ES2892274T3 - Novedosa forma de sal cristalina de 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona para aplicación médica - Google Patents

Abstract

Sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2- il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona: **(Ver fórmula)** su hidrato, solvato o modificación polimórfica de la sal, el hidrato o solvato.

Description

DESCRIPCIÓN

Novedosa forma de sal cristalina de 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona para aplicación médica

Campo técnico

Esta invención es relevante para la química de compuestos orgánicos, la farmacología y la medicina, concretamente para una forma de sal de compuesto así como para su forma de cristal (polimórfico) prometedora para el tratamiento de enfermedades del aparato locomotor relacionadas con el trastorno del metabolismo óseo y/o cartilaginoso, concretamente osteoporosis, osteoartritis y osteocondrosis.

Antecedentes de la invención

El problema de una tasa de incidencia creciente de enfermedades del aparato locomotor tales como la osteoporosis, la osteoartritis y la osteocondrosis está volviéndose cada vez más relevante. Esto se refleja en numerosas publicaciones dedicadas a este tema. A pesar de los esfuerzos realizados por los expertos en diferentes áreas, este problema está lejos de resolverse.

La osteoporosis es la enfermedad ósea humana más habitual. Esta una enfermedad sistémica crónica caracterizada por la reducción de la masa ósea y el deterioro progresivo de la microarquitectura del tejido óseo, lo que puede conducir a una resistencia ósea disminuida y un riesgo aumentado de fractura espontánea. En la actualidad, la osteoporosis se clasifica en dos tipos básicos que son el primario y el secundario. Los fármacos usados para el tratamiento de la osteoporosis son inhibidores de la resorción ósea (estrógenos, moduladores selectivos del receptor de estrógenos, reguladores selectivos de la actividad estrogénica tisular, calcitoninas, bisfosfonatos y otros fármacos (odanacatib, denosumab, etc.)); estimuladores de la osteogénesis (fluoruros, hormona somatotrópica, esteroides anabólicos, andrógenos); fármacos multifuncionales (ranelato de estroncio, metabolitos activos de ergocalciferol, compuesto de oseína-hidroxiapatita).

El problema del tratamiento de la osteoporosis sigue siendo un tema de actualidad a pesar de la amplia gama de fármacos aprobados. Las reacciones adversas graves inducidas por la administración prolongada de fármacos y el escaso cumplimiento del tratamiento prolongado son los principales inconvenientes del tratamiento existente. La osteoartritis (OA) se considera una lesión orgánica, es decir, una artropatía completa cuando un proceso patológico implica todos los componentes articulares: el cartílago, la placa ósea subcondral, la membrana sinovial, los ligamentos, la cápsula y los músculos.

El tratamiento de la osteoartritis todavía busca resolver los síntomas de la enfermedad, es decir, alivio del dolor, mejorar la funcionalidad de las articulaciones y detener la progresión de la patología. Se logra un efecto sintomático mediante una combinación de métodos no farmacológicos y farmacológicos establecidos en numerosas directrices. En la mayoría de los casos, los métodos de tratamiento existentes no logran la neogénesis de tejido articular, la detención de la progresión de la patología o al menos una desaceleración a largo plazo y constante en la progresión de la enfermedad.

Por tanto, es necesario desarrollar nuevos fármacos eficaces junto con otros métodos de tratamiento para las enfermedades del aparato locomotor relacionadas con el trastorno del metabolismo óseo y/o cartilaginoso, tales como la osteoporosis, la osteoartritis y la osteocondrosis. La modulación de las rutas de señalización intracelular se considera una de las tendencias más interesantes.

Las proteína cinasas son una familia de proteínas crítica para la regulación de procesos celulares clave; trastornos en la actividad de estas proteínas pueden dar como resultado diversas enfermedades. Un enfoque prometedor para el tratamiento de enfermedades asociadas con una actividad anómala de proteína cinasas es el uso de compuestos de bajo peso molecular para inhibir la actividad de las mismas. Ejemplos de tales inhibidores aprobados para la práctica clínica son: imatinib, nilotinib, dasatinib, sunitinib, sorafenib, lapatinib, gefitinib, erlotinib, crizotinib. En la actualidad, muchos de los candidatos a fármaco que son inhibidores de cinasa se encuentran en la etapa de ensayo clínico o en la etapa preclínica.

La cinasa c-Src (protooncogén tirosina-proteína cinasa) es una tirosina cinasa no receptora implicada en los procesos de embriogénesis y crecimiento celular. Se demostró que la inhibición de la cinasa c-Src bloqueaba la formación de anillos de actina y prevenía la destrucción ósea mediada por osteoclastos en diversos modelos in vitro. Además, la cinasa c-Src está implicada en la ruta de señalización que conduce a cambios hipertróficos en los condrocitos asociados con el metabolismo cartilaginoso aberrante, que es característico para enfermedades relacionadas con procesos de degeneración distrófica en este tejido.

Se ha demostrado previamente que saracatinib es un nuevo inhibidor competitivo de la cinasa Src, que inhibe la resorción de tejido óseo in vitro. En el transcurso de ensayos clínicos de fase I, se estableció que saracatinib inhibe la resorción de tejido óseo mediada por osteoclastos en hombres sanos sin ningún acontecimiento adverso (R. A. Hannon, G. Clack, M. Rimmer et al. Effects of the Src kinase inhibitor saracatinib (AZD0530) on bone turnover in healthy men: a randomized, double-blind, placebo-controlled, multiple ascending dose phase I trial.// J Bone Miner Res. 2010. vol. 25, n.° 3, págs. 463-71). Sin embargo, ensayos clínicos adicionales mostraron que la alta toxicidad de saracatinib durante la exposición diaria de una dosis terapéuticamente eficaz imposibilita el uso de este fármaco en la práctica clínica para el tratamiento de enfermedades del aparato locomotor.

Por tanto, la inhibición de cinasa c-Src es una estrategia altamente prometedora para el tratamiento de la osteoporosis, la osteoartritis y otras enfermedades del aparato locomotor, cuya patogénesis está relacionada con el metabolismo óseo y cartilaginoso aberrante.

Sin embargo, los fármacos basados en inhibidores de cinasa Src no están disponibles actualmente en la práctica clínica del tratamiento de enfermedades del aparato locomotor. Por tanto, surge la tarea de investigar y desarrollar nuevos fármacos eficaces, es decir, inhibidores de cinasa c-Src, para el tratamiento de la osteoporosis, la osteoartritis y otras enfermedades del aparato locomotor.

Divulgación de la invención

Un objeto de esta invención es el desarrollo de un nuevo fármaco con farmacocinética aceptable para el tratamiento eficaz de enfermedades del aparato locomotor, particularmente para su uso en el tratamiento de osteoporosis, osteoartritis u osteocondrosis.

Un resultado técnico de esta invención es el desarrollo y la preparación de un inhibidor de cinasa eficaz, particularmente un inhibidor de cinasa c-Src, con alta actividad inhibidora y parámetros farmacocinéticos, particularmente alta concentración diaria máxima y promedio así como alto valor de AUC» (área bajo la curva de concentración-tiempo) en sangre animal y humana, que permitiría el uso de este inhibidor para el tratamiento de enfermedades relacionadas con actividad cinasa aberrante que dan como resultado un trastorno del metabolismo óseo y cartilaginoso, es decir, para su uso en el tratamiento de enfermedades del aparato locomotor, concretamente osteoartritis, osteoporosis u osteocondrosis.

Un resultado técnico adicional es el desarrollo y la preparación de un inhibidor de cinasa, particularmente un inhibidor de cinasa c-Src, caracterizado por un procedimiento de producción y purificación fácilmente escalable así como una alta pureza del producto obtenido con un número mínimo de etapas de purificación del compuesto producido.

El resultado técnico especificado se logra produciendo una sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona

o un hidrato, solvato así como modificaciones polimórficas de la sal que pueden inhibir la actividad aberrante de cinasas de la familia Src, particularmente cinasa c-Src y cinasa Syk.

En realizaciones particulares de la invención, la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona es un hidrato así como modificaciones polimórficas del mismo.

Realizaciones particulares de la invención implican un monohidrato de ácido 4-metilbencenosulfónico y base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona así como modificaciones polimórficas del mismo.

Una de las realizaciones más preferibles de la invención es una modificación polimórfica del monohidrato de ácido 4-metilbencenosulfónico y base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona, que es una fase de cristal con los siguientes parámetros de una celda unitaria, determinados mediante un método de difracción de rayos X de polvo (XRD) a 25±5°C usando radiación CuKal con una longitud de onda de 1,5406 Á, iguales a a = 10,98±0,05 Á, b = 28,48±0,05 Á, c = 10,60±0,05 Á, P = 113,7±0, 1 ° y con un volumen de V = 3.037,5±0,5 Á3. Grupo de espacio P2i/c. Posiciones de los picos intrínsecos en un patrón de difracción de Debye de esta modificación polimórfica (20): 6,2; 8,8; 9,6; 10,7; 11,0; 11,6; 12,4; 15,3; 16,2; 16,5; 17,0; 17,4; 17,6; 17,9; 18,3; 18,6; 19,3; 19,3; 19,6; 20,6; 20,9; 23,5; 25,2; 26,2; 26,5; 27,2; 27,6; 30,2.

Otra realización preferible de la invención es una modificación polimórfica del monohidrato de ácido 4-metilbencenosulfónico y base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona, que es una fase de cristal con los siguientes parámetros de una celda unitaria, determinados mediante XRD a 25±5°C usando radiación CuKal con una longitud de onda de 1,5406 A, iguales a a = 11,09±0,05 A, b = 14,38±0,05 A, c = 10,53±0,05 A, a = 90,06°, p = 114,6±0,1°, y = 91,1°, y con un volumen de V = 1.525,9±0,5 A3. Grupo de espacio P1. Posiciones de los picos intrínsecos en un patrón de difracción de Debye de esta modificación polimórfica (29): 6,1; 8,8; 10,6; 11,0; 11,5; 12,3; 15,0; 15,2; 15,5; 15,8; 16,1; 16,3; 17,3; 17,6; 17,9; 18,5; 19,5; 20,5; 20,7; 20,8; 24,6; 24,8; 25,1; 26,1; 26,5; 26,9; 30,1; 43,0.

Esta invención también cubre el uso de la sal o su hidrato, solvato y modificaciones polimórficas según la invención como inhibidor de una actividad cinasa aberrante. Además, en algunas realizaciones de la invención, la cinasa es una proteína cinasa no receptora, en particular, la cinasa se selecciona de cinasa Syk o cinasa de la familia Src. La cinasa de la familia Src es cinasa c-Src, Yes, Fyn, Fgr, Yrk, Lyn, Blk, Hck o Lck.

El resultado técnico especificado también se logra usando la sal o su hidrato, solvato así como modificaciones polimórficas según la invención para producir una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de trastornos relacionados con la actividad cinasa aberrante. Además, en algunas realizaciones de la invención, la cinasa es una proteína cinasa no receptora, en particular, la cinasa se selecciona de cinasa Syk o cinasa de la familia Src. La cinasa de la familia Src es cinasa c-Src, Yes, Fyn, Fgr, Yrk, Lyn, Blk, Hck o Lck.

Además, la invención implica composiciones farmacéuticas para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un trastorno relacionado con actividad cinasa aberrante, en las que el trastorno relacionado con actividad cinasa aberrante se selecciona de osteoartritis, osteoporosis u osteocondrosis, que se caracterizan por un contenido de una cantidad eficaz de la sal según la invención y, al menos, una sustancia auxiliar farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones de la invención, la sustancia auxiliar es un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones se diseñan para modular la actividad de cinasas que son proteína cinasas no receptoras, en particular, la cinasa se selecciona de cinasa Syk o cinasa de la familia Src. La cinasa de la familia Src es cinasa c-Src, Yes, Fyn, Fgr, Yrk, Lyn, Blk, Hck o Lck. En realizaciones particulares de la invención, la composición farmacéutica es para su administración a un ser humano o un animal. En algunas realizaciones de la invención, el animal es un gato, perro o caballo.

También se proporciona el logro del resultado técnico especificado mediante un método de cristalización de los compuestos según la invención, que incluye las siguientes etapas:

a. introducción de ácido 4-metilbencenosulfónico o su hidrato en un disolvente orgánico en una suspensión o una disolución de 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona en un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes; el ácido 4-metilbencenosulfónico o su hidrato puede introducirse tanto a temperatura ambiente como con calentamiento o enfriamiento de cada componente; los reactivos también pueden mezclarse en el orden inverso;

b. cristalización de la sal obtenida;

c. separación de los cristales de sal a partir del disolvente.

En algunas realizaciones de la invención, el disolvente de la etapa (a) usado como medio de suspensión para 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona es acetona.

En realizaciones particulares de la invención, el disolvente de la etapa (a) usado para la disolución de ácido 4-metilbencenosulfónico o su hidrato es etanol.

En algunas realizaciones de la invención, la sal se recristaliza adicionalmente después de la etapa (c).

En algunas otras realizaciones particulares de la invención, se usa adicionalmente una etapa de iniciación de la cristalización cuando la sal se obtiene a partir de disoluciones. La iniciación de la cristalización puede lograrse introduciendo cristales de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona en la disolución o mediante cualquier otro método conocido.

En realizaciones particulares de la invención, la etapa (a) está precedida por una etapa adicional de purificación de la base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona, transformándola en una sal de ácido sulfúrico, clorhídrico, bencenosulfónico, 4-metilbencenosulfónico, 2-metilbencenosulfónico, metanosulfónico, cítrico, fosfórico, trifluoroacético, 4-nitrobencenosulfónico, tetrafluorobórico, hexafluorofosfórico u otro ácido, y la posterior obtención de la base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5 trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona a partir de esta sal y la síntesis repetida de la sal con ácido 4-metilbencenosulfónico a partir de esta base.

Se conoce una base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona libre y se describe en la patente n.° RU2509770.

Divulgación detallada de la invención

Como resultado de los estudios llevados a cabo, se halló que 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona (denominado a continuación en el presente documento compuesto 1) tiene una actividad de modulación hacia la familia de cinasas Src, particularmente hacia la cinasa c-Src humana a la concentración inhibidora semimáxima dentro de un intervalo nanomolar. Al mismo tiempo, se estableció que la farmacocinética de este compuesto no es aceptable para usar el compuesto en la práctica clínica como fárma

a un metabolismo óseo y cartilaginoso aberrante. Específicamente, los estudios de la farmacocinética del compuesto 1 en la administración oral en ratas a una dosis de 30 mg/kg mostraron una concentración máxima en el plasma sanguíneo animal 100 veces inferior a la concentración eficaz mínima establecida en estudios de eficacia (véanse los detalles en la sección de ejemplos).

Este problema, tal como se describe en esta invención, se resuelve mediante el desarrollo y la preparación de una nueva forma de sal que es una sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y el compuesto 1 como base.

Se halló que la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y el compuesto 1 es de lo más eficaz en la inhibición de la actividad de cinasas c-Src (CI⁵⁰ = 14 nmol/l). Además, se halló un efecto inhibidor aparente de esta forma de sal del compuesto 1 sobre el catabolismo del tejido óseo. El efecto especificado se refiere a la inhibición de la resorción de tejido óseo mediada por osteoclastos, que se demostró mediante experimentos in vitro en un sistema modelo usando osteoclastos humanos maduros. Los compuestos según la invención son prometedores para tratar enfermedades del aparato locomotor relacionadas con metabolismo óseo aberrante, particularmente para tratar enfermedades resistentes a otros métodos de tratamiento. Tales enfermedades incluyen osteoporosis, particularmente osteoporosis secundaria y especialmente osteoporosis secundaria en artritis reumatoide. Además, la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y el compuesto 1, así como su hidrato (monohidrato en particular) y/o modificaciones polimórficas, pueden usarse para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la disminución de la masa y densidad mineral ósea, el deterioro de la calidad ósea debido al deterioro de la microarquitectura ósea, la acumulación de microdaño, los trastornos de mineralización ósea y la tasa de remodelación ósea.

En el transcurso del estudio, se estableció inesperadamente que la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y el compuesto 1, así como su solvato, hidrato (monohidrato en particular) y modificaciones polimórficas, tienen una farmacocinética adecuada y pueden usarse para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por metabolismo óseo y cartilaginoso aberrante. Se halló inesperadamente que la administración única de la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y el compuesto 1 requiere una dosis significativamente inferior para lograr el efecto terapéutico requerido en comparación con otras formas de sal del compuesto 1.

El experimento in vivo también mostró que el hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 tiene una farmacocinética lineal dentro de un amplio intervalo de dosis en la administración intragástrica del fármaco en ratas Wistar. La concentración promedio diaria del compuesto 1 en órganos diana (tejidos óseos y cartilaginosos) supera la concentración promedio diaria del compuesto 1 en plasma sanguíneo animal en más de tres veces.

Además, un estudio de actividad biológica de la forma de sal del compuesto 1 según la invención permitió establecer un efecto positivo relacionado con la dosis aparente sobre los cambios hipertróficos inducidos por IL-1p en condrocitos asociados con metabolismo cartilaginoso aberrante, que es característico para la osteoartritis y se manifiesta como un aumento significativo de la expresión de agrecanos. Este efecto conduce a la aceleración del anabolismo cartilaginoso relacionada con un aumento de más de cuatro veces de la producción de agrecanos, a pesar de que el agrecano es uno de los componentes cartilaginosos.

Por tanto, el uso de un inhibidor de cinasas de la familia Src, particularmente un inhibidor de cinasa c-Src, según la invención como fármaco para una terapia de un único fármaco o en combinación con otros métodos para el tratamiento de enfermedades del aparato locomotor permite lograr una remisión significativa y prolongada. El inhibidor de cinasa c-Src según la invención puede usarse como agente de tratamiento complementario que sirve para prevenir posibles recidivas en pacientes que necesitan tal tratamiento.

Descripción de las figuras

Figura 1. Cristalización de sales del compuesto 1, 100 mg.

Figura 2. Cristalización de sales del compuesto 1, 2.000 mg.

Figura 3. Resultados del análisis elemental de formas de sal del compuesto 1. Los valores calculados para los monohidratos de las sales correspondientes se proporcionan entre paréntesis.

Figura 4. Patrones de difracción de rayos X de ácido clorhídrico y polvo de sal del compuesto 1: a) muestra S-3-10-B-HCl; b) muestra S-3-11-C2-HCI.

Figura 5. Patrones de difracción de rayos X de ácido bromhídrico y polvo de sal del compuesto 1 (muestra S-3-8-B-HBr).

Figura 6. Patrones de difracción de rayos X de ácido sulfúrico y polvo de sal del compuesto 1 (muestra S-3-16-D-SA).

Figura 7. Patrones de difracción de rayos X de ácido canfórico y polvo de sal del compuesto 1 (muestra S-3-9-B-CSA).

Figura 8. Patrones de difracción de rayos X de ácido metanosulfónico y polvo de sal del compuesto 1 (muestra S-3-17-D-MSA).

Figura 9. Patrones de difracción de rayos X de monohidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1:

a) muestra S-3-12-A1-TSA, modificación polimórfica A;

b) muestra SYK 91/1, modificación polimórfica B.

Figura 10. Curvas de TGA (análisis termogravimétrico) y DSC (calorimetría diferencial de barrido) de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 (muestra S-3-12-A1-TSA, modificación polimórfica A). Figura 11. Vista general de una parte independiente de una celda unitaria de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1:

a) muestra S-3-12-A1-TSA, modificación polimórfica A;

b) muestra SYK 91/1, modificación polimórfica B.

Figura 12. Influencia de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 (modificación polimórfica A) sobre la actividad cinasa de c-Src humana.

Figura 13. Espectros de 1H ^^C-RMN de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 (modificación polimórfica A):

a) espectro de 1H-RMN (Bruker DRX500,13400, 500,13 MHz, DMSO-d6);

b) espectro de 13C-RMN (Bruker DRX500, 125,76 MHz, DMSO-d6).

Figura 14. Espectros de 1H ^C -R M N de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 (modificación polimórfica B):

a) espectro de 1H-RMN (Bruker DRX500, 13, 500,13 MHz, DMSO-d6);

b) espectro de 13C-RMN (Bruker DRX500, 13, 125,76 MHz, DMSO-d6).

Figura 15. Curvas de HPLC de muestra de base libre del compuesto 1.

Figura 16. Curvas de HPLC de muestra de ácido metanosulfónico y sal del compuesto 1 muestra.

Figura 17. Curvas de HPLC de muestras de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1: a) modificación polimórfica A;

b) modificación polimórfica B.

Figura 18. Influencia de saracatinib, bosutinib y compuesto 1 sobre la resorción relativa de una matriz mineralizada.

Figura 19. Concentraciones promedio del compuesto 1 en plasma sanguíneo de ratas Wistar después de una única administración oral de una base libre a una dosis de 30 mg/kg. Los valores promedio para cada punto de tiempo se determinan basándose en datos individuales recibidos en tres animales.

Figura 20. Concentraciones promedio del compuesto 1 en plasma sanguíneo de ratas Wistar después de una única administración oral de mesilato de compuesto 1 a una dosis de 30 mg/kg (equivalente de base libre). Los valores promedio para cada punto de tiempo se determinan basándose en datos individuales recibidos en tres animales.

Figura 21. Concentraciones promedio del compuesto 1 en plasma sanguíneo de ratas Wistar después de una única administración oral de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 (modificación polimórfica A) a una dosis de 21 mg/kg (equivalente de base libre). Los valores promedio para cada punto de tiempo se determinan basándose en datos individuales recibidos en seis animales.

Términos y definiciones

Para los fines de este documento, el término compuesto 1 se refiere a 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona, que también se presenta como la fórmula estructural:

El término C, cuando se usa con referencia a la temperatura, significa una escala centígrada o una escala de temperatura Celsius.

El término CI⁵⁰ significa la concentración de un compuesto sometido a prueba a la que se logra la inhibición semimáxima de la actividad cinasa.

El término suspensión se refiere a una sustancia sólida suspendida en un medio líquido, habitualmente en agua o un disolvente orgánico.

El término modulación se refiere, en este documento, a la modificación de la actividad catalítica de cinasas. Particularmente, la modulación se refiere a la activación o inhibición de la actividad catalítica de cinasas.

El término modificación polimórfica se refiere a una fase de sustancia sólida que puede tener varias formas diferentes debido a diversas posiciones y/o conformaciones de moléculas en una estructura de cristal. Las modificaciones polimórficas tienen habitualmente diferentes propiedades químicas y físicas. Además, el término modificación polimórfica también se refiere a solvatos, a hidratos (es decir, formas cristalinas que contienen un disolvente o agua), así como a diversas formas cristalina no solvatadas y no hidratadas de un compuesto.

El término solvato se usa para describir un complejo molecular que contiene un compuesto según la invención y una o más moléculas de un disolvente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, etanol. El término hidrato se usa cuando se usa agua como disolvente.

El término patrón de difracción de rayos X de polvo o patrón de PXRD se refiere a un patrón de difracción experimentalmente observado o a datos obtenidos a partir del mismo. En general, los patrones de difracción de rayos X de polvo se caracterizan por una posición (en el eje x) y una intensidad (en el eje y) de un pico. El término intensidad de pico se refiere a una intensidad relativa de una señal en un patrón de difracción de rayos X particular. Factores que influyen en la intensidad de pico relativa son el grosor de la muestra y la orientación preferible (es decir, la distribución de partículas cristalinas no es accidental). El término posición de pico, para los propósitos de esta solicitud, se refiere a la posición de una posición de reflexión de rayos X medida y observada en experimentos de difracción de polvo. Las posiciones de pico están directamente relacionadas con los tamaños de una celda unitaria. Los picos identificados por su posición correspondiente se obtienen basándose en el patrón de difracción para las diferentes formas polimórficas de sales de 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona.

El término valor de 2-theta o 20 se refiere a una posición de pico en grados basándose en datos experimentales de la difracción de rayos X. En general, este es una unidad de medición en el eje x de los patrones difracción. 0 es un ángulo en el que se cumplen las condiciones de difracción para una longitud de onda particular. Un ángulo entre la dirección de haz difractado y el haz inicial constituye 29. Debe entenderse que, en esta solicitud, la referencia a valores específicos de 29 para una forma polimórfica específica implica el valor de 29 en grados medido usando las condiciones experimentales de la difracción de rayos X dadas a conocer en esta solicitud. El término actividad aberrante de cinasa significa, en este documento, actividad cinasa que es significativamente diferente con respecto a un nivel básico de la actividad cinasa en células cuando no hay presente una patología. La actividad aberrante puede surgir a partir de cambios del nivel de expresión de cinasas, de una anomalía de los procesos que da como resultado la activación de cinasas, de la desregulación de las rutas de degradación así como de otros factores.

El término sustancia auxiliar significa cualquier sustancia farmacéuticamente aceptable de naturaleza no orgánica u orgánica incluida en una composición de un fármaco o usada en el procedimiento de producción del fármaco para conferir las propiedades físicas y químicas requeridas al mismo.

El término AUC (área bajo la curva) significa un parámetro farmacocinético que caracteriza la concentración total del fármaco en plasma sanguíneo dentro del periodo de observación completo. Matemáticamente, se determina como una integral de 0 a M de la función (curva farmacocinética) de concentración de fármaco en plasma sanguíneo frente al tiempo, y es igual al área de figura formada por la curva farmacocinética y los ejes de coordenadas.

La familia de cinasas Src es una familia de tirosina-proteína cinasas no receptoras de mamíferos que tienen una estructura similar a la de una cinasa c-Src. En vertebrados, se conocen nueve cinasas de la familia Src: Src, Yes, Fgr, Fvn, Lyn, Hck, Lck, Blk, Frk. Las cinasas de esta familia están implicadas en la regulación del crecimiento celular, la señalización intracelular y particularmente en las rutas de señalización de receptores de células T y B, interacciones adhesivas entre células, etc. La cinasas de la familia Src tiene un papel activo en procesos relacionados con el metabolismo óseo y cartilaginoso así como en el progreso de procesos inflamatorios autoinmunitarios. La cinasa c-Src desempeña un papel clave en la formación de un anillo de actina, que es un citoesqueleto de osteoclasto único requerido para la resorción ósea.

La cinasa Syk (tirosina cinasa esplénica) es una tirosina cinasa citoplásmica no receptora implicada en la transferencia de señales por receptores de antígenos y Fc, BCR y otros receptores. La expresión de cinasa Syk más intensa tiene lugar en células hematopoyéticas (tales como macrófagos, mastocitos, glóbulos blancos, plaquetas y glóbulos rojos); la expresión es menos intensa en células epiteliales, fibroblastos, células nerviosas, hepatocitos, etc. (Yanagi, S., et al., Biochem Biophys Res Commun, 2001, 288, 495-8). La cinasa Syk participa en el desarrollo de inmunidad adquirida y desempeña un papel importante en una función de células de tipo complementario, incluyendo plaquetas, fagocitos, fibroblastos y osteoclastos. La cinasa Syk desempeña un papel en la diferenciación y función de los osteoclastos. Además, la cinasa Syk desempeña un papel particular en el proceso de osteólisis.

Los términos tratamiento y terapia cubren la gestión de estados patológicos en mamíferos, preferiblemente en un ser humano, es incluyen: a) mitigación; b) bloqueo (detención) de la progresión de la enfermedad; c) alivio de la gravedad de la enfermedad, es decir, inducción de la regresión de la enfermedad; d) reversión de una enfermedad o un estado al que se aplica el término, o uno o más síntomas de esta enfermedad o este estado. Los términos profilaxis y prevención cubren la eliminación de factores de riesgo así como el tratamiento preventivo de etapas subclínicas de una enfermedad en mamíferos, preferiblemente en un ser humano, con el objetivo de reducir la probabilidad de desarrollo de la enfermedad en etapa clínica. Los pacientes para el tratamiento de prevención se seleccionan en comparación con la población general basándose en factores que se sabe que conducen a un aumento del riesgo de aparición de la enfermedad en etapa clínica. El tratamiento preventivo incluye a) profilaxis primaria y b) profilaxis secundaria. La profilaxis primaria se define como el tratamiento preventivo de pacientes cuya enfermedad no ha progresado aún a la etapa clínica. La profilaxis secundaria significa la prevención de la recidiva o un estado clínico similar de la enfermedad.

Los compuestos de esta invención son prometedores para el tratamiento de enfermedades del aparato locomotor relacionadas con el trastorno del metabolismo óseo y/o cartilaginoso y procesos de degeneración distrófica en estos tejidos, concretamente osteoporosis, osteoartritis (artrosis deformante) y osteocondrosis de cualquier etiología y de cualquier naturaleza sistémica o local, incluyendo aquellos condicionados por los cambios patológicos primarios en estos tejidos o relacionados con diversas enfermedades o la administración a largo plazo de algunos fármacos. En algunas realizaciones particulares, los compuestos según la invención pueden usarse para el tratamiento de osteoporosis posmenopáusica, osteoporosis senil, osteoporosis inducida por fármacos, osteoporosis en pacientes con cáncer, osteoporosis secundaria en artritis reumatoide, gonartrosis, coxartrosis, osteocondrosis de las zonas lumbar, torácica y de la columna cervical, etc.

Forma de sal

La búsqueda de una sal adecuada para el fármaco apropiado es crítica para una fase preclínica de estudios farmacológicos. La modificación de una forma de sal de principio activo se usa habitualmente para la modificación de sus propiedades químicas y biológicas sin conducir a la modificación de su estructura. La selección de una forma de sal particular puede tener un efecto significativo sobre las propiedades físicas y químicas del fármaco (por ejemplo, tasa de disolución, solubilidad, estabilidad e higroscopicidad). Reemplazar una forma de sal en el fármaco por otra puede cambiar la eficacia terapéutica, la seguridad y/o la calidad, que son lo más importante para una composición óptima de forma de dosificación para la producción a gran escala. Sin embargo, no existe ningún método fiable para predecir con exactitud un efecto de los cambios en la forma de sal de principio activo sobre la actividad biológica del fármaco. Además, incluso después de la preparación de muchas sales del mismo agente básico, no existen técnicas de cribado eficaces para facilitar la selección de la sal con la probabilidad más alta de mostrar los perfiles farmacocinéticos, de solubilidad y de formulación deseados. En resumen, no existe ningún modo fiable para predecir la influencia de tipos de sales particulares sobre el comportamiento de un compuesto básico en las formas de dosificación (Berge et al., Pharmaceutical Salts // Journal Pharm. Sci., 1977, vol. 66, n.° 1; Verbeeck et al. Generic substitution: The use of medicinal products containing different salts and implications for safety and efficacy // EP Journal Pharm. Sci, 28, 2006, 1­ 6).

Habitualmente, se prefieren las formas de sal sólidas para la administración oral, puesto que es probable que muestren las propiedades físicas requeridas; y en caso de un fármaco básico, las sales de adición de ácido suelen ser una forma de sal preferible. Tal como ya se mencionó anteriormente, las diferentes formas de sal varían ampliamente en cuanto su capacidad para conferir las propiedades requeridas (tales como estabilidad en almacenamiento, facilidad de los procedimientos de producción y purificación, parámetros farmacocinéticos), y estas propiedades no pueden predecirse con suficiente exactitud. Por ejemplo, algunas sales son sólidos a temperatura ambiental, mientras que otras sales son líquidos, aceites espesos o resinas. Además, algunas formas de sal son estables en condiciones de tensión, calor y exposición a la luz, mientras que otras se descomponen fácilmente incluso en condiciones suaves. Por tanto, el desarrollo de una forma apropiada de sal de agente básico con adición de ácido para su uso en una composición farmacéutica es un procedimiento crítico y no siempre predecible.

Los parámetros farmacocinéticos son las propiedades más importantes que determinan la idoneidad de una forma de sal sólida (o modificación polimórfica particular) para su uso como fármaco. Las concentraciones promedio diarias y máximas de un fármaco en sangre animal y humana pueden depender significativamente del contenido de una forma de sal y de la modificación polimórfica. La posibilidad de producción a gran escala de la forma de sal seleccionada de un principio activo y la pureza (o complejidad de purificación) de un producto producido son características críticas que dependen esencialmente de la forma de sal seleccionada. Además, puesto que las composiciones farmacéuticas que contienen principios activos deben tener un periodo de almacenamiento adecuado, las formas de sal adecuadas no deben mostrar cambios significativos en las propiedades físicas y químicas (composición química, contenido de agua, densidad, higroscopicidad, solubilidad, etc.) cuando se almacenan durante un periodo de tiempo prolongado.

Las sustancias sólidas que incluyen compuestos farmacéuticamente activos suelen tener más de una forma cristalina; esta propiedad se conoce como polimorfismo. A menudo, el polimorfismo tiene lugar cuando un compuesto se cristaliza en múltiples fases sólidas diferentes que varían en cuanto a empaquetamiento de cristales. Las modificaciones polimórficas (polimorfos) tienen habitualmente propiedades físicas diferentes, incluyendo solubilidad, estabilidad física y química. Diversas formas de sal sólidas del mismo principio activo, además, diversos polimorfos de la misma forma de sal sólida, pueden diferir en la tasa de liberación de fármaco, la estabilidad de la fase sólida de la forma de sal y la idoneidad para la producción farmacéutica.

Por tanto, para producir composiciones medicinales comercialmente factibles y farmacéuticamente aceptables, es importante ofrecer (cuando sea posible) un fármaco en formas (o forma) cristalina(s) esencialmente estable(s).

Método de uso terapéutico de los compuestos

El objeto de esta invención también incluye la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto según la invención a un sujeto que necesita el tratamiento correspondiente. La cantidad terapéuticamente eficaz significa tal cantidad del compuesto introducida o administrada a un paciente a la que es más probable la respuesta deseada al tratamiento (profilaxis) en el paciente. Una cantidad requerida exacta puede variar para diversos pacientes dependiendo de la edad, el peso corporal y el estado general, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración del fármaco, la combinación con otros fármacos, etc.

El compuesto según la invención o una composición farmacéutica que contiene el compuesto puede introducirse en el cuerpo del paciente en cualquier cantidad (preferiblemente una dosis diaria del principio activo que constituye hasta 1,5 g por paciente al día; lo más preferible, una dosis constituye de 200 a 500 mg al día) y mediante cualquier vía de administración (preferiblemente por vía oral), que es eficaz en el tratamiento o la profilaxis.

Cuando el fármaco se mezcla con un portador apropiado y farmacéuticamente aceptado particular en una proporción deseada, las composiciones que son la esencia de la invención pueden introducirse en el cuerpo de un ser humano o animales por vía oral, por vía parenteral, por vía local, etc.

El fármaco puede administrarse tanto como una única dosis como varias veces al día, a la semana (o cualquier otro intervalo de tiempo), o desde un tiempo hasta otro. Además, el compuesto puede introducirse en el cuerpo del paciente diariamente durante un periodo particular (por ejemplo, de 2 a 10 días) seguido de un periodo sin administración (por ejemplo, de 1 a 30 días).

En caso de que el compuesto según la invención se use como parte de un régimen de terapia combinada, la dosis de cada componente de la terapia combinada se administra durante el periodo de tratamiento requerido. Los compuestos que comprenden la terapia combinada pueden introducirse en el cuerpo del paciente ambos al mismo tiempo como una forma de dosificación que contiene todos los componentes y como formas de dosificación individuales de los componentes.

Composiciones farmacéuticas

La invención también cubre composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos según la invención (o una forma de profármaco u otro derivado farmacéuticamente aceptable) y uno o más portadores, adyuvantes, disolventes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden introducirse en el cuerpo del paciente junto con el compuesto que es la esencia de esta invención, y que no alteran la actividad farmacológica de este compuesto y no tienen efectos tóxicos cuando se administran a dosificaciones suficientes para suministrar la cantidad terapéutica del compuesto.

Las composiciones farmacéuticas declaradas en esta invención contienen una combinación de esta invención con portadores farmacéuticamente aceptables, que pueden incluir cualquier disolvente, diluyente, dispersión o suspensión, tensioactivo, agente isotónico, gelificante, emulsionante, agente conservante, agente aglutinante, lubricante, etc., adecuado para una forma de dosificación particular. Los materiales adecuados para ser los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitarse a, monosacáridos y oligosacáridos así como derivados de los mismos; gelatina; talco; excipientes tales como aceite de cacao y cera para supositorios; aceites tales como aceites de cacahuete, semilla de algodón, safrol, sésamo, oliva, maíz y soja; glicoles tales como propilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes tales como hidróxido de sodio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; disolución isotónica; disolución de Ringer; alcohol etílico y disoluciones de tampón fosfato. The composición también puede contener otros lubricantes compatibles no tóxicos tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio así como agentes colorantes, líquidos de partición, materiales de formación de película, edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes conservantes y antioxidantes.

Esta invención también cubre formas de dosificación, es decir, una clase de composiciones farmacéuticas cuyo contenido se optimiza para una vía particular de introducción en el cuerpo a una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, por vía oral, por vía local, por vía pulmonar, por ejemplo, mediante pulverización de inhalación, o por vía intravenosa, por vía intranasal, por vía subcutánea, por vía intramuscular así como mediante infusión a las dosis recomendadas.

Las formas de dosificación de esta invención pueden tener un contenido obtenido usando liposomas, microencapsulación, preparación de nanoformas y otros métodos conocidos en el campo de la farmacia.

Cuando una composición tiene la forma de un comprimido, por ejemplo, el principio activo se mezcla con uno o varios excipientes farmacéuticos tales como gelatina, almidón, lactosa, estearato de magnesio, talco, sílice, goma arábiga, manitol, celulosa microcristalina, hipromelosa o compuestos similares.

Los comprimidos pueden recubrirse con sacarosa, derivado de celulosa u otras sustancias adecuadas para recubrir. Los comprimidos pueden obtenerse mediante diversos métodos, tales como prensado directo, granulación en seco o en húmedo o fusión en caliente.

Una composición farmacéutica en forma de cápsula de gelatina puede obtenerse mezclando el principio activo con una disolución y llenando la cápsula blanda o dura con una mezcla obtenida.

Para administrar un fármaco por vía parenteral, se usan diversas suspensiones en agua, soluciones salinas isotónicas o disoluciones estériles para inyección que contienen agentes farmacológicamente compatibles, por ejemplo, propilenglicol o butilenglicol.

Ejemplos de composiciones farmacéuticas

Las sustancias descritas en la presente invención pueden usarse para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades humanas o animales en una forma con la composición presentada a continuación (la sustancia significa un principio activo):

Comprimido I mg/comprimido

Sustancia 50

Lactosa Farm. Eur. 223,75

Croscarmelosa de sodio 6,0

Almidón de maíz 15

Polivinilpirrolidona (pasta al 5% p/v) 2,25

Estearato de magnesio 3,0

Comprimido II mg/comprimido

Sustancia 200

Lactosa Farm. Eur. 182,75

Croscarmelosa de sodio 12,0

Almidón de maíz (pasta al 5% p/v) 2,25

Estearato de magnesio 3,0

Cápsula mg/cápsula

Sustancia 10

Lactosa Farm. Eur. 488,5

Sulfato de magnesio 1,5

Composición de inyección I (50 mg/ml)

Sustancia 5,0% p/v

Disolución de hidróxido de sodio 1 M 15,0% p/v

Disolución de ácido clorhídrico 1 M hasta pH 7,6

Polietilenglicol 400 4,5% p/v

Agua para inyección hasta el 100%

Pomada ml

Sustancia 40 mg

Etanol 300 |il

Agua 300 |il

1-dodecilazacicloheptanona 50 |il

Propilenglicol hasta 1 ml

Estas composiciones pueden prepararse según las técnicas farmacéuticas convencionales. Los comprimidos (I)-(II) pueden tener un recubrimiento entérico, por ejemplo, usando acetato-ftalato de celulosa.

Ejemplos

Obtención de los compuestos según la invención

Síntesis de 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b![1,41oxazin-3(4H)-ona (compuesto 1)

Se añaden 193,2 g (1 mol) de 6-amino-2,2-dimetil-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona en porciones a 165 g de disolución (1,1 mol) de 2,4-diclorotriazina y 98,5 g (1,2 mol) de acetato de sodio anhidro en 2.000 ml de ácido acético glacial en el plazo de 30 minutos con agitación y manteniendo la temperatura sin superar los 30°C. Se deja reposar la mezcla de reacción durante la noche, se filtra el precipitado, se enjuaga sobre el filtro con ácido acético (2x500 ml), con agua hasta la reacción neutra y se seca. Se obtienen 220 g de 6-((4-cloro-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2,2-dimetil-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona.

Se añaden 306,7 g (1 mol) de 6-((4-cloro-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2,2-dimetil-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona y 384,7 g (2,1 mol) de 3,4,5-trimetoxianilina a 3 l de etilenglicol desgasificado anhidro mientras se agita intensamente. Después de eso, se calienta la mezcla de reacción hasta 110°C y se agita a esta temperatura durante 4 horas. Después de 4 horas, se eleva la temperatura de la mezcla de reacción hasta 125°C, se continúa la agitación durante 4 horas. Después se enfría la mezcla de reacción hasta 60°C, se filtra el precipitado, se enjuaga con etilenglicol (2x500 ml), seguido de acetona (3x600 ml) y agua (4x1,500 ml), después se seca. El rendimiento es de 365 g de 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona.

Síntesis de monohidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y base 2.2-dimetil-6-((4-((3.4.5-trimetoxifenil)amino)-1.3.5-triazin-2-il)amino)-2H-DÍridoí3.2-blí1.4loxazin-3(4H)-ona (modificación polimórfica A) Se añaden 20 g (~0,105 mol) de disolución de ácido 4-metilbencenosulfónico hidratado en 20 ml de etanol como una porción a una suspensión en ebullición de 45,3 g (0,1 mol) de 2,2-dimetil-6-([4-[(3,4,5-trimetoxifenil)amino]-1,3,5-triazin-2-il]amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona en 1.200 ml de acetona. Se hierve la mezcla durante 30 minutos, después se enfría la mezcla lentamente hasta temperatura ambiental y se deja reposar durante la noche. Se filtra el precipitado, se enjuaga sobre el filtro con acetona (2x50 ml) seguido de dietil éter (2x100 ml), después se seca. El rendimiento del producto es del 90%.

Espectro de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6): 11,13 (s, 1H), 8,57 (s, 1H) 7,52-7,44 (m, 3H) 7,12 (d, 2H, J = 8 Hz) 7.02 (s, 2H), 4,4-3,9 (s a, 4H), 3,8 (s, 6H), 3,7 (s, 3H), 2,3 (s, 3H), 1,5 (s, 6H)

Espectro de masas, m/z: 454,18 ([M+nH]+)

En la figura 13 se proporcionan los espectros de 1H y 13C-RMN de monohidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona (modificación polimórfica A).

Síntesis de monohidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y base 2.2-dimetil-6-((4-((3.4.5-trimetoxifenil)amino)-1.3.5-triazin-2-il)amino)-2H-piridoí3.2-blí1.4loxazin-3(4H)-ona (modificación polimórfica B) Se mantienen 64,4 g (0,1 mol) de monohidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona (modificación polimórfica A) a una temperatura de 110-115°C y presión residual de 6 mbar durante 2 horas, después se enfrían a vacío. El rendimiento del producto es del 100%.

La modificación polimórfica B de monohidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona también puede obtenerse tratando la modificación polimórfica A con etanol u otro disolvente.

Espectro de 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6): 11,13 (s, 1H), 8,57 (s, 1H) 7,52-7,44 (m, 3H) 7,12 (d, 2H, J = 8 Hz) 7.02 (s, 2H), 4,4-3,9 (s a, 4H), 3,8 (s, 6H), 3,7 (s, 3H), 2,3 (s, 3H), 1,5 (s, 6H)

Espectro de masas, m/z: 454,18 ([M+nH]+)

En la figura 14 se proporcionan los espectros de 1H y 13C-RMN espectros de monohidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona (modificación polimórfica B).

Optimización de forma de sal del compuesto 1

Para obtener una forma que tenga propiedades biológicas y físicas óptimas, se sintetizaron diversas formas de sal del compuesto 1. Un objetivo principal de la optimización de la forma de sal fue obtener una forma de sal del compuesto 1 que tuviera las siguientes propiedades: cristalinidad, estabilidad de composición, eficacia terapéutica, seguridad, facilidad de la escalabilidad del procedimiento de producción, uso de un contraión farmacológicamente aceptable (preferiblemente anión) y uso de disolventes orgánicos de baja toxicidad. Se obtuvieron las formas de sal de compuesto 1 con disoluciones orgánicas de alta polaridad y baja toxicidad (clase 3). Se usaron los contraiones basándose en la aceptación farmacológica y alta fuerza ácida (pKa no superior a 3,25). El requisito para la alta fuerza ácida está condicionado por el hecho de que un átomo de nitrógeno protonado de piridina del compuesto 1 es una base débil que tiene un pKa de 4.

En la primera etapa se estudió la solubilidad de la base primaria en los disolventes orgánicos seleccionados. Se seleccionó el volumen máximo de un disolvente para este estudio como 10 ml por 100 mg de la base teniendo en cuenta el aumento de escala del procedimiento posterior. En la tabla 1 se proporcionan los resultados de solubilidad de la base primaria en los disolventes orgánicos seleccionados.

Tabla 1. Solubilidad del compuesto 1 en diversos disolventes

Código Cantidad de base, mg Disolvente Volumen de disolvente, ml Temperatura, °C Solubilidad

En la segunda etapa del estudió se intentó producir sales basadas en 100 mg de base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona. Para esta etapa de desarrollo, se seleccionaron pares de un disolvente y un ácido de tal manera que se garantizara o bien la completa disolución de la muestra en el disolvente y la precipitación después de la adición de la sal o bien la homogeneización del sistema después de la adición del ácido y la precipitación después del enfriamiento del sistema hasta temperatura ambiental. En la figura 1 se proporcionan los resultados del estudio de cristalización de sal del compuesto 1. Se seleccionaron los siguientes pares disolvente-ácido basándose en los estudios llevados a cabo: etanol-HCI, acetona-ácido 4-metilbencenosulfónico, así como n-butanol y dioxano con ácido metanosulfónico, ácido canforsulfónico, ácido 4-metilbencenosulfónico, HCI, HBr y H²SO⁴.

En la tercera etapa, se obtuvieron sales en los sistemas disolvente-ácido seleccionados basados en 2.000 mg de la base. Se evaluó la escalabilidad del procedimiento de filtración. En la figura 2 se proporcionan los resultados de estos estudios. Se sometieron las muestras cuyo procedimiento de filtración se consideró fácilmente escalable a un análisis elemental (con el fin de establecer la estabilidad y estequiometría de la composición) y a un análisis mediante un método de difracción de rayos X de polvo (con el fin de estudiar la cristalinidad de la estructura). En el presente documento se obtuvieron todos los patrones de difracción a 25°C (±5°C) y humedad relativa de aire de =70% usando un sistema de difracción de rayos X de polvo D8 Advance de Bruker en geometría de Bragg-Brentano (tensión del ánodo de 40 kV, corriente de 40 mA), con un filtro de níquel (radiación CuKal, longitud de onda = 1,5406 A) y detector sensible a la posición LynxEye, intervalo de muestreo = 0,02° 29, intervalo de ángulo = de 4 a 65° 29. Se refinaron los patrones de difracción obtenidos usando el paquete de software TOPAS5 de Bruker.

Basándose en la escalabilidad apropiada del procedimiento de producción de forma de sal correspondiente, se seleccionaron pares de disolvente-contraión (ácido) en los que tuvo lugar la precipitación tras la adición del ácido o tras enfriar la disolución y se filtró fácilmente el precipitado obtenido. Se sometieron estos pares a los estudios posteriores. Por tanto, se seleccionaron las siguientes muestras para los siguientes estudios: S-3-1-B-TSA (a continuación en el presente documento, S3-1), S-3-2-B-HBr (S3-2), S-3-4-B-HCl (S3-4), S-3-8-B-HBr (S3-8), S-3-9-B-CSA (S3-9), S-3-10-B-HCl (S3-10), S-3-11-C2-HCI (S3-11), S-3-12-A1-TSA (S3-12), S-3-16-D-SA (S3-16) y S-3-17-D-MSA (S3-17).

Se sometieron las muestras de estos compuestos a un análisis elemental. Como resultado, se estableció que las muestras de sal de compuesto 1 y ácido 4-metilbencenosulfónico que son monohidratos demuestran la mejor reproducibilidad de los resultados con la composición elemental calculada (figura 3).

Estudios adicionales de la cristalinidad de la muestra mediante difracción de rayos X de polvo demostraron que la composición de las muestras estudiadas (S-3-1-B-TSA (a continuación en el presente documento, S3-1), S-3-2-B-HBr (S3-2), S-3-4-B-HCl (S3-4), S-3-8-B-HBr (S3-8), S-3-9-B-CSA (S3-9), S-3-10-B-HCl (S3-10), S-3-11-C2-HCI (S3-11), S-3-12-A1-TSA (S3-12), S-3-16-D-SA (S3-16) y S-3-17-D-MSA (S3-17)) incluían fases de cristal. Diversos ensanchamientos de pico y la imposibilidad de caracterizar los patrones de difracción usando una reflexión de una fase con una celda unitaria fueron indicativos de la presencia de varias fases de cristal en las muestras estudiadas (véanse las figuras 4 a 8). Las muestras no tenían fases de cristal similares: las posiciones e intensidades de pico eran diferentes en las diferentes muestras. El tamaño de las unidades cristalinas en la muestra S-3-17-D-MSA es pequeño, las líneas se ensanchan significativamente, lo que probablemente era el resultado de la destrucción de la estructura de cristal de la sustancia (véase la figura 8). En las demás muestras, el porcentaje de picos con alto tamaño de unidad cristalina es mayor.

La muestra S-3-10-B-HCl es una fase de cristal individual, sin embargo, debido al gran ancho de línea y a la baja reflectancia de la muestra, la asignación es ambigua. Parámetros más probables de una celda unitaria: a = 10,99±0,05 A; b = 28,53±0,05 A; c = 10,62±0,05 A; a = 95,98±0,1°; p = 95,85±0,1°; y = 92,74±0,1° Grupo de espacio P1.

La muestra S-3-11-C2-HCI también es una fase de cristal y también puede asignarse de diferentes maneras. Celda esperada: a = 10,36±0,05 A; b = 18,20±0,05 A; c = 28,08±0,05 A; a = 87,36±0,1°; p = 87,54±0,1°; y = 92,29±0,1° Grupo de espacio P1.

La muestra S-3-12-A1-TSA es una fase de cristal individual con los siguientes parámetros de celda: a = 10,98±0,05A; b=28,48±0,05A y c = 10,60±0,05 A, p = 113,7±0,1°, V = 3.037,5±0,5 A3. Grupo de espacio P2i/c. Se observa un pico no relacionado con una fase de cristal a aproximadamente 22,7° 29, que está relacionado con una base de Kapton (véase la figura 9a). La tabla 2 muestra la posición e intensidad de picos intrínsecos visualmente diferenciados en el patrón de difracción de Debye de la muestra S-3-12-A1-TSA. La figura 11a presenta una vista general de una parte independiente de una celda unitaria del hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 en una modificación polimórfica A (muestra S-3-12-A1-TSA).

Tabla 2. Posición e intensidad de picos intrínsecos visualmente diferenciados en el patrón de difracción de Debye de la muestra de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y base compuesto 1 (modificación polimórfica A). Las intensidades son las alturas de pico (ajustadas al nivel de fondo). Las posiciones corresponden al máximo en el patrón de difracción de Debye, pero no a la posición calculada de las reflexiones

Por tanto, únicamente tres muestras, S-3-10-B-HCI (S3-10), S-3-11-C2-HCI (S3-11) y S-3-12-A1-TSA (S3-12), son sustancias cristalinas, y únicamente la muestra S-3-12-A1-TSA (S3-12) tiene un tipo de un grupo de espacio que se asigna inequívocamente. Basándose en los datos del análisis elemental, la muestra S-3-12-A1-TSA es un monohidrato. Para confirmar la composición, se analizó la muestra usando calorimetría diferencial de barrido (DSC) y análisis termogravimétrico (TGA). Se llevó a cabo la DSC usando un dispositivo DSC 204 F1 de NETZSCH. Se calibró el sistema de medición siguiendo la norma ISO 11357-1 frente a parámetros de transición de fase de sustancias de referencia (C⁶H¹²; Hg; ácido benzoico; Ga; KNO³ ; In; Sn; Bi; CsCI; pureza del 99,99%). Un error sistemático de calibración de temperatura (determinada usando In) es de 0,1°. Se sometieron a prueba las muestras en celdas de aluminio convencionales (V = 56 mm3, d = 6 mm) engarzadas con una tapa que tenía un orificio (la razón del área de la parte inferior de la celda con respecto al área del orificio era de aproximadamente 40) en un flujo (20 ml/min) de aire sintético a temperaturas dentro del intervalo de 30°C a 300°C y una tasa de calentamiento de 10°C/min. Se llevaron a cabo mediciones de TGA usando una termobalanza TG 209 F1 de NETZSCH equipada con un soporte de corindón, una pantalla protectora y un sensor de temperatura de tipo P. Se calibró el dispositivo frente a puntos de fusión de sustancias de referencia (Ag; Al; Bi; In; Sn; pureza del 99,99%). Un error de pesaje no supera el 0,1% (determinado frente a la sustancia de referencia CaC2O4-2H2O). Se llevó a cabo el experimento en un recipiente de corindón convencional (V = 85 mm3, d = 6,7 mm) en un flujo de aire sintético a temperaturas dentro del intervalo de 30°C a 300°C y a una tasa de calentamiento de 10°C/min. Se procesaron los datos experimentales usando el paquete de software Proteus Analysis de NETZSCH siguiendo la norma ISO/CD 11358. Se pesó la muestra usando una balanza analítica GH 202 de AND que tenía una precisión de ±0,01 mg. No se sometió el material a un tratamiento mecánico antes de las mediciones con el fin de evitar la deshidratación.

En la figura 10 se proporcionan los resultados de las pruebas de la muestra. La pérdida de peso inicial y el carácter de las transiciones correspondientes a los efectos sobre las curvas de DSC está en consonancia con la pérdida de agua del cristal. El último efecto sobre las curvas de DSC y la pérdida de peso correspondiente están relacionadas con la fusión de la muestra seguido de la descomposición. Puede extraerse esta conclusión basándose en la observación visual del aspecto final de la muestra estudiada.

Estudios adicionales de un efecto de tratamiento térmico sobre la estructura cristalina de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y base compuesto 1 mostraron que el calentamiento de la modificación polimórfica A hasta 110-115°C a presión residual de 6 mbar en el plazo de 2 horas da como resultado cambios de la estructura cristalina de la sal y la formación de la modificación polimórfica B (muestra SYK 91/1). Estudios adicionales de la cristalinidad de la muestra mediante difracción de rayos X de polvo demostraron que la muestra es una fase de cristal individual con los siguientes parámetros de una celda unitaria: a = 11,09±0,05 A; b = 14,38±0,05 A y c = 10,53±0,05 A, a = 90,06±0,1°; p = 114,6±0,1° y y = 91,1±0,1°, V = 1.525,9±0,5 A3 y grupo de espacio P1 (véase la figura 9b). La tabla 3 muestra la posición e intensidad de picos intrínsecos visualmente diferenciados en el patrón de difracción de Debye de la muestra SYK 91/1. La figura 11b presenta una vista general de una parte independiente de una celda unitaria de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 en una modificación polimórfica B (muestra SYK 91/1).

Tabla 3. Posición e intensidad de picos intrínsecos visualmente diferenciados en el patrón de difracción de Debye de la muestra de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y base compuesto 1 (modificación polimórfica B). Las intensidades son las alturas de pico (ajustadas al nivel de fondo). Las posiciones corresponden al máximo en el patrón de difracción de Debye, pero no a la posición calculada de las reflexiones

Basándose en el estudio llevado a cabo, se estableció que la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y el compuesto 1 es la única forma de sal de cristal del compuesto 1, que puede producirse en disolventes orgánicos de baja toxicidad usando un método fácilmente escalable y que contiene un contraión farmacológicamente aceptable.

Análisis de impurezas en diversas formas de sal del compuesto 1

Se llevó a cabo el análisis del contenido de impurezas en diversas formas de sal para evaluar la calidad de las formas de sal del compuesto 1 obtenidas. Se determinaron las impurezas mediante un método de HPLC. Se calculó el contenido de una impureza individual independientemente del área de los picos correspondientes a los picos en el cromatograma del blanco en cuanto a tiempo de retención y pico de contraión. Se calculó el contenido total de impurezas sumando los resultados de las impurezas individuales.

Se ejecutó un procedimiento de HPLC para la medición de las impurezas en la primera etapa del estudio. Después se analizaron las muestras de una base libre y varias formas de sal del compuesto 1 para determinar las impurezas. En las figuras 15 a 17 y en las tablas 4 a 7 se presentan los resultados de los estudios.

Tabla 4. Resultados del análisis de muestra de compuesto 1 (base libre) para determinar las impurezas

Tabla 5. Resultados del análisis de muestra de sal de ácido metanosulfónico y compuesto 1 para determinar las impurezas

Tabla 6. Resultados del análisis de muestra de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 (modificación polimórfica A) para determinar las impurezas

Tabla 7. Resultados del análisis de muestra de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 (modificación polimórfica B) para determinar las impurezas

Como resultado del análisis para determinar las impurezas en la muestra de compuesto 1 en forma de base libre, se halló un alto contenido de diversas impurezas no identificadas en las muestras; este contenido de impurezas puede provocar efectos tóxicos y acontecimientos adversos como resultado de la introducción de este compuesto como fármaco en un cuerpo humano o animal. Por tanto, se requieren etapas de purificación adicionales para usar el compuesto 1 como candidato a fármaco. Las etapas de purificación adicionales darían como resultado inevitablemente un flujo de proceso más complicado y un aumento del precio de coste de producción del fármaco final.

Como resultado del análisis para determinar las impurezas en la muestra de sal de ácido metanosulfónico y el compuesto 1, se halló un contenido algo inferior de diversas impurezas no identificadas en comparación con el contenido de impurezas en una base libre (compuesto 1). Sin embargo, tal como se observa en la figura 16 y la tabla 5, el contenido de dos impurezas superó el 0,5%. A pesar del hecho de que tal contenido de impurezas es aceptable para la producción de fármacos según los requisitos de la ICH (Conferencia Internacional sobre Armonización) y documentos normativos rusos, esta alta concentración de impurezas puede conducir a efectos tóxicos en la administración en un cuerpo humano o animal; por tanto, el uso de tal sal en la práctica clínica es posible únicamente basándose en los resultados de estudios de toxicidad de esta impureza y/o etapas adicionales de la purificación de la sal.

Inesperadamente, el análisis de impurezas en la muestra de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 no mostró impurezas que superaran el 0,1%. Cabe señalar que, cuando se usa ácido 4-metilbencenosulfónico de baja calidad, el hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y base libre puede contener hasta el 0,15% de ácido orto-toluenosulfónico, sin embargo, esta impureza se retira fácilmente mediante recristalización de ácido 4-metilbencenosulfónico. Según los documentos normativos, concentraciones tan bajas (por debajo del 0,1%) de impurezas se consideran seguras y no requieren la identificación de las estructuras de las impurezas ni etapas de purificación adicionales.

Por tanto, el análisis de impurezas en las muestras de diversas formas de sal del compuesto 1 mostró inesperadamente que el hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 tiene la pureza más alta de entre las sales estudiadas y no contiene impurezas que superen el 0,15%.

Características de actividad biológica de los compuestos según la invención

Se llevaron a cabo diversos experimentos para estudiar la actividad biológica de la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 y las formas cristalinas de la misma que son el objeto de esta invención. Estudio del efecto de la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 sobre la actividad enzimática de cinasas humanas in vitro

Los estudios del efecto de los compuestos según la invención sobre la actividad enzimática de cinasas humanas in vitro revelaron por primera vez un efecto directo de inhibición de la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 (como modificación polimórfica A) sobre una gama de tirosina cinasas recombinantes humanas, particularmente sobre la tirosina cinasa c-Src humana.

Se midió el efecto del compuesto 1 sobre la tirosina cinasa c-Src recombinante humana de la siguiente manera: se disolvió un sustrato de péptido en un tampón de reacción hasta una concentración de 0,2 mg/ml. Se añadió una disolución de cinasa c-Src recombinante hasta una concentración de 2 nM y se añadió el compuesto estudiado a la concentración requerida (dentro del intervalo de 1 nM a 10 |iM). Se añadió una disolución de 33P-ATP hasta una concentración de 10 |iM (la actividad específica final de la disolución es de 0,01 |iCi). Después de 120 minutos de incubación, se aplicó la mezcla de reacción sobre un papel de intercambio iónico, que se enjuagó con abundante ácido fosfórico. Se determinó el grado de reacción basándose en la radiactividad de los productos de reacción.

Los estudios llevados a cabo mostraron que la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 a una concentración de 0,5 |imol/l inhibe la actividad de las siguientes cinasas en más del 50%: Blk, c-Src, Syk, Fgr, Frk, Fyn, Hck, Lck, Lyn, Yes. La inhibición más significativa de la actividad catalítica se detectó para la familia de cinasas Src; el efecto de la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 a una concentración de 0,5 |imol/l reduce la actividad residual de la familia de cinasas Src hasta el 25% y disminuye los valores de control. Particularmente, la actividad residual de la cinasa c-Src en presencia de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 a una concentración de 0,5 |imol/l fue el 6% de los valores de control, la actividad residual fue el 12% de las cinasas Yes y Lck, el 13% de la cinasa Lyn, el 20% de Blk, el 23% de Fgr, el 25% de las cinasas Fyn y Hck.

Se determinaron las concentraciones de inhibición semimáxima (CI⁵⁰) de la actividad enzimática de cinasas para refinar los datos obtenidos. Como resultado, se demostró un efecto de inhibición de la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 sobre la tirosina cinasa c-Src recombinante humana (véase la figura 12) en un intervalo nanomolar de concentraciones (CI⁵⁰ = 14 nmol/l). Además, la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 también inhibe la cinasa Syk en el intervalo nanomolar de concentraciones (CI⁵⁰ = 40 nmol/l). Comparación de la farmacocinética de formas de sal de base libre y compuesto I

Se estudiaron los parámetros farmacocinéticos de las formas de sal del compuesto 1 obtenidas para evaluar la idoneidad de las mismas como fármacos.

En la primera etapa, se estudió la farmacocinética de la base libre del compuesto 1 después de la administración oral en ratas Wistar a una dosificación de 30 mg/kg. En la figura 19 y la tabla 9 se proporcionan los resultados del estudio. Tal como muestran los resultados presentados, una concentración máxima de la sustancia en plasma es de 4,12 ng/ml, que corresponde a 9,1 nmol/l, y una concentración diaria promedio de la sustancia es de 4,8 nmol/l. Al mismo tiempo, los estudios de la actividad biológica del compuesto 1 mostraron que una concentración eficaz de la base libre es de aproximadamente 1 |imol/l. Por tanto, los parámetros farmacocinéticos de la base libre eliminan su uso como fármaco puesto que se requiere una alta dosificación del compuesto 1 para lograr el efecto terapéutico requerido. Esto sería poco práctico para la implementación técnica y práctica, conduciría a un consumo significativo de sustancias y también conduciría a la aparición de acontecimientos adversos gastrointestinales tóxicos.

Tabla 9. Parámetros farmacocinéticos básicos del compuesto 1 en la administración como base libre a ratas Wistar a una dosis de 30 mg/kg. Los valores promedio para cada punto de tiempo se determinan basándose en datos individuales recibidos en tres animales

Se estudió la farmacocinética de varias formas de sal del compuesto 1 después de la administración oral en ratas Wistar a una dosis de 37 mg/kg (30 mg/kg equivalente a una base libre). La figura 20 y la tabla 10 muestran los resultados del estudio farmacocinético de sal de ácido metanosulfónico y compuesto 1. Tal como muestran los resultados presentados, la sal de ácido metanosulfónico y compuesto 1 tiene parámetros farmacocinéticos significativamente más favorables frente a la base libre. Una concentración máxima de la sustancia en plasma es de 333 ng/ml, que corresponde a 735 nmol/l, y una concentración diaria promedio de la sustancia es de 104 nmol/l. Al mismo tiempo, los estudios de la actividad biológica del compuesto 1 mostraron que una concentración eficaz del compuesto 1 es de aproximadamente 1 |imol/l. Por tanto, se requiere una dosificación de sustancia significativamente mayor o la administración de múltiples dosis para usar la sal de ácido metanosulfónico y compuesto 1 como fármaco.

Tabla 10. Parámetros farmacocinéticos básicos de la sal de ácido metanosulfónico y compuesto 1 en la administración a ratas Wistar a una dosis de 30 mg/kg (equivalente a una base libre). Los valores promedio para cada punto de tiempo se determinan basándose en datos individuales recibidos en tres animales

T^1/2 Tmáx Cmáx AUC0-t AUC0

El estudio farmacocinético de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 después de la administración oral a ratas Wistar mostró inesperadamente que esta forma de sal tiene los parámetros farmacocinéticos óptimos frente a la base libre y otras formas de sal del compuesto 1 estudiadas. La figura 21 y la tabla 11 muestran los resultados del estudio farmacocinético de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1. Cuando se administró hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 a ratas Wistar a una dosis de 30 mg/kg (21 mg/kg equivalentes a una base libre), una concentración máxima de la sustancia en plasma fue de 416 ng/ml, que corresponde a aproximadamente 1 |imol/l, y una concentración diaria promedio de la sustancia superó los 200 nmol/l.

Tabla 11. Parámetros farmacocinéticos básicos del hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 (modificación polimórfica A) en la administración a ratas Wistar a una dosis de 21 mg/kg (equivalentes a una base libre). Los valores promedio para cada punto de tiempo se determinan basándose en datos individuales recibidos en seis animales

Estudios farmacocinéticos adicionales de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 en ratas mostraron que el fármaco se absorbe rápidamente en la sangre, alcanzando la concentración máxima después de 1,1 a 1,3 horas, y se distribuye a lo largo de los órganos y tejidos. La concentración promedio diaria de la sustancia en tejidos óseos y cartilaginosos supera la concentración promedio diaria de la sustancia en plasma sanguíneo animal en más de tres veces. El hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 tiene una farmacocinética lineal dentro de un amplio intervalo de dosis. Cuando el hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 se administra por vía intragástrica a dosificaciones de 30 a 200 mg/kg, la concentración del compuesto 1 en plasma sanguíneo de rata aumenta en proporción a la dosis. Se hallaron altas concentraciones del compuesto 1 en casi todos los tejidos estudiados y alcanzaron el máximo de 2 a 4 horas después de la administración del hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1. La concentración promedio diaria del compuesto 1 en órganos diana (tejidos óseos y cartilaginosos) supera la concentración promedio diaria del compuesto 1 en plasma sanguíneo animal en más de tres veces. La concentración más baja del compuesto 1 se registró en los músculos.

Estudios farmacocinéticos de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 en conejos en una única administración a una dosis de 50 mg/kg demostraron que la concentración de la sustancia en el plasma sanguíneo de conejo alcanza 8,6 |ig/ml (~16 |imol/l) y el tiempo medio de eliminación es de más de 7 horas.

Los estudios farmacocinéticos de diversas formas de sal del compuesto 1 mostraron inesperadamente que la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 es una forma de sal del compuesto 1 óptima que permite la administración oral única a una dosis significativamente más baja frente a otras formas de sal del compuesto 1 estudiadas.

Estudio del efecto del hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 sobre la resorción de tejido óseo mediada por osteoclastos

Este experimento reveló por primera vez un efecto del hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 (modificación polimórfica A) sobre la resorción de tejido óseo mediada por osteoclastos. Se llevó a cabo el estudio siguiendo el método a continuación: se cultivaron monocitos CD15+ (células precursoras de osteoclastos) durante 3 días en un medio de proliferación (medio esencial mínimo de Eagle a-modificado/suero de ternero fetal (aMEM/FCS) al 10% con 25 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF)). Durante esta etapa, M-CSF fomentó la proliferación y expresión de un activador de receptor de factor nuclear ^kB (RANK, kappa-B, proteína de membrana de tipo I). Se retiró el medio de proliferación y se diferenciaron las células en un medio de diferenciación (aMEM/FCS al 10% con 100 ng/ml de RANKL y 25 ng/ml de M-CSF). Cuando se detectaron osteoclastos maduros en el cultivo (día 4 del estudio), se recogieron las células y volvieron a inocularse en una placa de 96 pocillos recubierta con una matriz mineralizada sintética. El cultivo continuó durante 48 horas (en presencia de los compuestos estudiados) para evaluar la resorción por osteoclastos. Después se evaluaron el número de osteoclastos maduros y el grado de resorción. Se evaluó un efecto de la concentración de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 sobre la concentración y el grado de resorción de osteoclastos maduros en comparación con muestras de control (control positivo, disolvente DMSO al 0,3%) e inhibidores de referencia, es decir, saracatinib y bosutinib (véase la figura 18). Valores similares de número promedio de osteoclasto maduros por pocillo (488 ± 43 y 451 ± 11) y grados promedio de resorción de la matriz mineralizada (32,62 ± 1,16% y 35,53 ± 2,40%) en muestras de control (control positivo, disolvente) confirmaron que el disolvente no tenía ningún efecto sobre la supervivencia de osteoclastos y la resorción mediada por osteoclastos. Los estudios llevados a cabo demostraron que el compuesto 1 tiene un efecto inhibidor dependiente de la dosis sobre la resorción mediada por osteoclastos de la matriz mineralizada. Se halló un notable efecto inhibidor estadísticamente significativo a las concentraciones de 1,1 |iM y 10 |iM de monohidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 (véase la figura 18).

También se halló un efecto inhibidor dependiente de la dosis estadísticamente significativo sobre la resorción mediada por osteoclastos de la matriz mineralizada cuando se usó el hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 como modificación polimórfica B a concentraciones a partir de 1,0 |iM. Estudio del efecto del hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 sobre el metabolismo cartilaginoso

Se demostró por primera vez un efecto de la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 usando monohidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 (modificación polimórfica A). Se llevó a cabo el estudio siguiendo el método a continuación: se aislaron condrocitos a partir del cartílago de la articulación de la rodilla de ratas jóvenes (3 semanas de edad, raza Sprague Dawley). Se almacenaron los condrocitos aislados congelados a -80°C en un medio de cultivo (medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco/suero de ternero fetal (DMEM/FCS) al 10%, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazin-etanosulfónico (He PES) 25 mM). Se descongelaron los condrocitos obtenidos un día antes del experimento, se inocularon en placas de 12 pocillos y se cultivaron como monocapa durante 24 horas. Después de 24 horas de incubación, se inició la activación de condrocitos inducida por IL-1 p y el tratamiento con los compuestos estudiados y se continuó durante 3 días. Los estudios llevados a cabo mostraron que el hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 (modificación polimórfica A) demuestra un efecto positivo estadísticamente significativo sobre los cambios hipertróficos inducidos por IL-1 p en condrocitos manifestados como un aumento significativo de la expresión de agrecanos.

Por tanto, basándose en los resultados de los estudios llevados a cabo, se halló un efecto protector evidente de la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 sobre los tejidos óseos y cartilaginosos. Estos efectos pueden lograrse únicamente usando formas de sal del compuesto 1 que tengan parámetros farmacocinéticos satisfactorios. Se halló que los parámetros farmacocinéticos la base libre del compuesto 1 no permitían el uso de este compuesto para detener el metabolismo de tejido óseo mediado por osteoclastos y los cambios hipertróficos inducidos por IL-1 p en condrocitos. Al mismo tiempo, la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1, particularmente su monohidrato, tiene parámetros farmacocinéticos apropiados y puede usarse para el tratamiento de las enfermedades asociadas con metabolismo óseo y cartilaginoso aberrante.

Estudio del efecto de la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 sobre la destrucción de una articulación de la rodilla en modelos de rata de osteoartritis inducida por la introducción intraarticular de yodoacetato de sodio

Los estudios llevados a cabo en animales demostraron un efecto farmacológico directo de la sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 como monohidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 (modificación polimórfica A) sobre la destrucción de una articulación de la rodilla en modelos de rata Sprague-Dawley de osteoartritis inducida por la introducción intraarticular de yodoacetato de sodio. La introducción intraarticular de inhibidor de glicólisis aerobia (yodoacetato de sodio) da como resultado la muerte de condrocitos y una reacción inflamatoria aguda en una cavidad sinovial. En ausencia de tratamiento, el día 10 desde la inducción de la patología, se observa la aparición de dolor crónico debido a la destrucción de cartílago y el desarrollo de inflamación crónica en casos particulares [J Musculoskel Neuron Interact 2001; 1(4):363-376]. Se evaluó el grado de desarrollo de osteoartritis en ratas mediante la comparación del umbral de sensibilidad al dolor en las extremidades después de la introducción de yodoacetato de sodio frente a mediciones del nivel de fondo tomadas antes de la inducción de la patología. Se evaluó el umbral de sensibilidad al dolor mediante la prueba de alodinia mecánica usando filamentos de von Frey (véase la tabla 8).

Para los propósitos del estudio, se seleccionaron ratas macho que pesaban entre 150 y 200 g. Se aclimataron todos los animales durante 14 días. Se alojaron los animales en una jaula de policarbonato de tipo 3H fabricada por Charles River Laboratories Inc., según la norma GOST R 53434-2009. Se mantuvo un régimen de iluminación de 12 horas. Los animales tenían acceso libre a alimento y agua. Se indujo la patología mediante la introducción de 50 |il de disolución que contenía 2 mg de yodoacetato de sodio en una cavidad sinovial de las articulaciones de la rodilla de los animales. Se evaluó la alodinia táctil inducida por una irritación mecánica usando filamentos de von Frey que pesaban entre 0,06 y 23,96 g. Se repitió la prueba cinco veces para cada filamento a intervalos de 1 a 2 s. Se consideró el umbral de sensibilidad como umbral de reacción mínimo que provoca la retirada de la pata en una de las cinco repeticiones.

La tabla 8 contiene los resultados de la evaluación del efecto de la administración de monohidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 (modificación polimórfica A) sobre la destrucción de una articulación de la rodilla en modelos de rata de osteoartritis inducida por la introducción intraarticular de yodoacetato de sodio.

Tabla 8. Estudio de sensibilidad al dolor de extremidades afectadas de animales usando la prueba de alodinia mecánica con filamentos de von Frey. Los valores presentados son el umbral de reacción mínimo que provoca la retirada de la pata afectada, en porcentajes del valor de umbral de reacción antes de la inducción de la patología (n=10, M±m)

Se logra la detención total de la aparición de alodinia mecánica mediante la administración de hidrato de sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 a una dosis de 100 y 500 mg/kg comenzando el día de la inducción de la patología y a una dosis de 500 mg/kg comenzando el séptimo día de la inducción de la patología. Basándose en el experimento llevado a cabo, puede concluirse que este compuesto inhibe el metabolismo óseo y cartilaginoso aberrante y, a su vez, da como resultado la detención del desarrollo de alodinia mecánica y la diminución del umbral de sensibilidad al dolor en modelos de rata de osteoartritis.

Por tanto, los experimentos llevados a cabo muestran que sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y compuesto 1 así como su hidrato (monohidrato en particular), solvato y modificaciones polimórficas de la sal, el hidrato o solvato son inhibidores eficaces de la cinasa Syk y la familia de cinasas Src, particularmente la cinasa c-Src, y tienen parámetros farmacocinéticos que permiten el uso de las sales especificadas como fármaco para su introducción en un cuerpo humano o animal para tratar enfermedades asociadas con actividad cinasa aberrante que conducen a metabolismo óseo y cartilaginoso aberrante, concretamente osteoartritis, osteoporosis y osteocondrosis.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Sal de ácido 4-metilbencenosulfónico y base 2,2-dimetil-6-((4-((3,4,5-trimetoxifenil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)-2H-pirido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-ona:

su hidrato, solvato o modificación polimórfica de la sal, el hidrato o solvato.

2. Sal según la reivindicación 1, que es un hidrato o una modificación polimórfica del hidrato.

3. Sal según la reivindicación 2, cuya modificación polimórfica del hidrato es una fase de cristal caracterizada por los siguientes parámetros de una celda unitaria: a = 10,98±0,05 Á, b = 28,48±0,05 Á, c = 10,60±0,05 Á, P = 113,7±0,1°, V = 3.037,5±0,5 Á3; grupo de espacio P2i/c.

4. Sal según la reivindicación 2, cuya modificación polimórfica del hidrato es una fase de cristal caracterizada por picos intrínsecos en el patrón de difracción de Debye a los ángulos de difracción (20) 6,2; 8,8; 9,6; 10,7; 11,0; 11,6; 12,4; 15,3; 16,2; 16,5; 17,0; 17,4; 17,6; 17,9; 18,3; 18,6; 19,3; 19,3; 19,6; 20,6; 20,9; 23,5; 25,2; 26,2; 26,5; 27,2; 27,6 y 30,2, obtenido mediante un método de difracción de rayos X de polvo a una temperatura de 25±5°C usando radiación CuKa1 a una longitud de onda de 1,5406 Á.

5. Sal según la reivindicación 2, cuya modificación polimórfica del hidrato es una fase de cristal caracterizada por los siguientes parámetros de una celda unitaria: a = 11,09±0,05 Á, b = 14,38±0,05 Á, c = 10,53±0,05 Á, a = 90,06±0,1°, P = 114,6±0,1°, y= 91,1±0,1°, V = 1.525,9±0,5 Á3; grupo de espacio P1.

6. Sal según la reivindicación 2, cuya modificación polimórfica del hidrato es una fase de cristal caracterizada por picos intrínsecos en el patrón de difracción de Debye a los ángulos de difracción (20) 6,1; 8,8; 10,6; 11,0; 11,5; 12,3; 15,0; 15,2; 15,5; 15,8; 16,1; 16,3; 17,3; 17,6; 17,9; 18,5; 19,5; 20,5; 20,7; 20,8; 24,6; 24,8; 25,1; 26,1; 26,5; 26,9; 30,1 y 43,0, obtenido mediante un método de difracción de rayos X de polvo a una temperatura de 25±5°C usando radiación CuKa1 a una longitud de onda de 1,5406 Á.

7. Sal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un trastorno relacionado con actividad cinasa aberrante, en la que el trastorno relacionado con actividad cinasa aberrante es una enfermedad del aparato locomotor seleccionada de osteoartritis, osteoporosis u osteocondrosis.

8. Sal para su uso según la reivindicación 7, en la que la cinasa es una proteína cinasa no receptora seleccionada de cinasa Syk o cinasa de la familia Src.

9. Sal para su uso según la reivindicación 8, en la que la cinasa de la familia Src es cinasa c-Src, Yes, Fyn, Fgr, Yrk, Lyn, Blk, Hck o Lck.

10. Composición farmacéutica para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un trastorno relacionado con actividad cinasa aberrante y que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de la sal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y al menos una sustancia auxiliar farmacéuticamente aceptable, en la que el trastorno relacionado con actividad cinasa aberrante es una enfermedad del aparato locomotor seleccionada de osteoartritis, osteoporosis u osteocondrosis.

11. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 10, en la que la sustancia auxiliar es un portador y/o excipiente.

12. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 10, en la que la cinasa es una proteína cinasa no receptora seleccionada de cinasa Syk o cinasa de la familia Src.

13. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 12, en la que la cinasa de la familia Src es cinasa c-Src, Yes, Fyn, Fgr, Frk, Lyn, Blk, Hck o Lck.