KR20160058109A - 연골 및 원반 조직 병리들의 치료를 위한 방법들 및 조성물들 - Google Patents

연골 및 원반 조직 병리들의 치료를 위한 방법들 및 조성물들 Download PDF

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Abstract

다음에서 선택된 펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드 뿐만 아니라, 재조합 세포와 이의 용도:
i) DHX1SDNYT, 여기에서 X1은 L 또는 H이며(서열 번호: 3);
ii) i)의 보존적 변이체;
iii) i) 또는 ii)의 단편;
여기에서 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 유지하며, 상기 펩티드는 15개 이하의 아미노산이다.

Description

연골 및 디스크 조직 병리 치료용 방법 및 조성물{Methods and Compositions for Treatment of Cartilage and Disc Tissue Pathologies}
이건은 2013년 8월 27일자로 제출된 U.S. 가특허출원 번호 61/870,394, 및 2014년 8월 4일자로 제출된 U.S. 가특허출원 번호 61/975,329(각각 이들은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입됨)의 우선권을 근거로, 35 U.S.C. § 119의 편익을 청구하는 특허 협조 조약 출원이다.
분야
본 개시내용은 연골 및 디스크 장애의 치료를 위한 방법들과 조성물들에 관계되며, 구체적으로 연골(cartilage) 및 디스크 장애 이를 테면, 관절염 및 추간판 퇴행의 치료를 위하여 Link N 단편들을 이용하는 조성물 및 방법들에 관계된다.
배경기술
추간판 (IVDs)은 척추에서 인접하는 척추뼈를 연결시킨다. 추간판은 말초 섬유륜 (AF)과 중앙 수핵 (NP)으로 구성된다. AF는 콜라겐 원섬유에서 풍부한 동심원층판을 가진 섬유성 조직이다 (1). NP는 무작위 방향의 그리고 고함량의 아그레칸(aggrecan)을 보유한 콜라겐 원섬유와 함께 더욱 무정형의 일관성을 갖는데, 이때 아그레칸은 젤라틴모양의 외양을 제공하고, 압박성 부하에 저항하는 능력을 제공한다. 아그레칸은 이의 코어 단백질에 부착된 수많은 글리코사미노글리칸 (GAG) 쇄를 가진 큰 프로테오글리칸이며, NP에서 압박의 영향에 대항하는데 요구되는 삼투 성질을 제공한다.
디스크에서 퇴행성 변화에 기여하는 기전은 감손된 합성과 증가된 분해로 인하여, 세포외 매트릭스의 조성 및 구조에서 생화학적 변이를 유도하고, 아그레칸은 단백질가수분해성 손상 및 상실에 특히 민감하다. 노화, 영양부족, 생물기계적 (2-5), 생화학적 (6-10) 그리고 유전학적 영향이 (11-14) 증가된 IVD 퇴행과 연관된다. 퇴행되는 동안, NP에서 GAG 함량의 상실이 발생되며, 이의 젤라틴성 구조에서 섬유증 구조로 변화되며, 이는 더욱 아교질성이 되고, NP와 AF 모두에서 열창(fissures)이 나타난다 (15,16). 이것은 프로테오글리칸 고갈에 의해 가능하게 되는, 아마도 신경 내성장과 디스크 높이의 상실로 인하여 흔히 요통과 연합된다 (17). 현재, IVD 퇴행에 대한 의학적 치료는 없으며, 유일하게 제공되는 선택으로써, 종국에는 손상된 조직을 외과적으로 잘라내고, IVD 공간을 복원시키기 위하여 케이지 또는 보철의 삽입, 및 척추 뼈 융합이다. 통증 완화에 있어서 이것은 상대적으로 임상적으로 양호한 단기적 결과를 제공할 수 있지만(18), 많은 경우들에 있어서, 척추 생체역학을 또한 변경시켜, 후속 인접-수준의 디스크 퇴행으로 이어진다.
퇴행하는 IVD의 생물학적 복원은 외과적 절제가 바람직할 것이다.
디스크 퇴행은 삶의 초기에 시작되어, 나이가 들면서 진행된다(48, 49). 이 과정은 잔류 세포들의 표현형적 변화에 의해 특징화되고, 염증 사이토킨의 생산 증가를 초래한다 (50, 51). 많은 사이토킨이 디스크 퇴행에 연계되는데; IL-1β 및 TNF-α가 가장 먼저 언급되었지만, 추가적인 후보들 이를 테면, IL-6 및 IL-8는 최근 동물 모델에서 특히 언급되고 있다(17). 퇴행/헤르니아된 견본으로부터 인간 디스크 연구에서 건강한 대조군과 비교하였을 때, IL-1β 및 TNF-α에 추가하여, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12 및 IL-17의 수준의 증가를 보여주었다(52). 사이토킨 생산 증가를 유도하는 정확한 기전은 확실하지 않다. 많은 내부적 그리고 외부적 단서들이 사이토킨 생산에 영향을 줄 수 있는데, 이를 테면, 유전, 물리적 부하, 산소공급 또는 염증 세포의 존재등이 있을 수 있다 (17). 또한, 특이적 매트릭스 단편화(fragmentation) 산물들의 축적은 Toll-유사 수용체들을 활성화시킬 수 있고, 이로 인하여 사이토킨 생산이 유도될 수 있다.
염증성 사이토킨은 프로테아제 생산을 유도하는 것으로 알려져 있고, 후속적으로 아그레칸 및 콜라겐이 포함된, 세포외 매트릭스 (ECM)의 분해로 인하여 IVD 높이 상실 및 구조적 부전으로 이어진다 (53). 프로테아제는 비록 ECM의 주요 성분들의 단편화 및 분해를 담당하지만, 디스크의 정상 재건에서 유의적인 역할을 또한 가진다. 아그레칸의 매트릭스 메탈로프레테나제 (MMP) 단백질분해와 함께, 카텝신 K 활성은 디스크의 정상 조직 재건의 주요 공정으로 제안되어 왔었다 (54, 55). 그러나, 디스크 퇴행 동안 매트릭스 메탈로프레테나제 (MMP1, 2, 3, 7, 9, 13), 아그레카나제 (ADAMTS4, 5), 및 카텝신 (카텝신 D 및 L)은 모두 상승되었다(56, 9). 추가적으로, 세린 프로테아제 HTRA1이 디스크 퇴행에 중추적 역할을 하는 것으로 간주되는데, 그 이유는 HTRA1의 상승된 수준 및 CHAD의 분해는 디스크 퇴행 정도와 연관되기 때문이다(10, 57).
속질핵 (NP)의 단백질 및 프로테오글리칸 함량의 분해는 디스크 높이와 디스크의 중량 지지력의 상실을 초래할 수 있다. 디스크 분해의 최종 단계에서, 환상고리에서 열창이 일어나며, 이는 NP 물질의 탈출 및 신경 압박으로 인한 통증으로 이어진다. 통증이 있는 퇴행성 디스크의 복원 전략은 염증성 환경에서 ECM 성분들의 생산과 단백질분해효소 활성의 하향 조절을 요구한다. 이들 성질은 몇 가지 성장 인자들 이를 테면, TGF-β 및 BMP 7와 연합된다 (58-61). 그러나, 임상 진료에서 고가의 성장인자들 및 잠재적인 부작용에 의해 성장 인자들의 사용은 제한된다.
골관절염 (OA)은 수백만이 앓고 있는 만성 퇴행성 관절 장애다. 이것은 연골세포(chondrocytes)의 동화(anabolic) 및 이화(catabolic) 활성의 불균형으로 인하여, 관절 연골(cartilage) 파괴를 특징으로 한다. 관절 연골은 무혈관 결합 조직으로써, 가동관절의 뼈 부분들을 덮고 있어, 부하를 흡수하고, 소산시킴으로써, 마찰없이 이 관절의 움직임이 가능하도록 한다. 이러한 성질들은 세포외 매트릭스 (ECM)의 조성 및 구조와 관련된다. 이는 콜라겐 원섬유, 프로테오글리칸 (주로, 아그레칸), 비-아교질성 단백질들 및 높은 함량의 물로 구성된다. 관절 연골에서 유일한 세포 유형은 연골세포(chondrocyte)이며, 세포외 매트릭스의 합성 및 유지를 담당한다.
관절 연골의 분해 및 윤활막의 염증에 의해 특징화되는 골관절염 (OA)에서, 상기 매트릭스에서 콜라겐과 프로테오글리칸의 분해 증가 및 분자의 합성 감손으로 인하여, 이러한 균형이 파괴된다. 연골는 연골세포(chondrocyte)에서 유전자 발현 및 단백질 합성을 조절하는 자가분비(autocrine) 및 주변분비(paracrine) (동화 및 이화) 인자들의 다중 복합에 반응한다.
매트릭스 분해는 OA에 연루된 주요 사이토킨인 인터루킨-1베타 (IL-1β)에 의해 유도된 매트릭스 메탈로프레테나제 (MMPs)와 ADAMTS-4 및 -5에 의해 중개된다. OA 발병기전에 연루된 다른 사이토킨은 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), IL-6, 기타 공통적인 c-쇄 사이토킨 이를 테면, IL-2, IL-7, IL-15, 및 IL-21, 그리고 케모킨을 포함한다. 윤활막 세포 및 연골세포(chondrocytes)에 의해 생산된 이들 인자들은 매트릭스 메탈로프레테나제 (MMP), 디스인테그린 및 효소들의 트롬보스폰딘 모티프 (ADAMTS) 패밀리를 갖는 메탈로프레테나제의 구성요소들의 상향조절을 초래한다. MMPs는 ECM 전환(turnover) 및 연골 퇴행에 관련된다. 노화, 비만, 그리고 관절 손상은 OA 증가와 연관된다. 이는 관절 연골, 준연골 뼈, 윤활막, 인대, 및 관절주변 근육을 포함하는 모든 관절 조직에서 진행성 세포 및 분자 변화를 특징으로 한다. OA 환자들에게서 연골 분해를 역전 또는 복원하는 치료법은 현재 없다.
염증 과정이 다양한 류마티스성 질환, 이를 테면, OA 및 류마티스 관절염 (RA)의 발병 기전에서 근본적인 역할을 하기 때문에, 염증 활성의 선택적 저해는 치료에서 중요하며, 이 과정에서 NF-κB 전사 인자들의 패밀리는 주요 역할을 한다는 것이 일반적인 의견이다. 따라서, 몇몇 연구들은 비-스테로이드성 항-염증 약물, 코르티코스테로이드, 약효식품(nutraceuticals), 안티센스 DNA 치료법, RNA 간섭 및 항-류마티스성 약물을 이용하여 NF-κB 경로의 약리학적 조정에 집중되어 왔었다.
Link N은 16개 아미노산 서열로써, IVD 세포에 의한 프로테오글리칸 합성 및 다른 매트릭스 성분들의 생산을 증가시키는 것으로 확인되었다(29, 34). 토끼 디스크 천자 퇴행 모델에서 디스크 높이를 또한 증가시키는 것으로 나타났으며, 이로 인하여 생체내 재생 잠재력이 증명된다(31). 이 자연 발생적 펩티드는 디스크와 연골 모두에서 프로테오글리칸 덩어리(aggregates)를 안정화시키는 링크 단백질의 N-말단 영역이며, 생체내 조직 전환 동안 MMPs에 의해 생성된다. Link N은 배양된 토끼 IVD 세포에서 골 형성 단백질 (BMP) 유형 II 수용체와 상화작용하고, Smad1/5 신호생성(signaling)을 활성화시킨다(33).
Link N의 단편들이 테스트되었다. Wang et al. 는 아미노산 잔기 1-12를 가지는 펩티드가 포함된 더 짧은 Link N-유도된 펩티드의 수를 증가시킬 때, Link N의 자극 효과가 상실된다고 보고하였다(33).
요약
본 개시내용의 한 측면은 다음에서 선택된 펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함한다:
i) DHX1SDNYT, 여기에서 X1은 L 또는 H이다 (서열 번호:1);
ii) i)의 보존적 변이체
iii) i) 또는 ii)의 단편;
여기에서 상기 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 유지하고, 그리고 상기 펩티드는 15개 이하의 아미노산이다.
한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 다음으로 구성된 펩티드 서열을 포함한다: 1) DHLSDNYT (서열 번호:2); 및/또는 생물학적 활성을 유지하는 이의 보존적 변이체 또는 2) DHHSDNYT (서열 번호:3) 또는 생물학적 활성을 유지하는 이의 보존적 변이체.
또 다른 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 다음으로 구성된 펩티드 서열을 포함한다:
i) DHX1SDNYTX2DHDR X3I, 여기에서 X1 은 L 또는 H이며, X2는 L 또는 V이며, 그리고 X3은 A 또는 V이다 (서열 번호: 4);
ii) i)의 보존적 변이체; 그리고
iii) i) 또는 ii)의 단편.
여기에서 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 유지한다.
또 다른 측면은 Link N 단편 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산을 포함한다.
추가 측면은 1) Link N 단편 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산; 또는 2) Link N 단편 폴리펩티드가 포함된 벡터를 포함한다.
추가 측면은 Link N 단편 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 세포다.
여전이 또 다른 측면은 Link 단편 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드가 포함된 조성물, Link N 단편 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 세포다.
전술한 산물을 만들고, 이용하는 방법들 또한 개시된다.
본 개시내용의 기타 특징 및 장점은 다음의 명세서로부터 자명해질 것이다. 본 개시내용의 바람직한 구체예들을 제공하는 상세한 설명 및 특이적 구체예들은 본 개시내용의 사상 및 범위 안에 있는 다양한 변화 및 변형들은 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명하기 때문에, 오로지 설명을 위하여 제공되는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시내용의 구체예는 도면과 관련되어 지금부터 설명될 것이다:
도 1: 소의 또는 인간의 디스크 세포에 의한 프로테오글리칸 합성. Link N (1 ㎍/mL), 스크램블화된(scrambled) S-Link N (1 ㎍/mL), 역전된(reversed) R-Link N (1 ㎍/mL) 또는 펩티드 보충없는 배지 존재하에 48h 후, 35SO4 혼입을 평가함으로써, 합성은 추정되었다. 소의 속질핵 (NP) 및 섬유륜 (AF) 세포 (a)에서, 그리고 인간 속질핵 (NP) 및 내측 섬유륜 (iAF) 세포 (b)에서 상대적 프로테오글리칸 발현을 나타낸다. 데이터는 오로지 배지에만 노출된 대조 세포에 의한 혼입과 비교하여 비율의 평균 +SD로 나타낸다(n=3). p≤ 0.05 (*)의 값은 유의성이 있는 것으로 취한다.
도 2: 배양 배지에서 Link-N의 안정성. Link N은 배양 배지에서 37℃, 5% CO2에서 48h 동안 배양되었고, 무손상(intact) 펩티드의 피크 강도는 분광분석법에 의해 측정되었다. 6, 12, 24, 36 및 48 h 시점에서 분취액(aliquots)이 분석되었다. 데이터는 0 시점의 신호 강도와 비교하여 비율로써 플롯된다. 이 플롯은 3가지 대표 실험중 하나이다.
도 3: 세포 존재하에서 Link-N의 안정성. Link N은 인간 NP (a) 또는 AF (b) 세포 존재하에서 37℃, 5% CO2에서 48h 동안 배양되었고, 무손상 펩티드의 피크 강도는 분광분석법에 의해 측정되었다. 6, 12, 24, 36 및 48 h 시점에서 분취액(aliquots)이 분석되었다. 데이터는 0 시점의 신호 강도와 비교하여 비율로써 플롯된다. 이 플롯은 3가지 상이한 기증자의 세포로 실행된 3가지 대표 실험중 하나이다.
도 4: 프로세스된(processed) Link N의 질량분석이다. (a) 배지에서 탐지된 인간 NP (검정) 및 AF (회색) 세포로부터 펩티드의 질량 스펙트럼이다. 964.4 Da 질량의 단편화된 Link N은 그래프에 표시된다. 964.4 Da 펩티드는 2가지 상이한 영역, 대략 23min 및 32min의 정체시간에서 컬럼으로부터 용리되었다. ( b) 964.4 Da의 2가지 가능한 Link N 단편들, Link N 1-8 (짙은 갈색으로 표시됨) 및 Link N 4-11 (밝은 갈색으로 표시됨)의 도식적 설명. (c) 생성된 964.4 Da 단편의 아미노산 서열은 텐덤(tandem) MS에 의해 확인되었다. 상기 서열은 이 펩티드의 생성된 단편화 산물의 평가에 의해 확인되었다. 주요 탐지 피크는 A [(845.3Da) DHLSDNY(+1)], B [(682.28Da) DHLSDN(+1)] 및 C [(568.2Da) DHLSD (+1)], 1-8 서열에 의해서만 생성될 수 있는 덩어리이다.
도 5: Link N 단편들에 반응하여 소와 인간 세포에서 프로테오글리칸 합성. Link N (1 ㎍/mL), Link N 1-8 (0.5 ㎍/mL), Link N 9-16 (0.5 ㎍/mL) 또는 펩티드 보충없는 배지 존재하에 48h 후, 35SO4 혼입을 평가함으로써, 합성은 추정되었다. 소의 속질핵 (NP) 및 섬유륜 (AF) (a), 그리고 인간 속질핵 (NP)과 내측 섬유륜 (iAF) 세포 (b)에서 상대적 프로테오글리칸 발현을 나타낸다. 데이터는 오로지 배지에만 노출된 대조 세포에 의한 혼입과 비교하여 비율의 평균 +SD로 나타낸다(n=3). p≤ 0.05 (*)의 값은 유의성이 있는 것으로 취한다.
도 6: 단백질분해효소에 Link 1-16의 노출은 디스크 퇴행과 관련된 것으로 설명된다. Link 1-16은 MMPs 3, 7, 12, 13, 카텝신 L, K, 및 B, ADAMTS 4, 5 그리고 HTRA1에 노출되었고, 피크 면적 강도는 분광분석법을 이용하여 정량화되었다. A, 무손상 Link N 1-16, 펩티드의 상대적 강도. B Link N 1-8, 펩티드의 상대적 강도. C Link N 9-16, 펩티드의 상대적 강도.
도 7: 염증성 환경에서 Link N 단편들에 반응하여 소와 인간 세포에서 프로테오글리칸 합성. Link N (1 ㎍/mL), Link N 1-8 (0.5 ㎍/mL), Link N 9-16 (0.5 ㎍/mL)이 보충된 IL-1이 포함된 배지, 또는 펩티드 보충없는 배지 존재하에 48h 후, 35SO4 혼입을 평가함으로써, 합성은 추정되었다. 소의 속질핵 (NP) 및 섬유륜 (AF) (A), 그리고 인간 속질핵 (NP) 및 내측 섬유륜 (iAF) 세포 (B)에서 상대적 프로테오글리칸 발현을 나타낸다. IL-1-함유 배지에 노출된 세포에 의해 생산된 프로테오글리칸과 비교하여 비율의 평균 ±SD로 나타낸다(n=3). p≤ 0.05 (*)의 값은 유의성이 있는 것으로 취한다.
도 8: 염증성 환경에서 Link N 단편들에 반응하여 인간 골관절염 (OA) 연골에서 프로테오글리칸 (GAG) 농도. Link N (1㎍/ml), IL-1-함유 배지 (5ng/ml)로 21일간 배양되고, Link N 및 IL-1에 공동-노출된, 또는 펩티드 보충없는 배지 (대조군)에 노출된 OA 연골 체외이식편(explants)에서 프로테오글리칸 농도가 측정되었다. 결과는 대조군에 대하여 정상화시킨, 연골 안에 유지된 GAG 백불율로 나타낸다. p≤ 0.05 (*)의 값은 유의성이 있는 것으로 취한다.
도 9: 인간 골관절염 연골에서 아그레칸 코어 단백질 및 새로이 합성된 유형 II 콜라겐의 분석. (A) 대조군, Link N, IL-1 그리고 Link N와 IL-1 모두로 처리된 연골에서 아그레칸 (AGG) 코어 단백질의 면역블랏팅(immunoblotting) 및 분자량 약 320 kDa을 가진 무손상 아그레칸 코어 단백질의 반-정량적(semi-quantitative) 분석. (B) 대조군, Link N, IL-1 그리고 Link N 및 IL-1 모두로 처리된 연골에서 유형 II 콜라겐 (Col II)의 면역블랏팅과 분자량 360 kDa을 가진 콜라겐의 반-정량적 분석. 결과는 상이한 기증자의 4개 연골 시료의 평균 ± SD로 나타낸다 (* p<0.05).
도 10: 인간 골관절염 연골에서 MMP-13 및 유형 X 콜라겐 (Col X) 발현 분석. (A) 대조군, Link N, IL-1 및 Link N 및 IL-1 모두로 처리된 연골에서 MMP-13의 면역블랏팅과 분자량 55 kDa을 가진 MMP-13 단백질의 반-정량적 분석. (B) 대조군, Link N, IL-1 및 Link N 및 IL-1 모두로 처리된 연골에서 유형 X 콜라겐의 면역블랏팅과 분자량 60 kDa을 가진 콜라겐 알파 쇄의 반-정량적 분석. 결과는 상이한 기증자의 4개 연골 시료의 평균 ± SD로 나타낸다 (* p<0.05).
도 11: 염증성 환경에서 Link N이 보충된, OA 및 정상 기증자로부터 취한 연골 세포(chondrocytes)에서 NFkB의 분석. 연골세포(chondrocytes) 대조군, Link N 처리된, IL-1 처리된, Link N (10ng/ml) + IL-1, Link N (100ng/ml) + IL-1 및 Link N (1000ng/ml) + IL-1에서 NFkB의 웨스턴 블랏 분석. 결과는 상이한 기증자들의 3개 실험의 평균 ± SD로 나타낸다 (* p<0.05). 이들 결과에서 NF-kB의 IL-1 유도된 활성화는 정상 인간 연골세포(chondrocytes) (A) 및 OA 연골세포 (B)에서 Link N에 의해 투여분량(dose) 의존적으로 억제된다는 것이 설명된다.
도 12: 디스크에서 프로테오글리칸 농도. 유도된 퇴행이 있는 디스크, Link N, MSCs, Link N 및 MSCs 모두로 처리된 디스크와 비-대조군 퇴행성 디스크에서 프로테오글리칸 농도가 측정되었다. 결과는 상이한 소 꼬리로부터 취한 7개의 디스크의 평균 ± SD로 나타낸다 (* p<0.05).
도 13: 디스크에서 프로테오글리칸의 크기 분포. 상이한 처리를 받은 7개의 디스크로부터 단리된 프로테오글리칸을 모으고, 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석되었다. 프로테오글리칸은 톨루이딘(Toluidine) 블루 착색에 의해 시각화되었다.
도 14. 디스크에서 아그레칸 코어 단백질의 분석. 퇴행 대조군, Link N 처리된, MSCs 처리된, Link N 및 MSCs 모두로 처리된, 그리고 퇴행없는 대조군 디스크에서 약 320kDa의 분자량을 갖는 무손상 아그레칸 코어 단백질의 면역블랏팅 및 반-정량적 분석. 결과는 상이한 소 꼬리로부터 취한 7개의 디스크의 평균 ± SD로 나타낸다 (* p<0.05).
도 15. 디스크에서 새로이 합성된 유형 II 콜라겐의 분석. 퇴행 대조군, Link N 처리된, MSCs 처리된, Link N 및 MSCs 모두로 처리된, 퇴행없는 대조군 디스크에서 약 120kDa의 분자량을 갖는 유형 II 콜라겐 알파 쇄의 면역블랏팅 및 반-정량적 분석. 결과는 상이한 소 꼬리로부터 취한 7개의 디스크의 평균 ± SD로 나타낸다 (* p<0.05).
도 16: 디스크의 속질핵 영역에서 프로테오글리칸 분포. 트립신-유도된 퇴행을 가진 디스크는 다음의 주사후 14 일 동안 배양되었다: Link N, MSC 또는 Link N 및 MSCs. 대조군 퇴행성 디스크 및 대조군 비-퇴행성 디스크와 비교되었다. 이들 디스크는 사프라닌(Safranin) O 착색 (눈금막대, 100 ㎛)를 이용하여 조직학적으로 평가되었다.
도 17: MSCs의 라벨링 및 추적. A. MSC 세포 막은 PKH67 키트 (녹색 형광, 화살표)를 이용하여 라벨되었으며, 라벨링 효과는 형광 현미경을 이용하여 평가되었다. B. 라벨된 MSCs는 2일 동안 확장 배지에서 배양되었고, 유지된 라벨링은 형광 현미경에 의해 확인되었다. C. 라벨된 MSCs의 존재는 장기 배양물에서 14일 후 NP 영역에서 측정되었다. D. C의 확대.
도 18: 트립신-유도된 퇴행 후 2주 시점에서 소의 디스크 장기 배양물에서 프로테오글리칸 합성, 아그레칸 및 유형 II 콜라겐 발현에 대한 Link N 1-8의 효과. (A) 유도된 퇴행을 가진 디스크, 유도된 퇴행을 가지고, Link N 1-8로 처리된 디스크, 그리고 비-퇴행성 대조군 디스크에서 2주 후 디스크 안 프로테오글리칸 농도가 측정되었다. 결과는 상이한 소 꼬리로부터 취한 3개의 디스크의 평균 ± SD로 나타낸다 (* p<0.05). (B) 유도된 퇴행을 가진 디스크, 유도된 퇴행을 가지고, Link N 1-8로 처리된 디스크, 비-퇴행성 대조군 디스크 및 Link N 1-8로 처리된 비-퇴행성 디스크에서 처리 후 2주 시점에서 분자량 약 360kDa의 새로이 합성된 유형 II 콜라겐의 면역블랏팅 및 반-정량적 분석. 결과는 상이한 소 꼬리로부터 취한 7개의 디스크의 평균 ± SD로 나타낸다 (* p<0.05). (C) 유도된 퇴행을 가진 디스크, 유도된 퇴행을 가지고, Link N 1-8로 처리된 디스크, 비-퇴행성 대조군 디스크 및 Link N 1-8로 처리된 비-퇴행성 디스크에서 처리 후 2주 시점에서 분자량 약 320kDa의 무손상 아그레칸 코어 단백질의 면역블랏팅 및 반-정량적 분석. 결과는 상이한 소 꼬리로부터 취한 7개의 디스크의 평균 ± SD로 나타낸다 (* p<0.05).
도 19: 아그레칸 G1 도메인과 히알루론산염 사이의 상호작용을 안정화시키는 링크 단백질의 도식적 설명. Link 단백질 (LP)은 아그레칸 G1 도메인과 히알루론산염 (HA) 사이의 상호작용을 안정화시킨다. 이 도면은 또한 인간 Link N [DHLSDNYTLDLDRAIH] 및 소의 Link N [DHHSDNYTVDHDRVIH], 링크 단백질의 N-말단 부분을 나타내고, 그리고 소의 서열에서 발생되는 것과 같이 잔기의 치환(굵게 표시됨)을 강조한다.
도 20: 인간 또는 소의 Link N이 보충된 알긴산염에서 배양된 소의 추간판 세포의 세포 생존력(viability). 세포 생존력은 LIVE/DEAD ® 생존력 /세포독성 분석에 의해 측정되었다. 알긴산염에 매립된 소의 추간판 (IVD) 세포는 1ug/ ml 소의 (BLN) 또는 인간 (HLN) Link N 보충된 배지에서 18일 동안 배양되었다. 동일한 기간 동안 배지에서 배양된 비드(Beads)는 대조군 (CTL)으로 이용되었다. 18 일 후, 상기 비드는 회수되었고, 세포 생존력이 평가되었다. 모든 비드의 세포 생존력은 > 98%에서 평가되었다 (백색 밝은 반점들).
도 21: 축적된 글리코사미노글리칸은 1.2% 알긴산염에서 비이드화된(beaded) 소의 속질핵 세포에 의해 배양 배지로 방출된다. 1.2% 알긴산염에서 비이드화된 소의 속질핵 (NP) 세포는 소의 (BLN) 또는 인간 (HLN) Link N (1㎍/ml)이 보충된 배지에서 배양되었거나, 또는 단독 배지(CTL)에 노출되었다. 각 조건의 경우, 배지는 배양 3, 6, 9, 12, 15, 및 18 일차에 수집되었다. 배지로 방출된 황산염 글리코사미노글리칸 (GAG)은 1,9-디메틸메틸렌 블루 (DMMB) 염료-결합 분석에서 측정되었다. 결과는 박스 플롯(box plot)으로 나타내는데, 이때 박스는 삼중으로 실행된 3가지 독립 실험의 복합 데이터의 중간 50% (25%-75% 백분위수)을 나타낸다 (*p < 0.05 또는 ***p < 0.0001).
도 22: 축적된 글리코사미노글리칸은 1.2% 알긴산염에서 비이드화된 소의 섬유륜 세포에 의해 배양 배지로 방출된다. 1.2% 알긴산염에 매입된 소의 섬유륜 세포(AF)는 소의 (BLN) 또는 인간 (HLN) Link N (1㎍/ml)이 보충된 배지에서 배양되었거나, 또는 단독 배지(CTL)에 노출되었다. 각 조건의 경우, 배지는 배양 3, 6, 9, 12, 15, 및 18 일차에 수집되었다. 배지로 방출된 황산염 글리코사미노글리칸 (GAG)은 1,9-디메틸메틸렌 블루 (DMMB) 염료-결합 분석에서 측정되었다. 결과는 박스 플롯으로 나타내는데, 이때 박스는 삼중으로 실행된 3가지 독립 실험의 복합 데이터의 중간 50% (25%-75% 백분위수)을 나타낸다 (*p < 0.005 또는 ***p < 0.0001).
도 23: 아그레칸 유전자 발현에서 변화. 1㎍/ml 소의 (BLN) 또는 인간 Link N (HLN)이 보충된 배지에서 배양후 1주일 시점에 1.2% 알긴산염에서 비이드화된 소의 섬유륜 (AF) 및 속질핵 (NP) 세포의 아그레칸 (AGG) 유전자 발현에서 변화. 유전자 발현은 RT-PCR에 의해 측정되었다. 18S rRNA는 하우스키핑(housekeeping) 유전자로 이용되었으며, 결과를 정상화시키는 기능을 하였다. 값들은 단독 배지 (CTL)에 노출된 세포와 비교하여, Link N에 노출된 세포의 유전자 발현 비율로 나타낸다. (*p < 0.05, **p < 0.001).
도 24: 아그레칸 ADAMTS-4 및 ADAMTS-5 유전자 발현에서 변화. 1㎍/ml 소의 (BLN) 또는 인간 Link N (HLN)이 보충된 배지에서 배양후 1주일 및 2주일 시점에 1.2% 알긴산염에서 비이드화된 소의 섬유륜 (AF) 및 속질핵 (NP) 세포의 (A, B) ADAMTS-4 및 (C, D) ADAMTS-5 유전자 발현에서 변화. 유전자 발현은 RT-PCR에 의해 측정되었다. 18S rRNA는 하우스키핑(housekeeping) 유전자로 이용되었으며, 결과를 정상화시키는 기능을 하였다. 값들은 단독 배지 (CTL)에 노출된 세포와 비교하여, Link N에 노출된 세포의 유전자 발현 비율로 나타낸다. (*p < 0.05, **p < 0.001).
도 25: 소의 섬유륜 속질핵 세포에서 Smad1/5 활성화에 있어서 소의 또는 인간 Link N의 효과. 소의 섬유륜 (AF) 및 속질핵 (NP) 세포들은 1㎍/ml의 소의 (BLN) 또는 인간 Link N (HLN)이 보충된 배지에서 6h 동안 배양되었다. 단백질 발현은 전체 Smad1 및 포스포-Smad1/5에 대한 특이적 항체를 이용한 면역블랏팅에 의해 분석되었다. 삼중으로 실행된 3가지 독립 실험의 복합 데이터를 나타내는 정량적 결과는 평균±표준 편차로 나타낸다 (*p<0.05; **p<0.01; † p<0.001; § p < 0.0001). 겔 상의 밴드들은 하나의 대표 실험의 것을 나타낸다.
도 26: 소의 섬유륜 속질핵 세포에서 Smad2 활성화에 있어서 소의 또는 인간 Link N의 효과. 소의 섬유륜 (AF) 및 속질핵 (NP) 세포들은 1㎍/ml의 소의 (BLN) 또는 인간 Link N (HLN)이 보충된 배지에서 6h 동안 배양되었다. 단백질 발현은 전체 및 포스포-Smad2에 대한 특이적 항체를 이용한 면역블랏팅에 의해 분석되었다. 삼중으로 실행된 3가지 독립 실험의 복합 데이터를 나타내는 정량적 결과는 평균±표준 편차로 나타낸다 (*p<0.05). 겔 상의 밴드들은 하나의 대표 실험의 것을 나타낸다.
도 27: 퇴행이 있는 등급 2 내지 4 (AF 및 NP 영역)의 인간 디스크에서 NGF 발현. 이 도면은 인간 IVD에서 NGF 발현은 퇴행을 증가시킨다는 것을 보여주는 일련의 조직 착색 및 면역블랏이다.
도 28: Link N은 섬유륜 (AF) 세포에서 뉴로트로핀 (NGF 및 BDNF)과 물질 P (TAC1)의 TNFα 자극된 발현을 억제시킨다. 등급 2 인간 디스크의 AF 세포들은 Link N (1㎍/ml) + TNFα (100ng/ml) 또는 TNFα (100ng/ml) 단독으로 24hrs 동안 자극받았다. 결과는 4사람의 상이한 기증자의 4개 독립적인 실험의 평균 ± SD로 나타낸다. * p<0.05 vs. 대조군.
도 29: Link N은 섬유륜 (AF) 세포에서 뉴로트로핀 (NGF 및 BDNF)과 물질 P (TAC1)의 IL-1β 자극된 발현을 억제시킨다. 등급 2 인간 디스크의 AF 세포들은 Link N (1㎍/ml) + IL-1β (10ng/ml) 또는 IL-1β (10ng/ml) 단독으로 24hrs 동안 자극받았다. 결과는 4사람의 상이한 기증자의 4개 독립적인 실험의 평균 ± SD로 나타낸다. * p<0.05 vs. 대조군.
도 30: Link N은 뉴로트로핀 (TRKA 및 TRKB)과 물질 P (TAC1R) 수용체들의 TNFα 자극된 발현을 억제시킨다. Link N (1㎍/ml) + TNFα (100ng/ml) 또는 TNFα (100ng/ml) 단독 보충으로 자극을 받은 후 24hrs 후, 등급 2 인간 디스크의 섬유륜 (AF) 세포들에 의한 뉴트로핀 및 물질 P 유전자 발현에서의 변화. 결과는 4사람의 상이한 기증자의 4개 독립적인 실험의 평균 ± SD로 나타낸다. * p<0.05 vs. 대조군.
도 31: Link N은 뉴로트로핀 (TRKA 및 TRKB)과 물질 P (TAC1R) 수용체들의 Il-1베타 자극된 발현을 억제시킨다. Link N (1㎍/ml)+ IL-1β (10ng/ml) 또는 IL-1β (10ng/ml) 단독 보충으로 자극을 받은 후 24hrs 후, 등급 2 인간 디스크의 섬유륜 (AF) 세포들에 의한 뉴트로핀 및 물질 P 유전자 발현에서의 변화. 결과는 4사람의 상이한 기증자의 4개 독립적인 실험의 평균 ± SD로 나타낸다. * p<0.05 vs. 대조군.
도 32: NGF 유전자 발현 및 Link N과 함께 배양된 AF 세포의 배지로 방출된 NGF 유전자 발현 분석. Link N, IL-1β, 또는 Link N 및 IL-1β으로 처리된 등급 4 AF 세포에서 분자량 약 27kDa의 NGF 단백질의 웨스턴 블랏 및 반-정량적 분석. 결과는 상이한 기증자들의 4개 디스크의 평균 ± SD로 나타낸다 (* p<0.05).
도 33: 소의 꼬리뼈 IVD 사진과 Link N은 손상된 소의 IVD로부터 물질 P 방출을 감소시킨다는 것을 보여주는 도표다. 캡사이신으로 처리, 천자만 된 경우 또는 천자 + Link N (10㎍/ml) 보충으로 처리된 후 4 또는 24hr 후, 소의 디스크에서 물질 P 방출 변화. 결과는 4개 독립적인 실험의 평균 ± SD로 나타낸다. *p<0.05 vs. 대조군.
I. 정의
용어 "연골 세포(cartilage cell)"는 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 예를 들면, 연골 조직에서 볼 수 있는, 연골세포(chondrocyte) 계통 세포를 의미하며, 그리고 연골 조직을 만드는데 이용될 수 있다.
용어 "연골세포 계통 세포(chondrocyte lineage cells)"는 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 연골세포(chondrocytes), 그리고 세포화학적으로 유사하며, 연골세포 표지, 예를 들면, Sox9 및 콜라겐 II가 포함된 연골 세포 표지들을 발현시키고, 그리고 연골세포로 거동하는 세포를 의미한다. 상기 연골세포는 관절 연골 계통 연골세포 또는 비대해질 수 있는 비대성(hypertrophic) 계통 연골세포들이 될 수 있다.
용어 "연골 조직(cartilage tissue)"은 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 연골 조직, 그리고 조직학적으로 유사하고, 그리고 연골 표지들, 예를 들면, 콜라겐 II 및 아그레칸을 발현시키고, 그리고 관절 연골 조직 및/또는 성장판 연골 유사 조직이 포함된, 연골로 거동하는 조직을 말한다.
용어 "보존적 변이체(conservative variant)"란 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 Link N 폴리펩티드 단편을 말한다.
"보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)"이란 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상기 펩티드의 바람직한 성질의 폐기 없이, 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 적합한 보존적 아미노산 치환은 서로 유사한 소수성, 극성, 그리고 R-쇄 길이를 갖는 아미노산으로의 치환에 의해 만들어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환의 예로는 다음을 포함한다:
Figure pct00001
용어 "배양(culturing)"이란 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 흡착성, 현탁액 또는 3D 세포 및/또는 장기(organ) 배양에서 세포를 항온처리하고 및/또는 계대하는 것을 말한다. 상기 3D 세포 또는 장기(organ) 배양이란 세포들이 3-차원 골격(scaffold)에서 또는 골격 상에서 배양되는, 배양을 포함할 수 있다.
용어 "디스크 세포(disc cell)"는 본 명세서에서 사용된 바와 같이, NP 또는 AF 세포 계통의 세포를 말한다.
용어 "농축(enriching)" 또는 "농축된(enriched)"이란 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 한 가지 유형의 세포 수율(분율)이 출발 배양물 또는 조제물(preparation)에 있는 이 유형의 세포 분율과 비교하여, 최소한 약 10%, 최소한 약 20%, 최소한 약 30%, 최소한 약 40%, 최소한 약 50% 또는 최소한 약 60% 증가된다는 것을 의미한다. 농축과 부분적인 정제는 호환이용될 수 있다.
세포 집단은 상이한 방법들, 이를 테면, 표지들, 이를 테면, 세포 표면 표지들에 근거한 방법 (가령, FACS 소팅(sorting) 등)을 이용하여 농축될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현하다(express)"란 세포에서 폴리뉴클레오티드의 전사 또는 폴리펩티드의 해독을 지칭하며, 해당 분자의 수준은 세포가 분자 (가령, Link N 단편)에 접촉되지 않거나 노출되지 않은 경우보다, 이 분자에 접촉 또는 노출된 세포에서 해당 분자의 수준이 측정가능할 정도로 더 높아진 것을 말한다. 분자의 발현을 측정하는 방법은 당업계 숙련자들에게 잘 공지되어 있으며, 노던 블랏팅, RT-PCR, 제자리 혼성화(in situ hybridization), 웨스턴 블랏팅, 그리고 면역착색 이를 테면, FACS이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
용어 "혼성화되다(hybridize)"란 상보적 핵산과 서열 특이적 비-공유적 결합 상호작용을 지칭한다. 상기 혼성화는 최소한 중간수준의 엄격성(stringent) 조건하에서 실행된다. 바람직한 구체예에서, 상기 혼성화는 매우 엄격한 조건하에서 실행된다. 혼성화를 촉진시키는 적절한 엄격성 조건은 당업자들에게 공지되어 있거나, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 6.3.6에서 찾아볼 수 있다. 예를 들면, 6.0 x 염화나트륨/구연산나트륨 (SSC), 약 45℃에서 15 분 동안, 이어서 2.0 x SSC, 50℃에서 15 분 동안 세척이 이용될 수 있다. 상기 엄격성은 세척 단계에 이용된 조건에 근거하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 세척 단계의 염 농도는 약 0.2 x SSC, 50℃에서 15 분 동안의 높은 엄격성으로부터 선택될 수 있다. 추가적으로, 세척 단계에서 온도는 높은 엄격성 조건, 약 65℃에서 15 분 동안이 될 수 있다.
"최소한 중간수준의 엄격성 혼성화 조건"이란 용액 안에 2개의 상보적 핵산 분자들 간의 선택적 혼성화를 촉진시키는 조건이 선택된다는 것을 의미한다. 혼성화는 핵산 서열 분자의 전부 또는 일부분에서 발생될 수 있다. 상기 혼성화 부분은 전형적으로 길이가 최소한 15 (가령, 20, 25, 30, 40 또는 50)개의 뉴클레오티드이다. 당업계 숙련자는 핵산 듀플렉스, 또는 하이브리드(hybrids)의 안정성은 Tm에 의해 결정되는데, 이는 나트륨 함유된 완충액에서 나트륨 이온 농도와 온도의 함수가 된다는 것을 인지할 것이다 (Tm = 81.5℃ - 16.6 (Log10 [Na+]) + 0.41(%(G+C) - 600/l), 또는 유사한 식). 따라서, 하이브리드 안정성을 결정하는 세척 조건에서 매개변수는 나트륨 이온 농도와 온도다. 공지의 핵산 분자와 유사하지만, 그러나 동일하지 않는 분자를 식별해내기 위하여, 1% 미스매취(mismatch)는 Tm의 약 1℃ 감소를 초래하는 것으로 추정할 수 있고, 예를 들면, >95% 서열 동일성(identity)을 보유한 핵산 분자를 찾는다면, 최종 세척 온도는 약 5℃ 감소될 것이다. 이러한 고려사항에 근거하여, 당업자는 적절한 혼성화 조건을 용이하게 선택할 수 있을 것이다. 바람직한 구체예들에 있어서, 엄격성 혼성화 조건이 선택된다. 예로써, 다음 조건을 이용하여 엄격성 혼성화를 실행할 수 있는데: 상기 식에 기초하여, Tm - 5℃에서 5x 염화나트륨/구연산나트륨 (SSC)/5x Denhardt 용액/1.0% SDS에서 혼성화, 이어서 60℃에서 0.2x SSC/0.1% SDS에서 15 분 동안 세척. 중간수준의 엄격성 혼성화 조건은 42℃에서 3x SSC에서 15 분 동안 세척 단계를 포함한다. 그러나, 대체 완충액, 염 및 온도를 이용하여 등가의 엄격성이 획득될 수 있다고 인지된다. 혼성화 조건에 관계되는 추가 지침은 다음에서 찾아볼 수 있다: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6 및 in: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000, Third Edition.
용어 "서열 동일성(identity)"이란 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 2개의 폴리펩티드 서열 또는 2개의 핵산 서열 간에 서열 동일성 백분율을 지칭한다. 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위하여, 상기 서열들은 최적의 비교 목적으로 배열되며 (가령, 제 2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적의 배열을 위하여 제1 아미노산 또는 핵산 서열에 갭이 도입될 수 있다). 그 다음 대응하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 위치에서 해당 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제 1 서열의 한 위치를 제 2 서열의 대응 위치에 있는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 차지하는 경우, 이들 분자는 해당 위치에서 동일하다. 2개의 서열 간의 동일성 백분율은 이들 서열에 의해 공유되는 동일한 위치들의 수에 대한 함수가 된다 (즉, % 동일성=동일하게 중첩되는 위치의 갯수/전체 위치의 갯수 X 100%). 한 구체예에서, 상기 2개의 서열은 길이가 동일하다. 2개의 서열 간의 동일성 백분율 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 또한 실행될 수 있다. 2개의 서열 비교를 위하여 이용된 수학적 알고리즘의 바람직한 예는 Karlin and Altschul의 알고리즘, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268, Karlin and Altschul의 변형 알고리즘, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877이지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 알고리즘은 Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된다. 본 출원의 핵산 분자들에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 획득하기 위하여, BLAST 뉴클레오티드 조사는 NBLAST 뉴클레오티드 프로그램 매개변수 세트, 가령, 점수=100, 단어길이=12로 실행될 수 있다. 본 발명에서 설명된 단백질 분자에 대하여 상동성인 아미노산 서열을 획득하기 위하여, BLAST 단백질 조사는 XBLAST 프로그램 매개변수 세트, 가령, 점수-50, 단어길이=3으로 실행될 수 있다. 비교 목적으로 갭이 도입된 배열을 획득하기 위하여, Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에서 설명된 바와 같이, Gapped BLAST가 이용될 수 있다. 대안으로, PSI-BLAST는 분자들 사이의 먼거리 상관관계를 탐지하기 위한 반복(iterated) 조사를 실행하는데 이용될 수 있다 (Id.). BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 이용할 때, 해당 프로그램 (가령, XBLAST 및 NBLAST의)의 디폴트 매개변수가 이용될 수 있다 (가령, NCBI 웹사이트 참고). 두 서열 간의 동일성 백분율은 갭을 허용하거나 또는 허용하지 않고, 상기에서 설명된 것과 유사한 기술을 이용하여 결정될 수 있다. 동일성 백분율을 계산함에 있어서, 전형적으로 정확하게 일치되는 것만 계산된다. 한 구체예에서, 상기 단리된 핵산들은 프라이머로써 유용하다.
용어 "단리된(isolated)"이란 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 한 성분을 포함하는 혼합된 또는 이질적 환경으로부터 제거되고, 분리된 성분(가령, 폴리펩티드, 핵산, 재조합 세포, 유도된 세포)을 지칭한다. 예를 들면, 폴리펩티드에 있어서, 용어 "단리된 폴리펩티드"란 재조합적으로 생산될 때 세포성 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없는, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는, 단백질성 물질, 이를 테면, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 쇄에서 서로 결합된 다수의 아미노산 잔기로 구성된 폴리머를 말하며, 여기에는 자연 발생적 아미노산 뿐만 아니라 변형된 염기가 포함된 폴리머가 포함될 수 있다.
핵산에 있어서, 이는 A, G, T, C 및 또는 변형된 잔기의 폴리머를 말하며, 이를 테면, 재조합형 DNA 기법으로 생산될 때 세포성 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없는, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 DNA, RNA 및 cDNA를 의미한다. "단리된 핵산(isolated nucleic acid)"은 이 핵산이 유도된 핵산의 측면에 자연적으로 있던 서열(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)이 실질적으로 없다. 용어 "핵산(nucleic acid)"은 DNA와 RNA를 포함하는 것으로 의도되며, 이들은 이중가닥으로 되거나 또는 단일가닥일 수 있다.
단리된 세포 집단에 있어서, 혼합된 또는 이질적 세포 집단으로부터 제거되고, 분리된 세포 집단을 말한다. 일부 구체예들에서, 단리된 집단은 이 세포가 단리된 또는 농축된 이질적 집단과 비교하였을 때, 실질적으로 순수한 세포 집단이다.
용어 "Link N"는 본 명세서에서 사용된 바와 같이, MMP에 의해 Link 단백질로부터 절단된 자연 발생적 16개 아미노산 펩티드이며, 서열 DHLSDNYTLDHDRAIH을 갖는 인간의 Link N과 서열 DHHSDNYTVDHDRVIH을 갖는 소의 Link N을 포함한다. 관절 및 추간판 모두에서 생산되며, 디스크 (NP 및 AF)와 관절 연골 (연골세포) 세포에 의해 아그레칸/콜라겐 합성을 촉진시킨다.
용어 "Link N 단편"은 본 명세서에서 사용된 바와 같이, i) DHX1SDNYT, 여기에서 X1은 L 또는 H (서열 번호:1)이며; ii) i)의 보존적 변이체, 또는 iii) i) 또는 ii)의 단편으로부터 선택된 펩티드가 포함된 폴리펩티드를 의미하며; 여기에서 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 유지하며, 상기 펩티드는 15개 또는 그 미만의 아미노산이다. 상기 Link N 단편은 예를 들면, 서열 번호 1-6 중 임의의 하나에서 선택된 서열을 갖는 폴리펩티드, 생물학적 활성이 유지된 이의 보존적 변이체 및/또는 이의 단편일 수 있다.
용어 "간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell)" 또는 MSC는 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상이한 조건 하에서 하나 이상의 분화된 간엽 세포 유형으로 분화될 수 있는 능력을 가진 세포를 지칭한다. MSC는 유도된 간엽 줄기 세포 및 비-유도된 줄기 세포를 포함한다.
특정 세포 집단에 대하여 용어 "실질적으로 순수한(substantially pure)"이란 전체 세포 집단을 구성하는 세포에 대하여 최소한 약 65%, 바람직하게는 최소한 약 75%, 최소한 약 85%, 더 바람직하게는 최소한 약 90%, 그리고 가장 바람직하게는 최소한 약 95% 순수한 세포 집단을 지칭한다.
용어 "개체(subject)"에는 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 포유류, 바람직하게는 인간이 포함된 동물계의 모든 구성원이 포함된다.
단리된 세포에 적용될 때, 용어 "처리하다(treat)", "처리하는(treating)", "처리(treatment)" 등등은 세포가 임의의 종류의 프로세스 또는 조건을 겪거나 세포 상에서 임의의 종류의 조작 또는 절차를 겪는 것이 포함된다. 개체에게 적용될 때, 이 용어는 개체에게 의학적 또는 외과적 집중, 진료 또는 관리를 제공하는 것을 의미한다.
개체에게 적용될 때, 용어 "치료(treatment)"는 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 임상적 결과가 포함된 유익한 또는 바람직한 결과를 얻는 것을 목표로 하는 접근법을 말하며, 여기에는 예를 들면, 연골 및/또는 디스크 조직 병리 치료를 위한 약학적 중재, 외과술, 방사능요법 및 자연요법(naturopathic) 중재 뿐만 아니라 연골 및/또는 디스크 조직 병리 치료를 위한 테스트 치료가 포함된, 의료적 절차 및 응용이 포함된다. 유익한 또는 바람직한 임상 결과는 탐지가능하거나 또는 탐지불가능한 하나 또는 그 이상의 증상 또는 상태의 개선, 질환 심각성의 감소, 질환 상태의 안정화 (예컨데, 악화되지 않음), 질환의 확산 방지, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 진정 (부분적이건 또는 전체적이건)이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 치료는 예를 들면, 상기 단리된 Link N 단편 폴리펩티드를 개체에게 투여하거나, 또는 상기 단리된 Link N 단편 폴리펩티드 및/또는 전술한 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 세포로 처리된 세포를 이식 또는 조직을 조직이식하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "투여하는(administering)", "이식하는(implanting)" 그리고 "조직이식(transplanting)"은 본 명세서에서 설명된 단리된 폴리펩티드, 세포, 조직 및/또는 산물이 원하는 부위로 도입된 세포가 최소한 부분적으로 위치를 잡을 수 있도록 하는 방법 또는 경로에 의해 개체에게 전달되는 문맥에서 호환이용된다. 상기 세포는 척추뼈 또는 관절에 직접 이식될 수 있고, 또는 대안으로 임의의 적절한 경로에 의해 투여되어, 개체 안에서 원하는 위치로 전달될 수 있다.
본 개시내용의 범위 이해에 있어서, 용어 "포함하는(comprising)" 및 이로부터 유도된 용어는 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 언급된 특징, 요소들, 성분들, 집단들, 정수, 및/또는 단계의 존재를 명시하지만, 다른 언급되지 않은 특징, 요소들, 성분들, 집단들, 정수들, 및/또는 단계들을 배제하지 않는, 개방형(open ended) 용어로 의도된다. 전술한 내용은 유사한 의미를 가진 단어들 이를 테면, 용어 "함유하는(including)", "갖는(having)" 및 이로부터 유도된 단어들에게 또한 적용된다.
용어 "구성하는(consisting)" 및 이로부터 유도된 용어들은 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 언급된 특징, 요소들, 성분들, 집단들, 정수, 및/또는 단계의 존재를 명시하고, 언급되지 않은 다른 특징, 요소들, 성분들, 집단들, 정수들, 및/또는 단계들의 존재는 배제되는, 폐쇄형(closed ended) 용어로 의도된다.
더욱이, 정도를 나타내는 용어, 이를 테면, "실질적으로(substantially)", "약(about)" 그리고 "대략적으로(approximately)"는 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 최종 결과가 유의미적으로 변화되지 않는, 변형된 용어의 합당한 양의 편차를 의미한다. 이들 정도를 나타내는 용어들은 이러한 편차가 변형된 단어의 의미를 무효화시키지 않는 경우, 변형된 용어의 최소한 ±5% 편차가 포함되는 것으로 간주되어야 한다.
더욱 구체적으로, 용어 "약(about)"은 기준이 되는 수치의 플러스 또는 마이너스 0.1 내지 50%, 5-50%, 또는 10-40%, 10-20%, 10%-15%, 바람직하게는 5-10%, 가장 바람직하게는 약 5%를 의미한다.
본 명세서와 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수("a", "an" 및 "the")형은 다른 명시적인 언급이 없는 한, 복수 개념을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "화합물"이 포함된 조성물은 2개 또는 그 이상의 화합물의 혼합물을 포함한다. 용어 "또는(or)"은 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 일반적으로 "및/또는"이 포함된 의미로 이용된다는 것 또한 주지해야 한다.
특정 단락들에서 설명된 정의 및 구체예들은 당업계 숙련자들이 인지할 수 있는, 적합한 것으로 설명된 다른 구체예들에게도 적용될 수 있다.
본 명세서에서 끝점에 의한 수치적 범위의 언급은 해당 범위 안에 있는 모든 숫자와 분율을 포함한다 (가령, 1 내지 5에는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4, 및 5가 포함된다). 또한, 모든 숫자와 이의 분율은 용어 "약(about)"의 사용으로 변형되는 것으로 추정됨을 또한 인지해야 한다.
더욱이, 설명된 정의 및 구체예들은 당업계 숙련자들이 인지할 수 있는, 적합한 것으로 설명된 다른 구체예들에게도 적용될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서의 구절에서. 본 발명의 상이한 측면들은 더욱 상세하게 정의된다. 정의된 각 측면은 명시적으로 반대 기재가 없는 한, 임의의 다른 측면 또는 측면들과 복합될 수 있다. 특히, 바람직한 또는 장점으로 표시된 임의의 특징은 자람직한 또는 장점으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 복합될 수 있다.
더욱이, 특정 단락들에서 설명된 정의 및 구체예들은 당업계 숙련자들이 인지할 수 있는, 적합한 것으로 설명된 다른 구체예들에게도 적용될 수 있다. 예를 들면, 이어지는 구절에서. 본 발명의 상이한 측면들은 더욱 상세하게 정의된다. 정의된 각 측면은 명시적으로 반대 기재가 없는 한, 임의의 다른 측면 또는 측면들과 복합될 수 있다. 특히, 바람직한 또는 장점으로 표시된 임의의 특징은 자람직한 또는 장점으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 복합될 수 있다.
III. 방법 및 산물들
본 명세서에서 설명된 바와 같이, 처음 8개 아미노산을 포함하는 Link N 단편은 장기(organ) 배양에서 세포외 프로테오글리칸 수준을 유도하고, 복원시키고, 그리고 염증성 환경이 포함된, 디스크 세포 및 연골 세포에서 프로테오글리칸 및 콜라겐 II 합성을 더 유도하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 실시예 3에서 설명된 바와 같이, 골관절염 체외이식편이 IL-1β 존재하에 Link N으로 처리될 때, 대조군과 비교하여, GAG 함량이 상당히 증가되었다. 웨스턴 블랏 분석에서, IL-1β 단독의 경우와 비교하여, MMP-13 활성형의 정량화에서 감소를 또한 유도한 것으로 밝혀졌다. IL-1β 존재하에서 OA 연골의 체외 이식편이 LinK N으로 처리되는 경우, 추출가능한 유형 II 콜라겐의 양은 또한 증가되었다. 정상 및 OA 환자의 연골 세포(chondrocytes)에서 Link N은 IL-1β 자극된 P-P65(NF-kB)를 상당히 저해하였다.
더욱이, 소의 Link N (BLN)은 인간 Link N (HLN)과 같이, 디스크 세포에서 프로테오글리칸 및 콜라겐 II 합성을 또한 유도하는 것이 증명된다.
Link N은 16개 아미노산 펩티드이다. 본 개시내용 이전에는 Link N의 단편들이 존재하는지 및/또는 활성이 있는지 알지 못하였다. 예를 들면 Wang et al (33)은 Link N 의 첫 12개 아미노산이 포함된 Link N 단편은 활성을 보유하지 않는다고 보고하였다.
한 측면은 다음으로부터 선택된 단리된 펩티드가 포함된 폴리펩티드 (본 명세서에서 Link N 단편 또는 Link N 단편 폴리펩티드로 지칭됨)를 포함한다:
i) DHX1X2X3 X4X5X6 (서열 번호: 1);
여기에서 X1은 임의의 아미노산, 임의적으로 L, H, R Q이며;
X2는 S 또는 L이며;
X3은 D, S 또는 N이며;
X4는 N 또는 D이며;
X5는 Y 또는 S이며; 그리고/또는
X6은 T 또는 Y이며;
ii) i)의 보존적 변이체; 및/또는
iii) i) 및/또는 ii)의 단편;
여기에서 상기 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 유지하고, 그리고 상기 펩티드는 15개 이하의 아미노산이다.
Link N 서열의 실시예는 실시예 10에서 제공된다. 한 구체예에서, Link N 단편 폴리펩티드는 실시예 10에서 설명된 서열, 또는 설명된 서열로부터 결정가능한 보존 모티프에 근거된 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 DHX1SX3 NYT(서열 번호: 2)로 구성된 펩티드를 포함하며; 여기에서 X1는 임의의 아미노산, 임의적으로 L, H, R Q이며; 그리고/또는 X3은 D, S 또는 N이며; 이의 보존적 변이체 및/또는 이의 단편이며; 여기에서 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 유지하며, 그리고 상기 펩티드는 15개 이하의 아미노산이다.
한 구체예에서 상기 단리된 폴리펩티드 (본 명세서에서 Link N 단편 또는 Link N 단편 폴리펩티드로 지칭됨)는 다음으로부터 선택된 펩티드를 포함한다:
i) DHX1SDNYT, 여기에서 X1는 L 또는 H이며(서열 번호: 3);
ii) i)의 보존적 변이체; 그리고
iii) i) 및/또는 ii)의 단편;
여기에서 상기 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 유지하고, 그리고 상기 펩티드는 15개 이하의 아미노산이다.
보존적 변이체 b)는 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 보존적 변이체 치환을 포함한다.
한 구체예에서 상기 생물학적 활성은 BMP 수용체 유형 II의 결합 및/또는 SMAD 1/5 활성의 활성화이다.
한 구체예에서, 포함된 보존적 변이체 폴리펩티드는 스크램블화된 또는 역(reverse) Link N과 비교하였을 때, BMP 수용체 II에 결합하고, 그리고 SMAD1/5 활성을 활성화시키는 것들이다.
상기 단편 c)는 예를 들면, 서열 번호:1, 2, 3, 4 또는 5의 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산 또는 7개 아미노산일 수 있다. 상기 단편은 N 말단 대부분의 아미노산 또는 C 말단 대부분의 아미노산을 포함할 수 있다.
예를 들면, 더 작은 단편들이 예를 들면, 실시예 9에서 설명된 바와 같이, 활성에 대하여 테스트될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 단편은 스크램블화된 또는 역(reverse) Link N과 비교하였을 때, BMP 수용체 II에 결합하고, 그리고 SMAD1/5 활성을 활성화시킨다.
BMP 수용체 유형 II 결합 및/또는 SMAD 활성화는 예를 들면, Wang et al (33) 문헌에서 설명된 바와 같이, 평가될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 펩티드는 DHX1SDNYT (서열 번호: 3) 또는 생물학적 활성을 유지하는 이의 보존적 변이체로 구되며; 여기에서 X1은 L 또는 H이다.
또 다른 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 DHLSDNYT (서열 번호: 4) 또는 생물학적 활성을 유지하는 이의 보존적 변이체로 구성된 펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 DHHSDNYT (서열 번호: 5) 또는 생물학적 활성을 유지하는 이의 보존적 변이체로 구성된 펩티드 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 DHLSDNYT (서열 번호: 4) 또는 DHHSDNYT (서열 번호: 5)로 구성된 펩티드 서열을 포함한다.
더 큰 단편들은 Link N (가령, 인간 또는 소의 Link N)의 최대 15개 아미노산을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 펩티드는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산이다.
따라서 한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 다음에서 선택된 펩티드 서열을 포함한다:
i) DHX1X2X3 X4X5X6X7 X8 X9DX10 X11X12, X13, (서열 번호: 6)
여기에서 X1은 임의의 아미노산, 임의적으로 L, H, R Q이며;
X2는 S 또는 L이며;
X3은 D, S 또는 N이며;
X4는 N 또는 D이며;
X5는 Y 또는 S이며;
X6은 T 또는 Y이며;
X7은 L V 또는 T이며;
X8은 임의의 아미노산, 임의적으로 D G, N 또는 P이며;
X9는 H Y 또는 P이며;
X10은 R 또는 Q이며;
X11은 A V 또는 D이며;
X12는 I 또는 R이며; 그리고/또는
X13은 H 또는 V이며;
ii) i)의 보존적 변이체; 및/또는
iii) i) 및/또는 ii)의 단편;
여기에서 보존적 변이체 및/또는 단편 생물학적 활성을 유지하며, 여기에서 상기 펩티드는 15개 이하의 아미노산이며, 하나 또는 그 이상의 연속 C 말단 및/또는 N 말단 잔기는 결실된다.
한 구체예에서 상기 단리된 폴리펩티드는 다음에서 선택된 펩티드를 포함한다:
i) DHX1SX3 NYTX7X8 HDRVIH (서열 번호: 7) 또는 DHX1SDNYTX7DHDRX12I (서열 번호: 8); 여기에서 X1은 L 또는 H이며, X7은 L 또는 V이며 및/또는 X12는 A 또는 V이며;
ii) i)의 보존적 변이체; 그리고
iii) i) 및/또는 ii)의 단편;
여기에서 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 유지한다.
또 다른 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열 DHLSDNYTLDHDRAI (서열 번호: 9) 또는 생물학적 활성을 유지하는 이의 보존적 변이체 및/또는 단편을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열 DHHSDNYTVDHDRVI (서열 번호: 10) 또는 생물학적 활성을 유지하는 이의 보존적 변이체 및/또는 단편을 포함한다.
본 명세서에서 소의 Link N 및 인간 Link N은 생물학적 활성을 보유하고, 81% 서열 동일성을 공유하는 것으로 설명된다. 따라서, 한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 대하여 최소한 80%, 85%, 90%, 95% 서열 동일성을 갖는 펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 서열 번호: 4의 X1, X2 및/또는 X3에 상응하는 잔기들은 변형된다.
한 구체예에서 상기 단편은 서열 번호: 4, 5 또는 6의 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산 또는 15개 아미노산이다. 상기 단편은 N 말단 대부분의 아미노산 또는 C 말단 대부분의 아미노산을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 단편은 스크램블화된 또는 역(reverse) Link N과 비교하였을 때, BMP 수용체 II에 결합하고, 그리고 SMAD1/5 활성을 활성화시킨다.
한 구체예에서, 상기 단리된 펩티드는 고형 지지대, 임의적으로 겔 유형 지지대 이를 테면, 기능성 기들, 예를 들면, 폴리스티렌이 분포된 용매화된 폴리머: 1-2% 디비닐벤젠과 가교-연계된 스티렌; 폴리아크릴아미드: 폴리스티렌의 친수성 대체물; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG): PEG-폴리스티렌 (PEG-PS)에 접합된다. 한 구체예에서 상기 고형 지지대는 예를 들면, PEG-폴리프로필렌 글리콜 네트워크 또는 폴리아미드 또는 폴리스티렌과 PEG를 포함하는, PEG-기반의 지지대이다. 한 구체예에서, 상기 고형 지지대는 예를 들면, 조절된 구멍 유리, 셀룰로오스 섬유, 많이 가교-연계된 폴리스티렌이 포함된, 표면-유형 지지대이다. 한 구체예에서, 상기 고형 지지대는 복합물(composite) 예를 들면, 견고한 매트릭스에 의해 지지된 겔-유형 폴리머다.
한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 보호된 기(groups)들을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 N-말단 보호기를 갖는다. 한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 C-말단 보호기를 갖는다. 한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 측쇄 변화 보호기를 갖는다.
한 구체예에서, 상기 단리된 펩티드는 N 보호된 기를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 Fmoc 보호기를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 t-Boc 보호기를 포함한다. Fmoc. 한 구체예에서, 상기 보호기는 벤질로지 카르보닐 (Z) 기이다. 한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 alloc 보호기를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 평판(lithographic) 보호기를 갖는다.
한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 덴드라이머(dendrimer) 형태이거나 또는 포함된다. 한 구체예에서, 상기 덴드라이머는 본 명세서에서 설명된 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개 또는 그 이상의 단리된 폴리펩티드가 덴드라이머 골격에에 접합된 것을 포함한다. 한 구체예에서 상기 덴드라이머 골격은 폴리리신 골격이다.
한 구체예에서 상기 단리된 폴리펩티드는 운반체 모이어티 이를 테면, PEG 또는 알부민, 비드(bead)에 접합된다.
한 구체예에서, 상기 펩티드는 호밍(homing) 모이어티, 안정화 모이어티, 보호 모이어티 및 투여 모이어티로부터 선택된 활성 모이어티에 접합되며, 임의적으로 여기에서 상기 활성 모이어티는 단백질성질이다.
예를 들면, 안정화 모이어티는 자연적 분해 및/또는 단백질 전환에 저항하는 아미노산의 단백질 서열이 될 수 있는데, 이를 테면, 면역글로불린 Fc 부분, 알부민 및 이와 유사한 것들이며, 임의적으로 여기에서 상기 모이어티는 상기 단리된 펩티드의 N 및/또는 C 말단에 접합된다.
한 구체예에서 상기 단리된 폴리펩티드는 탐지가능한 또는 정제 테그(tag)에 접합되는데, 예를 들면, 모이어티 이를 테면, 재조합 단백질에 부속되거나 또는 도입될 수 있고, 이의 발현 또는 폴리텝티드의 정제에 유용한 펩티드 서열이다. 한 구체예에서, 상기 정제 테그는 단백질가수분해성 절단 부위를 포함하는 링커를 통하여 상기 단리된 펩티드에 접합된다.
한 구체예에서, 상기 단리된 펩티드는 리포좀 또는 나노입자(nanoparticle)안에 포함된다. 한 구체예에서, 상기 리포좀은 느린 방출 리포좀이다. 한 구체예에서 상기 리포좀은 페길화된(pegylated) 리포좀이다.
추가 측면은 본 명세서에서 설명된 단리된 Link N 단편 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산이다. 상기 단리된 핵산은 네이키드(naked)이거나 또는 벡터 안에 포함될 수 있다. 한 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 단리된 Link N 단편 폴리펩티드를 인코드하는 핵산에 혼성화되는 핵산이 또한 제공된다. 한 구체예에서, 상기 핵산은 코돈 최적화된다(optimized).
따라서 추가 측면은 본 명세서에서 설명된 단리된 핵산 및/또는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 벡터는 레트로바이러스성 벡터, 아데노바이러스성 벡터 그리고 핵산용 DNA 바이러스 벡터 및 폴리펩티드용 리포좀 또는 나노입자를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 벡터는 리포좀 또는 나노입자이다. 한 구체예에서, 상기 리포좀은 느린 방출 리포좀이다.
상기 단리된 폴리펩티드 및/또는 핵산은 재조합 기술을 이용하여 만들거나, 및 또는 합성에 의해 합성될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 합성에 의해 생성되며, 인간 생체내 발현된 폴리펩티드와 비교하였을 때, 글리코실화되지 않거나 또는 차등적으로 글리코실화된다.
한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 환형화된다(cyclized). 한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 D 아미노산 또는 그 이상의 또는 그 이상의 L 아미노산을 포함한다.
추가 측면은 본 명세서에서 설명된 단리된 Link N 단편 폴리펩티드를 발현시키는 및/또는 본 명세서에서 설명된 상기 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 재조합 세포를 포함한다.
본 개시내용의 Link N 단편들을 발현시킬 수 있는 다양한 재조합 세포가 만들어질 수 있다. 예를 들면, 세포는 본 출원의 Link N 단편이 인코딩된 핵산을 포함하는 벡터로 형질변환된, 형질감염된 또는 형질유도될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 세포는 연골세포(chondrocytes) 계통 세포, 줄기 세포 또는 디스크 세포이며, 임의적으로 여기에서 상기 줄기 세포는 간엽 줄기 세포이다. 한 구체예에서, 상기 재조합 세포는 치료용이다.
추가 측면은 본 명세서에서 설명된 단리된 폴리펩티드와 임의적으로 운반체 또는 희석제가 포함된 조성물이다.
본 명세서에서 설명된 단리된 핵산, 벡터, 또는 재조합 세포가 포함된 조성물이 또 다른 측면에서 제공된다.
한 구체예에서, 상기 희석제는 생리학적 완충제, 임의적으로 생리학적 무균 완충제다.
한 구체예에서, 상기 조성물은 약학적으로 수용가능한 운반체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이다.
상기 단리된 폴리펩티드, 단리된 핵산, 벡터, 재조합 세포는 임의적으로 동결건조되거나, 또는 액체, 겔 또는 고형 조성물 안에 있을 수 있다.
상기 조성물은 동결건조된 분말 또는 수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액일 수 있으며, 조성물은 항산화제, 완충액, 세균발육억제제 및 용질을 더 포함할 수 있다. 이러한 조성물에 존재할 수 있는 기타 성분들에는 예를 들면 물, 계면활성제 (이를 테면, Tween), 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일이 포함된다.
핵산용으로 적합한 희석제는 물, 염수 용액 및 에탄올이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
폴리펩티드, 및/또는 세포용으로 적합한 희석제는 염수 용액, pH 완충된 용액 및 글리세롤 용액 또는 폴리펩티드 및/또는 세포의 냉동용으로 적합한 기타 용액을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
상기 조성물은 안정화 물질, 예를 들면, 환원 물질, 소수성 첨가제, 그리고 생리학적 완충액에 추가되는 프로테아제 저해제를 더 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 조성물은 본 명세서에서 설명된 단리된 폴리펩티드, 재조합 세포 및/또는 조성물이 포함된 생체적합 물질로 형성된 골격을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 생체적합성 물질은 알긴산염 아가로스, 치토산, 폴리카프로락톤 및/또는 히알루론산 (또는 히알루론산염) 기반의 생물물질로부터 선택된다. 연골세포(chondrocytes) 및/또는 IVD 세포용 유전적 골격이 또한 이용될 수 있다.
구체예에서, 상기 골격은 히드로겔, 미소구(microsphere), 마이크로캡슐, 스폰지, 포말(foam) 또는 섬유 형태로 만들어진다.
한 구체예에서, 상기 조성물은 개체에게 조직이식을 위한 연골 또는 디스크 세포 제조용이며, 상기 조성물은 본 명세서에서 설명된 단리된 폴리펩티드 및/또는 재조합 세포, 연골 및/또는 디스크 세포 그리고 운반체 또는 희석제를 포함하며, 여기에서 상기 연골 및/또는 디스크 세포는 연골 세포 및/또는 디스크 세포가 프로테오글리칸 및/또는 콜라겐 II 합성을 증가시키도록 유도하는데 충분한 상기 단리된 폴리펩티드 및/또는 재조합 세포의 유효량에 노출된다. 상기 조성물 및/또는 상기 조성물의 세포는 단리되어, 예를 들면, 개체에게 상기 조성물의 투여시 개체의 조직 병리를 치료하는데 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 약학 조성물은 개체에서 연골 또는 디스크 조직 병리 치료용이며, 상기 조성물은 본 명세서에서 설명된 단리된 폴리펩티드 및/또는 재조합 세포, 연골 및/또는 디스크 세포 및 약학적으로 수용가능한 운반체 또는 희석제를 포함하며, 여기에서 상기 치료는 이 개체에게 상기 조성물의 투여시, 개체에서 조직 병리를 치료하기 위하여, 연골 세포 및/또는 디스크 세포가 프로테오글리칸 및/또는 콜라겐 II 합성을 증가시키도록 유도하는데 충분한 상기 단리된 폴리펩티드 및/또는 재조합 세포의 유효량에 연골 및/또는 디스크 세포를 노출시키는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 조성물 (상기 약학 조성물 포함)은 생체적합성 물질로 형성된 골격을 포함하고, 여기에서 상기 연골 및/또는 디스크 세포는 상기 골격 상에 또는 안에 배치된다.
한 구체예에서, 연골 및/또는 디스크 세포를 포함하는 조성물은 투여 전, 최소한 1 일 동안, 최소한 2 일 동안, 최소한 3 일 동안, 최소한 4 일 동안 또는 최소한 5 일 동안 배양된다.
또 다른 측면은 연골 및/또는 디스크 세포 또는 연골 및/또는 디스크 세포가 포함된 조직에서 매트릭스 합성 임의적으로 프로테오글리칸 합성 및/또는 콜라겐 II 합성을 유도하는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 프로테오글리칸 합성을 유도하여, 증가된 매트릭스 합성을 가진 유도된 연골 및/또는 디스크 세포가 생성되는 조건하에서 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 단리된 폴리펩티드, 상기 단리된 폴리펩티드 및/또는 조성물을 발현시키는 재조합 세포의 유효량과 함께, 상기 연골 및/또는 디스크 세포를 배양하는 것을 포함한다.
매트릭스 합성은 예를 들면, 실시예들에서 설명된 바와 같이, 프로테오글리칸 및/또는 콜라겐 II 합성을 평가함으로써, 측정될 수 있다.
한 구체예에서 상기 방법은 시험관에서 증가된 매트릭스 합성을 가진 세포 또는 조직을 만들기 위하여, 세포 배양, 임의적으로 디스크 장기(organ) 배양에서 실행된다.
한 구체예에서, 상기 세포 및/또는 조직은 연골, 임의적으로 연골 이식술에 사용되는 연골이 생성되는 조건하에서 접촉된다.
한 구체예에서, 상기 연골(cartilage) 세포는 연골세포(chondrocyte)이다. 한 구체예에서, 상기 디스크 세포는 AP 세포, 임의적으로 iAP 세포이다. 또 다른 구체예에서, 상기 디스크 세포는 NP 세포이다. 추가 구체예에서, 가령, AP 및 NP가 포함된, 혼합된 세포 집단이 이용된다. 한 구체예에서, 상기 조직은 연골(cartilage) 계통 세포를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 조직은 AP 및/또는 NP 계통 세포를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 재조합 세포는 본 명세서에서 설명된 단리된 폴리펩티드를 발현시키는 MSC이다.
한 구체예에서, 상기 연골(cartilage) 세포, 디스크 세포 및/또는 조직은 개체에 있으며, 상기 접촉은 단리된 폴리펩티드, 재조합 세포 또는 본 명세서에서 설명된 청구항 14 또는 15의 조성물을 상기 개체에게 투여함으로써, 실행된다.
한 구체예에서, 상기 유도된 연골(cartilage) 및/또는 디스크 세포가 이 개체 안으로 도입된다.
한 구체예에서, 상기 연골(cartilage) 세포 및/또는 디스크 세포는 시험관에서 처리된 자가(autologous) 세포이다. 예를 들면, 모자이크성형술(mosaicplasty)에서 예를 들면, 무릎의 비-체중 부하 영역으로부터 작은, 대개 원형 (4-8 mm)의 자생 이식편을 취한다. 한 구체예에서, 자생 이식편을 취하기 전 및/또는 복원를 촉진시키기 위한 노력으로 자생 이식편을 재도입시킬 때, Link N이 주사 또는 투여된다. 예를 들면, 이는 수집 부위 복원를 도울 수 있으며, 및/또는 이식 부위 처리는 이식편 주변 또는 이식편을 떼낸 주변의 복원를 촉진시킬 수 있다.
또 다른 측면은 개체에게 이식용 연골 및/또는 디스크 조직을 생산하는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 프로테오글리칸 합성을 유도하는 조건하에서 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 상기 단리된 폴리펩티드, 상기 단리된 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 세포 및/또는 조성물과 함께 연골 및/또는 디스크 세포를 배양하고, 증가된 매트릭스 합성, 임의적으로 증가된 프로테오글리칸 합성을 가진유도된 연골 및/또는 디스크 세포를 생산하고, 그리고 실질적으로 순수한 집단의 유도된 연골 및/또는 디스크 세포를 단리시키는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 매트릭스는 연골로된 매트릭스를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 연골로된 매트릭스는 프로테오글리칸 및/또는 콜라겐, 예를 들면, 콜라겐 II을 포함한다.
한 구체예에서 상기 프로테오글리칸 합성은 아그레칸이다.
한 구체예에서, 상기 연골 및/또는 디스크 세포는 골격, 이를 테면, 실시예에서 설명된 알긴산염 골격을 포함하는 3D 배양에서 배양된다.
한 구체예에서 상기 유도된 연골 및/또는 디스크 세포는 개체 안으로 이식된다.
한 구체예에서 예를 들면, 세포 배양 및/또는 투여용으로 대략적으로 0.5 ㎍/mL이 이용된다. 또 다른 구체예에서, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 10 mg/ml이 이용되며, 임의적으로 약 10 ㎍/mL. 약 100 ㎍/mL, 약 1000 ㎍/mL, 약 2 mg/mL, 약 3 mg/mL, 약 4 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 6 mg/ml, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL 약 9 mg/mL 또는 약 10 mg/mL이 이용된다. 한 구체예에서, 상기 투여분량은 임의의 10 ㎍/mL에서 0.5 ㎍씩 증분되어, 최대 약 10 mgs이다. 한 구체예에서, 상기 양은 중량/용적이다. 한 구체예에서, 주사당 상기 양이 투여된다. 예를 들면, 한 구체예에서, 최대 또는 약 1 mg이 요추 디스크에 주사되거나, 또는 최대 1 mg이 관절당 도입된다.
추가 측면은 연골 및/또는 디스크 조직 병리와 연합된 증상의 완화 및/또는 치료 방법을 포함하는데, 이 방법은 본 명세서에서 설명된 단리된 폴리펩티드, 재조합 세포, 유도된 연골 및/또는 디스크 세포 및/또는 약학 조성물을 이를 필료로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 증상은 통증이다. 도 27-30에서 설명된 바와 같이, IVD에서 NGF 발현의 발현으로 NP 및 AF 세포 모두에서 퇴행이 증가되며, Link N은 AF 세포에서 뉴로트로핀 (NGF, BDNF) 및 물질 P (TAC1)의 TNF 알파 유도된 유전자 발현을 억제시킬 수 있다. 도 29에서 Link N이 AF 세포에서 뉴로트로핀 (NGF, BDNF) 및 물질 P (TAC1)의 IL-1베타 유도된 발현을 억제시킨다는 것이 설명된다 뉴로트로핀, 및 물질 P는 통증 매개체다.
한 구체예에서, 상기 연골 및/또는 디스크 조직 병리는 추간판 퇴행이다. 한 구체예에서, 상기 추간판 퇴행은 초기 단계이다. 예를 들면 초기 단계 디스크 퇴행은 Thompson 등급 1, 2 및/또는 3 퇴행을 포함하며, 또는 임의적으로 이를 테면, MRI를 통한 영상촬영에서 결정되는 바와 같이, AF는 실질적으로 손상이 없다. 말기 단계 디스크 퇴행은 예를 들면, Thompson 등급 4, Thompson 등급 5 또는 그 이상의 퇴행을 포함할 수 있고 및/또는 융합이 일어난다. 예를 들면 본 명세서에서 설명된 산물 및 방법은 융합 후 인접 디스크 퇴행의 치료 및/또는 예방에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 설명된 치료를 받을 수 있는 적합한 개체를 선택하는데 있어서 민감성 및/또는 정량적 MRI 방법들이 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 치료는 가령, 탐지가능한 퇴행은 있지만, 통증이 있는 퇴행성 디스크가 되기 전, 퇴행의 복원 및/또는 지체를 위하여 예방적 차원으로 투여된다.
한 구체예에서, 상기 개체는 감소된 세포 밀도 및/또는 대사 활성을 가지며, 임의적으로 여기에서 이러한 감소된 세포 밀도 및/또는 대사 활성은 나이때문이다.
한 구체예에서, 상기 연골 및/또는 디스크 조직 병리는 관절염, 바람직하지 않는 골형성및/또는 석회화에서 선택된 염증성 또는 퇴행성 관절 질환이다.
한 구체예에서, 상기 관절염은 골관절염이다.
또 다른 구체예에서, 상기 관절염은 류마티스 관절염이다.
한 구체예에서, 상기 연골 및/또는 디스크 조직 병리는 골다공증이다. 한 구체예에서, 상기 연골 및/또는 디스크 조직은 골용해이다.
한 구체예에서, 상기 연골 및/또는 디스크 조직 병리는 기계적 손상(mechanical injury)이다.
한 구체예에서, 상기 개체는 인간, 말, 소, 염소 또는 개로부터 임의적으로 선택된 포유류다. 한 구체예에서, 상기 개체는 인간이다.
BMP 수용체 II 발현의 상실은 내피 염증의 원인이 되며, 죽상경화증은 마우스 모델이라는 것을 보여준다. Link N은 BMP 유형 II 수용체에 결합한다는 것이 밝혀졌으며, 본 명세서에서 NF카파B 활성화를 저지하는 것을 보여준다. 따라서 추가 측면은 내피 염증 및/또는 죽상경화증의 증상을 경감 및/또는 이를 앓고 있는 개체를 치료하는 방법인데, 이 방법은 본 명세서에서 설명된 단리된 Link N 단편 폴리펩티드, 재조합 세포, 유도된 연골 및/또는 디스크 세포 및/또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드, 재조합 세포 및/또는 약학 조성물은 골격 안에서 상기 개체에게 투여된다.
상기 단리된 Link N 폴리펩티드, 재조합 세포, 유도된 세포 또는 약학 조성물은 피부를 경유하여 상기 개체에게 투여되거나 및/또는 조직 병리 부위 또는 부근에 투여될 수 있다. 디스크 조직 병리의 경우, 상기 단리된 Link N 단편 폴리펩티드, 재조합 세포 및/또는 유도된 세포는 디스크 안으로 주사, 예를 들면, NP, AF로 주사, 임의적으로 내측 AF로 주사에 의해 개체에게 투여, 이식 또는 조직이식될 수 있다. 관절 병리의 경우, 상기 단리된 Link N 단편 폴리펩티드, 재조합 세포 및/또는 유도된 세포는 질병 부위로 주사에 의해, 개체에게 투여, 이식 또는 조직이식될 수 있다. 일부 구체예들에서, 예를 들면, 모자이크성형술에서 실시되는 자가 세포 및/또는 조직은 잘라내고, 설명된 바와 같이 처리되거나, 또는 재-이식된다.
한 구체예에서, 상기 단리된 Link N 단편 폴리펩티드, 재조합 세포 및/또는 유도된 세포는 윤활막 유체 안으로 주사에의해, 개체에게 투여, 이식 또는 조직이식될 수 있다. 한 구체예에서, 개체가 예를 들어, 병소 복원를 위하여 임플란트(implant) 골격을 보유하는 경우, 매립된 임플란트 골격 안으로 주사/도입에 의해 상기 투여가 진행될 수 있다.
한 구체예에서, 연골세포(chondrocytes) 및/또는 MSC 및/또는 유도된 세포가 포함된 기존 생체외 골격에 본 명세서에서 설명된 단리된 Link N 폴리펩티드, Link N 단편 산물을 포함하는 조성물이 추가 주입될 수 있다. 상기 골격은 이를 필요로 하는 개체에게 주사될 수 있다.
디스크와 연골 복원은 세포외 매트릭스 생산을 최대화시키는 간엽 MSC 및 Link N 보충에 의해 강화될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 단리된 Link N 단편 폴리펩티드, 재조합 세포 유도된 세포 및/또는 전술한 하나 이상의 것들이 포함된 조성물은 디스크 병소를 복원시키는데 이용된다. 자연적인 디스크 퇴행은 열창 생성과 관련될 수 있다. 이러한 병소를 복원시키기 위하여, Link N 단편들과 줄기 세포는 병소를 채우고, 도입된 물질의 균일한 분포를 허용하는 중합가능한 골격 안에 이식될 수 있다.
추가 구체예에서, 상기 단리된 폴리펩티드 또는 상기 단리된 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물은 복합 치료법에서 투여된다.
한 구체예에서, 상기 개체는 임의적으로 본 명세서에서 설명된 바와 같이 처리된, 또는 처리되지 않은 임플란트를 제공받았다. 상기 개체는 예를 들면, 프로테오글리칸 생산을 증가시키기 위하여, 본 명세서에서 설명된 단리된 폴리펩티드를 투여받는다.
한 구체예에서, 상기 방법은 본 명세서에서 설명된 단리된 폴리펩티드, 재조합 세포 또는 조성물과 복합된 MSC를 상기 세포 또는 조직에 접촉시키거나 또는 상기 개체에게 투여하는 것을 더 포함한다.
상기 본 개시내용은 전반적으로 본 출원을 설명한다. 다음의 특정 실시예를 참고하면 더 완벽한 이해를 할 수 있을 것이다. 이들 실시예는 단지 설명 목적으로 한 것이며, 본 발명의 범위를 제한시키는 것으로 간주되어서는 안된다. 환경이 임시방편을 제안 또는 제공해야 하는 경우, 형태의 변화 및 등가물로의 치환이 고려된다. 비록 특정 용어들이 본 명세서에서 이용되었지만, 이들 용어는 설명을 위한 견지이며, 제한을 목적으로 의도된 것은 아니다.
다음의 비-제한적인 실시예는 본 개시내용의 설명이다.
실시예
실시예 1
현재, 디스크 퇴행으로 발생된 요통을 예방, 중단 또는 지체시키는 확립된 치료는 없다. 기존 연구에서 Link N은 성장 인자로 작용할 수 있고, IVD에서 프로테오글리칸 및 콜라겐의 합성을 촉진시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 세포의 활성과 관련된 Link N의 서열은 충분히 인지되지 않고 있다. 디스크 세포가 Link N을 단백질가수분해적으로 가공할 수 있는지를 판단하기 위하여, 하기에서 설명된 바와 같이, 인간 디스크 세포는 원상태(native) Link N에 48 h 기간 동안 노출되었으며, 질량분광학적 분석에서 잔기 1 내지 8을 가진 펩티드는 AF 세포 존재하에서 생성되었지만, NP 세포에서는 생성되지 않음이 밝혀졌다. IL-1β 존재하에 NP 및 AF 세포에서 Link N 1-8은 프로테오글리칸 생산을 상당히 유도하였으며, 이로써 상기 생물학적 효과는 상기 펩티드의 첫 8개 아미노산에서 유지된다는 것이 확인되며, 상기 효과는 염증성 환경에서 지속됨을 나타낸다.
세포성 활성 조절에서 Link N의 독특한 효과는 서열 및/또는 모티프 특이적 상호작용을 제안한다. 그러나, Link N이 생물학적 시스템 안에서 안정적인지는 다소 불명확하다. 생물학적 시스템 안에서 Link N의 운명 또한 연구되었다.
방법 및 재료들
재료들:
프로네이즈(Pronase)는 Calbiochem (Darmstadt, Germany)의 것이다. 콜라게나제 1A, GlutaMAX, NaCl 및 포름산은 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 낮은점성도 알긴산염 (Keltone LV)은 Kelco Chemical Co (San Diego, CA, USA)으로부터 구입하였다.. 페니실린/스트렙토마이신, 겐타마이신 술페이트, 암포테리신 B, Dulbecco 변형된 Eagle 배지 (DMEM) 그리고 태아 송아지 혈청 (FCS)은 Gibco (Burlington, ON, Canada)로부터 구하였다. 알긴산염 비드를 만들기 위한 20G 1 1/2 인치 바늘은 BD syringes, (Concord, ON, Canada)로부터 구하였다. HPLC 등급 아세토니트릴은 Rathburn (Walkerburn, Scotland)에서 구입하였다. 트립신 골드,광분석법 등급은 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하였다 TopSert, TPX-Short Thread-Vial, 32x11.6 mm, 내장된 0.2mL Glass-Micro-Insert, 15 mm 톱은 Skandinaviska Gene Tec AB (Vastra Frolunda, Sweden)에서 구입하였다. Vydac UltraMicro Spin® Silica C18 300 Å 컬럼은 The Nest Group (Southborough, MA, USA)에서 구입하였다. 서열화 등급 키모트립신은 Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Germany)에서 구입하였다. 35SO4, 2 mCi, 안정화된 수성 용액은 Perkin Elmer (Montreal, Quebec, Canada)에 주문하였다. NUNC 6 웰 배양 플레이트는 Corning Inc. (Edmonton, Alberta, Canada)에서 구입하였다. MMPs 3, 7, 12, 13, ADAMTS 4,5는 R&D Systems (Minneapolis, MN)의 것이다. HTRA1은 Thermo Scientific (Waltham, MA)의 것이다. 카텝신 K, B, 및 L는 제공받았다.
Link-N 펩티드
Link N, DHLSDNYTLDHDRAIH (서열 번호: 15); 역 Link N, HIARDHDLTYNDSLHD (R-Link N) (서열 번호: 16), 스크램블화된 Link N, DLNRAHLHIDYHTDSD (S-Link N) (서열 번호:17), Link-N 첫 8개 펩티드 잔기, DHLSDNYT (Link N 1-8) (서열 번호: 4), 및 두번째 8개 펩티드 잔기, LDHDRAIH (Link N 9-16) (서열 번호: 18)는 CanPeptide (Pointe Claire, QC, Canada)에서 합성되었다. 상기 스크램블화된 16개 아미노산 펩티드 서열은 Institut Pasteur, Paris, France (http://mobyle.pasteur.fr)의 생물정보학 툴을 이용하여 기획되었다. Link N의 전체적인 성질들, 이를 테면, 원래 펩티드의 등전점(isoelectric point) 및 용해도를 모방하도록 상기 서열이 선택되었다. 상기 펩테드의 원(Stock) 용액 (10 mg/mL)은 HEPES가 보충된 DMEM에서 제조되었고, 사용 전 pH는 7.4로 조정되었다.
조직의 원천(Source of Tissues)
인간의 등요추 척추는 Transplant Quebec 장기 기증 프로그램을 통하여 수습되었다. 디스크는 7명의 기증자-남성 1명과 여성 6명, 평균 연령 29.6세, 연령 분포 16세 내지 47세-로부터 구하였다 (표 1). 최근 척추에 화학요법, 방사능요법을 받았거나, 또는 심각한 장기 마비를 겪는 기증자들은 본 연구에서 배제되었다. 척추 수습은 사망 8시간 이내에 실행되었다. 석회화 및 디스크 높이 상실된 디스크는 본 연구에 포함되지 않았다. 모든 절차는 Montreal General Hospital의 협회 평가단에 의해 승인되었다.
18-27 월령의 황소의 꼬리는 지역 도살장에서 도살 6h 이내에 것을 구하였다.
인간 및 소의 IVD 세포들의 단리
인간 및 소의 IVDs는 인접 척추 몸통으로부터 분리되었고, 소의 IVDs의 경우 NA와 AF, 인간의 IVDs의 경우 NP와 내측 섬유륜 (iAF)으로 세분되었다. 인간 외측 섬유륜 (oAF)의 조직은 본 연구의 세포 단리에 이용되지 않았다. 세포들은 이미 설명된 바와 같이, 각 영역으로부터 효소적으로 단리되었다(63). 간략하게 설명하자면, NP 및 AF 조직은 대략적으로 2-mm 두께의 조각으로 절단되었고, 50 ㎍/mL 겐타마이신, 100 ug/mL 페니실린, 100 U 스트렙토마이신 및 0.25 ㎍/mL 펑기존(fungizone)이 포함된 PBS에서 2회 세척되었고, 무혈청 DMEM에서 0.2% 프로네이즈로 1 h 동안 절단되었으며, 콜라게나제 유형 IA(NP조직의 경우, 0.01%)(AF 조직의 경우, 0.04%)을 이용하여 4 h 동안 절단되었다.
인간 IVD 세포의 단층 배양
Link N의 안정성을 평가하기 위하여, NP 및 AF 영역으로부터 새로 단리된 인간 세포는 6 웰 배양 플레이트에서 웰당 250,000개 세포 밀도로 도말되었다. 4.5 g/L 포도당을 포함하고, 그리고 10 % FCS, 25 mmol/L HEPES, 50 ㎍/mL 겐타마이신 술페이트, 0.25 ㎍/mL 펑기존(fungizone), 50 ㎍/mL L-아스코르베이트, 및 2 mmol/L GlutaMAX이 보충된, 3 mL DMEM에서 37℃, 5% CO2에서 배양되었다. 상기 웰들은 Link-N (1㎍/mL)에 노출되기 전, 2일 동안 방치되었다. 200 ㎕ 배지는 정해진 시점 (0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 36 h, 및 48 h)에서 수거되었다. 상기 펩티드의 안정성은 세포 부재하에 동일한 시점에서 또한 연구되었다.
Link N의 단백질분해효소 처리
300 ㎍ Link N 1-16는 10가지 상이한 단백질분해효소 존재하에서, 30분, 2h 및 24h 동안 항온처리되었다. MMPs 3, 7, 12, 13, ADAMTS 4,5, HTRA1에 이용된 완충제는 50 mM　Tris-HCl, 200 mM　NaCl, 5 mM　CaCl2, 0.01% Rapigest를 포함한다. 카텝신 K, B, 및 L의 경우, 절단(digest) 완충제는 2.5 mM　DTT, 0.15% 콘드로이틴 황산염 A, 0.1　M　아세트산 나트륨, pH 5.5을 포함한다.
질량 분광분석
상기에서 설명된 단층 배양물로부터 수집된 또는 펩티드 절단물에서 얻은 25㎕ 배지 시료는 C18 스핀(spin) 컬럼 상에서 표준 프로토콜 (Harvard Apparatus, Holliston, MA)에 따라 정제되었다. 용리된 펩티드는 20 ㎕, 2% 아세토니트릴 및 0.2% 포름산 (FA)에서 재구성되었다. 시료는 이지 나노-LC 시스템(Thermo Scientific)이 구비된 삼중 사중 질량분석계 TSQ VantageTM (Thermo Scientific, Waltham, MA)를 이용하여 주입 및 정량화되었다. 상기 질량분석계는 단위 해상도(FWHM 0.7 Da)에서 Q1 및 Q3 세팅과 함께, SRM 모드에서(FWHM 0.7 Da) 작동되었다. 탈용매화(desolvation)를 위하여 270℃의 가열된 이온 전달 세팅과 함께, +1,700 V의 스프레이 전압이 이용되었다. Xcalibur 소프트웨어 (버젼 2.1)을 이용하여 데이터를 획득하였다. 이용된 이동상(mobile phase)은 A (0.1% FA/물) 및 B (100% 아세토니트릴/0.1% FA)이었다. Reprosil-Pur C18-AQ 수지 (3 ㎛, Dr. Maich GmbH, Switzerland)가 패킹된, 10 ㎛ 팁, 75 ㎛ x 15 cm 모세관 컬럼 (PicoTipTM emitter, New Objective, Woburn, MA)에서 분리가 실행되었다. 1 ㎕ 시료가 주입되었고, 97% 이동상 A, 5 min; 85% A, 8 min; 65% A, 42 min; 그리고 19% A, 45-50 min의 차등을 이용하여, 300 nL/min의 유속에서 분리가 실행되었다.
Link N 펩티드에 대한 다중 반응 모니터링 방법(MRM)이 개발되었고, 최적화되었고, 이행(transitions)으로부터 합계 피크 면적과 함께 이용되었다, Link 1-16 이행: 641.30(3+)-->863.41 (y7), 641.30-->748.38 (y6), 641.30--> 611.33 (y5) 및 641.30-->682.28 (b6), Link 1-8 이행: 964.40 (1+)-->845.43 (b7)-->682.87 (b6)-->568.23 (b5) -->453.20 (b4) -->712.31 (y6) -->849,37 (y7), Link 9-16 이행: 488.75 (2+)--> 821.43 (b7) -->708.34 (b6) -->496.30 ((y4) -->611.32 (y5) -->748.38 (y6). MRM 데이터는 Skyline 1.4 소프트웨어 (MacCoss Lab Software, University of Washington, Seattle, WA)를 이용하여 분석되었다.
상기 펩티드의 임의의 단편화를 확인하기 위하여, 전자분무-이온 트랩 분광분석법 (LC ESI MS)과 동일 선상에 역상 액체 크로마토그래피 시스템상에서 이미 설명된 바와 같이(64), 8 ㎕ 시료를 주사하여, 발견 실험(discovery experiments) 또는 실행되었다.
3D 골격에 IVD 세포 배양
다양한 Link N 펩티드에 대한 대사 반응을 비교하기 위하여, NP 및 AF 영역으로부터 새로 단리된 인간 및 소의 세포는 이미 설명된 바와 같이, 1.2% 알긴산염 비드에 매립되었다(65). 알긴산염 비드 안의 세포는 4.5 g/L 포도당이 포함된, 그리고 10% FCS, 25 mmol/L HEPES, 50 ㎍/mL 겐타마이신 술페이트, 0.25 ㎍/mL 펑기존(fungizone), 50 ㎍/mL L-아스코르베이트, 및 2 mmol/L GlutaMAX가 보충된 DMEM에서 37℃, 5% CO2에서 배양되었다. 상기 비드는 7 일 동안 안정화되었고, 추가 처리 전, 세포 생존력은 Live/Dead® 분석에 의해 평가되었다. 그 다음 웰당 5개 비드는 48 웰 플레이트 안 0.5 mL DMEM 에서 Link N (1 ㎍/mL), R-Link N (1 ㎍/mL), S-Link N (1 ㎍/mL), Link N 1-8 (0.5 ㎍/mL) 또는 Link N 9-16 (0.5 ㎍/mL)의 동몰 농도 존재하에서 배양되었다. 25 μCi/mL 35SO4가 상기 배지에 추가되어 프로테오글리칸 합성이 평가되었다 (66). 추가적으로, 비드는 IL-1β (10 ng/mL) 단독, 또는 펩티드와 IL-1β의 조합에 48h 동안 노출되었다 (51). 상기 배양 기간 종료시, 배지는 수거되었고, 18.2 Ω (Spectra/Por® 3)에서 miliQ water를 통하여 철저하게 투석되었고, 이어서 미혼입된 임의의 잔류 35SO4를 제거하기 위하여, 2시간 동안 1M MgSO4 를 이용하여 한냉추척(cold chase)되었다. 35SO4 혼입은 베타 신틸레이션 카운터 (Beckman Coulter LS6500, Beckman Coulter, Mississauga, Canada)를 이용하여 측정되었다.
통계학적 분석
원 테일드 페어드(One tailed paired) t-test가 실행되었고, p≤ 0.05 값은 유의적인 것으로 간주되었다.
결과
16개 아미노산 Link N 펩티드는 단리된 디스크 세포 및 무손상 인간 디스크에서 프로테오글리칸 합성을 유도하고, 토끼 디스크 천자 퇴행 모델에서 디스크 높이를 또한 증가시키는 것으로 공지되어있다 (34, 31, 29). 그러나, 이 효과가 엄격하게 서열 의존적인지 또는 상기 펩티드의 전반적인 성질에 기여되는지는 명확하지 않다. 이 문제를 해결하기 위하여, 상기 펩티드의 3개 변이체가 합성되었다; 원상태 (Link N), 역전된 (R-Link N) 및 스크램블화된 (S-Link N), 그리고 상기 펩티드에 반응한 프로테오글리칸 합성을 평가하기 위하여 35SO4 혼입이 이용되었다. 소와 인간 NP 및 AF 세포는 48시간 동안 1㎍/mL의 상기 펩티드에 노출되었다. 소의 세포에서 Link N (NP p= 0.03, AF p=0.03)에 반응하여 프로테오글리칸 합성이 통계학적으로 유의적으로 증가됨이 나타났지만, 상기 세포가 역전된 또는 스크램블화된 펩티드에 노출되었을때 효과는 관찰되지 않았다 (도 1a). 인간 세포에서도 유사한 경향을 보였는데, 원상태 Link N (NP p=0.008, AF p=0.02)에 반응하여 유의적인 증가가 있었지만, 스크램블화된 또는 역전된 펩티드에는 반응하지 않았고, 이는 서열 특이적 반응임을 나타낸다 (도 1b). 소 및 인간 AF 세포 모두에서 NP 세포와 비교하여 더 강력한 반응을 나타내는 경향이 있었다.
치료의 지속 효과를 확인하기 위하여 펩티드 안정성 또는 유지된 활성은 중요하다. 따라서, 질량 분광학적 분석을 실행하여 용액 안에서 Link N의 안정성을 평가하였다. 분자량 1922 Da의, 원상태 Link N은 배양 배지에서 37℃, 48 h 동안 항온처리되었고, 상기 펩티드의 강도는 표적화된 분광분석법을 이용하여 최대 48 h 까지 정량화되었다. 이 기간 동안 1922 Da Link N 펩티드의 손실이 발견되지 않았고 (도 2), 이것은 상기 펩티드가 37℃ 용액에서 안정적임을 나타낸다.
대사적으로 활성 세포는 짧은 펩티드를 처리하는 능력을 가지며, 이로 인하여 이들의 생물학적 효과가 변형될 가능성이 있다 (67-69). 디스크 세포가 Link N을 단백질가수분해적으로 가공할 수 있는 지를 판단하기 위하여, 단층의 인간 디스크 세포는 48시간 동안 원상태 Link N에 노출되었고, 이의 운명을 평가하기 위하여, 1922 Da 펩티드의 피크 면적 강도가 정량화되었다. 상기 펩티드는 NP 세포 존재하에서 최소 48h 동안 안정적인 것으로 밝혀졌다 (도 3a). 그러나, AF 세포 존재하에서 6시간 시점에 Link N의 감소가 탐지되었으며, 48 h 후에는 단지 소량만이 남아있었고(도 3b), 이것은 AF 세포가 Link N 펩티드를 가공하는 능력을 보유한다는 것을 설명한다.
상기 Link N의 프로세스된 산물을 확인하기 위하여, 0 - 1930Da 범위의 질량 분광 범위에서 더 짧은 펩티드가 존재하는지 분석하였다. NP 및 AF 세포의 Link N 함유 배지와 비교하였을 때, 964.4Da 분자량의 펩티드가 AF 세포 배양 배지에 축적된 것으로 나타났다(도 4a). NP 세포 배양 배지에서는 동일한 펩티드가 매우 낮은 수준으로 존재하였다 (도 4a). 964.4 펩티드는 2가지 상이한 정체 시간에서 컬럼으로부터 용리되었다. 이 현상은 때때로 관찰되었고, 아마도 높은 농도로 인하여 컬럼 상에 펩티드 침전으로 인한 것일 가능성이 있다. 원상태 16개 아미노산 Link N에서 아미노산 1-8 또는 아미노산 4-11를 나타내는 2개의 별개 부분은 이 중량의 펩티드를 잠재적으로 만들 수 있다 (도 4b). 텐덤 분광분석법 분석에서 잔기 1 내지 8까지 이어진 펩티드는 AF 세포 존재하에서 생성되었지만, 상기 펩티드 9-16의 잔량은 발견되지 않았음이 확인되었다 (도 4c).
생물학적 치료를 위하여 기획된 펩티드의 유지된 활성은 매우 중요하며, AF 세포에 의한 Link N의 가공은 이의 생물학적 효과를 잠재적으로 변경시킬 수 있다. 이를 평가하기 위하여, 아미노산 서열 1-8 (Link N 1-8) 및 9-16 (Link N 9-16)에 상응하는 2개의 펩티드가 합성되었고, 프로테오글리칸 합성에서 이들의 영향은 원상태 인간 Link N의 것과 비교되었다. 프로테오글리칸 합성은 35SO4 혼입을 이용하여 평가되었고, 소 및 인간 NP 및 AF 세포는 48시간 동안 동일한 몰 농도의 상기 펩티드에 노출되었다. 소의 세포가 Link N 1-8 단독에 노출될 때, 35SO4 혼입에서 원상태 펩티드와 동일한 크기의 통계학적으로 유의적인 증가가 관찰되었지만(NP p=0.006 및 AF p=0.007), 그러나, Link N 9-16에서는 효과가 없었다 (도 5a). 인간 세포에서도 유사한 경향을 보여주었는데, Link 1-8에 반응하여 유의적인 증가가 있었지만 (NP p=0.004 및 AF p=0.01), 그러나, Link N 9-16에 대하여 반응이 없었고, 이것은 상기 펩티드의 첫 8개 아미노산이 유지된 서열에 생물학적 효과가 특이적임을 나타낸다 (도 5b). 소 및 인간 AF 세포 모두에서 NP 세포와 비교하여 더 강력한 반응을 나타내었다.
Link 1-16의 절단을 담당하는 단백질분해효소를 판단하기 위하여, 10가지 상이한 단백질분해효소를 이용한 절단은 30 분, 2h 및 24 h 동안 실행되었다. 상기 테스트된 단백질분해효소는 MMPs 3, 7, 12, 13, ADAMTS 4,5, HTRA1, 그리고 카텝신 K, B, 및 L이었다. 1922 Da, Link 1-16 펩티드의 피크 면적 강도는 분광분석법에 의해 정량화되었다. 카텝신 K와 함께 항온처리 한 경우, 피크의 강도는 30분 후 이미 유의적으로 감소되었고, 2h 및 24 h 후에는 거의 탐지되지 않았고, 한편 MMPs 3, 7, 12, 13, ADAMTS 4,5, HTRA1, 그리고 카텝신 B 및 L에 의해 거의 영향을 받지 않았다 (도 6A에서 2 시간 시점을 보여준다). 1922 Da 펩티드의 강도가 사라질 때, m/z 964.4 Da (+1) Link 1-8가 나타나는지를 평가하기 위하여, MRM 방법이 셋업되었다. 이 방법에 의해 Link 1-8은 카텝신 K에 의해 2시간 후 생성되었다는 것이 확인되었다 (도 6B). 카텝신 K가 아미노산 8과 아미노산 9 사이에 절단을 만드는지, 또는 Link 1-16이 잔기 8-16 영역 안 몇몇 부위에서 프로세스되는지를 평가하기 위하여, m/z 488.75 Da (2+) Link 9-16 펩티드에 대하여 또한 MRM 방법이 셋업되었다. 상기 분석에서 2시간 후 Link 9-16이 존재함이 드러났고, 이로써 Link N은 아미노산 8과 아미노산 9 사이의 단일 절단에 의해 프로세스된다는 것이 확인되었다 (도 6C).
디스크 퇴행은 생체내 염증 사이토킨의 존재와 밀접하게 연관되어 있고 (51), 그리고 원상태 Link N은 염증성 환경에서 대등하게 잘 작업하는 것으로 알려져 있기 때문에 (34) 염증성 환경에서 이들의 유익한 영향이 유지되는지를 판단하기 위하여, IL-1β 존재하에서 상기 펩티드에 대한 반응이 평가되었다. 프로테오글리칸 합성은 35SO4 혼입을 이용하여 평가되었다. Link N 1-8은 소의 NP 및 AF 세포에서 IL-1β 존재하에서 원상태 Link N과 동일한 수준으로 프로테오글리칸 생산을 유의적으로 유도하였다(NP p=0.006 및 AF p=0.013) (도 7A). 동일한 경향이 인간 세포에서도 발견되었는데, Link N 1-8에 반응하여 유의적으로 증가되었지만 (NP p=0.002 및 AF p=0.004) Link N 9-16에 대해서는 반응하지 않았고 (도 7B), 이로써 상기 생물학적 효과는 상기 펩티드의 첫 8개 아미노산에서 유지된다는 것이 확인되며, 그리고 상기 효과는 염증성 환경에서 지속됨을 나타낸다.
고찰
Link N은 연골세포(chondrocytes) (70), 시험관내 IVD 세포 그리고 생체외 무손상 인간 IVDs (19,20)에서 콜라겐 및 프로테오글리칸 합성을 촉진시킬 수 있으며, 뿐만 아니라 디스크 퇴행 토끼 모델에서 디스크 높이를 증가시킬 수 있다는 것은 이미 보고된 바 있다 (31). 그러나, 원상태 Link N이 생물학적 시스템 안에서 얼마나 안정적인지에 대해서는 모르고 있다. 본 연구에서 AF 세포는 Link N 펩티드를 단백질가수분해적으로 가공하여 아미노산 잔기 1-8의 단편을 생성시킬 수 있는 능력이 있음이 증명되었다. 상기 데이터는 또한 생물학적으로 활성 서열이 이 단편 안에 보존되며, 상기 펩티드는 NP 및 AF 세포 모두에서, 염증성 환경에서 프로테오글리칸 합성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. AF 세포는 NP 세포보다는 기저수준이상으로 더 강력하게 프로테오글리칸 증가를 보여주었다. 그러나 생성된 절대 농도는 이용된 상기 방법으로 평가될 수 없다. NP 세포는 더 높은 기저수준 생산을 가지며, 따라서 Link N 노출과 함께 그리고 노출없이도 더 높은 전체 농도의 프로테오글리칸이 생성되는 것이 가능하다. 역전된 또는 스크램블화된 Link N 펩티드, 뿐만 아니라 Link N의 잔기 9-16는 생물학적 효과가 없었다.
Wang et al. 은 아미노산 잔기 1-12의 펩티드가 포함된, 다수의 더 짧은 Link N-유도된 펩티드를 평가하였을 때, Link N의 자극 효과가 상실되었다고 이미 보고하였다(33). 대조적으로, Link N의 잔기 1-8 펩티드는 활성이 있는 것으로 밝혀졌다. 본 연구결과와 일치하게, 역전된 또는 스크램블화된 펩티드는 효과가 없다는 것을 알았다. 잔기 1-12 펩티드가 이들 시스템에서 왜 비활성인지는 불분명하지만, 이용된 상이한 조건과 관련있을 수 있다. Wang et al.은 크기와 무관하게, 100 ng/mL의 상이한 펩티드를 이용하였다.
상기 16개 아미노산 원상태 Link N의 1 ㎍/mL이 최적 농도인 것으로 판단되었고, 따라서 이 농도를 이용하고, 그리고 동일한 농도로 유지되었으며, 0.5 ㎍/ mL의 8개의 잔기의 더 짧은 펩티드가 이용되었다. Wang et al은 세포 용해물에서 세포-연합된 술페이트화된 GAG를 측정하였고, 한편 본 명세서에서는 배양 배지로 방출된 GAG 안에 방사능활성 술페이트의 혼입이 측정되었다. 이용된 세포 원천 또한 상이한데, Wang et al. 은 척추 융합을 위한 외과술 동안 추출된 퇴행 디스크 조직으로부터 세포를 단리하였고, 그리고 표현형을 변경시킬 수 있고, 이로 인하여 상기 세포에 대한 반응이 변경될 수 있는 3D 배양, 과정으로 옮기기 전 단층 배양에서 상기 세포를 확장시켰다.
Abbott et al (71)는 퇴행성 인간 디스크로부터 단층 확장된 세포가 원상태 Link N에 덜 반응하고, 단지 아그레칸 메세지 수준의 낮은 상향 조정과 MMP3 메세지 수준의 강력한 유도가 있었다는 것이 설명되었다 (71, 18). Wang et al 연구에서 이용된 Link-N 투여분량은 결정된 최적 투여분량보다 더 낮았고, 이 경우, 10배 더 적다. (71). 본 명세서에서 테스트된 세포는 약간의 퇴행이 있는 장기 기증자로부터 단리되었고, 표현형을 보존시키기 위하여, 상기 세포는 단층에서 확장되지 않았다. 이런 차이와 평가된 세포가 심각하게 퇴행된 외과적으로 제거된 디스크에서 얻은 것이 아니라는 사실로 상이한 결과를 설명할 수 있다. 심각한 퇴행이 있는 디스크는 탐지가능한 치료 반응을 제공하기 위한 충분한 세포를 보유하지 않을 수 있다. 중대한 형태학적 상실로 인하여 외과적으로 제거된 퇴행 디스크의 상이한 영역을 분리하는 것이 또한 곤란하고, NP 세포와 AF 세포 간의 차이를 구별하는 것 또한 곤란하다. 추가적으로, 심각하게 퇴행된 디스크에서 세포 수율은 낮고, 세포 수를 증가시키기 위하여 상기 세포를 확장할 필요가 있는데, 이것은 세포의 표현형에 영향을 줄 수 있다(72).
디스크 퇴행의 조기 사건과 특징은 아그레칸의 상실이며, 그리고 퇴행의 초기 단계에 이용된 임의의 치료용 물질은 아그레칸의 합성을 증가시켜야 한다. 따라서, 현재 Link N 단편의 유익한 효과를 평가하기 위한 판독(read out)으로 아그레칸 합성에 집중되어 있다. 그러나, 생체내 디스크 퇴행은 상기 디스크 매트릭스에서 증가된 분해대사(catabolism)와 밀접하게 연관된다. 이 과정은 이 질환 진행의 조기에 또한 나타날 수 있는, 다양한 사이토킨과 프로테아제의 상향 조정과 관련된다 (17, 53). 이러한 분해대사적 환경에서 동화대사적 효과를 발휘하기 위하여, 상기 디스크에서 퇴행성 과정을 역전 또는 지체시킬 수 있는 능력을 가진 생물활성 물질이 필수적이다. 이 데이터는 Link 1-8이 이러한 성질을 보유한다는 것을 나타낸다.
Link N은 비록 AF 세포에 의해 가공되지만, 활성 서열은 그대로 손상없이 유지된다는 것이 또한 밝혀졌다. 카텝신 K에 의해 Link N의 잔기 8-9 사이의 절단으로 인하여 2개의 펩티드, Link 1-8 및 Link 9-16이 생성되며, 한편 MMPs 3, 7, 12, 13, ADAMTS 4,5, HTRA1, 그리고 카텝신 B, 및 L은 Link N을 가공하지 못하였다. 디스크 퇴행에서 카텝신 K의 역할이 제시되었다(55, 73). Link 1-8이 퇴행하는 추간판의 세포외 매트릭스에서 생성되는지는 알려지지 않고 있다.
Link N은 BMP 유형 II 수용체를 통하여 작용하며, 수용체 활성화는 Smad1/5 신호생성 그리고 BMP-4 및 BMP-7 메세지 수준의 상향조정으로 이어진다는 것이 밝혀졌다 (32). BMP 유형 II 수용체는 Link N의 짝으로 설명된 유일한 수용체다. 따라서, Link 1-8은 동일한 수용체와 반응하고, 이 두 펩티드는 유사한 수준으로 프로테오글리칸 합성을 유도할 가능성이 있다. 만약 그렇다면, Link N은 또한 Link N의 다른 대사적 성질, 이를 테면, 메탈로프레테나제 발현을 하향-조절하는 능력을 가질 것으로 예상할 수 있다.
Link N 1-8은 퇴행성 디스크 질환의 치료를 위한 유망한 생물활성 물질이다. 상기 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 환자들은 예를 들면, 주요 콜라겐 분해가 발생되기 전, AF가 고유한, 손상 없는 상대로 유지된 초기 디스크 퇴행이 있는 환자를 포함한다. Thompson 등급 3 이상의 퇴행은 낮은 수의 세포와 디스크에 남아있는 심각하게 손상된 ECM으로 인하여 외과적 치료를 필요로 할 수 있다. 그러나, Link N 1-8은 이러한 높은 등급의 퇴행을 가진 개인에게도 여전히 유용할 것이며, 융합 후 인접 수준의 디스크 질환을 지연시키는데 이용될 수 있다(74-76). 치료에서 원래 16개 아미노산의 Link N보다 오히여 더 짧은 8개 아미노산 펩티드를 이용할 경우 한 가지 장점은 생산 단가가 될 것이다. 작은 크기는 생체내 운반이 더 잘 될 수 있다.
인간 추간판 디스크 ( IVD ) 기증자 확인
기증자 연령 ( yrs ) 성별 사망 원인 디스크 수준
1 19 F 코카인 과다투여 L1-L2, L2-L3, L5-S1
2 20 F MVA T12-L1, L3-L4, L5-S1
3 16 F 심정지(Cardiac Arrest) T12-L1, L1-L2, L5-S1
4 36 F MVA T12-L1, L3-L4, L5-S1
5 25 M 자살 T12-L1, L1-L2, L5-S1
6 47 F CVA T12-L1, L3-L4, L5-S1
7 42 F ICH T12-L1, L5-S1
ICH = 두개내출혈 , MVA = 자동차 사고, CVA = 뇌-혈관 장애.
실시예 2
이미 설명된 바와 같이, Link N은 MMP 절단에 의해 Link 단백질로부터 방출된다. 관절 및 추간판 모두에서 생산되며, 디스크 (NP 및 AF)와 관절 연골 (연골세포(chondrocytes)) 세포에 의해 아그레칸/콜라겐 합성을 촉진시킨다.
오직 배지만 주사된 디스크와 비교하여, 장기(organ) 배양에서 인간 디스크의 Link N 자극으로 1.15에서 7 배 이상 프로테오글리칸 합성이 증가된 것으로 보고되었다. 프로테오글리칸 합성은 Link N 자극 후 9일 시점에서 탐지가능하다.
디스크 퇴행의 토끼 모델에서, L2/3 환상 천자 후 2주 시점에 염수 10 ㎕ 안에 100 ㎍의 Link N 농도로 Link N 주사에 의해 Link N 주사 감염 후 14주 시점에서 IVD 디스크 높이가 상당히 증가되었다. 아그래칸 mRNA는 AF 및 NP 세포에서 (특히 AF 세포)에서 상당히 증가되었다. 뿐만 아니라, MMP-3 및 ADAMTS-4 단백질분해효소 발현은 상당히 감소되었다. Link N은 인간 디스크 안에 유지되며, AF가 아닌, 끝판을 통하여서 서서히 상실된다는 것이 설명되었다. Link N의 특이성은 서열 의존적이며, 그 이유는 스크램블화된 Link N 또는 역전된 Link N은 인간 NP 세포 또는 인간 iAF 세포에서 효과가 없었기 때문이다. 예를 들면, 참고문헌 29 및 34 참고.
NP 및 AF 존재하에서 배양물에서 Link N의 안정성은 도 3에서 나타내고, 상기에서 설명된 바와 같이, 테스트되었다. Link N은 AF 세포에 의해 가공되며, NP 세포에 의해서는 가공되지 않는다.
도 4b 및 4c에서 분광분석법에 의해 확인된 가능한 Link N 단편들을 보여준다. 다양한 상이한 단백질분해효소들과 함께 항온처리 후 Link N 펩티드 1-16의 다중 반응 모니터링에서, 카텝신 K 존재하에 항온처리 경우에서만 신호가 상실됨을 알았다 (도 6A). 이것은 도 6B 및 6C에서 나타낸 것과 같이, 피크의 출현에 상응한다. Link N 1-8은 인간 NP 세포 및 인간 iAF 세포와 접촉될 때, 프로테오글리칸 합성의 유도에 활성이 있지만, Link N 9-16은 활성이 없다(도 7A). Link N 1-8은 전장의 Link N와 유사하거나 또는 더 나은 활성을 보인다 (도 7B). Link N 및 Link N 1-8은 염증성 환경에서 프로테오글리칸 합성을 촉진시킬 수 있지만, Link N 9-16은 프로테오글리칸 합성을 촉진시킬 수 없다.
이들 결과는 NF 및 AF 세포 모두에서 아그레칸 생산은 증가되었고, Link N은 상기 디스크 안에 유지되며, AF가 아닌, 끝판을 통하여서 서서히 상실된다는 것을 보여준다. Link N은 AF 세포에 의해 가공되며, NP 세포에 의해서는 가공되지 않는다. Link N은 카텝신 K에 의해 절단되어, 1-8 단편이 생성되고, 그리고 AF 세포에 의해 생성된 Link N 단편은 활성이 있다. Line N 및 상기 단편은 염증성 환경에서 작용한다.
실시예 3
방법론(Methodology):
골관절염 (OA) 연골은 전체 무릎 관절성형을 받은 4명의 기증자로부터 사전동의 하에 구하였고, OA 연골- 뼈 체외이식편 및 OA 연골세포는 각 기증자로부터 준비되었다. 정상적인 인간 연골세포(chondrocytes)(PromoCell, Heidelberg, Germany) 및 소의 관절 연골 (12 월령)이 대조군으로 이용되었다.
체외이식편 ( Explants ) 조제 및 처리
동일한 기증자로부터 연골 체외이식편, 대략적으로 1 cm2이 준비되었고, 피질 뼈가 있는 연골이 포함되어 있다. 열에 의해 비활성화된 10% FBS가 보충된 DMEM에서 체외이식편이 배양되었다. 표준 배양 조건 하에서 7일 후, 상기 체외이식편은 21일 동안 IL-1 β (5ng/ml), Link N (1㎍/ml)에 노출되고, IL1 β +Link N에 공동 노출되었고, 배양 배지는 3일마다 교체되었다.
조직 프로세싱(Tissue processing) 및 분석
3 mm 직경의 연골 플러그(plugs)는 각 이식편의 상이한 영역으로부터 단리되었다. Col II, Agg, Col X 및 MMP-13의 발현은 웨스턴 블랏팅에 의해 평가되었다. 간략하게 설명하자면, 연골 플러그는 단백질분해효소가 함유된 15 용적의 (v/w) 4-M 염화 구아니디니움 (GuCl), 100-mM 아세트산 나트륨, pH 7.4을 이용하여 48 h 동안 4℃에서 추출되었다. 웨스턴 블랏 분석에 이용된 100 ㎕ 분취액은 9 용적의 에탄올로 침전되었고, 37℃에서 50mU 케라타나제 I (Seikagaku)와 함께 1시간 동안 항온처리되고, 이어서 37℃에서 20mU 콘드로이티나제 ABC (Seikagaku)와 함께 하룻밤 동안 항온처리되었다. 연골 매트릭스 성분들은 환원 조건하에 SDS/PAGE, 4-20% 구배(gradient) 겔(Bio-Rad) 상에서 해리되었고, 면역블랏팅을 위하여 0.2 um PVDF 막으로 이용되었다. 아그레칸은 아미도-말단 G1 (항-G1)을 인지하는 토끼 다중클룬 항체를 이용하여 탐지되었다. Col II 및 MMP-13은 항-Col II 및 항-MMP13 토끼 다중클론 항체 (Abcam)에 의해 인지되었으며, 유형 X 콜라겐은 항-Col X 마우스 단일클론 항체 (Sigma)에 의해 인지되었다.
상기 조직내 전체 글리코사미노글리칸 (GAG, 주로 아그레칸) 함량은 1,9-디메틸메틸렌 블루 (DMMB) 염료-결합 분석을 이용하여 정량화되었다.
OA 연골세포( chondrocyte ) 단리 및 배양
OA 연골세포(chondrocytes)는 0.125% 프로네이즈와 이어서 0.2% 콜라게나제에 의한 연속 절단에 의해 각 무릎의 연골로부터 회수되었다. 단리 후, 상기 세포는 10% 열에 의해 비활성화된 FBS 및 1% 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 확장되었다.
NFkB 신호생성(signaling)
OA 및 정상 연골세포(chondrocytes)는 6-웰 플레이트로 옮겨지고, 90% 합류가 될 때까지 성장되었다. 세포는 하룻밤 동안 혈청 제거되고, IL-1 β (5ng/ml), Link N (1㎍/ml)이 포함된, 또는 이들 둘의 복합물리 포함된 배양 배지에서 37℃, 10 분 동안 배양되었다. 세포는 RIPA (방사능 면역-침전 분석) 완충제와 프로테아제 칵테일 II (Sigma) 및 포스파타제 (ThermoScientific) 저해제에서 용해되었다. 용해물은 환원 조건하에 4-20% 구배 겔 (Bio-Rad) 상에서 전기영동되었고, 면역블랏팅을 위하여 0.2 um PVDF 막으로 이용되었다. 블랏은 정상화를 위하여 항-포스포-NFkB 항체 (Cell Signaling), 및 NFkB (Cell Signaling) 그리고 GAPDH (Sigma)로 프로브되었다.
결과:
Link N은 IL-1β 존재하에서, OA 체외이식편 및 연골세포(chondrocytes)에서 프로테오글리칸 생산을 상당히 유도하였다. OA 연골에서, Link N에 반응하여 프로테오글리칸 합성의 상당한 증가가 관찰되었고, 메트릭스 안에 유지되었다. Col II의 경우 유사한 결과를 얻었다. Link N은 또한 MMP-13 활성화와 Col X 발현을 억제하였다. 흥미로운 것은, OA 및 정상 연골세포(chondrocyte)(Link N에 반응하여)에서 NF-κB의 IL-1β-유도된 활성화는 Link N에 의해 투여분량-의존적으로 억제되었다.
도 8은 GAG가 Link N 처리된 OA 체외이식편에서 유지된다는 것을 보여준다. GAG 잔류(retention)는 대조군 (CTL) 체외이식편의 잔류 %로 산출되었다.
도 8에서 Link N은 IL-1β 존재하에서, OA 체외이식편 및 연골세포(chondrocytes)에서 프로테오글리칸 생산을 상당히 유도하였다.
도 9에서는 OA 연골에서, Link N에 반응하여 프로테오글리칸 합성의 상당한 증가가 관찰되었고, 메트릭스 안에 유지되었다 Col II의 경우 유사한 결과를 얻었다.
도 10에서 Link N은 IL-1β 유도된 MMP-13 활성화 (A) 및 Col X 발현 (B)을 억제한다는 것을 나타내고, 도 11에서 NF-kB의 IL-1β 유도된 활성화는 인간의 정상 연골세포(chondrocytes) (A) 및 OA 연골세포(chondrocytes) (B)에서 Link N에 의해 투여분량 의존적으로 억제됨이 설명된다.
따라서 Link N은 골관절염 연골에서 프로테오글리칸의 잔류를 촉진시키고, 염증성 환경에서 프로테오글리칸과 콜라겐을 자극한다. Link N은 골관절염 연골에서 MMP-13의 활성형을 억제할 수 있고, Link N은 IL-1 베타 유도된 프로테아제 발현을 억제하며, 그리고 이론에 결부되지는 않지만, NFkB의 하향조절을 통하여 억제한다.
OA는 생체내 염증 사이토킨의 존재와 밀접하게 연계된다. Link N은 추간판의 염증성 환경에서 프로테오글리칸 합성을 유도할 수 있다는 것이 설명된다. 그러나, Link N이 염증환경에서 골관절염 연골내 프로테오글리칸 함량을 복원시킬 수 있는지는 모른다. 이를 테스트하기 위하여, 골관절염 연골의 인간 체외이식편은 IL-1β 존재하에 Link N, Link N와 IL-1β의 조합 또는 배지 단독으로 21일동안 배양되었다. 추출가능한 프로테오글리칸의 농도는 DMMB 분석에 의해 정량화되었다. 대조군으로 정상화시켰을 때, Link N은 체외이식편의 GAG 함량을 약 50%까지 증가시켰다. 대조군과 비교하였을 때, IL-1β는 상기 프로테오글리칸 농도를 감소시켰다. 그러나, 대조군으로 정상화시켰을 때, Link N은 IL-1β 존재하에서 체외이식편의 GAG 함량을 약 30%까지 증가시켰다. 이는 연골 퇴행 동안, Link N은 프로테오글리칸을 복원시키는 능력을 가지며, 이 효과는 염증성 환경 하에서 유지된다는 것을 나타낸다.
G1 도메인에 대한 항체를 이용하여 상기 조직에서 아그레칸 합성 및 잔류량에 있어서 Link N의 효과가 그 다음 분석되었다. 보충물 없이 21일 동안 체외이식편을 배양한 후, 체외이식편은 약한 아그레칸 G1 함유된 단편들을 보여준다. Link N 보충되면, 아그레칸 G1 함유된 단편들의 함량이 상당히 증가된다 (P<0.0001). 체외이식편이 IL-1 단독으로 처리될 때, 비록 소수의 분자량이 더 낮은 단편들이 관찰되기는 하지만, 아그레칸 G1 함유된 단편들의 착색 강도는 대조군의 것과 비교하여 유사하였고, 한편 Link N 및 IL-1의 보충으로 인하여 Link N 단독 처리된 체외이식편과 필적하는 수준으로 양이 상당히 증가되었다.
상기 매트릭스의 진행 중인 대사 결과로써 생체내 연골에서 아그레카나제 및 MMP 활성에 의해 G1 도메인 밴드가 생성되기 때문에, 염증성 환경에서 MMP-13 발현에 있어서 Link N의 효과가 그 다음 테스트되었다. 오직 Link N, Il-1 단독 또는 Link N와 함께의 존재 또는 부재하에, 체외이식편을 배양한 후에, 웨스턴 블랏팅에 의해 MMP-13 발현이 분석되었다. 보충물 없이 체외이식편을 21 일 동안 배양 한 후, 체외이식편은 약한 활성 MMP-13을 나타낸다. Link N은 대조군과 비교하였을 때, 활성 MMP-13을 상당히 유도하였다. Il-1 보충과 함께, Link N에 의한 자극보다 활성 MMP-13이 더 증가되었다. 대조적으로, IL-1β 존재하에 Link-N를 추가하면, IL-1β 단독과 비교하였을 때, MMP-13의 활성형 양에 있어서 감소를 유도하였다. 따라서 Link N은 염증성 환경에서 활성형의 MMP-13을 억제한다.
연골 복원은 안정적인 매트릭스를 만들기 위하여 콜라겐 생산을 요구한다. 따라서, 최근 생성된 추출가능한 유형 II 콜라겐의 수준이 평가되었다. 골관절염 대조군 체외이식편으로부터 추출된 유형 II 콜라겐의 양은 비록 유의적이지는 않지만, Link N 보충된 체외이식편보다는 더 낮다. 상기 체외이식편이 Il-1 단독으로 처리되었을 때, 대조군 체외이식편과 비교하였을 때, 유형 II 콜라겐의 양은 유의적으로 감소되었다. 대조적으로, IL-1β 존재하에 Link-N을 첨가하면, IL-1β 단독과 비교하였을 때, 유형 II 콜라겐 양의 유의적 증가로 이어졌다. 따라서 Link N은 염증성 환경에서 아그레칸 생산을 자극할 뿐만 아니라, 유형 II 콜라겐 생산도 자극하였다.
몇 가지 연구에서 사전-염증 사이토킨과 매트릭스 분해 효소를 인코드하는 많은 유전자들은 전사 인자, 핵 인자-카파 B (NF-κB)에 의해 조절되는 것을 보여주었다. Link N을 이용한 NF-κB 활성화 연쇄단계의 억제로 사전-염증 매개물질들의 발현이 하향-조절될 수 있다.
그 다음, 정상 연골세포(chondrocytes)에서 IL-1에 의한 NF-κB 활성화에 있어서, Link N의 효과가 평가되었다. 정상적인 연골세포(chondrocytes)는 다양한 농도 Link N 존재 또는 부재 하에 IL-1β로 자극되었다. 포스포릴화된 NF-카파B RelA (p65)의 자극은 P-P65(NF-kB)에 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅에 의해 결정되었다. IL-1β 부재하에 연골세포(chondrocytes)를 배양한 후, 연골세포(chondrocytes)는 P-P65(NF-kB) 단백질을 보여주지 않는다. Link N 보충과 함께, P-P65(NF-kB) 단백질 상에 효과는 관찰되지 않았다. 예상했던 바와 같이, IL-1β에 의한 자극 후, P-P65(NF-kB)가 두드러진다. Link N은 투여분량-의존적 방식으로 IL-1β 자극된 P-P65(NF-kB)를 유의적으로 저해시켰고, - 100 ng의 Link N은 1000 ng Link N과 매우 유사하였다. OA 환자의 연골세포(chondrocytes)를 이용하였을 때, 유사한 결과들이 관찰되었다. Link N이 IL-1베타 매개된 NF-kB 활성화를 억제시키고, 그리고 NF-κB 신호생성의 저해로 인하여, IL-1β 자극된 MMP-13과 염증 사이토킨을 억제할 수 있음이 이 데이터에서 설명된다.
고찰
관절 연골 구조는 이화 및 동화 인자들을 통하여 무손상 상태로, 그리고 기능이 유지되며, 다시 상기 연골세포(chondrocytes)에서 작용하여, 합성과 분해의 균형에 의해 조직 항상성이 유지된다. 콜라겐 및 아그레칸의 분해 및 상실, 준연골 뼈 재구성, 그리고 윤활막의 염증은 이화작용으로 균형의 변이된, 골관절염을 특징화한다. Link N이 연골세포(chondrocytes)에서 콜라겐과 프로테오글리칸 합성을 촉진할 수 있다는 것은 이미 보고되었다. 그러나, Link N이 염증환경에서 골관절염 연골내 프로테오글리칸과 콜라겐 함량을 복원시킬 수 있는지는 모른다. 본 명세서에서 이들 결과는 초기 OA에서 Link N이 프로테오글리칸과 콜라겐 함량을 복원시키는 잠재력을 보유한다는 것을 설명한다. Link N이 단백질분해를 억제시키고, 염증성 환경에서도 NF-kB 신호전달을 억제함으로써 프로테오글리칸과 콜라겐 합성을 증가시킬 수 있다는 것을 이 데이터에서 또한 나타낸다.
생물활성 인자인 Link N은 디스크 복원을 자극하는 능력을 가진다는 것이 증명되었다. 콜라겐 및 프로테오글리칸 메세지 수준를 유도하기 위하여 시험관에서 단리된 IVD 세포의 이용이 확인되었고, 그리고 새로이 합성된 프로테오글리칸으로 방사능활성 35SO4의 혼입이 증가되었다고 보고되었다 (6,16,18). 게다가, 생체외 무손상 인간 IVDs로 Link N의 주입에 의해 방사능활성 35SO4가 새로이 합성된 프로테오글리칸 안에 혼입이 증가되며, 그리고 디스크 퇴행의 천자(stab) 모델에서 토끼 디스크에 주사되면, 디스크 높이가 부분적으로 회복되었다. Link N은 OA 환자의 연골세포(chondrocytes)에서 프로테오글리칸과 콜라겐 발현을 자극시킬 수 있고, 이는 연골의 기능적 성질 복원에 있어서 기능적 역활과 일관된다는 것이 이들 결과에서 나타난다.
Link N은 연골세포(chondrocytes)에서 P-P65(NF-kB) 활성화를 억제시켰다. NF-kB 신호생성 경로는 생체내 관절염의 발달 및 진행에서 활성 역할을 한다(19,20). 게다가, 우리 연구에서 IL-1b로 자극 후 관절 연골세포(chondrocytes)에서 NF-kB의 활성화를 보여주었으며, 이는 상기 관절 연골의 분해대사에서 중요한 역할을 한다. NF-kB 발현은 콜라게나제-3 (메탈로프레테나제 (MMP)-13)과 스트로멜리신 1 (MMP-3) 수준과 관련있었다. 또한, 유형 II 콜라겐으로 면역주사를 맞은 DBA/1 마우스에서 관절염 초기 단계에서 연골 파괴 동안 연골세포(chondrocytes)에서 핵 NF-kB 국소화의 이동이 나타났다. 본 결과들에서, IL-1b를 이용한 자극은 관절 연골세포에서 NF-kB 활성화 자극의 원인임을 보여준다.
기능성 매트릭스를 보유하기 위하여, 새로이 사용되던(laid down) 매트릭스는 재구성되어야 한다. 이것은 다양한 프로테아제의 상향조절과 관련된다. 본 연구에서, Link N은 대조군과 비교하였을 때 활성 MMP-13을 유의미적으로 억제하였다. 따라서 상기 연골 안에 이의 새로운 기능을 위하여 새로 합성된 ECM을 재구성하기 위하여, 상기 프로테아제의 상향조절이 요구된다. Link N은 보충된 인간 디스크 세포는 시험관내 그리고 디스크 퇴행의 토끼 생체내 모델에서 프로테아제 활성을 상향조절한다. 따라서, 연골의 기능을 복원시키기 위하여 디스크 ECM의 재구성과 관련된, 연골의 복구에서 Link N이 효과적인 것으로 보인다.
관절염에서 MMPs에 의한 관절 연골 분해를 감소시키기 위하여, NF-kB의 저해제의 잠재적 사용이 설명되었다.. 비스테로이드성 항-염증 약물 (NSAIDs), 글루코코르티코이드, 및 상이한 물질을 이용한 유익한 결과들은 감소된 NF-kB 활성화을 입증한다. 그러나, NSAIDs의 사용은 위장 부작용을 초래할 수 있고, 오직 단일 장기에서 표적 유전자 발현이 저해될 때, 안티센스에서 특이성 부재와 전사 인자 데코이(decoy) 전략은 큰 도전이 된다. 더욱이, 단백질 운반, 면역원성, 그리고 치료 단가의 문제들이 치료를 위한 온전한 단백질의 현실적 전망을 제한시켰다.
실시예 4
프로테오글리칸 고갈이 관련되었지만, 실질적인 콜라겐 파괴는 없는 초기 디스크 퇴행의 장기(organ) 배양 모델을 이용하여, 경제성있는 성장 인자 유사체로써 Link N과 세포 보충물로써 간엽 줄기 세포 (MSCs)를 이용한 분자 및 세포-기반 치료법의 효과를 연구한다.
재료 및 방법들
간엽 줄기 세포 배양
뼈 골수로부터 회수된 인간 MSCs는 Lonza (Basel, Switzerland)로부터 획득되었다. 공급자에 따라, 상기 세포는 CD105, CD166, CD29, 및 CD44에 대해 양성이며, 그리고 CD14, CD34, 및 CD45에 대해 음성이었다. 추가적으로, 상기 세포는 골형성, 연골생성, 및 지방생성 계통으로 분화될 수 있다는 것이 확인되었다. 모든 세포는 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 100 U/mL 페니실린, 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM)에서 확장되었고, 4개 계통에 이용되었다 (19,20). 모든 배양 시약들은 Wisent Inc. (St-Bruno, Canada)의 것이다.
간엽 줄기 세포 라벨링 및 경로추적
MSCs는 공급업자의 지시에 따라 PKH67 (Sigma-Aldrich, Oakville, Canada)로 라벨링되었다. 간략하게 설명하자면, 2x106 MSCs는 FBS 없이, DMEM로 세척되었고, 400 g에서 5분 동안 원심분리에 의해, 단단하지 않은 펠렛으로 수거되었다. 상기 펠렛은 Diluent C에서 재-현탁되었고, 염료 용액과 신속하게 혼합되었다. 세포/염료 현탁액은 그 다음 5 min 동안 항온처리되었고, 그 다음 FBS를 부가함으로써 반응은 중단되었다. 상기 세포의 생존력은 트립판 블루로 착색시켜 측정되었다. 분취액은 라벨링 효과를 추적하기 위하여 단층에서 배양되었다 (Sarstedt, Saint-Leonard, Canada). 나머지 상기 세포는 인산염-완충된 염수 (PBS) (Wisent), 또는 1 mg/mL Link N (CanPeptide, Montreal, Canada)가 보충된 PBS에 재현탁되었다. 그 다음 상기 세포 현탁액은 퇴행을 유도하기 위하여 트립신으로 처리된 소의 디스크에 주사되었다 (21).
디스크 단리 및 배양
이미 설명된 바와 같이, 24- 내지 30-월령의 황소 꼬리로부터 가장 큰 첫 3-4 꼬리 디스크들이 단리되었다 (21,22). 간략하게 설명하자면, 꼬리는 피부, 근육 및 인대가 없도록 분해되었고, 그리고 각 단편의 육경(pedicles)이 제거되었다. 빼와 연골로된 끝판의 인접 석회화 부분이 제거되었고, 그리고 상기 디스크의 표면은 탐지가능한 석회화된 조직이 없어 부드럽고, 유연성이 있었다. 상기 디스크는 1,000 U/mL 페니실린, 1,000 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 0.25 ㎍/mL 펑기존(fungizone) (GIBCO, Burlington, Canada)이 보충된 PBS에서 세척된 후, 50 mL 배양 배지 (2 mM Glutamax 및 25 mM Hepes와 함께, 5 % FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 50 ㎍/mL L-아스코르베이트가 보충된 DMEM)가 함유된 80 mL의 무균 견본 용기 (STARPLEX Scientific, Etobicoke, Canada)에서 3일 동안 사전-조건화되었다. 28G1/2 바늘 (21)을 이용하여 디스크의 중앙에 75 ㎕ PBS에 용해된 100 ㎍ 트립신 (Sigma-Aldrich)의 일회 주사에 의해 퇴행이 유도되었다. 상기 바늘은 디스크 중심에 바늘이 닿도록 필요한 거리를 측정하기 위하여, 디스크 상단에 배치되며, 그 다음 동일한 깊이도 삽입되었다. 일단 중앙에서, 상기 트립신 용액이 서서히 주사되었으며, 역류가 없도록 바늘을 천천히 빼내었다. 그 다음 상기 디스크는 추가 4일 동안 배양되었고, 최종 용적 75 ㎕ PBS에 MSCs (105 세포), Link N (75 ㎍), 또는 MSCs (105 세포)와 Link N (75 ㎍)의 복합이 주사되었다. 소 디스크의 평균 용적이 7.5 mL이라고 추정하여, Link N 농도는 단리된 소의 디스크 세포 (1 ㎍/ml)에 최적의 투여분량에 근거하였다. 이용된 MSCs의 수는 건강한 인간 디스크의 세포 밀도를 측정한 Liebscher et al ( 23 ) 연구에 근거하였다. 소의 디스크는 이미 높은 세포 밀도를 가지고 있기 때문에, 영양 고갈로 인한 세포 생존에서 잠재적 유해한 영향을 회피하기 위하여, 건강한 성인 인간 디스크에서 발견된 세포 수의 대략 절반이 본 연구에 이용되었다. 모든 실험 조건에서, 7개의 디스크가 주사되었다. 퇴행 대조군으로 이용되며, 그리고 NP의 프로테오글리칸 함량의 분해에 있어서 트립신이 활성이 있다는 것을 증명하기 위하여, 7개의 트립신-처리된 디스크에 PBS만이 주사되었다. 7개의 디스크는 비-퇴행 대조군으로 삼기 위하여 임의의 주사없이, 배양되었다. 그 다음 상기 디스크들은 14 일 동안 배양되었고, 배지는 매 3 일마다 교체되었다.
현미경 및 조직학에 의한 디스크 분석
배양 종료시, 2개의 마이크로톰 날로 구성된 인-하우스 기획된 커팅 도구를 이용하여 상기 디스크 중심을 통하여 2개 부분을 취하였다 (21). 이로써 약 3 cm 폭 (디스크 직경)과 1 cm 높이 (디스크 높이), 2개의 750 ㎛ 두께 슬라이스가 제공된다. 조직 분석을 위하여 한 개 슬라이스는 포르말린-없는 고정액 (Accustain, Sigma-Aldrich)에 고정되었다. 고정된 시료는 파라핀 왁스에 매립되었고, 5-㎛-두께 단편이 절단되고, 헤마토실린 및 사프라닌 O-패스트 그린으로 착색되었다 (24). 다른 슬라이스는 상기 디스크 조직에서 MSCs의 분포를 연구하기 위하여 새로 이용되었다. 상기 라벨된 줄기 세포가 이주된 상기 디스크는 역전된 공촛점 레이져 스캐닝 현미경을 이용하여 가시화되었다(CLSM, Zeiss LSM 510). 20개의 연속 6 ㎛ 단편이 영상화되었고, CLSM 스택(stacks)은 단일 영상으로 분리되었다.
세포외 ECM 단백질 및 프로테오글리칸의 추출
나머지 속질핵 (NP) 조직이 수거되었고, 습식 중량이 기록되었다 (21). 상기 조직은 작은 조각으로 절단되었고, 단백질 및 프로테오글리칸 추출을 위하여 14 용적의 추출 완충제 [4 M 염화 구아니디니움, 50 mM 아세트산 나트륨, pH 5.8, 10 mM EDTA, COMPLETE® (Roche, Laval, Canada)에 현탁되었다. 상기 조직은 4 ℃에서 48 시간 동안 연속 교반과 함께 추출되었고, 추출물은 12,000 g에서 30 min 동안 4 ℃에서 원심분리에 의해 맑아졌다. 상기 상청액이 수거되었고, 추가 분석을 위하여 -80 ℃에 보관되었다.
GAG 분석
술페이트화된 글리코사미노글리칸 (GAGs)은 변형된 디메틸 메틸렌 블루 (DMMB) 염료-결합 분석에 의해 조직 추출물에서 정량화되었다 (25,26). 시료는 표준 곡선의 선형 범위 중간에 속하도록 희석되었다. 상기 조직 추출물과 동량 용적의 추출 완충액이 표준 곡선에 추가되어, 가능한 간섭을 보상하였다.
아가로즈 겔 전기영동에 의한 프로테오글리칸 분석
프로테오글리칸 조성물은 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석되었다 (27). 10 ㎕ 분취액의 디스크 추출물 안에 프로테오글리칸은 무수 에탄올로 침전시키고, 증류된 물에 용해되었다. 상기 시료는 시료 완충제 (0.1 M Tris-HCl, 0.768 M 글리신, 0.01 % 브로모페놀 블루, 1.2 % 글리세롤, 0.05 % SDS, pH 8.3)와 혼합하고, 10 min 동안 가열하였다. 프로테오글리칸은 1.2 % 아가로즈 겔에서 전기영동에 의해 분리되었다. 상기 겔은 0.5 % (w/v) Triton X 100과 함께, 3% 아세트산에서 0.02 % (w/v) 톨루이딘 블루로 착색되었고, 3 % 아세트산, 그 다음 증류된 물로 탈착색되었다.
웨스턴 블랏에 의한 아그레칸 및 유형 II 콜라겐 분석
디스크 추출물의 10 ㎕ 분취액 안에 단백질과 프로테오글리칸은 9 용적의 무수 에탄올 추가에 의해 침전되었고, 95 % 에탄올에서 2회 세척되었고, 그리고 최종적으로 동결건조되었다. 유형 II 콜라겐 분석을 위한 시료는 증류된 물에 용해되었다. 아그레칸 분석을 위한 시료들은 완충제 (0.05 M Tris-HCl, 0.03M 아세트산 나트륨, pH 7.4, COMPLETE®)에 용해되었고, 케라타나제 I 및 콘드로이티나제 ABC (Amsbio, Lake Forest, CA , US)에 의해 절단되었다. 동일한 치료 군으로부터 시료를 풀링하였고, SDS 시료 완충제와 함께 혼합되었고, 그리고 10 분 동안 가열되었다. 그 다음 상기 단백질은 환원 조건하에 SDS-PAGE (4-12% Bio-Rad® 겔)에 의해 분리되었다. 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스 막으로 이동되었고, 0.2 % Tween 20 (차단 완충제)와 함께, PBS 안에 1% BSA로 차단되었다. 그 다음 4 ℃에서 하룻밤 동안 차단 완충액에서 1:2,000 희석에서 1차 항체로 항온처리되었고, 이어서 차단 완충제 안에서 홍당무 과산화효소 (1:5,000 희석, Sigma-Aldrich)가 접합된 2차 항체와 함께 항온처리되었다. 콜라겐 유형 II을 인지하는 1차 항체는 Abcam (Toronto, Canada)의 것이며; 아그레칸 G1 도메인을 인지하는 1차 항체는 전술한 바와 같이 준비되었다 (28). 결합된 항체는 화학발광 (GE Healthcare Baie d'Urfe Canada)에 의해 가시화되었고, Bio-Rad VersaDoc 영상 분석 시스템 (Bio-Rad, Mississauga, Canada)에 의해 분석되었다.
통계학적 분석
통계학적 분석은 변형 분석과, 이어서 GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA USA)를 이용하여 Fisher 보호된 최소 유의차 사후 분석(post hoc test)이 실행되었다. 결과는 상이한 소의 꼬리에서 취한 디스크를 이용한 7개 독립 실험의 평균 ± 표준 편차 (SD)로 나타낸다. 차이는 p < 0.05인 경우 통계학적으로 유의적인 것으로 간주된다.
결과
Link N은 단리된 디스크 세포에 의해 그리고 퇴행성 토끼 디스크에서 프로테오글리칸 합성을 유도하는 것으로 공지되어 있고, 그리고 시험관에서 연골형성을 강화시키는 것으로 공지되어 있다 (20,29- 32). 그러나, Link N 또는 MSCs가 단독으로 초기 퇴행이 있는 더 큰 디스크에서 상기 프로테오글리칸 함량을 복원시킬 수 있는지는 알려져 있지 않다. Link N과 MSCs의 복합이 부가 효과를 가질 수 있는 지 또한 알려져 있지 않다. 이를 테스트하기 위하여, 단백질가수분해에 의해 유도된 아그레칸 고갈이 있는 소의 디스크는 Link N 또는 MSCs 단독 또는 Link N과 MSCs의 복합으로 처리되었다. 상기 디스크는 처리 후 2주 동안 배양되었고, 추출가능한 프로테오글리칸의 농도는 DMMB 분석에 의해 정량화되었다 (도 12). 중재없이, 퇴행성 디스크에서 GAG 함량은 비-퇴행성 대조군에 있는 수준의 약 50%로 떨어졌다. 대조적으로, Link N과 MSCs 단독, 또는 복합은 대조군 퇴행성 디스크에서 GAG 함량과 비교하였을 때, 상기 디스크의 GAG 함량을 상당히 증가시켰다 (p<0.05). 처리된 디스크에서 프로테오글리칸 농도는 비-퇴행성 디스크의 것과 유사하였다. 그러나, 처리된 집단중에 통계학적 유의성은 관찰되지 않았다(p>0.05). 이는 초기 퇴행에서 Link N 또는 MSCs 단독은 원래 수준으로 프로테오글리칸을 복원시키는 능력이 있으며, 복합 치료법에 의해 추가적인 장점이 없다는 것을 나타낸다.
동일한 프로테오글리칸 함량을 가진다는 것이 이 구조가 정상 디스크의 구조와 동일하다는 것을 의미하는 것은 아니다. 이를 해결하기 위하여, 추출된 프로테오글리칸은 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석되었다. 처리된 디스크에서 착색 크기 분포와 강도는 비-퇴행성 대조군 디스크와 대등하지만, 한편, 대조군 퇴행성 디스크에서는 착색 강도가 더 낮았다 (도 13). 상기 데이터는 처리된 디스크에서 만들어진 새로이 합성된 프로테오글리칸이 비-퇴행성 디스크의 것과 동일한 크기 범주에 있음을 증명한다.
추가적으로, 무손상 아그레칸 코어 단백질의 존재 및 풍부성은 SDS-PAGE에 의해 평가되었다. 250 kDa 이상의 무손상된 아그레칸 코어 단백질은 비-퇴행성 대조군 디스크와 비교하였을 때, 대조군 퇴행성 디스크에 상당히 더 낮았고 (p<0.05), 한편 Link N 및/또는 MSCs의 주사로 상기 양은 비-퇴행성 대조군 디스크와 필적할 수 있는 수준으로 상당히 증가되었다(도 14).
디스크 복원은 또한 안정적인 매트릭스를 만들기 위하여 콜라겐 생산을 요구한다. 따라서, 최근 생성된 추출가능한 유형 II 콜라겐의 수준이 평가되었다 (도 15). 대조군 퇴행성 디스크로부터 추출된 유형 II 콜라겐의 양은 비-퇴행성 대조군 디스크의 것보다 상당히 더 낮았다. 상기 디스크에 MSCs 및/또는 Link N이 주사되었을 때, 유형 II 콜라겐의 양은 비-퇴행성 대조군 디스크에서 탐지된 것과 유사한 수준으로 증가되었다. 따라서 Link N와 MSCs는 모두 아그레칸 생산을 자극할 뿐만 아니라, 유형 II 콜라겐 생산도 자극한다.
조직학적 분석을 이용하여 복원 조직 안 프로테오글리칸 분포를 평가하였다. 조직 단편의 사프라닌 O 및 신속 그린 착색으로 사프라닌 O (적색) 착색이 거의 발견되지 않는, 대조군 퇴행성 디스크 안에 프로테오글리칸의 균일한 상실이 확인되었다 (도 16). 이 결과는 대조군 퇴행성 디스크에서 NP 영역 도체에 상기 프로테오글리칸 함량이 감손되었음을 확인시켰다. MSCs 또는 Link N 단독 또는 함께 처리된 상기 디스크에서, 사프라닌 O 착색의 강도 및 분포에서 비-대조군 퇴행성 디스크와 유사하게, NP 영역 전체적으로 고른 분포를 보였다. 따라서, 새로이 합성된 프로테오글리칸은 ECM을 통하여 확산될 수 있으며, 그리고 상기 세포로부터 떨어져 있는 영역들에서 조차도 조직 함량을 복원시킬 수 있었다.
지속되어야 하는 MSC 유도된 복원 공정의 경우, 주사된 줄기 세포는 살아있어야 하며, 복원 조직 전제적으로 분포되어야 한다. 이를 해결하기 위하여, MSCs는 PKH67 (도 17A, B)로 표지되었으며, 단층에서 2 일 동안 배양되어, 라벨링 효과와 염료 지속성이 평가되었다. 트립신-처리된 디스크에 주사되기 전, 상기 세포가 라벨되었고, PBS 또는 Link N/PBS에 현탁될 경우, MSC 생존력은 90% 이상이었다. 주사된 MSCs가 생존되고, 상기 디스트의 ECM에서 통합되었는 지를 평가하기 위하여, 세포는 공촛점 현미경에 의해 추적되었다. 라벨된 MSCs는 장기(organ) 배양 기간 2주 후, NP 영역을 통하여 분포되어 있음이 확인되었고 (도 17C, D), 이는 지속적인 복원 공정의 실행가능성을 나타낸다.
토의
본 연구에서, 초기 디스크 퇴행의 장기(organ) 배양 모델은 IVD 프로테오글리칸 함량을 복원시키기 위한 분자 및 세포-기반 요법의 가능성을 연구하는데 이용되었다. Link N은 분자 물질로, 그리고 MSCs는 세포 보충물로 이용되었다. 퇴행성 디스크는 치료법은 별도로, 복합적으로 처리되었으며, 그리고 이 결과들에서 Link N 또는 MSCs 단독은 조직 프로테오글리칸을 복원시키는 능력이 있으며, 둘의 복합에 의한 부가 효과는 관찰되지 않았다.
기존 작업에서 디스크 복원을 촉진시키는 Link N의 잠재력이 증명되었다 (20,29,31-35). 비록, 본 명세서에서 나타낸 것과 같이 Link N이 AF 세포에 의해 절단되지만, 생성된 N-말단 8개 아미노산 펩티드는 단백질가수분해적으로 안정적이며, 그리고 생물학적 활성을 유지하는 것으로 보인다. 시험관에서 단리된 IVD 세포를 이용한 연구에서 Link N은 콜라겐 및 프로테오글리칸 메세지 수준을 유도할 수 있으며, 그리고 방사능활성 35SO4가 새로이 합성된 프로테오글리칸으로 혼입 증가를 초래한다는 것을 보여주었다 (34,35). 추가적으로, 생체외 무손상 인간 IVDs로 Link N 주사하면, ( 34 ) 새로이 합성된 프로테오글리칸으로 방사능활성 35SO4의 혼입 증가를 초래하였고, 디스크 퇴행의 천자(stab) 모델에서 토끼 디스크에 Link N이 주사되면, 디스크 높이가 부분적으로 회복되었다(31). 본 연구에서 이용된 모델은 젊은이의 초기 단계 퇴행과 닮았으며, 초기 단계 퇴행의 경우 상기 조직은 Link N 자극에 반응할 수 있는 충분한 수의 세포를 보유한다. 대조적으로, 세포 수 감소, 세포 노화 그리고 한편으로 가능한 염증성 환경은 대개 인간 디스크 퇴행을 특징으로 묘사된다. 우리 집단의 기존 작업에서 Link N은 염증성 환경에서 대등하게 효력이 있는 것으로 나타났다 (34) 이 단계에서, 디스크 ECM을 합성할 수 있는 추가 세포를 또한 공급할 필요성이 있다.
자가 IVD 세포가 수거될 수 있고, IVD 복원을 위한 세포 원천으로 이용되어, MSCs가 매력적인 선택으로 남게 되는 양성 부위는 없다. IVD 복원을 위한 MSCs의 잠재적 용도는 작은 동물에서 설명되었다 (36-38). 토끼에서 양호한 결과는 증가된 디스크 높이, 뿐만 아니라 ECM 침착 및 수화를 입증한다. 그러나, 토끼에 대한 다른 연구는 특히 골격 없이 또는 AF의 봉쇄없이 MSCs가 투여된 경우, 특히 골증식체 형성을 보고한다 (39). Link N은 연골생성을 촉진시키고, 시험관에서 인간 MSCs의 골형성을 감소시키는 것으로 알려져 있기 때문에, 복합 치료의 이상적인 후보가 될 수 있다 (20). 동물 연구에 추가적으로, 소규모의 인간 임상 시험에서 통증과 장애 점수가 개선되었다는 것이 보고되었다(40). 임상 시험에서 디스크 높이의 증가는 없었지만, MRI에 의해 측정된 수화의 증가가 탐지될 수 있다. MSC 보충이 초기 퇴행에서 생존가능한 선택이 될 수 있음을 본 결과에서 나타낸다. 그러나, 끝판 석회화가 퇴행과 연합되기 때문에 (41), 퇴행성 디스크에서 결과된 상충된 영양 경로는 추가 세포의 대사 활성을 지지할 수 있는지를 확인하는 것이 남아 있다(42,43).
현행 모델은 분자 고갈 오직 열창 생성을 초래하지 않지만, 한편 자연적 디스크 퇴행은 대개 열창의 생성과 관련된다. 이러한 병소를 복원시키기 위하여, 병소를 채우고, 치료 물질의 균일한 분포가 허용되도록 중합가능한 골격 안에 Link N 단편들과 줄기 세포의 주사가 요구될 수 있다.
디스크들의 무작위화
동물 퇴행 대조군 비-퇴행 대조군 Link N MSCs Link N + MSCs
1 X x x x
2 x x x x
3 X x x x
4 X x x x
5 X x x x
6 X x x x
7 x x x x
8 X x x x
9 X x x
실시예 5
소의 디스크 장기(organ) 배양을 이용하여 추가 테스트가 실행되었다. 도 18은 Link N 1-8 처리 후 2주차 시점에서 Link N 1-8이 소의 퇴행 디스크에서 프로테오글리칸 합성, 아그레칸 및 유형 II 콜라겐 발현에 통계학적으로 유의적인 증가를 유도한다는 것을 보여준다.
Link N 및 아미노산 1-8이 포함된 단편은 퇴행성 디스크에서 아그레칸 수준을 복원시킬 수 있다고 설명된다.
실시예 6
인간 Link N [DHLSDNYTLDHDRAIH] (서열 번호: 16)은 시험관 및 생체내에서 추간판 (IVD) 세포에 의한 세포외 매트릭스 생합성을 촉진시킬 수 있다. 현재까지, 디스크 세포에서 소의 Link N [DHHSDNYTVDHDRVIH]의 효과에 대한 보고는 없었다. 본 연구의 목적은 소의 섬유륜 (AF) 및 속질핵 (NP) 세포에서 소의 Link N (BLN) 효과를 인간 Link N (HLN)의 의 효과에 비교하는 것이다.
방법: 22-24 월령의 건강한 황소의 꼬리뼈 디스크의 NP 및 AF 영역으로부터 단리된 세포는 프로테오글리칸 합성 및 유전자 발현을 위하여 1.2% 알긴산염 비드 또는 단백질 추출을 위하여 단층 배양물에 즉시 매립되었다. 상기 비드는 1㎍/ml HLN 또는 BLN이 보충된 배지에 18일 동안 배양되었다. 황산염화된 글리코사미노글리칸 (GAG) 방출이 분석되었다. 배양 7일 및 14 일 후, 아그레칸 (AGG), ADAMTS-4 및 ADAMTS-5를 위하여 정량적 PCR이 실행되었다. P-Smad1/5 및 P-Smad2에 대한 특이적 항체를 이용한 면역블랏팅에 의해 Smad 활성화가 분석되었다.
결과: NP 및 AF 세포에서, BLN 및 HLN과 함께 항온처리되면 배양 배지로 GAG 방출이 증가되었다. GAG 방출은 대조군 배지와 비교하였을 때, BLN 또는 HLN으로 항온처리된 AF 세포에서 유의적으로 더 높다. 그러나, HLN과 함께 항온처리될 때, NP 세포는 유의적이고 일관적인 GAG 방출 증가를 가졌다. AF 세포에서, 두가지 Link-N 보충물은 모두 6시간 일정을 통하여 대조군 수준 이하로 감소된 Smad1/5의 신속한(<10 분 동안) 활성화를 유도하였다. NP 세포에서, Smad1/5는 30분 후 지연된 시작과, 그리고 시간과 함께 지속적으로 증가되었다.
BLN은 Smad1/5의 활성화를 통하여 소의 IVD 세포에서 GAG 방출을 촉진시킬 수 있다. AF 세포에서 Smad1/5의 신속한 활성화는 GAG 합성 촉진에서 BLN 보충에 대해 NP 세포보다는 AF 세포가 더 잘 반응한다는 우리의 발견을 설명할 수 있고; 두 펩티드는 디스크 복원을 촉진시키도록 기획된 임의의 물질에 요구되는 특징들을 가진다.
실시예 7에 더 상세한 설명이 있다.
실시예 7
추간판 디스크 (IVDs)는 상기 프로테오글리칸-풍부한 중앙 수핵 (NP) 주변 말초 콜라겐-풍부한 섬유륜(AF)로 구성된 복합 구조다[77]. 큰 프로테오글리칸 덩어리를 만들기 위하여 히알루론산염과 상호작용하는 프로테오글리칸 아그레칸을 높은 함량을 보유하기 때문에, 이들은 압박에 저항한다. 이들 상호작용은 링크 단백질의 추가 상호작용에 의해 안정화된다 (도 19) [78,79]. AF 및 NP에 잔류하는 디스크 세포는 동화 및 이화 인자들간의 균형을 유지시키고, 매트릭스 분자와 분해 효소의 발현을 조절하는, 대사 과정을 통하여 IVDs의 항상성을 조절한다. 이러한 항정상태(steady state)의 불균형은 감손된 합성과 증가된 분해로 인하여, IVD 매트릭스의 조성 및 구조에서 생화학적 변경을 유도하며, 아그레칸은 단백질가수분해성 손상 및 상실에 특히 민감하다. 상기 세포외 매트릭스 (ECM)의 진행적 붕괴는 디스크 퇴행과 밀접하게 연합된다 [80].
IVD 퇴행은 인구의 절반 이상에서 심각하게 영향을 줄 수 있는 요통의 병인에 주요 역할을 한다 [53, 81-82]. 따라서, 요통 치료법의 경우, 퇴행성 IVDs의 퇴행 과정의 역전 및 복원(구조 또는 기능의 복원)이 중요하다. 최근, 세포 또는 성장 인자 치료법은 IVD 복원을 유도하는 것으로 제안되었다 [83-86]. 몇몇 연구에서 세포성 대사를 촉진시키고, 동화 상태로의 조직 항상성을 변화시키고 (매트릭스 합성), 이로 인하여 퇴행 과정을 역전시키기 위하여 성장 인자들을 이용하는 것이 제안되었다.
디스크 복원은 성장 인자 보충 이를 테면, 뼈 형성 단백질 (BMPs) 및 형질변환 성장 인자-β (TGF β)에 의해 강화될 수 있다. 이들 성장 인자는 세포외 매트릭스 생산을 최대화시키고, 그리고 조직 재생을 촉진시키기 위하여 직접적으로 적용될 수 있다. 성장인자의 경제적인 대체물로써, 조직 재생을 위하여 Link N을 이용할 수 있는 가능성이 있을 수 있다. 인간 Link N 펩티드 [DHLSDNYTLDHDRAIH] (서열 번호: 16)는 아그레칸 G1 도메인과 히알루론산염 사이의 비-공유적 상호작용을 안정화시키는 당단백질인, 링크 단백질의 N-말단 펩티드다 (도 19). 인간 Link N은 시험관에서 인간 관절 연골 및 소의 IVD 세포에서 콜라겐 및 프로테오글리칸 합성을 촉진시킬 수 있으며[87-88, 35], 그리고 디스크 퇴행의 토끼 모델에서 디스크 높이를 증가시킬 수 있다[31]. 기존 연구에서 Link N은 연골세포 비대의 표지인, 유형 X 콜라겐의 발현을 또한 감소시킬 수 있고 [89], 그리고 연골 및 디스크 ECM 형성의 표지인 유형 II 콜라겐의 발현을 유도할 수 있다는 것을 보여주었다 [90]. 따라서, Link N은 IVD 복원에 필수적인 ECM 형성을 촉진시키기 위하여 줄기 세포와 함께 이용될 수 있는 잠재력을 가진다.
현재까지, 디스크 세포 상에 소의 Link N [DHHSDNYTVDHDRVIH] (서열 번호: 18)의 효과에 대한 보고는 없었다. 본 연구의 목적은 BLN 서열에서 발생되는 것과 같이, 잔기의 치환(굵게 표시됨)이 Link N 기능을 변경시킬 수 있는 지를 판단하기 위하여, 소의 IVD 세포에서 소의 Link N (BLN) 및 인간 Link N (HLN)의 효과를 비교하는 것이다.
재료 및 방법들
소의 디스크 단리
20-24월령의 건강한 황소 꼬리뼈는 지역 도살장에서 도살 2-3h 이내에 것을 구하였다. IVDs는 이들 인접 척추체로부터 분리되었고, 상기 세포는 이미 설명된 바와 같이, 0.2% 프로네이즈를 이용한 절단에 이어서 0.125% 콜라게나제 절단에 의해, NP 및 AF 영역으로부터 단리되었다 [88]. 단리 후, NP 및 AF 세포는 알긴산염 비드에 즉시 매립되었거나, 또는 단백질 추출을 위하여 6 웰 플레이트에 도말되었다.
알긴산염 매립(Embedding)
단리 후, NP 및 AF 세포는 ml 당 2만개 세포 농도로 1.2% 알긴산염 (0.15 M NaCl에 용해된)에 재현탁되었다. 광범위한 세포 증식 부재하에서 매트릭스 생산에 있어서 효과를 평가하기 위하여 알긴산염이 선택되었다 [91-92]. 세포 현탁액 비말은 18-가우지 바늘을 통하여 102 mM 염화칼슘 용액으로 방출되었으며, 그리고 10 분 동안 중합화되도록 두었다. 알긴산염 비드는 배양 배지 (10% 태아 소 혈청 및 항생제가 보충된 Dulbecco 변형된 Eagle 배지 고포도당)에서 7일간 후속적으로 안정화되었다.　
알긴산염 비드의 배양 및 처리
안정화 후, 알긴산염 비드는 24 웰 플레이트에서 9개 비드/웰 밀도로 배치되었고, 그리고 1㎍/ml HLN 또는 BLN (CanPeptide, Montreal)이 보충된 배지에서 18일 동안 항온처리되었다. 동일 기간 동안 배지 단독에서 배양된 비드는 대조군 (CTL)으로 이용되었다. 1μg/ml Link N이 디스크 세포에서 프로테오글리칸 합성을 자극함에 있어서 최대 반응을 유도한다는 발견에 근거하여 BLN 및 HLN 보충 농도가 선택되었다 [93]. 임의의 표현형 변화가 상이한 Link N 보충하에 발생되도록 충분한 시간을 허용하기 위하여 배양 배지는 18일 동안 매 3일마다 교환되었다.
디스크 세포의 배양 및 처리
AF 및 NP 세포는 배양 배지 (10% 태아 소 혈청 및 항생제가 보충된 Dulbecco 변형된 Eagle 배지 고포도당)에서 80-90% 합류에 이를 때까지, 6 웰 플레이트 (7.5x105 세포/웰)로 확장되었다. 상기 세포는 무혈청 배지에서 하룻밤 동안 사전-배양되었고, 그 다음 최대 6시간 까지 상이한 시점 동안 1㎍/ml HLN 또는 BLN에서 항온처리되었다. 배지 단독에서 배양된 세포는 대조군 (CTL)으로 이용되었다.
세포 생존력
세포 생존력은 생존/사멸 형광 분석 (Live/Dead®, Invitrogen)에 의해 18일차 시점에서 알긴산염 비드 상에서 평가되었고, 그리고 형광 현미경에 의해 가시화되었다.
프로테오글리칸 함량
Link N과 함께, 또는 Link N 없이, 알긴산염 비드의 배양배지는 매 3일마다 교체되었고, 배지로 방출된 황산염화된 글리코사미노글리칸 (GAG, 주로 아그레칸)은 1,9-디메틸메틸렌 블루 (DMMB) 염료-결합 분석을 이용하여 분석되었다 [94]. 알긴산염은 DMMB와 반응하여, 분석을 간섭하는 다음이온이기 때문에 알긴산염에 GAG 잔류은 측정되지 않았다.
전체 RNA 단리 및 유전자 발현
7일차 및 14일차, 알긴산염 비드는 구연산 완충제에 재현탁되었고, 유전자 발현을 위하여 상기 세포가 회수되었다. 제조업자 지시에 따라 Trizol (Invitrogen, Burlington, ON, Canada)를 이용하여 디스크 세포로부터 전체 RNA가 추출되었다. Superscript™ First Strand cDNA 합성 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 1㎍의 전체 RNA가 cDNA로 역전사되었다. 역 전사후, 실시간 PCR은 아그레칸 (AGG), ADAMTS-4 및 ADAMTS-5의 메세지 수준을 정량적으로 분석하는데 적용된다. 유전자-특이적 프라이머를 이용하여 1 ㎕의 cDNA가 증폭되었다 (표 3). 우선, 표적 유전자의 발현은 18S rRNA 발현 수준으로 정상화되었고, 그리고 Link N-항온처리된 비드의 발현은 대조군 비드로 정상화되었다.　
단백질 발현
그 다음 항온처리된 AF 및 NP 세포는 10mM HEPES, 50mM Na4P2O7, 50mM NaF, 50mM NaCl, 5mM EDTA, 5mM EGTA, 2mM Na3VO4, 1% Triton X-100 (모두 Sigma-Aldrich 제품), 그리고 프로테아제 및 포스파타제 저해제 칵테일 (Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada)이 함유된 완충제(pH 7.4)에서 용해되었다. 단백질은 10% 아크릴아미드 겔 상에서 분리되었고, 그리고 P-Smad1/5, P-Smad2, Smad1 및 Smad2 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA)에 대한 특이적 항체를 이용하여 단백질 발현을 측정하기 위한 웨스턴 블랏을 위하여 PVDF 막으로 옮겨졌다. 상기 막은 ESL 화학적발광 시약 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)에서 항온처리되었고, 그리고 Molecular Imager VersaDoc™ MP 4000 System (Bio-Rad Canada, Mississauga, ON, Canada)을 이용하여 스캔되었다. ImageJ 소프트웨어 프로그램을 이용하여 밀도측정에 의해 밴드 강도가 정량화되었다. Smad1/5 및 Smad2의 포스포릴화는 대응하는 Smad1 및 Smad2 전체형에 대해 정상화되었다.
통계학적 분석
모든 실험은 삼중으로 실행되었으며, 3가지 독립 배양으로 반복되었다. 각 시점에서 실험집단 (CTL, BLN 및 HLN) 간에 처리 및 배양 기간의 영향 뿐만 아니라 차이의 유의성은 반복된 측정 ANOVA 및 Tukey's Multiple Comparison Test에 의해 평가되었다. 0.05 미만의 P 값은 통계학적으로 유의적으로 간주되었다.
결과
알긴산염 비드 생존력
1 ㎍/ml HLN 또는 BLN의 보충이 AF 및 NP 세포의 생존력에 유해하지 않는다는 것을 증명하기 위하여, 18일 동안 배양물에서 세포-접종된 알긴산염 골격이 유지되었다. HLN 또는 BLN이 보충된 골격의 경우, 세포의 생존력은 > 98%에서 유지되었다 (도 20).
프로테오글리칸 합성에 있어서 소와 인간 Link N의 효과
Link N와 함께 또는 Link N 없이 항온처리된 NP 및 AF 세포 모두의 경우, 배양 배지 안으로 방출되는 GAG 방출 속도는 시간에 따라 증가된다 (도 21 및 22). NP 세포는 AF 세포의 것과 유사한 전체 GAG 방출을 나타내는 경향이 있다.
1 ㎍/ml HLN이 보충된 NP 세포에 의한 GAG 방출은 모든 시점에서 대조군보다 상당히 더 높았다 (3일차 동안 p < 0.05 그리고 6, 9, 12, 15, 18일차 동안 p < 0.0001). BLN이 보충된 NP 세포에 의한 GAG 방출과 비교하였을 때, 12일차에 시작된 차이만 유의적 (p < 0.05)이었다. 대조적으로, 증가되는 경향이 관찰되기는 하지만, 대조군과 비교하였을 때, BLN이 보총된 NP 세포에 의한 GAG 방출에서 통계학적으로 유의성은 관찰되지 않았다(도 21).
1 ㎍/ml HLN이 보충된 AF 세포의 경우, 대조군과 비교하여, 6일차에 GAG 방출이 유의적으로 더 높았으며 (6일차의 경우 p < 0.005, 그리고 9, 12, 15, 18일차의 경우 p < 0.0001), 1 ㎍/ml BLN이 보충된 경우, 대조군과 비교하여 GAG 방출은 9일차부터 유의적으로 더 높았다 (p < 0.001) (도 22). 최종적으로, 비록 GAG 방출이 모든 시점에서 BLN보다 HLN이 보충된 AF 세포에서 더 높은 경향이 있지만, 단지 18일차 시점에서 이러한 차이가 유의적이었다.
우리의 기존 실험 결과와 유사하게 [95], GAG 합성 대부분이 배양 배지에서 방출된 것으로 발견되었고, 알긴산염 비드에서 최소 잔유된다. 따라서, GAG 방출은 프로테오글리칸 합성의 척도이며, BLN은 GAG 방출을 자극할 수 있는 것으로 보인다.
매트릭스 대사에서 소 또는 인간 Link N의 효과
프로테오글리칸 및 단백질분해효소 발현 상에 BLN 또는 HLN의 효과를 조사하기 위하여, 소의 세포-접종된 알긴산염 골격은 1㎍/mL Link N에 노출되었고, AGG, ADAMTS-4 및 ADAMTS-5에 대한 상대적 유전자 발현이 평가되었다. 결과는 Link N에 노출되지 않은 세포 (CTL)와 비교하여 나타낸다. 대조군과 비교하였을 때, NP 세포에서 Link N 처리는 모두 AGG 유전자 발현증가로 이어졌지만, 그러나 HLN 항온처리의 경우, 이러한 증가는 더 컸고, 통계학적으로 유의적이었다 (p = 0.0107) (도 23). AF 세포에서, AGG 발현은 대조군과 비교하였을 때, HLN 항온처리에 반응하여 상향조정되었지만 (p = 0.0257), 대조군과 비교하여 BLN 사이에 유의적인 효과는 관찰되지 않았다 (p > 0.1).
비록 7일차에 NP 세포의 ADAMTS-4 발현에서 중요한 변화가 관찰되지는 않았지만, 14일차에 발현은 비-유의적인 감소 경향을 나타내었다 (도 24B). 대조적으로, 비록 대조군과 비교하여 차이는 유의적이지는 않지만, AF 세포의 경우, BLN 및 HLN 항온처리와 함께 mRNA ADAMTS-4 발현 증가가 관찰되었다 (도 24A).
7일차에 HLN 항온처리에 반응하여, AF 및 NP 세포 모두에서 ADAMTS-5 발현이 상향조절되었다. 그러나, AF 세포의 경우에만 이러한 증가가 유의적이었다 (p = 0.0149). 대조군과 비교하였을 때, BLN 항온처리에 반응하여, ADAMTS-5 발현은 AF 세포에서 하향-조절되었으며 (p = 0.0329) 그리고 NP 세포에서 상향조절되었다(p = 0.0058) (도 24C 및 24D).
소의 디스크 세포에서 인간 및 소의 Link N 기능의 조절물질로써 표준 Smad-매개된 신호생성
BLN 및 HLN은 소의 NP 및 AF 세포에서 동화 반응에 의한 분자 기전을 설명하기 위하여, BLN 및 HLN이 Smad 표준 신호생성 경로의 주요 유도물질로써, Smad1/5 단백질을 활성화시키는지를 조사하였다.
웨스턴 블랏 결과에서 HLN은 5분 안에 소의 AF 세포에서 Smad1/5를 활성화시키며, 한편 BLN에 의한 활성화는 10 분안에 발생되었고, 30분 시점에 최대 활성을 얻었다는 것이 나타났다 (도 25). 두 가지 Link N 보충물 모두의 경우, AF 세포에서 Smad1/5 수준은 6시간 후 대조군 수준 이하로 감소되었다. NP 세포에서, BLN 및 HLN 보충물은 30분 후에 Smad1/5를 상당히 자극하였으며, 시간과 함께 지속적으로 증가되었다. 그러나, 두 IVD 세포의 경우, HLN은 BLN 보다 Smad1/5 활성화에 더 효과적인 것으로 보였다.
AF 세포에서, HLN 또는 BLN에서의 항온처리는 최대 3시간 까지 약간 증가된 Smad2 활성화를 유도하는 것으로 보였다. 대조적으로, Link N에서 항온처리된 NP 세포에서 Smad2 활성화는 탐지되지 않았다 (도 26).
토의
기존 연구에서, Link N은 성장 인자로 작용할 수 있으며, 시험관에서 소의 IVD 세포에서 프로테오글리칸 및 콜라겐의 합성을 촉진시킬 수 있으며[88, 35] 그리고 디스크 퇴행의 토끼 모델 생체내 에서 디스크 높이를 증가시킬 수 있다는 것을 보여주었다[31]. Link N은 3-D 골격 뿐만 아니라 무손상 인간 디스크에서 인간 디스크 세포에 의한 프로테오글리칸 합성을 또한 촉진시킬 수 있다 [93]. 본 데이터에서 HLN은 NP 세포에서 모든 시점에서, 그리고 AF 세포에서는 6일차부터 프로테오글리칸 합성을 유의적으로 자극하였다는 것이 증명되었다. BLN이 보충된 NP 세포는 유의적이지는 않지만, 프로테오글리칸 합성에서 증가된 경향을 보였다. 흥미로운 것은, BLN이 보충된 AF 세포의 GAG 방출은 9일차부터 계속 대조군과 비교하여 상당히 더 높았고, BLN은 NP 세포보다는 AF 세포에서 프로테오글리칸 합성 자극에 있어서 더 효과적이라는 것을 암시한다. 추가적으로, HLN은 소의 NP 세포에서 14일 후 ADAMTS-4 발현을 하향-조절할 수 있지만, AF 세포에서 ADAMTS-4 발현에 유의적으로 영향을 주지 않는다. AF 세포에서 증가되는 경향이 관찰되지는 않지만, NP 세포에서 14일 후 BLN은 ADAMTS-4 발현에 유의학적인 효과는 없었다. BLN은 AF 세포에서 ADAMTS-5를 하향조절할 수 있었고, 한편, NP 세포에서 14일 후 ADAMTS-5를 상향조절하였다. 최종적으로, BLN 및 HLN은 Smad1/5 신호생성 경로를 통하여, NP와 AF 세포에 의한 프로테오글리칸 합성을 촉진시킨다.
이미, 우리는 세포 증식이 알긴산염에서 광범위한 것으로 예상되지는 않지만 [91-92], GAG 생산에서 변화에 기여한다는 것을 발견하였다. 본 연구에서, 아그레칸의 메세지 수준과 축적된 프로테오글리칸 방출을 분석하였고, 그리고 Link N로 항온처리된 AF 및 NP 세포 모두에 있어서 아그레칸의 mRNA 발현이 증가된 것과 같이, GAG 방출은 대조군과 비교하여 증가되었다는 것을 알았다. 우리가 발견한 NP 및 AF 세포에 의한 GAG 합성에서 유사성과 단백질가수분해성 단리 동안 AF 세포의 증가된 존재 및 생존은 AF 세포가 NP 세포를 대신하여 기능적 치환물로 작용할 수 있고, 조직 공학에 유익할 수 있다.
BLN은 NP에서 ADAMTS-5를 자극하였고, AF 에서는 하향조절한다는 사실은 복원이 디스크 ECM의 재구성과 관련되고, 그리고 이러한 재구성은 단백질분해와 관련된다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 여기에서, 상기 매트릭스 합성이 전환을 초과하는 한, 복원 동안 단백질 분해의 완전한 부재를 필요로 하지는 않는다. HLN과 BLN은 디스크 기능을 복원하는 것을 돕기 위하여 프로테오글리칸 생산을 촉진시킬 수 있다. HLN은 소의 AF 세포에서 5분 이내 즉시 Smad1/5를 활성화시키고, BLN에 의한 활성화는 30분 이내에 점진적으로 발생되었다는 사실은 HLN 활성화는 직접적이지만, BLN의 활성화는 간접적일 수 있음을 암지한다. 간접 활성화는 NP 세포의 경우 일 수도 있으며, BLN 및 HLN의 보충은 30분 후 Smad1/5를 유의적으로 자극하였으며, 테스트 기간(6시간) 동안 증가는 지속되었다. 따라서, AF 및 NP에서 BLN 뿐만 아니라 NP에서 HLN은 다른 분자들을 활성화시킬 수 있으며, 이는 다시 프로테오글리칸 합성을 자극할 수 있다.
AF 세포에서 10 분 이내에 Smad1/5의 활성화는 프로테오글리칸 합성 촉진에서 NP 세포보다 AF 세포가 BLN 보충에 더 잘 반응한다는 우리 발견을 설명할 수 있다. 이미 연구에서 소의 디스크의 AF 세포는 TGF-β로 자극을 받을 경우 NP 세포보다 더 많은 프로테오글리칸을 생산한다는 것을 보여주었다 [96]. 그러나, 이것은 항상 그 경우가 아닌데, 그 이유는 NP 및 AF 세포는 유사한 방식으로 반응할 수 있기 때문이다 [97]. Smad1/5를 직접적으로 자극하는 Link N의 능력은 연령의 차이로 인하여 변화될 수 있다. 어린 디스크에서, NP는 프로테오글리칸의 주요 원천이다. 그러나, Smad1/5 신호생성의 직접적인 활성화를 통하여 AF에서 증가된 프로테오글리칸 함량은 나이 및 퇴행에서 관찰된다 [96, 98].
비록, 두 펩티드는 디스크 복원을 자극시키도록 기획된 임의의 물질에 요구되는 특징을 가지지만, HLN 보충은 AF가 여전히 무손상 상태인, 디스크 퇴행의 초기 단계에서 디스크 퇴행을 치료하기 위한 최적의 선택일 수 있다. 이 공리(axiom)는 프로테오글리칸 축적과 잠재적으로 연합된 부기의 증가로 인한 NP의 돌출을 방지하기 위한 최적의 복원용으로 무손상 AF를 상정한다.
BLN은 Smad1/5 신호생성의 간접 활성화에 의해 시험관내 NP 및 AF 세포 모두에서 프로테오글리칸 생산을 자극시킬 수 있다. 따라서 원리에 따르면, 디스크 퇴행의 치료에 BLN 보충은 하나의 선택이 또한 될 수 있다. 프로테오글리칸 합성에서 1ug/ml 농도의 HLN은 효과적이며, 그리고 나이 및 퇴행과 함께, 연령프로테오글리칸 합성의 주요 원천이 되는 AF에서 Smad1/5 신호생성을 직접적으로 활성화시킬 수 있다.
약어 목록
18S rRNA: 18S 리보좀 RNA ; ADAMTS: 트롬보스폰딘-유사 반복부를 가진 디스인테그린과 메탈로프로테아제; AGG: 아그레칸; AF: 섬유륜; BLN: 소의 Link N; BMPs: 뼈 형성 단백질; DMMB: 1,9-디메틸메틸렌 블루; ECM: 세포외 매트릭스; GAG: 황산염화된 글리코사미노글리칸; HA: 히알루론산염; HLN: 인간 Link N; IVD: 추간판; LP: 링크 단백질; NP: 속질핵; PCR: 중합효소 쇄 반응; RT: 역 전사; TGF β: 형질변환 성장 인자-β.
유전자 발현 평가에 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머
유전자 서열 크기
AGG 포워드 (6499-6518): AATGCCCAGGACTACCAGTG
역 (6636-6665): CCCTTCTCATGCCAGATCAT 		167 bp
ADAMTS-4 포워드 (1528-1547): CAATGCACTGGTCTGAATGG
역 (1659-1678): CTAGGAGACAGTGCCCGAAG		 151 bp
ADAMTS-5 포워드 (1165-1184): GGGACCATATGCTCTCCTGA
역 (1331-1350): AATGCTGGTGAGGATGGAAG 		186 bp
18S rRNA 포워드 (1351-1370): GGAGCGATTTGTCTGGGTTA
역 (1532-1551): CGCTGAGCCAGTCAGTGTAG 		201 bp
실시예 8
도 27은 IVD에서 NGF 발현은 NP 및 AF 세포 모두에서 퇴행과 함께 증가된다는 것을 보여주는 일련의 세포 착색 및 면역 블랏이다. 도 28은 Link N이 AF 세포에서 뉴로트로핀 (NGF, BDNF) 및 물질 P (TAC1)의 TNF 알파 유도된 발현을 억제시킨다는 것을 설명한다 도 29에서 Link N이 AF 세포에서 뉴로트로핀 (NGF, BDNF) 및 물질 P (TAC1)의 IL-1베타 유도된 발현을 억제시킨다는 것이 설명된다 도 30 및 31은 뉴로트로핀 및 SP 수용체들의 수준 감소에 의해 Link N의 효과가 매개된다는 것을 설명한다.
도 32는 Link N이 등급 4 인간 AF 세포에서 IL-1베타 유도된 NGF 방출을 억제 저해시킬 수 있음을 보여준다. 도 33에서 Link N (10㎍/ml) 보충은 천자후 24시간 시점에서 손상된 소의 디스크로부터 물질 P 방출을 감소시킨다는 것이 설명된다.
인간 IVD에서 NGF 발현은 퇴행과 함께 증가됨이 설명된다. Link N은 기계적으로 손상된 IVDs로부터 물질 P 방출을 감소시킨다. Link N은 AF 세포에서 TNF알파 및 IL-1베타 유도된 뉴로트로핀 유전자 발현 및 뉴로트로핀 수용체들을 유의적으로 억제한다.
실시예 9
더 작은 단편들의 활성에 대하여 테스트되었다. 서열 번호: 1의 아미노산 1-4, 4-8 및 3-6 단편들이 테스트된다. 더 작은 그리고 아미노산 1-7, 1-6, 1--5 등으로 구성된 더 작은 단편들은 활성이 상실될 때까지 테스트된다. 유사하게, NH2 단부로부터 아미노산이 상실된 더 작은 단편들, 가령, 아미노산 2-8, 3-8, 4-8, 5- 8 등으로 구성된 단편들이 테스트된다. 다른 구체예들에서 설명된 바와 같이, PCR 분석 및/또는 35S는 판독으로 이용될 수 있다.
실시예 10
Link N 단편들은 하기 표에서 있는 하나의 종에서 발견된 하나 또는 그 이상의 아미노산 변화를 포함할 수 있다.
상이한 종들의 Link N 서열에 대한 서열 표
Figure pct00002
본 출원은 현재 바람직한 실시예로 간주되는 것들을 언급하여 설명되지만, 본 출원은 공개된 실시예에 한정되지 않음을 인지할 것이다. 반대로, 첨부된 청구범위의 사상 및 범주 안에 속하는 다양한 변형 및 등가의 배열을 포함하는 것으로 의도된다.
모든 공개, 특허 및 특허 출원은 각 개별 공개, 특허, 또는 특허 출원이 특이적으로 그리고 개별적으로 참고자료에 편입된 것과 같이 동일한 수준으로 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 구체적으로, 예를 들면 표 및 명세서에서 제공된 접수 번호 및/또는 생물지표 서열 (가령, 단백질 및/또는 핵산)이 포함된, 본 명세서에서 제공된 각 접수번화와 연관된 서열은 전체가 참고자료에 편입된다.
명세서에서 참고 자료용으로 언급된 참고 자료에 대한 인용
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Xaa is any amino acid, optionally Leu, His, Arg, Gln <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Xaa is Asp, Ser or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> Xaa is Leu, Val or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> Xaa is any amino acid, optionally Asp, Gly, Asn or Pro <400> 7 Asp His Xaa Ser Xaa Asn Tyr Thr Xaa Xaa His Asp Arg Val Ile His 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Xaa is Leu or His <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> Xaa is Leu or Val <220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> Xaa is Ala or Val <400> 8 Asp His Xaa Ser Asp Asn Tyr Thr Xaa Asp His Asp Arg Xaa Ile 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp His Leu Ser Asp Asn Tyr Thr Leu Asp His Asp Arg Ala Ile 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 10 Asp His His Ser Asp Asn Tyr Thr Val Asp His Asp Arg Val Ile 1 5 10 15 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 11 Asp His Arg Ser Asp Asn Tyr Thr Leu Asp His Asp Arg Val Ile His 1 5 10 15 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 12 Asp His Gln Ser Asn Asn Tyr Thr Leu Gly His Asp Arg Val Ile His 1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Canis lupus <400> 13 Asp His His Ser Asp Asn Tyr Thr Leu Asn Tyr Asp Arg Val Ile His 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Asp His His Leu Ser Asp Ser Tyr Thr Pro Pro Asp Gln Asp Arg Val 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Asp His Leu Ser Asp Asn Tyr Thr Leu Asp His Asp Arg Ala Ile His 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 His Ile Ala Arg Asp His Asp Leu Thr Tyr Asn Asp Ser Leu His Asp 1 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Asp Leu Asn Arg Ala His Leu His Ile Asp Tyr His Thr Asp Ser Asp 1 5 10 15 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Leu Asp His Asp Arg Ala Ile His 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asp His Leu Ser Asp Asn Tyr 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Asp His Leu Ser Asp Asn 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Asp His Leu Ser Asp 1 5 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 aatgcccagg actaccagtg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 cccttctcat gccagatcat 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 caatgcactg gtctgaatgg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 ctaggagaca gtgcccgaag 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 gggaccatat gctctcctga 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 aatgctggtg aggatggaag 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 ggagcgattt gtctgggtta 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 cgctgagcca gtcagtgtag 20 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Xaa is any amino acid, optionally Leu, His, Arg, Gln <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> Xaa is Ser or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Xaa is Asp, Ser or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Xaa is Asn or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> Xaa is Tyr or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> Xaa is Thr or Tyr <400> 30 Asp His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Xaa is any amino acid, optionally Leu, His, Arg, Gln <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Xaa is Asp, Ser or Asn <400> 31 Asp His Xaa Ser Xaa Asn Tyr Thr 1 5 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Asp His Leu Ser Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Asp Arg Ala Ile His 1 5 10 15

Claims (37)

  1. 다음에서 선택된 펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드:
    i) DHX1X2X3X4X5X6 (서열 번호: 1);
    X1은 임의의 아미노산, 임의적으로 L, H, R Q이며;
    X2는 S 또는 L이며;
    X3은 D, S 또는 N이며;
    X4는 N 또는 D이며;
    X5는 Y 또는 S이며; 그리고/또는
    X6은 T 또는 Y이며;
    ii) i)의 보존적 변이체;
    iii) i) 또는 ii)의 단편;
    여기에서 상기 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 유지하고, 그리고 상기 펩티드는 15개 이하의 아미노산이다.
  2. 청구항 1 내지 3중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 DHX1SDNYT (서열 번호: 3)로 구성되며; 여기에서 X1은 L 또는 H 또는 생물학적 활성을 유지하는 이의 보존적 변이체인, 단리된 폴리펩티드.
  3. 청구항 1에 있어서, DHLSDNYT (서열 번호: 4) 또는 생물학적 활성을 유지하는 이의 보존적 변이체로 구성된 펩티드 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩티드.
  4. 청구항 4에 있어서, DHHSDNYT (서열 번호: 5) 또는 생물학적 활성을 유지하는 이의 보존적 변이체로 구성된 펩티드 서열을 포함하는, 단리된 폴리펩티드.
  5. 청구항 1 내지 4중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산인, 단리된 폴리펩티드.
  6. 청구항 1에 있어서, 다음에서 선택된 펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드:
    i) DHX1X2X3X4X5X6X7X8X9DX10X11X12, X13 (서열 번호: 6) 또는 DHX1SDNYTX2DHDR X3I, (서열 번호: 7);
    X1은 임의의 아미노산, 임의적으로 L, H, R Q이며;
    X2는 S 또는 L이며;
    X3은 D, S 또는 N이며;
    X4는 N 또는 D이며;
    X5는 Y 또는 S이며;
    X6은 T 또는 Y이며;
    X7은 L V 또는 T이며;
    X8은 임의의 아미노산, 임의적으로 D G, N 또는 P이며;
    X9는 H Y 또는 P이며;
    X10은 R 또는 Q이며;
    X11은 A V 또는 D이며;
    X12는 I 또는 R이며; 그리고/또는
    X13은 H 또는 V이며; 임의적으로 X1은 L 또는 H이며, X2는 L 또는 V이며, 그리고 X3은 A 또는 V이며;
    ii) i)의 보존적 변이체; 및
    iii) i) 또는 ii)의 단편;
    여기에서 상기 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 유지한다.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 서열은 DHLSDNYTLDHDRAI (서열 번호: 9) 또는 생물학적 활성을 유지하거나 또는 서열 번호: 9에 최소한 80% 서열 동일성을 갖는 이의 보존적 변이체 및/또는 단편이며, 그리고 임의적으로 상기 단리된 폴리펩티드는 글리코실화되지 않거나 또는 인간 생체내 발현된 폴리펩티드와 비교하여, 차등적으로 글리코실화된, 단리된 폴리펩티드.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 서열은 DHHSDNYTVDHDRVI (서열 번호: 10)이거나; 생물학적 활성을 유지하거나 또는 서열 번호: 10에 최소한 80% 서열 동일성을 갖는 이의 보존적 변이체 및/또는 단편이며, 임의적으로 상기 단리된 폴리펩티드는 글리코실화되지 않거나 또는 소 생체내 발현된 폴리펩티드와 비교하여, 차등적으로 글리코실화된, 단리된 폴리펩티드.
  9. 청구항 1 내지 8중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 안정화 모이어티, 및/또는 운반체에서 선택된 활성 모이어티에 접합된, 단리된 폴리펩티드.
  10. 청구항 1 내지 9중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코딩하거나, 또는 엄격한 조건하에서 상기 단리된 핵산에 혼성화되는 단리된 핵산.
  11. 청구항 10의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  12. 청구항 1 내지 9중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 발현시키고/시키거나 청구항 10의 단리된 핵산 또는 청구항 11의 벡터를 포함하는 재조합 세포.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 세포는 연골세포(chondrocyte) 계통 세포, 줄기 세포 또는 디스크 세포이며, 임의적으로 상기 줄기 세포는 간엽 줄기 세포인, 재조합 세포.
  14. 청구항 1 내지 9중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 청구항 12 또는 13의 재조합 세포 또는 상기 폴리펩티드 및/또는 재조합 세포를 포함하는 조성물로 처리된, 단리된 유도된 연골 또는 디스크 세포.
  15. 청구항 1 내지 9중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리펩티드와 임의적으로 운반체 또는 희석제, 청구항 12 또는 13의 재조합 세포, 및/또는 청구항 14의 유도된 세포를 포함하는 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 수용가능한 운반체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물인, 조성물.
  17. 청구항 15 또는 16에 있어서, 청구항 1 내지 16중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리펩티드, 재조합 세포, 유도된 세포 및/또는 조성물이 포함된, 생체적합성 물질로 형성된 골격을 포함하며, 임의적으로 상기 골격은 알긴산염 골격 또는 히드로겔 골격이며, 그리고 상기 재조합 또는 유도된 세포는 상기 골격 상에 또는 안에 배치된, 조성물.
  18. 연골 및/또는 디스크 세포에서 또는 연골 및/또는 디스크 세포가 포함된 조직에서 매트릭스 합성 임의적으로 프로테오글리칸 합성 및/또는 콜라겐 II 합성을 유도하는 방법에서, 상기 방법은 프로테오글리칸 합성이 유도되는 조건하에서 청구항 1-9중 어느 하나에 따른 단리된 폴리펩티드, 청구항 12 또는 13의 재조합 세포, 및/또는 청구항 15 내지 17중 어느 하나에 따른 조성물의 효과량과 함께 상기 연골 및/또는 디스크 세포를 항온처리/배양하는 것, 증가된 매트릭스 합성을 가진 유도된 연골 및/또는 디스크 세포를 생산하는 것을 포함하는, 방법.
  19. 개체로 이식하기 위한 연골 및/또는 디스크 조직을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 프로테오글리칸 합성이 유도되는 조건하에서 청구항 1-9중 어느 하나에 따른 단리된 폴리펩티드, 청구항 12 또는 13의 재조합 세포, 및/또는 청구항 15 내지 17중 어느 하나에 따른 조성물의 효과량과 함께 상기 연골 및/또는 디스크 세포를 항온처리/배양하는 것, 증가된 매트릭스 합성을 가진 유도된 연골 및/또는 디스크 세포를 생산하는 것; 및 실질적으로 순수한 집단의 유도된 연골 및/또는 디스크 세포를 단리하는 것을 포함하는, 방법.
  20. 청구항 18 또는 19에 있어서, 상기 세포 및/또는 조직은 연골, 임의적으로 연골 이식술에 이용을 위한 연골이 생성되는 조건하에서 접촉되는, 방법.
  21. 연골 및/또는 디스크 장애의 증상을 완화 및/또는 치료하는 방법으로서, 청구항 1-9중 어느 하나에 따른 단리된 폴리펩티드, 청구항 12 또는 13의 재조합 세포, 청구항 14의 유도된 세포 및/또는 청구항 15 내지 17중 어느 하나에 따른 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 연골 및/또는 디스크 조직 병리는 추간판 퇴행인, 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 추간판 퇴행은 초기 단계인, 방법.
  24. 청구항 21에 있어서, 상기 연골 및/또는 디스크 조직 병리는 관절염, 바람직하지 않는 골형성 및/또는 석회화에서 선택된 염증성 또는 퇴행성 관절 질환인, 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 관절염은 골관절염인, 방법.
  26. 청구항 24에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염인, 방법.
  27. 청구항 18 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 인간, 말 또는 개에서 임의적으로 선택된 포유류인, 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 개체는 인간인, 방법.
  29. 청구항 18 내지 28중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩티드, 재조합 세포, 유도된 세포 및/또는 약학 조성물은 상기 개체에게 골격 내에 투여되는, 방법.
  30. 청구항 18 내지 29중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩티드, 재조합 세포, 유도된 세포 또는 약학 조성물은 복합 치료법으로 투여되는, 방법.
  31. 청구항 18 내지 30중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 세포는 청구항 1 내지 9중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리펩티드를 발현시키는 간엽 줄기 세포 (MSCs), 연골 세포 또는 디스크 세포인, 방법.
  32. 청구항 18 내지 30중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 세포 또는 유도된 세포는 연골세포(chonrocytes), 임의적으로 자가 연골세포인, 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 모자이크성형술이 이용되는, 방법.
  34. 청구항 21 내지 32중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 임플란트를 제공받은 것인, 방법.
  35. 청구항 18 내지 34중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 청구항 1 내지 9중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리펩티드, 청구항 12 또는 13의 재조합 세포, 청구항 14의 유도된 세포 및/또는 청구항 15 내지 17중 어느 한 항에 따른 조성물과 복합되어 MSC를 상기 연골 및/또는 디스크 세포 또는 조직에 접촉시키거나, 또는 상기 개체에게 투여하는 것을 더 포함하는, 방법.
  36. 청구항 21 내지 35중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 감소된 세포 밀도 및/또는 대사 활성을 가지며, 임의적으로 상기 감소된 세포 밀도 및/또는 대사 활성은 나이로 인한 것인, 방법.
  37. 청구항 17 내지 35중 어느 한 항에 있어서, 청구항 1 내지 9중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리펩티드, 청구항 12 또는 13의 재조합 세포, 청구항 14의 유도된 세포 및/또는 청구항 15 내지 17중 어느 한 항에 따른 조성물은 염증성 환경에서 투여되거나 또는 이식되는, 방법.
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