por los últimos 60 nucleótidos del fragmento “d”, 200 nucleótidos corriente abajo del codón de detención del gen de levadura PGK1, la secuencia codificante de GGP sintasa CrtE (de Pantoea agglomerans, NCBI acceso M38424.1) de codón optimizado para su expresión en S. cerevisiae, el promotor de levadura bidireccional de GAL10/GAL1, una de las secuencias codificantes de esclareol sintasa probadas, 200 nucleótidos corriente abajo del codón de detención del gen de levadura CYC1 y la secuencia 5'-ATTCCTAGTGACGGCCTTGGGAACTCGATACACGATGTTCAGTAGACCGCTCACACATGG-3' (SEQ ID NO: 43), este fragmento se obtuvo por síntesis de ADN (DNA 2.0, Menlo Park, CA 94025) y

f) un fragmento compuesto por los últimos 60 nucleótidos del fragmento “e”, 200 nucleótidos corriente abajo del codón de detención del gen de levadura CYC1, una de las secuencias codificantes de CPP sintasa probadas, el promotor de levadura bidireccional de GAL10/GAL1 y 60 nucleótidos que corresponden al comienzo del fragmento “a”, este fragmento se obtuvo por síntesis de ADN (DNA 2.0, Menlo Park, CA 94025).

En total, se construyeron 15 plásmidos los cuales cubren todas las combinaciones posibles de diterpeno sintasa clase I y II listadas anteriormente. La tabla abajo muestra todos los plásmidos.

Para incrementar el nivel de combinación de farnesil-difosfato endógeno (FPP) en células de S. cervisiae, una copia extra de todos los genes endógenos de levadura involucrados en la trayectoria de mevalonato, a partir de ERG10 que codifica acetil-CoA C-acetiltransferasa a ERG20 que codifica FPP sintetasa, se integraron en el genoma de S. cerevisiae cepa CEN.PK2-1C (Euroscarf, Frankfurt, Alemania) bajo el control de promotores inducibles de galactosa, similarmente como se describe en Paddon et al., Nature, 2013, 496:528-532. Brevemente, se integraron tres casetes en los loci LEU2, TRP1 y URA3 respectivamente. Un primer casete que contiene los genes ERG20 y un HMG1 truncado (tHMGI) como se describe en Donald et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 1997, 109:E111-8, bajo el control del promotor bidireccional GAL10/GAL1 y los genes ERG19 y ERG13 también bajo el control del promotor GAL10/GAL1, el casete se flanqueó por dos regiones de 100 nucleótidos que corresponden a las secciones corriente arriba y corriente abajo de LEU2. Un segundo casete donde los genes IDI1 y tHMG1 estuvieron bajo el control del promotor GAL10/GAL1 y el gen ERG12 bajo el control de la región promotora de GAL7, el casete se flanqueó por dos regiones de 100 nucleótidos que corresponden a las secciones corriente arriba y corriente abajo de TRP1. Un tercer casete de los genes ERG10, ERG12, tHMG1 y ERG8, todos bajo el control de promotores GAL10/GAL1, el casete se flanqueó por dos regiones de 100 nucleótidos que corresponden a las secciones corriente arriba y abajo de URA3.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir (+)-manool que comprende:

a) poner en contacto geranilgeranil difosfato (GGPP) con una copalil difosfato sintasa (CPP) para formar un copalil difosfato, en donde la CPP sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15; o b) poner en contacto el CPP con una esclareol sintasa para formar (+)-manool; y en el que el polipéptido que tiene actividad de esclareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; y

c) opcionalmente aislar el (+)-manool.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa a) comprende cultivar una célula u organismo huésped no humano capaz de producir GGPP y transformarlo para expresar al menos un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15; y que tiene una actividad de CPP sintasa, en condiciones propicias para la producción de CPP.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, caracterizado porque el procedimiento comprende además, antes de la etapa a), transformar un organismo o célula huésped no humano capaz de producir GGPP con

a) al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15; y que tiene una actividad de CPP sintasa, de modo que dicho organismo o célula expresa dicho polipéptido que tiene una actividad de CPP sintasa; y,

b) al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de esclareol sintasa en el que el polipéptido que tiene actividad de esclareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID. NO: 4 o SEQ ID NO: 5, de modo que dicho organismo o célula exprese dicho polipéptido que tiene una actividad de esclareol sintasa.

4. El procedimiento según se menciona en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque comprende además procesar el (+)-manool a un derivado de (+)-manool usando una síntesis química o bioquímica, o una combinación de ambas.

5. El procedimiento según se menciona en la reivindicación 6, caracterizado porque el derivado es un alcohol, acetal, aldehido, ácido, éter, cetona, lactona, acetato y/o un éster.

6. El procedimiento según se recita en la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque el derivado es seleccionado a partir del grupo que consiste en copalol, copalal, manooloxi, Z-11, gamma-ambrol y ambrox.

7. Un procedimiento para transformar una célula huésped o un organismo no humano, caracterizado porque comprende transformar una célula huésped o un organismo no humano con un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de copalil difosfato sintasa y un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de esclareol sintasa,

en donde el polipéptido que tiene actividad de copalil difosfato comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15; y

en donde el polipéptido que tiene actividad de esclareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.

8. El procedimiento según se menciona en cualquiera de las reivindicaciones 3-7 en el que la célula u organismo huésped no humano es una planta, un procariota, o un hongo.

9. El procedimiento según se menciona en cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en célula u organismo huésped no humano es E. coli o Saccharomyces cerevisiae.

10. Una célula u organismo huésped no humano, que comprende

a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de copalil difosfato sintasa y un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de esclareol sintasa,

en donde el polipéptido que tiene actividad de copalil difosfato comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15; y

en donde el polipéptido que tiene actividad de esclareol sintasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; y |en donde al menos uno de los ácidos nucleicos es heterólogo con la célula u organismo huésped no humano.

11. La célula u organismo huésped no humano de la reivindicación 10, en el que la célula u organismo huésped no humano es una planta, un procariota, un hongo, Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae.