ES2886127T3

ES2886127T3 - Biotinta nanofibrilar de celulosa para bioimpresión 3D para aplicaciones de cultivo celular, ingeniería de tejidos y medicina regenerativa

Info

Publication number: ES2886127T3
Application number: ES15871191T
Authority: ES
Inventors: Paul Gatenholm
Original assignee: Cellink AB
Current assignee: Bico Group AB
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2021-12-16
Anticipated expiration: 2035-12-18
Also published as: PL3233493T3; EP3233493A4; DK3233493T3; EP3233493A1; WO2016100856A1; EP3912652B1; EP3912652C0; US20170368225A1; US20200206385A1; EP3233493B1; US20230398259A1; EP3912652A1; PT3233493T; US20200164103A1; US10675379B2

Abstract

Una biotinta a base de celulosa que comprende: una dispersión de nanofibrillas de celulosa en un medio líquido, en donde las nanofibrillas de celulosa tienen una longitud de 1-100 micrómetros y una anchura de 10-30 nanómetros; una viscosidad de entre 1 y 50 Pa·s a 100 s-1; y un contenido de sólidos en el intervalo del 1-3 % en peso de la dispersión.

Description

DESCRIPCIÓN

Biotinta nanofibrilar de celulosa para bioimpresión 3D para aplicaciones de cultivo celular, ingeniería de tejidos y medicina regenerativa

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una nueva biotinta, que es un biomaterial en forma de dispersión acuosa de nanofibrillas de celulosa y se puede convertir en las formas 3D (abreviatura de three-dimensional, tridimensional) deseadas utilizando la tecnología de bioimpresión 3D.

Esta nueva biotinta es adecuada para el cultivo 3D de células y el crecimiento de tejidos y órganos vivos. En la presente invención, el material nanofibrilar de celulosa se procesa a través de diferentes etapas mecánicas, enzimáticas y/o químicas para producir una dispersión de fibrillas con las propiedades reológicas y morfológicas deseadas para su uso como biotinta en una bioimpresora en 3D. Los procesos de homogeneización pueden ir seguidos de la purificación del material para producir un biomaterial, que tiene un nivel deseado de citocompatibilidad y, por tanto, se puede combinar con células vivas.

Las nanofibrillas de celulosa se pueden producir mediante un proceso microbiano, pero también se pueden aislar de la pared celular vegetal primaria o secundaria, de animales tales como tunicados, de algas y de hongos. Los parámetros deseados descritos en la presente invención son el tamaño de la fibrilla, las propiedades de la superficie, la concentración y la biocompatibilidad. En la presente invención se combinan nanofibrillas de celulosa con diferentes aditivos que facilitan un proceso de reticulación para mejorar las propiedades mecánicas de las estructuras bioimpresas en 3D. La biotinta de nanocelulosa, CELLINK™, se prepara normalmente con componentes estériles y se prepara en condiciones de sala aséptica. La osmolaridad de la CELLINK™ está diseñada para proporcionar compatibilidad con células de mamífero. CELLINK™ puede bioimprimirse en 3D con células o sin células. CELLINK™ también puede utilizarse para sustentar otras biotintas, tales como materiales preparados a partir de tejidos y órganos descelularizados.

Más particularmente, las realizaciones de la invención se refieren a la reparación de tejidos duros y blandos, a armazones, a sistemas y a métodos para el diseño, la producción y el control de la arquitectura y las propiedades biomecánicas de biomateriales que se utilizan para crecer tejidos y órganos. Las realizaciones específicas de la invención se refieren a materiales biocompatibles, a ingeniería de tejidos y a medicina regenerativa, a implantes, a dispositivos biomédicos y productos para la atención médica y, más particularmente, al uso como biotinta en procesos de bioimpresión 3D para crear una arquitectura y un rendimiento biomecánico óptimos de tejidos y órganos artificiales. La presente invención también se refiere a nuevos dispositivos, sistemas y métodos que emplean tejidos y/u órganos artificiales que tienen una arquitectura y morfología 3D deseadas con el soporte de un armazón basado en nanocelulosa 3D, que se pueden utilizar para el descubrimiento de fármacos de alto rendimiento, en cribado y en pruebas de toxicidad. También pueden usarse para crecer tumores artificiales y, por tanto, usarse para la investigación in vitro sobre el cáncer.

Descripción de la técnica relacionada

La ingeniería de tejidos es la utilización de células, material de soporte - armazones, factores de crecimiento y, en muchos casos, biorreactores, para crecer in vitro o in vivo tejidos y órganos. La fuerza impulsora ha sido la escasez de órganos necesarios para el trasplante. En los últimos 20 años se han logrado enormes avances científicos y técnicos que han hecho posible el crecimiento de casi todos los tejidos humanos y de muchos órganos. En los últimos años, la industria farmacéutica y cosmética ha mostrado un gran interés en aplicar los avances en la ingeniería de tejidos para crecer tejido y "mini" órganos para el descubrimiento y la prueba de fármacos. Las nuevas regulaciones imponen restricciones para el uso de animales en las pruebas de productos cosméticos. Esto ha suscitado un gran interés por el desarrollo de modelos de piel humana "piel en la placa".

Las células humanas deben tener un entorno 3D similar a un entorno de tejido natural para poder migrar, proliferar y/o diferenciarse para desarrollar tejidos funcionales. Asimismo, las células madre normalmente necesitan un entorno 3D para diferenciarse en el linaje celular deseado. Esta es la razón por la que se han desarrollado armazones con arquitectura 3D y microporosidad específica para aplicaciones de ingeniería de tejidos. En experimentos clásicos de ingeniería de tejidos, las células se siembran en un armazón 3D y luego se cultivan en una incubadora o se estimulan en un biorreactor, o se implantan directamente in vivo.

Se han evaluado muchos polímeros sintéticos y naturales diferentes como armazones para la ingeniería de tejidos. Los ejemplos de polímeros sintéticos biodegradables incluyen ácido poliláctico y poliglicólico. Estos polímeros tienen a menudo características de degradación rápida y/o producen un entorno que provoca inflamación. Los polímeros naturales incluyen colágeno, ácido hialurónico y sus derivados, alginato y quitosano. Si bien estos materiales se pueden fabricar en películas, mallas o estructuras 3D más complejas, su uso satisfactorio está limitado por sus propiedades físicas y bioquímicas. La fabricación de estructuras 3D con una arquitectura controlada y una porosidad interconectada ha sido un desafío. Los métodos utilizados, tales como la liofilización, la eliminación de porógenos o el electrohilado, muestran poca reproducibilidad y falta de control de la arquitectura 3D en microescala. Como consecuencia de eso, ha habido dificultades en la siembra de células ya que la migración celular requiere una buena interconectividad de poros.

En procesos de impresión 3D, se fabrica un objeto capa por capa mediante un dispositivo de impresión utilizando un diseño asistido por ordenador, un archivo CAD. Muchos científicos ya han utilizado con éxito la impresión 3D en la ingeniería de tejidos para fabricar armazones específicos para pacientes. Los armazones hechos de polímeros termoplásticos se han extrudido utilizando impresoras 3D. La desventaja de la impresión 3D utilizando materiales termoplásticos es una dificultad en la siembra de células debido a la limitada migración celular a estructuras porosas. La bioimpresión 3D funciona utilizando líquidos a temperatura ambiente o corporal y, por tanto, puede potencialmente emplear células vivas. Se espera que la introducción de la bioimpresión 3D revolucione el campo de la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa, lo que podría permitir la reconstrucción de tejidos y órganos vivos, preferentemente utilizando las propias células del paciente. La bioimpresora en 3D es un brazo robótico capaz de moverse en las direcciones X, Y, Z con una resolución de 10 pm mientras dispensa líquidos. La bioimpresora en 3D puede colocar varios tipos de células y, por tanto, reconstruir la arquitectura de órganos complejos.

En la Patente de los Estados Unidos N.° US 8.691.974 B2, titulada "Bioimpresión tridimensional de armazones de celulosa biosintéticos para ingeniería de tejidos", se presentó una nueva técnica de fermentación para el control de la forma 3D, el grosor y la arquitectura de la red de nanofibrillas de celulosa entrelazadas. La patente describió el uso de un proceso de fermentación para desarrollar una estructura 3D de celulosa biosintética. Desafortunadamente, esta técnica no se puede combinar con células de mamífero debido a las diferencias en las condiciones de cultivo a 37 grados, la cual se precisa para las células de mamífero, ya que las células bacterianas mueren. La celulosa biosintética, BC (por sus siglas del inglés biosynthetic cellulose) es un biomaterial novedoso para dispositivos e implantes biomédicos (Petersen N, Gatenholm, P., Bacterial cellulose-based materials and medical devices: current state and perspectives, Applied Microbiology and Biotechnology, 91, 1277, 2011). Las nanofibrillas de BC tienen un tamaño y morfología similares al colágeno (diámetro de 10-30 nm y longitud de hasta micrómetros), lo que es muy atractivo para la unión celular, la migración celular y la producción de componentes de la matriz extracelular. Los estudios in vitro e in vivo han demostrado que los implantes de BC normalmente no provocan ninguna reacción a cuerpo extraño, fibrosis y/o formación de cápsula, y/o el tejido conjuntivo se integra bien con el biomaterial de BC (Helenius G, H. Backdahl, A. Bodin, U. Nanmark, P. Gatenholm, B. Risberg, In vivo Biocompatibility of Bacterial Cellulose, J. Biomed. Mater. Res. A., 76, 431,2006; Martinez Avila, H., S. Schwarz, E.M. Feldmann, A. Mantas, A. Von Bomhard, P. Gatenholm y N. Rotter, Biocompatibility evaluation of densified bacterial nanocellulose hydrogel as an implant material for auricular cartilage regeneration. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2014. 98(17): pág. 7423--7435.).

Gethin et al. (Studies on the 3D printing of nanocellulose structures (Advances in printing and media technology, 2014, XLI(I), pág. 91-95)) desvela dos materiales de nanocelulosa: nanocelulosa TEMPO (pretratada con oxidación mediada por TEMPO) y nanocelulosa C-Peryodato (pretratada con una combinación de carboximetilación y oxidación con peryodato). Como se analizó en esta divulgación, los autores concluyen que la nanocelulosa C-peryodato es adecuada para su uso como biotinta debido a la mayor consistencia y una reología adecuada, mientras que la nanocelulosa TEMPO tendió a colapsar, probablemente debido a la baja consistencia del material. La longitud de las nanofibrillas de la nanocelulosa TEMPO es de aproximadamente 0,8-1 micrómetros, mientras que las nanofibrillas de C-peryodato tienen una longitud de aproximadamente 200 nm.

Se espera que una red de celulosa biosintética no pueda usarse como tal como un armazón para ingeniería de tejidos debido a la red relativamente compacta de nanofibrillas de celulosa que dificulta o imposibilita la migración celular. Se han descrito procesos de biofabricación en los que se ha desarrollado la macroporosidad del biomaterial de nanocelulosa 3D mediante la introducción de porógenos durante el proceso de fermentación en Backdahl, H., Esguerra, M., Delbro, D., Risberg, B. y Gatenholm, P., Engineering microporosity in bacterial cellulose scaffolds, Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 2 (6), 320 - 330 (2008). Los porógenos deben eliminarse durante el proceso de purificación. Ninguno de los métodos permite un control reproducible y escalable de la arquitectura de los armazones o un método conveniente para combinar con las células.

El desarrollo de bioimpresoras en 3D de alta resolución permite la colocación de varios tipos de células humanas con alta precisión y reproducibilidad y, por tanto, la reconstrucción de tejidos y órganos complejos. Los rápidos avances en el aislamiento de células madre de tejido del paciente, tal como el adiposo, permiten tener acceso a una cantidad suficiente de células autólogas para la reparación de tejidos en una cirugía de una sola etapa. Normalmente, las células no se pueden imprimir solas, ya que se espera que no permanezcan en su sitio. Como resultado, las células se suspenden en medio de cultivo o tampón, que tiene una viscosidad baja. Además, las células están preferentemente protegidas de altas tensiones de cizalla en el dispositivo de cabezal de impresión. Adicionalmente, después de la impresión, las células deben estar en un entorno citocompatible, que permitirá la administración de nutrientes y oxígeno a las células y, preferentemente, proporcionará soporte para la unión celular. Cuando se desea tejido con una arquitectura 3D deseada en diferentes escalas de longitud, existe la necesidad de una biotinta capaz de proporcionar características viscoelásticas a transferir a armazones 3D con forma predeterminada. Se prefiere desarrollar y comercializar las biotintas para garantizar un suministro de armazones imprimibles y compatibles con las células para aplicaciones de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa.

Sumario de la invención

En la presente invención se describen procesos para la preparación de una nueva biotinta, CELLINK™, para la impresión de tejidos blandos y órganos y el uso de esta biotinta en procesos de bioimpresión 3D de tejidos y órganos. En realizaciones, la estructura del tejido blando humano y animal se imita mediante la producción de biomateriales con una arquitectura deseada utilizando nanofibrillas de celulosa semicristalina. Las nanofibrillas de celulosa se pueden aislar de material de madera, de plantas anuales, de animales tales como tunicados o pueden ser producidas por hongos o bacterias. La presente invención describe una nueva generación de armazones de biomateriales imprimibles biomiméticos de base acuosa con capacidad de impresión única en formas 3D y capacidad para sustentar el crecimiento de tejidos y órganos.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una biotinta a base de celulosa como se define en las reivindicaciones 1-8, que comprende una dispersión de nanofibrillas de celulosa en un medio líquido, en donde las nanofibrillas de celulosa tienen una longitud de 1-100 micrómetros y una anchura de 10-30 nanómetros; una viscosidad de entre 1 y 50 Pas a 100 s-1; y un contenido de sólidos en el intervalo del 1-3 % en peso de la dispersión. En un segundo aspecto, definido en la reivindicación 9, la presente invención se refiere a un método para preparar la biotinta a base de celulosa de las reivindicaciones 1-8. Un tercer aspecto, definido en las reivindicaciones 10-11, se refiere a una materia, tejido u órgano bioimpreso con la biotinta a base de celulosa de las reivindicaciones 1-8. Un cuarto aspecto, definido en las reivindicaciones 12-14, se refiere a un método para construir una materia, tejido u órgano bioimpreso en 3D. Un quinto aspecto, definido en la reivindicación 15, se refiere al uso de la biotinta a base de celulosa de las reivindicaciones 1-8, preparada según el método de la reivindicación 9, como soporte para la bioimpresión de colágeno, elastina o una matriz extracelular. Un sexto aspecto, definido en las reivindicaciones 16-17, se refiere al uso de la biotinta a base de celulosa de las reivindicaciones 1-8, preparada según el método de la reivindicación 9, para bioimprimir armazones, tejidos u órganos. Un séptimo aspecto, definido en la reivindicación 18, se refiere al uso de la materia, tejido u órgano bioimpreso de las reivindicaciones 10-11, para el descubrimiento de fármacos, la prueba de cosméticos, o el uso como modelo de enfermedades. Un octavo aspecto, definido en las reivindicaciones 19-21, se refiere a un método para preparar un soporte para estructuras complejas adecuado para reforzar un tejido u órgano de un ser humano o animal.

La biotinta, CELLINK™, tal como se describe en la presente invención, está compuesta por una dispersión de celulosa nanofibrilada con la adición preferible de un componente de reticulación. Dicha biotinta se puede reticular preferentemente después de la impresión o incluso durante la operación de bioimpresión 3D. En algunas aplicaciones, CELLINK™ se puede utilizar sin un agente de reticulación. CELLINK™, tal como se describe en la presente invención, tiene propiedades reológicas únicas con una viscosidad a velocidad de cizalla cero extremadamente alta y un comportamiento de adelgazamiento por cizalla con recuperación rápida después del cizallamiento (operación de impresión). La viscosidad de CELLINK™ se puede configurar a medida seleccionando una concentración adecuada de nanofibrillas de celulosa, su longitud (relación de aspecto), la carga y los aditivos. Las características de citotoxicidad y las características de viabilidad celular deseadas se han desarrollado mediante un proceso de purificación y adaptación de la osmolaridad de la dispersión para imprimir CELLINK™ con células vivas.

Varios tipos diferentes de células de mamífero, incluidos los fibroblastos bovinos, los condrocitos humanos y las células madre pluripotentes inducidas se han impreso satisfactoriamente con CELLINK™ en formas 3D complejas de órganos humanos, y las células muestran una buena viabilidad después de la impresión y la reticulación. La evaluación a largo plazo (más de 28 días) mostró la regeneración de cartílago humano en tejido bioimpreso en 3D. También se ha demostrado que CELLINK™ es un gran material de soporte cuando se imprimen tejidos complejos con colágeno o biotintas a base de matriz descelularizada. Las características biomiméticas y de biocompatibilidad de estas nuevas biotintas basadas en fibrillas de nanocelulosa las convierten en candidatos ideales para aplicaciones en cultivo celular, ingeniería de tejidos y medicina regenerativa.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos adjuntos ilustran determinados aspectos de algunas de las realizaciones de la presente invención. Junto con la descripción escrita, los dibujos sirven para explicar determinados principios de la invención.

La FIGURA 1 es una imagen MFA de una dispersión nanofibrilar de celulosa bacteriana preparada por hidrólisis. El tamaño de la microfibrilla es: una anchura de 30 nm y una longitud por encima de los 2 micrómetros.

La FIGURA 2 es una imagen de microscopía electrónica de barrido (MEB) de una dispersión nanofibrilar de celulosa bacteriana preparada por hidrólisis. La microfibrilla tiene: una anchura de 30 nm y una longitud por encima de los 10 micrómetros.

La FIGURA 3 es un gráfico que muestra las propiedades reológicas de una biotinta de dispersión nanofibrilar de BC y de BC/alginato con una viscosidad de cizalla cero extremadamente alta y una viscosidad de 5 Pa s (Pascal segundo) a 100 s-1.

Las FIGURAS 4A-C son imágenes que muestran armazones bioimpresos en 3D con biotinta nanofibrilar de BC a) sin alginato, b) con alginato, c) con alginato, reticulada. Muestra una buena capacidad de impresión que se mejora aún más mediante la adición de alginato y la reticulación después de la impresión.

La FIGURA 5 es una imagen de una micrografía electrónica de barrido de una biotinta nanofibrilar de celulosa (NFC, por sus siglas del inglés cellulose nanofibrillar) obtenida de madera y CELLINK™ en un cartucho listo para la bioimpresión 3D. El tamaño de la microfibrilla es: anchura de aproximadamente 10 nm y longitud de más de 10 micrómetros. CELLINK™ en un cartucho listo para usar para bioimpresión.

Las FIGURAS 6A-B son imágenes que muestran respectivamente la bioimpresión 3D con la bioimpresora en 3D regenHU Discovery y biotinta NFC/alginato, y la fidelidad de impresión de biotinta de alginato puro y NFC/alginato, y la FIGURA 6C es un gráfico que muestra las propiedades reológicas del alginato y CELLINK™ basado NFC y alginato (80:20).

La FIGURA 7 es una imagen que muestra una excelente viabilidad celular cuando se mezclan condrocitos humanos con CELLINK™ y se hace bioimpresión 3D. El ensayo de vida-muerte se realizó 6 días después de la impresión.

Las FIGURAS 8A-C son imágenes que muestran órganos cartilaginosos en 3D impresos con CELLINK™, A) tráquea, B) menisco y C) oreja.

La FIGURA 9 es una imagen de microscopía confocal de condrocitos humanos en biotinta de NFC/alginato bioimpresa en 3D después de 30 días de cultivo.

La FIGURA 10 es un gráfico que muestra evidencia de la producción de neocartílago por condrocitos humanos en CELLINK™ bioimpresa en 3D después de 30 días de incubación. La presencia de colágeno II proporciona evidencia de la producción de cartílago.

La FIGURA 11 proporciona imágenes que muestran cómo se utiliza la tinta nanofibrilada de celulosa para bioimpresión 3D y órganos tubulares de soporte fabricados con colágeno.

Descripción detallada de diversas realizaciones de la invención

A continuación, se hará referencia con detalle a diversas realizaciones ilustrativas de la invención.

Las realizaciones de la presente invención se refieren a biomaterial en forma líquida (por ejemplo, dispersiones) definido como una biotinta que se puede utilizar para la bioimpresión 3D de armazones, tejidos y órganos. Más particularmente, las realizaciones de la invención incluyen un método para fabricar biotinta a partir de material de nanocelulosa y el uso de la biotinta con y sin células para bioimprimir armazones en 3D, modelos de cultivo celular en 3D, tejidos y órganos.

Las realizaciones de la invención incluyen productos de biotinta de nanofibrillas de celulosa preparados mediante los métodos descritos e incluyen el uso de los productos en operaciones de bioimpresión 3D. La celulosa se puede generar a partir de plantas (tales como plantas anuales), árboles, hongos o bacterias, con realizaciones preferidas generadas a partir de bacterias tales como de uno o más de los géneros Aerobacter, Acetobacter, Acromobacter, Agrobacterium, Alacaligenes, Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobium y/o Sarcina, específicamente Gluconacetobacter xylinus, Acetobacter xylinum, Lactobacillus mali, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, Sarcina ventriculi, Salmonella spp. de Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y varias especies de cyanobacteria.

La celulosa se puede generar a partir de cualquier especie de plantas vasculares, que incluyen aquellas dentro de los grupos Tracheophyta y Tracheobionta. Las nanofibrillas de celulosa formadas a partir de bacterias productoras de celulosa imitan más de cerca las características del colágeno que se encuentra en los tejidos blandos humanos y animales. El conjunto de fibrillas proporciona un material poroso pero duradero y flexible. Las nanofibrillas permiten que los nutrientes, el oxígeno, las proteínas, los factores de crecimiento y los proteoglucanos pasen a través del espacio entre las fibrillas, permitiendo que el armazón se integre con el implante y el tejido circundante. Las nanofibrillas también proporcionan la elasticidad y la fuerza necesarias para reemplazar el colágeno natural. Los materiales de celulosa bacteriana se han homogeneizado e hidrolizado, después de la purificación, para obtener una dispersión uniforme. La red 3D continua de la típica película de celulosa bacteriana se ha desintegrado y la longitud de las fibrillas se ha reducido a 10-100 micrómetros, mientras que la anchura de 30 nanómetros no se ha visto afectada (véanse las Figuras 1 y 2). Esta homogeneización mecánica combinada con hidrólisis químicas contribuyó a la formación de una dispersión estable y muy lisa sin obstrucción de la boquilla de la impresora. Las nanofibrillas de celulosa se han modificado ligeramente en la superficie con la adición de grupos sulfatados, lo que es ventajoso para unir los factores de crecimiento y estimular por tanto la diferenciación celular. La longitud reducida de las fibrillas permitió aumentar el contenido de sólidos en hasta un 5-8 % en peso. La dispersión tenía una viscosidad extremadamente alta a cizalla cero y una viscosidad de aproximadamente 10 Pa s a 100 s-1. Eso es lo que contribuyó a una buena capacidad de impresión. La dispersión de nanocelulosa se puede bioimprimir en 3D sin la adición de reticulante, como se puede observar en la Figura 4A. La adición de un reticulante tal como el alginato (al 20 % basado en la NC) se puede utilizar para mejorar la capacidad de impresión, pero también proporcionar estabilidad mecánica después de la reticulación con una solución de cloruro de calcio 100 mM (véanse las Figuras 4B y 4C). La biotinta de BC se ha purificado mediante un proceso de ultrafiltración y luego se ha diafiltrado con agua sin pirógenos. La osmolaridad se ajustó para las células disolviendo D-manitol y preparando una solución acuosa al 4,6 % de D-manitol (p/v).

Se seleccionaron nanofibrillas de celulosa obtenidas de madera como materia prima alternativa para la preparación de biotinta nanofibrilada de celulosa. La diferencia es que no forman una red tridimensional y su anchura es menor (10-20 nanómetros) y la longitud es menor (1-20 micrómetros). La desventaja de las nanofibrillas de celulosa obtenidas de madera puede ser la presencia de otros biopolímeros de madera, tales como las hemicelulosas, que pueden afectar a las células y provocar una reacción a cuerpo extraño. Por lo tanto, estas dispersiones deben purificarse preferentemente mediante un proceso de extracción y eliminación de la fase acuosa. Es un proceso sensible ya que puede conducir a la aglomeración de fibrillas, lo que puede dar como resultado biotinta que tiende a obstruir la boquilla de impresión de la bioimpresora en 3D. En la presente invención se utiliza homogeneización seguida de centrifugación y ultrafiltración para preparar biotinta a base de nanofibrillas de celulosa de madera. Se ha descubierto que las propiedades óptimas se consiguieron cuando se utilizaron dispersiones con un contenido de sólidos por encima del 2 % de materia seca.

La Figura 5 es una imagen de una micrografía electrónica de barrido de una biotinta nanofibrilar de celulosa (NFC) obtenida de madera y CELLINK™ en un cartucho listo para la bioimpresión 3D. El tamaño de las microfibrillas es: anchura de aproximadamente 10 nm y longitud de más de 10 micrómetros. La CELLINK™ se preparó mediante la adición de alginato al 20 % basado en la dispersión de NFC y la osmolaridad se ajustó preparando una solución acuosa de D-manitol (p/v) al 4,6 %.

Las FIGURAS 6A-C muestran la bioimpresión 3D con la bioimpresora en 3D regenHU Discovery y biotinta de NFC/alginato, la fidelidad de impresión de alginato puro y biotinta de NFC/alginato y las propiedades reológicas del alginato y CELLINK™ basado en NFC y alginato (80:20).

La FIGURA 7 muestra una excelente viabilidad celular cuando se mezclan condrocitos humanos con CELLINK™ y se hace bioimpresión 3D. El ensayo de vida-muerte se realizó 6 días después de la impresión.

Las FIGURAS 8A-C muestran órganos cartilaginosos en 3D tales como tráquea, menisco y oreja impresos con CELLINK™.

La FIGURA 9 muestra una imagen de microscopía confocal de condrocitos humanos en biotinta de NFC/alginato bioimpresa en 3D después de 30 días de cultivo. Las células han proliferado y están muy sanas como se puede observar por su forma.

La FIGURA 10 muestra evidencia de la producción de neocartílago por condrocitos humanos en CELLINK™ bioimpresa en 3D después de 30 días de incubación. La presencia de colágeno II es una evidencia de la producción de cartílago.

Otra ventaja de la biotinta nanofibrilada de celulosa es cuando se utiliza como material de soporte para la impresión de biotinta de colágeno o mediante la impresión de matriz extracelular como se muestra en la FIGURA 11. La biotinta de celulosa mantiene su forma 3D debido a sus propiedades extremas de adelgazamiento por cizalla. Esto permite imprimir un soporte en 3D complejo, que puede, después de la formación de colágeno o matriz extracelular, ser fácilmente eliminado.

Adicionalmente, las realizaciones pueden permitir la formación y difusión de proteoglucanos dentro de la estructura para proporcionar propiedades viscoelásticas. Los nutrientes, el oxígeno, las proteínas, los factores de crecimiento y los proteoglucanos pueden pasar y difundirse a través del espacio entre las fibrillas. Las realizaciones están diseñadas para permitir que las células permanezcan en la biotinta y sean capaces de sustentar la producción de matriz extracelular, lo que da como resultado la formación de tejido sin contracción.

Otra característica ventajosa de las realizaciones de la invención es que pueden ser no degradables (por ejemplo, tienden a no degradarse). La mayoría de los materiales de origen biológico son degradables, lo que significa que se descompondrán o deteriorarán con el tiempo, lo que puede ser problemático para su uso como modelos de enfermedades, para el cribado de fármacos o para la reparación de tejido blando. Un material biológico no degradable proporciona un armazón biológicamente compatible que tenderá a mantener la estructura y la función, o mantener la estructura y/o la función durante un período de tiempo deseado (tal como la duración de la prueba prevista). Además, las realizaciones proporcionan materiales con buenas propiedades mecánicas, propiedades que se desean para el uso de las construcciones como implantes.

Para facilitar una mejor comprensión de la presente invención, se proporcionan los siguientes ejemplos de determinados aspectos de algunas realizaciones.

Ejemplo 1: Preparación de biotinta de celulosa bacteriana (BC) y bioimpresión 3D.

Los biorreactores de bandeja se inocularon con Gluconacetobacter xylinus ATCC®700178. Se añadieron a cada bandeja una suspensión de 4x106 bacterias por ml y 25 ml de medios de cultivo estériles (descrito a continuación). Los volúmenes controlados de medios esterilizados se añadieron en cada incremento de 6 horas a la parte superior de la bandeja de tal manera que preferentemente no se alterara el cultivo de bacterias. Por ejemplo, la adición preferencial es utilizar micropulverización, en que los medios se añaden con una pulverización de baja presión, bruma, aspersión o goteo. Se calcula que la cantidad de medios añadidos es equivalente al menos a la cantidad que se espera que consuman las bacterias durante un período de tiempo de 6 horas. La composición del medio se puede variar para controlar la velocidad de producción de celulosa y la densidad de la red. Las bandejas se colocaron en una cabina de bacteriología y se permitió que las bacterias crecieran en estas condiciones semidinámicas durante 7 días a 30 °C. Las bacterias se eliminaron sumergiendo las películas en carbonato de sodio 0,1 durante la noche, seguido de 24 h en NaOH 0,1 M recién preparado calentado en un baño de agua a 60 °C. A continuación, las muestras se aclararon cuidadosamente con grandes cantidades de agua desionizada a 60 °C para eliminar los residuos bacterianos y neutralizar el pH utilizando ácido acético. Después del lavado, los armazones de BC se cortaron en armazones rectangulares (1x1 cm2).

Los ejemplos de medios adecuados para el crecimiento de bacterias incluyen, pero no se limitan a: medio Schramm-Hestrin que contiene, por litro de agua destilada, 20 g de glucosa, 5 g de bactopeptona, 5 g de extracto de levadura, 3,4 g de hidrogenofosfato disódico deshidratado y 1,15 g de monohidrato de ácido cítrico y que presenta un valor de pH de entre 6,0 y 6,3; té verde en polvo al 0,3 % en peso y sacarosa al 5 % en peso con el pH ajustado a 4,5 con ácido acético; Medio compuesto de (fructosa [al 4% en p/vol], extracto de levadura [al 0,5 % en p/v], (NH4)2SO4 [al 0,33 % en p/v], KH2PO4 [al 0,1 % en p/v], MgSO4^7H2O [al 0,025 % en p/v], licor de maíz macerado [al 2 % en v/v], solución de trazas de metales [1 % en v/v, (30 mg de EDtA, 14,7 mg de CaC^2H2O, 3,6 mg de FeSO4^7H2O, 2,42 mg de Na2MoO4^2H2O, 1,73 mg de ZnSO4^7H2O, 1,39 mg de MnSO4^5H2O y 0,05 mg de CuSO4^5H2O en 1 litro de agua destilada)] y solución de vitaminas [al 1 % en v/v (2 mg de inositol, 0,4 mg de HCl piridoxina, 0,4 mg de niacina, 0,4 mg de HCl tiamina, 0,2 mg de ácido para-aminobenzoico, 0,2 mg de calcio ácido D-pantoténico, 0,2 mg de riboflavina, 0,0002 mg de ácido fólico y 0,0002 mg de D-biotina en 1 litro de agua destilada)]) proporciona un buen crecimiento. Luego, las películas cortadas se desintegraron con un homogeneizador. La suspensión dio como resultado 371 g de pulpa de BC (el 1 % de contenido de celulosa) a la que se añadieron 220 g de ácido sulfúrico (el 98% puro) para iniciar el proceso de hidrólisis. La mezcla se colocó en un baño de aceite (60 °C) en un agitador durante 48 horas. Luego, se añadieron 1,1 litros de agua DI y se centrifugó a 3500 rpm durante aproximadamente 30 min. Después de la centrifugación, se decantó el agua y se añadieron 1,1 litros de agua DI y se centrifugó a 3500 rpm durante aproximadamente 30 min. Este procedimiento se repitió 3 veces. Después de la última centrifugación, se añadieron 1,1 litros de agua DI a la mezcla y se neutralizó con NaOH 0,1 M y se centrifugó a 3500 durante 30 min. Luego se decantó el agua y se añadieron 1,1 litros de agua a la mezcla. Se utilizó un homogeneizador IKA Ultra-turrax para la homogeneización. La mezcla homogeneizada se filtró con el uso de ultrafiltración usando membranas de celulosa de 30000 DA. La tinta de BNC filtrada/concentrada se colocó finalmente a 4 °C hasta su uso. El producto final se estima en alrededor de 70 ml de los 371 gr iniciales de pulpa de BNC. La red 3D continua de la típica película de celulosa bacteriana se ha desintegrado y la longitud de las fibrillas se ha reducido a 10-100 micrómetros, mientras que la anchura de 30 nanómetros se ha mantenido aproximadamente igual que antes del procesamiento (véanse las Figuras 1 y 2). Esta homogeneización mecánica combinada con hidrólisis químicas contribuyó a la formación de una dispersión estable y muy lisa sin obstrucción de la boquilla de la impresora. Es muy deseable que la boquilla de la impresora se obstruya poco o nada. Las nanofibrillas de celulosa se han modificado ligeramente en la superficie con la adición de grupos sulfatados, lo que es ventajoso para unir los factores de crecimiento y estimular por tanto la diferenciación celular. La longitud reducida de las fibrillas permitió aumentar el contenido de sólidos en hasta un 5-8 % en peso. La dispersión tenía una viscosidad extremadamente alta a cizalla cero y una viscosidad de aproximadamente 10 P a s a 100 s-1. Eso es lo que se cree que ha contribuido a una buena capacidad de impresión. La biotinta de BC se ha purificado mediante un proceso de ultrafiltración y luego se ha diafiltrado con agua sin pirógenos. La osmolaridad para la compatibilidad con células de mamífero se logró añadiendo D-manitol para preparar una solución de D-manitol (p/v) al 4,6 %. La esterilidad de la biotinta de BC se logró mediante esterilización en autoclave a 120 °C durante 30 minutos. La dispersión de nanocelulosa se puede bioimprimir en 3D sin la adición de reticulante, como se puede observar en la Figura 4A. La adición de un reticulante tal como el alginato (al 20% basado en la NC) mejora la capacidad de impresión, pero también proporciona estabilidad mecánica después de la reticulación con una solución de cloruro de calcio 100 mM (véanse las Figuras 4B y 4C).

Ejemplo 2: Preparación de biotinta a base de nanocelulosa obtenida de madera y bioimpresión 3D con condrocitos humanos.

La dispersión de nanofibrillas de celulosa (NFC) producida por refinamiento mecánico y tratamiento enzimático se utilizó como materia prima para la preparación de biotinta. Se determinó que la densidad de carga de las NFC era de 24 peq/g. La dispersión de las NFC se purificó usando ultrafiltración seguida de diafiltración con agua sin pirógenos. La dispersión de las NFC se homogeneizó adicionalmente usando un homogeneizador Ultra turrax y la concentración se llevó al 2,5 % mediante centrifugación (JOUAN CR 3i multifunción, Thermo Scientific) y eliminación del sobrenadante en exceso. La centrifugación se llevó a cabo a 4000 rpm durante 10-20 minutos hasta que se alcanzó la cantidad deseada de sobrenadante. Las NFC concentradas se mezclaron intensamente agitando con una espátula durante 10 minutos y se esterilizaron en autoclave (esterilizador de vapor Varioklav 135T, Thermo Scientific) en ajuste líquido, 120 °C durante 30 minutos. El procedimiento de esterilización alternativo se evaluó utilizando esterilización por haz de electrones (HE) a 25 kGy. No se observó ningún efecto sobre la viscosidad o la estabilidad de la dispersión de NFC mediante estos dos métodos de esterilización. El tamaño óptimo de las fibrillas de NFC que se utilizarán como biotinta se determinó utilizando MEB, véase la Figura 5. La anchura de las fibrillas era de entre 10 y 20 nanómetros y la longitud de aproximadamente 1 micrómetro. Sin embargo, hubo algunas fibrillas con una longitud de hasta 10 micrómetros. En realizaciones y para determinadas aplicaciones, es extremadamente importante que la dispersión de las NFC tenga una buena estabilidad y no contenga aglomerados que, de otro modo, pueden provocar la obstrucción de la boquilla de la impresora. La dispersión de las NFC se ajustó con respecto a la osmolaridad para la compatibilidad con células de mamífero añadiendo D-manitol para preparar una solución de D-manitol (p/v) al 4,6 %. A continuación, se mezcló la dispersión de NFC con alginato estéril en diversas relaciones. Se descubrió que la composición óptima era una relación de 80:20 entre las NFC y alginato. A continuación, dicha biotinta preparada se transfirió en condiciones asépticas en una cabina de FL a un cartucho de impresión estéril. La Figura 5 también muestra tal biotinta llamada CELLINK™ lista para usar para experimentos de bioimpresión 3D y la consistencia de la biotinta también se visualiza en la Figura 5. Las propiedades reológicas de las biotintas y sus componentes principales se analizaron utilizando el reómetro Discovery h R-2 (TA Instruments, RU) con placa Peltier. Todas las mediciones se realizaron a 25 °C y se dejó que las muestras alcanzaran la temperatura de equilibrio durante 60 s antes de cada medición. Para la determinación de la viscosidad se utilizó una placa cónica (40 mm, 1,99°). La viscosidad de cizalla se midió a velocidades de cizalla de 0,01 s_1 a 1000 s-1. Las propiedades reológicas se presentan en la Figura 6C. Se observa que CELLINK™ tiene una viscosidad de cizalla cero muy alta y es extremadamente adelgazante por cizalla. La viscosidad óptima para una buena fidelidad de forma está entre 1 y 50 Pas a 100 s-1. Esta velocidad de cizalla se espera en la boquilla de la bioimpresora en 3D utilizada en el presente estudio. La Figura 6C compara las propiedades de adelgazamiento por cizalla de CELLINK™ con el componente de alginato puro que no tiene una viscosidad de cizall cero tan alta. Esto se refleja en la fidelidad de impresión como se observa en la Figura 6B. La biotinta compuesta de alginato puro no muestra fidelidad de impresión. La biotinta se imprimió utilizando la bioimpresora en 3D 3D Discovery de regenHU (Suiza) como se observa en la Figura 6A. El cabezal de la impresora consistía en una microválvula con una boquilla de 300 pm que dispensaba la biotinta en dirección x, y y z. El caudal se controló controlando la velocidad de alimentación (10-20 mm/s), la presión (20-60 kPa), el tiempo de apertura de la válvula (400-1200 ps) y la distancia de dosificación (0,05- 0,07 mm). La CELLINK™ se ha mezclado en condiciones asépticas utilizando una cabina de FL con condrocitos del tabique nasal humanos. Se preparó CELLINK™ con 5 M de células por ml y se imprimieron armazones dispuestos en rejilla (6 x 5 mm, espaciado de línea de 1 mm, 5 capas) (30 kPa, velocidad de avance de 5 mm/s, distancia de dosificación de 0,07 mm, tiempo de apertura de la válvula de 1200 ps) con aproximadamente 300 K células por armazón. Después de la impresión, los armazones se reticularon en solución de CaCl2 90 mM durante diez minutos. Posteriormente se eliminó la solución de CaCh; los armazones se aclararon una vez en medio completo y posteriormente se mantuvieron en medio completo, que se reemplazó tres veces por semana. En el día 6, la tinción de vivo/muerto se realizó según las instrucciones del fabricante (Molecular probes/Life technologies, N.° R37601). La viabilidad se analizó calculando las células vivas y muertas en cinco imágenes de cada punto de tiempo. La Figura 7 muestra una excelente viabilidad celular (más del 70 %). Las rejillas, como se muestra en la Figura 6B, se diseñaron en el programa informático BioCAD proporcionado por regenHU. Se imprimieron estructuras 3D más complejas, un tubo para reemplazo traqueal, un menisco de oveja y una oreja humana mediante la conversión de archivos de estereolitografía (STL, por sus siglas del inglés Stereo lithography) en el código G utilizado por la bioimpresora en 3D Discovery. Las Figuras 8A-C muestran una excelente conservación de la forma cuando se imprimen estas complejas estructuras en 3D. Las muestras no se reticularon durante la impresión. Primero se reticularon después de imprimir colocando objetos en solución de CaCl290 mM durante diez minutos. Algunas de las rejillas impresas con condrocitos se incubaron durante 28 días. La Figura 9 muestra una distribución celular uniforme y una viabilidad celular excelente después de 28 días de cultivo en rejillas de CELLINK reticuladas. Las impresiones mantuvieron una buena integridad y buenas propiedades mecánicas. El análisis con rPCR, véase la Figura 10, muestra la producción de colágeno II y proteoglucanos, que aumentó después de 28 días, lo que es una evidencia del crecimiento de neocartílago en las rejillas bioimpresas en 3D con CELLINK.

Ejemplo 3: Impresión de soporte usando biotinta de nanocelulosa.

Para evaluar la capacidad de utilizar biotinta de nanocelulosa como soporte de estructuras complejas que podrían producirse con otros materiales tales como colágeno o matriz extracelular, se realizó el siguiente experimento. La tinta nanofibrilada de celulosa se formuló con un contenido de sólidos superior (por encima del 2,5 %) para proporcionar una viscosidad extremadamente alta. La estructura tubular interna para la aorta o la tráquea se imprimió usando biotinta de celulosa y luego la estructura tubular externa se imprimió con biotinta de celulosa. Después de cada 500 micrómetros, el colágeno se imprimió con otro cabezal de impresión entre los dos círculos. Se usó la tinta de colágeno, la biotinta de regenHU, y se reticuló usando UV. Este proceso continuó hasta que se logró la longitud deseada de tubo. La biotinta de celulosa no se reticuló y, por tanto, se pudo eliminar fácilmente después del proceso de impresión. Luego, este procedimiento se evaluó para imprimir con matriz extracelular que provenía de aorta descelularizada. La matriz extracelular autóloga se puede cargar con células autólogas y de esta manera se pueden imprimir tejidos y órganos listos para su implantación en el paciente. Esto se muestra en la Figura 11.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una biotinta a base de celulosa que comprende:

una dispersión de nanofibrillas de celulosa en un medio líquido, en donde las nanofibrillas de celulosa tienen una longitud de 1-100 micrómetros y una anchura de 10-30 nanómetros;

una viscosidad de entre 1 y 50 Pas a 100 s-1; y

un contenido de sólidos en el intervalo del 1-3 % en peso de la dispersión.

2. La biotinta a base de celulosa según cualquiera de la reivindicación 1, en donde las nanofibrillas de celulosa tienen una longitud promedio de 1-10 micrómetros y una anchura promedio de 10-20 nanómetros.

3. La biotinta a base de celulosa según cualquiera de la reivindicación 1, que comprende uno o más biopolímeros elegidos de colágeno o elastina.

4. La biotinta a base de celulosa según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además células.

5. La biotinta a base de celulosa según la reivindicación 4, en donde las células son células de mamífero.

6. La biotinta a base de celulosa según las reivindicaciones 4 o 5, en donde las células se eligen de fibroblastos bovinos, condrocitos humanos y células madre pluripotentes inducidas.

7. La biotinta a base de celulosa según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde las nanofibrillas de celulosa se eligen de uno o más de una pared celular primaria vegetal, una pared celular secundaria vegetal, algas, bacterias, hongos o animales, opcionalmente

i. en donde el material nanofibrilar de celulosa se obtiene de tunicados, o

ii. en donde la bacteria se elige de una o más de las Aerobacter, Acetobacter, Acromobacter, Agrobacterium, Alacaligenes, Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobium y/o Sarcina, y opcionalmente

iii. en donde la bacteria se elige de uno o más de Gluconacetobacterxylinus, Acetobacter xylinum, Lactobacillus mali, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium leguminosarum bv.trifolii, Sarcina ventriculi, Salmonella spp. de Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y especies de cianobacterias.

8. La biotinta a base de celulosa según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además D-manitol para ajustar la osmolaridad de la dispersión nanofibrilar de celulosa.

9. Un método para preparar una biotinta a base de celulosa como se define en las reivindicaciones 1-8, comprendiendo el método:

procesar material nanofibrilar de celulosa usando homogeneización mecánica y, opcionalmente, hidrólisis química y/o tratamiento enzimático para producir una dispersión nanofibrilar de celulosa;

purificar la dispersión nanofibrilar de celulosa usando ultrafiltración y, opcionalmente, centrifugación y/o eliminación de la fase acuosa;

esterilizar la dispersión nanofibrilar de celulosa para producir una biotinta a base de celulosa; y

ajustar la osmolaridad de la dispersión nanofibrilar de celulosa.

10. Una materia, tejido u órgano bioimpreso construido con una biotinta a base de celulosa según cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

11. La materia bioimpresa según la reivindicación 10, en donde la materia está bioimpresa en 3D y comprende rejillas impresas con biotinta de nanocelulosa con espacio dispuesto entre las rejillas para permitir la difusión de nutrientes, oxígeno, proteínas, factores de crecimiento y/o proteoglucanos, en donde la materia bioimpresa en 3D se prepara usando una biotinta según cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

12. Un método para construir una materia, tejido u órgano bioimpreso en 3D, comprendiendo el método:

(a) obtener una biotinta a base de celulosa según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, preparada según el método de la reivindicación 9;

(b) imprimir en 3D un material bioimpreso en 3D usando la biotinta a base de celulosa obtenida en (a).

13. El método según la reivindicación 12, en donde la materia bioimpresa en 3D se somete además a reticulación, en donde opcionalmente la reticulación comprende tratar la materia bioimpresa en 3D con alginato o ácido hialurónico, u opcionalmente

comprende tratar la materia bioimpresa en 3D con cloruro de calcio.

14. El método según cualquiera de la reivindicación 12 o 13, que comprende además tratar la materia bioimpresa en 3D con una resina reticulable por UV,

opcionalmente en donde la materia bioimpresa en 3D se trata con la resina reticulable por UV durante la impresión, u opcionalmente, en donde la materia bioimpresa en 3D se trata con la resina reticulable por UV después de la impresión.

15. Uso de la biotinta a base de celulosa de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, preparada según el método de la reivindicación 9, como soporte para la bioimpresión de colágeno, elastina o una matriz extracelular.

16. Uso de la biotinta a base de celulosa de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, preparada según el método de la reivindicación 9, para bioimprimir en 3D armazones, tejidos u órganos.

17. Uso de la biotinta a base de celulosa según la reivindicación 16 para bioimprimir en 3D con células o sin células, opcionalmente en donde las células son células humanas.

18. Uso de la biotinta a base de celulosa según cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, para aplicaciones de cultivo celular.

19. Uso de la materia, tejido u órgano bioimpreso de cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 para el descubrimiento de fármacos, la prueba de cosméticos, o el uso como modelo de enfermedades.

20. Un método para preparar un soporte para estructuras complejas adecuado para reforzar un tejido o un órgano de un ser humano o animal, comprendiendo el método:

(b) imprimir en 3D un material bioimpreso en 3D usando la biotinta a base de celulosa;

(c) siendo el material bioimpreso en 3D adecuado para reforzar el tejido u órgano.

21. El método de la reivindicación 20, en donde el material bioimpreso en 3D que es adecuado para reforzar el tejido u órgano está adaptado para implantarse en el ser humano o animal, y/o

i. adaptado para su uso en un método de cirugía plástica, o

ii. adaptado para su uso en un método de reparación de defectos del cartílago hialino, defectos del tejido cartilaginoso, defectos del tejido conjuntivo, defectos del tejido cardiovascular, defectos osteocondrales o defectos del tejido mamario, opcionalmente

en donde el tejido cartilaginoso es tejido cartilaginoso de una nariz, oreja, menisco o tráquea, o en donde el tejido conjuntivo es piel.

22. El método de la reivindicación 20 o 21, en donde el material bioimpreso es adecuado para proporcionar un órgano a un ser humano o animal que lo necesite, en donde en la etapa (b) el material bioimpreso en 3D es un órgano que comprende la biotinta a base de celulosa según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y el órgano bioimpreso en 3D es adecuado para implantarse en el ser humano o animal.