ES2890650T3 - Esteres de di-etilo de DTPA, composiciones de los mismos, y métodos para utilizar los mismos - Google Patents

Esteres de di-etilo de DTPA, composiciones de los mismos, y métodos para utilizar los mismos Download PDF

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Abstract

Un proceso para preparar un polimorfo de ácido 6,9-bis(carboximetil)-3-(2-etoxi-2-oxoetil)-11-oxo-12-oxa-3,6,9- triazatetradecan-1-oico caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene picos en 7.6, 12.4, 13.5, 14.0, 15.3, 18.1, 18.7, 18.8, 21.0, 22.5, 23.4, 24.5, 28.7, y 35.7 ± 0.2 grados 2 theta, que comprende (a) combinar bis-anhídrido de DTPA, etanol, y piridina para formar una mezcla de reacción; (b) agitar la mezcla de reacción bajo nitrógeno durante aproximadamente 24 horas; (c) agregar la mezcla de reacción a diclorometano para formar una solución de diclorometano; (d) enfriar la solución de diclorometano a una temperatura de aproximadamente -20 °C para formar un precipitado de un polimorfo de ácido 6,9-bis(carboximetil)-3-(2-etoxi-2-oxoetil)-11-oxo-12-oxa-3,6,9-triazatetradecan-1-oico; (e) filtrar la solución de diclorometano para obtener el precipitado; (f) opcionalmente lavar el precipitado con diclorometano durante la etapa de filtración; y (g) opcionalmente secar el precipitado, obteniendo de esta manera el polimorfo.

Description

DESCRIPCIÓN
Ésteres de di-etilo de DTPA, composiciones de los mismos, y métodos para utilizar los mismos
Campo de la Invención
La presente divulgación se refiere a ésteres de dietilo del ácido dietilentriamino pentaacético trisódico (DTPA). La presente divulgación se refiere además a composiciones que comprenden ésteres de dietilo de DTPA y métodos para utilizar los mismos.
Antecedentes de la invención
Los Estados Unidos y muchos otros países enfrentan crecientes amenazas de grupos terroristas con respecto al uso de armas de destrucción masiva contra poblaciones civiles. Es especialmente preocupante que algunos de estos grupos estén intensificando sus esfuerzos para adquirir y desarrollar armas nucleares y radiológicas, y hay un número limitado de terapias que se pueden ofrecer a las víctimas del terrorismo nuclear. Actualmente, los únicos agentes que han sido aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) como agentes quelantes para el americio, curio y plutonio son las sales de calcio y zinc del ácido dietilentriamino pentaacético trisódico (DTPA). Los radionúclidos transuránicos (es decir, aquellos con un número atómico de 92 o más), tales como el americio, curio y plutonio, se pueden incorporar potencialmente en dispositivos de dispersión de radiación (RDD; “bombas sucias”). El objetivo principal del tratamiento de las personas expuestas a radionucleidos transuránicos es quelar los radionucleidos transuránicos antes de que se fijen en tejidos, tales como el hígado y huesos, y mejorar su eliminación de los individuos contaminados.
Guilmette et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 2, no 68, 1979, páginas 194-196, divulga la síntesis, caracterización y evaluación terapéutica de una serie de derivados parcialmente esterificados de ácido pentético (dietilentriaminopentaacético).
Resumen de la invención
Un primer aspecto de la invención es un proceso para preparar un polimorfo de ácido 6,9-bis(carboximetil)-3-(2-etoxi-2-oxoetil)-11-oxo-12-oxa-3,6,9-triazatetradecan-1-oico caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene picos en 7.6, 12.4, 13.5, 14.0, 15.3, 18.1, 18.7, 18.8,21.0, 22.5, 23.4, 24.5, 28.7, y 35.7 ± 0.2 grados 2 theta, que comprende
(a) combinar bis-anhídrido de DTPA, etanol, y piridina para formar una mezcla de reacción;
(b) agitar la mezcla de reacción bajo nitrógeno durante aproximadamente 24 horas;
(c) agregar la mezcla de reacción a diclorometano para formar una solución de diclorometano;
(d) enfriar la solución de diclorometano a una temperatura de aproximadamente -20 °C para formar un precipitado de un polimorfo de ácido 6,9-bis(carboximetil)-3-(2-etoxi-2-oxoetil)-11-oxo-12-oxa-3,6,9-triazatetradecan-1-oico;
(e) filtrar la solución de diclorometano para obtener el precipitado;
(f) opcionalmente lavar el precipitado con diclorometano durante la etapa de filtración; y
(g) opcionalmente secar el precipitado, obteniendo de esta manera el polimorfo.
Otro aspecto de la invención es un proceso para preparar un polimorfo de ácido 6,9-bis(carboximetil)-3-(2-etoxi-2-oxoetil)-11-oxo-12-oxa-3,6,9-triazatetradecan-1-oico caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene picos en 8.1, 12.0, 13.8, 15.4, 16.0, 16.6, 18.3,19.3, 21.4, 22.1, 24.0, 26.5, y 29.2 ± 0.2 grados 2 theta, que comprende
(a) combinar bis-anhídrido de DTPA y etanol absoluto para formar una mezcla de reacción;
(b) calentar la mezcla de reacción hasta reflujo mientras que se agita durante aproximadamente 1.5 horas ± 20 %; (c) filtrar la mezcla de reacción para formar un filtrado;
(d) enfriar el filtrado a una temperatura por debajo de aproximadamente 20 °C para formar un precipitado de un polimorfo de ácido 6,9-bis(carboximetil)-3-(2-etoxi-2-oxoetil)-11-oxo-12-oxa-3,6,9-triazatetradecan-1-oico;
(e) filtrar el filtrado para obtener el precipitado;
(f) lavar el precipitado con etanol frío;
(g) lavar el precipitado con éter de metil tert-butilo para formar una torta de filtro;
(h) mezclar la torta de filtro con etanol para formar una segunda lechada;
(i) calentar la segunda lechada a una temperatura de aproximadamente 70 °C ± 20 %;
(j) filtrar la segunda lechada para formar un segundo filtrado;
(k) enfriar el segundo filtrado a una temperatura por debajo de 20 °C para formar un segundo precipitado;
(l) filtrar el segundo filtrado para obtener el segundo precipitado; y
(m) opcionalmente secar el precipitado, obteniendo de esta manera el polimorfo.
Estos y otros aspectos de la invención se establecen con más detalle en la descripción de la invención a continuación.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra un esquema sintético para C2E2.
La Figura 2 muestra muestras de soluciones de dosificación que contienen C2E2 del Lote 050, de izquierda a derecha: soluciones de dosificación de C2E2 de 20 mg/ml, 60 mg/ml y 100 mg/ml.
La Figura 3 muestra datos de calorimetría diferencial de barrido (DSC) para preparaciones de C2E2.
La Figura 4 muestra la comparación de los datos termogravimétricos obtenidos para ambas tandas de C2E2. El método 1 es la línea de puntos y el método 2 es la línea continua.
La Figura 5 muestra un gráfico de las concentraciones de iones metálicos en preparaciones de C2E2 según se detecta por espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS).
La Figura 6 muestra patrones de difracción de rayos X (XRD) para preparaciones de C2E2: A) estándar de referencia; B) Lote MTD; C) Lote 005-2; D) Lote 050; y E) una comparación de patrones XRD A-D.
La Figura 7 muestra una superposición de los patrones XRD para A) estándar de referencia y B) Lote MTD.
La Figura 8 muestra una superposición de los patrones XRD para C) Lote 005-2 y D) Lote 050.
La Figura 9 muestra las micrografías electrónicas de barrido de las preparaciones de C2E2. Izquierda: Lote MTD de C2E2; derecha: Lote 050 de C2E2.
La Figura 10 muestra el cromatograma de C2E2 del Lote 050.
La Figura 11 muestra el cromatograma de cristales de C2E2 producidos a partir de agua.
La Figura 12 muestra el cromatograma de material sólido C2E2 de 1 hora de calentamiento en etanol.
La Figura 13 muestra el cromatograma del filtrado C2E2 de 1 hora de calentamiento en etanol.
La Figura 14 muestra el transporte acumulativo de C2E2 desde el compartimento apical hasta el basolateral durante dos horas. Las barras de error representan el intervalo de confianza del 95 %.
La Figura 15 muestra el cambio en el fundente a concentraciones crecientes de C2E2. Las barras de error representan el intervalo de confianza del 95 %.
La Figura 16 muestra el cambio en el coeficiente de permeación aparente al aumentar la concentración de C2E2. Las barras de error representan el intervalo de confianza del 95 %.
La Figura 17 muestra la depuración diaria de 241Am en ratas macho Sprague Dawley.
La Figura 18 muestra la depuración diaria de 241Am en ratas hembras Sprague Dawley.
La Figura 19 muestra la curva de respuesta a la dosis de C2E2 de decorporación total que muestra la decorporación total de 241Am en ratas Sprague Dawley macho y hembra siete días después de contaminación.
La Figura 20 muestra la curva de respuesta a la dosis de C2E2 de la carga hepática que muestra la carga hepática de 241Am en ratas Sprague Dawley macho y hembra siete días después de contaminación.
La Figura 21 muestra la curva de respuesta a la dosis de C2E2 de la carga esquelética que muestra la carga hepática de 241Am en ratas Sprague Dawley macho y hembra siete días después de contaminación.
La Figura 22 muestra la curva de respuesta a la dosis de C2E2 de la carga del sitio de la herida que muestra el contenido de 241Am en el sitio de la herida en ratas Sprague Dawley machos y hembras.
La Figura 23A muestra el porcentaje promedio de actividad recuperada de 241Am en orina por día en perros después de la administración de 241Am mediante exposición por inhalación.
La Figura 23B muestra el porcentaje promedio de actividad recuperada de 241Am en heces por día en perros después de la administración de 241Am mediante exposición por inhalación.
La Figura 24A muestra el porcentaje promedio de actividad recuperada de 241Am para la excreción urinaria acumulada de perros a los que se administraron diferentes dosis de C2E2 a las 24 h después de exposición por inhalación de 241Am.
La Figura 24B muestra el porcentaje promedio de actividad recuperada de 241Am para la excreción fecal acumulativa de perros a los que se les administraron diferentes dosis de C2E2 a las 24 h después de exposición por inhalación de 241Am.
Las Figuras 25A-D muestran el porcentaje promedio de actividad recuperada de 241Am en A) hígado, B) bazo, C) riñón y D) pulmón de perros a los que se les administraron diferentes dosis de C2E2 24 h después de exposición por inhalación de 241Am.
Las Figuras 26A-F muestran el porcentaje promedio de actividad recuperada de 241Am en A) ovarios, B) testículos, C) GIT, D) Ganglio Linfático Traqueobronquial, E) tejido blando y F) contenido óseo total en perros a los que se les administraron diferentes dosis de C2E2 a 24 h después de exposición por inhalación de 241Am.
La Figura 27 muestra la concentración relativa de C2E2 a lo largo del tiempo en muestras preparadas a 60, 70 y 100 mg/mL.
Las Figuras 28A-C muestran la estabilidad de C2E2 en A) plasma de rata, B) perro y C) humano, representando cada columna del gráfico (de izquierda a derecha) plasma normal; plasma inactivado por calor; un sustrato de control, diltiazem, en plasma normal; y el sustrato de control, diltiazem, en plasma inactivado por calor a lo largo del tiempo. La Figura 29 muestra la carga de americio en el hígado, el esqueleto y el tejido del sitio de inyección siete días después de contaminación con cada columna en el gráfico que representa (de izquierda a derecha) control, C2E2 una vez al día (OD), C2E2 dos veces al día (BD) y DTPA.
Las Figuras 30A y 30B muestran el porcentaje de inyección de americio inicial eliminado en la orina por hora con A) que muestra el perfil durante todo el estudio y B) que muestra la vista ampliada que comienza 24 horas después de la contaminación por americio cuando se administraron las primeras dosis de C2E2. El porcentaje de decorporación por hora en el tiempo cero refleja el promedio de decorporación por hora durante las primeras 24 horas del estudio. ♦ es el grupo de control no tratado, ■ es el grupo OD con 600 mg/kg de C2E2, ▲ es el grupo BD con 300 mg/kg de C2E2.
Descripción detallada
La presente invención se describirá ahora con más detalle a continuación. Esta invención se puede realizar de diferentes formas y no se debe interpretar como limitada a las realizaciones establecidas en el presente documento.
La terminología utilizada en la descripción del presente documento tiene solo el propósito de describir realizaciones particulares y no pretende ser una limitación de la invención. Como se utiliza en la descripción y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” también pretenden incluir las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos (que incluyen los términos técnicos y científicos) utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Se entenderá adicionalmente que los términos, tales como aquellos definidos en los diccionarios de uso común, se deben interpretar como si tuvieran un significado que sea consistente con su significado en el contexto de la presente solicitud y el arte relevante y no se deben interpretar de una manera idealizada o sentido demasiado formal a menos que se defina expresamente en el presente documento. La terminología utilizada en la descripción en el presente documento tiene solo el propósito de describir realizaciones particulares y no pretende ser una limitación de la invención.
También como se utiliza en el presente documento, “y/o” se refiere y abarca todas y cada una de las combinaciones posibles de uno o más de los elementos enumerados asociados, así como la falta de combinaciones cuando se interpretan en la alternativa (“o”).
A menos que el contexto indique lo contrario, se pretende específicamente que las diversas características de las realizaciones de la invención descritas en el presente documento se puedan utilizar en cualquier combinación. Por ejemplo, las características descritas en relación con una realización también pueden ser aplicables y combinables con otras realizaciones y aspectos de la invención.
Más aún, las realizaciones de la presente invención también contemplan que, en algunas realizaciones, cualquier característica o combinación de características expuestas en el presente documento se puede excluir u omitir. Para ilustrar, si la especificación establece que un complejo comprende los componentes A, B y C, en algunas realizaciones, se puede omitir o descartar cualquiera de A, B o C, o una combinación de los mismos.
Como se utiliza en el presente documento, la frase de transición “que consiste esencialmente en” (y variantes gramaticales) se debe interpretar como que abarca los materiales o etapas enumeradas “y aquellos que no afectan materialmente las características básicas y novedosas” de la invención reivindicada. Por tanto, el término “que consiste esencialmente en” como se utiliza en el presente documento no se debe interpretar como equivalente a “que comprende”.
El término “aproximadamente”, como se utiliza en el presente documento cuando se refiere a un valor medible, tal como, por ejemplo, una cantidad o concentración, pretende abarcar variaciones de ± 20 %, ±10 %, ± 5 %, ± 1 %, ± 0.5 % o incluso ± 0.1 % de la cantidad especificada. Un rango proporcionado en el presente documento para un valor medible puede incluir cualquier otro rango y/o valor individual en el mismo.
La presente divulgación se refiere a un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA que tiene el nombre químico ácido 6,9-bis(carboximetil)-3-(2-etoxi-2-oxoetil)-11-oxo-12-oxa-3,6,9-triazatetradecan-1-oico (también denominado aquí como C2E2) y que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000004_0001
En algunos ejemplos de la presente divulgación, un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente divulgación puede ser más estable que otras formas conocidas de C2E2. La estabilidad se puede medir mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, en algunos ejemplos, la estabilidad se determina al comparar los puntos de fusión de los polimorfos de C2E2. En algunos ejemplos de la presente divulgación, un polimorfo de C2E2 de la presente divulgación es más estable, en algunos ejemplos, en comparación con otros polimorfos de C2E2 ya que el polimorfo de C2E2 de la presente divulgación tiene un punto de fusión más alto que los puntos de fusión de los otros polimorfos de C2E2. La estabilidad se puede referir a la estabilidad de un polimorfo de la presente divulgación durante el almacenamiento y/o en una solución, tal como una solución acuosa.
En ciertos ejemplos de la presente divulgación, un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente divulgación puede ser más fácil de formular y/o preparar en comparación con otras formas conocidas de C2E2. Por ejemplo, un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente divulgación puede tener una solubilidad mejorada en comparación con otras formas conocidas de C2E2. En algunos ejemplos de la presente divulgación, un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente divulgación puede proporcionar una mejor biodisponibilidad después del suministro a un sujeto en comparación con otras formas conocidas de C2E2 cuando se administra de la misma manera.
En ciertos ejemplos de la presente divulgación, un éster de dietilo de DTPA de la presente divulgación puede ser un profármaco de DTPA. Se puede desesterificar un profármaco de DTPA para formar DTPA y/o un metabolito de C2E2, tal como, pero sin limitarse a, un éster de monoetilo de DTPA (por ejemplo, C2E1). En algunos ejemplos de la presente divulgación, un éster de dietilo de DTPA de la presente divulgación puede ser un profármaco de DTPA que se puede desesterificar mediante una esterasa para formar DTPA y/o un metabolito de C2E2. Alternativamente o además, en ciertos ejemplos de la presente divulgación, un éster de dietilo de DTPA de la presente divulgación puede ser un agente quelante, tal como, pero sin limitarse a, un agente quelante para elementos radiactivos y/o elementos no radiactivos.
De acuerdo con algunos ejemplos de la presente divulgación, un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente divulgación puede tener un patrón de difracción de rayos X en polvo que corresponde a un patrón de difracción de rayos X en polvo mostrado en cualquiera de las Figuras 6-8. En los ejemplos particulares de la presente divulgación, un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente divulgación tiene un patrón de difracción de rayos X en polvo que corresponde al patrón de difracción de rayos X en polvo en la Figura 6 A, B, C, y/o D.
En ciertos ejemplos de la presente divulgación, un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente divulgación tiene un patrón de difracción de rayos X en polvo que corresponde al patrón de difracción de rayos X en polvo en la Figura 6A. El polimorfo que tiene un patrón de difracción de rayos X en polvo que corresponde a la Figura 6A se denomina en el presente documento como Forma I. Un éster de dietilo de DTPA de la Forma I se puede caracterizar por un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene picos en 7.6, 12.4, 13.5, 14.0, 15.3, 18.1, 18.7, 18.8, 21.0, 22.5, 23.4, 24.5, 28.7, y 35.7 ± 0.2 grados 2 theta.
Un éster de dietilo de DTPA de la Forma I se caracteriza por un punto de fusión desde aproximadamente 109 °C hasta aproximadamente 122 °C, o cualquier rango y/o valor individual en el mismo, según se mide utilizando calorimetría diferencial de barrido sobre un rango de aproximadamente 25 °C hasta aproximadamente 320 °C con una tasa de calentamiento de aproximadamente 10.00 °C/min. En algunos ejemplos de la presente divulgación, un éster de dietilo de DTPA de la Forma I puede tener un punto de fusión de aproximadamente 109 °C, 110 °C, 111 °C, 112 °C, 113 °C, 114 °C, 115 °C, 116 °C, 117 °C, 118 °C, 119 °C, 120 °C, 121 °C, o 122 °C, o cualquier rango en el mismo. En ciertos ejemplos de la presente divulgación, un éster de dietilo de DTPA de la Forma I puede tener un punto de fusión en aproximadamente 111.8 °C, 116.3 °C, o 119.4 °C.
Se puede obtener el éster de dietilo de DTPA de la Forma I al precipitar éster de dietilo de DTPA en diclorometano. En algunas realizaciones, un éster de dietilo de DTPA de la Forma I se obtiene al precipitar éster de dietilo de DTPA en diclorometano mientras que se enfría a una temperatura de aproximadamente -20 °C. La temperatura, por ejemplo, puede estar entre 16 °C y 24 °C o cualquier otro rango y/o valor individual en el mismo.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para preparar un éster de dietilo de DTPA de la Forma I, el método comprende combinar bis-anhídrido de DTPA, etanol y piridina para formar una mezcla de reacción, agitar la mezcla de reacción bajo nitrógeno durante aproximadamente 24 horas, tal como, por ejemplo, entre 20 horas y 28 horas o cualquier otro rango y/o valor individual en el mismo, agregar la mezcla de reacción a diclorometano para formar una solución de diclorometano, enfriar la solución de diclorometano a una temperatura de aproximadamente -20 °C, tal como, por ejemplo, entre 16 °C y 24 °C o cualquier otro rango y/o valor individual en el mismo, para formar un precipitado de un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente invención, filtrar la solución de diclorometano para obtener el precipitado, opcionalmente lavar el precipitado con diclorometano durante la etapa de filtración, y opcionalmente secar el precipitado, obteniendo de esta manera un éster de dietilo de DTPA de la Forma I.
En ciertas realizaciones de la presente invención, el polimorfo formado durante y/o después de la etapa de enfriamiento en un método para preparar un éster de dietilo de DTPA de la Forma I puede ser el mismo como y/o diferente de un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente invención formado durante y/o después de una o más de las etapas posteriores. De esta manera, una vez se forma un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente invención, después de cada una de las etapas posteriores en el método para preparar un éster de dietilo de DTPA de la Forma I se puede formar otro polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente invención que es el mismo y/o diferente. En algunas realizaciones de la presente invención, se puede obtener un éster de dietilo de DTPA de la Forma I durante y/o después de la etapa de enfriamiento en un método para preparar un éster de dietilo de DTPA de la Forma I de la presente invención. En ciertas realizaciones de la presente invención, un método para preparar un éster de dietilo de DTPA de la Forma I de la presente invención comprende lavar el precipitado con diclorometano durante la etapa de filtración y secar el precipitado, y se puede obtener un éster de dietilo de DTPA de la Forma I durante y/o después de la etapa de secado.
En otros ejemplos de la presente divulgación, un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente invención tiene un patrón de difracción de rayos X en polvo que corresponde al patrón de difracción de rayos X en polvo en la Figura 6D. El polimorfo que tiene un patrón de difracción de rayos X en polvo que corresponde a la Figura 6D se denomina en el presente documento como Forma II. Un éster de dietilo de DTPA de la Forma II se puede caracterizar por un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene picos en 8.1, 12.0, 13.8, 15.4, 16.0, 16.6, 18.3,19.3, 21.4, 22.1, 24.0, 26.5, y 29.2 ± 0.2 grados 2 theta.
Un éster de dietilo de DTPA de la Forma II se caracteriza por un punto de fusión desde aproximadamente 132 °C hasta aproximadamente 143 °C, o cualquier rango y/o valor individual en el mismo, según se mide utilizando calorimetría diferencial de barrido sobre un rango de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 320 °C con una tasa de calentamiento de aproximadamente 10.00 °C/min. La tasa, por ejemplo, puede estar entre 8.00 °C/min y 12.00 °C/min o cualquier otro rango y/o valor individual en el mismo. En algunos ejemplos de la presente divulgación, un éster de dietilo de DTPA de la Forma II puede tener un punto de fusión de aproximadamente 132 °C, 133 °C, 134 °C, 135 °C, 136 °C, 137 °C, 138 °C, 139 °C, 140 °C, 141 °C, 142 °C, o 143 °C, o cualquier rango en el mismo. En ciertos ejemplos de la presente divulgación, un éster de dietilo de DTPA de la Forma II puede tener un punto de fusión en aproximadamente 134.8 °C, 136.4 °C, 139.1 °C, o 141.6 °C.
Se puede obtener éster de dietilo de DTPA de la Forma II al precipitar éster de dietilo de DTPA en etanol. En algunas realizaciones, un éster de dietilo de DTPA de la Forma II se obtiene al precipitar éster de dietilo de DTPA en etanol mientras que se enfría a una temperatura por debajo de aproximadamente 20 °C. La temperatura, por ejemplo, puede estar entre 16 °C y 24 °C o cualquier otro rango y/o valor individual en el mismo.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para preparar un éster de dietilo de DTPA de la Forma II, el método comprende combinar bis-anhídrido de DTPA y etanol absoluto para formar una mezcla de reacción, calentar la mezcla de reacción hasta reflujo mientras que se agita durante aproximadamente 1.5 horas ± 20 %, tal como, por ejemplo, entre 1.2 horas y 1.8 horas o cualquier otro rango y/o valor individual en el mismo, filtrar la mezcla de reacción para formar un filtrado, enfriar el filtrado a una temperatura por debajo de 20 °C, tal como, por ejemplo, 16 °C o cualquier otro rango y/o valor individual en el mismo, para formar un precipitado de un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente invención, filtrar el filtrado para obtener el precipitado, y opcionalmente secar el precipitado, obteniendo de esta manera éster de dietilo de DTPA de la Forma II. Luego de la etapa de filtración y antes de la etapa de secado opcional, el método comprende adicionalmente lavar el precipitado con etanol frío y luego éter de metil tert-butilo (MTBE) para formar una torta de filtro, mezclar la torta de filtro con etanol para formar una segunda lechada, calentar la segunda lechada a una temperatura de 70 °C ± 20 %, tal como, por ejemplo, entre 56 °C y 84 °C o cualquier otro rango y/o valor individual en el mismo, filtrar la segunda lechada para formar un segundo filtrado, enfriar el segundo filtrado a una temperatura por debajo de 20 °C, tal como, por ejemplo, 16 °C o cualquier otro rango y/o valor individual en el mismo, para formar un segundo precipitado de un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente invención, filtrar el segundo filtrado para obtener el precipitado, y luego opcionalmente secar el precipitado, obteniendo de esta manera éster de dietilo de DTPA de la Forma II.
En ciertas realizaciones de la presente invención, el polimorfo formado durante y/o después de la primera etapa de enfriamiento en un método para preparar un éster de dietilo de DTPA de la Forma II puede ser el mismo como y/o diferente de un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente invención formado durante y/o después de una o más de las etapas posteriores. De esta manera, una vez se forma un polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente invención, después de cada una de las etapas posteriores en el método para preparar un éster de dietilo de DTPA de la Forma II se puede formar otro polimorfo de un éster de dietilo de DTPA de la presente invención que es el mismo y/o diferente. En algunas realizaciones de la presente invención, un se puede obtener éster de dietilo de DTPA de la Forma II durante y/o después de la primera etapa de enfriamiento en un método para preparar un éster de dietilo de DTPA de la Forma II de la presente invención. En ciertas realizaciones de la presente invención, un se puede obtener éster de dietilo de DTPA de la Forma II durante y/o después de la segunda etapa de enfriamiento en un método para preparar un éster de dietilo de DTPA de la Forma II de la presente invención. En algunas realizaciones de la presente invención, un método para preparar un éster de dietilo de DTPA de la Forma II de la presente invención comprende secar el primer y/o segundo precipitado, y un se puede obtener éster de dietilo de DTPA de la Forma II durante y/o después de la etapa de secado.
Ejemplos
Ejemplo 1
Método 1 para preparar C2E2
La primera etapa en el Método 1 para preparar C2E2 (también conocido como ácido 6,9-bis(carboximetil)-3-(2-etoxi-2-oxoetil)-11-oxo-12-oxa-3,6,9-triazatetradecan-1-oico) comprende proporcionar bis-anhídrido de DTPA. El bisanhídrido de DTPA está disponible comercialmente y se puede obtener de proveedores comerciales, tales como TCI America de Portland, Oregon, o se puede preparar como sigue.
Preparación de bis-anhídrido
Etapa 1 - Se agregaron DTPA (3.93 g, 10 mmol) y anhídrido acético (5.72 g, 56.9 mmol) a 6.2 mL de piridina y se calentaron a reflujo 65-70 °C durante 14 horas. El material se filtró a través de un embudo Buchner y se enjuagó con éter de dietilo. Un polvo blancuzco (DTPA-BA, 1) se recolectó y se secó en un desecador. 1H RMN (400MHz, DMSO) 8 3.65 (8H, s), 3.44 (2H, d), 2.74 (4H, t), 2.59 (4H, t).
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Una vez se obtiene bis-anhídrido de DTPA, Etapa 2 se sigue para preparar C2E2.
Preparación de C2E2
Etapa 2 - Se utiliza DTPA-BA (1) para producir C2E2 (2) al hacer reaccionar DTPA-BA (1) con etanol. DTPA-BA (1.02 g, 2.8 mmol), etanol (0.38 g, 8.2 mmol) y piridina (0.67 g, 8.4 mmol) se agitaron bajo nitrógeno durante 24 horas. El producto se precipitó en diclorometano (DCM) (200 mL) a -20 °C, se filtró mientras que de lavó con DCM, y se secó en un horno de vacío para dar un polvo blancuzco (Producción - 81.3 ± 13.3, n=4). 1H RMN (400MHz, DMSO) 84.07 (4H, q), 3.53 (4H, s), 3.45 (2H, s), 3.43 (4H, s), 2.89 (4H, d), 2.84 (4H, d), 1.19 (6H, t). Análisis elemental: Predicho -C, 48.10; H, 6.95; N, 9.35; O, 35.60; Real - C, 47.59; H, 7.22; N, 8.67; O, 36.29. La síntesis de C2E2 también se ha preparado con éxito en una escala 2 g.
Figure imgf000007_0002
Método 2 para preparar C2E2
De acuerdo con el Método 2 para preparar C2E2, se fabricó C2E2 en una escala de 1.5 kg de acuerdo con el esquema sintético de la Figura 1. La síntesis de bis-anhídrido 2 a partir de DTPA (1) se describe en la Solicitud Europea No. EP136134A1 (2003), Publicación Internacional No. WO 2007/142804 A2, y Chemistry, A European Journal, 2004, 10, 3252-3260. En cada caso, el ácido pentaacético se trató con anhídrido acético y piridina puro o en presencia de MeCN y el rango de rendimiento observado fue 95-97 %. A continuación, el bis-anhídrido se convierte en C2E2 por reacción con etanol. Esta conversión se ha utilizado para preparar 800 g y 1.5 kg de C2E2.
Preparación de bis-anhídrido (2): Se disolvió ácido dietilentriaminopentaacético (2029 g, 5.16 moles) en acetonitrilo (1100 ml) con agitación. Se agregaron anhídrido acético (1450 ml, 15.3 moles) y piridina (1660 ml, 20.5 moles) y la reacción se calentó a 60 °C durante 4 horas. La mezcla de reacción se enfrió a 22 °C y se agregó éter de t-butilmetilo (MTBE) (800 ml). La mezcla de reacción se filtró y el sólido obtenido se lavó con MTBE (3000 mL). El sólido se secó en un horno de vacío a 40 °C. Rendimiento: 1792 g, 97 %.
Preparación de C2E2: El bis-anhídrido (1792 g, 5.02 moles) se suspendió en etanol absoluto (9000 ml) y se calentó a reflujo con agitación durante 1.5 horas. La mezcla de reacción calentada se filtró a través de Celite y se enfrió por debajo de 20 °C. La lechada resultante se filtró y se lavó con etanol frío (2800 ml) seguido de éter de metil tert-butilo (MTBE) (3500 ml). La torta de Celite se suspendió en etanol (800 ml), se calentó a 70 °C y se filtró. Al enfriar, la lechada obtenida se filtró y se lavó con etanol y MTBE. Los sólidos aislados combinados se secaron en un horno de vacío a temperatura ambiente. Rendimiento: 1488 g, 66 %.
El certificado de análisis para el lote de 1.5 kg de C2E2 se proporciona a continuación. Dado que C2E2 no tiene cromóforo, se desarrolló un método de HPLC de fase inversa con detección de dispersión de luz por evaporación (ELSD) o Detección de Aerosol Cargado (CAD) y se calificó para el análisis de C2E2 e impurezas.
Certificado de análisis para C2E2:
Estructura:
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Material: C2E2
Número de lote: 020WJL050
Tamaño del lote: 1.72 kg
Apariencia: Un sólido blanco.
Identidad: Determinada por 1H RMN. Los datos son coherentes con la estructura.
Pureza cromatográfica: 97.5 % (% de área) por HPLC-ELSD de fase inversa
Impurezas individuales no especificadas (% de área, promedio de duplicados):
RRT0.33 0.33 %
RRT1.08 1.39 %
RRT1.28 0.77 %
Impurezas totales: 2.49 %
Humedad por KF 0.17 %
DSC: Endotermia única centrada en 141.6° observados
Polimorfos:
La posibilidad de múltiples polimorfos de C2E2 surgió durante el análisis de las soluciones de dosificación de C2E2. Las soluciones de dosificación de C2E2 se prepararon con C2E2 del Lote 050 obtenido utilizando el Método 2. La investigación de polimorfos es importante ya que afecta las propiedades fisicoquímicas del polvo a granel. Los sólidos cristalinos metaestables tienen un alto potencial químico y son inestables. La diferencia en las propiedades fisicoquímicas, el tamaño de las partículas y el área de la superficie puede alterar la biodisponibilidad del fármaco debido a cambios en la tasa de disolución. El objetivo de los siguientes estudios fue identificar la forma polimórfica más estable, ya que cualquier otro polimorfo es metaestable y podría cambiar durante el almacenamiento. Este cambio de fase podría resultar en precipitación de la solución o inestabilidad durante el almacenamiento.
Análisis de las soluciones de dosificación: Se recibieron muestras de la dosificación para análisis y se verificaron las fugas y el marcado antes de almacenarlas a 4 °C. Las muestras de formulación (0, 20, 60 y 100 mg/ml) se diluyeron a una concentración esperada de 0.40 mg/ml y se analizaron mediante HPLC-CAD.
Durante la preparación para el análisis, las soluciones de 60 y 100 mg/ml tenían un sólido notable precipitado a partir de las formulaciones, como se ve en la Figura 2. Las muestras diluidas se prepararon y analizaron como si las soluciones contuvieran la cantidad indicada de C2E2. Los resultados mostrados a continuación en la Tabla 1, muestran recuperaciones porcentuales deficientes sin tendencias claras relacionadas con la concentración. Ambas soluciones de 20 y 100 mg/ml quedan fuera del rango aceptado de 85-115 % de recuperación. La solución de 60 mg/ml está técnicamente dentro del rango de preparación recomendado, pero la formulación contenía un precipitado sólido.
T l 1: P r n r r i n 2E2 rir l f rm l i n ifi i n.
Figure imgf000008_0003
Estudio de estabilidad en agua: se utilizó el método 2 para preparar el C2E2 para las formulaciones de dosificación. Específicamente, los lotes 050 y 005-2 se prepararon utilizando el método 2, mientras que el estándar de Referencia y el Lote MTD se prepararon utilizando el método 1. Para las formulaciones de dosificación, se utilizó agua desionizada (agua desionizada potable en la habitación 18/19) con el C2E2 preparado utilizando el Método 2. Las formulaciones de dosificación se compararon con las formulaciones de C2E2 preparadas utilizando agua Milli-Q. Se registró el pH de cada muestra y los valores se enumeran a continuación en la Tabla 2.
T l 2: V l r H l m r l ili .
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Figure imgf000009_0001
El pH de los vehículos difiere en casi dos unidades. El pH de las diferentes preparaciones de 100 mg/ml de la Tanda 050 difiere solo en 0.3 unidades de pH, aunque es probable que las concentraciones no sean equivalentes debido a la cantidad de material precipitado en la muestra. Los valores de pH de las diferentes preparaciones de C2E2 elaboradas con el Método 1 varían entre 2.35 y 2.60. Si bien estas diferencias son pequeñas, parece probable que el C2E2 en los lotes 050 y 005-2 tenga un pH de solución ligeramente más alto que el del Lote MTD y el estándar de Referencia (el estándar de Referencia es un C2E2 purificado del Lote MTD). Si bien no se desea limitarse a ninguna teoría en particular, esto se puede deber a la presencia de impurezas en el estándar de Referencia y el lote de MTD.
Para recrear las soluciones inusuales, se prepararon muestras de 1 ml de C2E2 (lotes 005-2 y 050; Lote MTD; y estándar de Referencia) a concentraciones de 100 mg/ml en agua Milli-Q. Se almacenó un conjunto de muestras a temperatura ambiente, en el frigorífico (4 °C) y en el congelador a -20 °C. Las observaciones de estas soluciones en varios momentos muestran que en 24 horas el material de referencia comienza a precipitar como un polvo fino, independientemente de la temperatura de almacenamiento. El Lote 050 también comienza a desprenderse de la solución después de tres días, pero como materiales ligeramente grumosos. El almacenamiento a 4 °C exacerba la precipitación del Lote 050. Después de 8 días, tanto el Estándar de Referencia como el Lote 050 tienen cantidades significativas de sólido detectado a 4 °C y a temperatura ambiente y se han comenzado a formar cristales. La congelación y descongelación no provoca una precipitación excesiva. Las dos preparaciones que son relativamente menos puras (Lote MTD y Lote 005-2) no salen de la solución. Si bien no se desea limitarse a ninguna teoría en particular, es probable que esto se deba a que más impurezas aumentan la solubilidad.
Calorimetría diferencial de barrido (DSC): Se sellaron muestras de C2E2 (~5 mg) y se evaluaron mediante DSC en un rango de 25 °C a 320 °C con una velocidad de calentamiento de 10.00 °C/min. También se cicló una muestra tres veces de 25 a 150 °C con una velocidad de calentamiento de 10 °C/min y una velocidad de enfriamiento de 5 °C/min. Los resultados del análisis DSC se muestran en la Figura 3. Tanto el Lote MTD como el estándar de Referencia muestran un punto de fusión cercano a 120 °C. El Lote 050 tiene un punto de fusión de aproximadamente 140 °C. El material filtrado de la formulación de dosificación para el Lote 050 también tiene un punto de fusión de aproximadamente 140 °C, lo que sugiere que el C2E2 utilizado para las preparaciones de dosificación tiene la misma composición que el que sale de la solución. Las diferencias en el punto de fusión sugieren la presencia de polimorfos posiblemente debido a la presencia de diferentes solvatos.
Curiosamente, la tanda impura de C2E2 (lote 005-2) tiene dos puntos de fusión, uno cerca de 120 °C y el otro cerca de 140 °C. Aunque inicialmente se asumió que el segundo pico se debía a C2E3 detectado por MS y HPLC, sin desear estar limitado a ninguna teoría en particular, ahora parece probable que los dos picos sean indicativos de dos tipos de C2E2 presentes. Ambos picos se ensanchan, probablemente como resultado de impurezas (tal como el C2E3 detectado por RMN/HPLC/MS).
El C2E2 comienza a arder a temperaturas superiores a 150 °C. Cuando el lote mixto de material (lote 005-2) con dos puntos de fusión se cicla lentamente desde 25 hasta 150 °C, no se observa ningún cambio de un punto de fusión a otro. De hecho, después de un ciclo de calentamiento, no se observaron otros picos, aunque no se observó combustión en la endotermia. Si bien no se desea limitarse a ninguna teoría en particular, se había anticipado que se produciría un cambio de la temperatura más baja a la más alta, pero es probable que las condiciones de los ciclos no fueran las ideales.
Experimento de maduración competitiva: se realizó un breve experimento de maduración competitiva para determinar el punto de fusión más estable. Se combinaron 50 mg de cada uno del Lote 050 y el estándar de Referencia en 500 |jl de agua y se agitaron a temperatura ambiente durante la noche. Después de agitar, el sólido restante se filtró desde el líquido, se dejó secar y se analizó mediante DSC. El experimento de maduración competitiva mostró que el material sólido se recuperó de una mezcla agitada de dos materiales tenía un único punto de fusión de 140 °C. Si bien no se desea limitarse a ninguna teoría en particular, la preferencia por la temperatura más alta sugiere que el material con el punto de fusión más alto es el compuesto más estable.
Análisis termogravimétrico: se utilizó un segundo método de análisis térmico, el análisis termogravimétrico (TGA) para caracterizar los compuestos. La TGA mide la pérdida de peso inducida térmicamente en función de la temperatura y, por tanto, se puede utilizar para estudiar la desolvatación o descomposición del compuesto. Esta información es útil en combinación con los datos de DSC, ya que los procesos de desolvatación van acompañados de un cambio de peso, mientras que las transiciones de fase sólido-líquido o sólido-sólido no están asociadas con un cambio y, por lo tanto, no están presentes en el termograma TGA. Los sólidos de ambos métodos de síntesis se colocaron en el TGA y se calentaron utilizando el siguiente método. La temperatura inicial se estableció en 25 °C y la temperatura se aumentó de 10 °C/min a 100 °C. Se introdujo una etapa isotérmica a 100 °C durante 5 min para asegurar que se había producido toda la pérdida de agua, y luego se aumentó la temperatura de 10 °C/min a 170 °C (Fig. 4).
En primer lugar, los datos de TGA confirman que las endotermas observadas sobre el DSC son puntos de fusión ya que no se observa un cambio de peso significativo sobre el termograma de TGA para ninguno de los compuestos a la temperatura asociada, lo que es indicativo de un cambio de fase en lugar de descomposición o desolvatación. El Lote 050 exhibe una pérdida de peso gradual que se puede deber a la presencia de agua superficial. El Lote MTD no tiene una pérdida significativa de peso, aparte de una disminución del 0.5 % entre 116 y 123 °C. Si bien no se desea limitarse a ninguna teoría en particular, debido al hecho de que no se observa pérdida de peso estequiométrica, es poco probable que esto sea causado por la presencia de un hidrato o solvato. La pequeña pérdida de peso puede ser una impureza que se libera cuando el polimorfo comienza a fundirse. Ambos polimorfos comienzan a descomponerse alrededor de los 170 °C como se ve por la rápida pérdida de peso.
Análisis elemental: se realizó un análisis elemental en las muestras del Estándar de Referencia y del Lote 050. Los elementos solicitados para el análisis fueron C, H, N y O. Los resultados del análisis elemental C2E2 se muestran en la Tabla 3. El Estándar de Referencia suma el 98.92 % del peso total, lo que indica un nivel de contaminación muy pequeño. Por otro lado, la muestra del Lote 050 tiene un 1.93 por ciento en peso no contabilizado. Por lo tanto, es poco probable que el solvente tenga en cuenta la diferencia observada entre los lotes sintéticos.
T l r n m i i n r r i n 2E2
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IPC/MS: para eliminar un quelato metálico como una posibilidad de las diferencias en el C2E2, cada preparación se analizó mediante ICP-MS. Se realizaron diluciones de C2E2 (Estándar de Referencia y Lote 050) en agua a una concentración de 110 mg/ml. Los resultados se muestran en la Figura 5. No hay diferencias notables entre las dos muestras C2E2. El sodio tiene la concentración más alta detectada, entre 2 y 3 pg/mL para 110 mg/mL de C2E2. Otros elementos (magnesio, potasio, hierro y zinc) están presentes en concentraciones inferiores a 500 ng/mL y son casi iguales entre las dos muestras. Esta pequeña cantidad de metal se debe posiblemente al agua o al material de vidrio utilizado y es poco probable que sea responsable de las claras diferencias en los puntos de fusión que se ven sobre el DSC.
Difracción de rayos X en polvo: Se analizaron muestras de C2E2 (Estándar de Referencia, Lote MTD, Lote 050 y Lote 005-2) mediante difracción de rayos X en polvo por K Sueda en GSK. K Sueda realizó el análisis de las muestras de C2E2 y los resultados se muestran en las Figuras 6-8. Los cuatro espectros se muestran en la Figura 6. Las superposiciones del Estándar de Referencia y el Lote MTD muestran la misma estructura cristalina con solo pequeñas diferencias (Figura 7) y son claramente diferentes de la estructura cristalina de los Lotes 050 y 005-2. Los lotes 050 y 005-2 son diferentes entre sí (lo que confirma los datos de HPLC y DSC) (Figura 8). El lote 005-2 se parece más al Estándar de Referencia y al Lote MTD y, sin desear estar limitado a ninguna teoría en particular, puede ser una mezcla de cristales.
Si bien no se desea limitarse a ninguna teoría en particular, las diferencias entre las muestras de C2E2 no se deben a solvatación o quelación, y lo más probable es que se trate de un caso de polimorfismo. Parece que el Lote 050 es más estable (punto de fusión más alto) en su estado sólido.
Microscopía electrónica de barrido: se obtuvo la confirmación final de la presencia de dos polimorfos utilizando microscopía electrónica de barrido. Las muestras en polvo se recubrieron por pulverización catódica con un recubrimiento de 5 nm de espesor y se formaron imágenes. El Lote MTD de C2E2 es de naturaleza escamosa, a diferencia del hábito divergente del Lote 050, que posee una forma cristalina distinta, como se muestra en la Figura 9.
Sin desear estar limitado a ninguna teoría particular, los datos discutidos anteriormente sugieren que C2E2 tiene al menos dos formas polimórficas. El punto de fusión más alto y la solubilidad más baja (observada como precipitación durante el almacenamiento en el refrigerador) sugieren que el polimorfo observado en el Lote 050 es el más estable.
Estudios de recristalización de C2E2: el Lote 050 tiene impurezas conocidas de etanol y material relacionado con API, probablemente pequeñas cantidades de C2E3 y C2E1. El cromatograma de este material se muestra en la Figura 10. El pequeño pico con Tr de 11.86 min tiene un área aproximada de 5.2 % en esta inyección. No se detecta C2E1 (Tr ~4.5 min) y el pico a los 2.5 min es coherente con el volumen muerto de la inyección.
Se preparó una solución de C2E2 (100 mg/ml) en agua y, tras reposar durante varias semanas, se produjeron cristales cúbicos transparentes. Una pequeña cantidad de estos cristales se disolvió en agua y se analizó mediante HPLC. El cromatograma resultante se muestra en la Figura 11. El área del pico de C2E3 (Tr 11.8) disminuyó ligeramente hasta ~2.6 %, pero el pico de C2E1 ha aumentado hasta el 5.7 %.
La recristalización de C2E2 en etanol también se identificó como una posible ruta para mejorar la pureza. Como tal, se calentaron pequeñas porciones de C2E2 en etanol (prueba 200) hasta que se disolvió todo el material. Los viales se enfriaron y C2E2 precipitó lentamente. El material resultante del calentamiento y enfriamiento con etanol era de naturaleza blanca y pulverulenta, microcristalino en lugar de cristales visibles discretos. Las Figuras 12 y 13 muestran cromatogramas del material sólido y líquido de un calentamiento de una hora en etanol (la disolución de C2E2 en etanol es lenta). El material sólido recuperado de este experimento muestra mayores porcentajes de C2E3 (8.8%) y C2E1 (4.3 %), lo que sugiere que es poco probable que esta ruta de “purificación” dé como resultado un material de calidad estándar de referencia. El filtrado, aunque está enriquecido en C2E3 (Tr 11.8) también contiene una cantidad significativa de C2E2. Este material residual sugiere que se sacrificaría una cantidad significativa de C2E2 sin generar C2E2 con la pureza deseada.
Aunque no se desea limitarse a ninguna teoría en particular, este estudio muestra que la recristalización de C2E2, aunque aparentemente simple, es probable que introduzca mayores cantidades de impurezas adicionales al tiempo que disminuye el C2E3 presente. Si bien C2E2 es relativamente estable en solución, la adición de calor o humedad conduce a la esterificación o desesterificación y es probable que produzca C2E3 o C2E1 y DTPA.
Solubilidad acuosa
Prueba preliminar: se pesó una pequeña muestra de C2E2 (0,1 g, JH012B) y se colocó en una probeta graduada de 25 ml. Se agregaron volúmenes crecientes de agua destilada de acuerdo con el siguiente cuadro:
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Después de cada adición de la cantidad indicada de agua, la mezcla se agitó durante 10 minutos y se comprobó visualmente en busca de partes disueltas de la muestra. La prueba preliminar mostró que C2E2 era soluble en 10 ml de agua después de 10 minutos. Por tanto, la solubilidad aproximada es de 10 a 50 g/L.
ADME
Estabilidad metabólica: las células Caco-2 son una estirpe celular de cáncer epitelial de colon humano que expresa transportadores, proteínas de salida y enzimas de fase II y se pueden utilizar para correlacionar la permeabilidad celular con la absorción de fármacos. Además de determinar el coeficiente de permeabilidad aparente, se puede obtener una estimación del metabolismo de C2E2 durante el transporte. El objetivo de estos estudios preliminares fue evaluar un rango de concentraciones de C2E2 (25, 50 y 100 j M) para determinar un rango de concentración lineal en el que se podrían realizar estudios adicionales.
Se cultivaron células Caco-2 (paso #39) en matraces T de 75 cm2 a 37 °C en un entorno de humedad constante de CO2 al 5 %. El medio se reemplazó 3 veces por semana y las monocapas se subcultivaron hasta el paso #41. Al colocar en placas las células, se agregaron 0.5 ml de una suspensión de 120.000 células/ml a cada compartimento apical (AP) del primero y luego se colocaron 1.5 ml de medio de cultivo celular en el compartimento basolateral (BL) del Transwells®. Después de 21-24 días en las placas Transwell® con cambios de medio 2-3 veces por semana, se realizaron los estudios de transporte de Caco-2.
Antes de los experimentos de transporte, el medio de transporte se calentó a 37 °C. El medio de transporte consistió en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) (IX) con 500 mL de calcio y magnesio con la adición de tampón HEPES 1M (5 ml) y solución de D-glucosa 1.25 M en h Bs S (10 ml). El medio de cultivo celular se retiró del Transwells® para utilizarlo en el experimento y cada pocillo se lavó dos veces con medio de transporte caliente. A continuación, se preincubaron los Transwells® durante 30 min con medio de transporte. Finalmente, se midieron los valores de resistencia transepitelial (TEER) para cada Transwell® utilizando un voltohmetro y un electrodo de palillo. Los valores de TEER deben estar en el rango de 300-750 y deben variar lo menos posible. Las soluciones de dosificación se prepararon en medio de transporte caliente (37 °C). El medio de transporte preincubado se retiró del Transwells® y se pipetearon 1.5 ml de medio de transporte fresco a 37 °C en el compartimento aceptor. En el momento cero, se pipetearon 0.5 ml de la dosis en el compartimento donante. A continuación, los Transwells® se colocaron en una incubadora a 37 °C durante la duración del experimento. En cada momento (20, 40, 60 y 120 min) se recolectó el medio de transporte y se diluyó con acetonitrilo. El Transwell® se transfirió a un nuevo compartimento aceptor que contenía 1.5 ml de medio de transporte fresco precalentado. A continuación, se determinó la concentración de C2E2 mediante LC-MS/MS. También se midió la concentración de las soluciones de dosificación para determinar la concentración en el compartimento donante en el momento cero. Durante estos estudios preliminares, se investigó el transporte desde el compartimento apical hasta el basolateral.
Se detectó C2E2 en el compartimento receptor basolateral en todas las concentraciones probadas. El porcentaje de dosis que pasó a través de la membrana fue similar para las tres concentraciones, como se muestra en la Figura 14. Se detectó entre el 18 y el 22 % de la dosis en el compartimento receptor. Aunque ninguna de las líneas es estadísticamente diferente, las placas de 100 pM exhibieron el porcentaje de transporte más bajo.
Uno de los objetivos de estos experimentos fue determinar si a estas dosis había una respuesta lineal. La Figura 15 muestra el fundente calculado para cada concentración. Como el fundente es una medida de la masa de material que se mueve a través de la membrana por unidad de tiempo, si la respuesta a la dosis fuera lineal, entonces las concentraciones más altas deberían exhibir un fundente más alto. En estos experimentos, el nivel de dosis más alto tuvo el fundente más bajo. Si bien no se desea limitarse a ninguna teoría en particular, esto se podría deber a que la concentración ya no se encuentra en el rango lineal; alternativamente, se puede deber al procesamiento de estos datos en el espectrómetro de masas, ya que las muestras de 100 pM se procesaron en una serie separada. Los datos de todas las concentraciones de la muestra deben combinarse y reprocesarse para garantizar que los datos se procesaron de manera idéntica.
La Figura 16 muestra una disminución en el coeficiente de permeabilidad aparente al aumentar la dosis de C2E2. Si el C2E2 fue absorbido por difusión pasiva, entonces el coeficiente de permeabilidad debería ser constante. Por tanto, la disminución se puede deber a varias razones. La absorción puede estar mediada por transporte y, a concentraciones crecientes de C2E2, la absorción apical en la célula Caco-2 o la salida basolateral se satura. Alternativamente, la pgp puede expulsar el C2E2 sobre la membrana apical, lo que limita la absorción. Se requieren experimentos adicionales, tales como medir el transporte de C2E2 desde el lado basolateral hasta el apical y evaluar el efecto de los inhibidores de p-gp sobre el transporte de C2E2, para determinar la causa de la disminución de Papp al aumentar la concentración.
La relación entre el coeficiente de permeación aparente determinado en experimentos de Caco-2 con el porcentaje de dosis absorbida en humanos se describe en Shiyin Yee (Pharm. Res., junio de 1997; 14(6):763-6.). En base a los datos de Shiyin Yee, el coeficiente de permeación aparente observado de 4.88 x 10' 6 cm/s sugiere que C2E2 se absorbería moderadamente (20-70 %) en humanos siempre que la disolución y el metabolismo del GI no sean factores limitantes.
EFICACIA
Resumen de la decorporación de dosis única de C2E2 en ratas: Este estudio fue para evaluar la eficacia de una dosis única de C2E2 por sonda oral en ratas contaminadas con 241Am. Se extrajo una alícuota de 200 pl de una solución madre de nitrato de 241Am (0.1 mCi en 5 ml de HNO31 M), se evaporó hasta secado, se disolvió en HNO3 concentrado (15 M, 5 ml), luego se evaporó hasta secado y se disolvió en HNO3 diluido (0.1 M, 8 ml) para formar la solución inyectable. Grupos de 4 ratas hembras Sprague-Dawley se contaminaron con 250 nCi de nitrato de 241Am mediante inyección IM (0.1 pl) y luego se les administraron dosis únicas de C2E2 por sonda a 200, 600 o 1000 mg/kg en condiciones de alimentación ad lib utilizando un 10 % p/p de solución en agua estéril (los volúmenes de dosis fueron 2, 6 y 10 ml/kg, para las dosis de 200, 600 y 1000 mg/kg, respectivamente). Para el componente en ayunas del estudio, los animales se mantuvieron en ayunas 24 horas antes del tratamiento y luego durante 2 horas después de la administración del fármaco. Los grupos de control con acceso ad lib a alimentos y agua no recibieron tratamiento o se les administró una dosis intravenosa de la sal de calcio de DTPA (Ca-DTPA) a 14 mg/kg (volumen de dosis diana de 0.7 ml/kg y concentración de 20 mg/ml). El tratamiento se administró 1 día después de contaminación. Todos los animales se sacrificaron 7 días después de contaminación y se recolectaron los siguientes tejidos: hígado, ambos riñones, ambos fémures así como el tejido muscular de la pata trasera ipsilateral y contralateral y la piel del sitio de inyección. La orina y las heces se recolectaron desde el momento de la contaminación hasta la eutanasia. Los lavados de las jaulas también se recolectaron al final del estudio y se consideraron parte de la recolección total de orina. Se retiraron dos alícuotas (100 pl) de la solución de inyección y se determinó la actividad gamma de 241Am utilizando detección radiomática. El promedio de estos estándares es la dosis inyectada utilizada para todos los animales. Todos los tejidos y muestras se contaron de manera similar. El contenido de americio se expresó como porcentaje de la dosis inyectada. La recuperación general de radiactividad en todos los grupos de este estudio fue aproximadamente del 90 %. La Tabla 4 muestra la decorporación total y la carga hepática residual en el momento de la eutanasia en controles no tratados y después de una dosis única de Ca-DTPA o C2E2. La ruta principal por la que la eliminación mejorada de tanto el DTPA como el C2E2 de 241Am fue mediante la depuración urinaria. Los resultados sugieren que el estado de alimentación no afectó la depuración de 241Am total. La depuración fecal de 241Am no se alteró por el estado de alimentación, una observación que es consistente con la carga hepática similar entre los dos grupos al final del estudio. Este estudio demostró que el C2E2 aumentó la decorporación corporal total en ratas hembras y redujo la carga hepática de 241Am de una manera dependiente de dosis. Al igual que con DTPA, se produjo una mayor decorporación por C2E2 a través de una mayor depuración urinaria.
Tabla 4: Decorporación de americio 7 días después de contaminación IM: tratamiento con una dosis única de C2E2 24 h después de contaminación.
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Los detalles completos de este estudio son los siguientes: A ratas macho y hembra Sprague Dawley (n = 4/género/dosis) se les administraron dosis orales únicas de éster de dietilo del ácido dietilentriaminopentaacético (C2E2) por sonda 24 horas después de contaminación intramuscular con 241Am(NO3)3 (250 nCi) bajo condiciones ad libitum y en ayunas. Los animales recibieron dosis nominales orales únicas de 200, 600 o 1000 mg/kg de C2E2. Los animales no tratados y los animales tratados con una dosis intravenosa de Ca-DTPA (13.3 mg/kg) 24 horas después de contaminación sirvieron como controles; sólo se utilizaron condiciones ad libitum para los animales de control. Se evaluó la decorporación total de radionúclidos y la carga de tejido de radionúclidos siete días después de contaminación.
Se observó decorporación de americio dependiente de dosis de C2E2 en ratas tanto machos como hembras después del tratamiento con C2E2, con los beneficios del tratamiento con C2E2 evidentes a dosis de 600 mg/kg y superiores. A 1000 mg/kg, una sola dosis oral de C2E2 es comparable, en términos de eficacia, a una dosis intravenosa de Ca-DTPA (13.3 mg/kg), aunque no se ha realizado un análisis de equivalencia. De los otros efectos examinados, el estudio estableció que el sexo de la rata influye significativamente en la decorporación del americio y la carga de tejido, pero el ayuno antes de la administración de la dosis de C2E2 no lo hace. Esta determinación dio como resultado que los datos de los grupos ad libitum y en ayunas se combinaran para el análisis estadístico; los grupos de machos y hembras aún requerían un análisis por separado. De acuerdo con un estudio toxicológico de dosis única anterior (UNC-11.240-RMTD), no se observaron signos clínicos relacionados con C2E2 durante el período de 7 días.
Al reducir la cantidad de americio en los tejidos clave y aumentar la cantidad de americio que se elimina del cuerpo, una única dosis oral de C2E2 puede tratar eficazmente la contaminación por americio en un modelo de contaminación de herida de rata. Se ha demostrado la eficacia de C2E2 a dosis considerablemente inferiores a la dosis única máxima tolerada (2000 mg/kg) para la especie.
Introducción y objetivo: El objetivo de este estudio fue investigar los efectos de la comida, el sexo y la dosis sobre la carga de tejido y la decorporación de 241Am después de una única dosis oral de C2E2. La demora entre la contaminación y el tratamiento seleccionado para este estudio fue de 24 horas; esto refleja un retraso del tratamiento realista para un medicamento administrado por vía oral en una situación de víctimas masivas. Los resultados obtenidos de este estudio se utilizarán para diseñar estudios de farmacología de regímenes de dosis en ratas.
Materiales y métodos: este estudio se realizó bajo el protocolo UNC-10086-E7SD de The University of North Carolina en Chapel Hill.
Artículo de prueba y control: Se documentó que el artículo de prueba, C2E2 del Lote MTD, tenía una pureza del 98%, no se realizó ninguna corrección por pureza en la preparación de soluciones de dosis. El Artículo de Prueba se almacenó a temperatura ambiente. El Artículo de Control (Ca-DTPA; Hameln Pharmaceuticals) se almacenó a temperatura ambiente. Los registros de disposición se mantienen en el archivo del estudio.
Formulación del artículo de prueba y control: el artículo de prueba se disolvió cada día de dosificación en agua estéril (Hospira Inc.) para lograr una solución al 10 % p/p. El artículo de control (Ca-DTPA) se diluyó en solución salina al 0.9 % (Baxter International) el día de la dosificación. No se realizó el análisis de las soluciones de dosificación.
Preparación de radionúclidos: se preparó la solución de inyección de 241Am. Se extrajo una alícuota de 200 pl de la solución madre de 241Am(NO3)3 (0.1 mCi/ml en HNO3 1 M) y se colocó en un vial de vidrio de 20 ml. La alícuota se evaporó hasta secado en un baño de aceite agitado. Se agregó ácido nítrico concentrado (15 M, “ 5 ml) al nitrato de americio seco y la solución resultante se evaporó hasta secado. Para formar la solución de inyección, se agregó ácido nítrico diluido (0.1 M, 8 ml) al vial seco de 20 ml, luego se filtró la solución en un vial de inyección de 10 ml, se tapó y se almacenó de forma segura hasta uso.
Sistema de prueba: Se adquirieron ratas Sprague Dawley machos y hembras cateterizados en la yugular y sin tratamiento previo de Charles River Laboratories (Raleigh, NC). Poco después de su llegada al laboratorio, los animales se sacaron de las cajas de envío y se examinaron. No se identificó evidencia de enfermedad o anomalías físicas. En el momento de la contaminación, los animales eran machos de 260-310 g y hembras de 210-320 g. El destino de todos los animales está documentado en los registros del estudio.
Asignación: se midieron los pesos corporales antes de la administración de 241Am. Los pesos individuales de los animales colocados en estudio estuvieron dentro del ±20 % del peso medio para cada género con una excepción (hembra con peso corporal - 20.5 % de la media). Los animales considerados aptos para el estudio en base a las observaciones previas al estudio se asignaron a grupos de artículos de prueba o de control. Los animales no se asignaron al azar debido a limitaciones de espacio.
Identificación: a cada animal se le asignó un número de identificación temporal y la ubicación de la jaula al recibirlo. Inmediatamente después de contaminación, a los animales se les asignó un número de jaula y una ubicación y un número único asignado por la Instalación de Prueba (Tabla 5). Cría de animales: Los animales se alojaron individualmente en jaulas metabólicas (Techniplast USA). Los parámetros ambientales se registraron y se incluyen en el archivo del estudio. Temperatura (rango deseado de 68 ± 3 °F), humedad (aproximadamente de 30 a 70 %), iluminación (ciclo de luz/oscuridad de 12 horas; 0700-1900 hrs) e intercambios de aire (20-30 cambios de aire por hora) en el área del alojamiento vivienda fue monitoreada para asegurar que las condiciones se mantuvieran en la mayor medida posible. El saneamiento de la habitación y la apertura/cierre de la puerta de la habitación pueden haber creado excursiones temporalmente. El agua potable del sistema de agua municipal de Chape1Hill, Carolina del Norte y la comida estándar para roedores (Labdiet, Prolab RMH 3000) se proporcionaron ad libitum, excepto cuando se indicaba.
Grupos experimentales: Las asignaciones de números de animales individuales y los grupos experimentales se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5: Asi naciones de número de animales.
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Contaminación por americio: Se contaminaron ratas Sprague Dawley macho y hembra con 241Am(NO3)3 (0.25 |jC¡) mediante inyección intramuscular (0.1 ml, HNO3 0.1 M) en la pata trasera derecha, bajo anestesia con isoflurano. Inmediatamente después de la inyección, se registraron los pesos corporales (peso del día 0) y los animales se colocaron enjaulas metabólicas individuales.
Ayuno: Aproximadamente ocho horas después de contaminación - y 16 horas antes de la administración del artículo de prueba - las ratas asignadas a los grupos en ayunas tenían acceso restringido a la comida al retirar la cámara de comida de sus jaulas metabólicas y recogiendo toda la comida suelta de sus cámaras de alojamiento. Las cámaras de alimentos se reemplazaron 1 hora después del tratamiento con sonda oral, restableciendo el acceso a los alimentos. En todas las demás ocasiones, todos los animales tuvieron acceso ad libitum a la comida.
Administración del artículo de prueba: ratas Sprague-Dawley machos y hembras asignadas a los grupos de prueba recibieron cada una, una única dosis oral de 0, 200, 600 o 1000 mg/kg de C2E2 utilizando una solución al 10 % p/p en agua 24 horas después de contaminación. En algunos animales, se requirió una breve exposición al isoflurano (5 % por vaporizador) durante la dosificación para reducir la propagación del radionúclido. El volumen de dosis en estos grupos varió entre 2 y 10 ml/kg. Las dosis se basaron en el peso del día 0 (inmediatamente después de contaminación). Se registró la masa de la solución de dosificación administrada a cada rata.
Administración del artículo de control: bajo anestesia con isoflurano, cuatro ratas macho y cuatro hembras Sprague-Dawley recibieron cada una, una dosis intravenosa única de la solución de Ca-DTPA (13.3 mg/kg) a través de un catéter en la vena yugular 24 horas después de contaminación utilizando 0.67 ml/kg seguido de 0.2 ml de fundente de solución salina estéril al 0.9 %. Se registró la masa de la solución de dosificación de Ca-DTPA administrada. Las dosis se basaron en el peso del día 0 (registrado inmediatamente después de contaminación).
Eutanasia: la eutanasia programada mediante sobredosis de isoflurano y toracotomía se realizó siete días después de contaminación.
Comprobaciones de viabilidad: Se observaron todos los animales al menos una vez al día en cuanto a morbilidad, mortalidad y apariencia general.
Excreción: La orina y las heces excretadas se recolectaron diariamente, se dejaron secar durante la noche, se transfirieron a viales de centelleo de 20 ml, se pesaron y se colocaron en un contador gamma (Wizard22480, Perkin Elmer) para la detección de actividad gamma de 241Am.
Pesos corporales: Se pesó cada rata en el momento de la contaminación (día 0) y se tomó el peso corporal final (día 7) en la necropsia.
Consumo de alimentos: el consumo de alimentos se monitorizó diariamente mediante inspección visual para asegurarse de que había una cantidad suficiente de alimento. Los animales tenían un suministro continuo de alimento disponible para ellos, excepto donde se indicaba.
Post mortem: los animales programados se llevaron a la sala de necropsias, se sacrificaron mediante sobredosis de isoflurano seguida de toracotomía, se registraron sus pesos corporales finales y se retiraron los tejidos seleccionados, se pesaron y se colocaron en un contador gamma (Wizard22480, Perkin Elmer) para detección de la actividad gamma de 241Am.
Análisis de la muestra: la cantidad total de 241Am administrada a los animales se determinó al cuantificar los fotones de 59.7 keV emitidos por el 241Am en alícuotas duplicadas (100 j l) de la solución de inyección utilizando un contador gamma (serie wizard, Perkin-Elmer). Se utilizó una ventana de recuento de 40 a 80 keV y un tiempo de recuento de 60 segundos para la adquisición y cada lectura se corrigió para el fondo en la adquisición. Todos los tejidos y muestras experimentales se contaron utilizando el mismo protocolo y contador gamma. Para todas las muestras, el contenido de 241Am se expresó como porcentaje de la dosis inicial. El fémur de la pierna opuesta al lugar de la inyección fue escalado por un factor de 20 para estimar la carga esquelética total de 241Am.
Estadísticas: se realizó un análisis estadístico para los parámetros de decorporación finales: decorporación total, carga hepática, retención de la herida y carga esquelética estimada. Todos los animales tratados con C2E2 se analizaron mediante ANOVA para evaluar los efectos del género, dosis y estado de alimentación. Los efectos no contribuyentes se eliminaron del modelo y los datos de control (grupos de tratamiento con Ca-DTPA y no tratados) se incluyeron para el análisis posterior. Se realizó un ANOVA y se calcularon las medias de los mínimos cuadrados para todos los grupos de este modelo. La comparación de medias se realizó utilizando el ajuste de Tukey-Kramer para comparaciones múltiples, considerándose significativa una p <0.05.
Resultados
Animales: La contaminación y el tratamiento posterior de ratas macho y hembra se produjeron en nueve cohortes entre el 9 de junio y el 24 de agosto. Tres ratas macho en una cohorte que comenzó el 2 de agosto murieron como resultado de un error del experimentador durante el tratamiento por sonda, se agregaron animales adicionales a la cohorte del 24 de agosto para reemplazar estos animales perdidos. Se experimentó alguna dificultad en la dosificación de ratas hembra. Específicamente, la solución de dosificación se observó en la boca durante la alimentación por sonda en cinco ratas hembra. En los dos casos en los que la solución de dosificación permaneció confinada a la boca, el volumen observado se consideró insignificante y no se observaron efectos adversos; estas ratas se mantuvieron en el análisis. Sin embargo, en tres ratas se produjo alguna pérdida de dosis por la boca y puede haber ocurrido una aspiración parcial de la dosis al observarse una breve dificultad para respirar. Aunque no se observaron efectos adversos de la dosificación en estos animales una hora después de la dosificación y completaron la porción en vida del estudio, estos animales fueron excluidos del análisis de datos.
Observaciones clínicas: No se identificaron observaciones clínicas adversas relacionadas con la exposición a C2E2 para ratas macho o ratas hembra en ninguno de los grupos de dosis. Los datos de observación clínica de animales individuales se incluyen con los datos de excrementos diarios en las hojas de Observaciones Diarias de Jaula en el archivo del estudio.
Pesos corporales: se registraron los pesos corporales en el momento de la contaminación y en el momento de la eutanasia para todos los animales. Los pesos corporales medios y el cambio porcentual en el peso corporal durante el estudio se muestran en la Tabla 6 y la Tabla 7. Aunque se observan diferencias significativas entre diferentes grupos tanto en animales machos como hembras, no se prevé que influyan en los resultados del estudio. Una hembra (peso corporal -20.5 % de la media) se incluyó en el estudio a pesar de estar fuera del rango de peso ideal (20 % de la media del peso por género).
T l : P r r l r m i r r -D wl m h h m r
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T l 7: P r n r m i m i r r l.
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Análisis de datos de la excreción de 241Am: Sesenta y cuatro ratas completaron el estudio, de estas 61 ratas (32 machos y 29 hembras) se incluyeron en el análisis de datos. Se excluyeron del conjunto de datos tres ratas hembras en ayunas (1x 600 mg/kg; 2x 1000 mg/kg) porque no recibieron una dosis completa.
Efecto de los alimentos sobre la decorporación de 241Am: el contenido de americio en la producción diaria de orina y heces de ratas macho (Figura 17) y hembra (Figura 18) indica que la eficacia de la dosis de C2E2 no se vio alterada por el ayuno de las ratas antes de su tratamiento con C2E2.
El análisis de la decorporación total lograda en los siete días posteriores a la contaminación para todas las ratas tratadas con C2E2 mostró efectos significativos para el género (F(i44) = 17.54, p <0.001) y la dosis de C2E2 (F(2.44) = 40.71, p <0.001) pero no para el estado Fed en el momento del tratamiento (F(i44) = 1.51, p = 0.23), lo que confirma las observaciones en las Figuras 17 y 18. Las interacciones entre los efectos no se consideraron significativas y, por lo tanto, se combinaron para los análisis posteriores ad libitum y los grupos en ayunas. El análisis estadístico no se ha aplicado a los datos diarios.
Efecto del género sobre la decorporación de 241Am: la decorporación de americio en ratas macho es significativamente mayor durante los siete días del estudio que en ratas hembras (F(i60) = 21.37, p <0.001; Figura 19). La diferencia observada entre géneros es constante en todos los diferentes grupos de tratamiento (sin tratamiento, tres dosis de C2E2 y Ca-DTPA) y no es estadísticamente significativa en ningún nivel de tratamiento individual.
Efecto de la dosis de C2E2 sobre la decorporación de 241Am: C2E2 mejoró la eliminación de americio de una manera dependiente de dosis en ratas macho y hembra. En ratas macho, la decorporación total aumentó significativamente en comparación con los controles no tratados a dosis de 600 mg/kg y superiores (p <0.001) y aumentó la dosis de 600 mg/kg a 1000 mg/kg también aumentó significativamente la decorporación (p <0.05). Se observó una tendencia similar en ratas hembras con dosis superiores a 600 mg/kg que indujeron una decorporación significativamente mejorada (p <0.001), la dosis de 1000 mg/kg parece ser más eficaz que la dosis de 600 mg/kg, aunque esto no alcanzó significación estadística.
Análisis de datos de la carga de tejido de 241Am: se recolectaron tejidos y órganos de las 64 ratas que completaron el estudio, de estas 61 ratas (32 machos y 29 hembras) se incluyeron en el análisis de datos. Se excluyeron del conjunto de datos tres ratas hembras en ayunas (1x 600 mg/kg; 2x 1000 mg/kg) porque no recibieron una dosis completa.
Efecto de los alimentos sobre la carga de tejido de 241Am: se determinó la carga de americio en el hígado, el tejido del sitio de la herida y la carga esquelética se estimó siete días después de contaminación en animales tratados con 200, 600 o 1000 mg/kg de C2E2 un día después de contaminación intramuscular. Para todos los tejidos no se observaron diferencias en la carga de americio entre las ratas con acceso ad libitum a la comida y las ratas en ayunas durante la noche antes del tratamiento con C2E2 (Hígado, F(i44) = 0.02, p = 0.88; Herida, F(i44) = 0.84, p = 0.37; Esqueleto, F(i44) = 0.02, p = 0.88). Por el contrario, en estos animales el género fue un factor significativo, ya que las ratas macho tuvieron una menor retención que las ratas hembra (Hígado, F(i44) = 72.97, p <0.001; Herida, F(i44) = 12.87, p <0.01 ; Esqueleto, F(i44) = 48.29, p <0.001). La dosis de C2E2 también influyó en la carga de tejido (Hígado, F(2.44) = 8.52, p <0.01; Herida, F(2.44) = 10.03, p <0.001; Esqueleto, F(i .44) = 4.79, p < 0.05). Las interacciones entre los efectos no se consideraron significativas y para el análisis posterior se combinaron los grupos ad libitum y en ayunas.
Efecto del género sobre la carga de tejido de 241Am: para todos los animales del estudio, se observaron cargas de americio en el hígado y el lugar de la herida más bajas en ratas macho que en ratas hembra (hígado, F(1.60) = 91.24, p <0.001 y Herida, F(1.60) = 18.59, p <0.001). Aunque la tendencia a una mayor retención promedio de americio en el sitio de la herida en ratas hembras se observó en todos los grupos (Figura 20), solo alcanzó significación estadística en la dosis de C2E2 de 200 mg/kg (p <0.05). Ca-DTPA y C2E2 redujeron la carga de americio en hígados de rata macho en comparación con hígados de rata hembra (14 mg/kg de Ca-DTPA, p <0.05; 200 y 600 mg/kg de C2E2, p <0.001; y 1000 mg/kg de C2E2, p <0.05), las cargas de americio en ratas no tratadas no fueron significativamente diferentes entre los géneros (p = 0.42). En contraste con el hígado y el sitio de la herida, la carga esquelética estimada fue menor en las ratas hembra que en las ratas macho (F(i60) = 58.51, p <0.001). En los grupos de Ca-DTPA, la carga esquelética estimada no se vio significativamente influenciada por el género (p = 1.00) para todos los demás grupos, las estimaciones de la carga esquelética de americio en las hembras fueron menores que en los machos comparables (sin tratamiento y 200 mg/kg de C2E2, p <0.001; 600 y 1000 mg/kg de C2E2, p <0.05).
Efecto de la dosis de C2E2 sobre la carga de tejido de 241Am: en ratas machos y hembras, C2E2 redujo la carga de americio en el hígado, el esqueleto y en el sitio de la herida. En ratas macho, la carga hepática se redujo significativamente en comparación con los controles no tratados a dosis de 200 mg/kg (p <0.05) y 1000 mg/kg (p <0.001). Aunque la carga hepática después de una dosis de 600 mg/kg de C2E2 no alcanzó significación estadística (p = 0.056), es consistente con la tendencia del tratamiento con C2E2 a reducir la carga hepática. Se observó una reducción dependiente de dosis en la carga hepática de 241Am en ratas hembras. Solo la reducción de la carga después de la dosis de 1000 mg/kg fue estadísticamente significativa en comparación con los controles no tratados con la dosis de 1000 mg/kg (p <0.01). La carga estimada de americio esquelético en ratas macho disminuyó de una manera dependiente de dosis de C2E2 con una reducción significativa en comparación con los animales de control no tratados a dosis de 600 mg/kg y superiores. La carga esquelética en las ratas hembra fue menor que en las ratas macho para todos los grupos y no se modificó significativamente por el tratamiento con C2E2 (Figura 21). Aunque la dosis global de C2E2 fue un efecto significativo para la retención de americio en el sitio de la herida (F(3.52) = 7.92, p <0.01), este efecto no se correspondió con un cambio significativo en la carga de tejido en comparación con los controles no tratados con una sola dosis de C2E2 (Figura 22). En ratas hembras, puede existir una tendencia a reducir la carga con el aumento de la dosis de C2E2; C2E2 pareció no tener ningún efecto sobre la carga esquelética en ratas macho.
En conclusión, una única dosis oral de C2E2 puede inducir una mejora significativa en el resultado en función de las medidas-decorporación primarias, carga hepática y carga esquelética. La eficacia de C2E2 es independiente de los alimentos, aunque depende del género; esta dependencia es consistente con las diferencias entre géneros observadas en animales no tratados y tratados con Ca-DTPA y se debe a una diferencia de género en la biocinética del americio más que a un efecto directo de C2E2.
Estudios de eficacia en perros: a los perros se les administró 241Am (diana de 3 pCi/animal) mediante inhalación solo por la nariz el día 0. Al día siguiente de la exposición, los animales recibieron una de tres dosis orales diferentes (10, 300, 500 mg/kg) de C2E2. El grupo 1 fue un control y se utilizó para determinar la biocinética inalterada. Catorce (14) días después de la administración de C2E2, los animales fueron sedados y sacrificados. Se obtuvieron datos preliminares sobre la excreción urinaria y la retención hepática (Tabla 8). Estos resultados demostraron que la administración oral de C2E2 a perros contaminados pudo mejorar la excreción urinaria del radionúclido y reducir la carga hepática.
T l : r r i n 241Am n rin hí rr r n 2E2 r ví r l.
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Toxicología
Estudio de dosis repetidas de 10 días en perros: se llevó a cabo un estudio exploratorio para evaluar la toxicidad y determinar la toxicocinética del artículo de prueba, C2E2, cuando se administra a perros mediante 10 dosis diarias por sonda oral. Se administró C2E2 a grupos de 2 perros Beagle/sexo mediante sonda oral a niveles de dosis de 0, 60, 200, 400 o 600 mg/kg. El vehículo fue agua de ósmosis inversa y el volumen de dosis fue de 8 ml/kg. La evaluación de la toxicidad se basó en la mortalidad, observaciones clínicas, peso corporal, consumo de alimentos, patología clínica, patología general, peso de los órganos, histopatología de los tejidos seleccionados y análisis de los oligoelementos esenciales del plasma. Se recolectaron muestras de sangre los días 1 y 10 para evaluaciones toxicocinéticas de C2E2, C2E1, DTPAy C2E3. Se considera que C2E3 es una impureza en el lote C2E2 utilizado.
Se sacrificaron dos animales temprano debido a la condición moribunda, un macho recibió 600 mg/kg/día y un macho recibió 400 mg/kg/día. Estos animales tenían concentraciones plasmáticas de C2E2 notablemente más altas que otros animales en sus respectivos grupos de dosis. Según los hallazgos de patología clínica y la evidencia microscópica de degeneración/necrosis hepatocelular, la condición moribunda de estos animales se debió principalmente a la toxicidad hepática relacionada con el artículo de prueba.
Los animales que recibieron > 200 mg/kg/día demostraron dos tipos de observaciones clínicas relacionadas con el artículo de prueba. Estas observaciones consistieron en vómitos/emesis, normalmente inmediatamente después de la administración de la dosis, y anomalías fecales (no formadas, líquidas o mucoides), que normalmente ocurrieron dentro de 1 hora de la administración de la dosis. Las observaciones clínicas se resolvieron a la mañana siguiente. Se produjo una pérdida de peso corporal dependiente de dosis en machos que recibieron > 200 mg/kg/día y hembras que recibieron > 400 mg/kg/día. No se observó supresión de oligoelementos esenciales en plasma relacionada con el artículo de prueba (Cr, Co, Cu, Fe, Mg, Mn, Mo, Se y Zn) en perros después de la administración oral de C2E2 en dosis repetidas de hasta 600 mg/kg/día durante 10 días. Se observaron cambios en la química clínica compatibles con hepatotoxicidad a dosis > 400 mg/kg/día. En los animales que se sacrificaron temprano, estos cambios incluyeron un marcado aumento de la actividad de la aspartato aminotransferasa (AST) y la alanina aminotransferasa (ALT) en los machos que recibieron 600 mg/kg/día y se sacrificaron el día 2, y un marcado aumento de la actividad de la ALT en los machos que recibieron 400 mg/kg/día y sacrificados el día 6. En los animales que sobrevivieron a la necropsia programada el día 11, se observó un aumento leve a moderado de la actividad de AST el día 6 en machos y hembras que recibieron 600 mg/kg/día y el día 11 en machos que recibieron > 400 mg/kg/día y hembras que recibieron 600 mg/kg/día. En los días 6 y 11 de la fase de dosificación se observó un aumento leve o notable de la actividad de la ALT en animales que recibieron > 400 mg/kg/día.
Se produjo una disminución de los pesos absolutos y relativos de hígado/vesícula biliar relacionados con el artículo de ensayo en hembras que recibieron 600 mg/kg/día y probablemente se correlacionó con una degeneración/necrosis de hepatocitos mínima. Ambos machos sacrificados temprano exhibieron degeneración/necrosis de hepatocitos leve (400 mg/kg/día) o severa (600 mg/kg/día) (correlacionada con la decoloración de rojo a bronceado del hígado en el animal que recibió 600 mg/kg/día). Además, el hígado del animal que recibió 400 mg/kg/día mostró una ligera congestión/hemorragia centrolobulillar, un mínimo de pigmento granular marrón y una mínima inflamación mixta. Ambos animales exhibieron una degeneración/necrosis de las células del túbulo renal mínima (400 mg/kg/día) o leve (600 mg/kg/día). El riñón del animal que recibió 400 mg/kg/día exhibió túbulos basófilos mínimos. Los hallazgos microscópicos adicionales en estos animales fueron observados en varias partes del tracto intestinal, estómago, ganglios linfáticos, próstata, timo, bazo y tejido linfoide asociado al intestino.
En el sacrificio final, estaban presentes hallazgos microscópicos relacionados con el artículo de prueba en el hígado, el riñón y varios segmentos del tracto intestinal. Se produjo degeneración/necrosis de hepatocitos e inflamación de células mixtas en machos que recibieron >200 mg/kg/día. En las hembras, la degeneración/necrosis de los hepatocitos estuvo presente a 600 mg/kg/día y la inflamación de células mixtas estuvo presente a > 400 mg/kg/día. Ambas hembras que recibieron 600 mg/kg/día tuvieron congestión/hemorragia centrolobulillar, y varios machos y hembras tuvieron acumulaciones de pigmento similares a las descritas en las muertes no programadas. El macho que recibió 600 mg/kg/día tenía un único vaso sanguíneo trombosado dentro del parénquima hepático. Sobre la base de la gravedad mínima y la falta de diferencias correlativas en los parámetros de patología clínica, los hallazgos hepáticos en el macho que recibió 200 mg/kg/día no se consideraron adversos; Todos los demás hallazgos microscópicos del hígado en los machos que recibieron 400 o 600 mg/kg/día y en las hembras que recibieron 600 mg/kg/día se consideraron adversos.
En el riñón, la degeneración/necrosis de las células de los túbulos estuvo presente en una hembra que recibió 600 mg/kg/día y una hembra que recibió 400 mg/kg/día; sin embargo, este hallazgo no estuvo presente en los machos en el sacrificio final, pero se observó en ambos machos sacrificados temprano. Debido a la gravedad de los hallazgos, estos se consideraron adversos. Los hallazgos relacionados con el artículo de prueba en varios segmentos del tracto intestinal incluyeron absceso de criptas/glándulas, infiltrados de neutrófilos, congestión y/o supresión/necrosis de linfocitos de GALT en uno o más animales que recibieron > 200 mg/kg/día. Dado que estos hallazgos fueron esporádicos, de gravedad mínima y posiblemente relacionados con el estrés, no se consideraron adversos.
La exposición a C2E2 aumentó con el nivel de dosis de C2E2 aumentado de 60 a 600 mg/kg/día. Los aumentos en los valores medios de Cmáx y AUC0-24 no fueron consistentemente proporcionales a la dosis. Las diferencias de sexo fueron generalmente menos del doble en los valores medios de Cmáx y AUC0-24 de C2E2. No se observó acumulación de C2E2 después de múltiples dosis de C2E2 en perros. Las relaciones de los valores de AUC0-24 de C2E1, DTPAy C2E3 en comparación con las de C2E2 indicaron que la exposición sistémica de C2E1, DTPA y C2E3 fue muy baja en relación con C2E2 (<1 %). La administración diaria de C2E2 a perros beagle de raza pura por sonda oral durante 10 días a niveles de dosis de 60, 200, 400 y 600 mg/kg/día resultó en el sacrificio temprano de un macho que recibió 600 mg/kg/día y un macho que recibió 400 mg/kg/día debido a la pérdida de peso corporal y al deterioro de la salud. Debido a los primeros sacrificios, los niveles de dosis de 400 y 600 mg/kg/día excedieron la dosis máxima tolerada. El hígado y el riñón se identificaron como órganos diana de toxicidad a > 400 mg/kg/día. Con base en estos hallazgos, el nivel sin efectos adversos observados (NOAEL) es de 200 mg/kg/día. Después de 10 días de dosificación, la administración de 200 mg/kg/día de C2E2 correspondió a valores medios de C2E2 Cmáx de 59.450 y 71,950 ng/mL y valores de C2E2 AUC0-24 de 150,727 y 183,760 ng^h/mL para machos y hembras, respectivamente.
Ejemplo de referencia 2
Se evaluó la eficacia de C2E2 del Lote 050 obtenido utilizando el Método 2 en perros beagle machos y hembras a los que se les administró un complejo de nitrato de americio-241 (241Am) mediante inhalación (INH). Se administró C2E2 24 horas después de exposición por inhalación de 241Am. Los animales se controlaron y se recolectaron diariamente la orina y las heces. Las jaulas se enjuagaron diariamente. Los animales se sacrificaron 14 días después y se recolectaron los tejidos. Los tejidos se procesaron y analizaron para determinar el contenido de 241Am. Se describen las mediciones en vida y la biocinética de 241Am con y sin tratamiento de quelación.
Dieciséis (16) perros beagle machos y hembras se sometieron a un período de cuarentena de 14 días para aclimatación. Una vez liberados de la cuarentena, los animales se pesaron y ese peso se utilizó para distribuir al azar a los animales en el estudio. Los perros tenían 13.3 ± 2.2 meses de edad al inicio del estudio y pesaban 8.9 ± 1.2 kg. Después de la aleatorización, los animales se aclimataron a las jaulas de metabolismo durante aproximadamente 24 horas antes de la administración por inhalación de radionúclidos de nitrato de 241Am (III) en el momento 0 seguido de la administración por sonda oral de vehículo (agua) o 100, 300 o 500 mg/kg de C2E224 horas después de exposición por inhalación. Los animales se colocaron en jaulas de metabolismo durante la fase de vida.
Los animales se sacrificaron 14 días después de la administración de 241Am. Se realizó una necropsia completa e hígado, bazo, riñones, pulmones y tráquea, muestras de músculo (cuádriceps derecho e izquierdo), tracto gastrointestinal (estómago y esófago, intestino superior e inferior), gónadas, dos fémures, vértebras lumbares (L1-L4), patas y cola, TBLN (Ganglio Linfático Traqueobronquial) y se recolectaron todos los restos de tejidos blandos. El cerebro y los ojos se extrajeron del cráneo y se combinaron con los restos de tejidos blandos. Se desholló el esqueleto y se recolectaron todas las muestras de hueso para su análisis. La piel no se analizó para determinar el contenido de 241Am.
La orina, las heces, el enjuague de la jaula y todas las muestras de tejido se procesaron mediante tratamientos térmicos y químicos. Las muestras se analizaron mediante análisis de altura de pulso gamma.
Se evaluó con éxito el C2E2 terapéutico para determinar la eficacia de la decoporación en perros beagle expuestos por inhalación a 241Am como un nitrato relativamente soluble. Los perfiles de eliminación urinaria y fecal, así como las cargas de tejido en comparación con los controles, confirmaron que los tres niveles de dosis terapéuticas se decorporaron 241Am cuando se administraron 24 horas después de la administración del radionúclido. El contenido de 241Am en tejidos blandos y huesos también se redujo significativamente como resultado de la terapia de decorporación.
Para el estudio, se obtuvo el C2E2 de reserva (L/N: 020WJL050) como un polvo blanco y se almacenó a 2-8 °C. El C2E2 se pesó y se disolvió en un vehículo, agua desionizada. Se prepararon soluciones a 20 mg/ml, 60 mg/ml y 100 mg/ml cada día de dosificación. La formulación se protegió de la luz al envolver el recipiente en papel de aluminio. Se utilizaron espátulas, cristalería y barras de agitación sin metal al pesar y preparar la formulación.
El americio-241 se obtuvo del Departamento de Energía; se procesó y formuló como una solución madre como un complejo de nitrato. Se llevó a secado una alícuota de 20 mCi del complejo de nitrato en una placa calefactora de temperatura media. Se agregaron cien mililitros de ácido nítrico 0.25M. Se determinó que el pH era 0.74. Se recolectó una alícuota y se analizó mediante análisis de altura de pulso gamma. La concentración final de la formulación fue 201.1 pCi/mL.
Se encargaron ocho (8) perros beagle machos y ocho (8) hembras de Covance Laboratories para la asignación del estudio. Se asignaron dieciséis (16) animales a uno de los cuatro grupos de estudio por estratificación de peso corporal y aleatorización. Los perros tenían 13.3 ± 2.2 meses de edad al inicio del estudio y pesaban 8.8 ± 1.2 kg. Los animales del estudio se acondicionaron en sus jaulas de metabolismo durante 24 horas antes de la administración de 241Am. Se realizaron observaciones para asegurarse de que los animales estuvieran al tanto de la ubicación de los alimentos y el agua, así como de que excretaran cantidades normales de orina y heces. Los animales se identificaron de forma única con los grupos de estudio mediante tatuajes en las orejas. Además, cada jaula contenía tarjetas de jaula codificadas por colores con la identificación específica del estudio.
En la mañana de la exposición, los animales se mantuvieron en ayunas y se sedaron con acepromazina (0.05 mg/kg) por administración intramuscular. Los perros fueron anestesiados con isoflurano (5 %). Se colocó una máscara de látex sobre el hocico para minimizar la contaminación externa del perro. El hocico cubierto de látex se colocó en la cámara de exposición donde una mezcla de oxígeno e isoflurano fluía continuamente y se monitorizaba. El oxígeno en la caja se mantuvo en un 45-55 % y se suministró isoflurano según fuera necesario (2-3 % en oxígeno) para asegurar que el perro permaneciera anestesiado. Se generaron aerosoles a partir de la solución de nitrato 241Am utilizando un nebulizador Hospitec operado a 10 psi. El aerosol se pasó a través de un horno tubular que funcionaba a 70-80 °C para secar el aerosol y minimizar la cantidad de ácido presente.
El flujo de escape fue de 12.2 l/min. Los aerosoles se recolectaron sobre filtros Pallflex® FiberFilm™ a un índice de fluidez de 0.49 l/min para muestras de filtro y 1.95 l/min para muestras de impactador en cascada. Los filtros se colocaron en viales de 20 ml con 5 pl de HNO37 N y se agitaron en vórtex durante 30 segundos. Los filtros se retiraron y se colocaron individualmente en otro vial de 20 ml. Se extrajo una alícuota de 50 ml del vial original. El filtro y la alícuota se analizaron individualmente para determinar 241Am y se determinó la cantidad recolectada en el filtro. Se determinó que la concentración de aerosol era 1155 ± 223 nCi/L. Se determinó que el tamaño de partícula era de 0.63 pm de AMAD (diámetro aerodinámico medio de actividad) con una desviación estándar geométrica (GSD) de 1.72. Los animales se expusieron durante 8 minutos. Al final de cada exposición, los animales se retiraron de la caja de exposición, se colocaron en una caja de transporte y se devolvieron a sus jaulas de metabolismo. La actividad diana depositada en el tracto respiratorio fue de 3 pCi.
Veinticuatro (24) horas después de la administración de radionúclidos, a los animales se les administró el artículo de prueba (o vehículo) por sonda oral como se indica en la Tabla 9. Los animales recibieron una dosis única de artículo de prueba (o vehículo) un día después de la exposición al americio. El animal fue inmovilizado manualmente y se insertó en el esófago un tubo de alimentación de tamaño apropiado. El producto terapéutico se suministró a través del tubo (33-52 ml) para lograr la dosis de masa normalizada deseada de C2E2. A los perros de control se les administraron 45 ml de agua desionizada. Se enjuagó un (1) ml de agua a través del tubo de alimentación para asegurar la entrega completa del artículo de prueba. El animal fue devuelto a su jaula de metabolismo después de cada administración de dosis. Un programa de estudio se muestra en la Tabla 9.
T l : Di ñ x rim n l 241Am rí l r n r i .
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Tras la confirmación de la eutanasia, cada perro se sometió a una necropsia completa. Los tejidos recolectados incluyeron: hígado, bazo, riñones, pulmones y tráquea, muestra de músculo (cuádriceps derecho e izquierdo), tracto gastrointestinal más contenido (estómago y esófago, intestino superior e inferior), gónadas, dos fémures, vértebras lumbares (L1-L4), patas y cola, ganglios linfáticos traqueobronquiales (TBLN) y todo el tejido blando permanece. El cerebro y los ojos se extrajeron del cráneo y se combinaron con los restos de tejidos blandos. Se desholló el esqueleto y se recolectaron todas las muestras de hueso para su análisis. Todas las muestras de tejido se colocaron en recipientes de muestras etiquetados y de tamaño apropiado, con la excepción de la piel, que no se analizó para 241Am.
Todas las muestras biológicas y de enjuague de la jaula (excepto la piel) se analizaron mediante análisis de altura de pulso gamma. Antes del análisis dependiente de tejido, las muestras se procesaron térmica y químicamente mediante métodos específicos de muestra. Después de que las muestras se prepararon se colocaron en viales de centelleo líquido de 20 ml y se contaron en el contador gamma (Perkin Elmer, 2480 Wizard2 Gamma Counter).
La media y la desviación estándar de los pesos corporales recogidos para los datos de exposición y aleatorización se realizaron utilizando Microsoft Excel. El análisis estadístico se realizó mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) utilizado para evaluar el patrón de dosis recuperadas. Para cada tipo de muestra, las diferencias entre los controles no tratados y los grupos tratados se evaluaron con pruebas F individuales basadas en la estimación combinada de ANOVA de la varianza subyacente entre animales. La ausencia de evidencia estadística significativa de una diferencia en el patrón de respuesta entre los géneros (p > 0.05) acompañada de evidencia significativa (p <0.05) de las diferencias generales entre los géneros proporciona evidencia de un cambio constante en la respuesta entre los géneros, independientemente del tratamiento.
La porción del estudio durante la vida se realizó sin incidentes. La mayoría de los animales no presentaron efectos adversos o inusuales relacionados con el estudio; esto incluye los vómitos de las administraciones de dosis de C2E2. Sin embargo, se observó que un animal del grupo de dosis de C2E2 de alto nivel (Animal 4004) tenía emesis espumosa en la bandeja de la jaula después de la dosificación por sonda. Por tanto, no se puede asegurar la fidelidad de la retención de dosis en este animal.
La Tabla 10 resume la actividad total de 241Am recuperada para los cuatro grupos experimentales en este estudio. El grupo 4 recuperó menos material que los grupos restantes, pero esto se debió en gran parte a un único valor atípico (4003) que recibió menos de un total de 1000 nCi. Se desconoce el motivo de la baja actividad en este animal. Todos los registros muestran que no hubo problemas con el procesamiento de las muestras, que no hubo vómitos en el estudio, que la concentración de aerosol estaba en la diana y que el animal no se despertó durante las exposiciones. El único hallazgo notable es que este perro pesaba solo 6.5 kg y era el animal más pequeño del estudio, pero esto por sí solo no explica la baja actividad recibida. Si este animal se elimina del promedio del grupo, el promedio del grupo aumenta a 1940, que es similar al promedio de los animales del grupo 1. Para este estudio, los animales recibieron un promedio de 2220 nCi ± 610 de actividad total depositada. A diferencia de los estudios de heridas o IV, las recuperaciones fraccionarias no se pueden calcular con exposiciones por inhalación porque la actividad de 241Am real suministrada al tracto respiratorio solo se puede reconstruir basándose en datos de concentración de aerosol junto con mediciones fisiológicas o datos de medición radioquímica. La actividad depositada estimada viene dada por la ecuación:
Actividad Depositada = Concentración de Aerosol (AC) * Volumen de Minuto Respiratorio (RMV) * Fracción de Deposición (DF) * Duración de Exposición (ED)
Donde: AC = concentración de aerosol del perro (nCi/L); RMV = 0.499 * Peso corporalA(0.809); DF = 10 %; ED = 8 min
La actividad suministrada estimada para el estudio fue 2770 nCi para hembras y 2580 nCi para machos. La actividad administrada fue aproximadamente un 11 por ciento más baja que la actividad deseada, lo cual está dentro de las incertidumbres del procedimiento de exposición. La fracción de depósito para la región parenquimatosa del pulmón es variable en función de las características del aerosol (tamaño de partícula y ag) y patrones de respiración y puede variar del 10 % asumido.
Tabla 10: Grupo de dosis recu eradas.
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Las Figuras 23A y 23B muestran la eliminación urinaria y fecal diaria de 241Am para todos los grupos de estudio. No se ha realizado análisis estadístico de las recolecciones diarias. Los resultados se expresan como fracción de la actividad de 241Am recuperada total. Todos los grupos de dosis de C2E2 mostraron un aumento dependiente de dosis en la excreción urinaria en comparación con los controles no tratados. La excreción urinaria de los grupos de dosis se mantuvo durante la duración del estudio. La eliminación fecal aumentó modestamente para todos los grupos de dosis durante los primeros 3 días posteriores a la exposición, cuando los niveles de eliminación volvieron a los niveles de control.
Las Figuras 24A y 24B y la Tabla 11 muestran las eliminaciones acumuladas de orina y heces acumuladas para todos los grupos experimentales. El tratamiento con todas las dosis de C2E2 dio como resultado un aumento estadísticamente significativo de la actividad acumulativa en la excreción urinaria en comparación con el grupo de control no tratado. La dosis de 500 mg/kg resultó en una mayor eliminación urinaria de 241Am en comparación con los grupos de dosis de 100 y 300 mg/kg. El tratamiento con las dosis medias y altas de C2E2 dio como resultado un aumento estadísticamente significativo de la actividad acumulativa en las excreciones fecales en comparación con el grupo de control no tratado. La excreción fecal acumulada pareció aumentar con dosis crecientes de C2E2, pero la respuesta no fue monótona, es decir, la mayor cantidad de 241Am excretada ocurrió en el grupo de dosis media. Sin embargo, la cantidad de 241Am excretada en las heces fue estadísticamente mayor que para el grupo de control para los grupos tratados con dosis media y alta, y elevada (pero no estadísticamente significativamente diferente) para el grupo de dosis baja.
Tabla 11: Por n r m i ivi r r .
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Los contenidos finales de 241Am en los diversos tejidos analizados se muestran gráficamente para todos los grupos experimentales en las Figuras 25A-D y 26A-F, y numéricamente en las Tablas 12 y 13. Todos los resultados se expresan como porcentaje de la actividad total recuperada de 241Am. Las Figuras 25A-D muestran el contenido de tejido para hígado, bazo, riñón y pulmón para cada grupo de dosificación. Los tres grupos de C2E2 tuvieron reducciones estadísticamente significativas en las cargas de hígado, riñón y pulmón. Se observó poca respuesta a la dosis en el bazo restante y la carga renal entre los grupos de dosis media y alta.
Tabla 12: Porcentae romedio de actividad recu erada.
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T l 1 : P r n r m i ivi r r .
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Las Figuras 26A-F muestran los contenidos de tejido final para ovarios, testículos, GIT, Ganglio Linfático Traqueobronquial, tejido blando y hueso total para cada grupo de dosificación en comparación con los controles. En los ovarios, el contenido de 241Am para todos los grupos de dosis se redujo en comparación con el grupo de control no tratado. En los testículos, todos los grupos tratados mostraron reducciones estadísticamente significativas en el contenido de 241Am en comparación con los controles no tratados. No se indicaron patrones dependientes de la dosis para el ovario o los testículos. Esto puede atribuirse a las pequeñas cantidades de 241Am presentes en los tejidos. El GIT (que incluyen el contenido) y el contenido de 241Am en el tejido blando mostraron reducciones de tejido estadísticamente significativas pero no dependientes de la dosis en comparación con los controles. Se observaron reducciones de aproximadamente el 50 % y el 40 % del contenido de 241Am para Ganglio Linfático Traqueobronquial y el contenido óseo total, respectivamente. También hubo una sugerencia de una disminución dependiente de dosis en el contenido final de 241Am, pero la tendencia no fue fuerte.
La Tabla 14 muestra el porcentaje de reducción del contenido de tejido en comparación con el grupo de control no tratado y la Tabla 15 es el porcentaje de mejora urinaria o reducción fecal en comparación con el grupo de control no tratado. El grupo de dosis alta mostró una disminución de > 65 % en el hígado y el bazo, > 50 % de disminución en las cargas de riñón, pulmón, GIT, gónadas y tejidos blandos, y > 30 % de disminución en Ganglio Linfático Traqueobronquial y contenido óseo total en comparación con los controles no tratados. El grupo de tratamiento de dosis media mostró una disminución > 60 % en las cargas del bazo, riñón y gónadas, > 45 % disminución en hígado, pulmón, GIT, tejidos blandos y hueso total, y > 30 % de disminución en Ganglio Linfático Traqueobronquial. El grupo de tratamiento bajo mostró > 40 % de disminución en las cargas del bazo, riñón, GIT, gónadas, tejidos blandos y hueso total y > 20 % de disminución en las cargas de hígado, pulmones y Ganglio Linfático Traqueobronquial.
T l 14: P r n r i n l n ni 41Am n l i .
Figure imgf000022_0002
Tabla 15: Cambio porcentual en la excreción.
Figure imgf000023_0001
La producción de orina aumentó más del 800 % para los grupos de dosis baja y media y 1300 % para el grupo de dosis alta en comparación con los controles no tratados. La producción de heces aumentó más del 110 % para los grupos de dosis baja y alta, y 150 % para el grupo de dosis media.
Los perfiles de eliminación urinaria así como las cargas de tejido en comparación con los controles confirmaron que los tres niveles de dosis terapéutica se decorporaron de 241Am cuando se administraron 24 horas después de la administración del radionúclido, y en muchos casos de una manera dependiente de dosis. El grupo de dosis alta de C2E2 decorporó 241Am de manera más eficiente que el grupo de dosis baja. Las administraciones de dosis futuras se centrarán en los niveles más altos de C2E2 administrado, aunque, si bien no se desea limitarse a ninguna teoría en particular, se especula que los modestos aumentos en la eficacia dependiente de dosis se pueden compensar eficazmente con múltiples administraciones de C2E2, tanto como se realiza con terapia con DTPA.
Ejemplo 3
Se determinó inicialmente que la solubilidad de C2E2 del Lote 050 obtenido utilizando el Método 2 era de 100 mg/ml. Sin embargo, las soluciones de dosificación preparadas a esta concentración exhibieron precipitación con el tiempo. El objetivo de este estudio fue comprender el proceso detrás de la sobresaturación inicial y la precipitación posterior y determinar la solubilidad de C2E2.
Se realizó un estudio de precipitación para estimar la concentración a la que no se produce precipitación. Inicialmente, se prepararon 12 muestras de C2E2 a concentraciones que variaban entre 40 y 150 mg/ml en tampón de pH 3.0 en etapas de 10 mg/ml. Las soluciones se dejaron agitar hasta que se produjo la precipitación.
Se prepararon tres muestras de C2E2 a 60, 70 y 100 mg/ml en tampón de pH 3.0 y se agitaron a temperatura ambiente. A las 0.083, 5, 1, 2, 4, 6, 20, 24 y 44 horas, se extrajeron muestras de 0.5 ml, se centrifugaron a 14,000 x g y se midió la concentración de sobrenadante mediante HPLC-CAD. En cada punto de tiempo también se midió el pH del sobrenadante.
Después de 24 horas, se observó precipitación en soluciones con concentraciones de C2E2 superiores a 90 mg/ml. Se observó precipitación en soluciones con C2E2 a concentraciones superiores a 60 mg/mL que se dejaron reposar a temperatura ambiente sin agitación durante 48 horas después de 24 horas con agitación. La solubilidad de C2E2 a pH 3.0 está entre 60 y 70 mg/mL. En la segunda parte del estudio, se preparó C2E2 a concentraciones justo por encima y por debajo de la solubilidad determinada y una tercera muestra a una concentración más alta para probar si la precipitación de C2E2 daba como resultado una menor solubilidad en equilibrio. El perfil de concentración-tiempo alcanzado se muestra en la Figura 27. Las soluciones de C2E2 preparadas a 60 y 70 mg/ml se mantuvieron estables después de 6 horas y la muestra de 70 mg/ml estaba en una concentración más alta que la solución de 60 mg/ml. Se observó algo de precipitación de 70 mg/ml antes del final del estudio, por lo que la concentración mostrada por la línea con los símbolos ■ para la solución de 70 mg/ml es la solubilidad en equilibrio. Para la concentración de la solución de 100 mg/ml, C2E2 permaneció en una solución sobresaturada durante 20 horas y luego precipitó repentinamente de la solución entre 20-24 horas, con la solubilidad final en el rango de las soluciones de C2E2 de 60 y 70 mg/ml. El cambio repentino de concentración puede indicar la formación de otro polimorfo. El sólido centrifugado se separó del sobrenadante y se realizará el análisis por DSC.
En base a la observación de las soluciones de dosificación, después de una cierta cantidad de tiempo se produjo precipitación en las soluciones de C2E2 acompañada de una menor solubilidad medida de C2E2.
Ejemplo de referencia 4
El metabolismo de C2E2 por las esterasas en plasma puede provocar la pérdida de los profracciones de éster en C2E2. La degradación ex vivo de C2E2 en plasma, si está presente, tendría implicaciones para la interpretación de los datos de eficacia de C2E2 y para el análisis de datos de estudios de PK y TK; el metabolismo continuo del compuesto después de que se hayan recolectado las muestras de sangre daría como resultado un cálculo inexacto de los parámetros PK. Por tanto, el objetivo de este estudio fue determinar la estabilidad de C2E2 en plasma.
Antes del estudio, se precalentaron 975 pl de plasma (Rata, Beagle y Humano) a 37 °C en tubos Eppendorf y se preparó el compuesto de prueba (C2E2) en agua desionizada (10 mg/ml). El C2E2 fue del Lote 050 obtenido utilizando el Método 2. Para iniciar el estudio, se agregaron 25 pL de la solución de C2E2 al plasma precalentado y se agitó brevemente en vórtex para mezclar. A los 0, 15, 30, 60 y 120 minutos se tomó una muestra de plasma de 100 pL, se agregó un volumen igual de acetonitrilo frío y se mezcló para precipitar las proteínas en plasma. Las muestras se centrifugaron a 4 °C y 14,000 xg durante 10 minutos para eliminar las proteínas precipitadas, se recolectó el sobrenadante y se determinó la concentración de C2E2 mediante HPLC-CAD. Todas las condiciones se repitieron por triplicado. Se utilizó diltiazem como compuesto de control positivo y plasma inactivado por calor como control negativo.
Métodos de detección de HPLC: El análisis de C2E2 se realizó sobre una HPLC de prominencia (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón) equipada con un detector de aniones cargados Corona Ultra (CAD) (Thermo Scientific, Sunnyvale, CA). Se utilizó una separación en gradiente de fase inversa con una columna Alltima C18 (250 x 2.1 mm2 de diámetro interno con un tamaño de partícula de 5 pm (Grace)) a 40 °C y un índice de fluidez de 0.25 ml/min. La fase móvil está compuesta por agua con ácido trifluoroacético al 0.1 % (A) y acetonitrilo/isopropanol 2: 1 (B). La fase móvil sigue un gradiente lineal de 94:6 a 75:25 durante 14 min, luego el gradiente aumenta durante 0.5 min para lograr un flujo de 0: 100 durante 3.5 minutos seguido de reequilibrio del sistema a 94:6 durante 6 min. El análisis CAD se realiza a 25 °C con un flujo de nitrógeno a 35.1 psi. Para el diltiazem, la fase móvil en gradiente consta de dos componentes principales: Fase Móvil A, TEA acuosa (0.2 %, v/v) que se ajustó a pH 5.0 con o-PA, y Fase móvil B, ACN. El gradiente es de 0.01 a 34.99 min: 22 % de B; 35.00-44.99 min: 33 % de B; 45.00-60.00 min: 38% B. el índice de fluidez es de 1.0 ml/min, se utilizará una columna Thermo Hypersil ODS (150 mm de 4.6 mm de diámetro interno con partículas de 5.0 pm), el volumen de inyección será de 10 pl y la temperatura del horno de la columna se mantendrá a 25 °C. El diltiazem será detectado por UV a 240 nm. El límite de cuantificación es de 0.35 pg/ml. (Journal of Pharmaceutical Analysis 2012;2(3):226-237).
Los resultados preliminares del estudio se resumen en la Figura 28A-C. Aunque se observó cierta variabilidad, se observó un metabolismo robusto del control positivo (diltiazem) en todas las especies. En todas las especies analizadas, el metabolismo de C2E2 fue mínimo o no se detectó durante al menos dos horas; aproximadamente el 90 % de C2E2 permanece después de 2 horas en el plasma humano. Como C2E2 no se somete a metabolismo, la observación de que la inactivación por calor no previno el metabolismo en el control positivo de diltiazem no altera las conclusiones del estudio.
Ejemplo de referencia 5
El modelo preliminar de PK/PD predijo que la eficacia de C2E2 está correlacionada con el AUC. Si bien no se desea limitarse a ninguna teoría en particular, si los estudios de toxicología muestran que la toxicidad está asociada con la Cmáx en lugar del AUC, dividir la dosis y administrarla con más frecuencia podría aumentar la ventana terapéutica. Para evaluar los beneficios de dosis diarias únicas frente a múltiples de éster de dietilo de DTPA, se realizó un estudio de decorporación en ratas contaminadas con 241Am.
El estudio con animales se realizó de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de The University of North Carolina en Chapel Hill. Se contaminaron dieciséis ratas macho Sprague Dawley con 241Am(NO3)3 (0.25 pCi) mediante inyección intramuscular (0.1 ml, HNO30.1 M) en la pata trasera derecha, bajo anestesia con isoflurano. Inmediatamente después de la inyección, se registraron los pesos corporales (peso del día 0) y los animales se colocaron en jaulas metabólicas individuales. Las 16 ratas se asignaron a cuatro grupos; control no tratado, 5 dosis diarias de 600 mg/kg de C2E2 por sonda oral una vez al día, 5 días de tratamiento por sonda oral de 300 mg/kg de C2E2 dos veces al día o 5 dosis intravenosas diarias de solución de Zn-DTPA (13.3 mg/kg) por vía de catéter de vena yugular. El C2E2 fue del Lote 050 obtenido utilizando el Método 2. La solución de dosificación de C2E2 utilizada fue una solución al 10 % p/p en agua. Todos los animales se observaron al menos una vez al día en cuanto a morbilidad, mortalidad y apariencia general. La orina y las heces excretadas se recolectaron a las 2, 4, 8, 10, 12, 14, 18, 20 y 24 horas después de la primera dosis y diariamente durante el resto del estudio. Las muestras se transfirieron a viales de centelleo de 20 ml, se pesaron y se colocaron en un contador gamma (Wizard2 2480, Perkin Elmer) para la detección de actividad gamma 241Am. Además, después de la necropsia, se extrajeron los tejidos seleccionados, se pesaron y se colocaron en un contador gamma (Wizard2 2480, Perkin Elmer) para la detección de la actividad gamma de 241Am. La cantidad total de 241Am administrada a los animales se determinó al cuantificar los fotones de 59.7 keV emitidos por 241Am en alícuotas duplicadas (100 pl) de la solución de inyección utilizando un contador gamma (serie wizard, Perkin-Elmer). Se utilizó una ventana de recuento de 40 a 80 keV y un tiempo de recuento de 60 segundos para la adquisición y cada lectura se corrigió para el fondo en la adquisición. Todos los tejidos y muestras experimentales se contaron utilizando el mismo protocolo y contador gamma. Para todas las muestras, el contenido de 241Am se expresó como un porcentaje de la dosis inicial. El fémur de la pierna opuesta al lugar de la inyección fue escalado por un factor de 20 para estimar la carga esquelética total de 241Am.
Todas las dieciséis ratas macho completaron el estudio. El análisis preliminar muestra que la eliminación de americio mejoró significativamente en todos los grupos de tratamiento en comparación con el control no tratado y dividir la dosificación de C2E2 y administrarla dos veces al día no alteró significativamente la decorporación total. La Tabla 16 muestra la decorporación total en cada grupo y la Figura 29 muestra las cargas de americio en los tejidos diana clave.
Tabla 16: Decorporación total en los siete días posteriores a la contaminación con americio
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Además de examinar la decorporación total y la carga de tejido, se obtuvo el perfil de la decorporación de americio en la orina a lo largo del tiempo. Las Figuras 30A y 30B muestran los perfiles de decorporación urinaria después de un tratamiento de una y dos veces al día con C2E2. En la Figura 30B se puede ver claramente un aumento de la decorporación después de la segunda dosis de C2E2. El segundo pico en el grupo de dosificación dos veces al día alrededor de las 14 horas da como resultado una mayor eliminación urinaria que el primero a las 2 horas, lo que se puede deber a algo de C2E2 residual de la primera dosis. Sin embargo, la hora del día y la actividad de los animales también pueden afectar los perfiles, ya que la orina no se expresó manualmente en este estudio. En el transcurso del estudio, los grupos de una vez al día (OD) y dos veces al día (BD) dieron como resultado perfiles muy similares de eliminación urinaria diaria, consistente con la hipótesis de que, aunque no se desea limitarse a ninguna teoría en particular, el AUC del fármaco es el mejor indicador de eficacia en la rata.
El análisis preliminar de los datos sugiere que dividir la dosis de C2E2 en dos dosis más pequeñas no disminuye la eficacia y, por lo tanto, puede aumentar potencialmente la ventana terapéutica para C2E2. Se realizará un análisis completo una vez que se complete el brazo de hembras del estudio.
Ejemplo de referencia 6
El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad de C2E2 para inducir mutaciones inversas en el locus de histidina en las cepas de ensayo de Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535 y TA1537, y en el locus de triptófano de Escherichia coli (E. coli) cepa WP2uvrA en presencia o ausencia de un sistema de activación metabólica de mamífero exógeno (S9).
Se evaluó C2E2 en un ensayo de mutagenicidad inicial en las cinco cepas de prueba a niveles de dosis de 5.00, 16.0, 50.0, 160, 500, 1600 y 5000 pg/placa con y sin S9. El C2E2 se obtuvo del Lote 050 utilizando el Método 2. Se preparó C2E2 en un vehículo de agua de grado de cultivo celular y se formó una solución transparente e incolora. En comparación con los controles de vehículos simultáneos, se observaron reducciones en el número medio de colonias revertidas al nivel de 5000 pg/placa en TA100, TA1535, TA1537 y WP2uvrA bajo condiciones sin S9 y a >500 pg/placa en TA1535, TA1537 y WP2uvrA bajo condiciones con S9. Se observó un crecimiento bacteriano confluente mejorado a 5000 pg/placa con TA1537 en el ensayo sin S9. Las reducciones en el número de colonias revertidas y el crecimiento bacteriano confluente mejorado son indicativos de la toxicidad relacionada con el tratamiento con C2E2. Con excepción del crecimiento bacteriano confluente mejorado en TA1537 sin S9, todos los demás crecimientos bacterianos confluentes en todas las cepas, con y sin S9, fueron normales, lo que indica que hubo un crecimiento bacteriano apropiado durante el tratamiento para expresar un evento mutagénico. No se observaron aumentos relevantes en el número de colonias revertidas a ningún nivel de dosis con ninguna cepa en ausencia o presencia de activación metabólica S9.
Todos los valores del vehículo y del control positivo estaban dentro de los rangos aceptables y se cumplieron todos los criterios para un estudio válido.
Estos resultados indican que C2E2 es negativo en el Ensayo de Mutación Inversa Bacteriana probado hasta 5000 pg/placa con y sin S9 y bajo las condiciones de este protocolo.
Ejemplo de referencia 7
El objetivo de este ensayo in vitro fue evaluar la capacidad de C2E2 para inducir aberraciones cromosómicas en células cultivadas de ovario de hámster chino (CHO) con y sin un sistema de activación metabólica exógeno.
Se preparó C2E2 en agua de calidad cultivo celular (CCGW) y se formó una solución transparente e incolora. El C2E2 fue del Lote 050 obtenido utilizando el Método 2. Las subsiguientes reservas se prepararon mediante diluciones seriadas en vehículo y todos los tratamientos se administraron en cultivos de 10 mL en un volumen del 10 %. Los cultivos de control de vehículo se trataron con 100 pl/ml por cultivo. Los períodos de tratamiento fueron de 3 horas con y sin activación metabólica o aproximadamente 20 horas sin activación metabólica.
En un ensayo de aberración cromosómica inicial (prueba B1), concentraciones de C2E2 de 6.92, 9.89, 14.1, 20.2, 28.8, 41.2, 58.8, 84.0, 120, 172, 245, 350 y 500 pg/ml se analizaron en cultivos por duplicado en 3 y 20 pruebas de hora sin S9 y en la prueba de 3 horas con activación metabólica de S9. Todos los cultivos, bajo todas las condiciones de prueba, se cosecharon aproximadamente a las 20 horas desde el inicio del tratamiento. Al finalizar el cultivo, se contaron las células viables y se calculó la duplicación de la población para medir la citotoxicidad para respaldar la selección de niveles de dosis para el análisis de aberraciones. Se realizaron observaciones visuales de los cultivos para determinar la salud celular general y la confluencia antes de la terminación.
No se observó citotoxicidad relevante en las pruebas de tratamiento de 3 horas con y sin activación metabólica de S9 y se seleccionaron los niveles de dosis de 245, 350 y 500 |jg/ml para el análisis de aberraciones para cada condición de prueba de 3 horas. No se observaron aumentos estadísticamente significativos o biológicamente relevantes en el número de células con aberraciones cromosómicas a cualquier nivel de dosis examinado en la prueba de 3 horas bajo condiciones con o sin activación metabólica de S9.
En la prueba de 20 horas sin S9, se mostró una tendencia a la disminución de la citotoxicidad relacionada con el tratamiento mediante cálculos de duplicación de la población. Los niveles de tratamiento de 20.2, 172 y 500 jg/m l se seleccionaron para el análisis de aberraciones que representan una citotoxicidad del 18% al 51 % medida por duplicación de la población como reducciones porcentuales del control del vehículo. Sin embargo, los portaobjetos preparados a partir de los niveles de dosis de 172 y 500 jg/m l no tenían células en metafase adecuadas para el análisis. No se determinó la razón de esto y se repitió la prueba para determinar si los resultados eran reproducibles y si se requería un método alternativo para medir la citotoxicidad.
Se repitió la prueba de 20 horas sin S9 (prueba B2) a los mismos niveles de dosis que la prueba B1 inicial. Los resultados de la prueba B2 reprodujeron la prueba B1 inicial que muestra el mismo perfil de citotoxicidad medido por duplicación de la población, las mismas observaciones visuales de numerosas células en división al final del cultivo y resultados similares de ausencia de células en metafase en los portaobjetos preparados (245 y 500 jg/mL) a niveles de dosis que se estiman adecuados para el análisis cromosómico. En base a estos resultados, se leyeron los índices mitóticos de los portaobjetos de prueba B1 para reevaluar la citotoxicidad. Con base en los índices mitóticos, se seleccionaron los niveles de dosis de 6.92, 9.89 y 14.1 jg/m l para el análisis de aberraciones. El nivel de dosis de 14.1 jg/m l produjo una reducción del 53 % en el índice mitótico en comparación con el control con vehículo concurrente. El análisis cromosómico mostró que no hubo aumentos biológicamente relevantes o estadísticamente significativos en el número de células con aberraciones observadas en cualquier nivel de dosis.
Bajo todas las condiciones de prueba, los cultivos de control del vehículo estaban dentro del rango de control histórico para las células con aberraciones cromosómicas y los cultivos de control positivo tenían aumentos significativos en las células con aberraciones cromosómicas en comparación con los cultivos de control del vehículo.
Se determinó que C2E2 era negativo para la inducción de aberraciones cromosómicas bajo condiciones con y sin S9 cuando se probó hasta niveles de dosis limitantes de citotoxicidad y la dosis límite de 500 jg/m l para este ensayo.
Ejemplo de referencia 8
El objetivo de este estudio fue evaluar C2E2 para actividad clastogénica in vivo y/o alteración del aparato mitótico mediante la detección de micronúcleos en eritrocitos policromáticos (PCE) en médula ósea de rata Sprague-Dawley.
Se formuló C2E2 en un vehículo acuoso de calidad cultivo celular y el volumen de dosis para todos los grupos de tratamiento fue de 20 ml/kg. El C2E2 fue del Lote 050 obtenido utilizando el Método 2.
Se administró vehículo de control a ratas macho, o 500, 1000 o 2000 mg/kg/día de C2E2 una vez al día durante dos días separados por aproximadamente 24 horas. La dosis alta de 2000 mg/kg es la dosis límite para este ensayo recomendada por la guía de ICH S2(R1). Un grupo de control positivo de animales recibió un tratamiento único de 60 mg/kg de ciclofosfamida en el segundo día de administración. Se observó a los animales al menos dos veces al día en busca de signos tóxicos y/o mortalidad. La médula ósea se extrajo aproximadamente 24 horas después del último tratamiento en todos los grupos y se analizaron al menos 2000 PCE por animal para determinar la frecuencia de micronúcleos. La citotoxicidad se evaluó al puntuar el número de PCE y eritrocitos normocromáticos (NCE) observados mientras se puntuaba al menos 500 eritrocitos por animal.
Se observó un animal del grupo de 2000 mg/kg/día con respiración audible y comportamiento hipoactivo el día 2. No se observaron otros signos adversos de toxicidad clínica en ningún otro animal tratado con C2E2. No hubo disminuciones estadísticamente significativas en las relaciones de PCE:NCE del grupo tratado con C2E2 en comparación con el valor de control del vehículo que indica una ausencia de citotoxicidad de la médula ósea relacionada con el tratamiento. No hubo aumentos estadísticamente significativos o relacionados con el tratamiento en los PCE micronucleados en ningún nivel de dosis de C2E2 examinado.
Bajo las condiciones de este protocolo, se demostró que C2E2 era negativo para inducir micronúcleos en la médula ósea de rata cuando se administraba por vía oral a 500, 1000 o 2000 mg/kg/día una vez al día durante 2 días consecutivos.

Claims (2)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso para preparar un polimorfo de ácido 6,9-bis(carboximetil)-3-(2-etoxi-2-oxoetil)-11-oxo-12-oxa-3,6,9-triazatetradecan-1-oico caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene picos en 7.6, 12.4, 13.5, 14.0, 15.3, 18.1, 18.7, 18.8, 21.0, 22.5, 23.4, 24.5, 28.7, y 35.7 ± 0.2 grados 2 theta, que comprende
(a) combinar bis-anhídrido de DTPA, etanol, y piridina para formar una mezcla de reacción;
(b) agitar la mezcla de reacción bajo nitrógeno durante aproximadamente 24 horas;
(c) agregar la mezcla de reacción a diclorometano para formar una solución de diclorometano;
(d) enfriar la solución de diclorometano a una temperatura de aproximadamente -20 °C para formar un precipitado de un polimorfo de ácido 6,9-bis(carboximetil)-3-(2-etoxi-2-oxoetil)-11-oxo-12-oxa-3,6,9-triazatetradecan-1-oico;
(e) filtrar la solución de diclorometano para obtener el precipitado;
(f) opcionalmente lavar el precipitado con diclorometano durante la etapa de filtración; y
(g) opcionalmente secar el precipitado, obteniendo de esta manera el polimorfo.
2. Un proceso para preparar un polimorfo de ácido 6,9-bis(carboximetil)-3-(2-etoxi-2-oxoetil)-11-oxo-12-oxa-3,6,9-triazatetradecan-1-oico caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo que tiene picos en 8.1, 12.0, 13.8, 15.4, 16.0, 16.6, 18.3,19.3, 21.4, 22.1, 24.0, 26.5, y 29.2 ± 0.2 grados 2 theta, que comprende
(a) combinar bis-anhídrido de DTPA y etanol absoluto para formar una mezcla de reacción;
(b) calentar la mezcla de reacción hasta reflujo mientras que se agita durante 1.5 horas ± 20 %;
(c) filtrar la mezcla de reacción para formar un filtrado;
(d) enfriar el filtrado a una temperatura por debajo de 20 °C para formar un precipitado de un polimorfo de ácido 6,9-bis(carboximetil)-3-(2-etoxi-2-oxoetil)-11-oxo-12-oxa-3,6,9-triazatetradecan-1-oico;
(e) filtrar el filtrado para obtener el precipitado;
(f) lavar el precipitado con etanol frío;
(g) lavar el precipitado con éter de metil tert-butilo para formar una torta de filtro;
(h) mezclar la torta de filtro con etanol para formar una segunda lechada;
(i) calentar la segunda lechada a una temperatura de 70 °C ± 20 %;
(j) filtrar la segunda lechada para formar un segundo filtrado;
(k) enfriar el segundo filtrado a una temperatura por debajo de 20 °C para formar un segundo precipitado;
(l) filtrar el segundo filtrado para obtener el segundo precipitado; y
(m) opcionalmente secar el precipitado, obteniendo de esta manera el polimorfo.
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