ES2883567T3

ES2883567T3 - Métodos y composiciones para el tratamiento de patologías del tejido de cartílago y disco

Info

Publication number: ES2883567T3
Application number: ES14839126T
Authority: ES
Inventors: Fackson Mwale; John Antoniou; Lisbet Haglund; Peter J Roughley; Rahul Gawri; Laura M Epure; Michael P Grant
Original assignee: Royal Institution for the Advancement of Learning
Current assignee: Royal Institution for the Advancement of Learning
Priority date: 2013-08-27
Filing date: 2014-08-27
Publication date: 2021-12-09
Anticipated expiration: 2034-08-27
Also published as: US20210079040A1; JP2016534117A; IL244282A0; EP3039032A4; MX2016002556A; CN105940011B; AU2014311219B2; AU2014311219A1; IL244282B; EP3039032B1; KR20160058109A; WO2015027322A1; JP6700182B2; CN105940011A; CA2957965A1; US10202420B2; EP3039032A1; AU2019201512A1; US20190375788A1; ZA201601963B

Abstract

Un polipéptido aislado que consiste en una secuencia seleccionada de DHLSDNYT (SEQ ID NO:2) y DHHSDNYT (SEQ ID NO:3).

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para el tratamiento de patologías del tejido de cartílago y disco

Campo

La divulgación se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento de trastornos de cartílago y disco y en particular a métodos y composiciones que usan fragmentos de Enlace N para el tratamiento de los trastornos de cartílago y disco tales como artritis y degeneración del disco intervertebral.

Antecedentes

Los discos intervertebrales (IVD, por sus siglas en inglés) se unen a las vértebras adyacentes dentro de la columna vertebral. Están compuestos del anillo fibroso periférico (AF, por sus siglas en inglés) y el núcleo pulposo central (NP, por sus siglas en inglés). El AF es un tejido fibroso con laminillas concéntricas rico en fibrillas de colágeno (1). El NP tiene una consistencia más amorfa, con fibrillas de colágeno que tienen una orientación aleatoria y un alto contenido de agrecano que le dan una apariencia gelatinosa y proporciona la capacidad de resistir las cargas de compresión. El agrecano es un proteoglucano grande con numerosas cadenas de glucosaminoglucanos (GAG) unidas a su proteína central, que en el NP proporciona las propiedades osmóticas necesarias para contrarrestar los efectos de la compresión.

Los mecanismos que contribuyen a los cambios degenerativos en el disco llevan a alteraciones bioquímicas en la composición y estructura de la matriz extracelular debido tanto a la reducción de la síntesis como al aumento de la degradación, siendo el agrecano particularmente susceptible al daño y pérdida proteolíticos. El envejecimiento, la mala nutrición, y las influencias biomecánicas (2-5), bioquímicas (6-10) y genéticas (11-14) se asocian con el aumento de la degeneración de los IVD. Durante la degeneración, se produce pérdida de contenido de GAG en el NP, cambiándolo de una estructura gelatinosa a una textura fibrosa, ya que se vuelve más colagenoso y aparecen fisuras tanto en el NP como el AF (15,16). Esto se asocia comúnmente con el dolor lumbar, posiblemente debido al crecimiento interno del nervio y la pérdida de altura del disco, lo que está facilitado por la disminución de proteoglucanos (17). Actualmente, no existe un tratamiento médico para degeneración de los IVD, lo que finalmente lleva a la extirpación quirúrgica del tejido dañado, la inserción de una jaula o prótesis para restaurar el espacio IVD, y la fusión del hueso vertebral como la única opción ofrecida. Si bien esto puede proporcionar relativamente buenos resultados clínicos a corto plazo (18) en el alivio del dolor, en muchos casos, también altera la biomecánica de la columna vertebral lo que lleva a la posterior degeneración del disco del nivel adyacente.

La reparación biológica de la degeneración de los IVD sería preferible a la extirpación quirúrgica.

La degeneración del disco comienza temprano en la vida y progresa con la edad (48, 49). Este proceso se caracteriza por un cambio fenotípico de las células residentes y genera el aumento de la producción de citocinas inflamatorias (50, 51). Una serie de citocinas se han relacionado con la degeneración del disco; IL-1p y TNF-a fueron los primeros descritos, pero se recientemente se han descrito candidatos adicionales, tales como iL-6 y IL-8 especialmente en modelos animales (17). Los estudios de discos humanos de especímenes degenerados/herniados mostraron, además de la IL-1p y TNF-a, niveles aumentados de IL-2, IL-4, IL-10, IL-12 e IL-17 en comparación con los controles sanos (52). El mecanismo exacto que conduce a un aumento de la producción de citocinas no está claro. Múltiples señales internas y externas podrían influir en la producción de citocinas, tales como la herencia, carga mecánica, oxigenación, o presencia de células inflamatorias (17). Además, la acumulación de productos específicos de la fragmentación de matriz de puede activar los receptores de tipo Toll y por lo tanto inducir la producción de citocinas.

Las citocinas inflamatorias son conocidas por inducir la producción de proteasa, que posteriormente lleva al fallo estructural y la pérdida de altura de IVD debido a la degradación de la matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés), que incluye agrecano y colágeno (53). Aunque las proteasas son responsables de la fragmentación y degradación de los componentes importantes de la ECM, también tienen un papel importante en la remodelación normal del disco. La actividad de catepsina K, junto con la proteólisis de agrecano por metaloproteinasa de matriz (MMP, por sus siglas en inglés), se ha sugerido que es principalmente un proceso de remodelación de tejido normal en el disco (54, 55). Sin embargo, las metaloproteinasas de matriz (MMP1, 2, 3, 7, 9, 13), agrecanasas (ADAMTS4, 5), y catepsinas (catepsinas D y L) están elevadas durante la degeneración del disco (56, 9). Además, la serina proteasa HTRA1, se considera que desempeña un papel central en la degeneración del disco ya que los niveles elevados de HTRA1 y su degradación de CHAD se correlacionaron con el grado de degeneración de los discos (10, 57).

La degradación de la proteína y el contenido de proteoglucanos del núcleo pulposo (NP) pueden producir la pérdida de altura del disco y la capacidad de carga de peso del disco. En las fases finales se producen las fisuras por degradación de disco en el anillo anular, lo que lleva a la extrusión de material de NP y el dolor debido a la compresión de los nervios. Una estrategia de reparación del disco degenerado doloroso requiere la producción de componentes de la ECM y regulación por disminución de la actividad de proteinasa en el medio inflamatorio. Estas propiedades se asocian a varios factores de crecimiento tales como TGF-p y BMP 7 (58-61). Sin embargo, el uso de factores de crecimiento en la práctica clínica está limitado por su alto coste y efectos secundarios potenciales.

La osteoartritis (OA) es un trastorno articular degenerativo crónico que afecta a millones de personas. Se caracteriza por la destrucción del cartílago articular debido a un desequilibrio en las actividades anabólicas y catabólicas de las actividades de los condrocitos. El cartílago articular es un tejido conectivo avascular, que cubre las partes óseas de las articulaciones diartrodiales permiten el movimiento sin fricción de la articulación, mediante la absorción y disipación de carga. Estas propiedades están relacionadas con la composición y la estructura de su matriz extracelular (ECM). Se compone de fibrillas de colágeno, proteoglucanos (predominantemente agrecano), proteínas no colágenas y un alto contenido de agua. El único tipo de célula en el cartílago articular es el condrocito, y es responsable de la síntesis y el mantenimiento de la matriz extracelular.

Durante la osteoartritis (OA), caracterizada por la degradación del cartílago articular y la inflamación de la membrana sinovial, este equilibrio se altera debido a un aumento de degradación de colágenos y proteoglucanos de la matriz y reducida síntesis de moléculas. El cartílago responde a una multitud compleja de factores autocrinos y paracrinos (anabólicos y catabólicos) que regulan la expresión génica y la síntesis de proteínas en los condrocitos.

La degradación de la matriz está mediada por metaloproteinasas de la matriz (MMP) y ADAMTS-4 y -5, inducidas por interleucina-1 beta (IL-1 p), la principal citocina implicada en OA. Otras citocinas que han sido implicados en la patogénesis de OA incluyen factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), IL-6, otras citocinas de cadena c comunes, tales como IL-2, IL-7, IL-15 e IL-21, y quimiocinas. Estos factores producidos por las células sinoviales y condrocitos producen la regulación por aumento de los miembros de la metaloproteinasa de matriz (MMP) y una desintegrina y metaloproteinasa con familias de enzimas de los motivos de trombospondina (ADAMTS). Las m Mp están implicadas en el recambio de ECM y la degeneración del cartílago. El envejecimiento, obesidad, y lesiones en las articulaciones están asociados a un aumento de OA. Se caracteriza por cambios celulares y moleculares progresivos en todos los tejidos de las articulaciones, que incluyen cartílago articular, hueso subcondral, sinovia, ligamentos y músculos periarticulares. Actualmente no existen terapias que reviertan o reparen la degradación del cartílago en pacientes con OA.

Existe un acuerdo general de que debido a que los procesos inflamatorios cumplen un papel fundamental en la patogénesis de diversas enfermedades reumáticas, tales como, OA y artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), la inhibición selectiva de las actividades inflamatorias es vital para la terapia y la familia de factores de transcripción NF-kB cumple un papel importante en este proceso. En consecuencia, varios estudios se han dirigido a la modulación farmacológica de las rutas NF-kB usando fármacos antiinflamatorios no esteroides, corticoides, nutracéuticos, terapia de ADN antisentido, interferencia de ARN y fármacos antirreumáticos.

El enlace N es una secuencia de 16 aminoácidos que ha demostrado aumentar la síntesis de proteoglucanos y la producción de otros componentes de la matriz por las células de los IVD (29, 34). También ha demostrado aumentar la altura del disco en un modelo de degeneración por punción del disco de conejo, lo que demuestra un potencial de regeneración también in vivo (31). Este péptido de origen natural representa la región N-terminal de la proteína de enlace que estabiliza los agregados de proteoglucanos tanto en el disco como en el cartílago, y se genera por las MMP durante el recambio de tejido in vivo. El enlace N interactúa con el receptor de la proteína morfogenética ósea (BMP) tipo II y activa la señalización de Smad1/5 en las células de los IVD de conejo cultivadas (33).

Se han probado los fragmentos del Enlace N. Wang et al. informaron que el efecto estimulador del Enlace N se perdió cuando se evaluó una serie de péptidos derivados de del enlace N más cortos (33) que incluye un péptido que abarca los restos de aminoácidos 1-12. Gawri 2013 Thesis, McGill University, Montreal sugieren que los péptidos del enlace N pueden ser un agente terapéutico potencial para la reparación biológica de discos intervertebrales humanos degenerados tempranamente. Hongxiang et al (1997) Archives of Biochemistry and Biophysics 378, 1, 116-122 y Hongxiang et al (2000) Biochemical Society Transactions 25, 427S sugieren que los péptidos N-terminales de las proteínas del enlace pueden estimular la síntesis de proteoglucanos de cartílago y la biosíntesis de colágeno por el cartílago articular humano.

Sumario

Un aspecto de la invención proporciona un polipéptido aislado que consiste en una secuencia seleccionada de DHLSDNYT (SEQ ID NO:2) y DHHSDNYT (s Eq ID NO:3). En otras realizaciones, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de la invención, un vector que comprende el ácido nucleico aislado de la invención y una célula recombinante que expresa el polipéptido de la invención, preferentemente en donde la célula recombinante es una célula de linaje de condrocitos, una célula madre o una célula discal. En otras realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el polipéptido aislado de la invención y un vehículo, resto estabilizante o diluyente farmacéuticamente aceptable, preferentemente en donde la composición farmacéutica comprende además un andamio formado por un material biocompatible que comprende el polipéptido aislado de la invención.

En otras realizaciones, la invención proporciona un método in vitro de inducir la síntesis de matriz en una célula de cartílago y/o discal o en un tejido que comprende una célula de cartílago y/o discal, comprendiendo el método incubar/cultivar la célula de cartílago y/o discal con una cantidad eficaz del polipéptido aislado de la invención en condiciones para inducir la síntesis de proteoglucano, produciendo una célula de cartílago y/o discal inducida con síntesis de matriz aumentada.

En otras realizaciones, la invención proporciona un polipéptido aislado de la invención para su uso en un método de inducir la síntesis de matriz en una célula de cartílago y/o una célula discal o en un tejido que comprende una célula de cartílago y/o una célula discal, comprendiendo el método incubar/cultivar la célula de cartílago y/o la célula discal con una cantidad eficaz del polipéptido aislado de la reivindicación ¹en condiciones para inducir la síntesis de proteoglucano, produciendo una célula de cartílago y/o una célula discal inducida con síntesis de matriz aumentada. En otras realizaciones, la invención proporciona un método para producir tejido de cartílago y/o discal para implantarse en un sujeto, comprendiendo el método incubar/cultivar una célula de cartílago y/o una célula discal in vitro en una cantidad eficaz del polipéptido aislado de la invención en condiciones para inducir la síntesis de proteoglucano, produciendo una célula de cartílago y/o discal inducida con síntesis de matriz aumentada; y aislar una población sustancialmente pura de células de cartílago y discales inducidas.

También se proporciona el polipéptido aislado de la invención para su uso en un método para aliviar un síntoma y/o tratar un trastorno de cartílago y/o disco, en donde el uso comprende administrar a un sujeto que lo necesite el polipéptido aislado de la invención, o la célula recombinante de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, opcionalmente en donde el trastorno de cartílago y/o disco es degeneración de discos intervertebrales o una enfermedad inflamatoria o degenerativa de las articulaciones y opcionalmente en donde la enfermedad inflamatoria o degenerativa de las articulaciones comprende una afección de artritis, osteogénesis indeseable y/o calcificación.

Un aspecto de la divulgación incluye un polipéptido aislado que comprende un péptido seleccionado de:

i) DHX¹SDNYT, en donde X¹es L o H (SEQ ID NO:1);

ii) una variante conservativa de i)

iii) un fragmento de i) o ii);

en donde la variante conservativa y/o fragmento retiene la actividad biológica y el péptido tiene 15 o menos aminoácidos.

En una realización de la divulgación, el polipéptido aislado comprende una secuencia peptídica que consiste en: 1) DHLSDNYT (SEQ ID NO:2); y/o una variante conservativa del mismo que retiene actividad biológica o 2) DHHSDNYT (SEQ ID NO:3) o una variante conservativa del mismo que retiene actividad biológica

En otra realización de la divulgación, el polipéptido aislado comprende un péptido seleccionado de:

i) DHX¹SDNYTX²DHDRX³I, en donde X¹es Lo H, X²es L o V y X³es A o V (SEQ ID NO: 4);

ii) una variante conservativa de i); y

iii) un fragmento de i) o ii)

en donde la variante conservativa y/o fragmento retiene la actividad biológica.

Otro aspecto incluye un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende un péptido del fragmento del enlace N.

Un aspecto adicional incluye un vector que comprende 1) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un péptido del fragmento del enlace N; o 2) un polipéptido del fragmento del enlace N.

Un aspecto adicional es una célula recombinante que expresa un polipéptido que comprende un péptido del fragmento del enlace N.

Aún otro aspecto es una composición que comprende un polipéptido que comprende un polipéptido del fragmento del enlace, una célula recombinante que expresa un polipéptido que comprende un péptido del fragmento del enlace N. También se describen los métodos para preparar y usar dichos productos.

Breve descripción de los dibujos

Una realización de la presente divulgación se describirá a continuación con respecto a los dibujos en los que:

Figura 1: Síntesis de proteoglucano por las células del disco bovinas o humanas. La síntesis se estimó mediante la evaluación de la incorporación de 35SO⁴, después de 48 h en presencia del Enlace N (1 jg/ml), S-Enlace N mezclado (1 jg/ml), R-Enlace N invertido (1 jg/m l) o medio sin suplementación con péptido. La expresión de proteoglucanos relativa se muestra en células del núcleo pulposo (NP) y anillo fibroso (AF) bovinas (a), y en células de núcleo pulposo (NP) y anillo fibroso interno (iAF) humanas (b). Los datos se expresan como una media SD, de la relación relativa a la incorporación por las células control expuestas al medio solo (n=3). Los valores en donde p< 0,05 (*) se tomaron como significativos.

Figura 2: Estabilidad del Enlace N en medio de cultivo. El Enlace N se incubó durante 48 h a 37 °C, 5 % CO2 en medio de cultivo y la intensidad del pico del péptido intacto fue seguido por espectrometría de masas. Las alícuotas se analizaron a 6, 12, 24, 36 y 48 h. Los datos se grafican como relación relativa a la intensidad de señal a tiempo 0. El gráfico es uno de tres experimentos representativos.

Figura 3: Estabilidad del Enlace N en presencia de células. El Enlace N se incubó durante 48 h a 37 °C, 5 % CO²en presencia de células humanas de NP (a) o AF (b), y la del pico del péptido intacto fue seguido por espectrometría de masas. Las alícuotas se analizaron a 6, 12, 24, 36 y 48 h. Los datos se grafican como relación relativa a la intensidad de señal a tiempo 0. El gráfico es uno de tres experimentos representativos realizados con células de tres dadores diferentes.

Figura 4: Espectrometría de masas del Enlace N procesado. (a) Espectro de masas de los péptidos detectados en medio de células humanas de NP (negro) y AF (gris). El Enlace N fragmentado con una masa de 964,4 Da se indica en el gráfico. El péptido 964,4 Da se eluye de la columna es 2 regiones diferentes, con tiempos de retención de alrededor de 23 y 32 min. (b) La ilustración esquemática de los dos posibles fragmentos del Enlace N de 964,4 Da, Enlace N 1-8 (destacado en gris oscuro) y Enlace N 4-11 (destacado en gris claro). (c) La secuencia de aminoácidos del fragmento de 964,4 Da generado se identificó por MS en tándem. La secuencia se confirmó mediante la evaluación de los productos de fragmentación generados del péptido. Los picos detectados mayores son A [(845,3Da) DHLSDNY (SEQ ID NO:19) (+1)], B [(682,28Da) DHLSDN (SEQ ID NO:20) (+1)] y C [(568,2Da) DHLSD (SEQ ID NO:21) (+1)], masas que solo pueden ser generadas por la secuencia 1-8.

Figura 5: Síntesis de proteoglucano por las células humanas y bovinas en respuesta a los fragmentos del Enlace N. La síntesis se estimó mediante la evaluación de la incorporación de 35SO⁴después de 48 h en presencia del Enlace N (1 jg/ml), Enlace N 1-8 (0,5 jg/ml), Enlace N 9-16 (0,5 jg/m l) o medio sin suplementación con péptido. La expresión de proteoglucanos relativa se muestra en células del núcleo pulposo (NP) y anillo fibroso (AF) bovinas (a), y en células de núcleo pulposo (NP) y anillo fibroso interno (iAF) (b). Los datos se expresan como una media SD, de la relación relativa a la incorporación por las células control expuestas al medio solo (n=3). Los valores en donde p< 0,05 (*) se tomaron como significativos.

Figura 6: Exposición del Enlace 1-16 a la proteinasas descritas implicadas en la degeneración del disco. El Enlace 1-16 se expuso a MMP 3, 7, 12, 13, Catepsinas L, K, y B, ADAMTS 4, 5 y HTRA1 y la intensidad del área del pico se cuantificó mediante espectrometría de masas. A, Intensidad relativa del péptido del Enlace N 1-16 intacto. B, Intensidad relativa del péptido del Enlace N 1-8, C Intensidad relativa del péptido del Enlace N 9-16.

Figura 7: Síntesis de proteoglucano por las células humanas y bovinas en respuesta a los fragmentos del Enlace N en un ambiente inflamatorio. La síntesis se estimó mediante la evaluación de la incorporación de 35SO⁴después de 48 h en medio que contiene IL-1, suplementado con Enlace N (1 jg/ml), Enlace N 1-8 (0,5 jg/ml), Enlace N 9 16 (0,5 jg/m l) o medio sin suplementación con péptidos. La expresión de proteoglucanos relativa se muestra en las células del núcleo pulposo (NP) y anillo fibroso (AF) bovinas (A), y núcleo pulposo (NP) y anillo fibroso interno (iAF) humanas (B). Los datos se expresan como media SD, de la relación relativa a los proteoglucanos producidos por las células expuestas al medio que contiene IL-1 (n=3). Los valores en donde p< 0,05 (*) se tomaron como significativos.

Figura 8: Concentración de proteoglucano (GAG) en cartílago osteoartrítico humano (OA) en respuesta al Enlace N en un ambiente inflamatorio. Las concentraciones de proteoglucano se determinaron en explantes de cartílago OA incubados durante 21 días con Enlace N (1 Mg/ml), medio que contiene IL-1 (5 ng/ml), coexpuestos al Enlace N y IL-1, o medio sin suplementación con péptidos (control). Los resultados se presentan como el porcentaje de g Ag retenido en el cartílago, normalizado al control. Los valores en donde p< 0,05 (*) se tomaron como significativos.

Figura 9: Análisis de proteína nuclear de agrecano y colágeno tipo II recién sintetizado en cartílago osteoartrítico humano. (A) La inmunotransferencia de la proteína nuclear de agrecano (AGG) en el cartílago tratado con control, Enlace N, IL-1 y con Enlace N e IL-1 y el análisis semi-cuantitativo de la proteína nuclear de agrecano intacta con un peso molecular de aproximadamente 320 kDa. (B) La inmunotransferencia del colágeno tipo II (Col II) en cartílago tratado con control, Enlace N, IL-1 y Enlace N e IL-1 y el análisis semi-cuantitativo de colágeno con un peso molecular de 360 kDa. Los resultados se representan como media ± SD de cuatro muestras de cartílago de diferentes donantes (* p<0,05).

Figura 10: Análisis de MMP-13 y expresión de colágeno tipo X (Col X) en cartílago osteoartrítico humano. (A) La inmunotransferencia de MMP-13 en cartílago tratado con control, Enlace N, IL-1 y Enlace N e IL-1 y el análisis semi-cuantitativo de la proteína MMP-13 con un peso molecular de 55 kDa. (B) La inmunotransferencia del colágeno tipo X en cartílago tratado con control, Enlace N, IL-1 y Enlace N e IL-1 y el análisis semi-cuantitativo de cadenas alfa de colágeno con un peso molecular de 60 kDa. Los resultados se representan como media ± SD de cuatro muestras de cartílago de diferentes donantes (*p<0,05).

Figura 11: Análisis de NFkB en condrocitos de OA y donantes normales suplementados con Enlace N en un ambiente inflamatorio. El análisis de transferencia Western de NFkB en condrocitos control, tratados con Enlace N, tratados con IL-1, Enlace N (10 ng/ml) IL-1, Enlace N (100 ng/ml) IL-1 y Enlace N (1000 ng/ml) IL-1. Los resultados se representan como media ± SD de tres experimentos de diferentes donantes (* p<0,05). Los resultados demuestran que la activación inducida por IL-1 de NF-kB se suprime de forma dependiente de la dosis mediante el Enlace N en condrocitos humanos normales (A) y condrocitos OA (B).

Figura 12: Concentración de proteoglucanos en los discos. Las concentraciones de proteoglucano se determinaron en los discos con degeneración inducida, discos tratados con Enlace N, MSC, Enlace N y MSC, y discos control sin degeneración. Los resultados se representan como media ± SD de siete discos de diferentes colas bovinas. (* p<0,05)

Figura 13: Distribución de tamaño de los proteoglucanos en los discos. Los proteoglucanos aislados de siete discos con diferentes tratamientos se mezclaron y analizaron por electroforesis en gel de agarosa. El proteoglucano se visualizó mediante tinción con azul de toluidina.

Figura 14. Análisis de proteína nuclear de agrecano en los discos. Inmunotransferencia y el análisis semicuantitativo de la proteína nuclear de agrecano intacta con un peso molecular de aproximadamente 320 kDa en discos de control de degeneración, tratados con Enlace N, tratados con MSC, tratados con Enlace N y MSC y control sin degeneración. Los resultados se representan como media ± SD de siete discos de diferentes colas bovinas. (* p<0,05)

Figura 15. Análisis de colágeno tipo II recién sintetizado en los discos. Inmunotransferencia y el análisis semicuantitativo de las cadenas alfa de colágeno tipo II con un peso molecular de 120 kDa en discos de control de degeneración, tratados con Enlace N, tratados con MSC, tratados con Enlace N y MSC y control sin degeneración. Los resultados se representan como media ± SD de siete discos de diferentes colas bovinas. (* p<0,05)

Figura 16: Distribución de proteoglucanos en la región de núcleo pulposo de los discos. Los discos con degeneración inducida por tripsina se cultivaron durante 14 días después de la inyección con: Enlace N, MSC o Enlace N y MSC. Estos se compararon con discos de control de la degeneración y control sin degeneración. Los discos se evaluaron por histología usando tinción Safranina O (barra de escala, 100 pm).

Figura 17: Marcación y seguimiento de las MSC. A. las membranas celulares de MSC se marcaron utilizando el kit de PKH67 (fluorescencia verde, flecha) y se evaluó la eficiencia de la marcación mediante microscopía de fluorescencia. B. Las MSC marcadas se cultivaron en medio de expansión durante dos días y se verificó la marcación mantenida usando microscopía de fluorescencia. C. La presencia de MSC marcadas se determinó en la región NP después de 14 días en cultivo de órganos. D. Aumento de C.

Figura 18: Efecto del Enlace N 1-8 en la síntesis de proteoglucanos, agrecano y la expresión de colágeno tipo II en cultivo de órganos de disco bovino a las 2 semanas después de la degeneración inducida por la tripsina. (A) Se determinó la concentración de proteoglucanos en los discos a las 2 semanas después del tratamiento en los discos con degeneración inducida, discos con degeneración inducida y tratados con Enlace N 1-8, y discos de control no degenerados. Los resultados se representan como media ± Sd de tres discos de diferentes colas bovinas. (* p<0,05). (B) Inmunotransferencia y análisis semi-cuantitativo de colágeno tipo II recién sintetizado con un peso molecular de aproximadamente 360 kDa a las 2 semanas después del tratamiento en los discos con degeneración inducida, discos con degeneración inducida y tratados con Enlace N 1-8, discos de control no degenerados y los discos no degenerados tratados con enlace N 1-8. Los resultados se representan como media ± SD de siete discos de diferentes colas bovinas. (* p<0,05). (C) Inmunotransferencia y análisis semi-cuantitativo de proteína nuclear de agrecano intacta con un peso molecular de aproximadamente 320 kDa a 2 semanas después del tratamiento en discos con degeneración inducida, discos con degeneración inducida y tratados con Enlace N 1-8, discos control no degenerados y discos no degenerados tratados con Enlace N 1-8. Los resultados se representan como media ± SD de siete discos de diferentes colas bovinas. (* p<0,05).

Figura 19: Ilustración esquemática de la proteína del enlace que estabiliza la interacción entre el dominio G1 de agrecano y hialuronato. La proteína del enlace (LP) es estabilizante de la interacción entre el dominio G1 de agrecano y hialuronato (HA). La figura también representa el Enlace N humano [DHLSDNYTLDLDRAIH (SEQ ID NO:32)] y Enlace N bovino [DHHSDNYTVDHDRVIH (SEQ ID NO;5)], las partes N-terminales de la proteína de enlace, y destaca la sustitución de restos (marcada en negrita), como ocurre en la secuencia bovina.

Figura 20: Viabilidad celular de las células del disco intervertebral bovino cultivadas en alginato suplementado con Enlace N humano o bovino. La viabilidad celular se midió usando el ensayo de viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD ®. Las células del disco intervertebral bovino (IVD) embebidas en alginato se incubaron durante 18 días en los medios suplementados con 1 ug/ ml de Enlace N bovino (BLN) o humano (HLN). Se usaron perlas de vidrio cultivadas en medio solo durante el mismo periodo de tiempo como control (CTL). Después de 18 días, se recolectaron las perlas y se evaluó la viabilidad celular. La viabilidad celular para todas las cuentas se evaluó a > 98 % (puntos luminosos blancos).

Figura 21: Liberación de glucosaminoglucano acumulativa en el medio de cultivo por las células del núcleo pulposo bovino en perlas con alginato al 1,2 %. Las células del núcleo pulposo (NP) bovinas en perlas con alginato 1,2 % se cultivaron en medio suplementado con Enlace N bovino (BLN) o humano (HLN) (1 pg/ml) o expuesto al medio solo (CTL). Para cada condición, los medios se recolectaron a 3, 6, 9, 12, 15, y 18 días de cultivo. La liberación de sulfato de glucosaminoglucano (GAG) en los medios se midió mediante el ensayo de unión del colorante azul de 1,9-dimetilmetileno (DMMB). Los resultados se presentan como gráfico de caja en la que la caja representa el 50 % del medio (25 % -75 % percentil) de los datos combinados de tres experimentos independientes realizados por triplicado (*p < 0,05 o ***p < 0,0001).

Figura 22: Liberación de glucosaminoglucano acumulativa en el medio de cultivo por las células del anillo fibroso bovino en perlas con alginato al 1,2 %. Las células del anillo fibroso (AF) bovinas en perlas con alginato 1,2 % en medio suplementado con Enlace N bovino (BLN) o humano (HLN) (1 pg/ml) o expuesto al medio solo (CTL). Para cada condición, los medios se recolectaron a 3, 6, 9, 12, 15, y 18 días de cultivo. La liberación de sulfato de glucosaminoglucano (GAG) en los medios se midió mediante el ensayo de unión del colorante azul de 1,9-dimetilmetileno (DMMB). Los resultados se presentan como gráfico de cajas en donde la caja representa el 50 % del medio (25 % -75 % percentil) de los datos combinados de tres experimentos independientes realizados por triplicado (*p < 0,005 o ***p < 0,0001).

Figura 23: Cambios en la expresión del gen de agrecano. Cambios en la expresión del gen de agrecano (AGG) de las células bovinas de anillo fibroso (AF) y núcleo pulposo (NP) en perlas con alginato al 1,2 % a 1 semana después de la incubación en medio suplementado con 1 pg/ml del Enlace N bovino (BLN) o humano (HLN). Se midió la expresión del gen por RT-PCR. Se usó ARNr 18S como un gen constitutivo y sirvió para normalizar lo resultados. Los valores se expresan como una relación de la expresión del gen de las células expuestas en el Enlace N con respecto a la de las células expuestas al medio solo (CTL). (*p < 0,05, **p < 0,001).

Figura 24: Cambios en la expresión del gen de ADAMTS-4 y ADAMTS-5 agrecano. Cambios en la expresión del gen de (A, B) ADAMTS-4 y (C, D) ADAMTS-5 de las células bovinas de anillo fibroso (AF) y núcleo pulposo (NP) en perlas con alginato al 1,2 % a 1 semana y 2 semanas después de la incubación en medio suplementado con 1 pg/ml del Enlace N bovino (BLN) o humano (HLN). Se midió la expresión del gen por RT-PCR. Se usó ARNr 18S como un gen constitutivo y sirvió para normalizar lo resultados. Los valores se expresan como una relación de la expresión del gen de las células expuestas en el Enlace N con respecto a la de las células expuestas al medio solo (CTL). (*p < 0,05, **p < 0,001).

Figura 25: El efecto de Enlace N bovino o humano sobre la activación de Smad1/5 en las células bovinas del anillo fibroso y núcleo pulposo. Las células bovinas del anillo fibroso (AF) y núcleo pulposo (NP) se cultivaron durante 6 h en medio suplementado con 1 pg/ml de Enlace N bovino (BLN) o humano (HLN). La expresión de proteínas se analizó por inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos contra Smad1 total y fosfo-Smad1/5. Los resultados cuantitativos que representan los datos combinados de tres experimentos independientes realizados por triplicado se presentan como media ± desviación estándar (*p < 0,05; **p<0,01; fp < 0,001; §p < 0,0001). Las bandas en geles se muestran para un experimento representativo.

Figura 26: El efecto del Enlace N bovino o humano sobre la activación de Smad2 en las células bovinas del anillo fibroso y núcleo pulposo. Las células bovinas del anillo fibroso (AF) y núcleo pulposo (NP) se cultivaron durante 6 h en medio suplementado con 1 pg/ml de Enlace N bovino (BLN) o humano (HLN). La expresión de proteínas se analizó por inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos contra total y fosfo-Smad2. Los resultados cuantitativos que representan los datos combinados de tres experimentos independientes realizados por triplicado se presentan como media ± desviación estándar (*p < 0,05). Las bandas en geles se muestran para un experimento representativo.

Figura 27: Expresión de NGF en discos humanos de grados 2 a 4 (regiones AF y NP) con degeneración. La figura es una serie de tinciones de tejido y una inmunotransferencia que muestra que la expresión de NGF en IVD humano aumenta con la degeneración.

Figura 28: El Enlace N suprime la expresión estimulada con TNFa de la neutrofina (NGF y BDNF) y Sustancia P (TAC1) en la célula de anillo fibroso (AF). Las células de AF de los discos humanos de grado 2 se estimularon 24 h con Enlace N (1 pg/ml) TNFa (100 ng/ml) o TNFa (100 ng/ml) solo. Los resultados se muestran como medias ± S.D. de cuatro experimentos independientes con cuatro donantes diferentes. * p<0,05 frente a control.

Figura 29: El Enlace N suprime la expresión estimulada con IL-1p de la neutrofina (NGF y BDNF) y Sustancia P (TAC1) en la célula de anillo fibroso (AF). Las células de AF de los discos humanos de grado 2 se estimularon 24 h con Enlace N (1 |jg/ml)+) IL-1p (10ng/ml) o IL-1p (10ng/ml) solo. Los resultados se muestran como medias ± S.D. de cuatro experimentos independientes con cuatro donantes diferentes. * p<0,05 frente a control.

Figura 30: El Enlace N suprime la expresión estimulada con TNFa de los receptores de neutrofina (TRKA y TRKB) y sustancia P (TAC1R). Los cambios en expresión del gen de neutrofina y Sustancia P por anillo fibroso (AF) de los discos humanos de grado 2 se estimularon 24 h con suplementación de Enlace N (1 jg/m l) TNFa (100 ng/ml) o TNFa (100 ng/ml) solo. Los resultados se muestran como medias ± S.D. de cuatro experimentos independientes con cuatro donantes diferentes. * p<0,05 frente a control.

Figura 31: El Enlace N suprime la expresión estimulada con Il-1beta de los receptores de neutrofina (TRKA y TRKB) y sustancia P (TAC1R). Los cambios en expresión del gen de neutrofina y Sustancia P por anillo fibroso (AF) de los discos humanos de grado 2 se estimularon 24 h con suplementación de Enlace N (1 jg/ml)+ IL-1p (10 ng/ml) o IL-1p (10 ng/ml) solo. Los resultados se muestran como medias ± S.D. de cuatro experimentos independientes con cuatro donantes diferentes. * p<0,05 frente a control.

Figura 32: Análisis de la expresión del gen de NGF y liberación en el media de las células AF incubadas con el Enlace N. Las transferencias Western y el análisis semi-cuantitativo de la proteína NGF con un peso molecular de aproximadamente 27kDa en células Af de grado 4 tratados con el Enlace N, IL-1p, o Enlace N y IL-1p. Los resultados se representan como media ± SD de 4 discos de diferentes donantes (* p<0,05).

Figura 33: es una fotografía de un IVD coccígeo bovino y un gráfico que demuestra que Enlace N reduce la liberación de la sustancia P del IVD bovino lesionado. Los cambios en la liberación de sustancia P por los discos de la bovinos 4 o 24 horas después de ser tratados con suplementación de capsaicina, solo perforado o perforado Enlace N (10 jg/ml). Los resultados se muestran como medias ± S.D. de cuatro experimentos independientes. *p<0,05 frente a control.

Descripción detallada de la divulgación

I. Definiciones

La expresión "célula de cartílago" como se usa en el presente documento significa células del linaje de condrocitos, por ejemplo que se encuentran en el tejido del cartílago y que pueden usarse para producir tejido de cartílago.

La expresión "células de linaje de condrocitos" como se usa en el presente documento significa las células de condrocitos y células que son bioquímicamente similar y expresan marcadores de condrocitos, que incluyen, por ejemplo Sox9 y colágeno II, y se comportan como células de condrocitos. Las células de condrocitos pueden ser condrocitos del linaje del cartílago articular o condrocitos de linaje hipertrófico que son capaces de hipertrofia.

La expresión "tejido de cartílago" como se usa en el presente documento significa tejido de cartílago y el tejido que es histológicamente similar y expresa marcadores de cartílago, por ejemplo de colágeno II y agrecano, y se comporta como el cartílago, incluyendo tejido de cartílago articular y/o tejido tipo cartílago de la placa de crecimiento.

La expresión "variante conservativa" como se usa en el presente documento significa un fragmento de polipéptido del Enlace N que comprende una o más sustituciones conservativas de los aminoácidos.

Una "sustitución conservativa de aminoácidos" como se usa en el presente documento, es una en la que un resto de aminoácido se reemplaza por otro resto de aminoácido sin anular las propiedades deseadas del péptido. Las sustituciones conservativas de aminoácidos adecuadas pueden obtenerse mediante la sustitución de aminoácidos con hidrofobicidad, polaridad, y longitud de la cadena de R similares por otro. Los ejemplos de sustitución conservativa de aminoácidos incluyen:

El término "cultivo" como se usa en el presente documento significa la incubación y/o pases de células en una suspensión adherente de cultivo de células y/u órganos 3D. El cultivo de células u órganos 3D puede comprender un cultivo en el que se cultivan las células en o sobre un andamio tridimensional.

La expresión "célula de disco", como se usa en el presente documento significa células del linaje de células de NP o AF.

Los términos "enriquecimiento" o "enriquecido" como se usan en el presente documento significan que la producción (fracción) de células de un tipo está aumentada en al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 % o al menos aproximadamente el 60 % respecto de la fracción de células del mismo tipo en el cultivo o preparación inicial. El enriquecimiento y purificación parcial pueden usarse de modo indistinto.

La población de células puede enriquecerse mediante diferentes métodos tales como los métodos basados en marcadores tales como marcadores de superficie celular (por ejemplo, separación FACS etc.).

Como se usa en el presente documento, el término "expresar" se refiere a la transcripción de un polinucleótido o traducción de un polipéptido en una célula, de tal manera que los niveles de la molécula son considerablemente más altos en una célula que ha puesto en contacto con o expuesto a la molécula (por ejemplo, el fragmento de Enlace N) de lo que son en una célula que no se puesto en contacto o expuesto a la molécula. Los métodos para medir la expresión de una molécula se conocen por los expertos habituales en la materia, e incluyen, sin limitación, transferencia Northern, RT-PCR, hibridación in situ, transferencia Western e inmunotinción tal como FACS.

El término "hibridar" se refiere a la interacción de unión no covalente específica de secuencia con un ácido nucleico complementario. La hibridación se lleva a cabo en condiciones al menos moderadamente rigurosas. En una realización preferida, la hibridación es en condiciones de alta rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación son conocidas por los expertos en la materia, o pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 6.3.6. Por ejemplo, puede emplearse 6,0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C durante 15 minutos, seguido de un lavado de 2,0 x SSC a 50 °C durante 15 minutos. La rigurosidad puede seleccionarse basándose en las condiciones usadas en la etapa de lavado. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado puede seleccionarse a partir de una alta rigurosidad de aproximadamente 0,2 x SSC a 50 °C durante 15 minutos. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede ser en condiciones de alta rigurosidad, aproximadamente 65 °C durante 15 minutos.

Por " condiciones de hibridación al menos moderadamente rigurosas" se entiende que que se seleccionan condiciones que promueven la hibridación selectiva entre dos moléculas de ácido nucleico complementarias en solución. La hibridación puede producirse en la totalidad o una porción de una molécula de la secuencia de ácidos nucleicos. La porción de hibridación es típicamente al menos 15 (por ejemplo 20, 25, 30, 40 o 50) nucleótidos de longitud. Los expertos en la materia reconocerán que la estabilidad de un dúplex o híbridos de ácido nucleico, se determina por la Tm, que en los tampones que contienen sodio es una función de la concentración de iones de sodio y la temperatura (Tm = 81,5 °C -16,6 (Log10 [Na+]) 0,41 (% (G+C) - 600/l) o una ecuación similar). En consecuencia, los parámetros en las condiciones de lavado que determinan la estabilidad del híbrido son la concentración de ion sodio y la temperatura. Con el fin de identificar moléculas que sean similares, pero no idénticas, para una molécula de ácido nucleico conocida puede asumirse un error de apareamiento de 1 % que produce aproximadamente una disminución de 1°C en Tm, por ejemplo, si se buscan moléculas de ácido nucleico que tienen un > 95 % de identidad de secuencia, la temperatura de lavado final se reducirá en aproximadamente 5 °C. Basándose en estas consideraciones los expertos en la materia serán capaces de seleccionar fácilmente las condiciones de hibridación apropiadas. En realizaciones preferidas, se seleccionan condiciones de hibridación rigurosas. A modo de ejemplo, las siguientes condiciones pueden emplearse para lograr la hibridación rigurosa: hibridación a 5x de cloruro sódico/citrato sódico (SSC)/5x solución de Denhardt/1,0 % de SDS a Tm - 5 °C basándose en la ecuación anterior, seguido de un lavado de 0,2x SSC/0,1 % de SDS a 60 °C durante 15 minutos. Las condiciones de hibridación moderadamente rigurosas incluyen una etapa de lavado en 3x SSC a 42 °C durante 15 minutos. Se entiende, sin embargo, que pueden obtenerse rigurosidades equivalentes usando tampones, sales y temperaturas alternativas. La orientación adicional con respecto a las condiciones de hibridación puede encontrarse en: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1989, y en 6.3.1-6.3.6: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor. Laboratory Press, 2000, tercera edición.

La expresión "identidad de secuencia" como se usa en el presente documento se refiere al porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de polipéptidos o dos secuencias de ácidos nucleicos. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para la alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos). Los restos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes después se comparan. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones superpuestas idénticas/número total de veces de posiciones.100 %). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias también se puede lograr usando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido, no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5877. Tal algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403. Las búsquedas de nucleótidos BLa St pueden realizarse con los parámetros del programa de nucleótidos NBLAST ajustados, por ejemplo, para la puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una molécula de ácido nucleico de la presente solicitud. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con los parámetros del programa XBLAST ajustados, por ejemplo, para la puntuación =50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína descrita en el presente documento. Para obtener alineamientos con huecos con fines de comparación, puede usarse BLAST con huecos como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Como alternativa, puede usarse PSI-BLAST para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas (Id.). Cuando se utilizan los programas BLAST, BLAST con huecos y PSI-BLAST, pueden usarse parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, de XBLAST y NBLAST) (véase, por ejemplo, la página web NCBI). El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a las descritas anteriormente, con o sin permiso de huecos. Al calcular el porcentaje de identidad, se cuentan típicamente solo las coincidencias exactas. En una realización, los ácidos nucleicos aislados son útiles como cebadores.

El término "aislado" como se usa en el presente documento se refiere a un componente (por ejemplo, polipéptido, ácido nucleico, célula recombinante, celular inducida) que se ha extraído y separado de un medio mixto o heterogéneo que comprende el componente. Por ejemplo, con respecto a un polipéptido, la expresión "polipéptido aislado" se refiere a un agente proteico, tal como un péptido, polipéptido o proteína, que está sustancialmente libre de material celular o medio de cultivo cuando se produce de forma recombinante, o precursores químicos u otros productos químicos, cuando se sintetiza químicamente. El término "polipéptido" como se usa en el presente documento se refiere a un polímero que consiste en numerosos restos de aminoácidos unidos entre sí en una cadena y puede incluir polímeros que comprenden aminoácidos de origen natural, así como bases modificadas.

Con respecto a un ácido nucleico significa un polímero de A, G, T, C y o restos modificados, tales como ADN, ARN y ADNc sustancialmente libre de material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos, u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Un "ácido nucleico aislado" también está sustancialmente libre de secuencias que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) de la que deriva el ácido nucleico. La expresión "ácido nucleico" se considera que incluye a Dn y ARN y puede ser bicatenario o monocatenario.

Con respecto a una población aislada de células, se refiere a una población de células que se ha extraído y separado de una población mixta o heterogénea de células. En algunas realizaciones, una población aislada es una población sustancialmente pura de células en comparación con la población heterogénea de las que se aislaron o enriquecieron.

La expresión "Enlace N", como se usa en el presente documento significa un péptido de 16 aminoácidos de origen natural escindido de la proteína de Enlace por MMP e incluye enlace N humana que tiene la secuencia N DHLSDNYTLDHDRAIH (SEQ ID NO:15) y Enlace N bovina que tiene una secuencia DHHSDNYTVDHDRVIH (SEQ ID NO:5). Se produce tanto en los discos intervertebrales como articulares y promueve la síntesis de agrecano/colágeno por las células del disco (NP y AF) y cartílago articular (condrocitos).

La expresión "fragmento del Enlace N" como se usa en el presente documento significa un polipéptido que comprende un péptido seleccionado de i) DHX¹SDNYT, en donde X¹es L o H (SEQ ID NO:1); ii) una variante conservativa de i) o iii) un fragmento de i) o ii); en donde la variante conservativa y/o fragmento retiene actividad biológica y el péptido tiene 15 aminoácidos o menos. El fragmento del Enlace N por ejemplo puede ser un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO 1-6, una variante conservativa del mismo y/o un fragmento del mismo que retiene actividad biológica.

La expresión "célula madre mesenquimal" o MSC, como se usa en el presente documento se refiere a una célula con la capacidad, en condiciones diferentes, de diferenciar a más de un tipo de células mesenquimales diferenciadas. MSC incluyen células madre mesenquimales inducidas y células madre no inducidas.

La expresión "sustancialmente puro", con respecto a una población celular particular, se refiere a una población de células que es al menos aproximadamente el 65 %, preferentemente al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 85 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 90 %, y lo más preferentemente al menos aproximadamente el 95 % puro, con respecto a las células que componen una población de células totales.

El término "sujeto" como se usa en el presente documento incluye todos los miembros del reino animal, que incluyen mamíferos, preferentemente seres humanos.

Los términos y expresiones "tratar'', "que trata", "tratamiento", etc., aplicados a una célula aislada, incluyen someter la célula a cualquier tipo de proceso o condición o realización de cualquier tipo de manipulación o procedimiento en la célula. Tal como se aplica a un sujeto, los términos se refieren a la prestación de atención, cuidados o manejo médico o quirúrgico de un sujeto.

El término "tratamiento" como se usa en el presente documento aplicado a un sujeto, se refiere a un enfoque dirigido a la obtención de resultados beneficiosos o deseados, que incluyen resultados clínicos e incluye procedimientos médicos y aplicaciones, que incluyen, por ejemplo, intervenciones farmacéuticas, cirugía, radioterapia e las intervenciones en naturopatía así como tratamientos de ensayo para tratar patologías del tejido cartilaginoso y/o discal. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluir, pero sin limitación, alivio o mejora de uno o más síntomas o afecciones, disminución del grado de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, no empeoramiento) de la enfermedad, prevención de la propagación, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad, y la remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. El tratamiento puede incluir, por ejemplo, administrar el polipéptido del fragmento del enlace N aislado a un sujeto o células del implante o trasplante de tejido tratado con el polipéptido del fragmento del enlace N aislado y/o células recombinantes que expresan dicho polipéptido. Como se usan en el presente documento, los términos "administrar", "implantar" y "trasplantar" se usan indistintamente en el contexto de suministro de polipéptidos, células, tejidos y/o productos aislados descritos en el presente documento a un sujeto, por un método o vía que produce al menos la localización parcial de las células introducidas en un sitio deseado. Las células pueden ser implantadas directamente en una vértebra o articulación o de forma alternativa ser administradas por cualquier vía apropiada que produce la liberación en un lugar deseado en el sujeto.

En la comprensión del alcance de la presente divulgación, la expresión "que comprende" y sus derivados, como se usa en el presente documento, se consideran términos abiertos que especifican la presencia de las características, elementos, componentes, grupos, números enteros, y/o etapas indicadas, pero no excluyen la presencia de otras características, elementos, componentes, grupos, números enteros y/o etapas no mencionados. Lo anterior también se aplica a las palabras que tienen significados similares tales como las expresiones, "que incluye", "que tiene" y sus derivados.

La expresión "que consiste" y sus derivados, como se usa en el presente documento, se consideran términos cerrados que especifican la presencia de rasgos, elementos, componentes, grupos, enteros y/o etapas, y también excluyen la presencia otros rasgos, elementos, componentes, grupos, enteros y/o etapas.

Además, los términos de grado tales como "sustancialmente", "alrededor de" y "aproximadamente" tal como se usa en el presente documento significan una cantidad razonable de desviación del término modificado de tal manera que el resultado final no cambió significativamente. Estos términos de grado se deben interpretar como que incluyen una desviación de al menos 5 % del término modificado si esta desviación no niega el significado de la palabra que modifica.

Más específicamente, el término "aproximadamente" significa más o menos del 0,1 al 50 %, el 5-50 %, o el 10-40 %, el 10-20 %, el 10 %-15 %, preferentemente 5-10 %, más preferentemente aproximadamente el 5 % del número al que se hace referencia.

Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, una composición que contiene "un compuesto" incluye una mezcla de dos o más compuestos. También cabe señalar que el término "o" se emplea generalmente en su sentido que incluye "y/o" a menos que el contenido indique claramente lo contrario.

Las definiciones y realizaciones descritas en las secciones particulares se considera que son aplicables a otras realizaciones descritas en el presente documento para los que son adecuados tal como sería entendido por los expertos en la materia.

La mención de los rangos numéricos por puntos finales en el presente documento incluye todos los números y fracciones subsumidas dentro del mismo rango (por ejemplo 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,90, 4, y 5). También, debe entenderse que todos los números y fracciones se asume que están modificados por el término "aproximadamente".

Además, las definiciones y realizaciones descritas se consideran aplicables a otras realizaciones descritas en el presente documento para las que son adecuadas como puede ser entendido por los expertos en la materia. Por ejemplo, en los pasajes del presente documento, los diferentes aspectos de la invención se definen con más detalle. Cada aspecto así definido puede combinarse con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas.

Además, las definiciones y realizaciones descritas en secciones particulares se consideran aplicables a otras realizaciones descritas en el presente documento para las que son adecuadas como puede ser entendido por los expertos en la materia. Por ejemplo, en los siguientes pasajes, diferentes aspectos de la invención se definen con más detalle. Cada aspecto así definido puede combinarse con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferente o ventajosa puede combinarse con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas.

111. Métodos y productos

Como se describe en el presente documento, se ha descubierto que un fragmento de Enlace N que comprende los primeros ⁸aminoácidos induce y restaura los niveles de proteoglucanos extracelulares en cultivos de órganos y también induce la síntesis de proteoglucano y colágeno II en las células del disco y las células del cartílago, que se incluyen en un medio inflamatorio. Por ejemplo, como se demuestra en el Ejemplo 3 el contenido de GAG aumentó significativamente en comparación con el control cuando los explantes osteoartríticos se trataron con Enlace N en presencia de IL-1p. La transferencia Western reveló que esto también dio lugar a una disminución en las cantidades de la forma activa de MMP-13 en comparación con la IL-1p sola. La cantidad de colágeno tipo II extraíble también aumentó cuando los explantes de cartílago OA se trataron con Enlace N, en presencia de IL-1p. Enlace N, inhibió P-P65 (NF-kB) estimulada por IL-1p en condrocitos de pacientes normales y OA.

Además se demuestra que el Enlace N bovino (BLN) también induce la síntesis de proteoglucano y colágeno II en las células del disco como lo hace el enlace N humano (HLN).

El Enlace N es un péptido de 16 aminoácidos. Antes de la presente divulgación, no se sabía si los fragmentos de Enlace N existían y/o eran activos. Por ejemplo, Wang et al (33) informaron de que un fragmento del Enlace N que comprende los primeros 12 aminoácidos del Enlace N no tuvo actividad.

Se describe un polipéptido aislado (denominado en el presente documento un fragmento del Enlace N o polipéptido del fragmento del enlace N) que comprende a péptido seleccionado de:

i) DHX¹X²X³X⁴X⁵X⁶(SEQ ID NO: 30);

en donde

X¹es cualquier aminoácido, opcionalmente L, H, R Q;

X²es S o L;

X³es D, S o N;

X⁴es N o D;

X⁵es Y o S; y/o

Xa es T o Y;

ii) a variante conservativa of i); y/o

iii) un fragmento de i) y/o ii);

en donde la variante conservativa y/o fragmento retiene actividad biológica y el péptido tiene 15 o menos aminoácidos. Los ejemplos de las secuencias del Enlace N se proporcionan en el Ejemplo 10. En una realización, los polipéptidos del fragmento del enlace N incluyen las secuencias descritas o basadas en el motivo de conservación que puede determinarse a partir de las secuencias descritas en el Ejemplo 10.

En una realización, se describe un polipéptido aislado que comprende un péptido que consiste en DHX¹SX³NYT (SEQ ID NO:31); en donde X¹es cualquier aminoácido, opcionalmente L, H, R Q; y/o X³es D, S o N; una variante conservativa del mismo y/o un fragmento del mismo; en donde la variante conservativa y/o fragmento retiene actividad biológica y el péptido tiene 15 o menos aminoácidos.

Se describe un polipéptido aislado (denominado en el presente documento un fragmento del Enlace N o polipéptido del fragmento del enlace N) que comprende un péptido seleccionado de

i) DHX¹SDNYT, en donde X¹es L o H (SEQ ID NO:1);

ii) una variante conservativa de i); y

iii) un fragmento de i) y/o ii);

en donde la variante conservativa y/o fragmento retiene actividad biológica y el péptido tiene 15 o menos aminoácidos. La variante conservativa b) por ejemplo puede comprender una o más sustituciones de la variante conservativas.

En una realización la actividad biológica es la unión al receptor BMP tipo II y/o activación de la actividad de SMAD 1/5. En una realización, los polipéptidos de la variante conservativa polipéptidos abarcada son los que se unen al receptor II de BMP y activan actividad de SMAD1/5 en comparación con Enlace N revuelto o invertido.

El fragmento c) por ejemplo puede tener 4 aminoácidos, 5 aminoácidos, 6, aminoácidos o 7 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 o 5. El fragmento puede comprender la mayor parte de los aminoácidos N terminales o la mayor parte de los aminoácidos C terminales.

Por ejemplo, pueden probarse los fragmentos más pequeños por actividad como se describe por ejemplo en el Ejemplo 9.

En una realización, el fragmento se une al receptor II de BMP y activa la actividad de SMAD1/5 en comparación con el Enlace N revuelto o invertido.

La unión de receptor tipo II de BMP y/o activación de SMAD puede evaluarse por ejemplo como se describe en la bibliografía por ejemplo en Wang et al (33).

En una realización, el péptido consiste en DHX¹SDNYT (SEQ ID NO: 1); en donde X¹es L o H o una variante conservativa del mismo que retiene actividad biológica.

En otra realización, se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia peptídica que consiste en DHLSDNYT (SEQ ID NO: 2) o una variante conservativa del mismo que retiene actividad biológica.

En otra realización, se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia peptídica que consiste en DHHSDNYT (SEQ ID NO: 3) o una variante conservativa del mismo que retiene actividad biológica. En una realización, se describe un polipéptido aislado que comprende un péptido que consiste en DHLSDNYT (SEQ ID NO: 2) o DHHSDNYT (SEQ ID NO: 3).

Los fragmentos más grandes incluyen hasta 15 aminoácidos del Enlace N (por ejemplo, Enlace N humano o bovino). En una realización, el péptido tiene 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos.

Por consiguiente se describe un polipéptido aislado que comprende un péptido seleccionado de:

i) DHX¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷Xa X⁹DX¹⁰X¹¹X¹², X¹³, (SEQ ID NO:6)

en donde X¹es cualquier aminoácido, opcionalmente L, H, R Q;

X²es S o L;

X³es D, S o N;

X⁴es N o D:

X⁵es Y o S;

Xa es T o Y;

X⁷es LV o T;

Xa es cualquier aminoácido, opcionalmente D G, N o P;

X⁹es H Y o P;

X¹⁰es R o Q;

X¹¹es AV o D;

X¹²es I o R; y/o

X¹³es H o V;

ii) una variante conservativa de i); y/o

iii) un fragmento de i) y/o ii);

en donde la variante conservativa y/o fragmento retiene actividad biológica y en donde el péptido tiene 15 aminoácidos o menos y se eliminan uno o más restos C terminales y/o N terminales consecutivos.

En una realización se describe un polipéptido aislado que comprende un péptido seleccionado de:

i) DHX¹SX³NYTX⁷X⁸HDRVIH (SEQ ID NO: 7) o DHX¹SDNYTX⁷DHDRX¹²I (SEQ ID NO: 8); en donde X¹es L o H, X⁷es L o V y/o X¹²es A o V;

ii) una variante conservativa de i); y

iii) un fragmento de i) y/o ii);

en donde la variante conservativa y/o fragmento retiene actividad biológica.

Se describe un polipéptido aislado que comprende la secuencia DHLSDNYTLDHDRAI (SEQ ID NO: 9) o una variante conservativa y/o fragmento de la misma que retiene actividad biológica.

Se describe un polipéptido aislado que comprende la secuencia DHHSDNYTVDHDRVI (SEQ ID NO: 10) o una variante conservativa y/o fragmento de la misma que retiene actividad biológica.

En el presente documento se demuestra que el Enlace N bovino y Enlace N humano que comparten el 81 % de identidad de secuencia que tiene actividad biológica. Por consiguiente, en una realización, el polipéptido aislado comprende un péptido que tiene al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 o ⁶. En una realización, los restos correspondientes a X¹, X²y/o X³de SEQ ID NO: 4 están modificados.

En una realización, se describe que el fragmento tiene 4 aminoácidos, 5 aminoácidos, ⁶, aminoácidos, 7 aminoácidos, ⁸aminoácidos, 9 aminoácidos, 10 aminoácidos, 11 aminoácidos, 12 aminoácidos, 13 aminoácidos, 14 aminoácidos o 15 aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, 5 o ⁶. También se describe un fragmento que comprende la mayor parte de aminoácidos N-terminales o la mayor parte de aminoácidos C-terminales.

En una realización, el fragmento se une al receptor II de BMP y activa la actividad de SMAD1/5 en comparación con Enlace N revuelto o invertido.

En una realización, el péptido aislado se conjuga a un andamio sólido, opcionalmente un andamio tipo gel tal como polímeros solvatados con una distribución de grupos funcionales, por ejemplo, poliestireno: estireno reticulado con ¹ 2 % de divinilbenceno; Poliacrilamida: Una alternativa hidrófila para poliestireno; polietilenglicol (PEG): PEG-poliestireno (PEG-PS). En una realización, el andamio sólido es un andamio a base de PEG, por ejemplo, compuesto de una red de PEG-polipropilen glicol o PEG con poliamida o poliestireno. En una realización, el andamio sólido es un andamio de tipo superficie que incluye, por ejemplo vidrio de poro controlado, fibras de celulosa, y poliestireno altamente reticulado. En una realización, el andamio sólido es un material compuesto por ejemplo, un polímero de tipo gel soportado por una matriz rígida.

En una realización, el polipéptido aislado comprende uno o más grupos protegidos. En una realización, el polipéptido aislado tiene un grupo protector N-terminal. En una realización, el polipéptido aislado tiene un grupo protector C-terminal. En una realización, el polipéptido aislado tiene un grupo protector de cambio lateral.

En una realización, el péptido aislado comprende un grupo N-protegido.

En una realización, el polipéptido aislado comprende un grupo protector Fmoc. En una realización, el polipéptido aislado comprende un grupo protector t-Boc. Fmoc. En una realización, el grupo protector es un grupo Benciloxi carbonilo (Z). En una realización, el polipéptido aislado tiene un grupo protector alloc. En otra realización, el polipéptido aislado tiene un grupo protector litográfico.

En una realización, el polipéptido aislado está configurado o comprendido en un dendrímero. En una realización, el dendrímero comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4 o más polipéptidos aislados descritos en el presente documento conjugados a un andamio de dendrímero. En una realización el andamio de dendrímero es un andamio de polilisina.

En una realización el polipéptido aislado está conjugado a una fracción vehículo tal como PEG o albúmina, una perla.

En una realización, el péptido se conjuga a una fracción de la actividad seleccionada de un resto de conducción, una fracción de estabilización, una fracción de protección y una fracción de administración, opcionalmente en donde la fracción de la actividad es proteica.

Por ejemplo, una fracción de estabilización puede ser una secuencia proteica de aminoácidos que resiste a la degradación natural y/o recambio de proteínas, tales como una porción Fc de inmunoglobulina, albúmina y similares opcionalmente en donde la fracción se conjuga con el extremo N y/o C terminal del péptido aislado.

En una realización el polipéptido aislado se conjuga con una etiqueta detectable o de purificación, por ejemplo una fracción tal como una secuencia peptídica que puede añadirse o introducirse en la proteína recombinante y es útil para la detección de su expresión o purificación del polipéptido. En una realización, la etiqueta de purificación se conjuga con el péptido aislado por medio de un enlazador que comprende un sitio de escisión proteolítica.

En una realización, el péptido aislado está comprendido en un liposoma o nanopartícula. En una realización, el liposoma es un liposoma de liberación lenta. En una realización, el liposoma es un liposoma pegilado.

Un aspecto adicional es un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido del fragmento del enlace N aislado descrito en el presente documento. El ácido nucleico aislado puede ser desnudo o estar comprendido en un vector. También se proporciona en una realización un ácido nucleico que hibrida a un ácido nucleico que codifica el polipéptido del fragmento del enlace N aislado descrito en el presente documento. En una realización, el ácido nucleico está optimizado por codón.

Por consiguiente un aspecto adicional incluye un vector que comprende el ácido nucleico aislado y/o polipéptido aislado descritos en el presente documento. Los vectores pueden incluir vectores retrovíricos, vectores adenovíricos y vectores de virus de ADN para los ácidos nucleicos y liposomas o nanopartículas para polipéptidos. En una realización, el vector es un liposoma o nanopartícula. En una realización, el liposoma es un liposoma de liberación lenta.

El polipéptido aislado y/o ácido nucleico pueden obtenerse usando técnicas recombinantes, y o sintetizarse sintéticamente.

En una realización, el polipéptido aislado se produce sintéticamente y está no glucosilado o glucosilado de forma diferencial en comparación con un polipéptido expresado in vivo humano.

En una realización, el polipéptido aislado se cicla. En una realización, el polipéptido aislado comprende uno o más aminoácidos D o más o más L aminoácidos.

Un aspecto adicional incluye una célula recombinante que expresa el polipéptido del fragmento del enlace N aislado descrito en el presente documento y/o que comprende el ácido nucleico aislado o vector descrito en el presente documento.

Una diversidad de células recombinantes puede hacerse expresar los fragmentos del Enlace N de la divulgación. Por ejemplo, una célula puede transformarse, transfectarse o transducirse con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un fragmento del Enlace N de la solicitud.

En una realización, la célula es una célula del linaje de condrocitos, una célula madre o una célula del disco, opcionalmente en donde la célula madre es una célula madre mesenquimal. En una realización, la célula recombinante es para uso terapéutico.

Un aspecto adicional es una composición que comprende el polipéptido aislado descrito en el presente documento y opcionalmente un vehículo o diluyente.

También se proporciona en otro aspecto una composición que comprende el ácido nucleico, vector, o célula recombinante aislados descritos en el presente documento.

En una realización, el diluyente es un tampón fisiológico, opcionalmente un tampón fisiológico estéril.

En una realización, la composición es una composición farmacéutica que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

El polipéptido aislado, ácido nucleico aislado, vector, célula recombinante opcionalmente puede estar liofilizado, o en una composición líquida, en gel o sólida.

La composición puede ser un polvo liofilizado o una solución o suspensiones acuosas o no acuosas, que pueden contener además antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos. Otros componentes que pueden estar presentes en tales composiciones incluyen por ejemplo agua, tensioactivos (tales como Tween), alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales.

Los diluyentes adecuados para los ácidos nucleicos incluyen, pero sin limitación agua, soluciones salinas y etanol. Los diluyentes adecuados para polipéptidos, y/o células incluyen, pero sin limitación soluciones salinas, soluciones tamponadas de pH y soluciones de glicerol u otras soluciones adecuadas para la congelación de los polipéptidos y/o células.

La composición puede comprender además agentes estabilizantes, por ejemplo, agentes reductores, aditivos hidrófobos e inhibidores de proteasa que se añaden a tampones fisiológicos.

En una realización, la composición comprende un andamio formado de un material biocompatible que comprende el polipéptido aislado, célula recombinante y/o composición descritos en el presente documento.

En una realización, el material biocompatible se selecciona de un biomaterial basado en alginato agarosa, quitosano, policaprolactona y/o ácido hialurónico (o hialuronato). También pueden usarse andamios genéricos para los condrocitos y/o células IVD.

En la realización, el andamio se forma en un hidrogel, microesfera, microcápsula, esponja, espuma o fibra.

En una realización, la composición es para preparar una célula de cartílago o discal para trasplante en un sujeto, la composición que comprende un polipéptido aislado y/o célula recombinante descrita en el presente documento, una célula de cartílago y/o discal y un vehículo o diluyente, en donde la célula de cartílago y/o discal se expone a una cantidad eficaz de dicho polipéptido aislado y/o célula recombinante suficiente para inducir la célula de cartílago y/o dis

En una realización, la composición farmacéutica es para su uso en el tratamiento de una patología del tejido de cartílago o disco en un sujeto, comprendiendo la composición un polipéptido aislado y/o célula recombinante descritos en el presente documento, una célula de cartílago y/o disco y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, en donde el tratamiento comprende exponer la célula de cartílago y/o disco a una cantidad eficaz de dicho polipéptido aislado y/o célula recombinante suficiente para inducir la célula de célula de cartílago y/o disco a aumentar la síntesis de proteoglucano y/o colágeno para tratar patología del tejido de cartílago en el sujeto después de la administración de la composición al sujeto.

En una realización, la composición (que incluye la composición farmacéutica) comprende un andamio formado de un material biocompatible, y en donde la célula de cartílago y/o disco se dispone sobre o en el andamio.

En una realización, la composición que comprende la célula de cartílago y/o disco se cultiva durante al menos 1 día, al menos 2 días, al menos 3 días, al menos 4 días o al menos 5 días antes de la administración.

Otro aspecto incluye un método de inducir la síntesis de matriz opcionalmente síntesis de proteoglucano y/o síntesis de colágeno II en una célula de cartílago y/o disco o en un tejido que comprende una célula de cartílago y/o disco, comprendiendo el método incubar la célula de cartílago y/o disco con una cantidad efectiva del polipéptido aislado, la célula recombinante que expresa dicho polipéptido aislado y/o composición como se describe en el presente documento, en las condiciones para inducir síntesis de proteoglucano, producir una célula de cartílago y/o discal inducida con la síntesis de matriz aumentada.

La síntesis de matriz puede medirse por ejemplo mediante a evaluación de la síntesis de proteoglucano y/o colágeno II como se describe en los Ejemplos.

En una realización el método se realiza in vitro en un cultivo celular, opcionalmente un cultivo del órgano discal, para producir una célula o tejido con síntesis de matriz aumentada.

En una realización, la célula y/o tejido se pone en contacto en condiciones para producir cartílago, opcionalmente para usar en el trasplante de cartílago.

En una realización, la célula de cartílago es un condrocito. En una realización, la célula del disco es una célula AP opcionalmente una célula iAP. En otra realización, la célula del disco es una célula NP. En una realización adicional, se usa una población mixta de células, por ejemplo, que comprende AP y NP. En una realización, el tejido comprende células del linaje de cartílago. En una realización, el tejido comprende células del linaje de AP y/o NP.

En una realización, la célula recombinante es una MSC que expresa un polipéptido aislado descrito en el presente documento.

En una realización, la célula de cartílago, célula y/o tejido del disco está en un sujeto y el contacto se realiza por la administración al sujeto de un polipéptido aislado, una célula recombinante o una composición de la reivindicación 14 o 15, que se describe en el presente documento.

En una realización, la célula de cartílago y/o disco inducida se introduce en el sujeto.

En una realización, la célula de cartílago y/o célula de disco es una célula autóloga que se trata in vitro. Por ejemplo, en la mosaicoplastia se toman injertos autólogos circulares a menudo pequeños pequeñas (4-8 mm) por ejemplo a partir de regiones que no soportan peso de la rodilla. En una realización, el Enlace N se inyecta o se administra antes de tomar y/o cuando se reintroduce el injerto autógeno para tratar de promover la reparación. Por ejemplo, esto puede ayudar a reparar el sitio de recolección y/o tratar el sitio de implantación puede promover la reparación alrededor del injerto y de donde se tomó el injerto.

Otro aspecto incluye un método de producir tejido de cartílago y/o disco para implantar en un sujeto, comprendiendo el método incubar/cultivar la célula de cartílago y/o disco con una cantidad efectiva del polipéptido aislado, la célula recombinante que expresa dicho polipéptido aislado y/o composición descrita en el presente documento, en las condiciones para inducir la síntesis de proteoglucano, producir una célula de cartílago y/o disco inducida con síntesis de matriz aumentada, opcionalmente aumento de la síntesis de proteoglucano; y aislar una población sustancialmente pura de células de cartílago y/o disco inducidas.

En una realización, la matriz comprende una matriz cartilaginosa. En una realización, la matriz cartilaginosa comprende proteoglucano y/o colágeno, por ejemplo colágeno II.

En una realización la síntesis de proteoglucano es agrecano.

En una realización, la célula de cartílago y/o disco se cultiva en un cultivo 3D que comprende un andamio, tal como un andamio de alginato por ejemplo como se describe en los Ejemplos.

En una realización la célula de cartílago y/o disco inducida se implanta en un sujeto.

En una realización se usan aproximadamente 0,5 microgramos/ml por ejemplo en un cultivo celular y/o para la administración. En otra realización, se usan aproximadamente 0,5 microgramos/ml a aproximadamente 10 mg/ml, opcionalmente aproximadamente 10 microgramos/ml. aproximadamente 100 microgramos/ml, aproximadamente 1000 microgramos/ml, aproximadamente 2 mgramos/ml, aproximadamente 3 mgramos/ml, aproximadamente 4 mgramos/ml, aproximadamente 5 mgramos/ml, aproximadamente 6 mgramos/ml, aproximadamente 7 mgramos/ml, aproximadamente 8 mgramos/ml aproximadamente 9 mgramos/ml o aproximadamente 10 mgramos/ml. En una realización, la dosis es cualquier incremente de 10 microgramo/ml de 0,5 microgramos hasta aproximadamente 10 mg. En una realización, la cantidad es peso/volumen. En una realización, se administra por cantidad de inyección. Por ejemplo, en una realización, hasta o aproximadamente 1 mg se inyecta por disco lumbar o hasta 1 mg se introduce por articulación.

Un aspecto adicional incluye un método de aliviar un síntoma asociado con y/o tratar una patología del tejido de cartílago y/o disco que comprende administrar a un sujeto que lo necesita un polipéptido aislado, una célula recombinante, célula de cartílago y/o disco inducida y/o una composición farmacéutica descritos en el presente documento.

En una realización, el síntoma es dolor. Como se demuestra en las Figuras 27-30 la expresión de NGF en el IVD aumenta con la degeneración tanto en las células NP como AF y el Enlace N puede suprimir la expresión génica inducida por TNF alfa de las neurotrofinas (NGF, BDNF) y la Sustancia P (TAC1) en las células AF. La Figura 29 demuestra que el Enlace N suprime la expresión inducida por IL-1 beta de neurotrofinas (NGF, BDNF) y la sustancia P (TAC1) en las células AF. Las neurotrofinas, y la sustancia P son mediadores del dolor.

En una realización, la patología del tejido de cartílago y/o disco es degeneración del disco intervertebral. En una realización, la degeneración del disco intervertebral está en estadio temprano. Por ejemplo la degeneración del disco en estadio temprano incluye la degeneración de grado Thompson 1,2 y/o 3, u opcionalmente mientras que el AF está sustancialmente intacto por ejemplo como puede determinarse después del examen de imágenes tal como MRI. La degeneración del disco de estadio tardío puede incluir por ejemplo, grado Thompson 4, grado Thompson 5 o mayor y/o en donde ha tenido lugar la fusión. Por ejemplo, los productos y métodos descritos en el presente documento pueden usarse para tratar y/o evitar degeneración del disco adyacente después de la fusión.

Los métodos MRI sensibles y/o cuantitativos pueden usarse para la selección de sujetos adecuados para recibir un tratamiento descrito en el presente documento. En una realización, el tratamiento se administra profilácticamente, por ejemplo, después de la degeneración detectable pero antes del disco degenerado doloroso para reparar y/o retardar la degeneración.

En una realización, el sujeto tiene disminución de la densidad celular y/o actividad metabólica, opcionalmente en donde la disminución de densidad celular y/o actividad metabólica se debe a la edad.

En una realización, la patología del tejido de cartílago y/o disco es una enfermedad articular inflamatoria y/o degenerativa seleccionada de artritis, osteogénesis y/o calcificación no deseable.

En una realización, la artritis es osteoartritis.

En otra realización, la artritis es artritis reumatoide.

En una realización, la patología del tejido de cartílago y/o disco es osteoporosis. En una realización, el tejido de cartílago y/o disco es osteólisis.

En una realización, la patología del tejido de cartílago y/o disco es una lesión mecánica.

En una realización, el sujeto es un mamífero opcionalmente seleccionado de un ser humano, caballo, vaca, cabra o perro. En una realización, el sujeto es un ser humano.

Se ha demostrado que la pérdida de la expresión del receptor II de BMP provoca inflamación endotelial y aterosclerosis es un modelo de ratón. Se ha demostrado que el Enlace N se une al receptor tipo II de BMP y en el presente documento se muestra que inhibe la activación de NFkappaB. Por consiguiente un aspecto adicional es un método de aliviar un síntoma y/o tratar un sujeto con inflamación endotelial y/o aterosclerosis que comprende administrar a un sujeto que lo necesita un polipéptido del fragmento del enlace N aislado, una célula recombinante, célula de cartílago y/o disco inducida y/o una composición farmacéutica que se describe en el presente documento.

En una realización, el polipéptido aislado, célula recombinante y/o composición farmacéutica se administra al sujeto en un andamio.

El polipéptido del Enlace N aislado, célula recombinante, célula inducida o composición farmacéutica puede administrarse al sujeto en forma percutánea y/o cerca de o en el sitio de la patología tisular. Para las patologías del tejido del disco, el polipéptido del fragmento del enlace N aislado, célula recombinante y/o células inducidas pueden administrarse, implantarse o trasplantarse en un sujeto por inyección intradiscal por ejemplo, inyección en el NP, el AF, opcionalmente el AF interno. Para las patologías de la articulación, el polipéptido del fragmento del enlace N aislado, célula recombinante y/o células inducidas pueden administrarse, implantarse o trasplantarse en un sujeto mediante la inyección en la región afectada. En algunas realizaciones, las células y/o tejidos autólogos por ejemplo como se hace en la mosaicoplastia, se extirpan, se tratan como se describe y se reimplantan.

En una realización, el polipéptido del fragmento del enlace N aislado, célula recombinante y/o células inducidas pueden administrarse, implantarse o trasplantarse en un sujeto mediante la inyección en el líquido sinovial. En una realización, donde el sujeto tiene un andamio para el implante por ejemplo para reparar lesiones, la administración puede proceder por inyección/introducción en el andamio del implante incrustado.

En una realización, un andamio ex vivo existente que comprende condrocitos y/o MSC y/o células inducidas también puede impregnarse con polipéptidos del Enlace N aislados, composiciones que comprenden productos del fragmento del Enlace N descritos en el presente documento. El andamio después se puede inyectar en un sujeto que lo necesita.

La reparación del disco y cartílago se puede mejorar mediante la suplementación con MSC mesenquimales y el Enlace N para maximizar la producción de matriz extracelular.

En una realización, el polipéptido del fragmento del enlace N aislado, célula recombinante célula inducida y/o composición que comprende uno o más de los anteriores se usa para reparar una lesión del disco. La degeneración del disco natural puede involucrar la creación de las fisuras. Para reparar tales lesiones, los fragmentos del Enlace N y célula madres pueden implantarse en un andamio polimerizable que llenará las lesiones y permitirá la distribución uniforme de los agentes introducidos.

En una realización adicional, el polipéptido aislado o composición farmacéutica que comprende el polipéptido aislado se administra en una terapia de combinación.

En una realización, el sujeto ha recibido un implante, opcionalmente tratado como se describe en el presente documento o no tratado. Al sujeto por ejemplo se le administra un polipéptido aislado descrito en el presente documento para aumentar la producción de proteoglucano.

En una realización, el método comprende además poner en contacto la célula o tejido con o administrar al sujeto, MSC en combinación con un polipéptido aislado, célula recombinante o composición descrita en el presente documento.

La divulgación anterior describe generalmente la presente solicitud. Una comprensión más completa puede obtenerse mediante referencia a los siguientes ejemplos específicos. Estos ejemplos se describen únicamente con el fin de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la aplicación. Los cambios en la forma y sustitución de equivalentes se contemplan como circunstancias que se pueden sugerir o hacer convenientes. Aunque los términos específicos se han empleado en el presente documento, tales términos se pretenden en un sentido descriptivo y no con fines de limitación.

Los siguientes ejemplos no limitantes son ilustrativos de la presente divulgación:

Ejemplos

Ejemplo 1

Actualmente, no existen tratamientos establecidos para prevenir, detener o incluso retardar el dolor lumbar que surge de la degeneración del disco. Estudios anteriores han demostrado que el Enlace N puede actuar como un factor de crecimiento y estimular la síntesis de proteoglucanos y colágeno, en IVD. Sin embargo, las secuencias en Enlace N implicadas en la modulación de la actividad celular no se conocen bien. Para determinar si las células del disco pueden procesar proteolíticamente el Enlace N, las células del disco humanas se expusieron al Enlace N nativo durante un período de 48 h y como se describe más adelante, el análisis de espectrometría de masas reveló que se ha generado un péptido que abarca los residuos 1 a 8 en la presencia de las células de AF pero no las células de NP. El Enlace N 1-8 indujo significativamente la producción de proteoglucanos en la presencia de células NP y AF IL-1p, lo que confirma que el efecto biológico se mantiene en los primeros 8 aminoácidos del péptido e indica que el efecto se mantiene en un ambiente inflamatorio.

Los efectos únicos del Enlace N en la modulación de la actividad celular sugieren una interacción específica con secuencias y/o motivos. Sin embargo, es menos claro si el Enlace N es estable en un sistema biológico. También se estudió el destino del enlace N en un sistema biológico.

Método y materiales

Materiales

La Pronasa era de Calbiochem (Darmstadt, Alemania). La colagenasa 1A, GlutaMAX, NaCl y ácido fórmico se adquirieron en Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). El alginato de baja viscosidad (Keltone LV) se obtuvo de Kelco Chemical Co. (San Diego, CA, EE.UU.). Penicilina/estreptomicina, sulfato de gentamicina, anfotericina B, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y suero de ternera fetal (FCS) se obtuvieron de Gibco (Burlington, ON, Canadá). Las agujas 20G 11/2 pulgadas para preparar perlas de alginato se obtuvieron de BD syringes, (Concord, ON, Canadá). Acetonitrilo grado HPLC se adquirió de Rathburn (Walkerburn, Escocia). Oro tripsina de grado de espectrometría de masas se adquirió en Promega (Madison, WI, EE.UU.). TopSert, vial roscado TPX-Short, 32x11,6 mm con microinserto de vidrio de 0,2 ml, parte superior 15 mm se adquirieron en Skandinaviska Genetec AB (Vastra Frolunda, Suecia). Las columnas de sílice C18300 A Vydac ultramicro Spin® se adquirieron en The Nest Group (Southborough, MA, EE.UU.). La quimotripsina de grado de secuenciación se adquirió en Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Alemania). La solución acuosa estabilizada de 35SO⁴, 2 mCi, se obtuvo en Perkin Elmer (Montreal, Quebec, Canadá). Las placas de cultivo de 6 pocillos NUNC se adquirieron en Corning Inc. (Edmonton, Alberta, Canadá). MMP 3, 7, 12, 13, ADAMTS 4,5, fueron de R & D Systems (Minneapolis, MN). HTRA1 de Thermo Scientific (Waltham, MA). Se proporcionaron catepsinas K, B, y L.

Péptido del Enlace-N

Enlace N, DHLSDNYTLDHDRAIH (SEQ ID NO: 15); Enlace N inverso, HIARDHDLTYNDSLHD (R-Enlace N) (SEQ ID NO: 16), Enlace N revuelto, DLNrAh LHIDYHTDs D (S-Enlace N) (SEQ ID NO:17), primeros 8 restos de aminoácidos del Enlace-N, DHLSDNYT (Enlace N 1-8) (SEQ ID NO:2), y segundos 8 residuos del péptido, LDHDRAIH (Enlace N 9-16) (SEQ ID NO: 18), fueron sintetizados por CanPeptide (Pointe Claire, QC, Canadá). La secuencia de 16 aminoácidos revueltos se diseñó usando una herramienta bioinformática del Institut Pasteur, París, Francia (http://mobyle.pasteur.fr). La secuencia se seleccionó para imitar las propiedades generales del Enlace N, tales como punto isoeléctrico y solubilidad del péptido original. Las soluciones madre (10 mg/ml) de los péptidos se prepararon en DMEM, se suplementaron con HEPES y el pH se ajustó a 7,4 antes de usar.

Fuente de tejidos

Las columnas toracolumbares humanas se recuperaron a través del programa de donación de órganos Trasplant Quebec. Los discos se obtuvieron de 7 donantes, 1 varón y 6 mujeres, con una edad media de 29,6 años y un rango de edad de 16 a 47 años (Tabla 1). Los donantes que habían recibido quimioterapia reciente, terapias de radiación en la columna vertebral, o la parálisis significativa de muchos años fueron excluidos del estudio. La recuperación de la columna vertebral se llevó a cabo dentro de las 8 h de la muerte. Los discos con calcificación y pérdida de altura del disco no se incluyeron en el estudio. Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité de revisión institucional del Hospital General de Montreal.

Las colas bovinas de novillos de 18-27 meses se obtuvieron de un matadero local dentro de las 6 h del sacrificio.

Aislamiento de células de IVD humanas y bovinas

Los IVD humanos y bovinos se separaron del cuerpo vertebral adyacente y se dividieron en NP y AF para los IVD bovinos y NP y anillo fibroso interior (iAF) para los IVD humanos. El tejido de anillo fibroso exterior humano (oAF) no se usó para el aislamiento de células en este estudio. Las células fueron enzimáticamente aisladas de cada región como se describió previamente (63). Brevemente, los tejidos NP y AF se disecaron en trozos gruesos de aproximadamente 2 mm, se lavaron dos veces en PBS que contenía 50 pg/ml de gentamicina, 100 ug/ml de penicilina, 100 U de estreptomicina y 0,25 pg/ml de fungizona, a continuación, se digirieron con pronasa al 0,2 % durante 1 h, seguido por la colagenasa tipo IA al 0,01 % para el tejido NP y al 0,04 % para el AF durante 4 h en DMEM libre de suero.

Cultivos en monocapas de las células de IVD humano

Para evaluar la estabilidad del Enlace N, las células humanas recién aisladas de regiones NP y AF se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos a una densidad de 250.000 células por pocillo. Las células se cultivaron a 37 °C, CO²5 % en 3 ml de DMEM, que contiene 4,5 g/l de glucosa y suplementado con FCS al 10 %, HEPES 25 mmol/l, sulfato de gentamicina 50 pg/ml, fungizona 0,25 pg/ml, L-ascorbato 50 pg/ml, y GlutaMAX 2 mmol/l. Los pocillos se dejaron durante 2 días antes de la exposición al Enlace-N (1 pg/ml). Se recogieron 200 pl de medio en puntos de tiempo fijos (0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 36 h, y 48 h). La estabilidad del péptido también se estudió en los mismos puntos de tiempo en ausencia de células.

Tratamiento de proteinasa del Enlace N

Se incubaron 300 |jg de Enlace N 1-16 durante 30 minutos, 2 y 24 horas en presencia de 10 proteinasas diferentes. El tampón usado para MMP 3, 7, 12, 13, ADAMTS 4,5, HTRA1 estaba compuesto por Tris-HCl 50 mM, NaCl 200 mM, CaCl²5 mM, Rapigest al 0,01 %. Para las catepsinas K, B, y L, el tampón de digestión estaba compuestos por DTT 2,5 mM, sulfato de condroitina A 0,15 %, acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5.

Espectrometría de masas

Muestras de medio de 25 jl, recolectadas de los cultivos en monocapa descritos anteriormente o digestiones de péptidos, se purificaron en columnas C18 spin de acuerdo con protocolos convencionales (Harvard Apparatus, Holliston, MA). Los péptidos eluidos se reconstituyeron en 20 jl, acetonitrilo al 2 % y ácido fórmico al 0,2 % (FA). Las muestras se inyectaron y se cuantificaron utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo TSQ Vantage™ (Thermo Scientific, Waltham, MA) equipado con un sistema easy nano-LC (Thermo Scientific). El espectrómetro de masas fue operado en el modo de SRM, con las dos configuraciones de Q1 y Q3 a una resolución de unidad (FWHM 0,7 Da). Se usó un voltaje de pulverización de 1700 V se usó con un ajuste de transferencia de iones calentado a 270 °C durante la desolvatación. Los datos se obtuvieron usando el software Xcalibur (versión 2,1). Las fases móviles usadas fueron A (0,1 % FA en agua) y B (100 % de acetonitrilo en 0,1 % FA). La separación se realizó en la punta 10|jm, columnas capilares de 75 pmx 15 cm (emisor PicoTip™, New Objective, Woburn, MA) empaquetada con resina Reprosil-Pur C18 AQ (3 jm , Dr. Maich GmbH, Suiza). Se inyectó 1 j l de muestra y la separación se realizó con un caudal de 300 nl/min usando un gradiente del 97 % de fase móvil A durante 5 min, 85 % de A durante 8 min, 65 % de A durante 42 min, y 19 % de A durante 45 a 50 min.

Se desarrolló un método de control de reacción múltiple (MRM) para los péptidos del Enlace N, se optimizó y usó con la suma del área del pico de las transiciones del Enlace 1-16: 641,30(3+)-->863,41 (y7), 641,30-->748,38 (y6), 641,30 -> 611,33 (y5) y 641,30-->682,28 (b6), transiciones del Enlace 1-8: 964,40 (1+)-->845,43 (b7)-->682,87 (b6)-->568,23 (b5) -->453,20 (b4) -->712,31(y6) -->849,37 (y7), transiciones del Enlace 9-16: 488,75 (2+)--> 821,43 (b7) -->708,34 (b6) -->496,30 ((y4) -->611,32 (y5) -->748,38 (y6). Los datos de MRM se analizaron usando el software Skiline 1,4 (MacCoss Lab Software, University of Washington, Seattle, WA).

Los experimentos de descubrimiento también se llevaron a cabo con el fin de identificar cualquier fragmentación del péptido por la inyección de 8 j l de muestra en un sistema de cromatografía líquida de fase inversa en línea con la espectrometría de trampa de iones-electropulverización (CL ESI EM), como se describió anteriormente (64).

Cultivo de células IVD en andamios 3D

Para comparar la respuesta metabólica a los diversos péptidos del Enlace N, células humanas y bovinas recién aisladas provenientes de las regiones de NP y AF se incorporaron en perlas de alginato al 1,2 %, como se ha descrito previamente (65). Las células en perlas de alginato se cultivaron a 37 °C, CO²5 % en DMEM, que contiene 4,5 g/l de glucosa y suplementado con FCS al 10 %, HEPES 25 mmol/l, sulfato de gentamicina 50 jg/ml, fungizona 0,25 jg/ml, L-ascorbato 50 jg/ml, y GlutaMAX 2 mmol/l. Las perlas se estabilizaron durante 7 días y la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de Live/DEAD® antes de un tratamiento adicional. Luego se cultivaron 5 perlas por pocillo en placas de 48 pocillos en presencia de concentraciones equimolares de Enlace N (1 jg/ml), R-Enlace N (1 jg/ml), S-Enlace N (1 jg/ml), Enlace N 1-8 (0,5 jg/m l) o Enlace N 9-16 (0,5 jg/m l) en 0,5 ml de DMEM. Se añadieron 25 jCi/ml de 35SO⁴al medio para permitir la evaluación de la síntesis de proteoglucanos (66). Además, las perlas se expusieron durante 48 h a IL-1p (10 ng/ml) solos o a una combinación de péptidos e IL-1p (51). Al final del periodo de cultivo, se recolectó el medio y se dializó exhaustivamente frente a agua miliQ en 18,2 O (Spectra/Por® 3), seguido de un enjuague frío con MgSO⁴1 M durante 2 h para eliminar todo el 35SO⁴no incorporado restante. La incorporación 35SO⁴se midió usando un contador beta de centelleo (Beckman Coulter LS6500, Beckman Coulter, Mississauga, Canadá).

Análisis estadístico

Se realizó una prueba t apareada de una cola y los valores de p< 0,05 se tomaron como significativos.

Resultados

Se sabe que el péptido del Enlace N de 16 aminoácidos induce la síntesis de proteoglucanos en las células del disco aisladas y discos humanos intactos, y también aumenta la altura del disco en un modelo de degeneración de punción del disco de conejo (34, 31,29). Sin embargo, no está claro si el efecto es estrictamente dependiente de la secuencia o si esto se atribuye a las propiedades globales del péptido. Tres variantes del péptido se sintetizaron para abordar esto, nativo (Enlace N), invertido (R-Enlace N) y revueltos (S-Enlace N), y se usó la incorporación de 35SO⁴para evaluar la síntesis de proteoglucanos en respuesta a los péptidos. Las células NP y AF bovinas y humanas se expusieron a 1 jg/m l de los péptidos durante 48 h. Las células bovinas mostraron un aumento estadísticamente significativo en la síntesis de proteoglucanos en respuesta al Enlace N (NP p = 0,03, AF p = 0,03), pero no se observó ningún efecto cuando las células se expusieron a los péptidos invertidos o revueltos (Figura 1a). Las células humanas mostraron una tendencia similar, con un aumento significativo en la respuesta al Enlace N nativo (NP p = 0,008, AF p = 0,02) y sin respuesta a los péptidos revueltos o invertidos, lo que indica una respuesta específica de secuencia (Figura 1b). Las células AF bovinas y humanas mostraron una tendencia hacia una respuesta más fuerte en comparación con las células NP.

La estabilidad del péptido o la actividad mantenida es importante a fin de asegurar un efecto sostenido de tratamiento. Por lo tanto, se realizó un análisis de espectrometría de masas para evaluar la estabilidad de un Enlace N en solución. El Enlace N nativo con una masa molecular de 1922 Da se incubó a 37 °C durante 48 h en medio de cultivo y la intensidad del péptido se cuantificó hasta 48 h utilizando la espectrometría de masa dirigida. No se encontró pérdida del péptido del Enlace N de 1922 Da durante este período de tiempo (Figura 2), lo que indica que el péptido es estable en solución a 37 °C.

Las células metabólicamente activas tienen el potencial para procesar péptidos cortos y por lo tanto posiblemente alterar su efecto biológico (67-69). Para determinar si las células del disco pueden procesar proteolíticamente el Enlace N, células del disco humana en monocapa se expusieron al Enlace N nativo durante un período de 48 h y la intensidad del área del pico del péptido 1922 Da se cuantificó con el fin de evaluar su destino. Se encontró que el péptido es estable durante al menos 48 h en presencia de células NP (Figura 3a). Sin embargo, se detectó una disminución del Enlace N durante 6 horas en presencia de las células AF, y solo estaban presentes cantidades traza después de 48 h (Figura 3b), lo que demuestra que las células AF tienen la capacidad de procesar el péptido del Enlace N.

Para identificar los productos procesados del Enlace N, se analizó la presencia de péptidos más cortos en un espectro de masas que varía de 0 -1930Da. Era evidente al comparar el medio que contiene Enlace N de las células NP y AF que un péptido con una masa de 964,4 Da se acumuló en el medio de cultivo celular AF (Figura 4a). El mismo péptido estaba presente solo en niveles muy bajos en el medio de cultivo celular NP (Figura 4a). El péptido de 964,4 se eluyó de la columna a 2 tiempos de retención diferentes. Este fenómeno se observa a veces y es más probable debido a la precipitación del péptido en la columna resultante de la alta concentración. Dos partes separadas del Enlace N nativo de 16 aminoácidos, que representa los aminoácidos 1-8 o 4-11, podrían llegar a generar un péptido de esta masa (Figura 4b). El análisis de espectrometría de masas en tándem confirmó que se generó un péptido que abarca los residuos 1 a 8 en presencia de células de AF, pero no se hallaron trazas del péptido 9-16 (Figura 4c).

La actividad mantenida de los péptidos diseñados para el tratamiento biológico es de gran importancia y el procesamiento de Enlace N por las células AF potencialmente puede alterar su efecto biológico. Para evaluar esto, se sintetizaron dos péptidos correspondientes a la secuencia de aminoácidos 1-8 (Enlace N 1-8) y 9-16 (Enlace N 9-16) y su efecto sobre la síntesis de proteoglucanos se comparó con el del Enlace N humano nativo. La síntesis de proteoglucanos se evaluó usando la incorporación de 35SO⁴y las células NP y AF bovinas y humanas se expusieron a concentraciones equimolares de los péptidos durante 48 h. Se observó un aumento estadísticamente significativo en la incorporación de 35SO⁴de la misma magnitud que en el péptido nativo (NP p = 0,006 y AF p = 0,007) cuando las células bovinas se expusieron al Enlace N 1-8 solo, sin embargo no se observó efecto con el Enlace N 9-16 (Figura 5a). Las células humanas mostraron una tendencia similar, con un aumento significativo en la respuesta al Enlace 1 8 (NP p=0,004 y AF p=0,01), pero no hay respuesta al Enlace N 9-16, lo que indica que el efecto biológico es específico para una secuencia mantenida en los primeros 8 aminoácidos del péptido (Figura 5b). Tanto las células AF bovinas como humanas mostraron una respuesta más fuerte en comparación con las células NP.

Para determinar la proteinasa responsable de la escisión del Enlace 1-16, los digestos con 10 proteinasas diferentes se llevaron a cabo durante 30 minutos, 2 y 24 horas. Las proteinasas analizadas fueron MMP 3, 7, 12, 13, 4,5, ADAMTS HTRA1, y las catepsinas K, B, y L. La intensidad del área del pico del péptido del Enlace 1-16 de 1922 Da se cuantificó mediante espectrometría de masas. La intensidad del pico se redujo significativamente ya después de 30 minutos y fue apenas detectable a las 2 y 24 horas de incubación con catepsina K, mientras que no fue afectado por las MMP 3, 7, 12, 13, ADAMTS 4,5, HTRA1, y catepsinas B y L (el punto de tiempo 2 horas se muestra en la Figura 6A). Se estableció un método de MRM para evaluar si el Enlace 1-8 m/z 964,4 Da (+1) apareció como la intensidad del péptido de 1922 Da desaparecido. El método confirmó que Enlace 1-8 se generó después de 2 horas de la catepsina K (Figura 6B). Para evaluar si la catepsina K genera una escisión entre los aminoácidos 8 y 9 o si el Enlace 1-16 se procesa en varios sitios dentro de la región de los residuos 8-16, también se estableció un método de MRM también para el péptido del Enlace 9-16 z 488,75 Da (2+). El análisis mostró la presencia del Enlace 9-16 después de 2 horas, lo que confirma que el Enlace N se procesa mediante una sola escisión entre los aminoácidos 8 y 9 (Figura 6C).

Ya que la degeneración del disco está estrechamente ligada a la presencia de citocinas inflamatorias in vivo (51), y se sabe que el Enlace N que funciona igual de bien en un ambiente inflamatorio (34) se evaluó la respuesta a los péptidos en presencia de IL -1p para determinar si su efecto beneficioso se mantiene en un medio inflamatorio. La síntesis de proteoglucanos se evaluó mediante la incorporación de 35SO⁴. El Enlace N 1-8 indujo significativamente la producción de proteoglucanos en la misma medida que el Enlace N nativo en presencia de IL-1p, en las células NP y AF bovinas (NP p = 0,006 y AF p = 0,013) (Figura 7A). La misma tendencia se observó en las células humanas, con un aumento significativo de respuesta al Enlace N 1-8 (NP p=0,002 y AF p=0,004) y sin respuesta al Enlace N 9-16 (Figura 7B), lo que confirma que el efecto biológico se mantiene en los primeros 8 aminoácidos del péptido y que indica que el efecto se mantiene en un ambiente inflamatorio.

Análisis

Previamente se ha informado que el Enlace N puede estimular la síntesis de colágeno y proteoglucano en condrocitos (70) , en las células IVD in vitro y en IVD humano intacto ex vivo (19,20), así como aumento de la altura del disco de un modelo de conejo de degeneración del disco (31). Sin embargo, no se sabe cuán estable es el Enlace N nativo en un sistema biológico. El presente estudio demuestra que las células AF tienen la capacidad de procesar proteolíticamente el péptido del Enlace N, lo que produce un fragmento que abarca los restos de aminoácidos 1-8. Los datos indican también que la secuencia biológicamente activa se conserva dentro del mismo fragmento y que el péptido es capaz de aumentar la síntesis de proteoglucanos en las células NP y AF, incluso en un medio inflamatorio. Las células AF demostraron un aumento de proteoglucanos más fuerte respecto del valor inicial que las células NP. Sin embargo, la concentración absoluta producida no puede evaluarse con el método usado. Es posible que las células NP tengan una producción inicial más alta que produce una concentración total mayor de proteoglucano con y sin exposición al Enlace N. Un péptido del Enlace N invertido o revuelto, así como los residuos 9-16 de la Enlace N, no tuvieron ningún efecto biológico.

Wang et al. han informado anteriormente que el efecto estimulador del Enlace N se perdió cuando se evaluaron una serie de péptidos más cortos derivados del Enlace N (33) que incluye un péptido que abarca los restos de aminoácidos 1-12. En contraste, se encontró que un péptido que abarca los restos 1-8 de Enlace N estaba activo. De acuerdo con los presentes resultados se encontró que un péptido invertido o revuelto no tuvo ningún efecto. No está claro por qué el péptido de 1-12 restos era inactivo en su sistema, pero podría relacionarse con las diferentes condiciones que se usaron. Wang et al. usaron 100 ng/ml de los diferentes péptidos independientes del tamaño.

Se determinó que hay una concentración óptima de 1 pg/ml del Enlace N nativo de 16 aminoácidos, por lo tanto, se usó esta concentración y para mantener las concentraciones equimolares, se usaron 0,5 pg/ml de los péptidos más cortos de 8 restos. Wang et al midieron GAG sulfatado asociado con las células en los lisados celulares, mientras que en el presente documento se midió la incorporación de sulfato radiactivo en el GAG liberado en el medio de cultivo. La fuente de células usada también era diferente, Wang et al. aislaron células del tejido de disco degenerado extraídas durante la cirugía para la fusión espinal, y las células se expandieron en cultivo en monocapa antes de transferirlas a cultivos 3D, un procedimiento que puede haber alterado el fenotipo y por lo tanto la respuesta de las células.

Se ha demostrado en Abbott et al (71) que las células expandidas en monocapa de discos humanos degenerados no responden tan bien al Enlace N nativo, con solo una regulación por disminución de los niveles de mensajero de agrecano y una fuerte inducción de los niveles de mensajero MMP 3 (71, 18). La dosis del Enlace-N usada en el estudio de Wang et al era de nuevo menor que la dosis óptima que se determinó, en este caso era 10 veces menos (71) . Las células analizadas en el presente documento se aislaron de donantes de órganos con degeneración leve, y para preservar el fenotipo, las células no se expandieron en monocapa. Esta diferencia y el hecho de que las células evaluadas no eran de discos extirpados quirúrgicamente gravemente degenerados pueden explicar los diferentes resultados]. Los discos con la degeneración severa pueden no tener suficientes células para proporcionar una respuesta terapéutica detectable. También es difícil separar las diferentes regiones de discos degenerados extraídos quirúrgicamente debido a la pérdida de la morfología general, por lo que es difícil distinguir las diferencias entre las células NP y AF. Además, el rendimiento celular es bajo en discos degenerados severamente y es necesario expandir las células para aumentar el número de células, lo que puede influir en el fenotipo de las células (72).

Un evento temprano y marca característica de la degeneración del disco es la pérdida de agrecano y cualquier agente terapéutico usado en la etapa temprana de la degeneración debe aumentar su síntesis. Por lo tanto, en el presente documento la síntesis de agrecano se centró en cómo realizar la lectura para evaluar el efecto beneficioso del fragmento de Enlace N. Sin embargo, la degeneración del disco in vivo se asocia fuertemente con el aumento de catabolismo en la matriz del disco. Este proceso implica una regulación positiva de diversas citocinas y proteasas que probablemente también se expresan temprano en el proceso de la enfermedad (17, 53). Es esencial para un agente bioactivo con la capacidad de invertir o retardar el proceso degenerativo en el disco ejercer su efecto anabólico en este medio catabólico. Estos datos indican que el Enlace 1-8 tiene estas propiedades.

También se encontró que a pesar de que el Enlace N se procesa en las células AF, una secuencia activa permanece intacta. La escisión de la catepsina K del enlace N entre los residuos resultantes 8-9 en dos péptidos, el Enlace 1-8 y el Enlace 9-16, mientras que Mm P 3, 7, 12, 13, 4,5, ADAMTS HTRA1, y las catepsinas B, L y no pudieron procesar el Enlace N. Se ha sugerido un papel de la catepsina K en la degeneración del disco (55, 73). No se sabe si el Enlace 1 8 se genera en la matriz extracelular de los discos intervertebrales degenerados.

Se ha demostrado que el Enlace N actúa a través del receptor de tipo II de BMP y que la activación del receptor conduce a la señalización de Smad1/5 y una regulación positiva de los niveles de mensaje de BMP-4 y BMP-7 (32). El receptor de tipo II de BMP es el único receptor descrito como compañero del Enlace N. Por lo tanto, es probable que el Enlace 1-8 interactúe con el mismo receptor, y que ambos péptidos induzcan la síntesis de proteoglucanos en un grado similar. Si es así, luego sería de esperar que el Enlace N tuviera también las otras propiedades metabólicas del Enlace N, tal como la capacidad de regular por disminución de la expresión de metaloproteinasa.

El Enlace N 1-8 es una sustancia bioactiva prometedora para el tratamiento de la enfermedad degenerativa del disco. Los pacientes que podrían beneficiarse de este tratamiento incluyen, por ejemplo, aquellos con degeneración del disco temprana por ejemplo cuando el AF permanece intacto antes que se haya producido una importante degradación del colágeno. La degeneración más allá del grado Thompson 3 puede requerir tratamiento quirúrgico debido al bajo número de células y la ECM gravemente alterada restante en el disco. Sin embargo, el Enlace N 1-8 todavía podría ser útil en individuos con estos grados más altos de la degeneración, en los que puede usarse para retrasar la enfermedad de disco del nivel adyacente después de la fusión (74-76). Una de las ventajas en el uso del mismo péptido de 8 aminoácidos más corto en lugar del Enlace N de 16 aminoácidos original podría ser el coste de producción. El pequeño tamaño m también es más susceptible para a la administración in vivo.

Tabla 1: Identificación de donantes de disco intervertebral humano IVD .

Ejemplo 2

Como se ha demostrado anteriormente, el Enlace N se libera de la proteína del Enlace por la escisión de MMP. Se produce en los discos intervertebrales y articulares y promueve la síntesis de agrecano/colágeno en las células del disco (NP y AF) y cartílago articular (condrocitos).

Se ha informado que la estimulación del Enlace N de discos humanos en cultivo de órganos aumenta la síntesis de proteoglucanos en comparación con los discos inyectados con medio solo en 1,15 a más de 7 veces. La síntesis de proteoglucanos es detectable 9 días después de la estimulación de Enlace N.

En un modelo de conejo de degeneración del disco, la inyección del Enlace N a una concentración de 100 microgramos de Enlace N en 10 microlitros de solución salina 2 semanas después de la punción anular L2/3, aumentó significativamente la altura del disco IVD 14 semanas después de las inyecciones con Enlace N. El ARNm del agrecano aumentó significativamente en las células AF y NP (particularmente en células AF). La expresión de la proteasa de MMP-3 y ADAMTS-4 también se redujo significativamente. Se demostró que el Enlace N se conserva en el disco humano y solo se pierde lentamente a través de la placa terminal y no AF. La especificidad del Enlace N es una secuencia dependiente ya que el Enlace N revuelto o Enlace N invertido no tuvo ningún efecto en las células NP humanas o células iAF humanas. Véanse, por ejemplo, las referencias 29 y 34.

La estabilidad del Enlace N en cultivo en presencia de NP y AF se probó como se muestra en la Figura 3 y como se describió anteriormente. El Enlace N se procesa en las células AF pero en las células NP.

Las Figuras 4b y 4c muestran los posibles fragmentos Enlace N identificados por espectrometría de masas. El control de la reacción múltiple del péptido de Enlace N 1-16 después de la incubación con una diversidad de diferentes proteinasas encontró que la señal solo se pierde en presencia de la incubación con catepsina K (Figura 6A). Esto corresponde a la aparición de picos como se muestra en la figura 6B y 6C. El Enlace N 1-8, pero no el Enlace N 9-16 está activo para inducir la síntesis de proteoglucanos cuando se ponen en contacto con células NP humanas y células iAF humanas (Figura 7A). El Enlace N 1-8 muestra una actividad similar o mejor que el Enlace N de longitud completa (Figura 7B). El Enlace N y Enlace N 1-8, pero no el Enlace N 9-16 puede promover la síntesis de proteoglucanos en un ambiente inflamatorio.

Estos resultados muestran que la producción de agrecano aumenta en las células NF y AF, el Enlace N se conserva en el disco y solo se pierde lentamente a través de la placa terminal y no AF. El Enlace N se procesa en las células AF y no las células NP. El Enlace N se escinde mediante la catepsina K que genera el fragmento 1-8 y el fragmento del Enlace N producida por las células AF está activo. El Enlace N y el fragmento actúan en un ambiente inflamatorio.

Ejemplo 3

Metodología:

El cartílago osteoartrítico (OA) se obtuvo de cuatro donantes sometidos a artroplastia total de rodilla con el consentimiento informado, y los explantes de hueso y cartílago OA y los condrocitos OA se preparan a partir de cada donante. Los condrocitos humanos normales (PromoCell, Heidelberg, Alemania) y el cartílago articular bovino (12 meses) se usaron como controles.

Preparación de explantes y tratamientos

Los explantes de cartílago, de aproximadamente 1 cm2, se prepararon a partir de los mismos donantes e incluyeron cartílago con el hueso cortical. Los explantes se cultivaron en DMEM suplementado con FBS inactivado por calor al 10 %. Después de 7 días en condiciones de cultivo convencionales, los explantes se expusieron a: IL-1 p (5 ng/ml), Enlace N (1 pg/ml) y se co-expusieron a IL1 p Enlace N durante 21 días con cambio de medio de cultivo cada tres días.

Procesamiento y análisis del tejido

Se aislaron tapones de cartílago de 3 mm de diámetro de diferentes áreas de cada explante. La expresión de Col II, Agg, Col X y MMP-13 se evaluó mediante transferencia Western. Brevemente, los tapones de cartílago se extrajeron con 15 volúmenes (v/p) de cloruro de guanidinio 4 M (GuCl), acetato de sodio 100 mM, pH 7,4, que contiene inhibidores de proteinasa durante 48 horas a 4 °C. Una alícuota de 100 pl, usada para el análisis de transferencia Western, se precipitó con 9 volúmenes de etanol y se incubó una hora a 37 °C con 50 mU de queratanasa I (Seikagaku) seguido de una incubación durante la noche a 37 °C con 20 mU de condroitinasa ABC (Seikagaku). Los componentes de la matriz de cartílago se resolvieron por SDS/PAGE en geles en gradiente al 4-20 % (Bio-Rad) en condiciones reductoras, y se transfirieron a membranas de PVDF de 0,2 um para inmunotransferencia. El agrecano se detectó usando un anticuerpo policlonal de conejo que reconoce el amino-terminal G1 (anti-G1). Col II y MMP-13 se reconocieron con anticuerpos policlonales de conejo anti-Col II y anti-MMP13 (Abcam), mientras que el colágeno de tipo X se reconoció con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Col X (Sigma).

El contenido total de glucosaminoglucanos (GAG, predominantemente agrecano) en el tejido se cuantificó usando el ensayo de unión de colorante azul de 1,9-dimetilmetileno (DMMB).

Aislam iento y cu ltivo de condrocitos OA

Los condrocitos OA se recuperaron del cartílago de cada rodilla por digestión secuencial con Pronasa al 0,125 % seguido de colagenasa al 0,2 %. Después del aislamiento, las células se expandieron en DMEM suplementado con FBS inactivado por calor al 10 % y estreptomicina al 1 %.

Señalización de NFkB

Los condrocitos OA y normales se transfirieron a placas de 6 pocillos y se cultivaron a 90 % de confluencia. Las células se privaron de suero durante la noche y se incubaron en medio de cultivo que contiene IL-1 p (5 ng/ml), Enlace N (1 pg/ml) o combinación de las dos durante 10 minutos a 37 °C. Las células se lisaron en tampón RIPA (ensayo radio inmuno-precipitación) y cóctel de proteasa II (Sigma) e inhibidores de fosfatasa (Thermo Scientific). El lisado se sometió a electroforesis en geles de gradiente 4-20 % (Bio-Rad) en condiciones reductoras, y se transfirió a membranas de PVDF de 0,2 um. Las transferencias se sondaron con anticuerpo anti-fosfo-NFkB (Cell Signaling), y NFkB (Cell Signaling) y GAPDH (Sigma) para la normalización.

Resultados:

El Enlace N indujo significativamente la producción de proteoglucanos en presencia de IL-1p, en explantes de OA y condrocitos. En el cartílago OA, se observó un aumento significativo en la síntesis de proteoglucanos retenido en la matriz en respuesta al Enlace N, Se obtuvieron resultados similares para Col II. El Enlace N también suprimió la activación de MMP-13 y expresión de Col X. Curiosamente, en los condrocitos OA y normales, la activación inducida por IL-1p de NF-kB fue suprimida de forma dependiente de la dosis por el Enlace N.

La Figura 8 demuestra que GAG es retenido en los explantes OA tratados con el Enlace N. La retención de GAG se calculó como un % de retención de los explantes control (CTL).

La Figura 8 demuestra que el Enlace N indujo significativamente la producción de proteoglucano en presencia de IL-1p, en explantes OA y condrocitos.

La Figura 9 demuestra que en cartílago OA, se observa un aumento significativo en la síntesis de agrecano y se retiene en la matriz en respuesta al Enlace N. Resultaos similares se obtienen para Col II.

La Figura 10 demuestra que el Enlace N suprime la activación de MMP-13 inducida por IL-1p (A) y expresión de Col X (B) y la Figura 11 demuestra que la activación inducida por IL-1p de NF-kB se suprime en forma dependiente de la dosis mediante el Enlace N en condrocitos humanos normales (A) y condrocitos OA (B).

Por consiguiente el Enlace N estimula la retención del proteoglucano en el cartílago osteoartrítico y puede estimular proteoglucano y colágeno en un ambiente inflamatorio. El Enlace N puede suprimir la forma activa de MMP-13 en el cartílago osteoartrítico y el Enlace N suprime la expresión de proteasa inducida por IL-1 beta, y sin desear estar ligado por la teoría, por ejemplo, a través de regulación por disminución de NFkB.

La OA está estrechamente ligada a la presencia de citocinas inflamatorias in vivo. Se demuestra que el Enlace N puede inducir la síntesis de proteoglucano en un ambiente inflamatorio en el disco intervertebral. Sin embargo, no se sabe si el Enlace N puede restaurar el contenido de proteoglucanos en el cartílago osteoartrítico en un medio inflamatorio. Para probar esto, los explantes humanos de cartílago osteoartrítico se cultivaron durante 21 días con Enlace N, en presencia de IL-1p, con una combinación de Enlace N y IL-1p, o medio solo. La concentración de proteoglucanos extraíbles se cuantificó por el ensayo DMMB. El Enlace N aumentó el contenido de GAG de los explantes a aproximadamente 50 % cuando se normalizaron con el control. IL-1p disminuyó las concentraciones de proteoglucanos en comparación con el control. Sin embargo, el Enlace N aumentó el contenido de GAG de los explantes a aproximadamente 30 % en presencia de IL-1p cuando se normalizó con el control. Esto indica que durante degeneración del cartílago, el Enlace N tiene el potencial de restauración de proteoglucanos y que el efecto se mantiene en un ambiente inflamatorio.

El efecto del Enlace N sobre la síntesis y la retención de agrecano en el tejido mediante el uso de un anticuerpo contra el dominio G1 se analizó a continuación. Después de cultivar los explantes durante 21 días en ausencia de suplementos, los explantes muestran fragmentos que contienen G1 agrecano débil. Con la suplementación del Enlace N, el contenido de los fragmentos que contienen G1 agrecano aumentó significativamente (P<0,0001). Cuando los explantes se trataron con IL-1 sola la intensidad de la tinción de los fragmentos G1 que contienen agrecano fue similar en comparación con la del control, aunque se observaron algunos de los fragmentos de menor peso molecular mientras que la suplementación con Enlace N e IL-1 amentaron significativamente la cantidad a un nivel comparable al de los explantes tratados solo con Enlace N.

Debido a que las bandas de dominio G1 se producen mediante las agrecanasas y la actividad de MMP en el cartílago in vivo como resultado de metabolismo en curso de la matriz, el efecto del Enlace N sobre la expresión de MMP-13 en un medio inflamatorio se analizó a continuación. La expresión de MMP-13 se analizó mediante transferencia Western después de cultivar los explantes en ausencia o en presencia del Enlace N solo, Il-1 solo o junto con Enlace N. Después de cultivar los explantes durante 21 días en ausencia de suplementos, los explantes muestran MMP-13 activa débil. El Enlace N indujo significativamente la MMP-13 activa en comparación con los controles. Con la suplementación de IL-1, la MMP-13 activa aumenta más que la estimulada por el Enlace N. Por el contrario, la adición de Enlace-N en presencia de IL-1p condujo a una disminución en las cantidades de la forma activa de MMP-13 cuando se compara con IL-1p sola. Del mismo modo, el Enlace N suprime la forma activa de MMP-13, en un medio inflamatorio.

La reparación del cartílago también requiere la producción de colágeno para generar una matriz estable. Por lo tanto, se evaluaron los niveles de colágeno tipo II extraíble producido recientemente. La cantidad de colágeno tipo II extraído de los explantes de control osteoartríticos fue menor que en los explantes suplementados con Enlace N aunque no significativa. Cuando los explantes se trataron con IL-1 sola, las cantidades de colágeno de tipo II se redujeron significativamente en comparación con los explantes de control. Por el contrario, la adición de Enlace-N en presencia de IL-1p condujo a un aumento en las cantidades de colágeno de tipo II en comparación con IL-1p solo. Del mismo modo el Enlace N no solo estimuló la producción de agrecano, en un medio inflamatorio sino también la de colágeno de tipo II.

Varios estudios han demostrado que muchos genes que codifican citocinas pro-inflamatorias y enzimas que degradan la matriz están reguladas por el factor de transcripción, factor nuclear kappa B (NF-kB). La supresión de la cascada de activación de NF-kB usando Enlace N podría regular por disminución la expresión de los mediadores proinflamatorios.

A continuación se evaluó el efecto del Enlace N sobre la activación de NF-k B por IL-1 en condrocitos normales. Los condrocitos normales se estimularon con IL-1p en presencia o ausencia de concentraciones variables de Enlace N. La estimulación de NF-kappaB RelA fosforilada (p65) se determinó por transferencia Western usando anticuerpos específicos para P-P65 (NF-kB). Después de cultivar las células de condrocitos en ausencia de IL-1p, los condrocitos no muestran proteína P-P65 (NF-kB). Con la suplementación con Enlace N, no se observó efecto sobre la proteína P-P65 (NF-kB). Como era de esperar, P-P65 (NF-kB) es prominente después de la estimulación con IL-1p. El Enlace N, inhibió significativamente la P-P65 (NF-kB) estimulada por IL-1p de una manera dependiente de la dosis -100 ng de Enlace N fue muy similar a 1000 ng de Enlace N. Se observaron resultados similares cuando se utilizaron los condrocitos de pacientes con OA. Estos datos demuestran que el Enlace N suprime la activación de NF-kB mediada por IL-1 beta y puede suprimir la MMP-13 estimulada por IL-1p y citocinas inflamatorias mediante la inhibición de la señalización de NF-kB.

Análisis

La arquitectura del cartílago articular se mantiene intacta y funcional a través de factores anabólicos y catabólicos, que actúan sobre los condrocitos que a su vez mantienen la homeostasis del tejido mediante el equilibrio de la síntesis y la degradación. La degradación y pérdida de colágeno y agrecano, remodelación ósea subcondral, e inflamación de la membrana sinovial caracterizan la osteoartritis, ya que el equilibrio se desplaza hacia el catabolismo. Previamente se ha informado que el Enlace N puede estimular la síntesis de colágeno y proteoglucano en los condrocitos. Sin embargo, no se sabe si el Enlace N puede restaurar el contenido de proteoglucanos y colágeno en el cartílago osteoartrítico en un medio inflamatorio. Los resultados en el presente documento demuestran que en la OA temprana, el Enlace N tiene el potencial para restaurar el contenido de proteoglucanos y colágeno. Los datos también indican que Enlace N también puede suprimir la proteólisis, aumentar la síntesis de proteoglucano y colágeno mediante la inhibición de la señalización de NF-kB, incluso en un medio inflamatorio.

Se ha demostrado que el Enlace N, un factor bioactivo, tiene el potencial de estimular la reparación del disco. Se ha identificado usando células de IVD aisladas in vitro, para inducir los niveles de mensaje de colágeno y proteoglucanos y se ha informado que aumenta la incorporación de 35SO⁴radiactivo en los proteoglucanos recién sintetizados (6,16,18). En efecto, la inyección de Enlace N en IVD humanos intactos ex vivo produjo un aumento de la incorporación de 35SO⁴radiactivo en proteoglucanos recién sintetizados, y llevó a la restauración parcial de la altura del disco cuando se inyecta en los discos de conejo en un modelo de punzada de degeneración del disco. Los resultados indican que Enlace N puede estimular la expresión de proteoglucanos y colágeno en los condrocitos de pacientes con OA, compatible con un papel funcional en la restauración de las propiedades funcionales de cartílago.

El Enlace N suprimió la activación de P-P65 (NF-kB) en condrocitos. Las rutas de señalización de NF-kB desempeñan un papel activo en el desarrollo y progresión de la artritis in vivo (19,20). En efecto, los estudios de los autores demostraron la activación de NF-kB en condrocitos articulares después de la estimulación con IL-1b, que desempeña un papel importante en el catabolismo del cartílago articular. La expresión de NF-kB se correlacionó con los niveles de colagenasa-3 (metaloproteinasa (MMP)-13) y estromelisina 1 (MMP-3). Además, se mostró un cambio a la localización de NF-kB nuclear en los condrocitos durante la destrucción del cartílago en el estadio temprano de la artritis en ratones DBA/1 inmunizados con colágeno de tipo II. Los presentes resultados muestran que la estimulación con IL-1b provoca la estimulación de la activación de NF-KB en los condrocitos articulares.

Con el fin de tener una matriz funcional recién establecida la matriz debe ser remodelada. Esto implica la regulación positiva de diversas proteasas. En este estudio el Enlace N suprimió significativamente la MMP-13 activa en comparación con los controles. Por lo tanto con el fin de remodelar el ECM recién sintetizado para su nueva función dentro del cartílago, se requiere la regulación positiva de las proteasas. Las células del disco humanas suplementadas con Enlace N regulan por aumento las proteasas in vitro y en un modelo de conejo in vivo de degeneración del disco. Por lo tanto, el Enlace N parece ser eficaz en la estimulación de la reparación del cartílago, que implica la remodelación de la ECM del disco para restaurar la función del cartílago.

Se ha descrito el uso potencial de los inhibidores de NF-kB para reducir la degradación del cartílago articular en la artritis por MMP. Los resultados favorables usando fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), glucocorticoides, y diferentes agentes demuestran una disminución de la activación de NF-kB. Sin embargo, el uso de los AINE puede producir efectos secundarios gastrointestinales y la falta de especificidad en las estrategias antisentido y de señuelo de factores de transcripción presentan un gran desafío cuando el direccionamiento de la expresión génica debe inhibirse en un solo órgano. Por otra parte, los problemas de la administración de proteínas, inmunogenicidad, y el coste del tratamiento han limitado la perspectiva realista de proteínas completas para la terapia.

Ejemplo 4

Un modelo de cultivo de órganos de la degeneración del disco temprana, que implica la reducción de proteoglucanos pero no la alteración sustancial del colágeno se usa para estudiar el efecto de las terapias moleculares y a base de células, usando el Enlace N como análogo del factor de crecimiento económico y células madre mesenquimales (MSC) como un suplemento de la célula.

Materiales y métodos

Cultivos de células madre mesenquimales

Las MSC humanas recolectadas de la médula ósea se obtuvieron de Lonza (Basel, Suiza). De acuerdo con el proveedor, las células fueron positivas para CD105, CD166, CD29 y CD44 y negativas para CD14, CD34 y CD45. Además, se confirmó que las células son capaces de diferenciarse en linajes osteogénico, condrogénico y adipogénico. Todas las células se expandieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS), 100 U/ml de penicilina, y 100 pg/ml de estreptomicina y se usaron dentro de los cuatro pasajes (19,20). Todos los reactivos de cultivo eran de Wisent Inc. (St-Bruno, Canadá).

Marcaje y seguim iento de células madre mesenquimales

Las MSC se marcaron con PKH67 (Sigma-Aldrich, Oakville, Canadá) siguiendo las instrucciones del proveedor. Brevemente, 2x106 MSC se lavaron con DMEM sin FBS y se recolectaron como un sedimento suelto por centrifugación a 400 g durante 5 min. El sedimento se resuspendió en Diluyente C y se mezcló rápidamente con la solución de colorante. La suspensión de células/colorante se incubó durante 5 min, después de los cual se detuvo la reacción mediante la adición de un volumen igual de FBS. La viabilidad de las células se midió mediante tinción con azul de tripano. Una alícuota se cultivó en monocapa (Sarstedt, Saint-Léonard, Canadá) durante dos días para realizar un seguimiento de la eficiencia de marcaje. El resto de las células se resuspendió en solución salina regulada con fosfato (PBS) (Wisent), o en PBS suplementado con 1 mg/ml de Enlace N (CanPeptide, Montreal, Canadá). Luego se inyectó la suspensión de células en discos de bovinos tratados previamente con tripsina para inducir degeneración (21).

Aislam iento y cu ltivo del disco

Los primeros 3-4 discos caudales más grandes se aislaron de las colas de los novillos de 24 a 30 meses, como se describió previamente (21,22). En pocas palabras, las colas se diseccionaron libres de piel, músculos y ligamentos y se retiraron los pedículos para cada segmento. Se extrajeron el hueso y la parte calcificada adyacente de la placa terminal cartilaginosa, por lo que la superficie del disco era suave y flexible sin tejido calcificado detectable. Después de lavar los discos con PBS suplementado con 1,000 U/ml de penicilina, 1000 pg/ml de estreptomicina y 0,25 pg/ml de Fungizone (GIBCO, Burlington, Canadá), se acondicionaron previamente durante 3 días en recipientes de especímenes estériles de 80 ml (STARPLEX Científicas, Etobicoke, Canadá) que contienen 50 ml de medio de cultivo (DMEM con Glutamax 2 mM y Hepes 25 mM, suplementado con FBS al 5 %, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 |jg/ml, L-ascorbato 50 jg/ml). La degeneración fue inducida por una sola inyección de 100 |jg de tripsina (Sigma-Aldrich) disuelta en 75 j l de PBS en el centro del disco usando una aguja 28G1/2 (21). La aguja se colocó en la parte superior del disco para medir la distancia necesaria para llegar al centro y luego se insertó a la misma profundidad. Una vez en el centro, se inyectó lentamente la solución de tripsina y la aguja luego se sacó, gradualmente, para evitar el reflujo. Los discos se cultivaron a continuación durante otros 4 días, antes de la inyección de las MSC (105 células), Enlace N (75 jg , o una combinación de las MSC ((105 células), Enlace N (75 jg ) en un volumen final de 75 j l de PBS. La concentración Enlace N se basa en la dosis óptima para las células del disco aisladas bovinas (1 jg/ml), asumiendo que el volumen medio de los discos bovino es 7,5 ml. El número de MSC usado se basó en un estudio de Liebscher et al (23), que mide la densidad celular de los discos humanos sanos. Se usó aproximadamente la mitad del número de células que se encuentran en un disco humano adulto sano en este estudio, con el fin de evitar un posible efecto perjudicial en la supervivencia celular debido a la privación de nutrientes ya que los discos bovinos tienen una alta densidad celular. Para todas las condiciones experimentales, se inyectaron siete discos. Siete de los discos tratados con tripsina se inyectaron con PBS solo para servir como controles de degeneración y para verificar que la tripsina era activa en la degradación del contenido de proteoglucano de NP. Siete discos se cultivaron sin ninguna inyección para servir como controles de no degeneración. Los discos luego se cultivaron durante 14 días y los medios se cambiaron cada 3 días.

Análisis de discos por m icroscopía e histología

Al término del cultivo se tomaron dos secciones a través del centro de los discos usando una herramienta de corte de diseño propio que consta de dos cuchillas de micrótomo (21). Esto da dos cortes gruesos de 750 jm de aproximadamente 3 cm de ancho (diámetro del disco) y 1 cm de alto (la altura del disco). Un corte se fijó en fijador libre de formalina (Accustain, Sigma-Aldrich) para el análisis histológico. Las muestras fijadas se embebieron en cera de parafina y se cortaron secciones de 5 jm de espesor y se tiñeron con hematoxilina y verde safranina O-fast (24). El otro corte se usó fresco para estudiar la distribución de MSC en el tejido del disco. Las células madre marcadas que pueblan los discos se visualizaron utilizando un microscopio láser de barrido confocal invertido (CLSM, Zeiss LSM 510). Se analizaron las imágenes de veinte secciones de 6 jm y las pilas CLSM se dividieron en imágenes individuales.

Extracción de proteínas y proteoglucanos de ECM extracelulares

El tejido del núcleo pulposo (NP) restante se recolectó y se registró el peso en húmedo (21). El tejido se cortó en trozos pequeños y se suspendió en 14 volúmenes de tampón de extracción [cloruro de guanidinio 4 M, acetato de sodio 50 mM, pH 5,8, EDTA 10 mM, Complete® (Roche, Laval, Canadá) para la extracción de proteína y proteoglucano. El tejido se extrajo con agitación continua a 4 °C durante 48 horas, y los extractos se clarificaron por centrifugación a 12.000 g durante 30 min a 4 °C. Los sobrenadantes se recogieron y se almacenaron a -80 °C para su posterior análisis.

Análisis de GAG

Los glucosaminoglucanos sulfatados (GAG) se cuantificaron en extractos de tejido con un ensayo de unión con colorante azul de dimetil metileno modificado (DMMB) (25,26). Las muestras se diluyeron para estar dentro de la mitad del intervalo lineal de la curva patrón. Se añadió tampón de extracción de un volumen igual al de los extractos de tejido a la curva patrón para compensar la posible interferencia.

Análisis de proteoglucano por electroforesis en gel de agarosa

La composición de proteoglucanos se analizó por electroforesis en gel de agarosa (27). Los proteoglucanos en alícuotas de 10 j l de extractos de disco se precipitaron con etanol anhidro y se disolvieron en agua destilada. Las muestras se mezclaron con tampón de muestra (Tris-HCl 0,1 M, glicina 0,768 M, azul de bromofenol al 0,01 %, glicerol al 1,2 %, SDS al 0,05 %, pH 8,3) y se hirvieron durante 10 min. Los proteoglucanos se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1,2 %. El gel se tiñó con azul de toluidina al 0,02 % (p/v) en ácido acético al 3 % con Tritón X 100 al 0,5 % (p/v), y se decoloró con ácido acético al 3 % y luego agua destilada.

Análisis de agrecano y colágeno tipo II por transferencia Western

Las proteínas y proteoglucanos en alícuotas de 10 pl de los extractos de disco se precipitaron mediante la adición de 9 volúmenes de etanol anhidro, se lavaron dos veces en etanol 95 %, y finalmente se liofilizaron. Las muestras para el análisis de colágeno de tipo II se disolvieron en agua destilada. Las muestras para análisis de agrecano se disolvieron en tampón (Tris-HCl, 0,05 M con acetato de sodio 0,03 M, pH 7,4, COMPLETE®), y se digirieron por queratanasa I y condroitinasa ABC (Amsbio, Lake Forest, CA, US). Las muestras del mismo grupo de tratamiento se agruparon, se mezclaron con tampón de muestra SDS, y se hirvieron durante 10 minutos. A continuación, las proteínas se separaron por SDS-PAGE (geles al 4-12 % de Bio-Rad®) en condiciones reductoras. Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa que se bloquearon con BSA al 1 % en PBS con Tween 20 al 0,2 % (tampón de bloqueo). A continuación, se incubaron con los anticuerpos primarios a una dilución de 1:2000 en tampón de bloqueo a 4 °C durante la noche, seguido de incubación con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (dilución 1:5000, Sigma-Aldrich) en tampón de bloqueo. El anticuerpo primario que reconoce colágeno tipo II fue de Abcam (Toronto, Canadá); el anticuerpo primario que reconoce el dominio G1 de agrecano se preparó como se describió previamente (28). El anticuerpo unido se visualizó mediante quimioluminiscencia (GE Healthcare Baie d'Urfe Canadá) y se analizó mediante el uso de un sistema de análisis de imágenes VersaDoc Bio-Rad (Bio-Rad, Mississauga, Canadá).

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó mediante el uso de análisis de varianza seguido por prueba post hoc de diferencia significativa mínima protegida de Fischer usando GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA, EE.UU.). Los resultados se presentan como la media ± desviación estándar (SD) de siete experimentos independientes con discos de diferentes colas bovinas. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p < 0,05.

Resultados

Se sabe que el Enlace N induce la síntesis de proteoglucanos por las células del disco aisladas y en los discos degenerados de conejo, y para mejorar la condrogénesis de las MSC in vitro (20,29-32). Sin embargo, no se sabe si el enlace N o MSC solos pueden restaurar el contenido de proteoglucanos en los discos más grandes con la degeneración temprana. Tampoco se sabe si una combinación de Enlace N y MSC tendría un efecto aditivo. Para probar esto, los discos bovinos con reducción de agrecano proteolíticamente inducida se trataron con Enlace N o MSC solo o con una combinación de Enlace N y MSC. Los discos se cultivaron durante un período de 2 semanas después del tratamiento y la concentración de proteoglucanos extraíbles se cuantificó con el ensayo de DMMB (Figura 12). Sin intervención, el contenido de GAG en los discos degenerados se redujo aproximadamente el 50 % del de los controles no degenerados. En contraste, el Enlace N y MSC solos, o en combinación, aumentaron significativamente el contenido de GAG de los discos en comparación con el contenido de GAG en los discos de control de la degeneración (p<0,05). Las concentraciones de proteoglucanos en los discos tratados fueron similares a las de los discos no degenerados. Sin embargo, no se observó importancia estadística entre los grupos tratados (p>0,05). Esto indica que en la degeneración temprana el Enlace N o MSC solo tienen el potencial de restaurar los proteoglucanos a su nivel original y ningún beneficio adicional se consigue mediante una terapia de combinación.

Tener igual contenido de proteoglucanos no implica necesariamente que la estructura sea la misma que la del disco normal. Para abordar esto, los proteoglucanos extraídos se analizaron por electroforesis en gel de agarosa. La distribución del tamaño y la intensidad de tinción en los discos tratados es equivalente a la de los discos de control no degenerados, mientras que la intensidad de la tinción fue más baja en los discos de control de degeneración (Figura 13). Los datos demuestran que los proteoglucanos recién sintetizados producidos en los discos tratados son del mismo intervalo de tamaño que los de los discos no degenerados.

Además, la presencia y abundancia de la proteína nuclear de agrecano intacta se evaluó por SDS-PAGE. La proteína nuclear de agrecano intacta con una masa mayor de 250 kDa fue significativamente menor en los discos de control de degeneración en comparación con los discos de control no degenerados (p<0,05), mientras que la inyección del Enlace N y/o MSC aumentó significativamente la cantidad a un nivel comparable al de los discos de control no degenerados (Figura 14).

La reparación del disco requiere también la producción de colágeno para generar una matriz estable. Por lo tanto, se evaluaron los niveles de colágeno de tipo II extraíbles producido recientemente (Figura 15). La cantidad de colágeno de tipo II extraída de los discos de control degeneración fue significativamente menor que en los discos de control no degenerados. Cuando los discos se inyectaron con MSC y/o Enlace N, las cantidades de colágeno tipo II aumentaron a un nivel similar al detectado en discos de control no degenerados. En consecuencia, el Enlace N y MSC no solo estimulan la producción de agrecano, sino también la de colágeno de tipo II.

El análisis histológico se usó para evaluar la distribución de proteoglucanos en el tejido de reparación. La tinción con safranina O y de las secciones de tejido verde rápidas confirmó una pérdida uniforme de proteoglucanos en los discos de control de degeneración, en donde se encontró poca tinción de safranina O (rojo) (Figura 16). Los resultados confirmaron además que el contenido de proteoglucanos en discos de control de degeneración se redujo en toda la región de NP. En los discos tratados con MSC o Enlace N solos o juntos, la intensidad y distribución de la tinción con safranina O mostraron una distribución uniforme en toda la región NP, similar a la de los discos de control sin degeneración. En consecuencia, el proteoglucano recién sintetizado fue capaz de difundirse en toda la ECM y restaurar el contenido de tejido, incluso en áreas alejadas de las células.

Para sostener los procesos de reparación inducidos por MSC, las células madre inyectadas necesitan continuar siendo viables y estar distribuidas por todo el tejido de reparación. Para abordar esto, las MSC se marcaron con PKH67 (Figura 17A, B) y se cultivaron durante dos días en monocapa para evaluar la eficiencia de la marcación y sostenibilidad del colorante. La viabilidad de MSC fue mayor que el 90 % cuando las células se marcaron y se suspendieron en PBS o solución de Enlace N/PBS antes de la inyección en los discos tratados con tripsina. Para evaluar si las MSC inyectadas sobrevivieron y se integraron en ECM de los discos, las células se rastrearon por microscopía confocal. Se encontró que las MSC estaban distribuidas por toda la región de NP después del período de cultivo de órganos de dos semanas, (Figura 17C, D) que indica la viabilidad de un proceso de reparación sostenible.

Análisis

En el presente estudio se usó un modelo de cultivo de órganos de degeneración temprana del disco para estudiar el potencial de las terapias moleculares y basadas en células para restaurar el contenido de proteoglucanos del IVD. El Enlace N se usó como un agente molecular y MSC como un suplemento de la célula. Los discos degenerados se trataron con terapia por separado o en combinación, y los resultados revelaron que el Enlace N o MSC solo tienen la capacidad de restaurar el proteoglucanos de los tejidos y que no se observó ningún efecto adicional con una combinación de los dos.

El trabajo previo ha demostrado el potencial del Enlace N para estimular la reparación del disco (20,29,31-35). Aunque, el Enlace N se escinde por las células AF tal como se muestra en el presente documento, el péptido de 8 aminoácidos N-terminal resultante parece ser proteolíticamente estable y retiene la actividad biológica. Los estudios que utilizan las células IVD aisladas in vitro, mostraron que el Enlace N podría inducir niveles de mensaje de colágeno y proteoglucanos y producir aumento de incorporación de 35SO⁴radiactivo en los proteoglucanos recién sintetizados (34,35). Además, la inyección del Enlace N en los IVD humano intacto ex vivo (34) produjo un aumento de la incorporación de 35SO⁴radiactivo en proteoglucanos recién sintetizados, y el Enlace N produjo a la restauración parcial de la altura del disco cuando se inyecta en los discos de conejo en un modelo de punzada de la degeneración del disco (31). El modelo usado en el presente estudio imita la degeneración de estadio temprano de un adulto joven, donde el tejido tiene un número suficiente de células que pueden responder a la estimulación del Enlace N. En contraste, la disminución del número de células, la senescencia celular y, posiblemente, un ambiente inflamatorio por otra parte a menudo caracterizan la degeneración del disco humano. El trabajo previo de nuestro grupo ha demostrado que el enlace N es igualmente potente en un ambiente inflamatorio (34). En esta etapa también podría ser necesario suministrar células adicionales capaces de sintetizar ECM del disco.

No hay sitio benigno donde las células de IVD antólogos puedan recolectarse y usarse como una fuente de células para la reparación de IVD, lo que deja a MSC como una opción atractiva. El uso potencial de las MSC para la reparación del IVD se ha descrito en animales pequeños (36-38). Los resultados favorables en conejos demuestran un aumento de la altura del disco, así como la deposición e hidratación de ECM. Sin embargo, otros estudios en el conejo informan la formación de osteofitos, especialmente cuando se administraron MSC sin un andamio o sin sellar la AF (39). Como se conoce el Enlace N promueve la condrogénesis y reduce la osteogénesis de las MSC humanas in vitro, puede ser un candidato ideal para una terapia de combinación (20). Además de los estudios en animales, un ensayo clínico en seres humanos a pequeña escala ha informado mejora de la puntuación de dolor y discapacidad (40). No se encontró aumento en la altura del disco en los ensayos clínicos, pero se pudo detectar un aumento en la hidratación medida por MRI. Los presentes resultados indican que la suplementación MSC podría ser una opción viable en la degeneración temprana. Sin embargo, debido a que la calcificación de la placa terminal está asociada a degeneración (41), queda por ver si la vía de nutrición comprometida resultante en los discos degenerados puede avalar la actividad metabólica de las células adicionales (42,43).

El modelo actual no produce la generación de fisuras, solo reducción molecular, mientras que la degeneración del disco natural a menudo implica la creación de fisuras. Para reparar estas lesiones, puede requerirse la inyección del Enlace N y células madre en un andamio polimerizable que llenará las lesiones y permitirá la distribución uniforme de los agentes terapéuticos.

Tabla 2. Aleatorización de los discos

continuación

Ejemplo 5

Las pruebas adicionales se llevaron a cabo mediante el uso de un cultivo de órgano de disco bovino. La Figura 18 demuestra que el Enlace N 1-8 induce aumento estadísticamente significativo en la síntesis de proteoglucano, expresión de agrecano y colágeno de tipo II en los discos degenerados bovinos a 2 semanas después del tratamiento con el Enlace N 1-8.

Se demostró que el Enlace N y el fragmento que comprende los aminoácidos 1-8 pueden restaurar los niveles de agrecano en el disco degenerado.

Ejemplo 6

El Enlace N humano [DHLSDNYTLDHDRAIH] (SEQ ID NO:15) puede estimular la biosíntesis de la matriz extracelular por las células del disco intervertebral (IVD), tanto in vitro como in vivo. Hasta la fecha, no ha habido informes sobre el efecto del Enlace N bovino [DHHSd Ny t Vd HDRVIH] (SEQ ID NO:5) en las células del disco. El fin de este estudio es comparar el efecto del Enlace N bovino (BLN) con el del Enlace N humano (HLN) sobre las células bobinas del anillo fibroso (AF) y del núcleo pulposo (NP).

Métodos: las células aisladas de las regiones NP y AF de discos coccígeos de novillos sanos de 22-24 meses se embebieron de inmediato en perlas de alginato al 1,2 % para la síntesis de proteoglucanos y la expresión génica o cultivo en monocapa para la extracción de proteínas. Las perlas se incubaron durante 18 días en medio suplementado con 1 |jg/ml de HLN o BLN. Se analizó la liberación de glucosaminoglucanos sulfatados (GAG). Después de 7 y 14 días de cultivo, se realizó la PCR cuantitativa para agrecano (AGG), ADAMTS-4 y ADAMTS-5. La activación Smad se analizó por inmunotransferencia usando anticuerpos específicos dirigidos contra P-Smad1/5 y P-Smad2.

Resultados: En las células NP y AF, la incubación con BLN y HLN produjo un aumento de la liberación de GAG en los medios de cultivo. La liberación de GAG fue significativamente mayor en las células AF incubadas con BLN o HLN en comparación con el medio de control. Sin embargo, las células NP tuvieron un aumento significativo y consistente en la liberación de GAG cuando se incubaron con HLN. En las células AF, ambas suplementaciones del Enlace-N indujeron una activación rápida (<10 minutos) de Smad1/5 que disminuyó por debajo de los niveles de control en el transcurso de 6 horas. En las células NP, Smad1/5 apareció con retraso, que comenzó después de 30 minutos y siguió aumentando con el tiempo.

BLN es capaz de estimular la liberación de GAG en células IVD bovinas a través de la activación de Smad1/5. La rápida activación de Smad1/5 por BLN en las células AF puede explicar los presentes descubrimientos de que las células AF responden mejor que las células NP a la suplementación con BLN en la promoción de la síntesis de GAG; Ambos péptidos tienen las características necesarias para cualquier agente diseñado para estimular la reparación del disco.

Los detalles adicionales se encuentran en el Ejemplo 7.

Ejemplo 7

Los discos intervertebrales (IVD) son estructuras compuestas que comprenden un anillo fibroso (AF) rico en colágeno periférico que rodea el núcleo pulposo (NP) central rico en proteoglucano [77]. Resisten la compresión, ya que tienen un alto contenido del agrecano proteoglucano, que interactúa con hialuronato para producir grandes agregados de proteoglucanos. Estas interacciones se estabilizan por la interacción adicional de una proteína de enlace (Figura 19) [78,79]. Las células del disco que reside en AF y NP regulan la homeostasis de los IVD a través de procesos metabólicos, manteniendo un equilibrio entre los factores catabólicos y anabólicos y controlando la expresión de moléculas de la matriz y enzimas degradativas. Un desequilibrio de este metabolismo en estado estacionario conduce a alteraciones bioquímicas en la composición y la estructura de matriz de IVD debido tanto a la síntesis reducida como a la degradación aumentada, siendo el agrecano particularmente susceptible al daño y pérdida proteolítica. La degradación progresiva de la matriz extracelular (ECM) está estrechamente relacionada con la degeneración de disco [80].

La degeneración del IVD cumple un papel importante en la etiología del dolor lumbar, lo que puede afectar significativamente a más de la mitad de la población [53, 81-82]. Por lo tanto, para la terapia del dolor lumbar, la inversión del proceso de degeneración y reparación (la restauración de la estructura o función de) los IVD degenerados es crucial. Últimamente, se han propuesto terapias de células o factores de crecimiento para inducir la reparación de IVD [83-86]. Varios estudios han sugerido el uso de factores de crecimiento para estimular el metabolismo celular y cambiar la homeostasis del tejido al estado anabólico (síntesis de la matriz), invirtiendo de este modo el proceso de degeneración.

La reparación del disco puede mejorarse mediante la suplementación con factores de crecimiento tales como las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y factor de crecimiento transformante-p (TGF p). Estos factores de crecimiento pueden aplicarse directamente para maximizar la producción de matriz extracelular y promover la regeneración de tejidos. Como una alternativa económica a los factores de crecimiento, puede ser posible usar Enlace N para la regeneración de tejidos. El péptido del Enlace N humano [DHLSDNYTLd Hd RAIH] (SEQ ID NO:15) es el péptido N-terminal de la proteína de Enlace, una glucoproteína que estabiliza la interacción no covalente entre el dominio G1 de agrecano y hialuronato (Figura 19). El Enlace N humano puede estimular la síntesis de colágeno y proteoglucano en las células del cartílago articular humana e IVD bovina in vitro [87-88, 35], y puede aumentar la altura del disco en un modelo de conejo de la degeneración del disco in vivo [31]. Estudios anteriores han demostrado que el Enlace N también puede disminuir la expresión de colágeno tipo X, un marcador de la hipertrofia de los condrocitos [89], y estimular la expresión de colágeno de tipo II, un marcador de cartílago y la formación de ECM del disco [90]. Por lo tanto, el Enlace N tiene el potencial para ser utilizado junto con las células madre para promover la formación de la ECM necesaria para reparar los IVD.

Hasta la fecha, no ha habido informes sobre el efecto del Enlace N bovino [DHHSDNYTVDHDRVIH] (SEQ ID NO:5) en las células del disco. El de este estudio es comparar los efectos del Enlace N bovino (BLN) y Enlace N humano (HLN) sobre las células bovinas de IVD con el fin de determinar si la sustitución de restos (marcados en negrita), como ocurre en la secuencia de BLN, altera la función del Enlace N.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento de las células del disco bovinas

Los IVD coccígeos de novillos sanos de 20-24 meses se obtuvieron de un matadero local 2-3 horas después del sacrificio. Los IVD se separaron de sus cuerpos vertebrales adyacentes, y se aislaron las células de las regiones NP y AF por digestión secuencial con Pronasa al 0,2 % seguido de digestión con colagenasa al 0,125 % como se describió anteriormente [88]. Después del aislamiento, las células NP y AF se embebieron de manera inmediata en perlas de alginato o se sembraron en placas de 6 pocillos para la extracción de proteínas.

Embeber en alginato

Después de aislar las células NP y AF se resuspendieron en alginato al 1,2 % (disuelto en NaCl 0,15 M) a una concentración de 2 millones de células por ml. El alginato se eligió para evaluar el efecto sobre la producción de matriz en ausencia de proliferación celular extensa [91-92]. Se liberaron gotitas de la suspensión celular a través de una aguja de calibre 18 en una solución de cloruro de calcio 102 mM y se dejaron polimerizar durante 10 minutos. Las perlas de alginato se estabilizaron posteriormente durante 7 días en medio de cultivo (Medio de Eagle modificado de Dulbecco rico en glucosa suplementado con suero bovino fetal al 10 % y antibióticos).

Cultivo y tratamiento de las perlas de alginato

Después de la estabilización, las perlas de alginato se colocaron en placas de 24 pocillos a una densidad de 9 perlas/pocillo y se incubaron durante 18 días en medio suplementado con 1 pg/ml de HLN o BLN (CanPeptide, Montreal). Las perlas cultivadas en medio solo durante el mismo periodo de tiempo se usaron como control (CTL). La concentración de BLN y la suplementación de HLN se eligió basándose en el descubrimiento de que 1 pg/ml de Enlace N induce la respuesta máxima en la estimulación de la síntesis de proteoglucanos en las células del disco [93]. El medio de cultivo se cambió cada tres días durante 18 días con el fin de dar tiempo suficiente a que se produzcan los cambios fenotípicos en la suplementación de diferentes Enlaces N.

Cultivo y tratamiento de las células del disco

Las células AF y NP se expandieron en medio de cultivo (Medio Eagle modificado de Dulbecco rico en glucosa suplementado con suero bovino fetal al 10 % y antibióticos) en placas de 6 pocillos (7,5x105 células/pocillo) hasta alcanzar el 80-90 % de confluencia. Las células se preincubaron durante la noche en medio libre de suero, luego se incubaron en 1 pg/ml de HLN o BLN durante diferentes puntos de tiempo de hasta 6 horas. Las células incubadas en medio solo se usaron como control (CTL).

Viabilidad celular

La viabilidad celular se evaluó en el día 18, en las perlas de alginato usando un ensayo de fluorescencia vivo/muerto (Live/DEAD®, Invitrogen) y se visualizó mediante microscopía de fluorescencia.

Contenido de proteoglucano

El medio de cultivo de las perlas de alginato, con o sin enlace N, se cambió cada tres días, y el glucosaminoglucano sulfatado (GAG, predominantemente agrecano) liberado en el medio se analizó usando el ensayo de unión del colorante azul de 1,9-dimetilmetileno (DMMB)[94]. La retención de GAG en el alginato no se midió ya que el alginato es un polianión que reacciona con DMMB y por lo tanto interfiere en el ensayo.

Aislamiento del ARN total y expresión génica

En el día 7 y el día 14 las perlas de alginato se resuspendieron en el tampón de citrato y se recuperaron las células para la expresión génica. El ARN total se extrajo de las células del disco usando Trizol (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá), siguiendo las instrucciones del fabricante. Un microgramo de ARN total se transcribió de forma inversa en ADNc usando el kit de síntesis de ADNc de Superscript™ First Strand (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Después de la transcripción inversa, se aplicó PCR en tiempo real para analizar cuantitativamente los niveles de mensajero de agrecano (AGG), ADAMTS-4 y ADAMTS-5. Un microlitro de ADNc se amplificó usando cebadores específicos de genes (Tabla 3). Inicialmente, la expresión del gen diana se normalizó a niveles de expresión de ARNr 18S, y a continuación, la expresión de las perlas incubadas con el Enlace N se normalizó con las perlas de control.

Expresión de proteína

Las células AF y NP incubadas se lisaron después en un tampón (pH 7,4) que contiene HEPES 10 mM, Na⁴P²O⁷50 mM, NaF 50 mM, NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, EGTA 5 mM, NaaVO⁴2 mM, Triton X-100 al 1 % (todo de Sigma-Aldrich), y un cóctel de proteasa e inhibidor de fosfatasa (Roche Diagnostics, Laval, QC, Canadá). Las proteínas se separaron en geles de acrilamida al 10 % y se transfirieron a membranas de PVDF por transferencia Western para medir la expresión de proteínas usando anticuerpos específicos dirigidos contra P-Smad1/5, P-Smad2, Smad1 y Smad2 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Las membranas se incubaron en reactivo quimioluminiscente ESL (GE Healthcare, Piscataway, NJ) y se escanearon usando el sistema Molecular Imager VersaDoc™ MP 4000 (Bio-Rad Canada, Mississauga, ON, Canadá). Las intensidades de las bandas se cuantificaron por densitometría usando Programa de software el ImageJ. La fosforilación de Smad1/5 y Smad2 se normalizaron a las formas totales Smad1 y Smad2 correspondientes.

Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron con tres cultivos independientes. El efecto del tratamiento y el período de cultivo, así como la significancia de las diferencias entre los grupos experimentales (CTL, BLN y HLN) en cada punto de tiempo se evaluaron mediante ANOVA de medidas repetidas seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. El valor de p menor de 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

RESULTADOS

Viabilidad de la perla de alginato

Los andamios de alginato sembrado de células se mantuvieron en cultivo durante un periodo de 18 días con el fin de verificar que la suplementación de 1 pg/ml HLN o BLN no era perjudicial para la viabilidad de las células AF y NP. Para los andamios suplementados ya sea con HLN o BLN, la viabilidad celular se mantuvo a > 98 % (Figura 20).

Efecto del Enlace N bovino y humano sobre la síntesis de proteoglucano

Para las células de NP y AF incubadas con o sin Enlace N, la tasa de liberación de GAG en el medio de cultivo aumentó con el tiempo (Figura 21 y 22). Las células NP tendían a exhibir una liberación total de GAG similar a la de las células AF.

La liberación de GAG por las células NP suplementadas con 1 pg/ml de HLN fue significativamente más alta que el control en todos los puntos de tiempo (p < 0,05 para el día 3 y p < 0,0001 para los días ⁶, 9, 12, 15, 18). Cuando se compara con la liberación de GAG por las células NP suplementadas con BLN, esta diferencia solo fue significativa (p < 0,05) a partir del día 12. En contraste, no se observó significancia estadística entre la liberación de GAG por las células NP suplementadas con BLN en comparación con el control, aunque se observó una tendencia hacia un aumento (Figura 21).

Para las células AF suplementadas con 1 |jg/ml de HLN la liberación de GAG fue significativamente mayor que la del control a partir del día ⁶(p < 0,005 para el día ⁶y p < 0,0001 para los días 9, 12, 15, 18), mientras que para las suplementadas con 1 jg/m l de BLN, la liberación de GAG fue significativamente mayor que la del control a partir del día 9 (p < 0,001) (Fig. 22). Por último, a pesar de la liberación de GAG tendió a ser mayor en las células AF suplementadas con HLN que la de BLN en todos los puntos de tiempo, fue solo en el día 18 que esta diferencia fue significativa.

De manera similar a los resultados de nuestros experimentos anteriores [95], la mayor parte de la síntesis de GAG se encontró en el medio de cultivo con una retención mínima en las perlas de alginato. Por lo tanto, la liberación de GAG es una medición de la síntesis de proteoglucanos, y parece que BLN también es capaz de estimular la liberación de GAG.

El efecto del Enlace N bovino o humano sobre el metabolismo de la matriz

Para investigar el efecto de BLN o HLN sobre la expresión de proteoglucanos y proteinasa, los andamios de alginato sembrados de células bovinas se expusieron a 1 |jg/ml de Enlace N y la expresión génica relativa se evaluó para AGG, ADAMTS-4 y ADAMTS-5. Los resultados se expresan en relación a las células no expuestas al Enlace N (CTL). Ambos tratamientos con el Enlace N condujeron a un aumento en la expresión génica de AGG en las células NP, en comparación con el control, sin embargo, con la incubación de HLN, este aumento fue más grande y estadísticamente significativo (p = 0,0107) (Figura 23). En las células AF, la expresión AGG se reguló positivamente en respuesta a la incubación con HLN en comparación con los controles (p = 0,0257), pero no se observó efecto significativo entre BLN en comparación con los controles (p > ⁰,¹).

Aunque en el día 7, no se observó ningún cambio importante en la expresión de ADAMTS-4 de las células NP, en el día 14, la expresión indica una tendencia decreciente no significativa (Figura 24B). En contraste, para las células AF, se observó un aumento en la expresión del el ARNm ADAMTS-4 con las incubaciones de HLN y BLN, aunque las diferencias no fueron significativas en comparación con los controles (Figura 24A).

En el día 7, en respuesta a la incubación con HLN, la expresión de ADAMTS-5 se reguló positivamente para las células AF y NP. Sin embargo, este aumento fue significativo solo para las células AF (p = 0,0149). En respuesta a la incubación BLN, la expresión de ADAMTS-5 se reguló negativamente en las células AF (p = 0,0329) y se reguló positivamente en las células NP en comparación con los controles (p = 0,0058) (Figura 24C y 24D).

Señalización mediada por Smad canónica como un regulador de la función del Enlace N humano y bovino en las células del disco bovinas

Para explicar los mecanismos moleculares por los cuales BLN y HLN inducen respuestas anabólicas en las células NP y AF bovinas, se investigó si BLN y HLN activan las proteínas Smad1/5 como principales transductores de las rutas de señalización Smad canónicas.

Los resultados de la transferencia Western revelaron que HLN activa el Smad1/5 en las células AF bovinas dentro de 5 minutos, mientras que la activación con BLN se produjo dentro de 10 minutos, la activación máxima se alcanza a los 30 minutos (Figura 25). Para ambas suplementaciones con el Enlace N, los niveles de Smad1/5 en las células AF disminuyeron por debajo de los niveles de control después de ⁶horas. En las células NP, la suplementación con BLN y HLN estimuló significativamente Smad1/5 después de 30 minutos y siguió aumentando con el tiempo. Sin embargo, para ambas células de IVD, HLN parecía ser más eficaz en la activación Smad1/5 que BLN.

En las células AF, la incubación en HLN o BLN parecía inducir un ligero aumento de la activación de Smad2 hasta tres horas. En contraste, no se detectó activación de Smad2 en las células NP incubadas en Enlace N (Figura 26).

ANÁLISIS

Los estudios anteriores han demostrado que el Enlace N puede actuar como un factor de crecimiento y estimular la síntesis de proteoglucanos y colágenos in vitro en células de IVD bovinas [^{8 8}, 35] y puede aumentar la altura del disco en un modelo de conejo de la degeneración del disco in vivo [31]. El Enlace N también puede estimular la síntesis de proteoglucanos por las células del disco humanos en andamios 3-D, así como en los discos humanos intactos [93]. Los datos actuales indican que HLN estimuló significativamente la síntesis de proteoglucanos en todos los puntos de tiempo en las células NP y desde el día ⁶en las células AF. Las células NP suplementadas con BLN mostraron una tendencia hacia un aumento en la síntesis de proteoglucanos que no fue significativa. Curiosamente, la liberación de GAG de las células AF suplementadas con BLN fue significativamente mayor que el control de día 9 en adelante, lo que sugiere que BLN es más eficaz en la estimulación de la síntesis de proteoglucanos en las células AF que en las células NP. Además, HLN es capaz de regular negativamente la expresión de ADAMTS-4 después de 14 días en las células NP de la especie bovina, pero no afecta significativamente la expresión de ADAMTS-4 en las células AF. BLN no tuvo ningún efecto significativo en la expresión de ADAMTS-4 después de 14 días en las células NP, aunque se observó una tendencia hacia un aumento en las células AF. BLN fue capaz de regular negativamente ADAMTS-5 en las células AF mientras regula positivamente ADAMTS-5 en células NP después de 14 días. Por último, BLN y HLN estimulan la síntesis de proteoglucanos por las células NP y AF, a través de las rutas de señalización de Smad1/5.

Anteriormente, los presentes inventores descubrieron que aunque no se esperaba que la proliferación celular sea extensa en alginato, [91-92], puede haber contribuido a los cambios en la producción de GAG. En este estudio se analizó el nivel de mensajes de agrecano y la liberación de proteoglucanos acumulativa, y se encontró que la liberación de GAG para ambas células AF y NP incubadas con enlace N aumentó en comparación con el control, al igual que la expresión del ARNm de agrecano. La semejanza en la síntesis de GAG por las células NP y AF que se encontró y el aumento de la presencia y la supervivencia de las células AF durante el aislamiento proteolítico puede significar que las células AF podrían servir como un sustituto funcional para las células NP, lo que sería beneficioso para la modificación por ingeniería genética del tejido.

El hecho de que BLN estimuló ADAMTS-5 en el NP mientras que lo reguló negativamente en el AF puede explicarse por el hecho de que la reparación implica la remodelación de la ECM del disco, y que la remodelación implica la proteólisis. Por lo tanto, no hay necesidad de una ausencia completa de la proteólisis durante la reparación, siempre que la síntesis de la matriz supere el recambio. HLN y BLN pueden estimular la producción de proteoglucanos para ayudar a restaurar la función del disco. El hecho de que HLN activó Smad1/5 en las células de AF bovinas inmediatamente, dentro de los 5 minutos, mientras que la activación con BLN se produjo gradualmente dentro de los 30 minutos, sugiere que la activación HLN puede ser directa, mientras que la de BLN puede ser indirecta. La activación indirecta también puede ser el caso de las células NP, donde la suplementación con BLN y HLN estimuló significativamente Smad1/5 después de 30 minutos y continuó aumentando durante el período de prueba ^{( 6}horas). Por lo tanto, BLN en el AF y NP, así como HLN en el NP pueden activar otras moléculas que a su vez estimulan la síntesis de proteoglucanos.

La activación rápida dentro de 10 minutos de Smad1/5 por BLN en las células AF puede explicar el presente descubrimiento de que las células AF responden mejor que las células NP a la suplementación BLN en la promoción de la síntesis de proteoglucanos. Los estudios previos han demostrado que las células AF de los discos bovinos produjeron más proteoglucanos que las células NP cuando se estimula con TGF-p [96]. Sin embargo, esto no siempre es el caso, ya que las células NP y AF eran capaces de responder de una manera similar [97]. La capacidad del Enlace N de estimular directamente Smad1/5 puede variar debido a las diferencias de edad. En discos pequeños el NP es la principal fuente de proteoglucanos. Sin embargo, el aumento del contenido de proteoglucanos en el AF se observa con la edad y la degeneración [96, 98], probablemente a través de la activación directa de la señalización de Smad1/5.

Aunque, ambos péptidos tienen características necesarias para cualquier agente diseñado para estimular la reparación del disco, la suplementación con HLN podría ser una mejor opción para el tratamiento de la degeneración del disco durante su estadio temprano, mientras que el AF aún está intacto. Este axioma postula un AF intacto para la reparación óptima con el fin de evitar la protuberancia de NP debido al aumento de la hinchazón potencialmente asociado a la acumulación de proteoglucanos.

BLN puede estimular la producción de proteoglucanos in vitro tanto en las células de NP como AF por la activación indirecta de la señalización de Smad 1/5. Por lo tanto, en principio, la suplementación con BLN también podría ser una opción para el tratamiento de la degeneración del disco. HLN a la concentración de 1 ug/ml es eficaz en la estimulación de la síntesis de proteoglucanos y puede activar directamente la señalización de Smad1/5 en el AF, que es la fuente principal de la síntesis de proteoglucanos con la edad y degeneración.

Lista de abreviaturas

ARNr 18S: ARN ribosómico 18S; ADAMTS: una desintegrina y metaloproteinasa con repeticiones tipo trombospondina; AGG: agrecano; AF: anillo fibroso; BLN: Enlace N bovino; BMP: proteínas morfogenéticas óseas; DMMB: azul de 1,9-dimetilmetileno; ECM: matriz extracelular; GAG: glucosaminoglucano sulfatado; HA: hialuronato; HLN: Enlace N humana; IVD: disco intervertebral; LP: proteína de enlace; NP: núcleo pulposo; PCR: reacción en cadena de la polimerasa; RT: transcripción inversa; TGF p: factor de crecimiento transformante-p.

Ejemplo ⁸

La Figura 27 es una serie de tinciones celulares y de una inmunotransferencia que muestran que la expresión de NGF en IVD aumenta con la degeneración tanto en las células NP como AF. La Figura 28 demuestra que el Enlace N suprime la expresión de genes inducida por TNF alfa de las neurotrofinas (NGF, BDNF) y la Sustancia P (TAC1) en las células AF. La Figura 29 demuestra que el Enlace N suprime la expresión inducida por IL-1 beta de las neurotrofinas (NGF, BDNF) y la sustancia P (TAC1) en las células AF. Las Figuras 30 y 31 demuestran que el efecto del Enlace N está mediado por la reducción del nivel de los receptores de neurotrofinas y SP.

La Figura 32 muestra que el Enlace N es capaz de inhibir, suprimir la liberación de NGF inducida por IL-1 beta en las células AF humanas de grado 4. La Figura 33 demuestra que la suplementación con Enlace N (10 |jg/ml) reduce la liberación de la sustancia P de los discos bovinos lesionados 24 horas después de la punción.

Se demuestra que la expresión de NGF en IVD humano aumenta con la degeneración. El Enlace N disminuye la liberación de la Sustancia P de los IVD lesionados mecánicamente. El Enlace N suprime significativamente la expresión génica de neurotrofina inducida por TNF-alfa e IL-1 beta y los receptores de neurotrofinas en las células AF.

Ejemplo 9

Los fragmentos más pequeños se prueban para determinar la actividad. Se probaron los fragmentos de aminoácidos 1-4, 4-8 y 3-6 de la SEQ ID NO: 1. Los fragmentos más pequeños y más pequeños por ejemplo, que consiste en los aminoácidos 1-7, 1-6, 1--5 etc. se prueban hasta que se pierde la actividad. Del mismo modo se prueban los fragmentos más pequeños que carecen de los aminoácidos del extremo NH2, por ejemplo, se prueban los que consisten en los aminoácidos 2-8, 3-8, 4-8, 5- ⁸etc. El análisis PCR y/o 35S como se describe en otras realizaciones podría usarse como lectura.

Ejemplo 10

Los fragmentos del Enlace N pueden incluir uno o más cambios de aminoácidos descubiertos en una de las especies en la tabla a continuación.

Tabla de secuencias para diferentes especies del Enlace N.

^{1 2}3 4 5 ⁶7 ⁸- 9 ^{10 11 12}13 14 15 16 SEQ ID NO: Humano D H L S D N Y T - L D H D R A I H [[4]] 15 Bovino D H H S D N Y T - V D H D R V I H 5 Caballo D H R S D N Y T - L D H D R V I H ¹¹Conejo D H Q S N N Y T - L G H D R V I H ¹²

Perro D H H S D N Y T - L N Y D R V I H 13 Ratón D H H L S D S Y - T P P D Q D R V 14

D H X1 X2 X3 X4 X5 X⁶X7 X ⁸X9 D X10 X11 X12 X13

a

CITAS PARA LAS REFERENCIAS MENCIONADAS EN LA MEMORIA DESCRIPTIVA

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido aislado que consiste en una secuencia seleccionada de DHLSDNYT (SEQ ID NO:2) y DHHSDNYT (SEQ ID NO:3).

2. Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 1.

3. Un vector que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 2.

4. Una célula recombinante que expresa el polipéptido de la reivindicación 1, preferentemente en donde la célula recombinante es una célula del linaje de condrocitos, una célula madre o una célula del disco.

5. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido aislado de la reivindicación 1 y un vehículo, resto estabilizante o diluyente farmacéuticamente aceptable, preferentemente en donde la composición farmacéutica comprende además un andamio formado por un material biocompatible que comprende el polipéptido aislado de la reivindicación ¹.

⁶. Un método in vitro de inducir la síntesis de matriz en una célula de cartílago y/o disco o en un tejido que comprende una célula de cartílago y/o disco, comprendiendo el método incubar/cultivar la célula de cartílago y/o disco con una cantidad eficaz del polipéptido aislado de la reivindicación ¹en condiciones para inducir la síntesis de proteoglucano, lo que produce una célula de cartílago y/o disco inducida con síntesis de matriz aumentada.

7. Un polipéptido aislado de la reivindicación 1 para su uso en un método para inducir la síntesis de matriz en una célula de cartílago y/o una célula de disco, comprendiendo el método incubar/cultivar la célula de cartílago y/o célula de disco con una cantidad eficaz del polipéptido aislado de la reivindicación ¹en condiciones para inducir la síntesis de proteoglucano, lo que produce una célula de cartílago y/o célula de disco con síntesis de matriz aumentada.

⁸. Un método de producir tejido de cartílago y/o disco a implantarse en un sujeto, comprendiendo el método incubar/cultivar una célula de cartílago y/o disco in vitro con una cantidad eficaz del polipéptido aislado de la reivindicación ¹en condiciones para inducir la síntesis de proteoglucano, producir una célula de cartílago y/o disco inducida con síntesis de matriz aumentada; y aislar una población sustancialmente pura de células de cartílago y disco.

9. Un polipéptido aislado de la reivindicación 1 para su uso en un método de aliviar un síntoma y/o tratar un trastorno de cartílago y/o disco, en donde el uso comprende administrar a un sujeto que lo necesita el polipéptido aislado de la reivindicación 1 o la célula recombinante de la reivindicación 4 o la composición farmacéutica de la reivindicación 5, opcionalmente en donde el trastorno del cartílago y/o disco es degeneración del disco intervertebral o una enfermedad articular inflamatoria o degenerativa y opcionalmente en donde la enfermedad articular inflamatoria o degenerativa comprende afección de artritis, osteogénesis no deseable y/o calcificación.