KR102369010B1

KR102369010B1 - 연골 및 디스크 조직 병리들의 치료를 위한 방법들 및 조성물들

Info

Publication number: KR102369010B1
Application number: KR1020167007692A
Authority: KR
Inventors: 팩슨 므왈레; 존 안토니오우; 리스벳 해글런드; 피터 제이. 러플리; 라훌 가우리; 로라 엠. 에퓨어; 미카엘 피. 그랜트
Original assignee: 더 로얄 인스티튜션 포 디 어드밴스먼트 오브 러닝/맥길 유니버시티
Priority date: 2013-08-27
Filing date: 2014-08-27
Publication date: 2022-03-02
Also published as: CN105940011A; US20210079040A1; CA2957965A1; ES2883567T3; US20160207959A1; JP2016534117A; WO2015027322A1; EP3039032A1; AU2014311219A1; AU2019201512A1; MX2016002556A; US10202420B2; AU2014311219B2; KR20160058109A; JP6700182B2; IL244282A0; CA2957965C; IL244282B; ZA201601963B; US20190375788A1

Abstract

i) DHX₁SDNYT, 여기에서 X₁은 L 또는 H (서열번호 1);
ii) i)의 보존적 변이체;
iii) i) 또는 ii)의 단편:으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고,
상기 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 보유하며, 상기 펩타이드는 15개 이하의 아미노산들인, 분리된 폴리펩타이드뿐만 아니라 재조합 세포들, 및 그들의 용도들에 관한 것이다.

Description

연골 및 디스크 조직 병리들의 치료를 위한 방법들 및 조성물들 {Methods and Compositions for Treatment of Cartilage and Disc Tissue Pathologies}

본 발명은 연골 및 디스크 장애들의 치료를 위한 방법들 및 조성물들, 상세하게는 관절염 및 추간판 퇴화와 같은 연골 및 디스크 장애들의 치료를 위해 링크 N 단편들을 사용하는 방법들 및 조성물들에 관한 것이다.

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추간판들 (IVD)은 척수 내에서 인접한 척추들을 연결한다. 그들은 말초 섬유태 (AF) 및 중앙의 수핵 (NP)으로 구성된다. AF는 콜라겐 원섬유들이 풍부한 동심원상 층들을 가진 섬유 조직이다 (1). NP는 무작위한 방향성을 가지는 콜라겐 원섬유들 및 젤라틴성 외양을 부여하는 높은 함량의 아그레칸 (aggrecan)과 함께 더욱 무정형의 경도를 가지고, 압박성 부하들을 저항하는 능력을 제공한다. 아그레칸은 수많은 글리코사미노글리칸 (GAG)이 그의 코아 단백질과 부착된 커다란 프로테오글리칸이고, 이는 NP에서 압박의 효과들을 되받는 데 필요한 삼투적 성질들을 제공한다.

디스크에서 퇴행성 변화들에 기여하는 기작들은 고갈된 합성 및 증가된 퇴화 둘 다로 인한 세포외 기질의 조성 및 구조에서 생화학적 변경들을, 특히 아그레칸이 특히 단백질분해성 손상 및 손실에 대해 취약하여, 유도한다. 노화, 영양 부족, 생체역학적 (2-5), 생화학적 (6-10) 및 유전적 영향들 (11-14)은 증가된 IVD 퇴화와 연관되어 있다. 퇴화과정 동안, NP에서는 GAG 함량의 손실이 발생하고, 이는 더욱 콜라겐화되면서 젤라틴성 구조로부터 섬유성 직조로까지 변화되며, 틈새들이 NP 및 AF 둘 다에서 출현한다 (15, 16). 이것은 가능하게 프로테오글리칸 고갈에 의해 용이해지는 신경 내증식 및 디스크 높이의 손실로 인한, 허리 통증과 공통적으로 연관되어 있다 (17). 현재까지, IVD 퇴화에 대한 의학적 치료는 전혀 없고, 궁극적으로 단지 제시된 선택으로서 손상된 조직의 외과적 절개, IVD 공간을 회복시키도록 케이지 또는 인공뼈의 삽입, 및 척추 뼈 융합이 남아있다. 이것은 통증 완화에 비교적 좋은 단기 임상적 결과들을 제공할 수 있는 한편 (18), 많은 경우들에서 후속하는 인접-수준의 디스크 퇴화를 유도하도록 척수 생체역학들도 역시 변경시킨다.

퇴화하는 IVD의 생물학적 복구가 외과적 절개보다 바람직할 것이다.

디스크 퇴화는 생애 중 초기에 시작하고 연령이 증가하면서 진행한다 (48, 49). 이러한 과정은 잔류 세포들의 표현형적 변화를 특징으로 하고, 염증성 사이토카인들의 증가된 생산의 결과를 가져온다 (50, 51). 많은 사이토카인들이 디스크 퇴화와 연관되어 왔다: IL-1β 및 TNF-α이 보고된 첫 번째이지만, 보다 최근에 IL-6 및 IL-8과 같은 추가적인 후보들이 특히 동물 모델들에서 기술되었다 (17). 퇴화/탈출된 표본들로부터 얻은 인간 디스크들에 관한 연구들은, IL-1β 및 TNF-α과 추가하여 건강한 대조군과 비교 시 IL-2, IL-4, IL-10, IL-12 및 IL-17의 증가된 수준들을 보여주었다 (52). 증가된 사이토카인 생산을 유도하는 정확한 기작은 분명하지 않다. 유전, 기계적 부하, 산화, 또는 염증성 세포들의 존재와 같은 다수의 내부 및 외부 신호들이 사이토카인 생산에 영향을 줄 수 있다 (17). 또한, 특이적 기질 단편화 산물들의 축적도 톨-유사 수용체들을 활성화시키고 이로써 사이토카인 생산을 유도할 수 있다.

염증성 사이토카인들은 프로테아제 생산을 유도하는 것으로 알려져 있고, 이는 후속하여 아그레칸 및 콜라겐을 포함하는 세포외 기질 (ECM)의 퇴화로 인해 구조적 부전 및 IVD 높이의 손실을 유도한다 (53). 프로테아제들이 ECM의 중요한 구성성분들의 단편화 및 파괴를 부여하더라도, 그들은 역시 디스크의 정상적인 리모델링에서도 중요한 역할들을 가진다. 카텝신 K 활성은 아그레칸의 기질 금속프로테아제 (MMP) 단백질분해와 함께, 주로 디스크에서 정상적인 조직 리모델링의 공정인 것으로 제시되었다 (54, 55). 그러나, 기질 금속프로테아제들 (MMP1, 2, 3, 7, 9, 13), 아그레카나제들 (ADAMTS4, 5), 및 카텝신들 (카텝신들 D 및 L)은 디스크 퇴화과정 동안 모두 증가된다 (56, 9). 또한, 세린 프로테아제 HTRA1은 HTRA1의 증가된 수준들 및 CHAD의 분해가 디스크 퇴화의 정도와 상관되었기 때문에 디스크 퇴화에서 중심적인 역할을 담당하는 것으로 생각된다 (10, 57).

단백질의 분해 및 수핵 (NP)의 프로테오글리칸 함량은 디스크 높이 및 디스크의 무게-보유 능력의 손실을 가져올 수 있다. 디스크 퇴화의 마지막 단계에서 섬유태 고리에서 틈새들이 발생하여, NP 물질의 압출 및 신경들의 압박으로 인한 통증을 유발한다. 통증이 있는 퇴화 디스크의 복구 전략은 ECM 구성성분들의 생산 및 염증 환경에서 프로테아제 활성의 저하조절 (down regulation)을 요구한다. 이들 성질들은 TGF-β 및 BMP 7과 같은 여러 성장인자들과 연관된다 (58-61). 그러나, 임상적 진료에서 성장인자들의 사용은 그들의 높은 비용 및 잠재적인 부작용들에 의해 제한되고 있다.

골관절염 (OA)은 수백만 사람들을 침범한 만성 퇴행성 관절 장애이다. 이것은 연골세포들의 동화 및 이화 활성들의 불균형으로 인한 관절 연골의 파괴를 특징으로 한다. 관절 연골은 무혈관 연결 조직이고, 부하를 흡수하고 분산시켜서 관절의 마찰 없는 운동을 허용하는 가동 관절들의 뼈 부분들을 둘러싼다. 이들 성질들은 그의 세포외 기질 (ECM)의 조성 및 구조와 관련된다. 이것은 콜라겐 원섬유들, 프로테오글리칸들 (우세하게는 아그레칸), 비콜라겐성 단백질들 및 높은 함량의 물로 구성된다. 관절 연골에서 유일한 세포 유형은 연골세포이고, 세포외 기질의 합성 및 유지를 책임진다.

관절 연골의 분해 및 윤활막의 염증을 특징으로 하는 골관절염 (OA) 진행 동안, 이러한 평형은 기질로부터 콜라겐들 및 프로테오글리칸들의 증가된 분해 및 고갈된 분자들의 합성으로 인해 파괴된다. 연골은 연골세포들 (chondrocyte)에서 유전자 발현 및 단백질 합성을 조절하는 복합 다수의 자가분비 및 주변분비 (동화 및 이화) 인자들과 반응한다.

기질 분해는 OA에 관여하는 주요한 사이토카인, 인터루킨-1베타 (IL-1β)에 의해 유도되는 기질 금속프로테아제들 (MMP) 그리고 ADAMTS-4 및 -5에 의해 매개된다. OA 발병기전에 관여하였던 다른 사이토카인들은 종양괴사인자-알파 (TNF-α), IL-6, 기타 IL-2, IL-7, IL-15, 및 IL-21와 같은 공통 c-사슬 사이토카인들, 및 케모카인들을 포함한다. 윤활액 세포들 및 연골세포들에 의해 생산된 이들 인자들은 기질 금속프로테아제 (MMP)의 구성원들, 디스인테그린 및 트롬보스폰딘 모티브들 (ADAMTS) 패밀리들의 효소들을 가진 금속프로테아제의 상승조절 (upregulation)을 가져온다. MMP들은 ECM 교체 및 연골 퇴화에 관여한다. 노화, 비만, 및 관절 손상들은 증가된 OA와 연관된다. 이것은 관절 연골, 연골하 뼈, 윤활막, 인대들, 및 관절주변 근육들을 포함하는 모든 관절 조직들에서 진행성 세포 및 분자 변화들을 특징으로 한다. 현재까지 OA 환자들에서 연골 퇴화를 역전시키거나 복구시키는 치료법들은 전혀 존재하지 않는다.

염증 과정들이 OA 및 류마티스 관절염 (RA)과 같은 다양한 류마티스 질환들의 발병기전에서 기본적인 역할을 담당하기 때문에, 염증 활성들의 선택적인 저해가 치료법에서 핵심이 되고, NF-κB 전사인자들의 패밀리가 이러한 과정에서 분명한 역할을 담당하는 점은 일반적 동의가 이루어진다. 따라서 여러 연구들이 비-스테로이드성 항-염증 약물들, 코티코스테로이드들, 영양제들, 안티센스 RNA 치료법, RNA 간섭 및 항-류마티스 약물들을 사용하여 NF-κB 경로들의 약학적 조절에게로 방향을 잡았다.

링크 N은 IVD 세포들에 의해 프로테오글리칸 합성 및 다른 기질 구성성분들의 생산을 증가시키는 것으로 확인되었던 16개 아미노산 서열이다 (29, 34). 이것은 토끼 디스크 천자 퇴화 모델에서 디스크 높이를 증가시키는 점도 역시 확인되었으며, 이로써 생체내 재생의 잠재력도 또한 보여준다 (31). 이러한 자연적으로 생기는 펩타이드는 디스크 및 연골 둘 다에서 프로테오글리칸 응집물들을 안정화시키는 링크 단백질의 N-말단 부위를 나타내고, 생체내 조직 교체 동안 MMP들에 의해 생성된다. 링크 N은 뼈 형태형성 단백질 (BMP) 제 Ⅱ형 수용체와 상호작용하고 배양된 토끼 IVD 세포들에서 Smad1/5 신호전달을 활성화시킨다 (33).

링크 N의 단편들은 테스트되어 왔다. 왕 등 (Wang et al.)은 링크 N의 자극성 효과가 아미노산 잔기들 1번 내지 12번을 걸치는 펩타이드를 포함하는 더 짧은 다수의 N-유래 펩타이드들 (33)을 평가하였을 때 소실된 점을 보고하였다.

1. Mwale, F. (2013) Collagen and other proteins of the nucleus pulposus, annulus fibrosus, and cartilage endplates. I.M. Shapiro, M.V. Risbud (eds.), The Intervertebral discs 5, 79-92 2.Ishihara, H., McNally, D. S., Urban, J. P., and Hall, A. C. (1996) Effects of hydrostatic pressure on matrix synthesis in different regions of the intervertebral disk. J Appl Physiol (1985) 80, 839-846 3. Handa, T., Ishihara, H., Ohshima, H., Osada, R., Tsuji, H., and Obata, K. (1997) Effects of hydrostatic pressure on matrix synthesis and matrix metalloproteinase production in the human lumbar intervertebral disc. Spine (Phila Pa 1976) 22, 1085-1091 4. Hutton, W. C., Elmer, W. A., Boden, S. D., Hyon, S., Toribatake, Y., Tomita, K., and Hair, G. A. (1999) The effect of hydrostatic pressure on intervertebral disc metabolism. Spine (Phila Pa 1976) 24, 1507-1515 5. Hsieh, A. H., and Lotz, J. C. (2003) Prolonged spinal loading induces matrix metalloproteinase-2 activation in intervertebral discs. Spine (Phila Pa 1976) 28, 1781-1788 6. Kang, J. D., Stefanovic-Racic, M., McIntyre, L. A., Georgescu, H. I., and Evans, C. H. (1997) Toward a biochemical understanding of human intervertebral disc degeneration and herniation. Contributions of nitric oxide, interleukins, prostaglandin E2, and matrix metalloproteinases. Spine (Phila Pa 1976) 22, 1065-1073 7. Goupille, P., Jayson, M. I., Valat, J. P., and Freemont, A. J. (1998) Matrix metalloproteinases: the clue to intervertebral disc degeneration? Spine (Phila Pa 1976) 23, 1612-1626 8. Oegema, T. R., Jr., Johnson, S. L., Aguiar, D. J., and Ogilvie, J. W. (2000) Fibronectin and its fragments increase with degeneration in the human intervertebral disc. Spine 25, 2742-2747. 9. Roberts, S., Caterson, B., Menage, J., Evans, E. H., Jaffray, D. C., and Eisenstein, S. M. (2000) Matrix metalloproteinases and aggrecanase: their role in disorders of the human intervertebral disc. Spine (Phila Pa 1976) 25, 3005-3013 10. Akhatib, B., Onnerfjord, P., Gawri, R., Ouellet, J., Jarzem, P., Heinegard, D., Mort, J., Roughley, P., and Haglund, L. (2013) Chondroadherin Fragmentation Mediated by the Protease HTRA1 Distinguishes Human Intervertebral Disc Degeneration from Normal Aging. J Biol Chem 288, 19280-19287 11. Annunen, S., Paassilta, P., Lohiniva, J., Perala, M., Pihlajamaa, T., Karppinen, J., Tervonen, O., Kroger, H., Lahde, S., Vanharanta, H., Ryhanen, L., Goring, H. H., Ott, J., Prockop, D. J., and Ala-Kokko, L. (1999) An allele of COL9A2 associated with intervertebral disc disease. Science 285, 409-412. 12. Kawaguchi, Y., Osada, R., Kanamori, M., Ishihara, H., Ohmori, K., Matsui, H., and Kimura, T. (1999) Association between an aggrecan gene polymorphism and lumbar disc degeneration. Spine 24, 2456-2460. 13. Ala-Kokko, L. (2002) Genetic risk factors for lumbar disc disease. Ann Med 34, 42-47 14. Roughley, P., Martens, D., Rantakokko, J., Alini, M., Mwale, F., and Antoniou, J. (2006) The involvement of aggrecan polymorphism in degeneration of human intervertebral disc and articular cartilage. Eur Cell Mater 11, 1-7; discussion 7 15. Thompson, J. P., Pearce, R. H., Schechter, M. T., Adams, M. E., Tsang, I. K., and Bishop, P. B. (1990) Preliminary evaluation of a scheme for grading the gross morphology of the human intervertebral disc. Spine 15, 411-415. 16. Mwale, F., Roughley, P., and Antoniou, J. (2004) Distinction between the extracellular matrix of the nucleus pulposus and hyaline cartilage: a requisite for tissue engineering of intervertebral disc. Eur Cell Mater 8, 58-64 17. Wuertz, K., and Haglund, L. (2013) Inflammatory Mediators in Intervertebral Disk Degeneration and Discogenic Pain. Global Spine J 3, 175-184 18. Abbaszade, I., Liu, R. Q., Yang, F., Rosenfeld, S. A., Ross, O. H., Link, J. R., Ellis, D. M., Tortorella, M. D., Pratta, M. A., Hollis, J. M., Wynn, R., Duke, J. L., George, H. J., Hillman, M. C., Jr., Murphy, K., Wiswall, B. H., Copeland, R. A., Decicco, C. P., Bruckner, R., Nagase, H., Itoh, Y., Newton, R. C., Magolda, R. L., Trzaskos, J. M., and Burn, T. C. (1999) Cloning and characterization of ADAMTS11, an aggrecanase from the ADAMTS family. J Biol.Chem. 274, 23443-23450 19. Almaawi, A., Wang, H. T., Ciobanu, O., Rowas, S. A., Rampersad, S., Antoniou, J., and Mwale, F. (2013) Effect of acetaminophen and nonsteroidal anti-inflammatory drugs on gene expression of mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A 19, 1039-1046 20. Antoniou, J., Wang, H. T., Alaseem, A. M., Haglund, L., Roughley, P. J., and Mwale, F. (2012) The effect of Link N on differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Arthritis research & therapy 14, R267 21. Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., and Haglund, L. (2011) Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential. Eur Spine J 20, 1244-1254 22. Demers, C. N., Antoniou, J., and Mwale, F. (2004) Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine (Phila Pa 1976) 29, 2793-2799 23. Liebscher, T., Haefeli, M., Wuertz, K., Nerlich, A. G., and Boos, N. (2011) Age-related variation in cell density of human lumbar intervertebral disc. Spine (Phila Pa 1976) 36, 153-159 24. Rosenberg, L. (1971) Chemical basis for the histological use of safranin O in the study of articular cartilage. J Bone Joint Surg Am 53, 69-82 25. Barbosa, I., Garcia, S., Barbier-Chassefiere, V., Caruelle, J. P., Martelly, I., and Papy-Garcia, D. (2003) Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology 13, 647-653 26. Mort, J. S., and Roughley, P. J. (2007) Measurement of glycosaminoglycan release from cartilage explants. Methods Mol Med 135, 201-209 27. Bjornsson, S. (1993) Size-dependent separation of proteoglycans by electrophoresis in gels of pure agarose. Anal Biochem 210, 292-298 28. Sztrolovics, R., White, R. J., Roughley, P. J., and Mort, J. S. (2002) The mechanism of aggrecan release from cartilage differs with tissue origin and the agent used to stimulate catabolism. Biochem.J. 362, 465-472 Mwale, F., Masuda, K., Pichika, R., Epure, L. M., Yoshikawa, T., Hemmad, A., Roughley, P. J., and Antoniou, J. (2011) The efficacy of Link N as a mediator of repair in a rabbit model of intervertebral disc degeneration. Arthritis Res Ther 13, R120 32. Wang, Z., Weitzmann, M. N., Sangadala, S., Hutton, W. C., and Yoon, S. T. (2013) Link Protein N-terminal Peptide Binds to Bone Morphogenetic Protein (BMP) Type Ⅱ Receptor and Drives Matrix Protein Expression in Rabbit Intervertebral Disc Cells. J Biol Chem 288, 28243-28253 33. Wang, Z., Hutton, W. C., and Yoon, S. T. (2013) ISSLS Prize winner: Effect of link protein peptide on human intervertebral disc cells. Spine (Phila Pa 1976) 38, 1501-1507 34. Gawri, R., Antoniou, J., Ouellet, J., Awwad, W., Steffen, T., Roughley, P., Haglund, L., and Mwale, F. (2013) Best Paper NASS 2013: Link-N can stimulate proteoglycan synthesis in the degenerated human intervertebral discs. European cells & materials 26, 107-119 35. Petit, A., Yao, G., Rowas, S. A., Gawri, R., Epure, L., Antoniou, J., and Mwale, F. (2011) Effect of synthetic link N peptide on the expression of type I and type Ⅱ collagens in human intervertebral disc cells. Tissue Eng Part A 17, 899-904 36. Yang, H., Wu, J., Liu, J., Ebraheim, M., Castillo, S., Liu, X., Tang, T., and Ebraheim, N. A. (2010) Transplanted mesenchymal stem cells with pure fibrinous gelatin-transforming growth factor-beta1 decrease rabbit intervertebral disc degeneration. Spine J 10, 802-810 37. Hiyama, A., Mochida, J., Iwashina, T., Omi, H., Watanabe, T., Serigano, K., Tamura, F., and Sakai, D. (2008) Transplantation of mesenchymal stem cells in a canine disc degeneration model. J Orthop Res 26, 589-600 38. Sakai, D., Mochida, J., Yamamoto, Y., Nomura, T., Okuma, M., Nishimura, K., Nakai, T., Ando, K., and Hotta, T. (2003) Transplantation of mesenchymal stem cells embedded in Atelocollagen gel to the intervertebral disc: a potential therapeutic model for disc degeneration. Biomaterials 24, 3531-3541 39. Vadala, G., Sowa, G., Hubert, M., Gilbertson, L. G., Denaro, V., and Kang, J. D. (2012) Mesenchymal stem cells injection in degenerated intervertebral disc: cell leakage may induce osteophyte formation. J Tissue Eng Regen Med 6, 348-355 40. Orozco, L., Soler, R., Morera, C., Alberca, M., Sanchez, A., and Garcia-Sancho, J. (2011) Intervertebral disc repair by autologous mesenchymal bone marrow cells: a pilot study. Transplantation 92, 822-828 41. Hristova, G. I., Jarzem, P., Ouellet, J. A., Roughley, P. J., Epure, L. M., Antoniou, J., and Mwale, F. (2011) Calcification in human intervertebral disc degeneration and scoliosis. J Orthop Res 29, 1888-1895 42. Nachemson, A., Lewin, T., Maroudas, A., and Freeman, M. A. (1970) In vitro diffusion of dye through the end-plates and the annulus fibrosus of human lumbar inter-vertebral discs. Acta Orthop Scand 41, 589-607 43. Urban, J. P., and Roberts, S. (2003) Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Res Ther 5, 120-130 45. Antoniou, J., Epure, L. M., Michalek, A. J., Grant, M. P., Iatridis, J. C., and Mwale, F. (2013) Analysis of quantitative magnetic resonance imaging and biomechanical parameters on human discs with different grades of degeneration. J Magn Reson Imaging 46. Majumdar, S., Link, T. M., Steinbach, L. S., Hu, S., and Kurhanewicz, J. (2011) Diagnostic tools and imaging methods in intervertebral disk degeneration. Orthop Clin North Am 42, 501-511, viii 47. Borthakur, A., Maurer, P. M., Fenty, M., Wang, C., Berger, R., Yoder, J., Balderston, R. A., and Elliott, D. M. (2011) T1rho magnetic resonance imaging and discography pressure as novel biomarkers for disc degeneration and low back pain. Spine (Phila Pa 1976) 36, 2190-2196 48. Roughley, P. J. (2004) Biology of intervertebral disc aging and degeneration: involvement of the extracellular matrix. Spine 29, 2691-2699 49. Antoniou, J., Steffen, T., Nelson, F., Winterbottom, N., Hollander, A. P., Poole, R. A., Aebi, M., and Alini, M. (1996) The human lumbar intervertebral disc: evidence for changes in the biosynthesis and denaturation of the extracellular matrix with growth, maturation, ageing, and degeneration. J.Clin.Invest. 98, 996-1003 50. Roberts, S., Evans, E. H., Kletsas, D., Jaffray, D. C., and Eisenstein, S. M. (2006) Senescence in human intervertebral discs. Eur.Spine J. 15 Suppl 3, S312-S316 51. Le Maitre, C. L., Freemont, A. J., and Hoyland, J. A. (2005) The role of interleukin-1 in the pathogenesis of human intervertebral disc degeneration. Arthritis Res.Ther. 7, R732-R745 52. Shamji, M. F., Setton, L. A., Jarvis, W., So, S., Chen, J., Jing, L., Bullock, R., Isaacs, R. E., Brown, C., and Richardson, W. J. (2010) Proinflammatory cytokine expression profile in degenerated and herniated human intervertebral disc tissues. Arthritis Rheum 62, 1974-1982 53. Freemont, A. J. (2009) The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology.(Oxford) 48, 5-10 54. Struglics, A., and Hansson, M. (2012) MMP proteolysis of the human extracellular matrix protein aggrecan is mainly a process of normal turnover. Biochem J 446, 213-223 55. Gruber, H. E., Ingram, J. A., Hoelscher, G. L., Zinchenko, N., Norton, H. J., and Hanley, E. N., Jr. (2011) Constitutive expression of cathepsin K in the human intervertebral disc: new insight into disc extracellular matrix remodeling via cathepsin K and receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand. Arthritis research & therapy 13, R140 56. Bachmeier, B. E., Nerlich, A., Mittermaier, N., Weiler, C., Lumenta, C., Wuertz, K., and Boos, N. (2009) Matrix metalloproteinase expression levels suggest distinct enzyme roles during lumbar disc herniation and degeneration. European spine journal : official publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society, and the European Section of the Cervical Spine Research Society 18, 1573-1586 57. Tiaden, A. N., Klawitter, M., Lux, V., Mirsaidi, A., Bahrenberg, G., Glanz, S., Quero, L., Liebscher, T., Wuertz, K., Ehrmann, M., and Richards, P. J. (2012) Detrimental role for human high temperature requirement serine protease A1 (HTRA1) in the pathogenesis of intervertebral disc (IVD) degeneration. J Biol Chem 287, 21335-21345 58. Gruber, H. E., Fisher, E. C., Jr., Desai, B., Stasky, A. A., Hoelscher, G., and Hanley, E. N., Jr. (1997) Human intervertebral disc cells from the annulus: three-dimensional culture in agarose or alginate and responsiveness to TGF-beta1. Experimental cell research 235, 13-21 59. Chen, W. H., Lo, W. C., Lee, J. J., Su, C. H., Lin, C. T., Liu, H. Y., Lin, T. W., Lin, W. C., Huang, T. Y., and Deng, W. P. (2006) Tissue-engineered intervertebral disc and chondrogenesis using human nucleus pulposus regulated through TGF-beta1 in platelet-rich plasma. Journal of cellular physiology 209, 744-754 60. Hiyama, A., Gogate, S. S., Gajghate, S., Mochida, J., Shapiro, I. M., and Risbud, M. V. (2010) BMP-2 and TGF-beta stimulate expression of beta1,3-glucuronosyl transferase 1 (GlcAT-1) in nucleus pulposus cells through AP1, TonEBP, and Sp1: role of MAPKs. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research 25, 1179-1190 61. Jin, H., Shen, J., Wang, B., Wang, M., Shu, B., and Chen, D. (2011) TGF-beta signaling plays an essential role in the growth and maintenance of intervertebral disc tissue. FEBS letters 585, 1209-1215 62. Billington, C. J., Mason, P., Magny, M. C., and Mort, J. S. (2000) The slow-binding inhibition of cathepsin K by its propeptide. Biochem Biophys Res Commun 276, 924-929 63. Roughley, P., Hoemann, C., DesRosiers, E., Mwale, F., Antoniou, J., and Alini, M. (2006) The potential of chitosan-based gels containing intervertebral disc cells for nucleus pulposus supplementation. Biomaterials 27, 388-396 64. Danfelter, M., Onnerfjord, P., and Heinegard, D. (2007) Fragmentation of proteins in cartilage treated with interleukin-1: specific cleavage of type IX collagen by matrix metalloproteinase 13 releases the NC4 domain. The Journal of biological chemistry 282, 36933-36941 65. Maldonado, B. A., and Oegema, T. R., Jr. (1992) Initial characterization of the metabolism of intervertebral disc cells encapsulated in microspheres. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society 10, 677-690 66. Malemud, C. J., Killeen, W., Hering, T. M., and Purchio, A. F. (1991) Enhanced sulfated-proteoglycan core protein synthesis by incubation of rabbit chondrocytes with recombinant transforming growth factor-beta 1. J Cell Physiol 149, 152-159 67. Johnson, A. R., and Erdos, E. G. (1977) Metabolism of vasoactive peptides by human endothelial cells in culture. Angiotensin I converting enzyme (kininase Ⅱ) and angiotensinase. The Journal of clinical investigation 59, 684-695 68. Lu, H., Dalgard, C. L., Mohyeldin, A., McFate, T., Tait, A. S., and Verma, A. (2005) Reversible inactivation of HIF-1 prolyl hydroxylases allows cell metabolism to control basal HIF-1. The Journal of biological chemistry 280, 41928-41939 69. Wicks, S. J., Lui, S., Abdel-Wahab, N., Mason, R. M., and Chantry, A. (2000) Inactivation of smad-transforming growth factor beta signaling by Ca(2+)-calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ. Molecular and cellular biology 20, 8103-8111 70. McKenna, L. A., Liu, H., Sansom, P. A., and Dean, M. F. (1998) An N-terminal peptide from link protein stimulates proteoglycan biosynthesis in human articular cartilage in vitro. Arthritis and rheumatism 41, 157-162 71. Abbott, R. D., Purmessur, D., Monsey, R. D., Brigstock, D. R., Laudier, D. M., and Iatridis, J. C. (2013) Degenerative grade affects the responses of human nucleus pulposus cells to link-N, CTGF, and TGFbeta3. Journal of spinal disorders & techniques 26, E86-94 72. Kandel, R., Roberts, S., and Urban, J. P. (2008) Tissue engineering and the intervertebral disc: the challenges. European spine journal : official publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society, and the European Section of the Cervical Spine Research Society 17 Suppl 4, 480-491 73. Ariga, K., Yonenobu, K., Nakase, T., Kaneko, M., Okuda, S., Uchiyama, Y., and Yoshikawa, H. (2001) Localization of cathepsins D, K, and L in degenerated human intervertebral discs. Spine (Phila Pa 1976) 26, 2666-2672 74. Zigler, J. E., Glenn, J., and Delamarter, R. B. (2012) Five-year adjacent-level degenerative changes in patients with single-level disease treated using lumbar total disc replacement with ProDisc-L versus circumferential fusion. Journal of neurosurgery. Spine 17, 504-511 75. Ruberte, L. M., Natarajan, R. N., and Andersson, G. B. (2009) Influence of single-level lumbar degenerative disc disease on the behavior of the adjacent segments-a finite element model study. Journal of biomechanics 42, 341-348 76. Lund, T., and Oxland, T. R. (2011) Adjacent level disk disease-is it really a fusion disease? The Orthopedic clinics of North America 42, 529-541, viii 77. Hayes AJ, Benjamin M, Ralphs JR. Extracellular matrix in development of the intervertebral disc. Matrix Biol 2001;20:107-21. 78. Watanabe H, Yamada Y, Kimata K. Roles of aggrecan, a large chondroitin sulfate proteoglycan, in cartilage structure and function. J Biochem (Tokyo) 1998;124:687-693. 79. Roughley PJ. Biology of intervertebral disc aging and degeneration: involvement of the extracellular matrix. Spine. 2004;29:2691-2699. 80. Li X, An HS, Ellman M, Phillips F, Thonar EJ, Park DK, et al. Action of fibroblast growth factor-2 on the intervertebral disc. Arthritis Res Ther 2008;10:R48. 81. Smith LJ, Nerurkar NL, Choi KS, Harfe BD, Elliott DM. Degeneration and regeneration of the intervertebral disc: lessons from development. Dis Model Mech. 2011;14:31-41. 82. Miller JA, Schmatz C, Schultz AB. Lumbar disc degeneration: correlation with age, sex and spine level in 600 autopsy specimens. Spine. 1988;14:173-178. 83. Masuda K, An HS. Growth factors and the intervertebral disc. Spine J. 2004;4:330S-340S. 84. An HS, Takegami K, Kamada H, Nguyen CM, Thonar EJ, Singh K, Andersson GB, Masuda K. Intradiscal administration of osteogenic protein-1 increases intervertebral disc height and proteoglycan content in the nucleus pulposus in normal adolescent rabbits. Spine. 2005;30:25-31. 85. Henriksson HB, Svanvik T, Jonsson M, Hagman M, Horn M, Lindahl A, Brisby H. Transplantation of human mesenchymal stems cells into intervertebral discs in a xenogeneic porcine model. Spine. 2009;34:141-148 86. Sakai D, Mochida J, Iwashina T, Watanabe T, Nakai T, Ando K, Hotta T. Differentiation of mesenchymal stem cells transplanted to a rabbit degenerative disc model: potential and limitations for stem cell therapy in disc regeneration. Spine. 2005;30:2379-2387. 87. Liu H, McKenna LA, Dean MF. An N-terminal peptide from link protein can stimulate biosynthesis of collagen by human articular cartilage. Arch Biochem Biophys. 2000;14:116-122. 88. Mwale F, Demers CN, Petit A, Roughley P, Poole AR, Steffen T, Aebi M, Antoniou J. A synthetic peptide of link protein stimulates the biosynthesis of collagens Ⅱ, IX and proteoglycan by cells of the intervertebral disc. J Cell Biochem. 2003;14:1202-1213. 89. Tchetina E, Mwale F, Poole AR. Distinct phases of coordinated early and late gene expression in growth plate chondrocytes in relationship to cell proliferation, matrix assembly, remodeling, and cell differentiation. J Bone Miner Res. 2003;14:844-851. 90. Mwale F, Demers CN, Petit A, Antoniou J. Effect of the N-terminal peptide of Link protein on human mesenchymal stem cells from osteoarthritis patients. J Stem Cells. 2008;14:99. 91. Li Z, Gunn J, Chen MH, et al. On-site alginate gelation for enhanced cell proliferation and uniform distribution in porous scaffolds. J Biomed Mater Res A 2008; 86:552-9. 92. Lin YJ, Yen CN, Hu YC, et al. Chondrocytes culture in three-dimensional porous alginate scaffolds enhanced cell proliferation, matrix synthesis and gene expression. J Biomed Mater Res A 2009; 88:23-33. 93. Gawri R, Antoniou J, Ouellet J, Awwad W, Steffen T, Roughley P, Haglund L, Mwale F. Link-N can stimulate proteoglycan synthesis in the degenerated human intervertebral discs. Eur Cells Mater 2013, In Press. 94. Farndale RW, Buttle DJ, Barrett AJ. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue. Biochim Biophys Acta 1986; 883:173-7. 95. Mwale F, Ciobanu I, Giannitsios D, Roughley P, Steffen T, Antoniou J. Effect of oxygen levels on proteoglycan synthesis by intervertebral disc cells. Spine 2011; 36(2):E131-8. 96. Alini M, Roughley PJ, Antoniou J, Stoll T, Aebi M. A biological approach to treating disc degeneration: not for today, but maybe for tomorrow. Eur Spine J. 2002, Suppl 2:S215-20. 97. Chou AI, Reza AT, Nicoll SB. Distinct intervertebral disc cell populations adopt similar phenotypes in three-dimensional culture. Tissue Eng Part A. 2008; 14(12):2079-87. 98. Roughley PJ, Melching LI, Heathfield TF, Pearce RH, Mort JS. The structure and degradation of aggrecan in human intervertebral disc. Eur Spine J. 2006 Suppl 3:S326-32.

본 출원은 2013년 8월 27일자로 제출된 미국 가특허출원들 제 61/870,394호 및 2014년 8월 4일자로 제출된 제 61/975,329호의 우선권을 기초로 하는 35 U.S.C. §119의 유익을 주장하는 특허협력조약 출원이고, 이들은 본 명세서에서 그들의 전부가 참고문헌으로 통합된다.

본 발명의 한 가지 관점은,

i) DHX₁SDNYT, 여기에서 X₁은 L 또는 H (서열번호 1);

ii) i)의 보존적 변이체;

iii) i) 또는 ii)의 단편:

으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하는 분리된 폴리펩타이드로서, 상기 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 보유하고, 상기 펩타이드는 15개 이하의 아미노산들인, 분리된 폴리펩타이드를 포함한다.

한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 1) DHLSDNYT (서열번호 2) 및/또는 생물학적 활성을 보유하는 그의 보존적 변이체, 또는 2) DHHSDNYT (서열번호 3) 또는 생물학적 활성을 보유하는 그의 보존적 변이체로 구성되는 펩타이드 서열을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는

i) DHX_1SDNYTX_2DHDR X_3I, 여기에서 X₁은 L 또는 H, X₂는 L 또는 V, X₃는 A 또는 V (서열번호 4);

ii) i)의 보존적 변이체; 및

iii) i) 또는 ii)의 단편:

으로부터 선택되는 펩타이드로서, 상기 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 보유하는 펩타이드를 포함한다.

또 다른 관점은 링크 N 단편 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 분리된 핵산을 포함한다.

다른 관점은 1) 링크 N 단편 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드; 또는 2) 링크 N 단편 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.

또 다른 관점은 링크 N 단편 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 세포이다.

또한 또 다른 관점은 링크 N 단편 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드, 링크 N 단편 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 세포를 포함하는 조성물이다.

상기 산물들을 제조하고 사용하는 방법들도 역시 기술된다.
.
[과제의 해결 수단]

본 발명의 다른 특징들 및 장점들은 다음의 상술된 기술내용으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범주 내에서 다양한 변화들 및 변형들이 상술된 기술내용으로부터 당업자들에게 자명해질 것이기 때문에, 이러한 상술된 기술내용 및 특정한 실시예들은 본 발명의 바람직한 구현예들을 나타내면서 단지 설명으로 주어지는 점은 이해되어야 한다.
I. 정의
용어 "연골 세포 (cartilage cell)"는 본 명세서에서 사용되는 바, 예를 들면 연골 조직을 생산하는 데 사용될 수 있는 연골 조직에서 발견되는 연골세포 계통 세포들을 의미한다.
용어 "연골세포 계통 세포들 (chondrocyte lineage cell)"은 본 명세서에서 사용되는 바 연골세포 (chondrocyte) 세포들, 및 세포화학적으로 유사하고, 예를 들면 Sox9 및 콜라겐 Ⅱ를 포함하는 연골세포들 마커들을 발현하고 연골세포들로서 행동하는 세포들을 의미한다. 연골세포들은 관절 연골 계통 연골세포들 또는 과다증식을 할 수 있는 비대 계통 연골세포들일 수 있다.
용어 "연골 조직"은 본 명세서에서 사용되는 바 연골 조직 및 조직학적으로 유사하고, 연골 마커 예를 들면 콜라겐 Ⅱ 및 아그레칸을 발현하며, 관절 연골 조직 및/또는 성장판 연골 유사 조직을 포함하는 연골로서 행동하는 조직을 의미한다.
용어 "보존적 변이체"는 본 명세서에서 사용되는 바 하나 이상의 보존적 아미노산 치환들을 포함하는 링크 N 폴리펩타이드 단편을 의미한다.
"보존적 아미노산 치환"은 본 명세서에서 사용되는 바, 하나의 아미노산 잔기가 펩타이드의 원하는 성질들을 없애지 않고도 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 적합한 보존적 아미노산 치환들은 유사한 소수성, 극성, 및 R-사슬 길이를 가진 아미노산들을 또 다른 것으로 치환시켜서 만들어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환의 예들은 다음을 포함한다.

용어 "배양하는"은 본 명세서에서 사용되는 바 부착, 현탁 또는 3D 세포 및/또는 기관 배양으로 배양하고/거나 계대하는 것을 의미한다. 3D 세포 또는 기관 배양은 세포들이 3-차원의 스캐폴드 내에 또는 위에 배양되는 배양을 포함한다.
용어 "디스크 세포" 본 명세서에서 사용되는 바 NP 또는 AF 세포 계열의 세포들을 의미한다.
용어들 "농축강화" 또는 "농축강화된"는 본 명세서에서 사용되는 바 한 가지 유형의 세포들의 수율 (분획)이 시작 배양 또는 제조 시 해당 유형의 세포 분획들 대비 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50% 또는 적어도 약 60%까지 증가되는 것을 의미한다. 농축강화 및 부분적 정제는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
세포들의 집단은 세포 표면 마커들과 같은 마커들 (예로, FACS 선별 등)을 기초로 하는 방법들과 같은 서로 다른 방법들을 사용하여 농축강화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "발현한다"는 분자의 수준들이 분자 (예로, 링크 N 단편)와 접촉되지 않거나 분자에 노출되지 않았던 세포보다 분자와 접촉되거나 분자에 노출되었던 세포에서 더 높게 측정되도록 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 전사 또는 폴리펩타이드의 번역을 말한다. 분자의 발현을 측정하는 방법들은 당업자들에게 잘 알려져 있고, 이에 제한되는 것은 아니지만 노던 블럿팅, RT-PCR, 제자리 혼성화, 웨스턴 블럿팅, 및 FAC와 같은 면역염색법을 포함한다.
용어 "혼성화한다"는 상보적인 핵산과 서열 특이적 비-공유 결합 상호작용을 말한다. 혼성화는 적어도 적당하게 엄격한 조건들 하에서 시행된다. 바람직한 구현예에서, 혼성화는 높은 엄격도 조건들 하이다. 혼성화를 촉진하는 적절한 엄격도 조건들은 당업자들에게 잘 알려 있거나, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 6.3.6에서 찾아볼 수 있다. 예를 들면, 6.0 x 염화나트륨/소듐 시트레이트 (SSC)가 약 45°C에서 15분 동안, 이어서 2.0 x SSC로 50°C에서 15분 동안의 세척 단계가 사용될 수 있다. 엄격도는 세척 단계에 사용되는 조건들을 기초로 하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 세척 단계에서 염 농도는 약 0.2 x SSC로 50°C에서 15분 동안의 높은 엄격도로부터 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계에서 온도는 높은 엄격도 조건들로, 약 65°C에서 15분 동안일 수 있다.
"적어도 적당하게 엄격한 혼성화 조건들"에 의하여, 용액에서 2가지 상보적인 핵산 분자들 간의 선택적인 혼성화를 촉진하는 조건들이 선택되는 것을 의미한다. 혼성화는 핵산 서열 분자의 전부 또는 일부에서 일어날 수 있다. 혼성화 부분은 전형적으로 길이가 적어도 15개 (예로, 20개, 25개, 30개, 40개 또는 50개)의 뉴클레오타이드들이다. 당업자들이라면 핵산 이중체, 또는 하이브리드들의 안정성이 Tm에 의해 결정되고, 이는 소듐을 포함하는 완충액들에서 소듐 이온 농도 및 온도의 함수인 점을 알고 있을 것이다 (Tm = 81.5°C - 16.6 (Log10 [Na+]) + 0.41(%(G+C) - 600/l), 또는 유사한 방정식). 이에 따라, 하이브리드 안정성을 결정하는 세척 조건들에서 변수들은 소듐 이온 농도 및 온도이다. 기지의 핵산 분자와 유사하지만 일치하지는 않는 분자들을 확인하기 위하여, 1% 불일치 (mismatch)는 Tm에서 약 1°C 감소를 가져올 것으로 가정될 수 있고, 예를 들면 > 95% 서열 일치도를 가지는 핵산 분자들을 찾는 경우라면 최종 세척 온도는 약 5°C까지 감소될 것이다. 이들 고려사항들을 기초로 하여, 당업자들이라면 적절한 혼성한 조건들을 바로 선택할 수 있을 것이다. 예로서 다음의 조건들은 엄격한 혼성화를 달성하는 데 사용될 수 있다: 상기 방정식을 기초로 하여 5x 염화나트륨/소듐 시트레이트 (SSC)/5x 덴하르트 용액/1.0% SDS로 Tm - 5°C에서, 이어서 0.2x SSC/0.1% SDS로 60°C에서 15분 동안의 세척. 적당하게 엄격한 혼성화 조건들은 3x SSC로 42°C에서 15분 동안의 세척 단계를 포함한다. 그러나 동등한 엄격도들이 대안의 완충액들, 염들 및 온도들을 사용하여 달성될 수 있다. 혼성화 조건들에 관한 추가적인 지침은 다음에서 찾아볼 수 있다: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6; 및 Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000, 제 3판.
용어 "서열 일치도 (sequence identity)"는 본 명세서에서 사용되는 바2가지 폴리펩타이드 서열들 또는 2가지 핵산 서열들 간의 서열 일치도의 백분율을 말한다. 2가지 아미노산 서열들 또는 2가지 핵산 서열들 간의 일치도 백분율을 결정하기 위하여, 서열들은 최적의 비교를 위해 정렬된다 (예로, 갭들이 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열과 최적의 정렬을 위해 첫 번째 아미노산의 서열 또는 핵산 서열 내에 도입될 수 있다). 다음으로 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오타이드들은 해당하는 아미노산 위치들 또는 뉴클레오타이드 위치들에서 비교된다. 첫 번째 서열의 위치가 두 번째 서열의 해당 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드로 채워질 때, 분자들은 해당 위치에서 일치한다. 2가지 서열들 간의 일치도 백분율은 서열이 공유하는 일치하는 위치들의 수의 함수이다 (예로, % 일치도 = 일치하는 중첩된 위치들의 수 / 위치들의 전체 수 곱하기 100%). 한 가지 구현예에서, 2가지 서열들은 동일한 길이이다. 2가지 서열들 간의 일치도 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 역시 달성될 수 있다. 2가지 서열들의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한 비-제한적인 예는 이후 카를린 및 알트슐이 변형하였던 카를린 및 알트슐의 알고리즘 (Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268; Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877)이다. 이러한 알고리즘은 알트슐의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램들 (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403) 내에 도입된다. BLAST 뉴클레오타이드 조사들은 본 출원의 핵산 분자들과 동종유래의 뉴클레오타이드 서열들을 획득하도록 NBLAST 뉴클레오타이드 프로그램 변수들의 집합, 예로 점수=100, 단어 길이=12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 조사들은 본 명세서에서 기술된 단백질 분자와 동종유래의 아미노산 서열을 획득하도록 XBLAST 프로그램 변수들 집합, 예로 점수-50, 단어 길이=3로 수행될 수 있다. 비교를 위한 갭 형성된 정렬들을 획득하도록, 갭 형성된 BLAST가 Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 대안적으로, PSI-BLAST가 분자들 간의 먼 연관성들을 검출하는 반복된 조사를 수행하는 데 사용될 수 있다 (Id). BLAST, 갭 형성된 BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램들을 사용할 때, 개별 프로그램들 (예로, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴드 변수들이 사용될 수 있다 (예로, NCBI 웹사이트 참조). 2가지 서열들 간의 일치도 백분율은 상기에 기술된 것들과 유사한 기법들을 사용하여 갭들을 허용하거나 허용하지 않고도 결정될 수 있다. 일치도 백분율을 계산할 때, 전형적으로 정확한 매치들만이 계수된다. 한 가지 구현예에서, 분리된 핵산들은 프라이머들로서 유용하다.
용어 "분리된"은 본 명세서에서 사용되는 바, 구성성분을 포함하는 혼합된 또는 이종유래 환경으로부터 제거되거나 분리되었던 구성성분 (예로, 폴리펩타이드, 핵산, 재조합 세포, 유도된 세포)을 말한다. 예를 들면 폴리펩타이드의 측면에서 용어 "분리된 폴리펩타이드" 는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 같은 단백질성 제제를 말하고, 이는 세포성 물질, 또는 재조합으로 생산될 때 배양 배지, 또는 화학적 전구체들, 또는 화학적으로 합성될 때 기타 다른 화학물질들이 실질적으로 없다. 용어 "폴리펩타이드"는 본 명세서에서 사용되는 바 다함께 사슬로 결합된 많은 아미노산 잔기들로 구성되는 중합체를 말하고, 자연적으로 생기는 아미노산들뿐만 아니라 변형된 염기들도 포함하는 중합체들을 포함할 수 있다.
핵산의 측면은 이는 A, G, T, C의 중합체 및/또는 세포성 물질, 또는 재조합 DNA 기법들로 생산될 때 배양 배지, 또는 화학적 전구체들, 또는 화학적으로 합성될 때 기타 다른 화학물질들이 실질적으로 없는 DNA, RNA 및 cDNA와 같은 변형된 잔기들을 의미한다. "분리된 핵산"도 역시 핵산이 유래한 핵산을 자연적으로 끼워넣은 서열 (예로, 핵산의 5' 및3' 말단에 위치한 서열들)이 실질적으로 없다. 용어 "핵산"은 DNA 및 RNA를 포함하도록 의도되고 이중 가닥 또는 단일 가닥 둘 중 하나일 수 있다.
세포들의 분리된 집단의 측면은 세포들의 혼합된 또는 이종유래 집단으로부터 제거되고 분리되었던 세포들의 집단을 말한다. 일정 구현예들에서, 분리된 집단은 세포들이 분리되거나 농축강화된 이종유래 집단과 비교 시 세포들의 실질적으로 순수한 집단이다.
용어 "링크 N"은 본 명세서에서 사용되는 바, MMP에 의해 링크 단백질로부터 절단되는 자연적으로 생기는 16개 아미노산 펩타이드를 의미하고, 서열 DHLSDNYTLDHDRAIH (서열번호 15)을 가지는 인간 링크 N 및 서열 DHHSDNYTVDHDRVIH (서열번호 5)을 가지는 소의 링크 N을 포함한다. 이것은 관절 디스크들 및 추간판들 둘 다에서 생산되고, 디스크 (NP 및 AF) 및 관절 연골 (연골세포) 세포들에 의한 아그레칸/콜라겐 합성을 촉진시킨다.
용어 "링크 N 단편"은 본 명세서에서 사용되는 바 i) DHX₁SDNYT, 여기에서 X₁은 L 또는 H (서열번호 1); ii) i)의 보존적 변이체; 또는 iii) i) 또는 ii)의 단편으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드로서, 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 보유하고, 펩타이드는 15개 이하의 아미노산들인 폴리펩타이드를 의미한다. 링크 N 단편은 예를 들면 서열번호들 1 내지 6 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 가지는 폴리펩타이드, 생물학적 활성을 보유하는 그의 보존적 변이체 및/또는 그의 단편일 수 있다.
용어 "중간엽 줄기세포" 또는 MSC는 본 명세서에서 사용되는 바 서로 다른 조건들 하에서 하나 이상의 분화된 중간엽 세포 유형으로 분화하는 능력을 가진 세포를 말한다. MSC는 유도된 중간엽 줄기세포들 및 미유도된 줄기세포들을 포함한다.
특정한 세포 집단의 측면에서 용어 "실질적으로 순수한"은 전체 세포 집단을 구성하는 세포들에 대해 적어도 약 65%, 바람직하게 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 순수한 세포들의 집단을 말한다.
용어 "개체"는 본 명세서에서 사용되는 바 포유동물들, 바람직하게는 인간들을 포함하는 동물계의 모든 구성원들을 포함한다.
용어들 "처리하다", "처리하는", "처리" 등은 분리된 세포에 적용될 때 세포를 임의의 종류의 공정 또는 조건으로 처리하거나 세포 상에 임의의 종류의 조작 또는 절차를 수행하는 것을 포함한다. 개체에게 적용될 때, 용어들은 개체에게 의학적 또는 외과적 보호, 간호, 또는 관리를 제공하는 것을 말한다.
용어 "치료"는 본 명세서에서 사용되는 바 개체에게 적용될 때, 임상적 결과들을 포함하는 유익한 또는 원하는 결과들을 획득하는 것을 목적으로 하는 접근법을 말하고, 예를 들면 약제학적 개입들, 수술, 방사성요법 및 자연요법적 개입들뿐만 아니라 연골 및/또는 디스크 조직 병리들을 치료하는 테스트 치료들을 포함하는 의학적 절차들 및 적용들을 포함한다. 유익한 또는 원하는 임상적 결과들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 검출가능 또는 검출 불가능과 상관없이 하나 이상의 증상들 또는 병태들의 완화 또는 개선, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된 (예로, 악화되지 않음) 상태, 질환의 전염을 예방하기, 질환 진행의 지연 또는 늦추기, 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 소강 (일부 또는 전부 상관없이)을 포함할 수 있다. 치료는 예를 들면 분리된 링크 N 단편 폴리펩타이드를 개체에게 투여하거나 세포들을 이식하거나 분리된 링크 N 단편 폴리펩타이드 및/또는 상기 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 세포로 처리된 조직을 이식하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "투여하는", "이식하는 (implanting)" 및 "이식하는 (transplanting)"은 분리된 폴리펩타이드들, 세포들, 조직들 및/또는 본 명세서에서 기술된 산물들을, 원하는 부위로 도입된 세포들의 적어도 부분적 정착을 가져오는 방법 또는 경로에 의해 개체 내로 전달하는 맥락에서 상호교환적으로 사용된다. 세포들은 척추 또는 관절로 직접적으로 이식되거나, 대안적으로 개체의 원하는 위치로 전달을 가져오는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 범위를 이해하는 데 있어, 용어 "포함하는" 및 그의 파생어들은 본 명세서에서 사용되는 바, 진술된 특징들, 요소들, 구성성분들, 그룹들, 정수들, 및/또는 단계들의 존재를 특정하지만 기타 미진술된 특징들, 요소들, 구성성분들, 그룹들, 정수들, 및/또는 단계들의 존재를 배제시키지 않는 개방된 용어들인 것으로 의도된다. 상기 내용은 용어들 "포함하는 (including)", "가지는" 및 그들의 파생어들과 같은 유사한 의미들을 가지는 단어들에도 역시 적용된다.
용어 "구성하는" 및 그의 파생어들은 본 명세서에서 사용되는 바, 진술된 특징들, 요소들, 구성성분들, 그룹들, 정수들, 및/또는 단계들의 존재를 특정하는 폐쇄된 용어들인 것으로 의도되고, 기타 미진술된 특징들, 요소들, 구성성분들, 그룹들, 정수들, 및/또는 단계들의 존재를 배제시킨다.
또한, "실질적으로, "약" 및 "대략적으로"와 같은 정도의 용어들은 본 명세서에서 사용되는 바, 최종 결과가 유의하게 변화하지 않도록 변형된 용어의 합리적인 정도의 편차를 의미한다. 이들 용어들의 정도는 이러한 편차가 변형시키는 단어의 의미를 부정하지 않는 경우라면 변형된 용어의 적어도 ±5%의 편차를 포함하는 것으로서 고려되어야 한다.
더욱 상세하게, 용어 "약"은 기준이 작성된 수의 플러스 또는 마이너스 0.1 내지 50%, 5 내지 50%, 또는 10 내지 40%, 10 내지20%, 10% 내지 15%, 바람직하게는 5 내지 10%, 가장 바람직하게는 약 5%를 의미한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용되는 바, 단수 형태들 "하나 (a)", "하나 (an)" 및 "그 (the)"는 달리 내용상 명확하게 진술하지 않는 경우라면 복수의 기준들을 포함한다. 따라서 예를 들면, "하나의 화합물"을 포함하는 조성물은 둘 이상의 화합물들의 혼합물을 포함한다. 또한 용어 "또는"은 달리 내용상 명확하게 진술하지 않는 경우라면 일반적으로 "및/또는"을 포함하는 의미로 적용되는 점도 역시 주목되어야 한다.
특정한 섹션들에 기술된 정의들 및 구현예들은 당업자에 의해 이해될 바와 같이 본 명세서에서 기술되는 그들이 적합한 다른 구현예들에 적용가능한 것으로 의도된다.
본 명세서에서 종점들에 의한 수적 범위들의 인용은 해당 범위 내에 포괄되는 모든 수들 및 분수들을 포함한다 (예로, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4, 및 5를 포함함). 모든 수들 및 그들의 분수들은 용어 "약"으로 변형되는 것으로 생각되는 점도 역시 이해될 것이다.
또한 기술된 정의들 및 구현예들은 당업자에 의해 이해될 바와 같이 본 명세서에서 기술된 그들이 적합한 다른 구현예들에 적용가능한 것으로 의도된다. 예를 들면, 본 명세서의 단락들에서 본 발명의 다른 관점들이 더욱 자세하게 정의된다. 이렇게 정의된 각 관점은 정반대로 명확하게 지시되지 않는 경우라면 임의의 다른 관점 또는 관점들과 조합될 수 있다. 상세하게, 바람직하거나 유리한 것으로서 지시된 임의의 특징 또는 특징들은 바람직하거나 유리한 것으로서 지시된 임의의 다른 특징 또는특징들과 조합될 수 있다.
또한, 특정한 섹션들에서 기술된 정의들 및 구현예들은 당업자에 의해 이해될 바와 같이 본 명세서에서 기술된 그들이 적합한 다른 구현예들에 적용가능한 것으로 의도된다. 예를 들면, 다음의 단락들에서 본 발명의 다른 관점들이 더욱 자세하게 정의된다. 이렇게 정의된 각 관점은 정반대로 명확하게 지시되지 않는 경우라면 임의의 다른 관점 또는 관점들과 조합될 수 있다. 상세하게, 바람직하거나 유리한 것으로서 지시된 임의의 특징 또는 특징들은 바람직하거나 유리한 것으로서 지시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
Ⅲ. 방법들 및 산물들
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 첫 8개 아미노산들을 포함하는 링크 N 의 단편은 기관 배양에서 세포외 프로테오글리칸 수준들을 유도하고 회복시키며 또한 염증 환경을 포함하는 디스크 세포들 및 연골 세포들에서 프로테오글리칸 및 콜라겐 Ⅱ 합성을 유도하는 점이 밝혀졌다. 예를 들면, 실시예 3에서 설명된 바와 같이 GAG 함량은 골관절염 체외이식편들이 IL-1β의 존재 시 링크 N으로 처리될 때 대조군과 비교하여 유의하게 증가되었다. 웨스턴블럿 분석은 이것이 IL-1β 단독과 비교 시 MMP-13 활성 형태의 양들의 증가도 역시 유도하는 점을 보여주었다. OA 연골로부터 얻은 체외이식편들이 IL-1β의 존재 시 링크 N으로 처리될 때 추출가능한 제 Ⅱ형 콜라겐의 양도 역시 증가되었다. 링크 N은 정상 및 OA 환자들로부터 얻은 연골세포들에서 IL-1β 자극된 P-P65(NF-kB)를 유의하게 억제하였다.
또한 소의 링크 N (BLN)도 디스크 세포들에서 프로테오글리칸 및 콜라겐 Ⅱ 합성을 인간 링크 N (HLN)과 같이 유도하는 점이 역시 확인된다.
링크 N은 16개 아미노산 펩타이드이다. 본 발명 이전에, 링크 N의 단편들이 존재하고/거나 활성을 가지는 여부는 알려져 있지 않았다. 예를 들면 왕 등 (33)은 링크 N의 첫 12개 아미노산들을 포함하는 링크 N 단편이 활성을 가지지 않는다고 보고한 바 있었다.
한 가지 관점은
i) DHX₁X₂X₃X₄X₅X₆ (서열번호 30);
X1은 임의의 아미노산, 선택적으로 L, H, R, Q이고;
X2는 S 또는 L이고;
X3는 D, S 또는 N이고;
X4는 N 또는 D이고;
X5는 Y 또는 S이고/거나;
X6는 T 또는 Y이다.
ii) i)의 보존적 변이체; 및/또는 iii) i) 및/또는 ii)의 단편:으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하는 분리된 폴리펩타이드로서, 상기 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 보유하며, 상기 펩타이드는 15개 이하의 아미노산들인, 분리된 폴리펩타이드 (본 명세서에서 링크 N 단편 또는 링크 N 단편 폴리펩타이드로도 약칭됨)를 포함한다.
링크 N의 예들은 실시예 10에서 제공된다. 한 가지 구현예에서, 링크 N 단편 폴리펩타이드들은 실시예 10에 기술된 서열들 또는 실시예 10에 기술된 서열들로부터 결정가능한 보존 모티브를 기초로 하는 서열들을 포함한다.
한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 DHX₁SX₃ NYT (서열번호 31), 여기에서 X1은 임의의 아미노산, 선택적으로 L, H, R Q; 및/또는X3는 D, S 또는 N; 그의 보존적 변이체 및/또는 그의 단편으로 구성되는 펩타이드로서, 상기 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 보유하고, 15개 이하의 아미노산들인, 펩타이드를 포함한다.
한 가지 구현예에서 분리된 폴리펩타이드 (본 명세서에서 링크 N 단편 또는 링크 N 단편 폴리펩타이드라고도 약칭됨)는
i) DHX₁SDNYT, 여기에서 X1은 L 또는 H (서열번호 1);
ii) i)의 보존적 변이체; 및
iii) i) 및/또는 ii)의 단편:으로부터 선택되는 펩타이드로서, 상기 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 보유하고, 15개 이하의 아미노산들인 펩타이드를 포함한다.
보존적 변이체 b)는 예를 들면 하나 이상의 보존적 변이체 치환들을 포함한다.
한 가지 구현예에서, 생물학적 활성은 BMP 수용체 제 Ⅱ 형의 결합 및/또는 SMAD 1/5 활성의 활성화이다.
한 가지 구현예에서, 포괄된 보존적 변이체 폴리펩타이드들은 BMP 수용체 제 Ⅱ형과 결합하고 혼합된 또는 역전된 링크 N과 비교하여 SMAD1/5 활성을 활성화시키는 것들이다.
단편 c)는 예를 들면 서열번호들 1, 2, 3, 4 또는 5의 4개 아미노산들, 5개 아미노산들, 6개 아미노산들 또는 7개 아미노산들일 수 있다. 단편은 N 말단의 대부분 아미노산들 또는 C 말단의 대부분 아미노산들을 포함할 수 있다.
예를 들면, 더 작은 단편이 예를 들면 실시예 9에서 기술된 바와 같이 활성에 대해 테스트될 수 있다.
한 가지 구현예에서, 단편은 BMP 수용체 Ⅱ과 결합하고 혼합된 또는 역전된 링크 N과 비교하여 SMAD1/5 활성을 활성화시킨다.
BMP 수용체 제 Ⅱ형의 결합 및/또는SMAD 활성화는 예를 들면 왕 등 (33)의 문헌에서 기술된 바와 같이 평가될 수 있다.
한 가지 구현예에서, 펩타이드는 DHX₁SDNYT (서열번호 1), 여기에서 X₁은 L 또는 H, 또는 생물학적 활성을 보유하는 그의 보존적 변이체로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 DHLSDNYT (서열번호 2)로 구성되는 펩타이드 서열 또는 생물학적 활성을 보유하는 그의 보존적 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 DHHSDNYT (서열번호 3)로 구성되는 펩타이드 서열 또는 생물학적 활성을 보유하는 그의 보존적 변이체를 포함한다. 한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 DHLSDNYT (서열번호 2) 또는 DHHSDNYT (서열번호 3)로 구성되는 펩타이들를 포함한다.
더 큰 단편들은 링크 N (예로, 인간 또는 소의 링크 N)의 15개까지의 아미노산들을 포함한다. 한 가지 구현예에서, 펩타이드는 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산들이다.
이에 따라 한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는
i) DHX1X2X3 X4X5X6X7 X8 X9DX10 X11X12, X13, (서열번호 6)
여기에서 X1은 임의의 아미노산, 선택적으로 L, H, R, Q이고;
X2는 S 또는 L이고;
X3 는 D, S 또는 N이고;
X4는 N 또는 D이고:
X5는 Y 또는 S이고;
X6는 T 또는 Y이고;
X7는 L, V 또는 T이고;
X8는 임의의 아미노산, 선택적으로 D, G, N 또는 P이고;
X9는 H, Y 또는 P이고;
X10는 R 또는 Q이고;
X11는 A, V 또는 D이고;
X12는 I 또는 R이고/거나;
X13는 H 또는 V이다.
ii) i)의 보존적 변이체; 및/또는
iii) i) 및/또는 ii)의 단편:
으로부터 선택되는 펩타이드로서, 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 보유하고, 15개 이하의 아미노산들이고, 하나 이상의 연속적인 C 말단 및/또는N 말단 잔기들이 결실되는, 펩타이드를 포함한다.
한 가지 구현예에서 분리된 폴리펩타이드는
i) DHX₁SX₃ NYTX₇X₈ HDRVIH (서열번호 7) 또는 DHX₁SDNYTX7DHDRX12I (서열번호 8), 여기에서 X₁은 L 또는 H, X₇은 L 또는 V 및/또는X12는 A 또는 V;
ii) i)의 보존적 변이체; 및
iii) i) 및/또는 ii)의 단편:
으로부터 선택되는 펩타이드로서, 보존적 변이체 및/또는 단편은 생물학적 활성을 보유하는 펩타이드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 서열 DHLSDNYTLDHDRAI (서열번호 9) 또는 생물학적 활성을 보유하는 그의 보존적 변이체 및/또는 단편을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 서열 DHHSDNYTVDHDRVI (서열번호 10) 또는 생물학적 활성을 보유하는 그의 보존적 변이체 및/또는 단편을 포함한다.
본 명세서에서는 81% 서열 일치도를 공유하는 소의 링크 N 및 인간 링크 N 둘 다가 생물학적 활성을 가지는 점이 확인된다. 이에 따라 한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 서열 일치도를 가지는 펩타이드를 포함한다. 한 가지 구현예에서, 서열번호 4의 X₁, X₂ 및/또는X₃에 해당하는 잔기들은 변형된다.
한 가지 구현예에서 단편은 서열번호 4, 5 또는 6의 4개 아미노산들, 5개 아미노산들, 6개 아미노산들, 7개 아미노산들, 8개 아미노산들, 9개 아미노산들, 10개 아미노산들, 11개 아미노산들, 12개 아미노산들, 13개 아미노산들, 14개 아미노산들 또는 15개 아미노산들이다. 단편은 N 말단의 대부분 아미노산들 또는 C 말단의 대부분 아미노산들을 포함할 수 있다.
한 가지 구현예에서, 단편은 BMP 수용체 Ⅱ와 결합하고 혼합된 또는 역전된 링크 N과 비교하여 SMAD1/5 활성을 활성화시킨다.
한 가지 구현예에서, 분리된 펩타이드는 고체 지지체, 선택적으로 기능기들의 분포를 가지는 용매화 중합체들, 예를 들면 폴리스티렌: 1 내지 2% 디비닐벤젠으로 교차-결합된 스티렌; 폴리아크릴아마이드: 폴리스티렌의 친수성 대안; 폴리에틸렌글리콜 (PEG): PEG-폴리스티렌 (PEG-PS)과 같은 젤 유형 지지체와 결합된다. 한 가지 구현예에서 고체 지지체는 예를 들면 PEG-폴리프로필렌 글리콜 망 또는 폴리아마이드 또는 폴리스테렌을 가진 PEG로 구성되는 PEG-기초 지지체들이다. 한 가지 구현예에서, 고체 지지체는 예를 들면 조절된 공극 유리, 셀룰로스 섬유들, 및 높게 교차-결합된 폴리스티렌을 포함하는 표면-유형 지지체이다. 한 가지 구현예에서, 고체 지지체는 복합체 예를 들면 딱딱한 기질에 의해 지지되는 젤-유형 중합체이다.
한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 하나 이상의 보호기들을 포함한다. 한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 N-말단 보호기를 포함한다. 한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 C-말단 보호기를 포함한다. 한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 측면 변화 (side change) 보호기들을 포함한다.
한 가지 구현예에서, 분리된 펩타이드는 N 보호기를 포함한다.
한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 Fmoc 보호기를 포함한다. 한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 t-Boc 보호기를 포함한다. 한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 벤질옥시 카르보닐 (Z)기이다. 한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 alloc 보호기를 가진다. 또 다른 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 석판 (lithographic) 보호기를 가진다.
한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 덴드리머로 입체형성되거나 이에 포함된다. 한 가지 구현예에서, 덴드리머는 덴드리머 스캐폴드와 결합하는 것으로 본 명세서에서 기술된 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개 이상의 분리된 폴리펩타이드들을 포함한다. 한 가지 구현예에서 덴드리머 스캐폴드는 폴리라이신 스캐폴드이다.
한 가지 구현예에서 분리된 폴리펩타이드는 PEG 또는 알부민과 같은 담체 모이어티, 비드와 결합된다.
한 가지 구현예에서, 펩타이드는 귀소 모이어티, 안정화 모이어티, 보호 모이어티 및 투여 모이어티로부터 선택되는 활성 모이어티로서, 선택적으로 단백질성인 활성 모이어티와 결합된다.
예를 들면, 안정화 모이어티는 면역글로불린 Fc 부분, 알부민 등과 같은, 자연적인 분해 및/또는 단백질 교체에 대해 저항하는 아미노산들의 단백질 서열일 수 있고, 선택적으로 모이어티는 분리된 펩타이드의 N 및/또는 C 말단과 결합된다.
한 가지 구현예에서 분리된 폴리펩타이드는 검출 또는 정제 태그, 예를 들면 재조합 단백질 내로 부착되거나 도입될 수 있고 그의 발현을 검출하거나 폴리펩타이드를 정제하는 데 유용한 펩타이드 서열과 같은 모이어티와 결합된다. 한 가지 구현예에서, 정제 태그는 단백질분해 절단 부위를 포함하는 링커에 의해 분리된 펩타이드와 결합된다.
한 가지 구현예에서, 분리된 펩타이드는 리포좀 또는 나노입자 내에 포함된다. 한 가지 구현예에서, 리포좀은 서방성 리포좀이다. 한 가지 구현예에서 리포좀은 PEG화된 리포좀이다.
다른 관점은 본 명세서에서 기술된 분리된 링크 N 단편 폴리펩타이드를 인코딩하는 분리된 핵산이다. 분리된 핵산은 미가공이거나 벡터에 포함될 수 있다. 또한 한 가지 구현예에서 본 명세서에서 기술된 분리된 링크 N 단편 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산과 혼성화하는 핵산이 제공된다. 한 가지 구현예에서, 핵산은 코돈 최적화된다.
이에 따라 다른 관점은 본 명세서에서 기술된 분리된 핵산 및/또는 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 벡터를 포함한다. 벡터들은 핵산들을 위해 레트로바이러스 벡터들, 아데노바이러스 벡터들 및 DNA 바이러스 벡터들 그리고 폴리펩타이드들을 위해 리포좀들 또는 나노입자들을 포함할 수 있다. 한 가지 구현예에서, 리포좀은 서방성 리포좀이다.
분리된 폴리펩타이드 및/또는 핵산은 재조합 기법들을 사용하여 제작되고/거나 합성적으로 합성될 수 있다.
한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 합성적으로 생산되고 인간 생체내 발현된 폴리펩타이드와 비교하여 미글리코실화 (unglycosylated) 또는 차별적으로 글리코실화된다.
한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 고리화된다. 한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드는 하나 이상의 D 아미노산들 또는 더 많은 L 아미노산들을 포함한다.
다른 관점은 본 명세서에서 기술된 분리된 링크 N 단편 폴리펩타이드를 발현하고/거나 본 명세서에서 기술된 분리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 재조합 세포를 포함한다.
본 발명의 링크 N 단편들을 발현하는 다양한 재조합 세포들이 만들어질 수 있다. 예를 들면 세포는 본 발명의 링크 N 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환 (transform)되거나, 형질전환 (transfect)되거나, 형질감염될 수 있다.
한 가지 구현예에서, 세포는 연골세포 계통 세포, 줄기 세포 또는 디스크 세포이고, 선택적으로 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 한 가지 구현예에서, 재조합 세포는 치료적 용도를 위한 것이다.
다른 관점은 본 명세서에서 기술된 분리된 폴리펩타이드, 선택적으로 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물이다.
또한 또 다른 관점에서 본 명세서에서 제공된 분리된 핵산, 벡터, 또는 재조합 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
한 가지 구현예에서, 희석제는 생리학적 완충액, 선택적으로 무균의 생리학적 완충액이다.
한 가지 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물이다.
분리된 폴리펩타이드, 분리된 핵산, 벡터, 또는 재조합 세포는 선택적으로 동결건조되거나, 액체, 젤 또는 고체 조성물로 존재할 수 있다.
조성물은 동결건조된 분말 또는 수용성 또는 비-수용성 용액 또는 현탁액들일 수 있고, 이는 산화제들, 완충액들, 정균제들 및 용질들을 더 포함할 수 있다. 이러한 조성물들에 존재할 수 있는 다른 성분들은 예를 들면 물, 표면활성제들 (트윈과 같음), 알코올들, 폴리올들, 글리세린 및 식물성 오일들을 포함한다.
핵산들에 적합한 희석제들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 식염수 용액들 및 에탄올을 포함한다.
폴리펩타이드들, 및/또는 세포들에 적합한 희석제들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 폴리펩타이드들 및/또는 세포들을 냉동시키는 데 적합한 식염수 용액들, pH 완충화 용액들 및 글리세롤 용액들 또는 기타 용액들을 포함한다.
조성물은 예를 들면 생리학적 완충액들에 첨가되는 환원제들, 소수성 첨가제들, 및 프로테아제 저해제들을 더 포함할 수 있다.
한 가지 구현예에서, 조성물은 본 명세서에서 기술된 분리된 폴리펩타이드, 재조합 세포 및/또는 조성물을 포함하는 생체적합한 물질로 형성된 스캐폴드를 포함한다.
한 가지 구현예에서, 생체적합한 물질은 알기네이트, 아가로스, 키토산, 폴라카프로락톤 및/또는 하이알루온산 (또는 하이알루로네이트)를 기초로 한 생체물질로부터 선택된다. 연골세포들 및/또는IVD 세포들을 위한 일반명의 스캐폴드들도 역시 사용될 수 있다.
한 가지 구현예에서, 스캐폴드는 하이드로겔, 미세구, 미세캡슐, 스폰지, 폼 또는 섬유 내에 형성된다.
한 가지 구현예에서, 조성물은 개체 내로 이식을 위한 연골 또는 디스크 세포를 제조하기 위한 것이고, 본 명세서에서 기술된 분리된 폴리펩타이드 및/또는 재조합 세포, 연골 및/또는 디스크 세포 그리고 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물로서, 연골 세포 및/또는 디스크 세포가 프로테오글리칸 및/또는 콜라겐 Ⅱ를 증가시키도록 유도하는 데 충분한 유효량의 상기 분리된 폴리펩타이드 및/또는 재조합 세포에 노출되는, 조성물이다. 조성물 및/또는 조성물의 세포들은 예를 들면 개체에게 조성물을 투여 시 개체의 조직 병리를 치료하기 위해 분리되고 사용될 수 있다.
한 가지 구현예에서, 약제학적 조성물은 개체에서 연골 또는 디스크 조직 병리의 치료에 사용하기 위한 것이고, 본 명세서에서 기술된 분리된 폴리펩타이드 및/또는 재조합 세포, 연골 및/또는 디스크 세포 그리고 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물로서, 상기 치료는 개체에게 상기 조성물의 투여 시 개체에서 조직 병리를 치료하기 위해 연골 세포 및/또는 디스크 세포를 프로테오글리칸 및/또는 콜라겐 Ⅱ를 증가시키도록 유도하는 데 충분한 상기 분리된 폴리펩타이드 및/또는 재조합 세포의 유효량에 노출시키는 단계를 포함한다.
한 가지 구현예에서, 조성물 (약제학적 조성물 포함)은 생체적합한 물질로 형성된 스캐폴드로서, 연골 및/또는 디스크 세포가 스캐폴드 위에 또는 내에 배치되는, 스캐폴드를 포함한다.
한 가지 구현예에서, 연골 및/또는 디스크 세포를 포함하는 조성물은 투여 이전에 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일 또는 적어도 5일 동안 배양된다.
또 다른 관점은 연골 및/또는 디스크 세포에서 또는 연골 및/또는 디스크 세포를 포함하는 조직에서 기질 합성, 선택적으로 프로테오글리칸 합성 및/또는 콜라겐 Ⅱ 합성을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 연골 및/또는 디스크 세포를 상기에 기술된 바와 같이 분리된 폴리펩타이드, 상기 분리된 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 세포 및/또는 조성물의 유효량으로 프로테오글리칸 합성을 유도하는 조건들 하에서 배양하여, 증가된 기질 합성을 가진 유도된 연골 및/또는 디스크 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 방법을 포함한다.
기질 합성은 실시예들에서 기술된 바와 같이 예를 들면 프로테오글리칸 및/또는 콜라겐 Ⅱ 합성을 평가하여 측정될 수 있다.
한 가지 구현예에서 방법은 증가된 기질 합성으로 세포 또는 조직을 생산하도록 시험관내에서 세포 배양, 선택적으로 디스크 기관 배양으로 시행된다.
한 가지 구현예에서, 세포 및/또는 조직은 연골을 생산하는 조건들 하에서 접촉시키고, 선택적으로 연골 이식에 사용하기 위해 시행된다.
한 가지 구현예에서, 연골 세포는 연골세포 (chondrocyte)이다. 한 가지 구현예에서, 디스크 세포는 AP 세포 선택적으로 iAP 세포이다. 또 다른 구현예에서, 디스크 세포는 NP 세포이다. 다른 구현예에서, 예로 AP 및 NP를 포함하는 세포들의 혼합된 집단이 사용된다. 한 가지 구현예에서, 조직은 연골 계통 세포들을 포함한다. 한 가지 구현예에서, 조직은 AP 및/또는NP 계열 세포들을 포함한다.
한 가지 구현예에서, 재조합 세포는 본 명세서에서 기술된 분리된 폴리펩타이드를 발현하는 MSC이다.
한 가지 구현예에서, 연골 세포, 디스크 세포 및/또는 조직은 개체 내에 존재하고, 접촉시키는 단계는 개체에게 본 명세서에서 기술된 분리된 폴리펩타이드, 재조합 세포 또는 상기 조성물을 투여하는 것에 의해 시행된다.
한 가지 구현예에서, 유도된 연골 및/또는 디스크 세포는 개체 내로 도입된다.
한 가지 구현예에서, 연골 세포 및/또는 디스크 세포는 시험관내에서 처리된 자가유래 세포이다. 예를 들면, 모자이크 성형술로 작고 종종 원형의 (4 내지 8 mm) 자가 이식물들이, 예를 들면 무릎의 무게-미유지 부위들로부터 채취된다. 한 가지 구현예에서, 링크 N은 자가유래 이식물을 채취하기 이전 및/또는 이를 재도입할 때 복구를 촉진하려고 주사되거나 투여된다. 예를 들면 이것은 수확 부위를 복구하도록 도울 수 있고/거나, 이식 부위를 치료하는 것은 이식물 주변 및 이식물이 채취된 부위에서 복구를 촉진시킬 수 있다.
또 다른 관점은 개체 내로 이식하기 위한 연골 및/또는 디스크 조직을 생산하는 방법으로서, 연골 및/또는 디스크 세포를 상기에 기술된 바와 같이 분리된 폴리펩타이드, 상기 분리된 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 세포 및/또는 조성물의 유효량으로 프로테오글리칸 합성을 유도하는 조건들 하에서 배양하는/세포 배양하는 단계; 증가된 기질 합성, 선택적으로 증가된 프로테오글리칸 합성을 가진 유도된 연골 및/또는 디스크 세포를 생산하는 단계; 및 유도된 연골 및/또는 디스크 세포들의 실질적으로 순수한 집단을 분리하는 단계;를 포함하는, 방법을 포함한다.
한 가지 구현예에서, 기질은 연골성 기질을 포함한다. 한 가지 구현예에서, 연골성 기질은 프로테오글리칸 및/또는 콜라겐, 예를 들면 콜라겐 Ⅱ를 포함한다.
한 가지 구현예에서 프로테오글리칸 합성은 아그레칸이다.
한 가지 구현예에서, 연골 및/또는 디스크 세포는 실시예들에 기술된 바와 같이 예를 들면 알기네이트 스캐폴드와 같은 스캐폴드를 포함하는3D 배양으로 배양된다.
한 가지 구현예에서 유도된 연골 및/또는 디스크 세포는 개체 내에 이식된다.
한 가지 구현예에서 대략 0.5 마이크로그램/mL이 예를 들면 세포 배양에 및/또는 투여를 위해 사용된다. 또 다른 구현예에서, 약 0.5 마이크로그램/mL 내지 약 10 mg/mL, 선택적으로 약 10 마이크로그램/mL, 약 100 마이크로그램/mL, 약 1000 마이크로그램/mL, 약 2 밀리그램/mL, 약 3 밀리그램/mL, 약 4 밀리그램/mL, 약 5 밀리그램/mL, 약 6 밀리그램/mL, 약 7 밀리그램/mL, 약 8 밀리그램/mL, 약 9 밀리그램/mL 또는 약 10 밀리그램/mL이 사용된다. 한 가지 구현예에서, 용량은 약 10 mg까지 0.5 마이크로그램의 임의의 10 마이크로그램/mL 증가분이다. 한 가지 구현예에서, 양은 무게/부피이다. 한 가지 구현예에서, 주사를 통해 양이 투여된다. 예를 들면, 한 가지 구현예에서, 약 1 mg까지의 양이 요추 디스크를 통해 주사되거나 약 1 mg까지의 양이 관절을 통해 도입된다.
다른 관점은 연골 및/또는 디스크 조직 병리와 연관된 증상을 완화하고/거나 이를 치료하는 방법으로서, 본 명세서에서 기술된 분리된 폴리펩타이드, 재조합 세포, 유도된 연골 및/또는 디스크 세포 및/또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
한 가지 구현예에서, 증상은 통증이다. 도면들 27 내지 30에서 도시된 바와 같이, IVD에서 NGF 발현은 NP 및 AF 세포들 둘 다의 퇴화로 증가하고 링크 N은 AF 세포들 에서 뉴트로핀들 (NGF, BDNF) 및 물질 P (TAC1)의 TNF 알파 유도성 유전자 발현을 억제할 수 있다. 도 29는 링크 N이 AF 세포들 에서 뉴트로핀들 (NGF, BDNF) 및 물질 P (TAC1)의 IL-1베타 유도성 발현을 억제하는 점을 보여준다. 뉴트로핀들, 및 물질 P는 통증의 매개인자들이다.
한 가지 구현예에서, 연골 및/또는 디스크 조직 병리는 추간판 퇴화이다. 한 가지 구현예에서, 추간판 퇴화는 초기 단계이다. 예를 들면 초기 단계 디스크 퇴화는 톰슨 등급 1, 2 및/또는3의 퇴화를 포함하거나, 선택적으로 예를 들면 MRI와 같은 촬영 시 결정가능한 바와 같이 AF가 실질적으로 무변화 (intact)인 동안을 포함한다. 후기 단계 디스크 퇴화는 예를 들면 톰슨 등급 4, 톰슨 등급 5 이상의 퇴화 및/또는 융합이 일어나는 지점을 포함할 수 있다. 예를 들면 본 명세서에서 기술된 산물들 및 방법들은 융합 이후에 인접한 디스크 퇴화를 치료하고/거나 예방하는 데 사용될 수 있다.
민감한 및/또는 정량적인 MRI 방법들이 본 명세서에서 기술된 치료를 받는데 적합한 개체들을 선별하는 데 사용될 수 있다. 한 가지 구현예에서, 치료는 퇴화를 복구하고/거나 지연시키도록 예방적으로, 예로 검출가능한 퇴화 이후이지만 통증이 있는 퇴화 디스크 이전에 투여된다.
한 가지 구현예에서, 개체는 감소된 세포 밀도 및/또는 대사적 활성을 가지고, 선택적으로 감소된 세포 밀도 및/또는 대사적 활성은 연령으로 인한다.
한 가지 구현예에서, 연골 및/또는 디스크 조직 병리는 관절염, 바람직하지 않은 골생성 및/또는 석회화로부터 선택되는 염증성 또는 퇴행성 관절 질환이다.
한 가지 구현예에서, 관절염은 골관절염이다.
또 다른 구현예에서, 관절염은 류마티스 관절염이다.
한 가지 구현예에서, 연골 및/또는 디스크 조직 병리는 골다공증이다. 한 가지 구현예에서, 연골 및/또는 디스크 조직은 골용해 (osteolysis)이다.
한 가지 구현예에서, 연골 및/또는 디스크 조직 병리는 기계적인 손상이다.
한 가지 구현예에서, 개체는 포유동물이고, 선택적으로 인간, 말, 소, 염소 또는 개로부터 선택된다.
BMP 수용체 Ⅱ 발현의 손실이 내피 염증을 초래하는 것으로 확인되었고, 죽상 동맥경화증이 마우스 모델이다. 링크 N은 BMP 제 Ⅱ형 수용체와 결합하는 것으로 관찰되었고 본 명세서에서 NF카파B 활성화를 저해하는 것으로 관찰된다. 이에 따라 다른 관점은 증상을 완화시키고/거나 내피 염증 및/또는 죽상 동맥경화증을 가진 개체를 치료하는 방법으로서, 본 명세서에서 기술된 분리된 링크 N 단편 폴리펩타이드, 재조합 세포, 유도된 연골 및/또는 디스크 세포 및/또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이다.
한 가지 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드, 재조합 세포 및/또는 약제학적 조성물은 스캐폴드로 개체에게 투여된다.
분리된 링크 N 폴리펩타이드, 재조합 세포, 유도된 세포 또는 약제학적 조성물은 개체에게 피하를 통해 및/또는 조직 병리 부위에 또는 근처로 투여될 수 있다. 디스크 조직 병리들의 경우, 분리된 링크 N 단편 폴리펩타이드, 재조합 세포 및/또는 유도된 세포들이 디스크내 주사, 예를 들면 NP, AF, 선택적으로 내부 AF 내로 주사에 의해 개체에게 투여되거나, 이식되거나, 이식될 수 있다. 관절 병리들의 경우, 분리된 링크 N 단편 폴리펩타이드, 재조합 세포 및/또는 유도된 세포들이 침범된 부위 내로 주사하여 개체에게 투여되거나, 이식되거나, 이식될 수 있다. 일정 구현예들에서, 예를 들면 모자이크 성형술에서 시행된 바와 같이 자가유래 세포들 및/또는 조직들은 기술된 바와 같이 절개되고, 처리되어 재이식된다.
한 가지 구현예에서, 분리된 링크 N 단편 폴리펩타이드, 재조합 세포 및/또는 유도된 세포들은 윤활액 내로 주사하여 개체에게 투여되거나, 이식되거나, 이식될 수 있다. 한 가지 구현예에서, 개체가 예를 들면 손상들을 복구하도록 이식 스캐폴드를 가지는 경우, 투여는 포매된 이식 스캐폴드 내로의 주사/도입에 의해 진행될 수 있다.
한 가지 구현예에서, 연골세포들 및/또는 MSC 및/또는 유도된 세포들을 포함하는 기존의 생체외 스캐폴드는 본 명세서에서 기술된 분리된 링크 N 폴리펩타이드들, 링크 N 단편 산물들을 포함하는 조성물들로 더 포화될 수 있다. 다음으로 스캐폴드는 이를 필요로 하는 개체 내로 주사될 수 있다.
디스크 및 연골 복구는 세포외 기질 생산을 최대화하도록 중간엽 MSC 및 링크 N 보충에 의해 증진될 수 있다.
한 가지 구현예에서, 분리된 링크 N 단편 폴리펩타이드, 재조합 세포, 유도된 세포 및/또는 전술 내용의 하나 이상을 포함하는 조성물은 디스크 손상을 복구하는 데 사용된다. 자연적인 디스크 퇴화는 틈새들의 생성이 관여할 수 있다. 이러한 손상을 복구하기 위하여, 링크 N 단편들 및 줄기세포들이 손상들을 충전시키고 도입된 제제들의 일정한 분포를 허용할 중합가능한 스캐폴드에 이식될 수 있다.
다른 구현예에서, 분리된 폴리펩타이드 또는 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 조합 요법으로 투여된다.
한 가지 구현예에서, 개체는 이식물을 받았고 선택적으로 본 명세서에서 기술된 바와 같이 치료되거나 미치료된다. 개체는 예를 들면 프로테오글리칸 생산을 증가시키도록 본 명세서에서 기술된 폴리펩타이드가 투여된다.
한 가지 구현예에서, 방법은 본 명세서에서 기술된 분리된 폴리펩타이드, 재조합 세포 또는 조성물과 조합으로 세포 또는 조직을 MSC와 접촉시키는 단계 또는 MSC를 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 발명은 일반적으로 본 출원을 기술한다. 보다 완벽한 이해는 다음의 특정한 실시예들을 참고하여 획득될 수 있다. 이들 실시예들은 단지 설명의 목적으로 기술되고 본 출원의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 동등물들의 형식 및 치환으로의 변화들은 상황들이 방편을 제시하거나 만들 수 있을 때 고려된다. 본 명세서에서 특정한 용어들이 사용되지 않았더라도, 이러한 용어들은 설명적인 의미이고 제한의 목적들로 의도되지 않는다.

본 발명의 구현예는 지금 다음의 도면들과 관련하여 기술될 것이다:
도 1은 소 또는 인간 디스크 세포들에 의한 프로테오글리칸 합성을 나타낸 것이다. 합성은 링크 N (1 μg/mL), 혼합된 (scrambled) S-링크 N (1 ug/mL), 역전된 R-링크 N (1 ug/mL) 또는 펩타이드 보충이 없는 배지의 존재 시 48시간 이후에 ³⁵SO₄도입을 측정하여 추정되었다. 상대적 프로테오글리칸 발현은 소의 수핵 (NP) 및 섬유태 (AF) 세포들 (a), 그리고 인간 수핵 (NP) 및 내부 섬유태 (iAF) 세포들 (b)에서 관찰된다. 데이타는 배지 단독 (n = 3)에 노출된 대조군 세포들에 의한 도입과 대비한 평균 +SD의 비율로서 표현된다. p≤ 0.05 (*)인 수치들이 유의한 것으로 고려되었다.
도 2는 배양 배지에서 링크 N의 안정성을 나타낸 것이다. 링크 N은 배양 배지로 37℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 배양되었고, 미가공 펩타이드의 피크 강도가 량 분광분석법에 의해 추적되었다. 분량들이 6, 12, 24, 36 및 48시간대에서 분석되었다. 데이타는 0 시간대에 신호 강도와 대비한 비율로서 좌표화된다. 좌표는 3번의 대표적 실험들 중 하나이다.
도 3은 세포들의 존재 시 링크 N의 안정성을 나타낸 것이다. 링크 N은 인간 NP (a) 또는 AF (b)의 존재 시 37℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 배양되었고, 미가공 펩타이드의 피크 강도가 질량 분광분석법에 의해 추적되었다. 분량들이 6, 12, 24, 36 및 48시간대에서 분석되었다. 데이타는 0 시간대에 신호 강도와 대비한 비율로서 좌표화된다. 좌표는 3명의 서로 다른 공여자들로부터 얻은 세포들로 시행된 3번의 대표적 실험들 중 하나이다.
도 4는 프로세싱된 링크 N의 질량 분광분석법을 나타낸 것이다. (a) 펩타이드들의 질량 스펙트럼이 인간 NP (검정색) 및 AF (회색) 세포들로부터 얻은 배지에서 검출되었다. 964.4 Da의 질량을 가진 단편화된 링크 N이 그래프에 표시된다. 964.4 Da 펩타이드는 컬럼의 2가지 다른 영역들로부터 약 23 및 32분의 보유 시간을 가지고 용출되었다. (b) 964.4 Da의 2가지 가능한 링크 N 단편들, 링크 N 1-8 (진한 회색으로 강조됨) 및 링크 N 4-11 (옅은 회색으로 강조됨)이 모식적 도시이다. (c) 생성된 964.4 Da 단편의 아미노산 서열은 일렬 (tandem) MS에 의해 확인되었다. 서열은 펩타이드의 생성된 단편화 산물들을 평가하여 입증되었다. 주요 검출된 피크들은 A [(845.3Da) DHLSDNY (서열번호 19)(+1)], B [(682.28Da) DHLSDN (서열번호 20)(+1)] 및 C [(568.2Da) DHLSD (서열번호 21)(+1)], 1-8 서열에 의해 단지 생성될 수 있는 질량들이다.
도 5는 링크 N 단편들과 반응한 소 및 인간 세포들에 의한 프로테오글리칸 합성을 나타낸 것이다. 합성은 링크 N (1 ug/mL), 링크 N 1-8 (0.5 ug/mL), 링크 N 9-16 (0.5 ug/mL) 또는 펩타이드 보충이 없는 배지의 존재 시 48시간 이후에 ³⁵SO₄도입을 측정하여 추정되었다. 상대적 프로테오글리칸 발현은 소의 수핵 (NP) 및 섬유태 (AF) (a), 그리고 인간 수핵 (NP) 및 내부 섬유태 (iAF) 세포들 (b)에서 관찰된다. 데이타는 배지 단독 (n = 3)에 노출된 대조군 세포들에 의한 도입과 대비한 평균 + SD의 비율로서 표현된다. p≤ 0.05 (*)인 수치들이 유의한 것으로 고려되었다.
도 6은 디스크 퇴화에 관여하는 것으로 기술된 프로테아제들에 링크 1-16의 노출을 나타낸 것이다. 링크 1-16은 MMP들 3, 7, 12, 13, 카텝신들 L, K, 및 B, ADAMTS 4, 5 및 HTRA1에 노출되었고, 피크 면적 강도는 질량 분광분석법을 사용하여 정량되었다. A, 미가공 링크 N 1-16 펩타이드의 상대적 강도. B, 링크 N 1-8 펩타이드의 상대적 강도. C, 링크 N 9-16 펩타이드의 상대적 강도.
도 7은 염증 환경에서 링크 N 단편들과 반응하여 소 및 인간 세포들에 의한 프로테오글리칸 합성을 나타낸 것이다. 합성은 링크 N (1 ug/mL), 링크 N 1-8 (0.5 ug/mL), 링크 N 9-16 (0.5 ug/mL) 또는 펩타이드 보충이 없는 배지로 보충된 IL-1-포함 배지에서 48시간 이후에 ³⁵SO₄도입을 측정하여 추정되었다. 상대적 프로테오글리칸 발현은 소의 수핵 (NP) 및 섬유태 (AF) (A), 그리고 인간 수핵 (NP) 및 내부 섬유태 (iAF) 세포들 (B)에서 관찰된다. 데이타는 IL-1-포함 배지 (n = 3)에 노출된 세포들에 의해 생산된 프로테오글리칸과 비교한 평균 + SD의 비율로서 표현된다. p≤ 0.05 (*)인 수치들이 유의한 것으로 고려되었다.
도 8은 염증 환경에서 링크 N과 반응한 인간 골관절염 (OA) 연골에서 프로테오글리칸 (GAG) 농도를 나타낸 것이다. 프로테오글리칸 농도들은 링크 N (1 ug/ml), IL-1-포함 배지 (5 ng/ml), 링크 N 및 IL-1에 공동-노출된 배지, 또는 펩타이드 보충이 없는 배지 (대조군)로 21일 동안 배양된 OA 연골 이식물들에서 결정되었다. 결과들은 대조군으로 정상화된 연골에 보유된 GAG의 백분율로서 표현된다. p≤ 0.05 (*)인 수치들이 유의한 것으로 고려되었다.
도 9는 인간 골관절염 연골에서 아그레칸 코아 단백질 및 새로이 합성된 제 Ⅱ형 콜라겐의 분석을 나타낸 것이다. (A) 대조군, 링크 N, IL-1 그리고 링크 N 및 IL-1 둘 다로 처리된 연골에서 아그레칸 (AGG) 코아 단백질의 면역블럿팅 또한 약 320 kDa의 분자량을 가진 미가공 아그레칸 코아 단백질의 반-정량적인 분석. (B) 대조군, 링크 N, IL-1 그리고 링크 N 및 IL-1 둘 다로 처리된 연골에서 제 Ⅱ형 콜라겐 (Col Ⅱ)의 면역블럿팅 또한 약 360 kDa의 분자량을 가진 콜라겐의 반-정량적인 분석. 결과들은 서로 다른 공여자들로부터 얻은 4가지 연골 시료들의 평균 ± SD로서 나타낸다 (*p<0.05).
도 10은 인간 골관절염 연골에서 MMP-13 및 제 X형 콜라겐 (Col X) 발현의 분석을 나타낸 것이다. (A) 대조군, 링크 N, IL-1 그리고 링크 N 및 IL-1 둘 다로 처리된 연골에서 MMP-13의 면역블럿팅 또한 55 kDa의 분자량을 가진 MMP-13 단백질의 반-정량적인 분석. (B) 대조군, 링크 N, IL-1 그리고 링크 N 및 IL-1 둘 다로 처리된 연골에서 제 X형 콜라겐의 면역블럿팅 또한 60 kDa의 분자량을 가진 콜라겐 알파 사슬들의 반-정량적인 분석. 결과들은 서로 다른 공여자들로부터 얻은 4가지 연골 시료들의 평균 ± SD로서 나타낸다 (*p<0.05).
도 11은 염증 환경에서 링크 N으로 보충된 OA 및 정상 공여자들로부터 얻은 연골세포들에서 NFkB의 분석을 나타낸 것이다. 대조군, 링크 N 처리된, IL-1 처리된, 링크 N (10 ng/ml) + IL-1, 링크 N (100 ng/ml) + IL-1 및 링크 N (1000 ng/ml) + IL-1로 처리된 연골세포들에서 NFkB의 웨스턴블럿 분석을 나타낸다. 결과들은 서로 다른 공여자들로부터 얻은 3번의 실험들의 평균 ± SD로서 나타낸다 (*p<0.05). 결과들은 정상 인간 연골세포들 (A) 및 OA 연골세포들 (B)에서 IL-1 유도성 NF-kB의 활성화가 링크 N에 의해 의존적으로 억제되는 것을 설명한다.
도 12는 디스크들에서 프로테오글리칸 농도를 나타낸 것이다. 프로테오글리칸 농도들은 유도성 퇴화를 가진 디스크들, 링크 N, MSC들, 링크 N 및 MSC들 둘 다로 처리된 디스크들, 그리고 미퇴화 대조군 디스크들에서 결정되었다. 결과들은 서로 다른 소 꼬리들로부터 얻은 7가지 디스크들의 평균 ± SD로서 나타낸다 (*p<0.05).
도 13은 디스크들에서 프로테오글리칸들의 크기 분포를 나타낸 것이다. 서로 다른 처리들을 거친 7가지 디스크들로부터 분리된 프로테오글리칸이 풀로 만들어졌고 아가로스젤 전기영동에 의해 분석되었다. 프로테오글리칸은 톨루이딘블루 염색에 의해 관찰되었다.
도 14는 디스크들에서 아그레칸 코아 단백질의 분석을 나타낸 것이다. 퇴화 대조군, 링크 N 처리된, MSC들 처리된, 링크 N 및 MSC들 둘 다 처리된, 및 무퇴화 대조군 디스크들에서 320 kDa의 분자량을 가진 미가공 아그레칸 코아 단백질의 면역블럿팅 및 반-정량적인 분석을 나타낸다. 결과들은 서로 다른 소 꼬리들로부터 얻은 7가지 디스크들의 평균 ± SD로서 나타낸다 (*p<0.05).
도 15는 디스크들에서 새로이 합성된 제 Ⅱ형 콜라겐의 분석을 나타낸 것이다. 퇴화 대조군, 링크 N 처리된, MSC들 처리된, 링크 N 및 MSC들 둘 다 처리된, 및 무퇴화 대조군 디스크들에서 120 kDa의 분자량을 가진 제 Ⅱ형 콜라겐 알파 사슬들의 면역블럿팅 및 반-정량적인 분석을 나타낸다. 결과들은 서로 다른 소 꼬리들로부터 얻은 7가지 디스크들의 평균 ± SD로서 나타낸다 (*p<0.05).
도 16은 디스크들의 수핵 부위에서 프로테오글리칸 분포를 나타낸 것이다. 트립신-유도성 퇴화를 가진 디스크들은 링크 N, MSC 또는 링크 N 및 MSC들과의 주사 이후에 14일 동안 배양되었다. 이들은 퇴화 대조군 및 미퇴화 대조군 디스크들과 비교되었다. 디스크들은 사프라닌 O 염색을 사용한 조직학에 의해 측정되었다 (척도 막대, 100 um).
도 17은 MSC들의 표지화 및 추적을 나타낸 것이다. A. MSC 세포막은 PKH67 키트 (녹색 형광, 화살표)를 사용하여 표지되었고, 표지화 효율은 형광 현미경법을 사용하여 평가되었다. B. 표지된 MSC들은 증식 배지에서 2일 동안 배양되었고 지속된 표지는 형광현미경법을 사용하여 확인되었다. C. 표지된 MSC들의 존재는 기관 배양 14일 이후에 NP 부위에서 결정되었다. D. C의 확대.
도 18은 트립신-유도성 퇴화 이후 2주째 소의 디스크 기관 배양에서 프로테오글리칸 합성, 아그레칸 및 제 Ⅱ형 콜라겐 발현에 미치는 링크 N 1-8의 효과를 나타낸 것이다. (A) 디스크들에서 프로테오글리칸 농도는 유도성 퇴화를 가진 디스크들, 유도성 퇴화를 가지고 링크 N 1-8로 처리된 디스크들, 및 미퇴화 대조군 디스크들에서 처리 이후 2주째 결정되었다. 결과들은 서로 다른 소 꼬리들로부터 얻은 3가지 디스크들의 평균 ± SD로서 나타낸다 (*p<0.05). (B) 유도성 퇴화를 가진 디스크들, 유도성 퇴화를 가지고 링크 N 1-8로 처리된 디스크들, 미퇴화 대조군 디스크들 및 링크 N 1-8로 처리된 미퇴화 디스크들에서 처리 이후 2주째 약 360 kDa의 분자량을 가진 새로이 합성된 제 Ⅱ형 콜라겐의 면역블럿팅 및 반-정량적 분석을 나타낸다. 결과들은 서로 다른 소 꼬리들로부터 얻은 7가지 디스크들의 평균 ± SD로서 나타낸다 (*p<0.05). (C) 유도성 퇴화를 가진 디스크들, 유도성 퇴화를 가지고 링크 N 1-8로 처리된 디스크들, 미퇴화 대조군 디스크들 및 링크 N 1-8로 처리된 미퇴화 디스크들에서 처리 이후 2주째 약 320 kDa의 분자량을 가진 미가공 아그레칸 코아 단백질의 면역블럿팅 및 반-정량적 분석을 나타낸다. 결과들은 서로 다른 소 꼬리들로부터 얻은 7가지 디스크들의 평균 ± SD로서 나타낸다 (*p<0.05).
도 19는 아그레칸 G1 도메인 및 하이알루로네이트 간의 상호작용을 안정화시키는 링크 단백질 (LP)의 모식적 도시를 나타낸 것이다. 링크 단백질 (LP)는 아그레칸 G1 도메인 및 하이알루로네이트 (HA) 간의 상호작용을 안정화시킨다. 도면은 인간 링크 N [DHLSDNYTLDLDRAIH (서열번호 32)] 및 소 링크 N [DHHSDNYTVDHDRVIH (서열번호 5)], 링크 단백질의 N-말단 부분들도 역시 나타내고, 소의 서열에서 발생기는 바와 같이 잔기들의 치환을 강조한다 (굵게 표시됨).
도 20은 인간 또는 소의 링크 N으로 보충된 알기네이트에서 배양된 소의 추간판 세포들의 세포 생존도를 나타낸 것이다. 세포 생존도는 LIVE/DEAD ® 생존도/세포독성 검정법을 사용하여 측정되었다. 알기네이트에 포매된 소의 추간판 (IVD) 세포들은 1ug/ml 소 (BLN) 또는 인간 (HLN) 링크 N 둘 중 하나로 보충된 배지에서 18일 동안 배양되었다. 동일한 기간 동안 배지 단독에서 배양된 비드들이 대조군 (CTL)으로서 사용되었다. 18일 이후에, 비드들이 수확되었고 세포 생존도가 평가되었다. 모든 비드들의 세포 생존도는 > 98%에서 평가되었다 (밝은 흰색 점들).
도 21은 1.2% 알기네이트에서 비드화된 수핵 소 세포들에 의한 배양 배지 내로 누적 글리코사미노글리칸 방출을 나타낸 것이다. 1.2% 알기네이트에서 비드화된 수핵 (NP) 소 세포들은 소 (BLN) 또는 인간 (HLN) 링크 N (1 ug/ml) 둘 중 하나가 보충된 또는 배지 단독에 노출된 (CTL) 배지로 배양되었다. 각 조건의 경우, 배지들이 배양 3, 6, 9, 12, 15, 및 18일째 수집되었다. 배지 내로 설페이트 글리코사미노글리칸 (GAG) 방출은 1,9-디메틸메틸렌블루 (DMMB) 염료-결합 검정법에 의해 측정되었다. 결과들은 박스 좌표로서 표시되고, 박스는 3벌로 수행된 3번의 독립적인 실험들의 조합된 데이타의 중간 50% (25% - 75% 백분율)를 나타낸다 (*p < 0.05 또는 ***p < 0.0001).
도 22는 1.2% 알기네이트에서 비드화된 섬유태 소 세포들에 의한 배양 배지 내로 누적 글리코사미노글리칸 방출을 나타낸 것이다. 1.2% 알기네이트에서 비드화된 섬유태 (AF) 소 세포들은 소 (BLN) 또는 인간 (HLN) 링크 N (1 ug/ml) 둘 중 하나가 보충된 또는 배지 단독에 노출된 (CTL) 배지로 배양되었다. 각 조건의 경우, 배지들이 배양 3, 6, 9, 12, 15, 및 18일째 수집되었다. 배지 내로 설페이트 글리코사미노글리칸 (GAG) 방출은 1,9-디메틸메틸렌블루 (DMMB) 염료-결합 검정법에 의해 측정되었다. 결과들은 박스 좌표로서 표시되고, 박스는 3벌로 수행된 3번의 독립적인 실험들의 조합된 데이타의 중간 50% (25% - 75% 백분율)를 나타낸다 (*p < 0.05 또는 ***p < 0.0001).
도 23은 아그레칸 유전자 발현의 변화들을 나타낸 것이다. 1 ug/ml 소 (BLN) 또는 인간 링크 N (HLN) 둘 중 하나가 보충된 배지로 배양 이후 1주째 1.2% 알기네이트에서 비드화된 섬유태 (AF) 및 수핵 (NP) 소 세포들의 아그레칸 (AGG) 유전자 발현의 변화들을 나타낸다. 유전자 발현은 RT-PCR에 의해 측정되었다. 18S rRNA는 살림 유전자로서 사용되었고 결과들을 정상화하였다. 수치들은 배지 단독에 노출된 세포 (CTL)와 비교하여 링크 N에 노출된 세포들의 유전자 발현의 비율로서 표현된다 (*p < 0.05, **p < 0.001).
도 24는 아그레칸 ADAMTS-4 및 ADAMTS-5 유전자 발현의 변화들을 나타낸 것이다. 1 ug/ml 소 (BLN) 또는 인간 링크 N (HLN) 둘 중 하나가 보충된 배지에서 배양 이후 1주 및 2주째 1.2% 알기네이트에서 비드화된 섬유태 (AF) 및 수핵 (NP) 소 세포들의 (A, B) ADAMTS-4 및 (C, D) ADAMTS-5 유전자 발현의 변화들을 나타낸다. 유전자 발현은 RT-PCR에 의해 측정되었다. 18S rRNA는 살림 유전자로서 사용되었고 결과들을 정상화하였다. 수치들은 배지 단독에 노출된 세포 (CTL)와 비교하여 링크 N에 노출된 세포들의 유전자 발현의 비율로서 표현된다 (*p < 0.05, **p < 0.001).
도 25는 섬유태 및 수핵 소 세포들에서 Smad1/5 활성화에 미치는 소 또는 인간 링크 N의 효과를 나타낸 것이다. 소의 섬유태 (AF) 및 수핵 (NP) 세포들이 1 ug/ml의 소 (BLN) 또는 인간 링크 N (HLN) 둘 중 하나가 보충된 배지에서 6시간 동안 배양되었다. 단백질 발현은 전체 Smad1 및 포스포-Smad1/5에 대한 특이 항체들을 사용한 면역블럿팅에 의해 분석되었다. 3벌로 수행된 3번의 독립적인 실험들의 조합된 데이타를 도시한 정량적인 결과들이 평균 ± 표준 편차로서 표시된다 (*p<0.05; **p<0.01; ⁺p<0.001; ^§p < 0.0001). 젤들 상의 밴드들은 1번의 대표적인 실험의 경우를 보여준다.
도 26은 소의 섬유태 및 수핵 세포들에서 Smad2 활성화에 미치는 소 또는 인간 링크 N의 효과를 나타낸 것이다. 섬유태 (AF) 및 수핵 (NP) 소 세포들은 1 ug/ml의 소 (BLN) 또는 인간 링크 N (HLN) 둘 중 하나가 보충된 배지에서 6시간 동안 배양되었다. 단백질 발현은 전체 및 포스포-Smad1/5에 대한 특이 항체들을 사용한 면역블럿팅에 의해 분석되었다. 3벌로 수행된 3번의 독립적인 실험들의 조합된 데이타를 도시한 정량적인 결과들이 평균 ± 표준 편차로서 표시된다 (*p<0.05). 젤들 상의 밴드들은 1번의 대표적인 실험의 경우를 보여준다.
도 27은 퇴화를 가진 등급 2부터 등급 4까지의 인간 디스크들 (AF 및 NP 부위들)에서 NGF 발현을 나타낸 것이다. 도면은 인간 IVD에서 NGF 발현이 퇴화와 함께 증가하는 점을 보여주는 일련의 조직 염색들 및 면역블럿이다.
도 28은 링크 N이 섬유태 (AF) 세포에서 뉴로트로핀 (NGF 및 BDNF) 및 물질 P (TAC1)의 TNFα 자극성 발현을 억제하는 점을 나타낸 것이다. 등급 2의 인간 디스크들로부터 얻은 AF 세포들이 링크 N (1 ug/ml) + TNFα (100ng/ml) 또는 TNFα (100 ng/ml) 단독으로 24시간 동안 자극되었다. 결과들은 4명의 다른 공여자들과 4번의 독립적인 실험들의 평균 ± S.D. 로서 나타낸다. * p<0.05 대비 대조군.
도 29는 링크 N이 섬유태 (AF) 세포에서 뉴로트로핀 (NGF 및 BDNF) 및 물질 P (TAC1)의 IL-1β 자극성 발현을 억제하는 점을 나타낸 것이다. 등급 2의 인간 디스크들로부터 얻은 AF 세포들이 링크 N (1 ug/ml) + IL-1β (10 ng/ml) 또는 IL-1β (10 ng/ml) 단독으로 24시간 동안 자극되었다. 결과들은 4명의 다른 공여자들과 4번의 독립적인 실험들의 평균 ± S.D. 로서 나타낸다. * p<0.05 대비 대조군.
도 30은 링크 N이 뉴로트로핀 (TRKA 및 TRKB) 및 물질 P (TAC1R) 수용체들의 TNFα 자극성 발현을 억제하는 점을 나타낸 것이다. 링크 N (1 ug/ml) + TNFα (100 ng/ml) 또는 TNFα (100 ng/ml) 단독 보충 이후에 24시간 동안 자극된 등급 2의 인간 디스크들로부터 얻은 섬유태 (AF)에 의한 뉴트로핀 및 물질 P 유전자 발현에서 변화들을 나타낸다. 결과들은 4명의 다른 공여자들과 4번의 독립적인 실험들의 평균 ± S.D. 로서 나타낸다. * p<0.05 대비 대조군.
도 31은 링크 N이 뉴로트로핀 (TRKA 및 TRKB) 및 물질 P (TAC1R) 수용체들의 IL-1β 자극성 발현을 억제하는 점을 나타낸 것이다. 링크 N (1 ug/ml) + IL-1β (10 ng/ml) 또는 IL-1β (10 ng/ml) 단독 보충 이후에 24시간 동안 자극된 등급 2의 인간 디스크들로부터 얻은 섬유태 (AF)에 의한 뉴트로핀 및 물질 P 유전자 발현에서 변화들을 나타낸다. 결과들은 4명의 다른 공여자들과 4번의 독립적인 실험들의 평균 ± S.D. 로서 나타낸다. * p<0.05 대비 대조군.
도 32는 링크 N과 배양된 AF 세포들의 배지에서 방출된 NGF 유전자 발현의 분석을 나타낸 것이다. 링크 N, IL-1β, 또는 링크 N 및 IL-1β로 처리된 등급 4의 AF 세포들에서 약 27 kDa의 분자량을 가진 NGF 단백질의 웨스턴블럿들 및 반-정량적인 분석을 나타낸다. 결과들은 서로 다른 공여자들로부터 얻은 4가지 디스크들의 평균 ± SD로서 나타낸다 (* p<0.05).
도 33은 소의 꼬리뼈 IVD의 사진 그리고 링크 N이 손상된 소 IVD로부터 물질 P 방출을 감소시키는 점을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 캡사이신으로 처리되거나 단지 천자되거나 천자 + 링크 N (10 ug/ml) 보충으로 처리된 이후 4 또는 24시간째 소의 디스크들로부터 물질 P 방출에서 변화들을 나타낸다. 결과들은 4번의 독립적인 실험들의 평균 ± S.D. 로서 나타낸다. * p<0.05 대비 대조군.

삭제

다음의 비-제한적인 실시예들은 본 발명을 설명한다.

실시예들

실시예 1

현재까지, 디스크 퇴화로부터 발생하는 등 통증을 예방하거나, 정지시키거나 심지어 지연시키는 확립된 치료들은 전혀 존재하지 않는다. 이전의 연구들이 링크 N이 성장인자로서 작용하고 IVD에서 프로테오글리칸들 및 콜라겐들의 합성을 촉진할 수 있는 점을 보여주었다. 그러나, 세포성 활동을 조정하는 데 관여하는 링크 N의 서열들은 잘 이해되지 않고 있다. 디스크 세포들이 단백질분해로 링크 N을 프로세싱하는지 여부를 결정하기 위하여, 인간 디스크 세포들이 48시간 이상 동안 미가공 링크 N에 노출되었다. 하기에 더 기술되는 바와 같이, 질량 분광분석법은 잔기들 1번 내지 8번을 연장시킨 펩타이드가 NP 세포들이 아닌 AF 세포들의 존재 시 생성되었던 점을 보여주었다. 링크 N 1-8은 IL-1β NP 및 AF 세포들의 존재 시 프로테오글리칸 생산을 유의하게 유도하였고, 생물학적 효과가 펩타이드의 첫 8개 아미노산들에서 유지되는 점을 입증하며 효과가 염증 환경에서 지속되는 점을 가리킨다.

세포 활성을 조정하는 데 있어 링크 N의 독특한 효과들은 서열 및/또는 모티브 특이적 상호작용을 제시한다. 그러나, 링크 N이 생물학적 시스템에서 안정한지 여부는 덜 분명하다. 생물학적 시스템에서 링크 N의 운명도 역시 연구되었다.

방법 및 재료

재료

프로나제는 칼바이오켐사 (Calbiochem, 독일 다름스타트)로부터 얻었다. 콜라게나제 1A, GlutaMAX, NaCl 및 포름산은 시그마사 (Sigma, 미국 세인트루이스 MO)로부터 구입되었다. 저점도 알기네이트 (Keltone LV)는 켈코 케미칼사 (Kelco Chemical Co., 미국 캘리포니아 샌디에고)로부터 획득되었다. 페니실린/스트렙토마이신, 젠타마이신 설페이트, 암포테리신 B, 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) 및 우태아 혈청 (FCS)은 집코사 (Gibco, 캐나다 온타리오 벌링톤)로부터 획득되었다. 알기네이트 비드들을 만드는 20G 1 1/2 인치 바늘들은 BD 실린지사 (BD syringes, 캐나다 온타리오 콘코드)로부터 획득되었다. HPLC 등급 아세토니트릴은 라스번사 (Rathburn, 스코틀랜드 워커번)로부터 획득되었다. 트립신 골드의 질량 분광분석법 등급은 프로메가사 (Promega, 미국 와이오밍 매디슨)로부터 구입되었다. 통합된 0.2mL 유리-마이크로-인서트, 15 mm 탑을 가진 TopSert, TPX-Short Thread-바이알, 32x11.6은 스칸디나비스카 진텍사 (Skandinaviska GeneTec AB, 스웨덴 Vastra Frolunda)로부터 구입되었다. 비닥 울트라마이크로 스핀® (Vydac UltraMicro Spin®) 실리카 C18 300 Å 컬럼들은 네스트 그룹사 (Nest Group, 미국 MA 사우스보로)로부터 구입되었다. 시퀀싱 등급 카이모트립신은 로슈진단사 (Roche Diagnostics GmbH, 독일 만하임)로부터 구입되었다. ³⁵SO₄, 2 mCi, 안정화된 수용성 용액은 퍼킨 엘머사 (Perkin Elmer, 캐나다 퀴벡 온타리오)로부터 주문되었다. NUNC 6웰 배양 플레이트들은 코닝사 (Corning Inc., 캐나다 앨버타 에드몬튼)로부터 구입되었다. MMP들 3, 7, 12, 13, ADAMTS 4, 5는 R&D 시스템사 (R&D Systems, MN 미네어폴리스)로부터 얻었다. HTRA1는 써모 사이언티픽사 (Thermo Scientific, MA 월탐)로부터 얻었다. 카텝신들 K, B, 및 L는 제공되었다.

링크-N 펩타이드

링크 N, DHLSDNYTLDHDRAIH (서열번호 15); 역방 링크 N, HIARDHDLTYNDSLHD (R-링크 N) (서열번호 16), 혼합된 링크 N, DLNRAHLHIDYHTDSD (S-링크 N) (서열번호 17), 링크-N 첫 번째 8개 펩타이드 잔기들, DHLSDNYT (링크 N 1-8) (서열번호 2), 및 두 번째 8개 펩타이드 잔기들, LDHDRAIH (링크 N 9-16) (서열번호 18)은 캔펩타이드사 (Canpeptide, 캐나다 QC 포인트클레어)에 의해 합성되었다. 혼합된 16개 아미노산 펩타이드 서열은 프랑스 파리 파스퇴르 연구소로부터 나온 생물정보학 도구를 사용하여 설계되었다 (http://mobyle.pasteur.fr). 서열은 고유 펩타이드의 등전점 및 용해도와 같은 링크 N의 전반적인 성질들을 모방하도록 선택되었다. 펩타이드들의 스톡 용액들 (10 mg/mL)은 HEPES가 보충된 DMEM으로 제조되었고, pH는 사용 전 7.4로 조절되었다.

조직들의 출처

인간 흉요부 척추들은 트랜스플랜트 퀘벡 기관공여 프로그램을 통하여 채취되었다. 디스크들은 29.6세의 평균 연령 및 16세 내지 47세의 연령 범위를 가진 7명의 공여자들, 1명의 남성 및 6명의 여성들로부터 획득되었다 (표 1). 최근의 화학요법, 척추로의 방사선조사 요법들, 또는 유의한 장기간의 마비를 겪었던 공여자들은 연구로부터 배제되었다. 척수 채취는 사망 8시간 이내에 수행되었다. 석회화 및 디스크 높이의 감소를 가진 디스크들은 연구에 포함되지 않았다. 모든 절차들은 몬트리얼 종합병원의 연구 리뷰 위원회에 의해 승인받았다.

18 - 27개월령 거세 송아지들로부터 얻은 소 꼬리들이 지역 도살장으로부터 도살 6시간 이내에 획득되었다.

인간 및 소의 IVD 세포들의 분리

인간 및 소의 IVD들은 인접하는 척추체로부터 분리되었고 소의 IVD들의 경우 NP 및 AF로 그리고 인간 IVD들의 경우 NP 및 내부 섬유태 (iAF)로 나뉘었다. 인간 외부 섬유태 (oAF)로부터 얻은 조직은 본 연구에서 세포 분리에 사용되지 않았다. 세포들은 이전에 기술된 바와 같이 각 부위로부터 효소적으로 분리되었다 (63). 간략하게, NP 및 AF 조직들은 대략 2-mm 두께의 조각들로 절개되었고, 50 ug/mL 젠타마이신, 100 ug/mL 페니실린, 100 U 스트렙토마이신 및 0.25 ug/mL 퓨지존을 포함하는 PBS로 2번 세척되었으며, 다음으로 0.2% 프로나제로 1시간 동안 소화되었고, 이어서 무혈청 DMEM에서 NP의 경우 0.01% 그리고 AF 조직의 경우 0.04%의 콜라게나제 제 IA형으로 4시간 동안 처리되었다.

인간 IVD 세포들의 단일층 배양

링크 N의 안정성을 평가하기 위하여, NP 및 AF 부위들로부터 신선하게 분리된 인간 세포들이 6웰 배양 배지에서 웰 당 250,000개 세포들의 밀도로 배양되었다. 세포들은 37℃, 5% CO₂에서 4.5 g/L 포도당을 포함하고 10% FCS, 25 mmol/L HEPES, 50 ug/mL 젠타마이신 설페이트, 0.25 ug/mL 퓨지존, 50 ug/mL L-아스코베이트, 및 2 mmol/L GlutaMAX가 보충된 3 mL DMEM로 배양되었다. 웰들은 링크-N (1 ug/mL)에 노출 이전에 2일 동안 방치되었다. 200 uL 배지가 고정된 시간대들 (0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 36 h, 및 48 h)에서 수집되었다. 펩타이드의 안정성은 세포들의 부재 시에도 역시 동일한 시간대에서 연구되었다.

링크 N의 프로테아제 처리

300 ug의 링크 N 1-16이 10가지 서로 다른 프로테아제들의 존재 시 30분, 2 및 24시간 동안 배양되었다. MMP들 3, 7, 12, 13, ADAMTS 4, 5, HTRA1를 위해 사용된 완충액은 50 mM　트리스-HCl, 200 mM　NaCl, 5 mM　CaCl₂, 0.01% 라피제스트 (Rapigest)로 구성되었다. 카텝신들 K, B, 및 L의 경우, 소화 완충액이 2.5 mM　DTT, 0.15% 콘드로이틴 설페이트 A, 0.1　M　소듐 아세테이트, pH 5.5로 구성되었다.

질량 분광분석법

상기에서 기술된 단일층 배양액들로부터 수집된 25 uL 배지 시료들 또는 펩타이드 소화물들은 C18 스핀 컬럼들 상에서 표준 프로토콜들 (하바드 장치사 (Harvard Apparatus), Holliston, MA)에 따라 정제되었다. 용출된 펩타이드들은 20 uL, 2% 아세토니트릴 및 0.2% 포름산 (FA)에서 재구성되었다. 시료들이 주입되었고 나노-LC 시스템 (써모 사이언티픽사)이 장착된 트리플 쿼드로폴 질량 분광분석기 TSQ Vantage^TM(써모 사이언티픽사, Waltham, MA)를 사용하여 정량되었다. 질량 분광분석기는 SRM 모드에서 Q1 및 Q3 설정들로 단위 해상도 (FWHM 0.7 Da)에서 작동되었다. +1,700 V의 스프레이 전압이 탈용매화를 위해 270℃의 가열된 이온 전달 설정으로 사용되었다. 데이타는 X칼리버 소프트웨어 (버전 2.1)을 사용하여 획득되었다. 사용된 유동 상들은 A (물에서 0.1% FA) 및 B (100% 아세토니트릴에서 0.1% FA)이었다. 분리는 Reprosil-Pur C18-AQ 레진 (3 um, 닥터마이치사 (Dr. Maich GmbH), 스위스)으로 포장된 10 um 팁, 75 um x 15 cm 모세관 컬럼들 (PicoTip^TM emitter, 뉴업젝티스사 (New Objective), MA 워번) 상에서 수행되었다. 1 uL 시료들이 주입되었고 분리는 300 nL/분의 유속으로 5분 동안 97% 유동상 A, 8분 동안 85% A, 42분 동안 65% A, 및 45 내지 50분 동안 19% A의 구배를 사용하여 수행되었다.

링크 N 펩타이드들에 대한 다수 반응들을 모니터링하는 방법 (MRM)이 개발되었고, 최적화되었으며 변위들로부터 얻은 총 피크 면적으로 사용되었다, 링크 1-16 변위들: 641.30(3+)-->863.41 (y7), 641.30-->748.38 (y6), 641.30--> 611.33 (y5) 및 641.30-->682.28 (b6), 링크 1-8 변위들: 964.40 (1+)-->845.43 (b7)-->682.87 (b6)-->568.23 (b5) -->453.20 (b4) -->712.31 (y6) -->849,37 (y7), 링크 9-16 변위들: 488.75 (2+)--> 821.43 (b7) -->708.34 (b6) -->496.30 ((y4) -->611.32 (y5) -->748.38 (y6). MRM 데이터는 스카이라인 1.4 소프트웨어 (MacCoss Lab Software, 워싱턴주 시애틀 와싱톤대학교)를 사용하여 분석되었다.

펩타이드의 임의 단편화를 확인하기 위하여, 발견 실험들이 이전에 기술된 바와 같이 (64), 전기스프레이-이온 포집 질량 분광분석법 (LC ESI MS)으로 역상 액체 크로마토그래피 시스템 온라인 상에 8 uL 시료의 주입에 의해 역시 진행되었다.

3D 스캐폴드들로 IVD 세포들의 배양

다양한 링크 N 펩타이드들과 대사적 반응을 비교하기 위하여, NP 및 AF 부위들로부터 신선하게 분리된 인간 및 소 세포들이 이전에 기술된 바와 같이 (65), 1.2% 알기네이트 비드들 내에 포매되었다. 알기네이트 비드들 내의 세포들은 37℃, 5% CO₂에서 4.5 g/L 포도당을 포함하고 10% FCS, 25 mmol/L HEPES, 50 ug/mL 젠타마이신 설페이트, 0.25 ug/mL 퓨지존, 50 ug/mL L-아스코베이트, 및 2 mmol/L GlutaMAX가 보충된 DMEM으로 배양되었다. 비드들은 7일 동안 안정화되었고, 세포 생존도가 추가 처리 이전에 Live/Dead® 검정법에 의해 평가되었다. 다음으로 웰 당 5개 비드들이 0.5 mL DMEM에 넣은 링크 N (1 ug/mL), R-링크 N (1 ug/mL), S-링크 N (1 ug/mL), 링크 N 1-8 (0.5 ug/mL) 또는 링크 N 9-16 (0.5 ug/mL) 의 등분자 농도들의 존재 시 48웰 플레이트에서 배양되었다. ³⁵SO₄ 가 프로테오글리칸 합성의 평가를 허용하도록 배지에 첨가되었다 (66). 또한, 비드들은 IL-1β (10 ng/mL) 단독, 또는 펩타이드들 및 IL-1β의 조합에 48시간 동안 노출되었다 (51). 배양 기간의 마지막에, 배지가 수집되었고 밀리Q 물에 대하여 18.2 Ω (Spectra/Por^® 3)에서 철저하게 투석되었으며, 임의의 남아 있는 미도입된 ³⁵SO₄를 제거하도록 1 M MgSO₄로 2시간 동안 콜드 체이스가 이어졌다. ³⁵SO₄ 도입은 베타 섬광 계수기 (벡크만 쿨터 계수기 LS6500, 캐나다 벡크만쿨터사 (Beckman Coulter))를 사용하여 측정되었다.

통계학적 분석

원 테일화 쌍 형성된 t-테스트가 수행되었고, 수치들 p≤ 0.05가 유의한 것으로서 고려되었다.

결과

16개 아미노산 링크 N 펩타이드는 분리된 디스크 세포들 및 미가공 인간 디스크들에서 프로테오글리칸 합성을 유도하고, 또한 토끼 디스크 천자 퇴화 모델에서 디스크 높이를 증가시키는 것으로 알려져 있다 (34, 31, 29). 그러나 효과가 엄격하게 서열 의존적인지 여부 또는 펩타이드의 전반적인 성질들로 인한 것인지 여부는 분명하지 않다. 펩타이드의 3가지 변이체들이, 미가공 (링크 N), 역전된 (R-링크 N) 및 혼합된 (S-링크 N)이 이것을 설명하도록 합성되었고, ³⁵SO₄도입이 펩타이드들과 반응한 프로테오글리칸 합성을 평가하는 데 사용되었다. 소 및 인간 NP 및 AF 세포들이 1 ug/mL의 펩타이드들에 48시간 동안 노출되었다. 소 세포들은 링크 N (NP p= 0.03, AF p=0.03)와 반응하여 프로테오글리칸 합성의 통계학적으로 유의한 증가를 보여주었지만, 세포들이 역전된 또는 혼합된 펩타이드들에 노출되었을 때는 효과가 전혀 관찰되지 않았다 (도 1a). 인간 세포들은 미가공 링크 N (NP p=0.008, AF p=0.02)와 반응하여 유의한 증가로 유사한 경향성을 그리고 혼합된 또는 역전된 펩타이드들과는 무반응을 보여주었다 (도 1b). 소 및 인간 AF 세포들 둘 다는 NP 세포들과 비교하여 더욱 강한 반응으로 경향성을 보여주었다.

펩타이드 안정성 또는 유지된 활성은 치료의 지속되는 효과를 입증하기 위하여 중요하다. 따라서, 질량 분광분석법이 용액에서 링크 N의 안정성을 평가하도록 수행되었다. 1922 Da의 분자량을 가진 미가공 링크 N이 배양 배지로 37℃에서 48시간 동안 배양되었고 펩타이드의 강도가 표적화 질량 분광분석법을 사용하여 48시간 동안 정량되었다. 1922 Da 링크 N 펩타이드의 손실은 이러한 기간 동안 전혀 관찰되지 않았으며 (도 2), 펩타이드가 용액에 넣어 37℃에서 안정한 점을 가리킨다.

대사적으로 활성을 가진 세포들 은 짧은 펩타이드들을 프로세싱하는 잠재력을 가지고 이에 의해 가능하게는 그들의 생물학적 효과를 변경시킨다 (67-69). 디스크 세포들이 단백질분해로 링크 N를 프로세싱하는지 여부를 결정하기 위하여, 단일층의 인간 디스크 세포들이 미가공 링크 N에 48시간에 걸쳐서 노출되었고, 1922 Da 펩타이드의 피크 면적 강도가 그의 운명을 평가하기 위하여 정량되었다. 펩타이드는 NP 세포들의 존재 시 적어도 48시간 동안 안정한 것으로 확인되었다 (도 3a). 그러나, 링크 N의 감소가 AF 세포들의 존재 시 6시간까지 검출되었고, 단지 미량들이 48시간 이후에 존재하였으며 (도 3b), AF 세포들이 링크 N 펩타이드를 프로세싱하는 능력을 가지는 점을 보여준다.

링크 N의 프로세싱된 산물들을 확인하기 위하여, 0 내지 1930 Da의 범위를 가지는 질량 스펙트럼에서의 더 짧은 펩타이드들이 분석되었다. NP 및 AF 세포들로부터 얻은 링크 N을 포함하는 배지를 비교할 때, 964.4Da의 질량을 가진 펩타이드가 AF 세포 배양 배지에 축적되는 것은 분명하였다 (도 4a). 동일한 펩타이드가 NP 세포 배양 배지에서는 매우 낮은 수준들로만 존재하였다 (도 4a). 964.4Da 펩타이드는 2가지 서로 다른 보유 시간들에서 컬럼으로부터 용출되었다. 이러한 현상이 때로 관찰되고 높은 농도로부터 결과가 나오는 컬럼 상의 펩타이드 침전으로 인한 것 같다. 아미노산 1-8 또는 4-11를 나타내는 미가공 16개 아미노산 링크 N의 2가지 분리된 부분들은 잠재적으로 이러한 질량의 펩타이드를 생성할 수 있다 (도 4b). 일렬 질량 분광분석법은 잔기들 1번 내지 8번이 연장된 펩타이드가 AF 세포들의 존재 시 생성되지만, 미량이라도 펩타이드 9-16는 전혀 관찰되지 않는 점을 입증하였다 (도 4c).

생물학적 처리를 위해 설계된 펩타이드들의 유지된 활성이 매우 중요하고 AF 세포들에 의한 링크 N의 프로세싱은 잠재적으로 그의 생물학적 효과를 변경시킬 수 있다. 이러한 점을 평가하기 위하여, 아미노산 서열 1-8 (링크 N 1-8) 및 9-16 (링크 N 9-16)에 해당하는 2가지 펩타이드들이 합성되었고 프로테오글리칸 합성에 미치는 그들의 효과가 미가공 인간 링크 N의 효과와 비교되었다. 프로테오글리칸 합성은 ³⁵SO₄ 도입을 사용하여 평가되었고, 소 및 인간 NP 및 AF 세포들은 펩타이드의 등분자 농도들에 48시간 노출되었다. 미가공 펩타이드와 동일한 크기의 통계학적으로 유의한 ³⁵SO₄도입의 증가 (NP p=0.006 및 AF p=0.007)가 소의 세포들이 링크 N 1-8 단독에 노출될 때 관찰되었지만, 효과가 링크 N 9-16으로는 전혀 관찰되지 않았다 (도 5a). 인간 세포들은 링크 1-8과 반응하여 유의한 증가로 유사한 경향성을 보여주었지만 (NP p=0.004 및 AF p=0.01), 링크 N 9-16과 반응은 전혀 없었고, 생물학적 효과는 펩타이드의 첫 8개 아미노산들에서 유지되는 서열에 특이적이다 (도 5b). 소 및 인간 AF 세포들 둘 다는 NP 세포들과 비교하여 더욱 강한 반응을 보여주었다.

링크 1-16를 절단하는 데 작용하는 프로테아제를 결정하기 위하여, 10가지 서로 다른 프로테아제들로의 소화들이 30분, 2 및 24시간 동안 수행되었다. 테스트된 프로테아제들은 MMP들 3, 7, 12, 13, ADAMTS 4, 5, HTRA1, 그리고 카텝신들 K, B, 및 L이었다. 1922 Da, 링크 1-16 펩타이드의 피크 면적 강도는 질량 분광분석법을 사용하여 정량되었다. 피크의 강도는 30분 이후에 이미 유의하게 감소되었고, 카텝신 K와의 2 및 24시간 배양에서 거의 검출가능 하지 않았고, 한편 이것이 MMP들 3, 7, 12, 13, ADAMTS 4, 5, HTRA1, 및 카텝신들 B 및 L에 의해 영향을 받지 않았다 (2시간대는 도 6A에 나타냄). MRM 방법은 m/z 964.4 Da (+1) 링크 1-8이 1922 Da 펩타이드의 강도가 사라지면서 출현하는지 여부를 평가하도록 설정되었다. 방법은 링크 1-8이 카텝신 K에 의해 2시간 이후에 생성되는 점을 입증하였다 (도 6B). 카텝신 K가 아미노산들 8 및 9 간의 절단을 생성하는지 여부 또는 링크 1-16이 잔기들 8-16 부위 내의 여러 부위들에서 프로세싱되는지 여부를 평가하기 위하여, MRM 방법이 m/z 488.75 Da (2+) 링크 9-16 펩타이드를 위해서도 역시 설정되었다. 분석은 2시간 이후에 링크 9-16의 존재를 관찰하였고, 링크 N은 아미노산들 8 및 9 간의 단일 절단에 의해 프로세싱되는 점을 입증하고 있다 (도 6C).

디스크 퇴화는 생체내에서 염증성 사이토카인들의 존재와 밀접하게 연관되고 (51), 미가공 링크 N은 염증 환경에서 동등하게 잘 작용하는 것으로 알려져 있다 (34). 펩타이드들과 반응은 그들의 유익한 효과가 염증 환경에서 유지되는지 여부를 결정하도록 IL-1β의 존재 시 평가되었다. 프로테오글리칸 합성은 ³⁵SO₄ 도입을 사용하여 측정되었다. 링크 N 1-8는 NP 및 AF 세포들에서 IL-1β의 존재 시 미가공 링크 N와 동일한 정도로 프로테오글리칸 생산을 유의하게 유도하였다 (NP p=0.006 및 AF p=0.013) (도 7A). 동일한 경향성은 인간 세포들에서 링크 N 1-8과 유의하게 증가된 반응으로 관찰되었고 (NP p=0.002 및 AF p=0.004) 링크 N 9-16과 반응은 전혀 없었으며 (도 7B), 생물학적 효과는 펩타이드의 첫 8개 아미노산들에서 유지되는 점을 입증하였고 효과가 염증 환경에서 지속되는 점을 가리킨다.

논의

링크 N은 콜라겐 및 프로테오글리칸 합성을 연골세포들 (70), 시험관내 IVD 세포들 및 생체외 미가공 인간 IVD들 (19, 20)에서 촉진할뿐만 아니라 디스크 퇴화의 토끼 모델 (31)에서 디스크 높이를 증가시킬 수 있는 점이 이전에 보고되어 왔다. 그러나 링크 N이 생물학적 시스템에서 얼마나 안정한지 여부는 알려지지 않았다. 본 연구는 AF 세포들이 아미노산 잔기들 1-8번을 걸치는 단편을 가져오는 링크 N 펩타이드를 단백질분해로 프로세싱하는 능력을 가지는 점을 보여준다. 데이터는 또한 생물학적으로 활성을 가진 서열이 이러한 단편 내에 보존되고 펩타이드가 NP 및 AF 세포들 둘 다에서, 심지어 염증 환경에서도 프로테오글리칸 합성을 증가시킬 수 있는 점을 가리킨다. AF 세포들은 NP 세포들보다 기저선을 초과하는 더 강한 프로테오글리칸 증가를 보여주었다. 그러나 생산된 절대적 농도는 사용된 방법으로 평가될 수 없다. NP 세포들이 링크 N 노출의 존재 또는 부재 둘 다의 경우 프로테오글리칸의 더 높은 전체 농도의 결과를 가져오는 더 높은 기저선 생산을 가지는 것이 가능하다. 역전된 또는 혼합된 링크 N 펩타이드, 뿐만 아니라 링크 N의 잔기들 9-16은 생물학적 효과를 전혀 가지지 않았다.

왕 등은 아미노산 잔기들 1-12번을 걸치는 펩타이드를 포함하는 많은 더 짧은 링크 N-유래 펩타이드들 (33)을 평가할 때 링크 N의 자극적 효과가 상실되는 점을 이전에 보고하여 왔다. 대조적으로, 본 명세서에서 링크 N의 아미노산 잔기들 1-8번을 걸치는 펩타이드가 활성이 가지는 점을 관찰하였다. 본 결과들과 동의하여, 그들은 역전된 또는 혼합된 펩타이드가 효과가 전혀 없는 점을 확인하였다. 잔기 1-12 펩타이드가 그들의 시스템에서 무활성인 이유는 분명하지 않지만, 서로 다른 사용된 조건들과 관련될 수 있다. 왕 등은 크기와 독립적인 100 ng/mL의 서로 다른 펩타이드들을 사용하였다.

16개 아미노산 미가공 링크 N의 1 ug/mL의 최적의 농도가 존재하는 점이 결정되었고, 따라서 이러한 농도가 사용되었고 8개 잔기의 더 짧은 펩타이드들의 등분자 농도들 0.5 ug/mL를 유지하는 것이 사용되었다. 왕 등은 세포 용출물들에서 세포-연관된 설페이트화 GAG를 측정하였던 반면, 본 명세서에서는 배양 배지 내로 방출된 GAG에서 방사성 설페이트의 도입이 측정되었다. 사용된 세포 출처도 역시 달랐고, 왕 등은 척수 융합을 위한 수술 동안 추출된 퇴화된 디스크 조직으로부터 세포들을 분리하였고, 이들을 3D 배양들, 표현형 및 이에 의해 세포들의 반응을 변경시킬 수 있었던 절차로 이동시키기 이전에 세포들을 단일층 배양으로 증식시켰다.

애보트 등 (Abbott et al) (71)에 의해 퇴화 인간 디스크들로부터 얻은 단일층으로 증식된 세포들은 아그레칸 신호 수준들의 단지 낮은 상승-조절 및 MMP3 신호 수준들의 강한 유도를 가지고 미가공 링크 N과 덜 반응하는 점이 주장되었다 (71, 18). 왕 등의 연구에서 사용된 링크-N의 용량은 결정되었던 최적의 용량보다 배로 더 낮았고, 이러한 경우에 용량은 10배 더 적었다 (71). 본 명세서에서 테스트된 세포들은 가벼운 퇴화를 가진 기관 공여자들로부터 분리되었고, 표현형을 보존하기 위하여 세포들은 단일층으로 증식되지 않았다. 이러한 차이점 및 평가된 세포들이 심각하게 퇴화된 수술적으로 제거된 디스크들로부터 나오지 않은 사실은 다른 결과들을 설명할 수 있다. 중증 퇴화를 가진 디스크들은 검출가능한 치료적 반응을 제공하는 데 충분한 세포들을 가질 수 없다. 전체 형태의 소실로 인해 수술적으로 제거된 퇴화된 디스크들의 다른 부위들을 분리하는 것도 역시 어렵고, NP 및 AF 세포들 간의 차이들을 구분하는 것을 어렵게 만든다. 또한, 세포 수율도 심각하게 퇴화된 디스크들에서는 낮아서, 세포수를 증가시키도록 세포들을 증식시키는 것이 필요하며, 이는 세포들의 표현형에 영향을 줄 수 있다 (72).

디스크 퇴화의 초기 과정 및 표식은 아그레칸의 손실이고 퇴화의 초기 단계에 사용되는 임의의 치료제는 그의 합성을 증가시켜야 한다. 이에 따라 본 발명에서는 링크 N 단편의 유익한 효과를 평가하는 해석으로서 아그레칸 합성에 초점을 맞추었다. 그러나, 생체내 디스크 퇴화는 디스크 기질에서 증가된 이화작용과 강하게 연관된다. 이러한 과정은 질환 진행에서 역시 초기에 발현되는 것 같은 다양한 사이토카인들 및 프로테아제들의 상승-조절이 관여한다 (17, 53). 이러한 이화 환경에서 그의 동화 효과를 발휘하도록 디스크에서 퇴화 과정을 역전시키거나 지연시키는 능력을 가진 생체활성 제제는 필수적이다. 이러한 데이터는 링크 1-8이 이들 성질들을 가지는 점을 가리킨다.

링크 N이 AF 세포들에 의해 프로세싱되더라도, 활성을 가진 서열이 미가공으로 남아 있는 것도 역시 관찰되었다. 잔기들 8-9 간에 링크 N의 카텝신 K 절단은 2가지 펩타이드들, 링크 1-8 및 링크 9-16을 가져오는 한편, MMP들 3, 7, 12, 13, ADAMTS 4, 5, HTRA1, 및 카텝신들 B, 및 L은 링크 N을 프로세싱하지 못하였다. 디스크 퇴화에서 카텝신 K의 역할은 제시되지 않았다 (55, 73). 링크 1-8이 퇴화하는 추간판들의 세포외 기질에서 생성되는지 여부는 알려지지 않고 있다.

링크 N은 BMP 제 Ⅱ형 수용체를 통하여 작용하고 수용체 활성화는 Smad1/5 신호전달 그리고BMP-4 및 BMP-7 신호 수준들의 상승조절을 유도하는 것으로 확인되었다 (32). BMP 제 Ⅱ형 수용체는 단지 링크 N의 파트너로서 기술된 수용체이다. 따라서 링크 1-8이 동일한 수용체와 상호작용하고 둘 다의 펩타이드들이 프로테오글리칸 합성을 유사한 정도로 유도하는 것 같다. 만일 그렇다면 다음으로 링크 N은 금속프로테아제 발현을 저하-조절하는 능력과 같은 링크 N의 다른 대사적 성질들도 역시 가질 것으로 예상할 것이다.

링크 N 1-8은 퇴화 디스크 질환의 치료를 위한 유망한 생체활성 물질이다. 이러한 치료로부터 유익할 수 있는 환자들은 예를 들면 AF가 주요한 콜라겐 분해가 일어나기 이전에 미가공으로 남아 있는 곳에서 예를 들면 초기 디스크 퇴화를 가진 환자들을 포함한다. 톰슨 등급 3을 초과하는 퇴화는 디스크에 남아 있는 적은 수의 세포들 및 개별적으로 파괴된 ECM으로 인해 외과적 치료를 요구할 수 있다. 그러나, 링크 N 1-8는 이들 더 높은 등급들의 퇴화를 가진 개인들에서 여전히 유용할 수 있고, 이것은 융합 이후에 인접한 수준 디스크 질환을 지연시키는 데 사용될 수 있다 (74-76). 치료법에서 고유의 16개 아미노산 링크 N이 아닌 이러한 더 짧은 8개 아미노산 펩타이드를 사용하는 데 있어 한 가지 장점은 생산 비용일 수 있다. 작은 크기도 역시 생체내 전달에서 더 다루기 쉽다. 표 1은 인간 추간판 (IVD) 공여자들의 확인을 나타낸다.

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실시예 2

이전에 기술된 바와 같이, 링크 N은 MMP 절단에 의해 링크 단백질로부터 방출된다. 이것은 동맥 및 추간판들 둘 다에서 생산되고 디스크 (NP 및 AF) 및 관절 연골 (연골세포) 세포들에 의한 아그레칸/콜라겐 합성을 촉진시킨다.

기관 배양에서 인간 디스크들의 링크 N 자극은 배지 단독이 주사된 디스크들과 비교하여 프로테오글리칸 합성을 1.15배 내지 7배 이상으로 증가시키는 것으로 보고되어 왔다. 프로테오글리칸 합성은 링크 N 자극 이후 9일째 검출가능하다.

디스크 퇴화의 토끼 모델에서, L2/3 섬유태 천자 이후 2주째 10 마이크로리터의 식염수에 넣은 100 마이크로그램 농도의 링크 N의 주사가 링크 N 감염들 이후 14주째 IVD 디스크 높이를 유의하게 증가시켰다. 아그레칸 mRNA 가 AF 및 NP 세포들 (상세하게는 AF 세포들)에서 유의하게 증가되었다. 마찬가지로 MMP-3 및 ADAMTS-4 프로테아제 발현은 유의하게 감소되었다. 링크 N이 인간 디스크에서 보유되고 종말 판을 통하여 단지 느리게 소실되며 AF는 그렇지 않은 점이 확인된다. 링크 N의 특이성은 혼합된 링크 N 또는 역전된 링크 N이 인간 NP 세포들 또는 인간 iAF 세포들에서 효과를 전혀 효과를 가지지 않기 때문에 서열 의존적이다. 예를 들면 참고문헌들 29 및 34 참조.

NP및 AF의 존재 시 배양에서 링크 N의 안정성은 도 3에 나타낸 바와 같이 그리고 상기에 기술된 바와 같이 테스트되었다. 링크 N은 AF 세포들에 의해 프로세싱 되지만 NP 세포들에 의해서는 아니다.

도 4b 및 4c는 질량 분광분석법에 의해 확인된 가능한 링크 N 단편들을 나타낸다. 다양한 서로 다른 프로테아제들과 배양 이후에 링크 N 펩타이드 1-16를 모니터링하는 다수의 반응이 신호가 카텝신 K 배양의 존재 시에만 소실되는 점을 관찰하였다 (도 6A). 이것은 도 6B 및 6C에서 나타낸 바와 같이 피크들의 출현에 해당한다. 링크 N 9-16 이 아닌 링크 N 1-8은 인간 NP 세포들 및 인간 iAF 세포들과 접촉될 때 프로테오글리칸 합성을 유도하는 데 활성을 가진다 (도 7A). 링크 N 1-8은 전장의 링크 N과 유사하거나 이보다 나은 활성을 보여준다 (도 7B). 링크 N 9-16 이 아닌 링크 N 및 링크 N 1-8은 염증 환경에서 프로테오글리칸 합성을 촉진시킬 수 있다.

이들 결과는 아그레칸 생산이 NF 및 AF세포들 둘 다에서 증가되고, 링크 N이 디스크에서 보유되고 종말판을 통하여 단지 느리게 소실되며 AF는 그렇지 않은 점을 보여준다. 링크 N은 AF 세포들에 의해 프로세싱 되고 NP 세포들은 아니다. 링크 N은 1-8단편을 생성하는 카텝신 K에 의해 절단되고 AF 세포들에 의해 생산된 링크 N 단편은 활성을 가진다. 링크 N 및 단편은 염증 환경에서 작용한다.

실시예 3

방법론:

골관절염 (OA) 연골은 정보 동의를 받은 전체 무릎 관절성형술을 거친 4명의 공여자들로부터 획득되었고, OA 연골-뼈 이식물들 및 OA 연골세포들은 각 공여자로부터 준비되었다. 정상 인간 연골세포들 (프로모셀사 (PromoCell), 독일 하이델베르그) 및 소의 관절 연골 (12개월령)이 대조군들로서 사용되었다.

이식물들 준비 및 치료

대략 1 cm²인 연골 이식물들이 동일한 공여자들로부터 준비되었고, 피질 뼈를 가진 연골을 포함하였다. 이식물들은 10% 열-불활성화 FBS가 보충된 DMEM으로 배양되었다. 표준 배양 조건들 하에서 7일 동안, 이식물들은 IL-1 β (5 ng/ml), 링크 N (1 ug/ml)에 노출되었고, 3일마다 교환된 배양 배지에서 21일 동안 IL1 β +링크 N에 공동-노출되었다.

조직 프로세싱 및 분석

3 mm 반경의 연골 덩어리들이 각 이식물로부터 나온 다른 영역들로부터 분리되었다. Col Ⅱ, Agg, Col X 및 MMP-13의 발현이 웨스턴블럿에 의해 평가되었다. 간략하게, 연골 덩어리들은 프로테아제 저해제들을 포함하는15 부피 (v/w)의 4-M 염화구아니디움 (GuCl), 100-mM 소듐 아세테이트, pH 7.4로 4°C에서 48시간 동안 추출되었다. 웨스턴블럿 분석에 사용되는 100 uL의 분량이 9 부피의 에탄올로 침전되었고, 37°C에서 1시간 동안 50 mU 케라타나제 I (세이카가구사 (Seikagaku))와 배양되었으며 37°C에서 밤샘 동안 20 mU 콘드로이티나제 ABC (세이카가구사)와 배양이 이어졌다. 연골 기질 구성성분들은 환원 조건들 하에 4 내지 2-% 구배 젤들 (바이오-래드사) 상의 SDS/PAGE에 의해 분석되었고, 면역블럿팅을 위해 0.2 um PVDF 막들로 이동되었다. 아그레칸은 아미노-말단 G1을 인식하는 토끼 폴리클론 항체 (항-G1)를 사용하여 검출되었다. Col Ⅱ 및 MMP-13은 항-Col Ⅱ 및 항-MMP13 토끼 폴리클론 항체들 (아브캠사)로 인식되었던 한편, 제 X형 콜라겐은 항-Col X 마우스 폴리클론 항체 (시그마사)로 인식되었다.

조직에서 전체 글리코사미노글리칸 (GAG, 우세하게 아그레칸) 함량은 1,9-디메틸메틸렌 블루 (DMMB) 염료-결합 검정법을 사용하여 정량되었다.

OA 연골세포 분리 및 배양

OA 연골세포들은 각 무릎의 연골로부터 0.125% 프로나제와 이어지는 0.2% 콜라게나제에 의한 연속적 소화에 의해 회수되었다. 분리 이후에, 세포들은 10% 열-불활성화 FBS 및 1% 스트렙토마이신이 보충된 DMEM으로 증식되었다.

NFkB 신호전달

OA 및 정상 연골세포들은 6-웰 플레이트들로 이동되었고 90% 충만도까지 배양되었다. 세포들은 밤샘 동안 혈청이 고갈되었고 IL-1β (5 ng/ml), 링크 N (1 ug/ml) 또는 둘의 조합을 포함하는 배양 배지로 37°C에서 1분 동안 배양되었다. 세포들은 RIPA (방사성 면역-침전 검정법) 완충액 그리고 프로테아제 칵테일 Ⅱ (시그마사) 및 프로테아제 (써모 사이언티픽사) 저해제들에서 용해되었다. 용해물은 환원 조건들 하에 4-20% 구배 젤들 (바이오-래드사) 상에서 전기영동되었고, 0.2 um PVDF 막들로 이동되었다. 블럿들은 정상화를 위해 항-포스포-NFkB 항체 (셀시그널링사), 및 NFkB (셀시그널링사)로 탐색되었고, GAPDH (시그마사)는 정상화에 사용되었다.

결과:

링크 N은 OA 이식물들 및 연골세포들에서 IL-1β의 존재 시 프로테오글리칸 생산을 유도하였다. OA 연골에서, 프로테오글리칸 합성의 유의한 증가가 관찰되었고 링크 N과 반응하여 기질에서 유지되었다. 유사한 결과들이 Col Ⅱ의 경우 획득되었다. 링크 N은 MMP-13 활성화 및 Col X 발현도 역시 억제하였다. 흥미롭게도, OA 및 정상 연골세포들에서 NF-κB의 IL-1β-유도성 활성화가 링크 N에 의해 용량-의존적으로 억제되었다.

도 8은 링크 N으로 처리된OA 이식물들에서 GAG가 보유되는 점을 보여준다. GAG 보유는 대조군 (CTL) 이식물들의 % 보유로서 계산되었다.

도 8은 OA 이식물들 및 연골세포들에서 IL-1β의 존재 시 링크 N이 프로테오글리칸 생산을 유의하게 유도하였던 점을 나타낸다.

도 9는 OA 연골에서 아그레칸 합성의 유의한 증가가 관찰되고 링크 N과 반응하여 기질에서 보유되는 점을 나타낸다. 유사한 결과들이 Col Ⅱ의 경우 획득된다.

도 10은 링크 N이 IL-1β 유도성 MMP-13 활성화 (A) 및 Col X 발현 (B)을 억제하는 점을 나타내고, 도 11은 정상 인간 연골세포들 (A) 및 OA 연골세포들 (B)에서 NF-kB의 IL-1β 유도성 활성화가 링크 N에 의해 용량 의존적으로 억제되었던 점을 나타낸다.

이에 따라 링크 N은 골관절염 연골에서 프로테오글리칸의 보유를 촉진시키고 염증 환경에서 프로테오글리칸 및 콜라겐을 촉진시킬 수 있다. 링크 N이 골관절염 연골에서 MMP-13의 활성 형태를 억제할 수 있고, 링크 N이 IL-1 베타 유도성 프로테아제 발현을 억제하며, 이론에 의해 얽매이려 하지 않더라도 예를 들면 NFkB의 저하조절을 통한다.

OA는 생체내에서 염증성 사이토카인들의 존재와 밀접하게 연관된다. 링크 N은 추간판의 염증성 환경에서 프로테오글리칸 합성을 유도하는 점이 확인된다. 그러나, 링크 N이 염증 환경에서 골관절염 연골의 프로테오글리칸 함량을 회복시킬 수 있는지 여부는 알려져 있지 않다. 이것을 테스트하기 위하여, 골관절염 연골로부터 얻은 인간 이식물들이 링크 N, IL-1β의 존재 시, 링크 N 및 IL-1β의 조합, 또는 배지 단독으로 21일 동안 배양되었다. 추출가능한 프로테오글리칸들의 농도가 DMMB 검정법에 의해 정량되었다. 링크 N은 이식물의 GAG 함량을 대조군으로 정상화될 때 약 50%까지 증가시켰다. IL-1β은 대조군과 비교 시 프로테오글리칸 농도를 감소시켰다. 그러나, 링크 N은 이식물들의 GAG 함량을 IL-1β의 존재 시 대조군으로 정상화될 때 약 30%까지 증가시켰다. 이것은 연골 퇴화 과정 동안 링크 N이 프로테오글리칸을 회복시키는 잠재력을 가지고 효과가 염증 환경에서 지속되는 점을 가리킨다.

조직에서 아그레칸의 합성 및 보유에 미치는 링크 N의 효과가 다음으로 G1 도메인에 대한 항체를 사용하여 분석되었다. 이식물들을 보충물들의 부재 시 21일 동안 배양한 이후에, 이식물들은 약한 아그레칸 G1을 포함하는 단편들을 보여준다. 링크 N 보충으로, 아그레칸 G1을 포함하는 단편들의 함량은 유의하게 증가된다 (P<0.0001). 이식물들이 IL-1 단독으로 처리될 때, 더 낮은 분자량의 단편들이 거의 관찰되지 않더라도 아그레칸 G1을 포함하는 단편들의 염색 강도가 대조군의 강도와 비교하여 유사하였던 한편, 링크 N 및 IL-1의 보충은 링크 N 단독 처리된 이식물들과 비슷한 정도로 수준을 유의하게 증가시켰다.

G1 도메인 밴드들이 연골에서 기질의 진행되는 대사의 결과로서 아그레카나제들 및 MMP 활성에 의해 생체내 생산되기 때문에, 염증 환경에서MMP-13 발현에 미치는 링크 N의 효과가 다음에 테스트되었다. MMP-13 발현은 링크 N 단독, IL-1 단독 또는 링크 N과 함께의 존재 또는 부재 시 이식물들을 배양한 이후에 웨스턴블럿에 의해 분석되었다. 이식물들을 보충물들의 부재 시 21일 동안 배양한 이후에, 이식물들은 약한 활성을 가진 MMP-13를 보여준다. 링크 N은 대조군들과 비교할 때 활성을 가진 MMP-13를 유의하게 유도하였다. IL-1 보충으로, 활성 MMP-13은 링크 N에 의해 자극되는 것보다 더 증가된다. 대조적으로, IL-1β의 존재 시 링크 N을 첨가하는 IL-1β 단독과 비교할 때 MMP-13의 활성 형태의 정량들에서 감소를 가져왔다. 따라서 링크 N은 염증 환경에서 MMP-13의 활성 형태를 억제한다.

연골 복구도 역시 안정한 기질을 생성하는 데 콜라겐 생산을 요구한다. 따라서, 최근에 생산된 추출가능한 제 Ⅱ형 콜라겐의 수준들이 평가되었다. 골관절염 대조군 이식물들로부터 추출된 제 Ⅱ형 콜라겐의 정량은 유의하지 않더라고 링크 N 보충된 이식물들에서 더 낮았다. 이식물들이 IL-1 단독으로 처리될 때, 제 Ⅱ형 콜라겐의 정량들은 대조군 이식물들과 비교할 때 유의하게 감소되었다. 대조적으로, IL-1β의 존재 시 링크 N을 첨가하는 것은 IL-1β 단독과 비교할 때 제 Ⅱ 형 콜라겐의 정량들에서 증가를 가져왔다. 따라서 링크 N은 염증 환경에서 아그레칸 생산을 촉진할 뿐만 아니라 제 Ⅱ형 콜라겐의 생산도 촉진시켰다.

여러 연구들은 전-염증성 사이토카인들 및 기질 분해 효소들을 인코딩하는 많은 유전자들이 전사인자, 핵인자-카파 B (NF-κB)에 의해 조절되는 것으로 보고하였다. 링크 N을 사용하는 NF-κB 활성화 연쇄반응의 억제는 전-염증성 매개인자들의 발현을 저하조절할 수 있다.

IL-1에 의한 NF-κB 활성화에 미치는 링크 N의 효과가 정상 연골세포들에서 다음으로 평가되었다. 정상 연골세포들이 변화하는 농도들의 링크 N의 존재 또는 부재 시 IL-1β로 자극되었다. 인산화된 NF-카파B RelA (p65)의 자극은 P-P65(NF-kB)에 대해 특이적인 항체들을 사용하는 웨스턴블럿에 의해 결정되었다. 연골세포들을 IL-1β의 부재 시 배양한 이후에, 연골세포들은 P-P65(NF-kB) 단백질을 전혀 보여주지 않는다. 링크 N 보충으로, P-P65(NF-kB) 단백질에 미치는 효과는 전혀 관찰되지 않았다. 예상된 바와 같이, P-P65(NF-kB)는 IL-1β 로의 자극 이후에 현저해진다. 링크 N은 IL-1β 자극된 P-P65(NF-kB)를 용량-의존적 방식으로 유의하게 억제하였다 - 100 ng의 링크 N은 1000 ng의 링크 N과 매우 유사하였다. 유사한 결과들이 OA 환자들로부터 얻은 연골세포들이 사용될 때 관찰되었다. 이러한 결과는 링크 N이 IL-1베타 매개성 NF-κB 활성화를 억제하고 IL-1β 자극성 MMP-13 및 염증성 사이토카인들을 NF-κB 신호전달을 저해하여 억제할 수 있는 점을 설명한다.

논의

관절 연골 골조는 동화 및 이화 인자들 통하여 그대로 유지되고 기능적이며, 이는 다음 순서로 합성 및 분해를 균형잡아 조직 항상성을 유지하도록 연골세포들 상에 작용한다. 콜라겐 및 아그레칸의 분해 및 소실, 연골하 뼈 리모델링, 및 윤활막의 염증은 이화의 균형적 변화들로서 골관절염을 특징으로 한다. 링크 N이 연골세포들에서 콜라겐 및 프로테오글리칸 합성을 촉진시킬 수 있는 점이 이전에 보고되었다. 그러나, 링크 N이 염증 환경에서 골관절염 연골의 프로테오글리칸 및 콜라겐 함량을 회복시킬 수 있는지 여부는 알려져 있지 않다. 본 명세서에서 결과들은 초기 OA에서, 링크 N이 프로테오글리칸 및 콜라겐 함량을 회복시키는 잠재력을 가지는 점을 설명한다. 데이터는 링크 N이 심지어 염증 환경에서도 NF-κB 신호전달을 억제하여 단백질분해를 억제하고, 프로테오글리칸 및 콜라겐 합성을 증가시키는 점도 역시 가리킨다.

링크 N, 생체활성 인자는 디스크 복구를 촉진시키는 잠재력을 가지는 것으로 설명되어 왔다. 분리된 IVD 세포들을 시험관내 사용하여 콜라겐 및 프로테오글리칸 신호 수준들을 유도하는 것으로 확인되었고, 새로이 합성된 프로테오글리칸들 내로 방사성 ³⁵SO₄의 도입을 증가시키는 것으로 보고되었다. (6,16,18). 따라서, 미가공 인간 IVD 들 내로 링크 N 주사는 생체외에서 새로이 합성된 프로테오글리칸들 내로 방사성³⁵SO₄의 증가된 도입의 결과를 가져왔고, 디스크 퇴화의 질병 모델에서 토끼 디스크들 내로 주사될 때 디스크 높이의 부분적인 회복을 유도하였다. 결과들은 링크 N이 OA 환자들로부터 얻은 연골세포들에서 프로테오글리칸 및 콜라겐 발현을 촉진시킬 수 있고, 연골의 기능적 성질들을 회복시키는 데 기능적인 역할과 합치하는 점을 가리킨다.

링크 N은 연골세포들에서 P-P65(NF-kB)의 활성화를 억제하였다. NF-kB 신호전달 경로들은 생체내에서 관절염의 발생 및 진행에서 활발한 역할을 담당한다 (19,20). 따라서, 우리의 연구들은 IL-1b로의 자극 이후에 관절 연골세포들에서 NF-kB의 활성화를 보여주었고, 이는 관절 연골의 이화작용에서 중요한 역할을 담당한다. NF-kB 발현은 콜라게나제-3 (금속프로테아제 (MMP)-13) 및 스트로멜라이신 1 (MMP-3) 수준들과 상관되었다. 또한 핵내 NF-kB 정착으로 이동이 연골세포들에서 제 Ⅱ형 콜라겐으로 면역화된 DBA/1 마우스에서 관절염의 초기 단계의 연골 파괴과정 동안 관찰되었다. 본 결과는 IL-1b로의 자극이 NF-kB 활성화의 자극을 관절 연골세포들에서 초래하는 점을 보여준다.

기능적 기질을 가지기 위하여, 새로이 배치된 기질은 리모델링되어야 한다. 이것은 다양한 프로테아제들의 상승조절이 관여한다. 본 연구에서 링크 N은 대조군과 비교할 때 활성 MMP-13를 유의하게 억제하였다. 따라서 새로이 합성된 ECM을 연골 내의 그의 새로운 기능을 위해 리모델링하기 위하여, 프로테아제들의 상승조절이 요구된다. 링크 N이 보충된 인간 디스크 세포들이 프로테아제들을 시험관내에서 및 디스크 퇴화의 토끼 생체내 모델에서 상승조절한다. 따라서, 링크 N은 연골의 복구를 촉진하는 데 효과적이고, 연골의 기능을 회복시키도록 디스크 ECM의 리모델링에 관여하는 것으로 보인다.

관절염에서 MMP들에 의한 관절 연골 분해를 감소시키도록 NF-kB의 저해제들의 잠재적인 용도가 기술되어 왔다. 미스테로이드성 항-염증 약물들 (NSAID들), 글루코코르티코이드들 및 다른 제제들을 사용한 바람직한 결과들이 감소된 NF-kB 활성화를 설명한다. 그러나, NSAID들의 사용은 위창자의 부작용들 및 안티센스에서 특이성의 결여를 유발할 수 있고, 전사인자 유인 전략들은 유전자 발현을 표적화하는 것이 단지 단일한 기관에서 저해될 때 큰 문제점을 나타낸다. 또한, 단백질 전달, 면역원성 및 치료의 비용의 문제는 치료법을 위한 전체 단백질들의 실제적 전망을 제한하여 왔다.

실시예 4

실질적인 콜라겐 파괴가 전혀 없는 프로테오글리칸 결핍이 관여하는 초기 디스크 퇴화의 기관 배양 모델이 링크 N을 경제적인 성장인자로서 그리고 중간엽 줄기세포들 (MSC)를 세포 보충물로서 사용하여, 분자적 및 세포-기초 치료법들의 효과를 연구하는 데 사용된다.

재료 및 방법

중간엽 줄기세포 배양

골수로부터 수확된 인간 MSC들이 론자사 (Lonza, 스위스 바젤)로부터 획득되었다. 공급자 지침에 따라, 세포들은 CD105, CD166, CD29, 및 CD44에 대해 양성이고 CD14, CD34, 및 CD45에 대해 음성이었다. 또한, 세포들은 골생성, 연골생성, 및 지방생성 계열들로 분화될 수 있는 것으로 입증되었다. 모든 세포들은 10 % 우태아 혈청 (FBS), 100 U/mL 페니실린, 및 100 ug/mL 스트렙토마이신이 보충된 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM)으로 증식되었고 4번 계대들 내에서 사용되었다 (19, 20). 모든 배양 시약들은 위센트사 (Wisent Inc., 캐나다 세인트-브루노)로부터 얻었다.

중간엽 줄기세포 표지화 및 추적

MSC들은 공급자의 지침들에 따라 PKH67 (시그마-알드리치사, 캐나다 오크빌)로 표지되었다. 간략하게, 2x10⁶개 MSC들이 FBS가 없이 DMEM으로 세척되었고, 400 g에서5분 동안의 원심분리에 의해 느슨한 펠렛으로서 수집되었다. 펠렛은 희석제 C에서 현탁되었고, 염료 용액과 신속하게 혼합되었다. 세포/염료 현탁액은 다음으로 5분 동안 배양되었고, 이후에 반응은 동일한 부피의 FBS를 첨가하여 정지되었다. 세포들의 생존도는 트립신 블루로 염색하여 측정되었다. 분량이 표지화 효율을 추적하도록 단일층 (사스테드사 (Sarstedt), 캐나다 세인트-레오나드)으로 2일 동안 배양되었다. 세포들의 나머지는 포스페이트-완충 식염수 (PBS) (Wisent), 또는1 mg/mL 링크 N (캔펩타이드사, 캐나다 몬트리온)이 보충된 PBS 둘 중 하나로 재현탁되었다. 다음으로 세포 현탁액은 퇴화를 유도하도록 트립신으로 전처리된 소의 디스크들 내로 주사되었다 (21).

디스크 분리 및 배양

가장 큰 첫 3-4 꼬리 디스크들이 24- 내지 30-개월령 거세 송아지들의 꼬리로부터 이전에 기술된 바와 같이 분리되었다 (21,22). 간략하게, 꼬리들은 피부, 근육들 및 인대들이 없이 해부되었고 각 분절의 뿌리는 제거되었다. 뼈 및 인접한 연골성 종말판의 석회화된 부분은 제거되어, 디스크의 표면은 검출가능한 조직이 없이 연하고 유연하였다. 디스크들은 1,000 U/mL 페니실린, 1,000 ug/mL 스트렙토마이신 및 0.25 ug/mL 퓨지존 (GIBCO사, 캐나다 벌링톤)이 보충된 PBS로 헹구어진 이후에, 그들은 50 mL 배양 배지 (5 % FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 ug/mL 스트렙토마이신, 50 ug/mL L-아스코베이트가 보충된, 2 mM 글루타맥스 (Glutamax) 및 25 mM Hepes를 가진 DMEM)를 포함하는 무균의 80 mL 표본 용기들 (STARPLEX 사이언티픽사, 캐나다 Etobicoke)에서 3일 동안 전조정되었다. 퇴화는 28G1/2 바늘을 사용하여 디스크의 중앙 내로 75 uL PBS에 용해된 100 ug 트립신 (시그마-알드리치사)의 단일 주사에 의해 유도되었다 (21). 바늘은 중앙에 도달하는 데 필요한 거리를 측정하도록 디스크의 상부 위에 두었고 다음으로 동일한 깊이에 삽입되었다. 일단 중앙에서는, 트립신 용액이 느리게 주사되었고 다음으로 바늘은 역류를 피하도록 점진적으로 당겨졌다. 다음으로 디스크들은 최종 부피 75 uL PBS로 MSC들 (10⁵ 세포들), 링크 N (75 ug), 또는 MSC들 (10⁵ 세포들) 및 링크 N (75 ug)의 조합의 주사 이전에 또 다른 4일 동안 배양되었다. 링크 N 농도는 소 디스크들의 평균 부피는7.5 mL인 것으로 가정하여 분리된 소의 디스크 세포들의 최적의 용량 (1 ug/mL)을 기초로 하였다. 사용된 MSC들의 수는 건강한 인간 디스크들의 세포 밀도를 측정하는 레이셔 등 (Liebscher et al., ( 23))에 의한 연구를 기초로 하였다. 소의 디스크들이 이미 높은 세포 밀도를 가지기 때문에, 영양분 고갈로 인해 세포 생존에 미치는 잠재적인 해로운 효과를 피하기 위하여 건강한 어른 인간 디스크에서 관찰되는 세포들의 약 절반의 수가 본 연구에서는 사용되었다. 모든 실험적 조건들의 경우, 여러 개의 디스크들이 주사되었다. 7개의 트립신-처리된 디스크들이 퇴화 대조군들로서 작용하고 트립신이 NP의 프로테오글리칸 함량을 분해하는 데 활성을 가지는 점을 확인하도록 PBS 단독으로 주사되었다. 7개의 디스크들은 미-퇴화 대조군들로서 작용하도록 전혀 주사 없이 배양되었다. 다음으로 디스크들은 14일 동안 배양되었고 배지는 3일마다 교환되었다.

현미경법 및 조직학에 의한 디스크들의 분석

배양의 종결 시 2개의 마이크로톰 칼날들로 구성되는 내장 설계된 절단 도구를 사용하여 디스크들의 중앙을 통과하는 2가지 절편들이 채취되었다 (21). 이것은 약 3 cm 너비 (디스크 반경) 및 1 cm 높이 (디스크 높이)의 2가지 750 um 두께 조각들을 제공한다. 하나의 조작은 조직학 분석을 위해 무-포르말린 고정액 (어큐스타틴 (Accustain), 시그마-알드리치사)으로 고정되었다. 고정된 시료들은 파라핀 왁스로 포매되었고 5-um-두께 절편들이 절단되었으며 헤마톡실린 및 사프라닌 O-패스트 그립으로 염색되었다 (24).다른 절편은 신선하게^디스크 조직에서 MSC들의 분포를 연구하는데 사용되었다. 표지된 줄기세포들을 집단화한 디스크들은 역전된 공초점 레이저 스캔화 현미경 (CLSM, Zeiss LSM 510)을 사용하여 영상화되었다. 20개의 연속적인 6 um 절편들이 촬영되고, CLSM 모음들은 단일한 사진들로 분열된다.

세포외 ECM 단백질들 및 프로테오글리칸들의 추출

남아있는 수핵 (NP) 조직이 수집되었고 습윤 무게가 기록되었다 (21). 조직은 작은 조각들로 절단되었고 단백질 및 프로테오글리칸 추출을 위해 14 부피의 추출 완충액 [4 M 염화구아니디움, 50 mM 소듐 아세테이트, pH 5.8, 10 mM EDTA, COMPLETE® (로슈사, 캐나다 라발)으로 현탁되었다. 조직은 4℃에서 48시간 동안 연속적으로 교반하면서 추출되었고, 추출물들은 4℃에서 30분 동안 12,000 g로의 원심분리에 의해 제거되었다. 상청액들이 수집되었고 심화 분석을 위해 -80℃에서 보관되었다.

GAG 분석

설페이트화 글리코사미노글리칸들 (GAG)은 조직 추출물들에서 변형된 디메틸 메틸렌블루 (DMMB) 염료-결합 검정법에 의해 정량되었다 (25,26). 시료들은 표준 곡선의 선형 범위의 중간 내에 위치하도록 희석되었다. 조직 추출물과 동일한 부피의 추출 완충액이 가능한 간섭을 보상하도록 표준 곡선에 첨가되었다.

아가로스 젤 전기영동에 의한 프로테오글리칸 분석

프로테오글리칸 조성물은 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석되었다 (27). 디스크 추출물들의 10 uL 분량들에서 프로테오글리칸들이 무수 에탄올로 침전되었고 증류수에 용해되었다. 시료들은 시료 완충액 (0.1 M 트리스-HCl, 0.768 M 글리신, 0.01% 브로모페놀블루, 1.2% 글리세롤, 0.05% SDS, pH 8.3)과 혼합되었고, 10분 동안 가열되었다. 프로테오글리칸들은 1.2% 아가로스 젤들에서 전기영동에 의해 분리되었다. 젤은 0.5% (w/v) 트리톤 X 100을 가진 3% 아세트산에 넣은 0.02% (w/v) 톨루이딘 블루로 염색되었고, 3% 아세트산 다음으로 증류수로 탈색되었다.

웨스턴블럿에 의한 아그레칸 및 제 Ⅱ형 콜라겐 분석

디스크 추출물들의 10 uL 분량들에서 단백질들 및 프로테오글리칸이 9부피들의 무수 에탄올의 첨가에 의해 침전되었고, 95% 에탄올로 2번 세척되었으며, 마지막으로 동결건조되었다. 제 Ⅱ형 콜라겐의 분석을 위한 시료들은 증류수로 용해되었다. 아그레칸의 분석을 위한 시료들은 완충액 (0.03M 소듐 아세테이트, pH 7.4, COMPLETE®를 가진 0.05 M 트리스-HCl)로 용해되었고, 케라타나제 I 및 콘드로이티나제 ABC (암스비오사 (Amsbio), 미국 캘리포니아 레이크 포리스트)에 의해 소화되었다. 동일한 처리 그룹으로부터 얻은 시료들이 풀로 만들어졌고, SDS 시료 완충액과 혼합되었으며, 10분 동안 가열되었다. 단백질들은 환원 조건들 하에 SDS-PAGE (4 내지12% Bio-Rad^® 젤들)에 의해 분리되었다. 분리된 단백질들은 0.2% 트윈 20을 가진 PBS (차단 완충액)에 넣은 1% BSA로 차단되었다. 다음으로 그들은 차단 완충액에 넣은 1:2,000 희석으로 일차 항체들과 4℃에서 밤샘 동안 배양되었고, 차단 완충액에 넣은 호스래디쉬 퍼옥시다제 (1:5,000 희석, 시그마-알드리치사)와 결합된 이차 항체와 배양이 이어졌다. 콜라겐 제 Ⅱ형을 인식하는 일차 항체는 아브캠사 (아브캠사, 캐나다 토론토)로부터 얻었고; 아그레칸 G1 도메인을 인식하는 일차 항체는 이전에 기술된 바와 같이 (28) 제조되었다. 결합된 항체는 화학발광 (GE 헬스케어사 (GE Healthcare), 캐나다 바이에두르페)에 의해 영상화되었고, 바이오-래드 VersaDoc 이미지 분석 시스템 (바이오-래드사, 캐나다 미시소가)을 사용하여 분석되었다.

통계학적 분석

통계학적 분석은 분산 분석을 사용하여 수행되었고, 그래프패드 프리즘 (그래프패드 소프트웨어사, 미국 캘리포나아 라졸라)을 사용하여 피셔 보호된 가장 적은 유의한 차이 post hoc 테스트가 이어졌다. 결과들은 서로 다른 소 꼬리들로부터 얻은 디스크들로 7번의 독립적인 실험들의 평균 ± 표준 편차 (SD)로서 표현된다. 차이들은 p < 0.05에서 통계학적으로 유의한 것으로 고려되었다.

결과

링크 N은 분리된 디스크 세포들에 의해 그리고 퇴화 토끼 디스크들에서 프로테오글리칸 합성을 유도하고, 시험관내에서 MSC들의 연골생성을 증진하는 것으로 알려져 있다 (20,29-32). 그러나, 링크 N 또는 MSC들 단독이 초기 퇴화를 가진 더 큰 디스크들에서 프로테오글리칸 함량을 회복시킬 수 있는지 여부는 알려져 있지 않다. 링크 N 및 MSC들의 조합이 추가적 효과를 가지는지 여부도 역시 알려져 있지 않다. 이 점을 테스트하기 위하여, 단백질분해로 유도된 아그레칸 고갈을 가진 소의 디스크들이 링크 N 또는 MSC들 단독 또는 링크 N 및 MSC들로 처리되었다. 디스크들은 처리 이후에 2주 기간 동안 배양되었고 추출가능한 프로테오글리칸들의 농도가 DMMB 검정법에 의해 정량되었다 (도 12). 개입이 없이도 퇴화 디스크들에서 GAG 함량은 미-퇴화 대조군들의 함량보다 약 50%까지 강하되었다. 대조적으로, 링크 N 및 MSC들 단독, 또는 조합은 퇴화 대조군 디스크들에서 GAG 함량과 비교하여 디스크들의 GAG 함량을 유의하게 증가시켰다 (p<0.05). 처리된 디스크들에서 프로테오글리칸 농도들은 미-퇴화 디스크들에서 농도와 유사하였다. 그러나, 통계학적 유의성은 처리된 그룹들 중에서 전혀 관찰되지 않았다 (p>0.05). 이것은 초기 퇴화에서 링크 N 또는 MSC들 단독 둘 중 하나가 프로테오글리칸을 그의 원래 수준으로 회복시키는 잠재력을 가지고 추가적인 유익이 조합 치료법에 의해 전혀 달성되지 않는 점을 가리킨다.

동등한 프로테오글리칸 함량을 가지는 것이 구조가 정상 디스크의 구조와 동일한 점을 반드시 의미하지는 않는다. 이것을 설명하기 위하여, 추출된 프로테오글리칸들이 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석되었다. 처리된 디스크들에서 크기 분포 및 염색의 강도는 미-퇴화 대조군 디스크들의 정도와 등등한 한편, 염색의 강도는 퇴화 대조군 디스크들에서 더 낮았다 (도 13). 데이터는 처리된 디스크들에서 생산된 새로이 합성된 프로테오글리칸들이 미-퇴화 디스크들의 것들과 동일한 크기 범위인 점을 설명하고 있다.

또한, 미가공 아그레칸 코아 단백질의 존재 및 풍부함은 SDS-PAGE에 의해 평가되었다. 250 kDa 이상의 질량을 가진 미가공 아그레칸 코아 단백질은 미-퇴화 대조군 디스크들과 비교하여 퇴화 대조군 디스크들에서 유의하게 더 낮았던 한편 (p<0.05), 링크 N 및/또는MSC들의 주사는 미-퇴화 대조군 디스크들과 비슷한 정도의 수준으로 유의하게 증가시켰다 (도 14).

디스크 복구는 안정한 기질을 생성하도록 콜라겐 생산도 역시 요구한다. 따라서, 최근에 생산된 추출가능한 제 Ⅱ형 콜라겐의 수준들이 측정되었다 (도 15). 퇴화 대조군 디스크들로부터 추출된 제 Ⅱ형 콜라겐의 정량은 미-퇴화 대조군 디스크들에서보다 유의하게 더 낮았다. 디스크들이 MSC들 및/또는 링크 N으로 주사될 때, 제 Ⅱ형 콜라겐의 정량들은 미-퇴화 대조군 디스크들에서 검출되는 것과 유사한 수준으로 증가된다. 따라서, 링크 N 및 MSC들 둘 다는 아그레칸 생산뿐만 아니라 제 Ⅱ형 콜라겐의 생산도 역시 촉진시킨다.

조직학적 분석이 복구 조직 내에서 프로테오글리칸 분포를 평가하는 데 사용되었다. 조직 절편들의 사프라닌 O 및 패스트 그린 염색은 사프라닌 O (적색) 염색이 확인되는 퇴화 대조군 디스크들에서 프로테오글리칸들의 일정한 소실을 입증하였다 (도 16). 또한 결과는 퇴화 대조군 디스크들에서 프로테오글리칸 함량이 NP 부위 전체를 통하여 고갈되는 점을 입증하였다. MSC들 또는 링크 N 단독 또는 다함께로 처리된 디스크들에서, 사프라닌 O 염색의 강도 및 분포는 미-퇴화 대조군 디스크들의 결과와 유사하게 NP 부위 전체를 통한 고른 분포를 보여주었다. 따라서 새로이 합성된 프로테오글리칸은 ECM 전체를 통하여 확산하고 심지어 세포들로부터 먼 부위에서도 조직 함량을 회복시킬 수 있었다.

지속되는 MSC 유도성 복구 과정들을 위해 주사된 줄기세포들은 살아남은 것이 필요하고 복구 조직 전체를 통하여 분포하였다. 이것을 설명하기 위하여, MSC들이 PKH67로 표지되었고 (도 17A, B) 표지화 효율 및 염료 지속성을 평가하도록 단일층으로 2일 동안 배양되었다. MSC 생존도는 세포들이 표지되고 트립신-처리된 디스크들 내로 주사되기 이전에 PBS 또는 링크 N/PBS 용액에서 현탁될 때 90% 이상으로 높았다. 주사된 MSC들이 생존하고 디스크들의 ECM에서 통합되는지 여부를 평가하기 위하여, 세포들이 공초점 현미경법에 의해 추적되었다. 표지된 MSC들은 2주의 기관 배양 기간 이후에 NP 부위 전체를 통하여 분포된 것으로 관찰되었고 (도 17C, D) 지속가능한 복구 과정의 가능성을 가리킨다.

논의

본 연구에서 초기 디스크 퇴화의 기관 배양 모델이 IVD 프로테오글리칸 함량을 회복시키는 분자적 및 세포-기초 치료법들의 잠재력을 연구하는 데 사용되었다. 링크 N이 분자적 제제로서 그리고 MSC들이 세포 보충물로서 사용되었다. 퇴화 디스크들이 둘 중 하나의 치료법으로 별도로 또는 조합으로 처리되었고, 결과들은 링크 N 또는 MSC들 단독이 조직 프로테오글리칸을 회복시키는 능력을 가지고 추가적인 효과가 둘의 조합에 의해 전혀 관찰되지 않는 점을 보여주었다.

이전의 작업은 디스크 복구를 촉진시키는 링크 N의 잠재력을 설명하여 왔다 (20,29,31-35). 본 명세서에서 나타난 바와 같이 링크 N이 AF 세포들에 의해 절단되더라도, 결과로 얻은 N-말단 8개 아미노산 펩타이드가 단백질분해 측면에서 안정한 것으로 보이고 생물학적 활성을 보유한다. 시험관내에서 분리된 IVD 세포들을 사용하는 연구들은 링크 N이 콜라겐 및 프로테오글리칸 신호 수준들을 유도하고 새로이 합성된 프로테오글리칸들 내로 방사성 ³⁵SO₄의 증가된 도입의 결과를 가져오는 점을 확인하였다 (34,35). 또한, 미가공 인간 IVD들 내로 링크 N 주사는 생체외에서 (34) 새로이 합성된 프로테오글리칸들 내 방사성 ³⁵SO₄의 증가된 도입의 결과를 가져왔고, 링크 N은 디스크 퇴화의 질병 모델에서 토끼 디스크들 내로 주사될 때 디스크 높이의 부분적인 회복을 유도하였다 (31). 본 연구에서 사용된 모델은 조직은 링크 N 자극과 반응할 수 있는 충분한 수의 세포들을 가지는 젊은 어른에서의 초기 단계 퇴화를 모방한다. 대조적으로, 세포 수들의 감소, 세포 노화 및 가능하게는 염증 환경은 다른 한편으로 종종 인간 디스크 퇴화의 특징이 된다. 우리 연구진으로부터 나온 이전의 작업은 링크 N이 염증 환경에서 동등하게 강력한 점을 확인하였다 (34). 이러한 단계에서 디스크 ECM을 합성할 수 있는 추가적인 세포들도 공급하는 것도 역시 필요할 수 있을 것이다.

자가유래 IVD 세포들이 수확되고 IVD 복구를 위한 세포 출처로서 사용될 수 있는, MSC들을 매력적인 선택으로서 남기는 양성 부위는 전혀 존재하지 않는다. IVD 복구를 위한 MSC들의 잠재적인 용도가 작은 동물들에서 기술되어 왔다 (36-38). 토끼들에서 바람직한 결과들이 증가된 디스크 높이, 뿐만 아니라 ECM 침전 및 수화를 설명한다. 그러나, 토끼에서 다른 연구들은 특히 MSC들이 스캐폴드가 없이 또는 AF의 밀봉이 없이 투여될 때, 골증식체 형성을 보고하고 있다 (39). 링크 N이 시험관내에서 연골생성을 촉진시키고 인간 MSC들의 골생성을 감소시키는 것으로 알려져 있기 때문에, 이것은 조합 요법을 위한 이상적인 후보일 수 있다 (20). 동물 연구들에 추가하여, 소규모 인간 임상 시험은 개선된 통증 및 장애 점수를 보고하여 왔다 (40). 디스크 높이의 증가는 임상 시험들에서 전혀 관찰되지 않았지만, MRI에 의해 측정되는 수화의 증가는 검출될 수 있다. 본 결과들은 MSC 보충이 초기 퇴화에서 생존가능한 선택일 수 있는 점을 가리킨다. 그러나, 종말판 석회화가 퇴화와 연관되기 때문에 (41), 퇴화 디스크들에서 결과로 얻은 타협 영양적 경로가 추가적인 세포들의 대사적 활성을 지지할 것인지 여부가 관찰되도록 남게 된다 (42,43).

현재의 모델이 틈새들의 생성, 단지 분자적 고갈을 가져오지 않는 한편, 자연적 디스크 퇴화는 종종 틈새들의 생산이 관여한다. 이러한 병변들을 복구하기 위하여, 병변들을 채우고 치료제들의 일정한 분포를 허용할 중합가능한 스캐폴드 내에 링크 N 및 줄기세포들을 주사하는 것을 요구할 수 있다. 표 2는 디스크들의 무작위화를 나타낸다.

삭제

실시예 5

삭제

추가적인 테스트들이 소의 디스크 기관 배양을 사용하여 시행되었다. 도 18은 링크 N 1-8이 퇴화된 소의 디스크들에서 링크 N 1-8 처리 이후 2주째 프로테오글리칸 합성, 아그레칸 및 제 Ⅱ형 콜라겐 발현에서 통계학적으로 유의한 증가를 유도한다.

링크 N 및 아미노산들 1-8을 포함하는 단편이 퇴화 디스크에서 아그레칸 수준들을 회복시킬 수 있는 점이 설명된다.

실시예 6

인간 링크 N [DHLSDNYTLDHDRAIH] (서열번호 15)은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 추간판 (IVD) 세포들에 의한 세포외 기질 생합성을 촉진시킬 수 있다. 지금까지, 디스크 세포들에 미치는 소 링크 N [DHHSDNYTVDHDRVIH] (서열번호 5)의 효과에 관한 보고들은 전혀 없었다. 본 연구의 목적은 소의 섬유태 (AF) 및 수핵 (NP) 세포들 상에서 인간 링크 N (HLN)의 효과와 소 링크 N (BLN)의 효과를 비교하는 것이다.

방법: 건강한 22-24개월령 거세 송아지들로부터 얻은 꼬리뼈 디스크들의 NP 및 AF 부위들로부터 분리된 세포들은 프로테오글리칸 합성 및 유전자 발현 또는 단백질 추출을 위한 단일층으로의 배양 둘 중 하나를 위해1.2% 알기네이트 비드들에 즉시 포매되었다. 비드들은 1 ug/ml의 HLN 또는 BLN 둘 중 하나가 보충된 배지에서 18시간 동안 배양되었다. 설페이트화 글리코사미노글리칸 (GAG) 방출이 분석되었다. 배양 7일 및 14일 이후에, 정량적인 PCR이 아그레칸 (AGG), ADAMTS-4 및 ADAMTS-5에 대해 수행되었다. Smad 활성화가 P-Smad1/5 및 P-Smad2에게로 유도되는 특이 항체들을 사용하는 면역블럿팅에 의해 분석되었다.

결과: NP 및 AF 세포들 둘 다에서, BLN 및 HLN와 배양은 배양 배지에서 증가된 GAG 방출의 결과를 가져왔다. GAG 방출은 대조군 배지와 비교하여 BLN 및 HLN 둘 중 하나와 배양된 AF 세포들에서 유의하게 더 높았다. 그러나, NP 세포들은 HLN와 배양될 때 GAG 방출에서 유의하고 일정한 증가를 가졌다. AF 세포들에서, 링크-N 보충물들 둘 다는 6시간 과정 동안 대조군 수준들 미만으로 감소된 Smad1/5의 신속한 활성화 (< 10분)을 유도하였다. NP 세포들에서, Smad1/5는 지연되어 30분 이후에 시작하여 출현하고 시간에 따라 계속 증가하였다.

BLN는 Smad1/5의 활성화를 통하여 소의 IVD 세포들에서 GAG 방출을 자극할 수 있다. AF 세포들에서 BLN에 의한 Smad1/5의 신속한 활성화는 AF 세포들이 GAG 합성을 촉진하는 데 있어 NP 세포들보다 더 잘 BLN 보충에 반응한다는 우리의 연구를 설명할 수 있다. 펩타이드들 둘 다는 디스크 복구를 촉진시키도록 설계된 임의의 제제를 위해 필요한 특징들을 가진다.

또한 자세한 사항들은 실시예 7에서 확인된다.

실시예 7

추간판들 (IVD)은 프로테오글리칸-농축강화 중앙 수핵 (NP)을 감싸는 말초 콜라겐-강화 섬유태 (AF)로 구성된 복합 구조들이다 [77]. 그들은 프로테오글리칸 아그레칸의 높은 함량을 가지기 때문에 압박을 견디고, 이는 큰 프로테오글리간 응집물들을 생산하도록 하이알루로네이트와 상호작용한다. 이들 상호작용들은 링크 단백질의 심화 상호작용에 의해 안정화된다 (도 19) [78,79]. AF 및 NP에 존재하는 디스크 세포들은 대사적 과정들을 통하여 IVD들의 항상성을 조절하고, 동화 및 이화 인자들 간의 균형을 유지하며 지질 분자들 및 분해 효소들의 발현을 통제한다. 이러한 견실한 상태 대사의 불균형은 고갈된 합성 및 증가된 분해 둘 다로 인해 아그레칸은 특히 단백질분해적 손상 및 손실에 취약해지면서, IVD 기질의 조성물 및 구조에서 생화학적 변경들을 유발한다. 세포외 기질 (ECM)의 진행적인 파괴는 디스크 퇴화와 밀접하게 연관된다 [80].

IVD 퇴화는 허리 통증의 병인학에서 주요한 역할을 담당하고, 이는 인구 집단의 절반 이상에게 유의하게 영향을 미칠 수 있다 [53, 81-82]. 따라서, 허리 통증 치료법을 위해, 퇴화 과정을 역전시키고 퇴화된 IVD들을 복구 (구조 또는 기능을 회복)시키는 것이 중요하다. 최근에, 세포 또는 성장인자 치료법들이 IVD 복구를 유도하도록 제안되었다 [83-86]. 세포성 대사를 촉진시키고 조직 항상성을 동화 상태 (기질 합성)로 변화시키고 이에 의해 퇴화 과정을 역전시키도록 성장인자들을 사용하는 여러 연구들이 제시되었다.

디스크 복구는 뼈 형태형성 단백질들 (BMP) 및 형질전환 성장인자-β (TGF β)와 같은 성장인자 보충에 의해 증진될 수 있다. 이들 성장인자들은 세포외 기질 생산을 최대화 하고 조직 재생을 촉진시키는 데 직접적으로 적용될 수 있다. 성장인자들의 경제적인 대안으로서, 조직 재생을 위해 링크 N을 사용하는 것이 가능할 수 있다. 인간 링크 N 펩타이드 [DHLSDNYTLDHDRAIH] (서열번호 15)은 아그레칸 G1 도메인 및 하이알루로네이트 간의 비-공유 상호작용을 안정화하는 당단백질인 링크 N의 N-말단 펩타이드이다 (도 19). 인간 링크 N은 인간 관절 연골 및 소의 IVD 세포들에서 콜라겐 및 프로테오글리칸 합성을 시험관내에서 자극할 수 있고 [87-88, 35], 디스크 퇴화의 토끼 모델에서 디스크 높이를 생체내에서 증가시킬 수 있다 [31]. 이전의 연구들은 링크 N이 제 X형 콜라겐, 연골세포 비대의 마커의 발현도 역시 감소시킬 수 있고[89], 제 Ⅱ형 콜라겐, 연골 및 디스크 ECM 형성의 마커의 발현을 자극할 수 있는 [90] 점을 보여주었다. 따라서, 링크 N은 IVD 복구에 필요한 ECM 형성을 촉진하도록 줄기세포들과 함께 사용될 잠재력을 가진다.

지금까지, 디스크 세포들에 미치는 소의 링크 N [DHHSDNYTVDHDRVIH] (서열번호 5)의 효과에 관한 보고들은 전혀 존재하지 않았다. 본 연구의 목적은 잔기들 (굵게 표시됨)의 치환이 BLN 서열에서 발생할 때 링크 N 기능을 변경시키는지 여부를 결정하는지 여부를 결정하기 위하여 소의 IVD 세포들 상에 미치는 소의 링크 N (BLN) 및 인간 링크 (HLN)의 효과들을 비교하는 것이다.

재료 및 방법

소의 디스크 세포 분리

건강한 20-24개월령 거세 송아지들로부터 얻은 꼬리뼈 IVD 세포들이 도살 이후 2-3시간째 지역 도살장으로부터 획득되었다. IVD들은 그들의 인접한 척추체들로부터 분리되었고, 세포들은 이전에 기술된 바와 같이 0.2% 프로나제, 이어서 0.125% 콜라게나제로의 연속적인 소화에 의해 NP 및 AF부위들로부터 분리되었다 [88]. 분리 이후에, NP 및 AF 세포들은 알기네이트 비드들 내에 즉시 포매되거나 단백질 추출을 위해 6웰 플레이트들에 도말되었다.

알기네이트 포매화

분리 이후에 NP 및 AF 세포들은 mL 당 2백만 개 세포들의 농도로 1.2% 알기네이트 (0.15 M NaCl에 용해됨)에서 재현탁되었다. 알기네이트는 활발한 세포 증식의 부재 시 기질 생산에 미치는 효과를 평가하도록 선택되었다 [91-92]. 세포 현탁액의 방울들이 18-게이지 바늘을 통하여 102 mM 염화칼슘 내로 방출되었고 10분 동안 중합하도록 방치하였다. 알기네이트 비드들은 배양 배지 (10% 우태아 혈청 및 항체들이 보충된 높은 포도당의 둘베코 변형 이글 배지)에서 7일 동안 계속하여 안정화되었다.

알기네이트 비드들의 배양 및 처리

안정화 이후에, 알기네이트 비드들은 9개 비드들/웰의 밀도로 24웰 플레이트들에 넣어 두었고 1 ug/mL의 HLN 또는 BLN (캔펩타이드사, Montreal) 둘 중 하나가 보충된 배지에서 18일 동안 배양되었다. 배지 단독으로 동일한 기간 동안 배양된 비드들이 대조군 (CTL)으로서 사용되었다. BLN 및 HLN 보충물의 농도는 1 ug/ml 링크 N이 디스크 세포들에서 프로테오글리칸 합성을 자극하는 데 최대의 반응을 유도한다는 연구를 기초로 하여 선택되었다 [93]. 임의의 표현형 변화가 서로 다른 링크 N 보충 하에서 일어나는 데 충분한 시간을 허용하기 위하여 배양 배지가 18일 동안 3일마다 교환되었다.

디스크 세포들의 배양 및 처리

AF 및 NP 세포들은 6웰 플레이트들 (7.5 x 10⁵개 세포들/웰) 내에서 배양 배지 (10% 우태아 혈청 및 항생제들이 보충된 높은 포도당의 둘베코 변형 이글 배지)로 80 내지 90% 충만도에 도달할 때까지 증식되었다. 세포들은 무-혈청 배지에서 밤샘 동안 전배양되었고, 다음으로 6시간까지 서로 다른 시간대들 동안 1 ug/mL의 HLN 또는 BLN에서 배양되었다. 배지 단독으로 배양된 세포들은 대조군 (CTL)으로서 사용되었다.

세포 생존도

세포 생존도가 생존/사망 형광 검정법 (Live/Dead®, 인비트로겐사 (Invitrogen))을 사용하여 알기네이트 비드들 상에서 18일째 평가되었고 형광현미경에 의해 영상화되었다.

프로테오글리칸 함량

링크 N이 있거나 없는 알기네이트 비드들의 배양 배지가 3일마다 교환되었고, 배지 내로 방출된 설페이트화된 글리코사미노글리칸 (GAG, 우세하게는 아그레칸)이 1,9-디메틸메틸렌 블루 (DMMB) 염료-결합 검정법을 사용하여 분석되었다 [94]. 알기네이트에서 GAG 보유는 알기네이트가 DMMB과 반응하고 따라서 검정법을 간섭하는 다중음이온이기 때문에 측정되지 않았다.

전체 RNA 분리 및 유전자 발현

7일 및 14일째 알기네이트 비드들이 시트레이트 완충액으로 재현탁되었고 세포들은 유전자 발현을 위해 회수되었다. 전체 RNA는 제조사의 지침들에 따라 디스크 세포들로부터 트리졸 (인비트로겐사, Burlington, ON, Canada)을 사용하여 추출되었다. 1 마이크로그램의 전체 RNA가 Superscript™ 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트 (인비트로겐사, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 cDNA로 역전사되었다. 역전사 이후에, 실시간 PCR이 아그레칸 (AGG), ADAMTS-4 및 ADAMTS-5의 신호 수준들을 정량적으로 분석하는 데 적용되었다. 1 마이그로그램의 cDNA는 유전자-특이적 프라이머들을 사용하여 증폭되었다 (표 3). 처음에 표적 유전자의 발현은 18S rRNA 발현 수준들로 정상화되었고, 다음으로 링크 N-배양된 비드들의 발현이 대조군 비드들로 정상화되었다.

단백질 발현

배양된 AF 및 NP 세포들은 다음으로 10mM HEPES, 50mM Na₄P₂O₇, 50mM NaF, 50mM NaCl, 5mM EDTA, 5mM EGTA, 2mM Na₃VO₄, 1% 트리톤 X-100 (모두 시그마-알드리치사로부터 얻음) 그리고 프로테아제 및 포스파타제 저해제 칵테일 (로슈진단사, 캐나다 퀘벡 라발)을 포함하는 완충액 (pH 7.4)으로 용해되었다. 단백질들은 10% 폴리아크릴아마이드 젤들 상에서 분리되었고 웨스턴블럿을 위해 PVDF 막들로 이동되었으며 P-Smad1/5, P-Smad2, Smad1 및 Smad2에게로 유도되는 특이 항체들 (셀스그널링 테크놀로지사, Danvers, MA)을 사용하여 단백질 발현이 측정되었다. 막들은 ESL 화학발광 시약 (GE 헬스케어사, Piscataway, NJ)으로 배양되었고 분자적 촬영기 VersaDoc™ MP 4000 시스템 (바이오-래드 캐나다사, 캐나다 온타리오 미시소가)을 사영하여 스캔되었다. 밴드 강도들은 ImageJ 스프트웨어 프로그램을 사용하는 밀도측정법에 의해 정량되었다. Smad1/5 및 Smad2의 인산화는 해당하는 Smad1 및 Smad2 전체 형태들로 정상화되었다.

통계학적 분석

모든 실험들은 3벌로 수행되었고 3번의 독립적인 배양들로 반복되었다. 각 시간대에서 처리 및 배양 기간의 효과뿐만 아니라 실험적 그룹들 (CTL, BLN 및 HLN) 중에서 차이들의 유의성은 반복된 척도들 ANOVA에 의해 평가되었고 터키의 다수 비교 테스트가 이어졌다. 0.05 이하의 P 수치들은 통계학적으로 유의한 것으로서 고려되었다.

결과

알기네이트 비드 생존도

1 ug/mL의 HLN 또는 BLN의 보충이 AF and NP 세포들의 생존도에 해롭지 않은 점을 확인하기 위하여 세포-접종된 알기네이트 스캐폴드들이 18일 의 기간 동안 배양으로 유지되었다. HLN 또는 BLN 둘 중 하나가 보충된 스캐폴드들의 경우, 세포성 생존도가 > 98%에서 유지되었다 (도 20).

프로테오글리칸 합성에 미치는 소 및 인간 링크 N의 효과

링크 N이 있거나 없이 배양된 NP 및 AF 세포들 둘 다의 경우, 배양 배지 내로 GAG 방출의 속도가 시간에 따라 증가되었다 (도 21 및 도 22). NP 세포들은 AF 세포들과 유사한 전체 GAG 방출을 나타내는 경향이 있었다.

1 ug/mL의 HLN이 보충된 NP 세포들에 의한 GAG 방출은 모든 시간대들에서 대조군보다 유의하게 더 높았다 (3일의 경우 p < 0.05 및 6, 9, 12, 15, 18일의 경우 p < 0.0001). BLN이 보충된 NP 세포들에 의한 GAG 방출과 비교할 때, 이러한 차이는 12일째 시작하여 단지 유의하였다 (p < 0.05). 대조적으로, 증가로의 경향성은 관찰되더라도, 대조군과 비교하여 BLN이 보충된 NP 세포들에 의한 GAG 방출 간에 통계학적 유의성은 전혀 관찰되지 않았다 (도 21).

1 ug/mL의 HLN이 보충된 AF 세포들에 의한 GAG 방출은 6일부터 시작하여 대조군보다 유의하게 더 높았던 한편 (6일의 경우 p < 0.005 및 9, 12, 15, 18일 경우 p < 0.0001), 1 ug/mL의 BLN이 보충된 세포들의 경우 GAG 방출이 9일부터 시작하여 대조군보다 유의하게 더 높았다 (도 22). 마지막으로, GAG 방출이 모든 시간대들에서 BLN보다 HLN이 보충된 AF 세포들에서 더 높은 경향이 있었더라도, 이러한 차이가 유의한 것은 단지 18일째이었다.

우리의 이전의 실험들의 결과들과 유사하게 [95], 알기네이트 비들들에서 최소의 보유를 가진 배양 배지 내에 방출된 GAG 합성의 대부분이 관찰되었다. GAG 방출은 따라서 프로테오글리칸 합성의 척도이고, 이것은 BLN도 역시 GAG 방출을 자극할 수 있는 점을 보여준다.

기질 대사에 미치는 소 또는 인간 링크 N의 효과

프로테오글리칸 및 프로테아제 발현에 미치는 BLN 또는 HLN의 효과를 조사하기 위하여, 소의 세포-접종된 알기네이트 스캐폴드들이 1 ug/mL 링크 N에 노출되었고, 상대적인 유전자 발현도 AGG, ADAMTS-4 및 ADAMTS-5에 대해 평가되었다. 결과들은 링크 N (CTL)에 미노출된 세포들과 비교하여 표현된다. 링크 N 처리들 둘 다는 대조군과 비교할 때 NP 세포들에서 AGG 유전자 발현의 증가를 가져왔지만, HLN 배양과 함께 이러한 증가는 더 크고 통계학적으로 유의하였다 (p = 0.0107) (도 23). AF 세포들에서, AGG 발현은 대조군들과 비교하여 HLN 배양과 반응하여 상승조절되었지만 (p = 0.0257), 유의한 효과는 대조군들과 비교하여 BLN 간에 전혀 관찰되지 않았다 (p > 0.1).

7일째 NP 세포들의 ADAMTS-4 발현에서 중요한 변화가 전혀 관찰되지 않았더라도, 14일째 발현은 미-유의한 감소하는 경향성을 가리켰다 (도 24B). 대조적으로, 차이들이 대조군들과 비교하여 유의하지 않더라도, AF 세포들에서 mRNA ADAMTS-4 발현의 증가가 BLN 및 HLN 배양들과 함께 관찰되었다 (도 24A).

7일째, HLN 배양과 반응하여 ADAMTS-5 발현은 AF 및 NP 세포들 둘 다의 경우 상승조절되었다. 그러나, 이러한 증가는 AF 세포들의 경우에만 유의하였다 (p = 0.0149). BLN 배양과 반응하여 ADAMTS-5 발현은 대조군들과 비교하여 AF 세포들에서 저하조절되었고 (p = 0.0329) NP 세포들에서 상승조절되었다 (p = 0.0058) (도 24C 및 도 24D).

소의 디스크 세포들에서 인간 및 소의 링크 N기능의 조절인자로서 표준적인 Smad-매개성 신호전달

BLN 및 HLN이 소의 NP 및 AF 세포들에서 동화적 반응들을 유도하는 분자적 기작들을 설명하기 위하여, 우리는 BLN 및 HLN이 Smad 표준 신호전달 경로들의 기본적인 신호전달인자들로서 Smad1/5 단백질들을 활성화하는지 여부를 조사하였다.

웨스턴블럿 결과들은 HLN이 소의 AF 세포들에서5분 이내 Smad1/5를 활성화하는 한편 BLN로의 활성화는 10분 이내에 일어나고 30분에서 최대의 활성화를 달성하는 점을 보여주었다 (도 25). 링크 N 둘 다의 보충들의 경우, AF 세포들의 Smad1/5 수준들이 6시간 이후에 대조군 수준들 미만으로 감소되었다. NP 세포들에서, BLN 및 HLN 보충은 30분 이후에 Smad1/5을 유의하게 자극시켰고 시간에 따라 계속 증가되었다. 그러나, IVD 세포들 둘 다의 경우, HLN은 BLN보다 Smad1/5 활성화에 더욱 효과적인것으로 보였다.

AF 세포들에서, HLN 또는 BLN 둘 중 하나가 3시간까지 약간 증가된 Smad2 활성화를 유도하였다. 대조적으로, Smad2 활성화가 링크 N으로 배양된 NP 세포들에서는 전혀 검출되지 않았다 (도 26).

논의

이전의 연구들은 링크 N이 성장인자로서 작용하고 소의 IVD 세포들에서 프로테오글리칸들 및 콜라겐들의 합성을 시험관내에서 자극할 수 있고 [88, 35] 디스크 퇴화의 토끼 모델에서 디스크 높이를 에서 증가시킬 수 있는 점 [31]을 보여주었다. 링크 N은 3-D 스캐폴드뿐만 아니라 미가공 인간 디스크들에서도 인간 디스크 세포들에 의한 프로테오글리칸 합성을 역시 자극할 수 있다 [93]. 본 데이터는 HLN이 프로테오글리칸 합성을 NP 세포들의 모든 시간대들에서 그리고 AF 세포들에서 6일부터 유의하게 자극하였다. BLN이 보충된 NP 세포들은 유의하지 않은 프로테오글리칸 합성의 증가로의 경향성을 나타냈다. 흥미롭게도, BLN이 보충된 AF 세포들의 GAG 방출은 9일부터 대조군보다 유의하게 더 높았으며, BLN이 NP 세포들보다 AF 세포들에서 프로테오글리칸 합성을 자극시키는 데 더욱 효과적인 점을 제시하고 있다. 또한, HLN은 소의 NP 세포들에서 14일 이후에 ADAMTS-4 발현을 저하조절할 수 있지만, AF 세포들에서는 ADAMTS-4 발현에 유의하게 영향을 주지 못한다. AF 세포들에서 증가의 경향성이 관찰되었더라도, BLN은 NP 세포들에서 14일 이후에 ADAMTS-4 발현에 미치는 유의한 효과를 가지지 못하였다. BLN이 AF 세포들에서 ADAMTS-5를 저하조절할 수 있는 한편 NP 세포들에서는 14일 이후 ADAMTS-5를 상승조절할 수 있었다. 마지막으로, BLN 및 HLN는 Smad1/5 신호전달 경로들을 통하여 NP 및 AF 세포들에 의한 프로테오글리칸 합성을 자극하고 있다.

이전에, 세포 증식이 알기네이트에서 활발할 것으로 예상하지 않았더라도 [91-92], 이것이 GAG 생산에서 변화들로 인할 수 있다는 점을 우리는 확인하였다. 본 연구에서 우리는 아그레칸의 신호 수준 및 누적 프로테오글리칸 방출을 분석하였고, 링크 N과 함께 배양된 AF 및 NP 세포들 둘 다의 경우 GAG 방출이 대조군과 비교하여 아그레칸의 mRNA 발현이 증가하면서 증가한 점을 확인하였다. 우리가 관찰하였던 NP 및 AF 세포들에 의한 GAG 합성에서 유사성 그리고 단백질분해성 분리 과정 동안 AF 세포들의 증가된 존재 및 생존은 AF 세포들이 NP 세포들의 기능적 대체물로서 작용할 수 있는 것을 의미할 수 있고, 이는 조직 공학을 위해 유익할 것이다.

BLN이 NP에서 ADAMTS-5를 촉진시키는 한편 AF에서 이를 저하조절한다는 사실은 복구가 디스크 ECM의 리모델링이 관여하고 리모델링이 단백질분해에 관여한다는 사실들에 의해 설명될 수 있다. 따라서, 기질 합성이 교체를 능가하는 한 복구 과정 동안 단백질분해의 완벽한 부재에 대한 필요성이 전혀 존재하지 않는다. HLN 및 BLN은 디스크 기능을 회복하게 돕도록 프로테오글리칸 생산을 촉진시킬 수 있다. HLN이 소의 AF 세포들에서 5분 이내에 Smad1/5를 즉시 활성화하는 한편, BLN로의 활성화가 30분 이내에 점진적으로 일어났던 사실은 HLN 활성화가 직접적일 수 있는 반면 BLN의 활성화는 간접적일 수 있는 점을 제시하고 있다. 간접적인 활성화가 역시 NP 세포들의 경우일 수 있고, 여기에서 BLN 및 HLN로의 보충은 30분 이후에 Smad1/5를 유의하게 자극시켰고 테스트의 지속 기간 동안 (6시간) 계속 증가시켰다. 따라서, AF 및 NP에서 BLN뿐만 아니라 NP에서 HLN은 다음으로 프로테오글리칸 합성을 자극시키는 다른 분자들을 활성화할 수 있다.

AF 세포들에서 BLN에 의한 Smad1/5의 10분 이내 신속한 활성화는 AF 세포들이 프로테오글리칸 합성을 촉진시키는 데 있어 NP 세포들보다 BLN 보충에 더 잘 반응한다는 우리의 연구를 설명할 수 있다. 이전의 연구들은 소의 디스크들로부터 얻은 AF 세포들이 TGF-β로 자극될 때 NP 세포들보다 더 많은 프로테오글리칸을 생산하였던 점을 보여주었다 [96]. 그러나, NP 및 AF 세포들은 유사한 방식으로 반응할 수 있었기 때문에, 이것은 항상 맞지는 않는다 [97]. Smad1/5를 직접적으로 자극하는 링크 N의 능력은 연령의 차이들로 인해 변화할 수 있다. 어린 디스크에서 NP는 프로테오글리칸의 주요한 출처이다. 그러나, AF에서 증가된 프로테오글리칸 함량은 연령 및 퇴화와 함께 [96, 98], 아마도 Smad1/5 신호전달의 직접적인 활성화를 통하여 관찰된다.

둘 다의 펩타이드들이 디스크 복구를 자극하도록 설게된 임의의 제제에 필요한 특징들을 가지더라도, HLN 보충은 초기 단계들 동안, AF가 여전히 미가공인 때 디스크 퇴화를 치료하기 위한 더 나은 선택일 수 있다. 이러한 공리는 잠재적으로 프로테오글리칸 축적과 연관된 증가된 부종으로 인한 NP의 돌출을 예방하기 위하여 최적의 복구를 위한 미가공 AF를 가정한다.

BLN은 NP 및 AF 세포들 둘 다에서 프로테오글리칸 생산을 Smad1/5 신호전달의 간접적인 활성화에 의해 시험관내에서 자극시킬 수 있다. 따라서 기본적으로, BLN 보충은 디스크 퇴화를 위한 선택이 역시 될 수 있다. 1 ug/mL 농도의 HNL은 프로테오글리칸 합성을 자극하는 데 효과적이고, 연령 및 퇴화와 함께 프로테오글리칸 합성의 주요한 출처가 되는 AF에서 Smad1/5 신호전달을 직접적으로 활성화할 수 있다.

약어들의 리스트

18S rRNA: 18S 리보좀 RNA; ADAMTS: 트롬보스폰딘-유사 반복서열들을 가지는 디스인테그린 및 금속프로테아제; AGG: 아그레칸; AF: 섬유태; BLN: 소의 링크 N; BMP들: 소의 형태형성 단백질들; DMMB: 1,9-디메틸메텔렌 블루; ECM: 세포외 기질; GAG: 설페이트화 글리코사미노글리칸; HA: 하이알루로네이트; HLN: 인간 링크 N; IVD: 추간판; LP: 링크 단백질; NP: 수핵; PCR: 중합효소 연쇄반응; RT: 역전사; TGF-β: 형질전환 성장인자-β. 표 3은 유전자 발현을 평가하는 데 사용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머들을 나타낸다.

실시예 8

도 27은 IVD에서 NGF 발현이 퇴화와 함께 NP 및 AF 세포들 둘 다에서 증가하는 점을 보여주는 일련의 세포 염색들 및 면역블럿이다. 도 28은 링크 N이 AF 세포에서 뉴로트로핀들 (NGF 및 BDNF) 및 물질 P (TAC1)의 TNFα 유도성 유전자 발현을 억제하는 점을 나타낸다. 도 29는 링크 N이 AF 세포에서 뉴로트로핀들 (NGF 및 BDNF) 및 물질 P (TAC1)의 IL-1베타 유도성 발현을 억제하는 점을 나타낸다. 도 30 및 도 31은 링크 N의 효과가 뉴트로핀들 및 SP 수용체들의 수준을 감소시키는 단계에 의해 매개되는점을 나타낸다.

도 32는 링크 N이 등급 4의 인간 AF 세포들에서 IL-1베타 유도성 NGF 방출을 억제할 수 있는 점을 나타낸다. 도 33은 링크 N (10 ug/mL) 보충이 손상된 소의 디스크들로부터 천자 이후 24시간째 물질 P 방출을 감소시키는 점을 나타낸다.

NGF 발현 인간 IVD가 퇴화와 함께 증가하는 점이 설명된다. 링크 N은 기계적으로 손상된 IVD들로부터 물질 P 방출을 감소시킨다. 링크 N은 AF 세포들에서 TNF알파 및 IL-1베타 유도성 뉴트로핀 유전자 발현 및 뉴트로핀 수용체들을 유의하게 억제한다.

실시예 9

더 작은 단편들이 활성을 위해 테스트된다. 서열번호 1의 아미노산들 1-4, 4-8 및 3-6의 단편들이 테스트된다. 예로 아미노산들 1-7, 1-6, 1-5 등으로 구성되는, 점점 더 작은 단편들이 활성이 없어질 때까지 테스트된다. 유사하게 NH2 말단으로부터 아미노산들이 제거되는, 아미노산들 2-8, 3-8, 4-8, 5-8 등으로 구성되는 더 작은 단편들이 테스트된다. 다른 구현예들에서 기술된 바와 같이 PCR 분석 및/또는 35S가 해석으로서 사용될 수 있다.

실시예 10

링크 N 단편들은 하기 표에 있는 하나의 종에서 확인된 하나 이상의 아미노산 변화들을 포함할 수 있다. 표 4는 서로 다른 종들의 링크 N을 위한 서열을 나타낸다.

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본 출원은 현재까지 바람직한 실시예들로 고려되는 것들을 참조하여 기술되는 한편, 본 출원이 기재된 실시예들에 제한되지 않는 점이 이해되어야 한다. 이와 반대로, 본 출원은 첨부된 청구항들의 정신 및 범주 내에 포함된 다양한 변형들 및 동등한 배열들을 포괄하도록 의도된다.

모든 출판물, 특허들 및 특허 출원들은 본 명세서에서 각 개별 출판물, 특허 또는 특허 출원이 상세하게 및 개별적으로 그의 전부가 참고문헌으로 통합되도록 표시되는 것처럼 동일한 정도로 그들의 전부가 참고문헌으로 통합된다. 상세하게, 예를 들면 기탁번호들을 포함하는 본 명세서에서 제공된 각 기탁번호와 연관된 서열들 및/또는 표들 또는 기타 부분에서 제공된 바이오마커 서열들 (예로, 단백질 및/또는 핵산)은 그의 전부가 참고문헌으로 통합된다.

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<110> THE ROYAL INSTITUTION FOR THE ADVANCEMENT OF LEARNING/MCGILL UNIVERSITY <120> Methods and Compositions for Treatment of Cartilage and Disc Tissue Pathologies <130> 51140-002WO3 <150> US 61/870,394 <151> 2013-08-27 <150> US 61/975,329 <151> 2014-04-04 <160> 32 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Xaa is Leu or His <400> 1 Asp His Xaa Ser Asp Asn Tyr Thr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp His Leu Ser Asp Asn Tyr Thr 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 3 Asp His His Ser Asp Asn Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Xaa is Leu or His <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> Xaa is Leu or Val <220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> Xaa is Ala or Val <400> 4 Asp His Xaa Ser Asp Asn Tyr Thr Xaa Asp His Asp Arg Xaa Ile 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 5 Asp His His Ser Asp Asn Tyr Thr Val Asp His Asp Arg Val Ile His 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Xaa is any amino acid, optionally Leu, His, Arg, Gln <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> Xaa is Ser or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Xaa is Asp, Ser, or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Xaa is Asn or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> Xaa is Tyr or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> Xaa is Thr or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> Xaa is Leu, Val or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> Xaa is any amino acid, optionally Asp, Gly, Asn or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (11) <223> Xaa is His, Tyr or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> Xaa is Arg or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> Xaa is Ala, Val or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (15) <223> Xaa is Ile or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (16) <223> Xaa is His or Val <400> 6 Asp His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Xaa is any amino acid, optionally Leu, His, Arg, Gln <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Xaa is Asp, Ser or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> Xaa is Leu, Val or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> Xaa is any amino acid, optionally Asp, Gly, Asn or Pro <400> 7 Asp His Xaa Ser Xaa Asn Tyr Thr Xaa Xaa His Asp Arg Val Ile His 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Xaa is Leu or His <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> Xaa is Leu or Val <220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> Xaa is Ala or Val <400> 8 Asp His Xaa Ser Asp Asn Tyr Thr Xaa Asp His Asp Arg Xaa Ile 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp His Leu Ser Asp Asn Tyr Thr Leu Asp His Asp Arg Ala Ile 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 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MOD_RES <222> (3) <223> Xaa is any amino acid, optionally Leu, His, Arg, Gln <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Xaa is Asp, Ser or Asn <400> 31 Asp His Xaa Ser Xaa Asn Tyr Thr 1 5 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Asp His Leu Ser Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Asp Arg Ala Ile His 1 5 10 15

Claims

DHLSDNYT (서열번호 2) 및 DHHSDNYT (서열번호 3)으로부터 선택되는 서열로 이루어진 분리된 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 안정화 모이어티(moiety) 또는 담체와 접합되는(conjugated), 분리된 폴리펩타이드.
제2항에 있어서, 상기 안정화 모이어티는 면역글로불린 Fc 부분 또는 알부민인, 분리된 폴리펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 인코딩하는 분리된 핵산.
제4항의 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 세포.
제6항에 있어서, 상기 세포는 연골세포 계통 세포(chondrocyte lineage cell), 줄기세포 또는 디스크 세포(disc cell)인, 재조합 세포.
제7항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인, 재조합 세포.
연골, 연골 세포 또는 디스크 세포 내에서 또는 연골, 연골 세포 또는 디스크 세포를 포함하는 조직내에서 기질(matrix) 합성을 유도하는 시험관내 방법으로서, 상기 방법이 상기 연골, 연골 세포 또는 디스크 세포를, 프로테오글리칸 또는 콜라겐 합성을 유도하는 조건들 하에서, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 분리된 폴리펩타이드의 유효량과 함께 인큐베이팅 또는 배양(culturing)하여, 증가된 기질 합성과 함께 유도된 연골, 연골 세포 또는 디스크 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 시험관내 방법.
개체 내로 이식하기 위한 연골, 연골 세포 또는 디스크 조직을 생산하는 시험관내 방법으로서, 상기 방법이 연골, 연골 세포 또는 디스크 세포를, 프로테오글리칸 또는 콜라겐 합성을 유도하는 조건들 하에서, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 분리된 폴리펩타이드의 유효량과 함께 인큐베이팅 또는 배양(culturing)하여, 증가된 기질 합성과 함께 유도된 연골, 연골 세포 또는 디스크 세포를 생산하는 단계, 및 전체 세포 집단을 구성하는 세포들에 대해 적어도 65% 순수한 유도된 연골, 연골 세포 또는 디스크 세포의 집단을 분리하는 단계를 포함하는, 시험관내 방법.
연골 또는 디스크 장애의 증상을 완화시키거나 이들을 치료하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물.
제11항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제11항에 있어서, 상기 연골 또는 디스크 장애가 추간판 퇴화이거나, 또는 관절염 또는 석회화로부터 선택되는 염증성 또는 퇴행성 관절 질환인, 약제학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 추간판 퇴화가 초기 단계이거나, 또는 상기 관절염이 골관절염 또는 류마티스 관절염인, 약제학적 조성물.
제11항에 있어서, 상기 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 생체적합성 물질로 형성된 스캐폴드를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
연골 또는 디스크 장애의 증상을 완화시키거나 이들을 치료하기 위한, 제7항 의 재조합 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 상기 재조합 세포를 포함하는 생체적합성 물질로 형성된 스캐폴드를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
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