ES2896686T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento de una enfermedad fibrótica - Google Patents

Composiciones y métodos para el tratamiento de una enfermedad fibrótica Download PDF

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Konstantinos Alevizopoulos
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Abstract

Un compuesto de fórmula (IV) R-Y1-CH2-CO-X (IV) en donde R es un grupo alquileno insaturado no sustituido C10-24 lineal, comprendiendo dicho grupo al menos 4 dobles enlaces no conjugados; X es CF3; y Y1 se selecciona de O, S, SO o SO2; o una sal de este para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad fibrótica, en donde la enfermedad fibrótica es un trastorno fibrótico pulmonar o fibrosis hepática.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para el tratamiento de una enfermedad fibrótica
Esta invención se relaciona con composiciones para uso en el tratamiento de enfermedades fibróticas o trastornos fibróticos. En particular, la invención se relaciona con el uso de ciertas cetonas poliinsaturadas de cadena larga en el tratamiento, prevención o reducción de síntomas de fibrosis o afecciones relacionadas.
Antecedentes de la invención
La fibrosis es una característica de muchas enfermedades inflamatorias crónicas y es una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La fibrosis se caracteriza por la acumulación de un exceso de componentes de la matriz extracelular (por ejemplo, colágeno, fibronectina) que forma tejido conectivo fibroso en y alrededor de un tejido inflamado o dañado. La fibrosis puede causar, por ejemplo, crecimiento excesivo, endurecimiento y/o cicatrización que altera la arquitectura del órgano o tejido subyacente. Si bien la remodelación y cicatrización controlada de tejido es parte del proceso normal de cicatrización de heridas, la cicatrización excesiva y persistente debido a lesiones graves o repetitivas o cicatrización de heridas desregulada pueden eventualmente conducir a cicatrices permanentes, disfunción y falla de órganos e incluso la muerte.
La fibrosis y los cambios relacionados pueden ocurrir en trastornos vasculares tales como enfermedad vascular periférica, enfermedad cardíaca, enfermedad cerebral y en todos los sistemas principales de tejidos y órganos (por ejemplo, pulmón, hígado, riñón, corazón, piel). Los trastornos fibróticos incluyen una amplia gama de presentaciones clínicas, que incluyen trastornos multisistémicos, como esclerosis sistémica, fibroesclerosis multifocal y trastornos específicos de órganos, como fibrosis pulmonar, hepática y renal. Si bien la etiología y los mecanismos causales de los trastornos fibróticos individuales pueden variar (por ejemplo, evento isquémico, exposición a una sustancia química, radiación o agente infeccioso) y no se comprenden completamente, casi todos comparten la característica común de la deposición anormal y excesiva de matriz extracelular en tejidos afectados.
Los presentes inventores buscaron nuevos métodos para tratar enfermedades fibróticas ya que no existen terapias claramente eficaces para tratar, prevenir o reducir los síntomas de las enfermedades fibróticas. Por tanto, existe la necesidad de métodos eficaces para tratar, prevenir o reducir los síntomas asociados con estos trastornos. Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que ciertas cetonas poliinsaturadas de cadena larga pueden usarse para tratar, prevenir o reducir los síntomas de enfermedades fibróticas.
Las cetonas poliinsaturadas de cadena larga no son nuevas en sí mismas. Se han descrito métodos para preparar compuestos de cetona poliinsaturados en J. Chem. Soc., Perkin Trans 1, 2000, 2271-2276. Sin embargo, estos compuestos no se han sugerido previamente para uso en el tratamiento, prevención o reducción de síntomas de trastornos fibróticos.
El documento WO 02/060535 divulga un método para tratar o modular procesos inflamatorios, como la fibrosis pulmonar idiopática, usando un inhibidor de cPLA2.
Liver International, 2011, p.1565-1573; L. Zhao et al. describe la inhibición de cPLA2 en relación con el daño hepático y muestra que cPLA2 está implicado en la activación de las células estrelladas hepáticas (HSC).
Sumario de la invención
Por tanto, visto desde un aspecto, la invención proporciona un compuesto de fórmula (IV)
R-Y1-CH2-CO-X (IV)
en donde R es un grupo alquileno insaturado no sustituido C10-24 lineal, comprendiendo dicho grupo al menos 4 dobles enlaces no conjugados;
X es CF3; y
Y1 se selecciona de O, S, SO o SO2; o una sal de este
para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad fibrótica, en donde la enfermedad fibrótica es un trastorno fibrótico pulmonar o fibrosis hepática.
Visto desde otro aspecto, la invención proporciona un compuesto de fórmula (IV) o una sal de este como se describió anteriormente para uso para tratar, prevenir o reducir los síntomas de un trastorno fibrótico, seleccionado entre un trastorno fibrótico pulmonar o fibrosis hepática.
Visto desde otro aspecto, la invención proporciona un compuesto de fórmula (IV) o una sal de este como se describió anteriormente para uso como un medicamento para reducir uno o más del contenido de hidroxiprolina o la expresión de ARNm de colágeno de tipo I en el pulmón o hígado de un animal.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra microfotografías representativas de fibrosis renal inducida por UUO revelada por tinción con rojo Sirio de secciones de riñón. UUO indujo una fibrosis renal significativa (grupo de vehículo) en comparación con el control simulado. La fibrosis renal se redujo significativamente en los animales UUO tratados con el compuesto B. (x200: aumento aplicado).
La Figura 2 muestra microfotografías representativas de la inflamación renal inducida por UUO revelada por secciones de riñón teñidas con PAS. UUO indujo una inflamación renal significativa (grupo de vehículo) en comparación con el control simulado. La inflamación del riñón se redujo en los animales UUO tratados con el compuesto B, especialmente en el grupo de dosis alta. (x100, x400: diferentes aumentos de la misma muestra). La Figura 3 muestra que los inhibidores selectivos contra cPLA2a reducen la expresión de ARNm de marcadores fibróticos en células tratadas con TGF-p1.
La Figura 4 muestra que el compuesto B reduce los niveles de eicosanoide PGE2 proinflamatorio en sobrenadantes de fibroblastos de riñón de rata tratados con TGF-p1.
La Figura 5 muestra microfotografías representativas de fibrosis renal inducida por UUO reveladas por tinción con rojo Sirio de secciones de riñón. UUO indujo una fibrosis renal significativa (grupo de vehículo) en comparación con el control simulado. La fibrosis renal se redujo significativamente en los animales UUO tratados con el compuesto B. x200: aumentos aplicados, ID: corresponde al número de muestra.
La Figura 6 muestra microfotografías representativas de la inflamación renal inducida por UUO revelada por secciones de riñón teñidas con PAS. UUO indujo una inflamación renal significativa (grupo de vehículo) en comparación con el control simulado. La inflamación del riñón se redujo en los animales UUO tratados con el compuesto B, especialmente en el grupo de dosis alta (15 mg/kg). x100, x400: diferentes aumentos de la misma muestra. ID: corresponde al número de muestra.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación proporciona métodos para prevenir, mejorar, tratar o incluso reducir los síntomas de un trastorno fibrótico o enfermedad fibrótica. Como se usa aquí, puede entenderse que el término "tratar o prevenir" se relaciona con el tratamiento o prevención de la enfermedad en sí o el tratamiento o prevención de los síntomas asociados con la enfermedad, incluida la reducción de la enfermedad y/o los síntomas y/o la desaceleración de la progresión de la enfermedad y/o síntomas. El término fibrosis describe el desarrollo de tejido conectivo fibroso como una respuesta reparadora a una lesión o daño. La reparación de tejidos dañados es un proceso biológico fundamental que permite el reemplazo ordenado de células muertas o lesionadas durante una respuesta inflamatoria, un mecanismo que es crucial para la supervivencia. El proceso de reparación generalmente involucra dos etapas distintas: una fase regenerativa, en la que las células dañadas son reemplazadas por células del mismo tipo y no hay evidencia duradera de daño; y una fase conocida como fibroplasia o fibrosis, en la que el tejido conectivo reemplaza al tejido parenquimatoso normal. En la mayoría de los casos, se requieren ambas etapas para ralentizar o revertir el daño causado por un agente nocivo. Sin embargo, aunque inicialmente es beneficioso, el proceso de curación puede volverse patógeno si continúa sin control, lo que lleva a una remodelación tisular considerable y a la formación de tejido cicatricial permanente. La cicatrización fibrótica a menudo se define como una respuesta de curación de heridas que ha salido mal.
Una lesión es un evento que daña el tejido e inicia el proceso de curación de la herida. Después de una lesión, tanto las señales mecánicas (es decir, el estrés extracelular causado por la interrupción de la matriz extracelular, ECM) como las químicas (por ejemplo, mediadores inflamatorios como TGF.beta.) activan las células fibroblásticas para aumentar la producción de componentes de la matriz extracelular (ECM), dando inicio al proceso de diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos (Tomasek et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3:349, 2002; Werner et al., Physiol. Rev.
83:835, 2003). Dependiendo del tipo de tejido que se esté remodelando, los fibroblastos que se diferencian pueden provenir de diferentes fuentes, incluidos fibroblastos, pericitos, células de músculo liso presentes localmente, fibrocitos de médula ósea y de transición epitelio-mesenquimatosa (EMT) (Hinz et al., Am. J. Pathol. 170:1807, 2007). La cicatrización de la herida se considera completa cuando el ECM entrecruzado recién formado asume la carga mecánica, que es una señal para que los miofibroblastos experimenten apoptosis (Tomasek et al., 2002; Carlson et al., J. Surg. Res. 110:304, 2003).
Si la lesión es grave o repetitiva, o si el proceso de cicatrización de la herida está desregulado, la fibrosis se vuelve patógena, lo que da como resultado cicatrización permanente o endurecimiento del tejido, mal funcionamiento o fallo de los órganos y, en última instancia, la muerte. Por ejemplo, la fibrosis pulmonar idiopática (IPF) no se comprende completamente, pero se considera una enfermedad pulmonar progresiva y fatal que tiene pocos tratamientos efectivos además del trasplante de pulmón (Mason et al., Ann. Thorac. Surg. 84:1121-8, 2007). La mediana de supervivencia de cinco años después del diagnóstico es inferior al 20 %. La mayoría de las formas de enfermedades pulmonares intersticiales y otras formas de fibrosis pulmonar se caracterizan por lesiones fibróticas, se produce una distorsión progresiva de la arquitectura alveolar y el reemplazo por tejido fibrótico o cicatricial con un exceso de depósito de ECM (American Thoracic Society, Am. J. Respir. Crit. Care Med 161:646, 2000; Noble et al., Clin. Chest Med. 25:749, 2004; Selman et al., Ann. Intern, Med. 134:136, 2001). Esto puede resultar en disnea progresiva y pérdida de la función pulmonar. Una lesión morfológica característica es la heterogeneidad espacial y temporal que incorpora áreas de pulmón normal que están directamente adyacentes a áreas de fibrosis completamente establecida, formación de panales microscópicos y áreas de fibrosis en evolución que contienen fibroblastos/miofibroblastos productores de colágeno, a menudo denominados "focos fibróticos".
El término "trastorno fibrótico" o "enfermedad fibrótica" (que se usan indistintamente aquí) se refiere a una afección médica que presenta fibrosis progresiva y/o irreversible, en donde se produce un depósito excesivo de matriz extracelular en y alrededor de tejido inflamado o dañado. En determinadas realizaciones, un trastorno o enfermedad fibrótica se asocia con la presencia persistente de miofibroblastos en y alrededor de focos o lesiones fibróticas. La fibrosis excesiva y persistente puede remodelar y destruir progresivamente el tejido normal, lo que puede provocar disfunción y fallo de los órganos afectados y, en última instancia, la muerte. Un trastorno fibrótico puede afectar cualquier tejido del cuerpo y generalmente se inicia por una lesión y la transdiferenciación de fibroblastos en miofibroblastos.
Como se usa aquí, "lesión" se refiere a un evento que daña el tejido e inicia la fibrosis. Una lesión puede ser causada por un factor externo, como daño mecánico (por ejemplo, corte, cirugía), exposición a radiación, químicos (por ejemplo, quimioterapia, toxinas, irritantes, humo) o agente infeccioso (por ejemplo, bacteria, virus o parásito). Una lesión puede ser causada, por ejemplo, por inflamación autoinmune crónica, respuesta alérgica, desajuste de HLA (por ejemplo, receptores de trasplante) o isquemia (es decir, un "evento isquémico" o "isquemia" se refiere a una lesión que restringe el suministro de sangre a un tejido, lo que resulta en daño o disfunción del tejido, que puede ser causado por problemas con los vasos sanguíneos, aterosclerosis, trombosis o embolia, y puede afectar una variedad de tejidos y órganos; un evento isquémico puede incluir, por ejemplo, un infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, trasplante de órganos o tejidos o estenosis de la arteria renal). En determinadas realizaciones, una lesión que conduce a un trastorno fibrótico puede ser de etiología desconocida (es decir, idiopática).
Los ejemplos no limitantes de trastornos fibróticos o enfermedades fibróticas incluyen fibrosis renal (riñón), fibrosis pulmonar, tal como fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, fibrosis hepática (por ejemplo, cirrosis), fibrosis cardíaca, fibrosis endomiocárdica, fibrosis vascular (por ejemplo, aterosclerosis, estenosis, reestenosis), fibrosis auricular, fibrosis mediastínica, mielofibrosis, fibrosis retroperitoneal, fibrosis masiva progresiva (por ejemplo, pulmones), fibrosis sistémica nefrogénica, enfermedad de Crohn, cicatrización hipertrófica, queloide, esclerodermia, esclerosis sistémica (por ejemplo, piel, pulmones), atrofibrosis (por ejemplo, rodilla, hombro, otras articulaciones), enfermedad de Peyronie, contractura de Dupuytren, capsulitis adhesiva, fibrosis asociada a trasplante de órganos, fibrosis asociada a isquemia, o similares.
En un aspecto que no está de acuerdo con la invención, la divulgación se refiere al tratamiento, prevención o reducción de síntomas asociados con la fibrosis renal (riñón). La referencia a "fibrosis renal" o "fibrosis de riñón" (los dos términos se usan indistintamente aquí) significa una manifestación fibrótica progresiva de diversas enfermedades que pueden conducir a una enfermedad grave e incluso a la muerte. Por ejemplo, la enfermedad renal crónica (CKD) puede presentarse en algunos pacientes con un fenotipo fibrótico potencialmente mortal. Esta condición (CKD con fibrosis) puede resultar de una variedad de otras indicaciones graves, como nefropatía diabética, hipertensión, glomerulonefritis (GN) y enfermedad poliquística. Sin desear estar ligado a la teoría, se cree que las terapias previas destinadas a tratar estas enfermedades a menudo son inadecuadas para detener el desarrollo o progresión de la fibrosis que conduce a una enfermedad grave y la muerte en algunos casos. La presente divulgación aborda este problema, por ejemplo, proporcionando un método que se centra en el desarrollo y/o progresión de la fibrosis en un paciente que tiene, se sospecha que tiene o está en riesgo de desarrollar CKD, neuropatía diabética, hipertensión, glomerulonefritis (GN) y/o una enfermedad poliquística.
En una realización, la invención se relaciona con tratamiento de un trastorno fibrótico pulmonar. La referencia a "trastorno fibrótico pulmonar" significa enfermedades o trastornos caracterizados por hipertrofia fibrótica o fibrosis del tejido pulmonar. Los trastornos fibróticos pulmonares de ejemplo incluyen fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar intersticial, neumonitis intersticial crónica, síndrome de Hamman-Rich, neumonitis intersticial habitual (UIP), alveolitis fibrosante, sarcoidosis pulmonar, fibrosis masiva progresiva (por ejemplo, pulmones), esclerosis sistémica (por ejemplo, pulmones), fibrosis asociada a trasplante de pulmón o similares.
Un aspecto que no está de acuerdo con la invención implica el uso de compuestos de fórmula (I) o sales de los mismos en el tratamiento o prevención de trastornos fibróticos. En el compuesto de fórmula (I)
R-L-CO-X (I)
R es un grupo hidrocarburo insaturado C10-24 opcionalmente interrumpido por uno o más heteroátomos o grupos de heteroátomos seleccionados entre S, O, N, SO, SO2, comprendiendo dicho grupo hidrocarburo al menos 4 dobles enlaces no conjugados;
L es un grupo de enlace que forma un puente de 1 a 5 átomos entre el grupo R y el carbonilo CO en donde L comprende al menos un heteroátomo en el esqueleto principal del grupo de enlace; y
X es un grupo extractor de electrones; o una sal de este.
El grupo R preferiblemente comprende de 5 a 9 dobles enlaces, preferiblemente 5 u 8 dobles enlaces, por ejemplo, 5 a 7 dobles enlaces como 5 o 6 dobles enlaces. Estos enlaces no deben estar conjugados. También se prefiere si los dobles enlaces no se conjugan con la funcionalidad carbonilo.
Los dobles enlaces presentes en el grupo R pueden estar en la configuración cis o trans, sin embargo, se prefiere si la mayoría de los dobles enlaces presentes (es decir, al menos el 50 %) están en la configuración cis. En otras realizaciones ventajosas, todos los dobles enlaces del grupo R están en la configuración cis o todos los dobles enlaces están en la configuración cis excepto el doble enlace más cercano al grupo carbonilo que puede estar en la configuración trans.
El grupo R puede tener entre 10 y 24 átomos de carbono, preferiblemente de 12 a 20 átomos de carbono, especialmente de 17 a 19 átomos de carbono.
Aunque el grupo R puede estar interrumpido por al menos un heteroátomo o grupo de heteroátomos, esto no es preferido y el esqueleto principal del grupo R contiene preferiblemente solo átomos de carbono.
El grupo R puede llevar hasta tres sustituyentes, por ejemplo, seleccionado de halo, alquilo C1-6 , por ejemplo, metilo o alcoxi C1-6. Si están presentes, los sustituyentes son preferiblemente no polares y pequeños, por ejemplo, un grupo metilo. Sin embargo, se prefiere si el grupo R permanece sin sustituir.
El grupo R es preferiblemente un grupo alquileno.
El grupo R es preferiblemente lineal. Preferiblemente deriva de una fuente natural tal como un éster o ácido graso de cadena larga. En particular, el grupo R puede derivar de AA, EPA o DHA.
Por tanto, visto desde otro aspecto que no está de acuerdo con la invención, la divulgación emplea un compuesto de fórmula (I')
R-L-CO-X (I')
en donde R es un grupo alquileno insaturado no sustituido C10-24, comprendiendo dicho grupo al menos 4 dobles enlaces no conjugados;
L es un grupo de enlace que forma un puente de 1 a 5 átomos entre el grupo R y el carbonilo CO en donde L comprende al menos un heteroátomo en el esqueleto del grupo de enlace; y
X es un grupo extractor de electrones; o una sal de este.
Idealmente, R es lineal. Por tanto, R es preferiblemente una cadena de polialquileno C10-24 insaturado.
El grupo de enlace L proporciona un grupo puente de 1 a 5 átomos de esqueleto principal, preferiblemente de 2 a 4 átomos de esqueleto principal entre el grupo R y el carbonilo, tal como 2 átomos. Los átomos en el esqueleto principal del enlazador pueden ser carbono y/o heteroátomos tales como N, O, S, SO, SO2. Los átomos no deben formar parte de un anillo y los átomos del esqueleto principal del grupo de enlace pueden estar sustituidos con cadenas laterales, por ejemplo, con grupos tales como alquilo C1-6 , oxo, alcoxi o halo.
Los componentes preferidos del grupo de enlace son -CH2-, -CH(alquilo C1-6)-, -N(alquilo C1-6)-, -NH-, -S-, -O-, -CH=CH-, -CO-, -SO-, -SO2- que pueden combinarse entre sí en cualquier orden (químicamente significativo) para formar el grupo de enlace. Por tanto, utilizando dos grupos metileno y un grupo -S- se forma el enlazador -SCH2CH2-. Se apreciará que al menos un componente del enlazador proporciona un heteroátomo en el esqueleto principal. El grupo de enlace L contiene al menos un heteroátomo en el esqueleto principal. También se prefiere si el primer átomo del esqueleto principal del grupo de enlace unido al grupo R es un heteroátomo o grupo de heteroátomos. Es muy preferido si el grupo de enlace L contiene al menos un enlace -CH2- en el esqueleto principal. Idealmente, los átomos del grupo de enlace adyacentes al carbonilo son -CH2-.
Se prefiere que el grupo R o el grupo L (dependiendo del tamaño del grupo L) proporcione un heteroátomo o grupo de heteroátomos posicionados a, p, y o 8 en el carbonilo, preferiblemente p o y en el carbonilo. Preferiblemente, el heteroátomo es O, N o S o un derivado de azufre tal como So .
Los grupos de enlace L muy preferidos son, por tanto, -NH2CH2 , -NH(Me)CH2-, -SCH2 , -SOCH2-, o -COCH2-El grupo de enlace no debe comprender un anillo.
Los grupos de enlace L muy preferidos son SCH2 , NHCH2 y N(Me)CH2.
Visto desde otro aspecto que no está de acuerdo con la invención, la divulgación emplea un compuesto de fórmula (II)
R-L-CO-X (II)
en donde R es un grupo alquileno insaturado no sustituido C10-24 lineal, comprendiendo dicho grupo al menos 4 dobles enlaces no conjugados;
L es -SCH2-, -OCH2, -SOCH2 o -SO2CH2-; y
X es un grupo extractor de electrones o una sal de este.
El grupo X es un grupo extractor de electrones. Los grupos adecuados a este respecto incluyen O-alquilo C1-6, CN, OCO2-alquilo C1-6, fenilo, CHah, CHahH, CHalH2 en donde Hal representa un halógeno, por ejemplo, flúor, cloro, bromo o yodo, preferiblemente flúor.
En una realización preferida, el grupo extractor de electrones es CHah, especialmente CF3.
Por tanto, los compuestos preferidos de fórmula (I) son los de fórmula (III) (no de acuerdo con la invención).
R-Y1-Y2-CO-X (III)
en donde R es un grupo alquileno insaturado no sustituido C10-24, comprendiendo dicho grupo al menos 4 dobles enlaces no conjugados;
X es como se definió anteriormente;
Y1 se selecciona de O, S, NH, N(alquilo C1-6), SO o SO2 y
Y2 es (CH2)n o CH(alquilo C1-6); o
donde n es 1 a 3, preferiblemente 1.
De acuerdo con la presente invención, los compuestos son los de fórmula (IV)
R-Y1 -CH2-CO-X (IV)
en donde R es un grupo alquileno insaturado no sustituido C10-24 lineal, comprendiendo dicho grupo al menos 4 dobles enlaces no conjugados;
X es CF3; y
Y1 se selecciona entre O, S, SO o SO2.
A continuación, se representan compuestos muy preferidos para uso en la invención.
Figure imgf000007_0001
donde X es CF3
Los siguientes compuestos son muy preferidos para uso en la invención:
Figure imgf000007_0002
X= CF3 = Compuesto A
Figure imgf000007_0003
X= CF3 = Compuesto B
De acuerdo con la invención, los compuestos A o B se utilizan en el tratamiento o prevención de la fibrosis pulmonar o hepática.
Donde sea posible, los compuestos de la invención se pueden administrar en forma de sal, hidrato o solvato, especialmente en forma de sal.
Normalmente, una sal farmacéuticamente aceptable se puede preparar fácilmente usando un ácido deseado. La sal se puede precipitar de la solución y recolectarse por filtración o puede recuperarse por evaporación del disolvente. Por ejemplo, se puede añadir una solución acuosa de un ácido tal como ácido clorhídrico a una suspensión acuosa de un compuesto de fórmula (I) y la mezcla resultante se evapora a sequedad (liofilizada) para obtener la sal de adición de ácido como un sólido. Alternativamente, se puede disolver un compuesto de fórmula (I) en un disolvente adecuado y se puede añadir el ácido en el mismo disolvente u otro disolvente adecuado. La sal de adición de ácido resultante puede precipitarse luego directamente, o mediante la adición de un disolvente menos polar, tal como diisopropiléter o hexano, y aislarse por filtración.
Las sales de adición adecuadas se forman a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos que forman sales no tóxicas y los ejemplos son clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, bisulfato, nitrato, fosfato, hidrógeno fosfato, acetato, trifluoroacetato, maleato, malato, fumarato, lactato, tartrato, citrato, formiato, gluconato, succinato, piruvato, oxalato, oxalacetato, trifluoroacetato, sacarato, benzoato, alquil o aril sulfonatos (por ejemplo, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato o p-toluenosulfonato) e isetionato. Los ejemplos representativos incluyen trifluoroacetato y sales de formiato, por ejemplo, las sales de bis o tris trifluoroacetato y las sales de mono o diformiato, en particular la sal de tris o bis trifluoroacetato y la sal de monoformiato.
Los compuestos de fórmula (IV) se pueden fabricar usando rutas de síntesis química conocidas. Es conveniente comenzar la síntesis a partir de los compuestos disponibles comercialmente ácido araquidónico (AA), EPA (ácido todo-Z-eicosa-5,8,11,14,17-pentaenoico) o DHA (ácido todo-Z-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoico). La conversión de la funcionalidad ácida de estos compuestos en, por ejemplo, un grupo -COCF3 se puede lograr fácilmente, por ejemplo, convirtiendo el ácido carboxílico en su correspondiente cloruro de ácido y haciéndolo reaccionar con anhídrido trifluoroacético en presencia de piridina.
La introducción de un heteroátomo en la cadena de carbono también se logra fácilmente. Convenientemente, por ejemplo, el ácido de partida se reduce a un alcohol y, si es necesario, se convierte en el tiol correspondiente. A continuación, el tiol nucleófilo puede hacerse reaccionar con un grupo tal como BrCH2COCF3, introduciendo de ese modo la especie carbonilo y aceptora de electrones. Se pueden encontrar protocolos sintéticos completos en J. Chem. Soc., Perkin Trans 1, 2000, 2271-2276 o J. Immunol., 1998, 161, 3421.
La cantidad de los compuestos de la invención en la composición la determinará a menudo el médico dependiendo de la dosificación requerida.
La composición de la invención se propone para uso en el tratamiento o prevención de trastornos fibróticos, en donde el trastorno fibrótico es un trastorno fibrótico pulmonar o fibrosis hepática.
Por tratar o tratamiento se entiende al menos uno de:
(I). inhibir la enfermedad, es decir, detener, reducir o retrasar el desarrollo de la enfermedad o una recaída de esta o al menos un síntoma clínico o subclínico de esta, o
(ii). aliviar o atenuar uno o más de los síntomas clínicos o subclínicos de la enfermedad.
Por prevención se entiende (i) prevenir o retrasar la aparición de síntomas clínicos de la enfermedad que se desarrolla en un mamífero.
El beneficio para un sujeto a tratar es estadísticamente significativo o al menos perceptible para el paciente o para el médico. En general, una persona experimentada puede apreciar cuándo se produce el "tratamiento". Es particularmente preferido si la composición de la invención se usa terapéuticamente, es decir, para tratar una condición que se ha manifestado en lugar de profilácticamente. Puede ser que la composición de la invención sea más eficaz cuando se usa de manera terapéutica que profiláctica.
La composición de la invención se puede usar en cualquier sujeto animal, en particular un mamífero y más particularmente en un humano o un animal que sirve como modelo para una enfermedad (por ejemplo, ratón, mono, etc.).
Para tratar una enfermedad, es necesario administrar a un paciente una cantidad eficaz de la composición activa. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de una composición que, cuando se administra a un animal para tratar un estado, trastorno o afección, es suficiente para efectuar dicho tratamiento. La "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo de la composición, la enfermedad y su gravedad y la edad, peso, condición física y capacidad de respuesta del sujeto a tratar y, en última instancia, quedará a criterio del médico asistente.
Puede ser que para tratar la fibrosis de acuerdo con la invención, la composición de la invención tenga que volver a administrarse a ciertos intervalos. Un médico puede prescribir regímenes de dosificación adecuados.
La composición de la invención típicamente comprende los componentes activos mezclados con al menos un portador farmacéuticamente aceptable seleccionado con respecto a la vía de administración pretendida y la práctica farmacéutica estándar.
El término "portador" se refiere a un diluyente, excipiente y/o vehículo con el que se administra un compuesto activo. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener combinaciones de más de un portador. Dichos portadores farmacéuticos son bien conocidos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender cualquier aglomerante o aglomerantes, lubricante o lubricantes, agente o agentes de suspensión, agente o agentes de recubrimiento y/o agente o agentes solubilizantes adecuados, etc. Las composiciones también pueden contener otros componentes activos, por ejemplo, otros fármacos para el tratamiento contra el cáncer. Se apreciará que la composición farmacéutica para uso de acuerdo con la presente invención puede estar en forma de suspensiones orales, parenterales, transdérmicas, sublinguales, tópicas, de implante, nasales o administradas enteralmente (u otras administradas por vía mucosa), cápsulas o comprimidos, que pueden formularse de manera convencional usando uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones de la invención también podrían formularse como formulaciones de nanopartículas.
Sin embargo, para el tratamiento de la fibrosis, la composición de la invención se puede administrar mediante una variedad de rutas tales como por oral o parenteralmente (por ejemplo, subcutánea, intramuscular o intravenosa).
Para muchas realizaciones de la invención, se preferirá la administración subcutánea. En realizaciones en las que las composiciones de la invención se administran por vía oral, la composición puede por tanto proporcionarse en forma de comprimido o solución inyectable.
La composición farmacéutica de la invención puede contener de 0.01 a 99 % en peso, por volumen del material activo. Las dosis terapéuticas estarán generalmente entre aproximadamente 10 y 2 0 0 0 mg/día y preferiblemente entre aproximadamente 30 y 1500 mg/día. Pueden usarse otros intervalos, que incluyen, por ejemplo, 50-500 mg/día, 50-300 mg/día, 100-200 mg/día.
La administración puede ser una vez al día, dos veces al día o más a menudo, y puede reducirse durante una fase de mantenimiento de la enfermedad o trastorno, por ejemplo, una vez cada dos o tres días en lugar de todos los días o dos veces al día. La dosis y la frecuencia de administración dependerán de los signos clínicos, que confirman el mantenimiento de la fase de remisión, con la reducción o ausencia de al menos uno o más preferiblemente más de un signo clínico de la fase aguda conocido por la persona experimentada en la técnica.
El tratamiento de acuerdo con la invención puede llevarse a cabo junto con otros tratamientos conocidos para la enfermedad fibrótica en cuestión. Por ejemplo, a los pacientes con fibrosis pulmonar se les puede administrar oxígeno. El tratamiento de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo en otras realizaciones junto con otros tratamientos conocidos en la misma o en diferentes composiciones farmacéuticas. Los "agentes de combinación" ilustrativos pueden incluir, entre otros: un fármaco inmunosupresor que incluye, pero no se limita a, ciclosporina, azatioprina, ciclofosfamida o micofenolato de mofetilo; un fármaco antiinflamatorio que incluye, pero no se limita a, corticosteroides (por ejemplo, prednisona), una citoquina que incluye, pero no se limita a, interferón alfa, interferón gamma, interleucina 12, un inhibidor de TNF, CCR2, CCR5 o VAP1; talidomida; un agente antihipertensivo que incluye, pero no se limita a, inhibidores de la ACE, ARB, inhibidores de renina y antagonistas de los receptores de mineralcorticoides (por ejemplo, captopril, ramipril, lisinopril, losarían, telmisartan, aliskiren, espironolactona, finerenona, CS-3150, MT-3995, eplerenona, etc.); un anticuerpo monoclonal u otro agente direccionado a, entre otros, CTGF, TGF-p, MCP-1, IL-4 e IL-13; un inhibidor de tirosina quinasa de múltiples receptores que incluye, pero no se limita a, nintedanib y el inhibidor de JNK (quinasa) tanzisertib (CC-930) o ruxolitinib (Jakavi™); un antioxidante tal como, pero no limitado a, N-acetilcisteína, pirfenidona, vitamina E, S-adenosil metionina, piridorin, GKT137831 o penicilamina; un inhibidor de enzima que incluye, pero no se limita, a lisiloxidasa-tipo-2 (enzima LOXL2); un inhibidor de la integrina tal como, pero sin limitarse a, ayp6; un modulador del receptor de lípidos o un agente hipolipidémico que incluye, pero no se limita a, antagonistas del receptor del ácido lisofosfatídico, inhibidores de la HMG-CoA reductasa, inhibidores de estearoil-CoA desaturasa, inhibidores de PPAR y tiazolindionas o inhibidores de la absorción de colesterol; un inhibidor que afecta la vasculatura o la angiogénesis que incluye pero no se limita a inhibidores de ETa como atrasentan, inhibidores de SGLT2 como canagliflozin; pomalidomida; un inhibidor de la apoptosis como IDN-6556 o GS-4997; un inhibidor de PDE como CTP-499; un inhibidor de la trombomodulina o una terapia con base en células madre (SC) como las SC de cordón umbilical, las SC autólogas y las SC de médula ósea;
La invención se describe con más detalle a continuación con referencia a los siguientes ejemplos y figuras no limitantes.
Ejemplo 1 (ejemplo de referencia)
La obstrucción ureteral unilateral (UUO) es un modelo de roedor bien validado de lesión renal que se utiliza para estudiar la fisiopatología de la fibrosis intersticial renal. El modelo se basa en la ligadura quirúrgica de un uréter único (izquierdo o derecho) bajo anestesia que desencadena un aumento de la presión hidrostática resultante de la obstrucción que conduce a la muerte celular tubular progresiva por apoptosis y necrosis, infiltración inflamatoria intersticial, rarefacción capilar y fibrosis progresiva con pérdida de parénquima renal, activación de miofibroblasto y deposición de matriz extracelular (revisado en Dendooven A et al, Int. J. Exp. Path. (2011), 92, 202-210). Como la fibrosis renal inducida por UUO puede desarrollarse dentro de los 7 o 14 días posteriores a la ligadura del uréter, este modelo es muy adecuado para evaluar los efectos antifibróticos de los compuestos administrados a roedores en un período de tiempo razonablemente corto (Eddy A et al, Pediatr Nephrol.2012 Aug; 27(8):1233-47).
Articulo de prueba y formulaciones
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X= CF3 = Compuesto B
El compuesto B se formuló para administración subcutánea en una nanoemulsión que contenía 2 mg/ml de compuesto B, 2 mg/ml de aceite MCT (Lipoid), 2 mg/ml de Polisorbato 80 (Fluka) y regulador de citrato de sodio 10 mM (pH 7). La solución final se esterilizó por filtración y se saturó con argón 5.0 AGA antes de dividir en alícuotas en tubos de 10 ml almacenados a -20 ° C hasta su uso posterior. Por separado también se preparó, esterilizó, dividió en alícuotas y almacenó una solución de vehículo de polisorbato 80 y a base de regulador de citrato de sodio sin compuesto B y aceite de MCT, que sirvió como control de vehículo subcutáneo utilizado en el estudio con animales UUO.
Animales
Se obtuvieron ratones hembra C57BL/6J de siete semanas de edad de Japan SLC, Inc. (Japón). Los animales se mantuvieron en una sala para animales a una temperatura de 23 ± 2 ° C, humedad de 45 ± 10 %, bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas (luz de 8:00 a 20:00). Se mantuvo una alta presión de 20 ± 4 Pa en la sala experimental para evitar la contaminación. Los animales se alojaron en jaulas TPX (CLEA Japan) y se alimentaron con una dieta normal esterilizada (CE-2; CLEA Japan, Japón) proporcionada ad libitum, colocándose en una tapa metálica en la parte superior de la jaula. Se proporcionó agua pura ad libitum desde una botella de agua equipada con un tapón de goma y un tubo de sorbete.
Diseño experimental
Se dividieron en grupos 29 ratones hembra C57BL/6J y se trataron de acuerdo con el diseño de la Tabla 1 a continuación (día 0 a día 13).
Tabla 1. Gru os tratamientos
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Inducción de UUO
Los ratones bajo anestesia (medetomidina, midazolam, butorfanol) se afeitaron en el lado izquierdo del abdomen. Se hizo una incisión vertical a través de la piel con un bisturí y se retrajo la piel. Se hizo una segunda incisión a través del peritoneo y esa piel también se retrajo para revelar el riñón. Usando fórceps, se llevó el riñón a la superficie y se ligó la porción media del uréter izquierdo con seda quirúrgica de nailón 4-0 en dos puntos. El riñón ligado se volvió a colocar en su posición anatómica correcta y se añadió solución salina estéril para reponer la pérdida de líquido. Las incisiones se suturaron y los ratones se enjaularon individualmente para experimentación adicional.
Tratamientos grupales
La tabla 1 anterior resume los programas de tratamiento del estudio. El compuesto B (a dosis de 6 o 12 mg/kg) o el vehículo se administraron por vía subcutánea (SC) durante 13 días diariamente después de la UUO (Grupos 2-4). No se realizó UUO en animales del grupo 1 que sirvieron como grupo normal/simulado (sin enfermedad). Los animales se sacrificaron el día 14.
Evaluaciones grupales
La viabilidad, signos clínicos y comportamiento se monitorizaron diariamente. El peso corporal individual se midió diariamente antes del tratamiento. Se observaron los ratones en busca de signos clínicos significativos de toxicidad, estado moribundo y mortalidad aproximadamente 60 minutos después de cada administración. Los animales se sacrificaron mediante exanguinación mediante punción cardíaca directa bajo anestesia con isoflurano el día 14 de acuerdo con procedimientos éticos estándar.
Recolección de muestras, ensayos y mediciones
Medición de bioquímica plasmática
Para la bioquímica plasmática, se recolectó sangre no en ayunas en tubos de polipropileno con anticoagulante (Novo-Heparin, Mochida Pharmaceutical Co. Ltd., Japón) y se centrifugó a 1,000 xg durante 15 minutos a 4 ° C. El sobrenadante se recolectó y se almacenó a -80 ° C hasta su uso. El nitrógeno ureico sanguíneo en plasma (BUN) se midió con FUJI DRI-CHEM 7000 (Fujifilm, Japón).
Medición de bioquímica renal
Para cuantificar el contenido de hidroxiprolina del riñón, se procesaron muestras de riñón izquierdo congeladas mediante un método de hidrólisis de ácido alcalino de la siguiente manera. Las muestras de riñón se disolvieron en NaOH 2 N a 65 °C y se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Las muestras lisadas (400 jl) se hidrolizaron con ácido con 400 j l de HCl 6 N a 121 °C durante 20 minutos y se neutralizaron con 400 j l de NaOH 4 N que contenía 10 mg/ml de carbón activado. Se añadió regulador AC (ácido acético 2.2 M/ácido cítrico 0.48 M, 400 jl) a las muestras, seguido de centrifugación para recolectar el sobrenadante. Se construyó una curva estándar de hidroxiprolina con diluciones en serie de trans-4-hidroxi-L-prolina (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) a partir de 16 jg/ml. Las muestras y los estándares preparados (cada uno de 400 jl) se mezclaron con 400 j l de solución de cloramina T (Wako Pure Chemical Industries, Japón) y se incubaron durante 25 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las muestras se mezclaron con solución de Ehrlich (400 jl) y se calentaron a 65 ° C durante 20 minutos para desarrollar el color. Después de enfriar las muestras en hielo y centrifugarlas para eliminar los precipitados, se midió la densidad óptica de cada sobrenadante a 560 nm. Las concentraciones de hidroxiprolina se calcularon a partir de la curva estándar de hidroxiprolina. Las concentraciones de proteínas de muestras de riñón se determinaron utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos) y se utilizaron para normalizar los valores de hidroxiprolina calculados. Los contenidos de hidroxiprolina del riñón se expresaron como jg por mg de proteína.
Análisis histopatológicos
Para la tinción PAS, se cortaron secciones de bloques de parafina y se tiñeron con reactivo de Schiff (Wako Pure Chemical Industries) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para observar los daños tubulares, se capturaron imágenes de campo brillante en la región corticomedular utilizando una cámara digital (DFC295; Leica Microsystems, Alemania) con aumentos de 100 y 400 veces.
El riñón se fijó en formalina regulada neutra al 10 % (Wako Pure Chemical Industries) y se incrustaron en parafina. Para visualizar la deposición de colágeno, se tiñeron secciones de riñón usando una solución de rojo picro-Sirio (Waldeck, Alemania). Para la cuantificación del área de fibrosis intersticial, se capturaron imágenes de campo brillante en la región corticomedular usando una cámara digital (DFC295) con un aumento de 200 veces, y las áreas positivas en 5 campos/sección se midieron usando el software ImageJ (National Institute of Health, Estados Unidos). RT-PCR cuantitativa de ARNm de colágeno tipo 1
El ARN total se extrajo de muestras de riñón usando ARNiso (Takara Bio, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sometió a transcripción inversa un jg de ARN utilizando una mezcla de reacción que contenía 4.4 mM de MgCh (F. Hoffmann-La Roche, Suiza), 40 U de inhibidor de ARNasa (Toyobo, Japón), 0.5 mM de dNTP (Promega, Estados Unidos), 6.28 jM de hexámero aleatorio (Promega), 5 x regulador de primera hebra (Promega), 10 mM de ditiotreitol (Invitrogen, Estados Unidos) y 200 U de MMLV-RT (Invitrogen) en un volumen final de 20 jl. La reacción se llevó a cabo durante 1 hora a 37 °C, seguida de 5 minutos a 99 °C. La PCR en tiempo real se realizó utilizando PCR en tiempo real DICE y SYBR premezcla Taq (Takara Bio). Para calcular el nivel relativo de expresión de ARNm del gen de colágeno tipo I, su expresión se normalizó a la del gen de referencia GAPDH. Se han utilizado los siguientes conjuntos de cebadores de PCR:
GAPDH:
Sentido: 5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3' (SEQ ID NO:1)
Antisentido: 5'-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3' (SEQ ID NO:2)
Colágeno tipo 1
Sentido: 5'-CCAACAAGCATGTCTGGTTAGGAG-3' (SEQ ID NO:3)
Antisentido: 5'-GCAATGCTGTTCTTGCAGTGGTA-3' (SEQ ID NO:4)
Pruebas estadísticas
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba de comparación múltiple de Bonferroni en GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Estados Unidos). Los valores de P <0.05 se consideraron estadísticamente significativos. Se asumió una tendencia o inclinación cuando una prueba t de una cola arrojó valores de P <0.1. Los resultados se expresaron como media ± SD.
Resultados
Análisis bioquímicos
No se observaron diferencias significativas en el nitrógeno ureico sanguíneo (BUN) en plasma medido en muestras de plasma de diferentes grupos (no se muestra). En lo que respecta a la hidroxiprolina, el grupo de vehículo mostró un aumento significativo en el contenido de hidroxiprolina de riñón en comparación con el grupo de control simulado (p <0.0001). El compuesto B redujo la hidroxiprolina renal de una manera dependiente de la dosis (Tabla 2).
Tabla 2. Resultados de hidroxi rolina renal
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Análisis histológicos
Tinción de rojo Sirio
Microfotografías representativas de secciones de riñón teñidas con rojo Sirio se muestran en
Figura 1. La cuantificación del área de fibrosis intersticial (tabla 3) mostró un aumento significativo en el área de fibrosis (área positiva de rojo Sirio) del grupo de vehículo en comparación con el grupo de control simulado (p <0.0001). El grupo de dosis alta del compuesto B mostró una disminución significativa en el área de fibrosis en comparación con el grupo de vehículo (p <0.05). El grupo de dosis baja del compuesto B también tendió a disminuir el área de fibrosis en comparación con el grupo de vehículo (Tabla 3).
Tabla 3. Área de fibrosis tinción roo Sirio
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Tinción PAS
En la Figura 2 se muestran fotomicrografías representativas de secciones de riñón teñidas con PAS (ácido periódico-Schiff). Las secciones de riñón del grupo vehículo exhibieron infiltración de células inflamatorias, dilatación tubular severa, atrofia y formación de cilindros PAS positivos en las regiones cortical y medular. La infiltración de células inflamatorias se redujo con el tratamiento con compuesto B, especialmente en el grupo de tratamiento de dosis alta. No se encontraron diferencias obvias en los daños tubulares entre el grupo de vehículo y los grupos de tratamiento del compuesto B.
Pesos corporales, toxicidad de los compuestos y mortalidad
No se observaron cambios de peso significativos durante los períodos de tratamiento. No hubo animales muertos en el estudio y ninguno de los animales mostró deterioro en su estado general. Estos resultados indicaron la falta de toxicidad de los tratamientos con compuesto B.
Expresión de ARNm de colágeno tipo 1
El grupo de vehículo mostró una sobrerregulación significativa en el nivel de expresión de ARNm de colágeno tipo 1 en comparación con el grupo de control simulado (p <0.0001). El compuesto B a la dosis alta mostró una subregulación significativa en los niveles de expresión de ARNm de colágeno de tipo 1 en comparación con el grupo de vehículo (p <0.0001). El grupo de dosis baja de compuesto B también tendió a subregular el nivel de expresión de ARNm de colágeno tipo 1 en comparación con el grupo de vehículo (tabla 4).
Tabla 4. Ex resión de ARNm de colá eno ti o 1 RT-PCR
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Como puede verse en este ejemplo, la UUO indujo una fibrosis renal significativa 14 días después de la UUO en ratones C57B. El tratamiento con el compuesto B mostró una disminución significativa en el área de fibrosis de una manera dependiente de la dosis. El compuesto B también redujo el contenido de hidroxiprolina renal y la expresión de ARNm de colágeno tipo 1. La tinción con PAS mostró que la infiltración de células inflamatorias en el grupo de tratamiento con el compuesto B se redujo en comparación con el grupo de vehículo. Estos resultados mostraron que el compuesto B posee efectos antifibróticos y antiinflamatorios en el modelo UUO.
Ejemplo 2: El compuesto B inhibe la expresión inducida por TGF-p1 de marcadores de fibrosis y PGE2.
Se entiende que la fibrosis es el resultado de una lesión tisular y una inflamación crónica. Se reporta que el TGF-p1 es un regulador central del tejido conectivo y el depósito de tejido cicatricial en la fibrosis, lo que finalmente altera o destruye la función de un órgano, como los riñones, pulmones o hígado. Los siguientes datos muestran, entre otras cosas, que un inhibidor de cPLA2a reduce de manera eficiente y dependiente de la dosis los niveles transcripcionales de factores fibróticos clave y reduce la producción del eicosanoide proinflamatorio PGE2 en varios modelos celulares de fibrosis.
Se trataron tres líneas celulares diferentes con TGF-p1 para inducir marcadores de fibrosis. Los efectos antifibróticos del compuesto B se midieron mediante la expresión de ARNm de marcadores clave de fibrosis. También se muestra un efecto del compuesto B sobre los niveles del metabolito PGE2 en una de las líneas celulares.
Se usaron los siguientes materiales y métodos según fue necesario.
Cultivo celular
NRK-49F (fibroblastos de riñón de rata normales, ATCC® CRL-1570™) se mantuvieron en DMEM con 4500 mg/l de glucosa, FBS al 5 %, L-glutamina y gentamicina. Para los experimentos, se sembraron 3 x 10A5 células/pozo en placas de 6 pozos. Después de tres días, las células postconfluentes se privaron de suero durante 24 horas. Luego se preincubaron con inhibidores durante 90 minutos, antes de ser tratados con 10 ng/ml de TGF-p1 durante 24 horas (expresión de ARNm) o 72 horas (PGE2).
Se mantuvieron MRC-5 (fibroblasto de pulmón humano, ATCC® CCL-171™) en MEM con FBS al 10 %, L-glutamina y gentamicina. Para los experimentos, se sembraron 1 x 10A5 células/pozo en placas de 6 pozos. Después de dos días, las células preconfluentes se privaron de suero durante 24 horas. Luego se preincubaron con inhibidores durante 90 minutos, antes de ser tratados con 2 ng/ml de TGF-p1 durante 24 horas.
Se mantuvieron RMC (células mesangiales de rata, ATCC® CRL-2573™) en DMEM con 4500 mg/l de glucosa (Sigma), FBS al 15 %, L-glutamina y 0.4 mg/ml de G418. Para los experimentos, se sembraron 3 x 10A5 células/pozo en placas de 6 pozos. Después de cinco días, las células postconfluentes se privaron de suero durante 24 horas. Luego se preincubaron con inhibidores durante 90 minutos, antes de ser tratados con 5 ng/ml de TGF-p1 durante 24 horas.
qRT-PCR
El ARN total se aisló usando el RNeasy Mini Kit (Qiagen). La síntesis de ADNc se realizó con 1 |jg de ARN total en 20 j l de reacción del kit de transcripción inversa QuantiTect (Qiagen). Después de la síntesis, el ADNc se diluyó 1:6 con agua libre de RNasa. La qRT-PCR se realizó con LightCycler 480 SYBr Green I Master (Roche), y los análisis de qRT-PCR se llevaron a cabo utilizando el sistema Lightcycler 96 (Roche). Las secuencias de cebadores se enumeran en la tabla 5.
Tabla 5: Secuencias de cebadores
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Detección por inmunoensayo ligado a enzimas de PGE2
Las muestras de sobrenadante celular se analizaron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (EIA) para PGE2 (Cayman # 514010) de acuerdo con el protocolo del kit. Los sobrenadantes celulares se ensayaron sin diluir. Los sobrenadantes se hibridaron con incubación durante la noche, se leyó la conversión enzimática del sustrato a DO420 nm. Los datos se procesaron utilizando un modelo de ajuste logístico de 4 parámetros.
Se ha reportado que el factor de crecimiento transformante p1 (TGF-p1) es un impulsor principal de la fibrosis e induce la diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos. Se dice que la diferenciación en miofibroblastos se caracteriza por la síntesis novo de a-actina del músculo liso (a-SMA). Como se muestra en la figura 3 a-c, TGF-p1 es un potente inductor de ARNm de a-SMA en ambas líneas celulares de fibroblastos probadas y en la línea celular mesangial. El compuesto B inhibidor de cPLA2a (5 j M ) inhibe la expresión inducida por TGF-p1 de ARNm de a­ SMA en células NRK-49F en un 50 % (figura 3a). En MRC-5, el compuesto B es más eficaz, disminuyendo la expresión de ARNm de a-SMA en un 76 % (figura 3b). También en la línea celular mesangial, RMC, el compuesto B reduce la expresión de ARNm de a-SMA alrededor del 35 %, aunque no de manera significativa (figura 3c).
Se dice que los miofibroblastos activados y las células mesangiales contribuyen a un aumento significativo en la producción de ECM. Los colágenos son los componentes más abundantes de la ECM y TGF-p1 induce varios colágenos en NRK-49F y MRC-5. El tratamiento con el compuesto B redujo de manera dependiente de la dosis los niveles de colágeno. En las células NRK-49F, el compuesto B 10 j M reduce los niveles de Col1a2 en un 34 % (figura 3d) y Col3a1 en un 46 % (figura 3f). En las células MRC-5, el compuesto B 5 j M reduce los niveles de Col4a1 en un 50 % (figura 3e) y Col3a1 en un 38 % (figura 3g).
Se cree que la fibronectina juega un papel de "organizador maestro" en el ensamblaje de la matriz, ya que forma un puente entre los receptores de la superficie celular y compuestos como colágenos y proteoglicanos en la ECM [Halper and Kjaer, 2014]. En las células NRK-49F, se observó una reducción dependiente de la dosis de los niveles de fibronectina en respuesta al compuesto B. El tratamiento con el compuesto B 10 j M condujo a una reducción del 30 % en los niveles de fibronectina (figura 3h). Además, mostramos que el tratamiento con TGF-p1 de las células MRC-5 induce la expresión de ARNm del factor de crecimiento del tejido conectivo de la proteína matricelular (CTGF), que regula la producción de ECM y podría contribuir a la fibrosis [Rayego-Mateos, 2018]. El tratamiento con el compuesto B 5 pM reduce significativamente el nivel de ARNm de CTGF en un 42 % (figura 3i).
Se cree que cPLA2a es un actor clave en la regulación de la liberación de ácido araquidónico (AA) para la biosíntesis de eicosanoides [Hao, 2007]. La vía enzimática de la ciclooxigenasa (COX) convierte el AA en la prostaglandina eicosanoide E2 (PGE2) biológicamente activa y proinflamatoria. TGF-p1 induce la expresión de ARNm de Ptgs2 (que codifica la proteína COX2) en las tres líneas celulares. El compuesto B 5 pM reduce la expresión de Ptgs2 inducida por TGF-p1 en un 44 % en células NRK-49F (figura 3j). En las células MRC-5, el compuesto B 5 pM reduce la expresión de Ptgs2 en un 44 % y un 58 %, respectivamente (figura 3k). También en RMC, el compuesto B 5 pM parece reducir los niveles de ARNm de Ptgs2 (figura 3l). De acuerdo con la expresión reducida observada de Ptgs2, mostramos que la producción de PGE2 inducida por TGF-p1 se reduce de manera dependiente de la dosis en presencia del compuesto B (figura 4). El compuesto B 2 pM reduce los niveles de PGE2 en un 26 % y el compuesto B 5 pM reduce los niveles en un 58 %.
En la figura 3, la columna 1 muestra células NRK-49F postconfluentes pretratadas con inhibidores durante 90 minutos, antes del tratamiento con TGF-p1 (10 ng/ml, 24 horas). Los resultados mostrados son el promedio de tres experimentos biológicamente independientes.
La columna 2 muestra células MRC-5 preconfluentes pretratadas con inhibidores durante 90 minutos, antes del tratamiento con TGF-p1 (2 ng/ml, 24 horas). Los resultados mostrados son el promedio de tres experimentos biológicamente independientes.
La columna 3 muestra células RMC postconfluentes pretratadas con inhibidores durante 90 minutos, antes del tratamiento con TGF-p1 (5 ng/ml, 8 horas (a-SMA) o 24 horas (Ptgs2)). Se muestran los resultados de un experimento.
En la figura 4, células NRK-49F postconfluentes pretratadas con inhibidores durante 90 minutos, antes del tratamiento con 10 ng/ml de TGF-p1 durante 72 horas. Los resultados mostrados son el promedio de dos experimentos biológicamente independientes.
En las figuras se utilizan las siguientes abreviaturas:
TGF-p1, factor de crecimiento transformante p1;
a-SMA, a-actina de músculo liso;
Ptgs2, prostaglandina endoperóxido sintasa 2/ciclooxigenasa 2;
Col1a2, colágeno 1a2;
Col3a1, colágeno 3a1;
Col4a1, colágeno 4a1;
CTGF, factor de crecimiento del tejido conectivo.
Ejemplo 3 (ejemplo de referencia)
: El modelo UUO repetido con dosis más altas de compuesto B muestra una reducción de la fibrosis renal
Se repitió el experimento del modelo UUO descrito en el ejemplo 1 excepto como se indica a continuación. Los materiales y métodos que no se describen a continuación se pueden encontrar en otra parte de esta especificación. Se obtuvieron resultados antifibróticos y antiinflamatorios similares en este experimento UUO realizado a lo largo de las líneas del ejemplo 1 excepto con 12 mg/kg y 15 mg/kg de compuesto B. Brevemente, 29 ratones hembra C57BL/6J se dividieron en grupos y tratados de acuerdo con el diseño de la tabla 1, con las únicas diferencias de que el compuesto B se dosificó a 12 y 15 mg/kg en volúmenes de dosis de 6 y 7.5 ml/kg, respectivamente (Primer experimento: 6 y 12 mg/kg de compuesto B, en volúmenes de dosis de 3 y 6 ml/kg, respectivamente). Los resultados de este experimento se presentan en las Tablas 6 y 7 a continuación.
Tabla 6. Resultados de hidroxi rolina renal
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Tabla 7. Área de fibrosis tinción con roo Sirio
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En la figura 5 se muestran fotomicrografías representativas de secciones de riñón teñidas con rojo Sirio, mientras que en la figura 6 se muestran fotomicrografías representativas de secciones de riñón teñidas con PAS (ácido periódico-Schiff). En general, los resultados del experimento muestran al menos lo siguiente:
Para la hidroxiprolina (tabla 6), el grupo de vehículo mostró un aumento significativo en el contenido de hidroxiprolina de riñón en comparación con el grupo de control simulado (p <0.0001). El compuesto B pareció reducir la hidroxiprolina renal, especialmente en el grupo de dosis baja (12 mg/kg). Comparando el grupo de vehículo con el grupo de control simulado, se observó un aumento significativo en el área de fibrosis (área positiva para rojo Sirio) (p <0.0001). El compuesto B dosificado a 15 mg/kg mostró una disminución significativa en el área de fibrosis en comparación con el grupo de vehículo (p <0.01). El compuesto B dosificado a 12 mg/kg también disminuyó el área de fibrosis de una manera significativa en comparación con el grupo de vehículo (p <0.05).
Las secciones de riñón del grupo de vehículo exhibieron infiltración de células inflamatorias, dilatación tubular severa, atrofia y formación de cilindros PAS positivos en las regiones cortical y medular. La infiltración de células inflamatorias se redujo con el tratamiento con el compuesto B a 15 mg/kg. No se encontraron diferencias obvias en los daños tubulares entre el grupo de vehículo y los grupos de compuesto B 12 mg/kg.
Finalmente, y de manera comparable al experimento UUO descrito en el ejemplo 1, no se observaron cambios de peso significativos durante los períodos de tratamiento. No hubo animales muertos en el estudio y ninguno de los animales mostró deterioro en su estado general. Estos resultados confirmaron la falta de toxicidad del tratamiento con compuesto B.
La UUO indujo fibrosis renal significativa 14 días después de la UUO en ratones C57B. El tratamiento con el compuesto B mostró una disminución significativa en el área de fibrosis. La tinción de PAS mostró que la infiltración de células inflamatorias en el grupo de tratamiento con alto contenido de compuesto B se redujo en comparación con el grupo de vehículo. Estos resultados mostraron que el compuesto B posee efectos antifibróticos y antiinflamatorios en el modelo UUO.
Ejemplo 4: El compuesto B muestra actividad antifibrótica en el modelo de bleomicina de fibrosis pulmonar idiopática.
El modelo de bleomicina de fibrosis idiopática (IPF) es un modelo animal de enfermedad pulmonar intersticial (ILD) bien caracterizado y actualmente muy utilizado debido a su: i) capacidad para reproducir muchos aspectos de la enfermedad, ii) buena reproducibilidad, y iii) facilidad de inducción. En general, los estudios que utilizan el modelo de bleomicina han identificado muchos de los mecanismos celulares y moleculares que ahora se reconocen como importantes en la patogénesis de la IPF, así como nuevas terapias para las iLd . El modelo se basa en la administración intratraqueal de bleomicina en ratones que da como resultado daño epitelial alveolar, inflamación alveolar y fibrosis en un período de 21 días. En consecuencia, el modelo permite realizar pruebas terapéuticas de agentes novedosos en un período de tiempo razonablemente corto (Liu T et al, Methods Mol Biol. 2017; 1627:27-42).
Artículo de prueba y formulaciones
El compuesto B (Synthetica A/S, Noruega) se formuló para administración subcutánea en una nanoemulsión que contiene 2 mg/ml de compuesto B, 2 mg/ml de aceite MCT (Lipoid), 2 mg/ml de polisorbato 80 (Fluka) y regulador de citrato de sodio 10 mM (pH 7). La solución final se esterilizó por filtración y se saturó con argón 5.0 AGA antes de dividir en alícuotas en tubos de 10 ml almacenados a -20 ° C hasta su uso posterior. Por separado también se preparó, esterilizó, dividió en alícuotas y almacenó una solución de vehículo de polisorbato 80 y a base de regulador de citrato de sodio sin compuesto B y aceite MCT, que sirvió como control de vehículo subcutáneo utilizado en el estudio animal de UUO. Se utilizó nintedanib (aprobado y comercializado para la IPF bajo las marcas comerciales Ofev/Vargatef) como control positivo. El compuesto se adquirió de Chemexpress Co., Ltd. (China) y se suspendió en metilcelulosa al 1 %.
Animales
Se obtuvieron ratones hembra C57BL/6J de seis semanas de edad de Japan SLC, Inc. (Japón). Los animales se mantuvieron en una sala para animales a una temperatura de 23 ± 2 ° C, humedad de 45 ± 10 %, bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas (luz de 8:00 a 20:00). Se mantuvo una alta presión de 20 ± 4 Pa en la sala experimental para evitar la contaminación. Los animales fueron alojados en jaulas TPX (CLEA Japan; máximo de 6 ratones por jaula) y alimentados con una dieta normal esterilizada (CE-2; CLEA Japan, Japón) proporcionada ad libitum, colocándose en una tapa metálica en la parte superior de la jaula. Se usó Paper-Clean esterilizado (Japan SLC) para la cama y se reemplazó una vez a la semana. Se proporcionó agua pura ad libitum desde una botella de agua equipada con un tapón de goma y un tubo de sorbete.
Modelo de fibrosis pulmonar inducida por inducción de bleomicina (BLM)
El día 0, 48 ratones fueron anestesiados con pentobarbital de sodio (Kyoritsu Seiyaku, Japón) y BLM administrado por vía intratraqueal (lote # 761820, Nippon Kayaku, Japón) en solución salina a una dosis de 3 mg/kg, en un volumen de 50 pl por animal usando un Microsprayer® (Penn-Century, Estados Unidos). Los ratones se transfirieron a una jaula limpia (jaula de reposo) y se mantuvieron hasta que se recuperaron de la anestesia. La administración de BLM tuvo lugar en dos días separados, con el mismo número de ratones asignados a cada día. Los ratones se distribuyeron aleatoriamente en 4 grupos de 6 ratones con base en sus cambios de peso corporal el día antes del inicio del tratamiento en el día 7. A los ratones de control se les administró solución salina por vía intratraqueal, en lugar de BLM, y sirvieron como el grupo de control.
Diseño experimental
El diseño involucró 60 ratones hembra C57BL/6J, 12 ratones que recibieron solución salina y 48 ratones que recibieron BLM, como se describió anteriormente. Los animales se dividieron en grupos y se trataron de acuerdo con el diseño de la tabla 8 a continuación. El compuesto B (a dosis de 7 o 14 mg/kg) o el vehículo se administraron por vía subcutánea (SC) durante los días 7-20 (grupos 2-4). Nintedanib se administró per os a una dosis diaria de 100 mg/kg (grupo 5). Los animales se sacrificaron el día 21.
Tabla 8. Gru os tratamientos
Figure imgf000017_0001
Evaluaciones grupales
La viabilidad, signos clínicos y comportamiento se monitorizaron todos los días. El peso corporal se registró diariamente después del día de inicio de la administración de BLM (día 0). Los animales se sacrificaron mediante exanguinación a través de la aorta abdominal bajo anestesia con pentobarbital sódico y de acuerdo con procedimientos éticos estándar.
Recolección de muestras, ensayos y mediciones
Medición del contenido de hidroxiprolina pulmonar
Para cuantificar el contenido de hidroxiprolina pulmonar, se procesaron muestras congeladas del pulmón izquierdo completo mediante un método de hidrólisis ácida como sigue. Las muestras de pulmón se hidrolizaron con ácido con 300 |jl de HCl 6 N a 121 ° C durante 20 minutos y se neutralizaron con 300 j l de NaOH 4 N que contenía 10 mg/ml de carbón activado. Se añadió regulador AC (ácido acético 2.2 M/ácido cítrico 0.48 M, 300 jl) a las muestras, seguido de centrifugación para recolectar el sobrenadante. Se construyó una curva estándar de hidroxiprolina con diluciones en serie de trans-4-hidroxi-L-prolina (Sigma-Aldrich Co. LLC., Estados Unidos) a partir de 16 jg/ml. Las muestras y los estándares preparados (cada uno de 400 jl) se mezclaron con 400 j l de solución de cloramina T (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y se incubaron durante 25 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las muestras se mezclaron con solución de Ehrlich (400 jl) y se calentaron a 65 ° C durante 20 minutos para desarrollar el color. Después de enfriar las muestras en hielo y centrifugarlas para eliminar los precipitados, se midió la densidad óptica de cada sobrenadante a 560 nm. Las concentraciones de hidroxiprolina se calcularon a partir de la curva estándar de hidroxiprolina. Los niveles de hidroxiprolina en el pulmón se expresaron como jg por pulmón izquierdo.
Análisis histopatológico
Los tejidos del pulmón derecho prefijados en formalina regulada neutra al 10 % se incrustaron en parafina y se seccionaron a 4 jm. Para la tinción Trichrome de Masson, las secciones se tiñeron con el kit de tinción Trichrome de Masson (Sigma, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El grado de fibrosis pulmonar se evaluó utilizando la puntuación de Ashcroft (Ashcroft, T., et al., J Clin Pathol, 1988; 41:467-70) para el análisis histológico cuantitativo.
Recolección de muestra
Para las muestras de pulmón congeladas, se recolectó el lóbulo postcava, se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 ° C. Los bloques de tejido pulmonar incrustados en parafina se almacenaron a temperatura ambiente.
Pruebas estadísticas
Se realizaron análisis estadísticos usando Prism Software 6 (GraphPad Software, Estados Unidos). Para el análisis de supervivencia se realizó el análisis de Kaplan-Meier con la prueba de grado logarítmico. Para otros datos, se realizaron análisis estadísticos utilizando la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Los valores de p <0.05 se consideraron estadísticamente significativos. Se asumió una tendencia o inclinación cuando una prueba t de una cola arrojó valores de P <0.1. Todos los resultados se expresaron como media ± SD.
Cambios en el peso corporal y estado general
El peso corporal se expresó como porcentaje del cambio de peso corporal con respecto al valor inicial (día 0). Los cambios medios de peso corporal del grupo de vehículo fueron significativamente más bajos que los del grupo de control desde el día 6 al 11. Los cambios de peso corporal medio del grupo de compuesto B de 7 mg/kg fueron significativamente más bajos que los del grupo de vehículo el día 14. No hubo diferencias significativas en los cambios de peso corporal medio en ningún día durante el período de estudio entre el grupo de vehículo y los otros grupos de tratamiento (datos no mostrados).
Los cambios medios de peso corporal en el momento de sacrificio del grupo de vehículo tendieron a disminuir en comparación con el grupo de control. No hubo diferencias significativas en los cambios de peso corporal medio en el momento del sacrificio entre el grupo de vehículo y los grupos de tratamiento (tabla 1). Durante el período de tratamiento, los ratones encontrados muertos antes de alcanzar el día 21 fueron los siguientes; tres de 12 ratones fueron encontrados muertos en los grupos de vehículo y nintedanib. Cuatro de los 12 ratones se encontraron muertos en los grupos del compuesto B. La rata de mortalidad observada en este experimento en todos los grupos es una característica del modelo estándar y las muertes observadas están dentro del intervalo histórico para los ratones modelo BLM.
Figure imgf000018_0001

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de fórmula (IV)
    R-YI-CH2-CO-X (IV)
    en donde R es un grupo alquileno insaturado no sustituido C10-24 lineal, comprendiendo dicho grupo al menos 4 dobles enlaces no conjugados;
    X es CF3; y
    Y1 se selecciona de O, S, SO o SO2; o una sal de este
    para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad fibrótica, en donde la enfermedad fibrótica es un trastorno fibrótico pulmonar o fibrosis hepática.
    2. Un compuesto para uso según la reivindicación 1, en donde dicho grupo R tiene de 5 a 7 dobles enlaces.
    3. Un compuesto para uso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde en la fórmula (IV) no se conjuga ningún doble enlace con el grupo carbonilo.
    4. Un compuesto para uso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde en dicho grupo R todos los dobles enlaces están en la configuración cis o todos los dobles enlaces están en la configuración cis excepto el doble enlace más cercano al carbonilo.
    5. Un compuesto para uso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el grupo R comprende de 17 a 19 átomos de carbono.
    6. Un compuesto para uso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde R es lineal.
    7. Un compuesto para uso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho compuesto de fórmula (IV) tiene la fórmula:
    Figure imgf000027_0001
    en donde X es CF3.
    8. Un compuesto para uso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el compuesto de fórmula (IV) es el compuesto A o el compuesto B:
    Figure imgf000027_0002
    X= CF3 = Compuesto A
    Figure imgf000028_0001
    X= CF3 = Compuesto B
    9. Un compuesto para uso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la enfermedad fibrótica se debe a una lesión o es idiopática.
    10. Un compuesto para uso según se reivindica en la reivindicación 9, en donde la lesión es un evento isquémico o debido a la exposición a radiación, una sustancia química o un agente infeccioso.
    11. Un compuesto para uso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el compuesto se administra después de que se haya desarrollado una lesión fibrótica en el sujeto.
    12. Un compuesto para uso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el compuesto se formula con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
    13. Un compuesto para uso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el compuesto se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos adyuvantes.
    14. Un compuesto para uso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el trastorno fibrótico pulmonar es uno de fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar intersticial, neumonitis intersticial crónica, síndrome de Hamman-Rich, neumonitis intersticial habitual (UIP), alveolitis fibrosante, sarcoidosis pulmonar, fibrosis masiva progresiva de pulmón, esclerosis sistémica de pulmón o fibrosis asociada a trasplante de pulmón.
    15. Un compuesto de fórmula (IV) o una sal de este como se define en las reivindicaciones 1 a 8 para uso como medicamento para reducir uno o más del contenido de hidroxiprolina o la expresión de ARNm de colágeno de tipo 1 en el pulmón o hígado de un animal.
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