CN105940011B - 用于治疗软骨和椎间盘组织病变的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了经分离的多肽以及重组细胞及其用途，所述经分离的多肽包含选自下述的肽：i)DHX₁SDNYT，其中X₁是L或H(SEQ ID NO:1)；ii)i)的保守变体；iii)i)或ii)的片段；其中所述保守变体和/或片段保留生物活性，并且所述肽为15个或更少的氨基酸。

Description

用于治疗软骨和椎间盘组织病变的方法和组合物

与相关申请的交叉参考

本申请是专利合作条约申请，其基于35 U.S.C.§119要求于2013年8月27日提交的美国临时专利申请号61/870,394，以及于2014年8月4日提交的美国临时专利申请号61/975,329的利益，所述美国临时专利申请以引用的方式全文并入本文。

技术领域

本公开内容涉及用于治疗软骨和椎间盘病症的方法和组合物，并且具体涉及使用连接N(Link N)片段用于治疗软骨和椎间盘病症，例如关节炎和椎间盘退变的方法和组合物。

背景技术

椎间盘(IVD)连接脊柱内的相邻椎骨。它们由外周纤维环(AF)和中央髓核(NP)组成。AF是具有富含胶原纤维的同心片层的纤维组织(1)。NP具有更无定形的一致性，含具有随机取向和高含量的聚集蛋白聚糖的胶原纤维，所述聚集蛋白聚糖给予NP凝胶状外观且提供抵抗压缩载荷的能力。聚集蛋白聚糖是具有附着至其核心蛋白的众多糖胺聚糖(GAG)链的大蛋白聚糖，所述聚集蛋白聚糖在NP中提供了对抗压缩效应所需的渗透性。

由于耗尽的合成和增加的降解两者，促成椎间盘中的退变性变化的机制导致细胞外基质的组成和结构中的生物化学改变，其中聚集蛋白聚糖对蛋白酶解损害和损失特别敏感。衰老、营养不良、生物力学(2-5)、生物化学(6-10)和遗传影响(11-14)与增加的IVD降解相关。在退变期间，发生NP中的GAG含量损失，从而使其从凝胶状结构变成纤维化质地，因为它变得更多产生胶原，并且在NP和AF两者中出现裂缝(15,16)。这通常与腰痛相关，可能是由于神经向内生长和椎间盘高度丧失，这通过蛋白聚糖耗尽而得到促进(17)。目前，不存在IVD退变的医学治疗，最终留下受损组织的手术切除、插入笼(cage)或假体以恢复IVD空间以及椎骨融合作为唯一提供的选项。虽然这可提供在疼痛缓解中相对良好的临床短期结果(18)，但在许多情况下，它还改变脊柱生物力学，导致后续相邻椎间盘退变。

退变IVD的生物学修复将优于手术切除。

椎间盘退变在生命早期开始，并且随着年龄增加而进展(48、49)。这个过程的特征在于驻留细胞的表型改变，并且导致炎性细胞因子的增加产生(50、51)。许多细胞因子已与椎间盘退变相联系；IL-1β和TNF-α首先得到描述，但另外的候选物例如IL-6和IL-8近来尤其是在动物模型中得到描述(17)。当与健康对照相比较时，除IL-1β和TNF-α之外，来自退变/突出样本的人椎间盘的研究还显示了增加水平的IL-2、IL-4、IL-10、IL-12和IL-17。导致细胞因子产生增加的确切机制并不明确。多重内部和外部线索可影响细胞因子生产，例如遗传、机械负荷、氧合或炎性细胞的存在(17)。另外，特异性基质断裂产物的累积可活化Toll样受体且由此诱导细胞因子生产。

炎性细胞因子已知诱导蛋白酶产生，由于细胞外基质(ECM)包括聚集蛋白聚糖和胶原的降解，所述蛋白酶产生随后导致结构失效和IVD高度丧失(53)。尽管蛋白酶负责ECM的重要组分的断裂和分解，但它们还在椎间盘的正常重塑中具有显著作用。已提出组织蛋白酶K活性连同聚集蛋白聚糖的基质金属蛋白酶(MMP)蛋白酶解主要是椎间盘中的正常组织重塑过程(54、55)。然而，基质金属蛋白酶(MMP1、2、3、7、9、13)、蛋白聚糖酶(ADAMTS4、5)和组织蛋白酶(组织蛋白酶D和L)在椎间盘退变期间全部升高(56、9)。另外，丝氨酸蛋白酶HTRA1被认为在椎间盘退变中起关键作用，因为升高水平的HTRA1及其CHAD降解与椎间盘退变程度关联(10、57)。

髓核(NP)的蛋白质和蛋白聚糖含量降解可导致椎间盘高度以及椎间盘的承重能力丧失。在椎间盘退变的终末期，出现环形圈裂缝，导致NP材料挤出和由于神经压缩的疼痛。疼痛退变性椎间盘的修复策略要求ECM组分的产生和炎性环境中的蛋白酶活性下调。这些特性与几种生长因子例如TGF-β和BMP 7相关(58-61)。然而，生长因子在临床实践中的使用受其高成本和潜在副作用限制。

骨关节炎(OA)是影响数百万人的慢性退变性关节病症。它的特征在于由于软骨细胞的合成代谢和分解代谢活性中的失衡的关节软骨破坏。关节软骨是无血管结缔组织，覆盖可动关节的骨性部分，从而通过吸收和分散载荷而允许关节的无摩擦运动。这些特性涉及其细胞外基质(ECM)的组成和结构。它由胶原纤维、蛋白聚糖(主要是聚集蛋白聚糖)、非胶原蛋白质和高含量的水组成。关节软骨中的唯一细胞类型是软骨细胞，并且负责细胞外基质的合成和维持。

在特征在于关节软骨的降解和滑膜炎症的骨关节炎(OA)期间，这种平衡由于来自基质的胶原和蛋白聚糖的降解增加和分子的合成耗尽而被破坏。软骨响应复杂多样的自分泌和旁分泌(合成代谢和分解代谢)因子，所述因子调节软骨细胞中的基因表达和蛋白质合成。

基质降解通过由白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的基质金属蛋白酶(MMP)以及ADAMTS-4和-5介导，所述IL-1β是OA中牵涉的主要细胞因子。已牵涉OA发病机制的其他细胞因子包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)，IL-6，其他常见的c链细胞因子例如IL-2、IL-7、IL-15和IL-21，以及趋化因子。通过滑膜细胞和软骨细胞产生的这些因子导致基质金属蛋白酶(MMP)以及具有凝血酶敏感蛋白基序的解聚素和金属蛋白酶(ADAMTS)酶家族成员的上调。MMP涉及ECM周转和软骨降解。衰老、肥胖和关节损伤与增加的OA相关。它的特征在于所有关节组织中的进行性细胞和分子变化，所述关节组织包括关节软骨、软骨下骨、滑膜、韧带和关节周围的肌肉。目前不存在逆转或修复OA患者中的软骨降解的疗法。

普遍认为因为炎症过程在各种风湿性疾病例如OA和类风湿性关节炎(RA)的发病机制中起基础作用，所以炎症活性的选择性抑制对于疗法是至关重要的，并且NF-κB转录因子家族在该过程中起显著作用。因此几个研究已涉及使用非类固醇抗炎药、皮质类固醇、营养制品、反义DNA疗法、RNA干扰和抗风湿药的NF-κB途径的药理学调节。

连接N是16个氨基酸的序列，其已显示增加通过IVD细胞的蛋白聚糖合成以及其他基质组分的产生(29、34)。它还已显示增加兔椎间盘穿刺退变模型中的椎间盘高度，由此也在体内证实了再生潜力(31)。这种天然存在的肽代表连接蛋白的N末端区域，其使椎间盘和软骨两者中的蛋白聚糖聚集体稳定，并且在体内组织周转期间通过MMP生成。连接N与骨形态生成蛋白(BMP)II型受体相互作用，并且活化培养的兔IVD细胞中的Smad1/5信号传导(33)。

已测试了连接N的片段。Wang等人报道当他们评估许多较短的连接N衍生肽(33)，包括跨越氨基酸残基1-12的肽时，连接N的刺激效应丧失。

发明内容

本公开内容的一个方面包括经分离的多肽，其包含选自下述的肽：

i)DHX₁SDNYT，其中X₁是L或H(SEQ ID NO:1)；

ii)i)的保守变体；

iii)i)或ii)的片段；

其中所述保守变体和/或片段保留生物活性，并且所述肽为15个或更少的氨基酸。

在一个实施例中，经分离的多肽包含由下述组成的肽序列：1)DHLSDNYT(SEQ IDNO:2)；和/或其保留生物活性的保守变体，或2)DHHSDNYT(SEQ ID NO:3)或其保留生物活性的保守变体。

在另一个实施例中，经分离的多肽包含选自下述的肽：

i)DHX₁SDNYTX₂DHDR X₃I，其中X₁是L或H，X₂是L或V，并且X₃是A或V(SEQ ID NO:4)；

ii)i)的保守变体；和

iii)i)或ii)的片段；

其中所述保守变体和/或片段保留生物活性。

另一个方面包括经分离的核酸，其编码包含连接N片段肽的多肽。

进一步方面包括载体，其包含i)编码包含连接N片段肽的多肽的核酸；或2)连接N片段多肽。

进一步方面是表达包含连接N片段肽的多肽的重组细胞。

另外一个方面是包括包含连接片段多肽的多肽的组合物、表达包含连接N片段肽的多肽的重组细胞。

本发明还描述了用于制备和使用所述产物的方法。

本公开内容的其他特点和优点由于下述详述将变得显而易见。然而，应理解详述和具体例子在指示本公开内容的优选实施例的同时，仅为了举例说明而给出，因为在本公开内容的精神和范围内的各种变化和修饰由于该详述对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图说明

本公开内容的一个实施例现在将与附图相关进行描述，其中：

图1a-图1b：通过牛或人椎间盘细胞的蛋白聚糖合成。在连接N(1μg/mL)、混杂S-连接N(1μg/mL)、逆转R-连接N(1μg/mL)或者不含肽补充的培养基的存在下48小时后，通过评估³⁵SO₄掺入来估计合成。显示了在牛髓核(NP)和纤维环(AF)细胞(图1a)，以及人髓核(NP)和内部纤维环(iAF)细胞(图1b)中的相对蛋白聚糖表达。数据表示为相对于通过暴露于单独培养基的对照细胞的掺入的比率的平均值±SD(n＝3)。其中p≤0.05(*)的值视为显著的。

图2：连接N在培养基中的稳定性。连接N在37℃、5％CO₂下在培养基中温育48小时，并且通过质谱法跟踪完整肽的峰强度。等分试样在6、12、24、36和48小时进行分析。数据标绘为相对于在时间0时的信号强度的比率。曲线是三个代表性实验之一。

图3a-图3b：连接N在细胞的存在下的稳定性。连接N在人NP(图3a)或AF(图3b)细胞的存在下，在37℃、5％CO₂下温育48小时，并且通过质谱法跟踪完整肽的峰强度。等分试样在6、12、24、36和48小时进行分析。数据标绘为相对于在时间0时的信号强度的比率。曲线是用来自三个不同供体的细胞进行的三个代表性实验之一。

图4a-图4c：经加工的连接N的质谱法。(图4a)在培养基中由人NP(黑色)和AF(灰色)细胞检测到的肽的质谱法。在曲线图中指出了具有964.4Da质量的断裂的连接N。964.4Da肽在2个不同区域中从柱中洗脱，具有约23和32分钟的保留时间。(图4b)具有964.4Da的两种可能的连接N片段：连接N1-8(以深灰色突出显示)和连接N 4-11(以浅灰色突出显示)的图示。(图4c)通过串联MS鉴定所生成的964.4Da片段的氨基酸序列。序列通过评估所生成的肽的断裂产物加以证实。主要的检测峰为A[(845.3Da)DHLSDNY(SEQ ID NO: 19)(+1)]、B[(682.28Da)DHLSDN(SEQ ID NO:20)(+1)]和C[(568.2Da)DHLSD(SEQ ID NO: 21)(+1)]，为仅可通过1-8序列生成的质量。

图5a-图5b：通过牛和人细胞响应连接N片段的蛋白聚糖合成。在连接N(1μg/mL)、连接N1-8(0.5μg/mL)、连接N 9-16(0.5μg/mL)或不含肽补充的培养基的存在下48小时后，通过评估³⁵SO₄掺入来估计合成。显示了在牛髓核(NP)和纤维环(AF)(图5a)，以及人髓核(NP)和内部纤维环(iAF)细胞(图5b)中的相对蛋白聚糖表达。数据表示为相对于通过暴露于单独培养基的对照细胞的掺入的比率的平均值±SD(n＝3)。其中p≤0.05(*)的值视为显著的。

图6：使连接1-16暴露于描述为涉及椎间盘退变的蛋白酶。使连接1-16暴露于MMP3、7、12、13，组织蛋白酶L、K和B，ADAMTS 4、5和HTRA1，并且使用质谱法定量峰面积强度。A)完整的连接N1-16肽的相对强度。B)连接N1-8肽的相对强度。C)连接N 9-16肽的相对强度。

图7：在炎性环境中通过牛和人细胞响应连接N片段的蛋白聚糖合成。在补充有连接N(1μg/mL)、连接N1-8(0.5μg/mL)、连接N 9-16(0.5μg/mL)的含IL-1培养基，或不含肽补充的培养基中48小时后，通过评估³⁵SO₄掺入来估计合成。显示了在牛髓核(NP)和纤维环(AF)(图7的(A))，以及人髓核(NP)和内部纤维环(iAF)细胞(图7的(B))中的相对蛋白聚糖表达。数据表示为相对于通过暴露于含IL-1培养基的细胞产生的蛋白聚糖的比率的平均值±SD(n＝3)。其中p≤0.05(*)的值视为显著的。

图8：在炎性环境中响应连接N在人骨关节炎(OA)软骨中的蛋白聚糖(GAG)浓度。蛋白聚糖浓度在OA软骨外植体中进行测定，所述OA软骨外植体与连接N(1μg/ml)、含IL-1培养基(5ng/ml)、共暴露于连接N和IL-1、或不含肽补充的培养基(对照)一起温育21天。结果呈现为针对对照标准化的在软骨中保留的GAG百分比。其中p≤0.05(*)的值视为显著的。

图9：在人骨关节炎软骨中的聚集蛋白聚糖核心蛋白和新近合成的II型胶原的分析。(A)在对照、连接N、IL-1以及连接N和IL-1两者处理的软骨中的聚集蛋白聚糖(AGG)核心蛋白的免疫印迹，以及分子量约320kDa的完整的聚集蛋白聚糖核心蛋白的半定量分析。(B)在对照、连接N、IL-1以及连接N和IL-1两者处理的软骨中的II型胶原(Col II)的免疫印迹，以及分子量360kDa的胶原的半定量分析。结果表示为来自不同供体的四个软骨样品的平均值±SD(*p<0.05)。

图10：在人骨关节炎软骨中的MMP-13和X型软骨(Col X)表达的分析。(A)在对照、连接N、IL-1以及连接N和IL-1两者处理的软骨中的MMP-13的免疫印迹，以及分子量55kDa的MMP-13蛋白的半定量分析。(B)在对照、连接N、IL-1以及连接N和IL-1两者处理的软骨中的X型胶原的免疫印迹，以及分子量60kDa的胶原α链的半定量分析。结果表示为来自不同供体的四个软骨样品的平均值±SD(*p<0.05)。

图11：在炎症环境中来自补充有连接N的OA和正常供体的软骨细胞中的NFkB分析。软骨细胞对照、连接N处理的、IL-1处理的、连接N(10ng/ml)+IL-1、连接N(100ng/ml)+IL-1和连接N(1000ng/ml)+IL-1中的NFkB的蛋白质印迹分析。结果表示为来自不同供体的三个实验的平均值±SD(*p<0.05)。结果证实IL-1诱导的NF-kB活化在正常人软骨细胞(图11的A))和OA软骨细胞(图11的B))中被连接N剂量依赖性压制。

图12：椎间盘中的蛋白聚糖浓度。在具有经诱导的退变的椎间盘，用连接N、MSC、连接N和MSC两者处理的椎间盘，以及非退变对照椎间盘中测定蛋白聚糖浓度。结果表示为来自不同牛尾的七个椎间盘的平均值±SD。(*p<0.05)

图13：椎间盘中的蛋白聚糖的尺寸分布。将从具有不同处理的七个椎间盘中分离的蛋白聚糖合并，并且通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。蛋白聚糖通过甲苯胺蓝染色进行显现。

图14.椎间盘中的聚集蛋白聚糖核心蛋白的分析。在退变对照、连接N处理、MSC处理、连接N和MSC两者处理、以及无退变对照椎间盘中分子量约320kDa的完整的聚集蛋白聚糖核心蛋白的免疫印迹和半定量分析。结果表示为来自不同牛尾的七个椎间盘的平均值±SD。(*p<0.05)

图15.椎间盘中的新近合成的II型胶原的分析。在退变对照、连接N处理、MSC处理、连接N和MSC两者处理、以及无退变对照椎间盘中分子量120kDa的II型胶原α链的免疫印迹和半定量分析。结果表示为来自不同牛尾的七个椎间盘的平均值±SD。(*p<0.05)

图16：在椎间盘的髓核区域中的蛋白聚糖分布。在用下述注射后，将具有胰蛋白酶诱导的退变的椎间盘培养14天：连接N、MSC或连接N和MSC。这些与退变对照和非退变对照椎间盘相比较。椎间盘通过组织学使用番红O染色进行评估(比例尺，100μm)。

图17：MSC的标记和跟踪。A.使用PKH67试剂盒标记MSC细胞膜(绿色荧光，箭头)，并且使用荧光显微镜检查评估标记效率。B.标记的MSC在扩增培养基中培养两天，并且使用荧光显微镜检查验证维持的标记。C.在器官培养中14天后，在NP区域中测定标记的MSC的存在。D.C的放大。

图18：在胰蛋白酶诱导的退变后2周时，连接N1-8对牛椎间盘器官培养物中的蛋白聚糖合成、聚集蛋白聚糖和II型胶原表达的作用。(A)在具有经诱导的退变的椎间盘、具有经诱导的退变且用连接N1-8处理的椎间盘、以及非退变对照椎间盘中，在处理后2周时测定椎间盘中的蛋白聚糖浓度。结果表示为来自不同牛尾的三个椎间盘的平均值±SD。(*p<0.05)。(B)在具有经诱导的退变的椎间盘、具有经诱导的退变且用连接N1-8处理的椎间盘、非退变对照椎间盘以及用连接N1-8处理的非退变椎间盘中，在处理后2周时新近合成的分子量约360kDa的II型胶原的免疫印迹和半定量分析。结果表示为来自不同牛尾的七个椎间盘的平均值±SD。(*p<0.05)。(C)在具有经诱导的退变的椎间盘、具有经诱导的退变且用连接N1-8处理的椎间盘、非退变对照椎间盘以及用连接N1-8处理的非退变椎间盘中，在处理后2周时分子量约320kDa的完整的聚集蛋白聚糖核心蛋白的免疫印迹和半定量分析。结果表示为来自不同牛尾的七个椎间盘的平均值±SD。(*p<0.05)。

图19：稳定聚集蛋白聚糖G1结构域和透明质酸盐之间的相互作用的连接蛋白的图示。连接蛋白(LP)稳定聚集蛋白聚糖G1结构域和透明质酸盐(HA)之间的相互作用。该图还描绘了人连接N[DHLSDNYTLDLDRAIH(SEQ ID NO:32)]和牛连接N[DHHSDNYTVDHDRVIH(SEQ ID NO:5)]、连接蛋白的N末端部分，并且突出显示了如牛序列中出现的残基置换(以粗体标记)。

图20：在补充有人或牛连接N的海藻酸盐中培养的牛椎间盘细胞的细胞活力。细胞活力使用

Viability/Cytotoxicity Assay进行测量。在海藻酸盐中嵌入的牛椎间盘(IVD)细胞在补充有1ug/ml牛(BLN)或人(HLN)连接N的培养基中温育18天。在单独的培养基中培养相同时间段的珠子用作对照(CTL)。在18天后，收获珠子并且评价细胞活力。关于所有珠子的细胞活力评价为>98％(白色亮点)。

图21：通过在1.2％海藻酸盐中成珠的髓核牛细胞释放到培养基内的累积糖胺聚糖。在1.2％海藻酸盐中成珠的髓核(NP)牛细胞在补充有牛(BLN)或人(HLN)连接N(1μg/ml)的培养基中进行培养，或者暴露于单独的培养基(CTL)。对于每种条件，在培养3、6、9、12、15和18天时收集培养基。通过1,9-二甲基亚甲蓝(DMMB)染料结合测定，测量释放到培养基内的硫酸糖胺聚糖(GAG)。结果呈现为箱式图，其中箱代表一式三份执行的三次独立实验的合并数据的中间50％(25％–75％百分位数)(*p<0.05或***p<0.0001)。

图22：通过在1.2％海藻酸盐中成珠的纤维环牛细胞释放到培养基内的累积糖胺聚糖。在1.2％海藻酸盐中成珠的纤维环(AF)牛细胞在补充有牛(BLN)或人(HLN)连接N(1μg/ml)的培养基中进行培养，或者暴露于单独的培养基(CTL)。对于每种条件，在培养3、6、9、12、15和18天时收集培养基。通过1,9-二甲基亚甲蓝(DMMB)染料结合测定，测量释放到培养基内的硫酸糖胺聚糖(GAG)。结果呈现为箱式图，其中箱代表一式三份执行的三次独立实验的合并数据的中间50％(25％–75％百分位数)(**p<0.005或***p<0.0001)。

图23：聚集蛋白聚糖基因表达中的变化。在补充有1μg/ml牛(BLN)或人连接N(HLN)的培养基中温育后1周时，在1.2％海藻酸盐中成珠的纤维环(AF)和髓核(NP)牛细胞的聚集蛋白聚糖(AGG)基因表达中的变化。基因表达通过RT-PCR进行测量。18S rRNA用作看家基因且用于标准化结果。值表示为相对于暴露于单独的培养基(CTL)的细胞，暴露于连接N的细胞的基因表达的比率。(*p<0.05,**p<0.001)。

图24：聚集蛋白聚糖ADAMTS-4和ADAMTS-5基因表达中的变化。在补充有1μg/ml牛(BLN)或人连接N(HLN)的培养基中温育后1周和2周时，在1.2％海藻酸盐中成珠的纤维环(AF)和髓核(NP)牛细胞的((A)、(B))ADAMTS-4和((C)、(D))ADAMTS-5基因表达中的变化。基因表达通过RT-PCR进行测量。18S rRNA用作看家基因且用于标准化结果。值表示为相对于暴露于单独的培养基(CTL)的细胞，暴露于连接N的细胞的基因表达的比率。(*p<0.05,**p<0.001)。

图25：牛或人连接N对纤维环和髓核牛细胞中的Smad1/5活化的作用。纤维环(AF)和髓核(NP)牛细胞在补充有1μg/ml牛(BLN)或人连接N(HLN)的培养基中培养6小时。蛋白质表达通过免疫印迹使用针对总Smad1和磷酸-Smad1/5的特异性抗体进行分析。描述一式三份执行的三次独立实验的合并数据的定量结果呈现为平均值±标准差(*p<0.05；**p<0.01；

^§p<0.0001)。在凝胶上的条带对于一个代表性实验显示。

图26：牛或人连接N对纤维环和髓核牛细胞中的Smad2活化的作用。纤维环(AF)和髓核(NP)牛细胞在补充有1μg/ml牛(BLN)或人连接N(HLN)的培养基中培养6小时。蛋白质表达通过免疫印迹使用针对总和磷酸-Smad2的特异性抗体进行分析。描述一式三份执行的三次独立实验的合并数据的定量结果呈现为平均值±标准差(*p<0.05)。在凝胶上的条带对于一个代表性实验显示。

图27：在来自具有退变的2至4级(AF和NP区域)的人椎间盘中的NGF表达。该图是一系列组织染色和免疫印迹，其显示人IVD中的NGF表达随着退变而增加。

图28：连接N压制纤维环(AF)细胞中TNFα刺激的神经营养因子(NGF和BDNF)和P物质(TAC1)的表达。来自2级人椎间盘的AF细胞用连接N(1μg/ml)+TNFα(100ng/ml)或单独的TNFα(100ng/ml)刺激24小时。结果显示为使用四个不同供体的四次独立实验的平均值±S.D.。*相对于对照p<0.05。

图29：连接N压制纤维环(AF)细胞中IL-1β刺激的神经营养因子(NGF和BDNF)和P物质(TAC1)的表达。来自2级人椎间盘的AF细胞用连接N(1μg/ml)+IL-1β(10ng/ml)或单独的IL-1β(10ng/ml)刺激24小时。结果显示为使用四个不同供体的四次独立实验的平均值±S.D.。*相对于对照p<0.05。

图30：连接N压制TNFα刺激的神经营养因子(TRKA和TRKB)和P物质(TAC1R)受体的表达。在连接N(1μg/ml)+TNFα(100ng/ml)或单独的TNFα(100ng/ml)补充后刺激24小时，通过来自2级人椎间盘的纤维环(AF)的神经营养因子和P物质基因表达中的变化。结果显示为使用四个不同供体的四次独立实验的平均值±S.D.。*相对于对照p<0.05。

图31：连接N压制IL-1β刺激的神经营养因子(TRKA和TRKB)和P物质(TAC1R)受体的表达。在连接N(1μg/ml)+IL-1β(10ng/ml)或单独的IL-1β(10ng/ml)补充后刺激24小时，通过来自2级人椎间盘的纤维环(AF)的神经营养因子和P物质基因表达中的变化。结果显示为使用四个不同供体的四次独立实验的平均值±S.D.。*相对于对照p<0.05。

图32：在与连接N一起温育的AF细胞的培养基中的NGF基因表达和释放的分析。在用连接N、IL-1β或连接N和IL-1β处理的4级AF细胞中，分子量约27kDa的NGF蛋白质的蛋白质印迹和半定量分析。结果表示为来自不同供体的4个椎间盘的平均值±SD(*p<0.05)。

图33：是牛尾骨IVD的照片和证实连接N减少来自受损的牛IVD的P物质释放的曲线图。在用辣椒素处理、仅穿刺或穿刺+连接N(10μg/ml)补充后4或24小时，通过牛椎间盘释放的P物质中的变化。结果显示为四次独立实验的平均值±S.D.。*相对于对照p<0.05。

具体实施方式

I.定义

如本文使用的，术语“软骨细胞”意指例如在软骨组织中发现，并且可用于产生软骨组织的软骨细胞谱系细胞。

如本文使用的，术语“软骨细胞谱系细胞”意指软骨细胞以及这样的细胞，其在细胞化学上相似且表达软骨细胞标记物，包括例如Sox9和胶原II，并且表现为软骨细胞。软骨细胞可为关节软骨谱系软骨细胞或能够过度增生的肥大谱系软骨细胞。

如本文使用的，术语“软骨组织”意指软骨组织和以及这样的组织，其在组织学上相似且表达软骨标记物，例如胶原II和聚集蛋白聚糖，并且表现为软骨，包括关节软骨组织和/或生长板软骨样组织。

如本文使用的，术语“保守变体”意指包含一个或多个保守氨基酸置换的连接N多肽片段。

如本文使用的，“保守氨基酸置换”是其中一个氨基酸残基替换为另一个氨基酸残基，而不取消肽的所需特性的置换。合适的保守氨基酸置换可通过置换彼此具有相似疏水性、极性和R链长的氨基酸进行制备。保守氨基酸置换的例子包括：

如本文使用的，术语“培养”包括在贴壁、悬浮或3D细胞和/或器官培养中温育和/或传代细胞。3D细胞或器官培养物可包括其中细胞在3维支架中或3维支架上进行培养的培养物。

如本文使用的，术语“椎间盘细胞”意指NP或AF细胞谱系的细胞。

如本文使用的，术语“富集”或“富集的”意指一个类型细胞的得率(部分)增加超过该类型细胞在起始培养或制剂中的部分至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％。富集和部分纯化可互换使用。

细胞群体可使用不同方法例如基于标记物例如细胞表面标记物的方法(例如FACS分选等)进行富集。

如本文使用的，术语“表达”指细胞中的多核苷酸转录或多肽翻译，使得与在未与该分子(例如连接N片段)接触或暴露于该分子的细胞中的水平相比较，分子的水平在已与该分子接触或暴露于该分子的细胞中可测量地更高。测量分子表达的方法是本领域普通技术人员众所周知的，并且包括但不限于RNA印迹、RT-PCR、原位杂交、蛋白质印迹和免疫染色例如FACS。

术语“杂交”指与互补核酸的序列特异性非共价结合相互作用。杂交在至少中等严格条件下进行。在一个优选实施例中，杂交在高度严格条件下。促进杂交的适当严格条件是本领域技术人员已知的，或可在Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.16.3.6的Current Protocols中找到。例如，可采用在约45℃下6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)15分钟，随后为在50℃下2.0 x SSC的15分钟洗涤。严格性可基于在洗涤步骤中使用的条件加以选择。例如，洗涤步骤中的盐浓度可选自在50℃下约0.2 x SSC共15分钟的高严格性。另外，洗涤步骤中的温度可在高严格条件下，在约65℃下15分钟。

“至少中等严格杂交条件”意指选择为促进溶液中的两种互补核酸分子之间的选择性杂交的条件。杂交可对核酸序列分子的全部或一部分发生。杂交部分通常为长度至少约15(例如20、25、30、40或50)个核苷酸。本领域技术人员将认识到核酸双链体或杂交物的稳定性由Tm决定，所述Tm在含钠缓冲液中是钠离子浓度和温度的函数(Tm＝81.5℃–16.6(Log10[Na+])+0.41(％(G+C)–600/l)，或相似等式)。相应地，洗涤条件中决定杂交物稳定性的参数是钠离子浓度和温度。为了鉴定与已知的核酸分子相似但非等同的分子，1％错配可假定为导致Tm中的约1℃减少，例如如果寻求具有>95％序列同一性的核酸分子，则最终洗涤温度将下降约5℃。基于这些考虑，本领域技术人员将能够容易地选择适当的杂交条件。在优选实施例中，选择严格杂交条件。例如，下述条件可用于实现严格杂交：在5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5x Denhardt’s溶液/1.0％SDS下在基于上述等式的Tm-5℃下的杂交，随后为在60℃下0.2x SSC/0.1％SDS共15分钟的洗涤。中等严格杂交条件包括在3x SSC中在42℃下15分钟的洗涤步骤。然而，应理解等价严格性可使用替代缓冲液、盐和温度来实现。关于杂交条件的另外指导可在下述中发现：Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.,1989,6.3.1–6.3.6中的Current Protocols，以及Sambrook等人，MolecularCloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2000，第三版。

如本文使用的，术语“序列同一性”指两个多肽序列或两个核酸序列之间的序列同一性百分比。为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，序列就最佳比较目的进行比对(例如可在第一氨基酸序列或核酸序列中引入缺口，用于与第二氨基酸或核酸序列的最佳比对)。随后比较在相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处是等同的。两个序列之间的同一性百分比是由序列共享的等同位置数目的函数(即同一性％＝等同的重叠位置数目/总位置数目乘以100％)。在一个实施例中，两个序列是相同长度。两个序列之间的同一性百分比测定还可使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性例子是Karlin和Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264-2268的算法，如Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5877中修饰的。此类算法并入Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序内。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST核苷酸程序参数设置来执行，例如得分＝100，字长＝12，以获得与本专利申请的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用XBLAST程序参数设置来执行，例如得分-50，字长＝3，以获得与本文描述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口的比对，Gapped BLAST可如Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述利用。可替代地，PSI-BLAST可用于执行迭代搜索，其检测分子间的遥远关系(同上)。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数(参见例如NCBI网站)。两个序列之间的同一性百分比可使用类似于上文描述的那些的技术进行测定，允许或不允许缺口。在计算同一性百分比中，通常仅计数确切匹配。在一个实施例中，经分离的核酸可用作引物。

如本文使用的，术语“经分离的”指已从包含该组分的混合或异质环境中取出且分开的组分(例如多肽、核酸、重组细胞、经诱导的细胞)。例如就多肽而言，术语“经分离的多肽”指蛋白质性质试剂，例如肽、多肽或蛋白质，当重组产生时，其基本上不含细胞材料或培养基，或者当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学品。如本文使用的，术语“多肽”指由在链中键合在一起的多个氨基酸残基组成的聚合物，并且可包括包含天然存在的氨基酸以及经修饰的碱基的聚合物。

就核酸而言意指A、G、T、C和或经修饰的残基的聚合物，例如DNA、RNA和cDNA，当通过重组DNA技术产生时，其基本上不含细胞材料或培养基，或者当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学品。“经分离的核酸”还基本上不含天然侧接核酸由其衍生的核酸的序列(即，位于核酸的5'和3'末端处的序列)。术语“核酸”意欲包括DNA和RNA，并且可为双链的或单链的。

就经分离的细胞群体而言指已从混合或异质细胞群体中取出且分开的细胞群体。在一些实施例中，经分离的群体是与细胞由其分离或富集的异质群体相比较基本上纯的细胞群体。

如本文使用的，术语“连接N”意指通过MMP由连接蛋白切割的天然存在的16个氨基酸的肽，并且包括具有序列DHLSDNYTLDHDRAIH(SEQ ID NO:15)的人连接N以及具有序列DHHSDNYTVDHDRVIH(SEQ ID NO:5)的牛连接N。它在关节和椎间盘两者中产生，并且促进通过椎间盘(NP和AF)和关节软骨(软骨细胞)细胞的聚集蛋白聚糖/胶原合成。

如本文使用的，术语“连接N片段”意指包含选自下述的肽的多肽：i)DHX₁SDNYT，其中X₁是L或H(SEQ ID NO:1)；ii)i)的保守变体；或者iii)i)或ii)的片段；其中所述保守变体和/或片段保留生物活性，并且所述肽为15个氨基酸或更少。连接N片段可例如为具有选自SEQ ID NO 1-6中任何一个的序列、其保留生物活性的保守变体和/或片段的多肽。

如本文使用的，术语“间充质干细胞”或MSC指在不同条件下，具有分化成超过一个分化的间充质细胞类型的能力的细胞。MSC包括经诱导的间充质干细胞和未经诱导的干细胞。

就特定细胞群体而言的术语“基本上纯的”指就构成总细胞群体的细胞而言，至少约65％、优选至少约75％、至少约85％、更优选至少约90％、且最优选至少约95％纯的细胞群体。

如本文使用的，术语“受试者”包括动物界的所有成员，包括哺乳动物，优选人。

当应用于经分离的细胞时，术语“治疗/处理(treat)”、“治疗/处理(treating)”、“治疗/处理(treatment)”等包括使细胞经历任何类型的过程或条件，或者对细胞执行任何种类的操作或程序。当应用于受试者时，该术语指对受试者提供内科或外科关注、护理或管理。

当应用于受试者时，如本文使用的术语“治疗/处理(treatment)”指旨在获得有益或所需结果包括临床结果的方法，且包括医疗程序和应用包括例如药物干预、手术、放射疗法和自然疗法的干预措施，以及用于治疗软骨和/或椎间盘组织病变的测试治疗。有益或所需临床结果可包括但不限于一种或多种症状或状况的减轻或改善、疾病程度减少、疾病的稳定化(即非恶化)状态、预防疾病传播、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分还是总体)、无论是可检测的还是不可检测的。治疗可包括例如将经分离的连接N片段多肽施用于受试者，或植入细胞或移植用经分离的连接N片段多肽处理的组织和/或表达所述多肽的重组细胞。如本文使用的，术语“施用”、“植入”和“移植”在通过导致所引入的细胞在所需部位处至少部分定位的方法或途径，将本文描述的经分离的多肽、细胞、组织和/或产物递送到受试者内的背景下是可互换使用的。细胞可直接植入至椎骨或关节，或可替代地通过导致对受试者中的所需位置的递送的任何适当途径施用。

在理解本公开内容的范围时，如本文使用的，术语“包含”及其衍生物预期是开放式术语，其指定所述特点、元素、组分、组、整数和/或步骤的存在，但不排除其他未陈述的特点、元素、组分、组、整数和/或步骤的存在。前述还应用于具有相似含义的单词，例如术语“包括”、“具有”及其衍生物。

如本文使用的，术语“由……组成”及其衍生物预期是封闭式术语，其指定所述特点、元素、组分、组、整数和/或步骤的存在，并且还排除其他未陈述的特点、元素、组分、组、整数和/或步骤的存在。

此外，如本文使用的，程度术语例如“基本上”、“约”和“大约”意指被修饰术语的合理的偏差量，使得最后结果并无显著变化。这些程度术语应解释为包括被修饰术语至少±5％的偏差，如果该偏差不取消它修饰的单词的含义。

更具体而言，术语“约”意指加上或减去对其作出提及的数目的0.1至50％、5-50％、或10-40％、10-20％、10％-15％、优选5-10％、最优选约5％。

如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。因此，例如含有“化合物”的组合物包括两种或更多种化合物的混合物。还应注意到术语“或”一般以其包括“和/或”的含义使用，除非上下文另有明确说明。

在特定部分中所述的定义和实施例预期可应用于它们对于其是合适的本文描述的其他实施例，如本领域技术人员理解的。

本文通过端点叙述的数字范围包括在该范围内的所有数字和分数(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。还应理解所有数字及其分数假定为由术语“约”进行修饰。

此外，所述定义和实施例预期可应用于它们对于其是合适的本文描述的其他实施例，如本领域技术人员理解的。例如，在本文段落中，本发明的不同方面更详细地进行定义。如此定义的每个方面可与任何其他一个或多个方面组合，除非明确指出相反。特别地，指示为优选的或有利的任何特点可与指示为优选的或有利的任何其他一个或多个特点组合。

此外，在特定部分中描述的定义和实施例预期可应用于它们对于其是合适的本文描述的其他实施例，如本领域技术人员理解的。例如，在下文段落中，本发明的不同方面更详细地进行定义。如此定义的每个方面可与任何其他一个或多个方面组合，除非明确指出相反。特别地，指示为优选的或有利的任何特点可与指示为优选的或有利的任何其他一个或多个特点组合。

III.方法和产物

如本文描述的已发现包含前8个氨基酸的连接N片段诱导且恢复器官培养物中的细胞外蛋白聚糖水平，并且还诱导在椎间盘细胞和软骨细胞中，包括在炎症环境中的蛋白聚糖和胶原II合成。例如，如实例3中证实的，当骨关节炎外植体在IL-1β的存在下用连接N进行处理时，GAG含量与对照相比较显著增加。蛋白质印迹分析揭示当与单独的IL-1β相比较时，这还导致活性形式的MMP-13的数量中的减少。当来自OA软骨的外植体在IL-1β的存在下用连接N进行处理时，可提取的II型胶原的数量也是增加的。连接N在来自正常和OA患者的软骨细胞中显著抑制IL-1β刺激的P-P65(NF-kB)。

此外，证实牛连接N(BLN)还在椎间盘细胞中诱导蛋白聚糖和胶原II合成，如人连接N(HLN)一样。

连接N是16个氨基酸的肽。在本公开内容之前，不知道连接N的片段是否存在和/或有活性。例如，Wang等人(33)报道包含连接N的前12个氨基酸的连接N片段不具有活性。

一个方面包括经分离的多肽(本文被称为连接N片段或连接N片段多肽)，其包含选自下述的肽：

i)DHX₁X₂X₃ X₄X₅X₆(SEQ ID NO:30)；

其中X1是任何氨基酸，任选L、H、R Q；

X2是S或L；

X3是D、S或N；

X4是N或D；

X5是Y或S；和/或

X6是T或Y；

ii)i)的保守变体；和/或

iii)i)和/或ii)的片段；

其中所述保守变体和/或片段保留生物活性，并且所述肽为15个或更少的氨基酸。

连接N序列的例子在实例10中提供。在一个实施例中，连接N片段多肽包括所述的序列或基于由实例10中所述序列可测定的保守基序的序列。

在一个实施例中，经分离的多肽包含由下述组成的肽：DHX₁SX₃ NYT(SEQ ID NO:31)，其中X1是任何氨基酸，任选L、H、R Q，和/或X3是D、S或N；其保守变体和/或片段；其中所述保守变体和/或片段保留生物活性，并且所述肽为15个或更少的氨基酸。

在一个实施例中，经分离的多肽(本文被称为连接N片段或连接N片段多肽)包含选自下述的肽：

i)DHX₁SDNYT，其中X₁是L或H(SEQ ID NO:1)；

ii)i)的保守变体；和

iii)i)和/或ii)的片段；

其中所述保守变体和/或片段保留生物活性，并且所述肽为15个或更少的氨基酸。

保守变体b)可例如包含一个或多个保守变体置换。

在一个实施例中，生物活性是结合BMP受体II型和/或SMAD 1/5活性的活化。

在一个实施例中，所涵盖的保守变体多肽是与混杂或逆转连接N相比较，结合BMP受体II且活化SMAD1/5活性的那些多肽。

片段c)可例如为SEQ ID NO:1、2、3、4或5的4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸或7个氨基酸。该片段可包含最N末端的氨基酸或最C末端的氨基酸。

例如，更小的片段可如例如实例9中所述就活性进行测试。

在一个实施例中，与混杂或逆转连接N相比较，该片段结合BMP受体II且活化SMAD1/5活性。

BMP受体II结合和/或SMAD活化可例如如文献中例如Wang等人(33)中所述进行评价。

在一个实施例中，肽由其中X₁是L或H的DHX₁SDNYT(SEQ ID NO:1)或者其保留生物活性的保守变体组成。

在另一个实施例中，经分离的多肽包含由DHLSDNYT(SEQ ID NO:2)或其保留生物活性的保守变体组成的肽序列。

在另一个实施例中，经分离的多肽包含由DHHSDNYT(SEQ ID NO:3)或其保留生物活性的保守变体组成的肽序列。在一个实施例中，经分离的多肽包含由DHLSDNYT(SEQ IDNO:2)或DHHSDNYT(SEQ ID NO:3)组成的肽。

更大的片段包括连接N(例如人或牛连接N)的最高达15个氨基酸。在一个实施例中，肽是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。

相应地，在一个实施例中，经分离的多肽包含选自下述的肽：

i)DHX₁X₂X₃ X₄X₅X₆X₇ X₈ X₉DX₁₀ X₁₁X₁₂,X₁₃,(SEQ ID NO:6)

其中X1是任何氨基酸，任选L、H、R Q；

X2是S或L；

X3是D、S或N；

X4是N或D:

X5是Y或S；

X6是T或Y；

X7是L V或T；

X8是任何氨基酸，任选D G、N或P；

X9是H Y或P；

X10是R或Q；

X11是A V或D；

X12是I或R；和/或

X13是H或V；

ii)i)的保守变体；和/或

iii)i)和/或ii)的片段；

其中所述保守变体和/或片段保留生物活性，并且其中所述肽为15个或更少的氨基酸，并且一个或多个邻接C末端和/或N末端残基被缺失。

在一个实施例中，经分离的多肽包含选自下述的肽：

i)DHX₁SX₃ NYTX₇X₈ HDRVIH(SEQ ID NO:7)或DHX₁SDNYTX7DHDRX12I(SEQ ID NO:8)；其中X₁是L或H，X₇是L或V，和/或X12是A或V；

ii)i)的保守变体；和

iii)i)和/或ii)的片段；

其中所述保守变体和/或片段保留生物活性。

在另一个实施例中，经分离的多肽包含序列DHLSDNYTLDHDRAI(SEQ ID NO:9)或者其保留生物活性的保守变体和/或片段。

在另一个实施例中，经分离的多肽包含序列DHHSDNYTVDHDRVI(SEQ ID NO:10)或者其保留生物活性的保守变体和/或片段。

本文证实共享81％序列同一性的牛连接N和人连接N均具有生物活性。相应地，在一个实施例中，经分离的多肽包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6具有至少80％、85％、90％、95％序列同一性的肽。在一个实施例中，对应于SEQ ID NO:4的X₁、X₂和/或X₃的残基是经修饰的。

在一个实施例中，该片段是SEQ ID NO:4、5或6的4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸或15个氨基酸。该片段可包含最N末端的氨基酸或最C末端的氨基酸。

在一个实施例中，与混杂或逆转连接N相比较，该片段结合BMP受体II且活化SMAD1/5活性。

在一个实施例中，经分离的肽缀合至固体支撑物，任选凝胶型支撑物例如具有官能团分布的溶剂化聚合物，例如聚苯乙烯：与1–2％二乙烯苯交联的苯乙烯；聚丙烯酰胺：聚苯乙烯的亲水替代物；聚乙二醇(PEG)：PEG-聚苯乙烯(PEG-PS)。在一个实施例中，固体支撑物是例如由PEG-聚丙二醇网络或PEG与聚酰胺或聚苯乙烯组成的基于PEG的支撑物。在一个实施例中，固体支撑物是表面型支撑物，包括例如可控孔径玻璃、纤维素纤维和高度交联的聚苯乙烯。在一个实施例中，固体支撑物是复合物例如由刚性基质支撑的凝胶型聚合物。

在一个实施例中，经分离的多肽包含一个或多个被保护基团。在一个实施例中，经分离的多肽具有N末端保护基团。在一个实施例中，经分离的多肽具有C末端保护基团。在一个实施例中，经分离的多肽具有侧链保护基团。

在一个实施例中，经分离的肽包含N被保护基团。

在一个实施例中，经分离的多肽包含Fmoc保护基团。在一个实施例中，经分离的多肽包含t-Boc保护基团。Fmoc。在一个实施例中，保护基团是苄氧羰基(Benzylozycarbonyl)(Z)。在一个实施例中，经分离的多肽具有alloc保护基团。在另一个实施例中，经分离的多肽具有平板印刷(lithographic)保护基团。

在一个实施例中，经分离的多肽在树枝状聚合物中配置或包含在树枝状聚合物中。在一个实施例中，树枝状聚合物包含缀合至树枝状聚合物支架的至少2、至少3、至少4或更多个本文描述的经分离的多肽。在一个实施例中，树枝状聚合物支架是聚赖氨酸支架。

在一个实施例中，经分离的多肽缀合至载体部分例如PEG或白蛋白、珠子。

在一个实施例中，肽缀合至选自归巢部分、稳定化部分、保护部分和施用部分的活性部分，任选地其中所述活性部分是蛋白质性质的。

例如，稳定化部分可为抵抗天然降解和/或蛋白质周转的氨基酸的蛋白质序列，例如免疫球蛋白Fc部分、白蛋白等等，任选地其中所述部分缀合至经分离的肽的N末端和/或C末端。

在一个实施例中，经分离的多肽缀合至可检测或纯化标签，例如部分，例如可附加或引入重组蛋白质内的肽序列，并且可用于检测其表达或纯化多肽。在一个实施例中，纯化标签经由接头缀合至经分离的肽，所述接头包含蛋白酶解切割位点。

在一个实施例中，经分离的肽包含在脂质体或纳米颗粒中。在一个实施例中，脂质体是缓慢释放脂质体。在一个实施例中，脂质体是聚乙二醇化的脂质体。

进一步方面是编码本文描述的经分离的连接N片段多肽的经分离的核酸。经分离的核酸可为裸露的或包含在载体中。在一个实施例中，本发明还提供的是与核酸(其编码本文描述的经分离的连接N片段多肽)杂交的核酸。在一个实施例中，核酸是密码子优化的。

相应地，进一步方面包括包含本文描述的经分离的核酸和/或经分离的多肽的载体。载体可包括用于核酸的逆转录病毒载体、腺病毒载体和DNA病毒载体，以及用于多肽的脂质体或纳米颗粒。在一个实施例中，载体是脂质体或纳米颗粒。在一个实施例中，脂质体是缓慢释放脂质体。

经分离的多肽和/或核酸可使用重组技术进行制备和或用合成方法合成。

在一个实施例中，经分离的多肽合成产生且是非糖基化的或与人体内表达多肽相比较是差异糖基化的。

在一个实施例中，经分离的多肽是环化的。在一个实施例中，经分离的多肽包含一个或多个D氨基酸或者一个或多个L氨基酸。

进一步方面包括表达本文描述的经分离的连接N片段多肽和/或包含本文描述的经分离的核酸或载体的重组细胞。

可制备表达本公开内容的连接N片段的各种重组细胞。例如，细胞可用载体进行转化、转染或转导，所述载体包含编码本专利申请的连接N片段的核酸。

在一个实施例中，细胞是软骨细胞谱系细胞、干细胞或椎间盘细胞，任选地其中干细胞是间充质干细胞。在一个实施例中，重组细胞用于治疗用途。

进一步方面是包含本文描述的经分离的多肽和任选的载体或稀释剂的组合物。

在另一个方面，本发明还提供的是包含本文描述的经分离的核酸、载体或重组细胞的组合物。

在一个实施例中，稀释剂是生理缓冲液，任选无菌生理缓冲液。

在一个实施例中，组合物是包含药学可接受的载体或稀释剂的药物组合物。

经分离的多肽、经分离的核酸、载体、重组细胞可任选是冻干的，或者在液体、凝胶或固体组合物中。

组合物可为冻干粉末或者水性或非水性溶液或悬浮液，其还可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质。可存在于此类组合物中的其他组分包括例如水、表面活性剂(例如Tween)、醇、多元醇、甘油和植物油。

用于核酸的合适稀释剂包括但不限于水、盐水溶液和乙醇。

用于多肽和/或细胞的合适稀释剂包括但不限于盐水溶液、pH缓冲溶液和甘油溶液或适合于冷冻多肽和/或细胞的其他溶液。

组合物还可包含稳定剂例如还原剂、疏水添加剂和加入生理缓冲液中的蛋白酶抑制剂。

在一个实施例中，组合物包含由生物相容性材料形成的支架，所述生物相容性材料包含本文描述的经分离的多肽、重组细胞和/或组合物。

在一个实施例中，生物相容性材料选自海藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、聚己内酯和/或透明质酸(或透明质酸盐)基生物材料。还可使用用于软骨细胞和/或IVD细胞的一般支架。

在实施例中，支架形成为水凝胶、微球体、微胶囊、海绵、泡沫或纤维。

在一个实施例中，组合物用于制备用于移植到受试者内的软骨或椎间盘细胞，该组合物包含本文描述的经分离的多肽和/或重组细胞、软骨和/或椎间盘细胞和载体或稀释剂，其中所述软骨和/或椎间盘细胞暴露于有效量的所述经分离的多肽和/或重组细胞，所述有效量足以诱导软骨细胞和/或椎间盘细胞，以增加蛋白聚糖和/或胶原II合成。在将组合物施用于受试者后，组合物和/或组合物的细胞可进行分离且用于例如治疗受试者中的组织病变。

在一个实施例中，药物组合物用于治疗受试者中的软骨或椎间盘组织病变，该组合物包含本文描述的经分离的多肽和/或重组细胞、软骨和/或椎间盘细胞和药学可接受的载体或稀释剂，其中所述治疗包括使软骨和/或椎间盘细胞暴露于有效量的所述经分离的多肽和/或重组细胞，所述有效量足以诱导软骨细胞和/或椎间盘细胞，以增加蛋白聚糖和/或胶原II合成，在将组合物施用于受试者后，用于治疗受试者中的组织病变。

在一个实施例中，组合物(包括药物组合物)包含由生物相容性材料形成的支架，并且其中所述软骨和/或椎间盘细胞设置在支架上或支架中。

在一个实施例中，包含软骨和/或椎间盘细胞的组合物在施用前培养至少1天、至少2天、至少3天、至少4天或至少5天。

另一个方面包括诱导软骨和/或椎间盘细胞或者包含软骨和/或椎间盘细胞的组织中的基质合成，任选蛋白聚糖合成和/或胶原II合成的方法，该方法包括在诱导蛋白聚糖合成的条件下，使软骨和/或椎间盘细胞与有效量的如本文描述的经分离的多肽、表达所述经分离的多肽的重组细胞和/或组合物一起温育，从而产生具有增加的基质合成的经诱导的软骨和/或椎间盘细胞。

基质合成可例如通过如实例中所述评价蛋白聚糖和/或胶原II合成进行测量。

在一个实施例中，该方法在体外细胞培养、任选椎间盘器官培养中进行，以产生具有增加的基质合成的细胞或组织。

在一个实施例中，细胞和/或组织在产生软骨的条件下接触，任选用于软骨移植。

在一个实施例中，软骨细胞(cartilage cell)是软骨细胞(chondrocyte)。在一个实施例中，椎间盘细胞是AP细胞，任选iAP细胞。在另一个实施例中，椎间盘细胞是NP细胞。在一个进一步的实施例中，使用例如包含AP和NP的混合细胞群体。在一个实施例中，组织包含软骨谱系细胞。在一个实施例中，组织包含AP和/或NP谱系细胞。

在一个实施例中，重组细胞是表达本文描述的经分离的多肽的MSC。

在一个实施例中，软骨细胞、椎间盘细胞和/或组织在受试者中，并且接触通过给受试者施用本文所述权利要求14或15的经分离的多肽、重组细胞或组合物来进行。

在一个实施例中，将经诱导的软骨和/或椎间盘细胞引入受试者内。

在一个实施例中，软骨细胞和/或椎间盘细胞是在体外进行处理的自体细胞。例如，在软骨镶嵌术中，从例如膝盖的非承重区域获取小的通常为环形的(4-8mm)自体移植物。在一个实施例中，在获取自体移植物之前和/或在将自体移植物再引入以尝试促进修复时，注射或施用连接N。例如，这可帮助修复收获部位，和/或治疗植入部位可促进在移植物周围和在其中获得移植物的区域的修复。

另一个方面包括产生用于植入受试者内的软骨和/或椎间盘组织的方法，该方法包括在诱导蛋白聚糖合成的条件下，使软骨和/或椎间盘细胞与有效量的如本文描述的经分离的多肽、表达所述经分离的多肽的重组细胞和/或组合物一起温育/培养，从而产生具有增加的基质合成，任选增加的蛋白聚糖合成的经诱导的软骨和/或椎间盘细胞；和分离基本上纯的经诱导的软骨和/或椎间盘细胞群体。

在一个实施例中，基质包含软骨基质。在一个实施例中，软骨基质包含蛋白聚糖和/或胶原例如胶原II。

在一个实施例中，蛋白聚糖合成是聚集蛋白聚糖。

在一个实施例中，软骨和/或椎间盘细胞在包含支架，例如如实例中所述的海藻酸盐支架的3D培养物中进行培养。

在一个实施例中，将经诱导的软骨和/或椎间盘细胞植入受试者内。

在一个实施例中，例如大约0.5微克/mL用于细胞培养中和/或用于施用。在另一个实施例中，使用约0.5微克/mL至约10mg/ml，任选约10微克/mL、约100微克/mL、约1000微克/mL、约2微克/mL、约3微克/mL、约4微克/mL、约5微克/mL、约6微克/ml、约7微克/mL、约8微克/mL约9微克/mL或约10微克/mL。在一个实施例中，剂量是0.5微克直到约10mgs的任何10微克/mL增量。在一个实施例中，量是重量/体积。在一个实施例中，施用每注射量。例如，在一个实施例中，每腰椎间盘注射最高达约1mg或每关节引入最高达1mg。

进一步方面包括减轻与软骨和/或椎间盘组织病变有关的症状和/或治疗软骨和/或椎间盘组织病变的方法，该方法包括给有此需要的受试者施用本文描述的经分离的多肽、重组细胞、经诱导的软骨和/或椎间盘细胞和/或药物组合物。

在一个实施例中，症状是疼痛。如图27-30中证实的，IVD中的NGF表达随着NP和AF细胞两者中的退变而增加，并且连接N可压制AF细胞中TNFα诱导的神经营养因子(NGF、BDNF)和P物质(TAC1)的基因表达。图29证实连接N压制AF细胞中IL-1β诱导的神经营养因子(NGF、BDNF)和P物质(TAC1)的表达。神经营养因子和P物质是疼痛介质。

在一个实施例中，软骨和/或椎间盘组织病变是椎间盘退变。在一个实施例中，椎间盘退变是早期。例如，早期椎间盘退变包括汤普森(Thompson)1、2和/或3级退变，或任选地同时AF是基本上完整的，例如如经成像例如MRI可测定的。晚期椎间盘变性可包括例如汤普森4级、汤普森5级或更大的退变，和/或其中融合已发生。例如，本文描述的产物和方法可用于治疗和/或预防融合后的邻近椎间盘退变。

灵敏和/或定量MRI方法可用于选择适合于接受本文描述的治疗的受试者。在一个实施例中，治疗预防地施用，例如在可检测退变之后但在疼痛性退变椎间盘之前，以修复和/或延迟退变。

在一个实施例中，受试者具有减少的细胞密度和/或代谢活性，任选地其中减少的细胞密度和/或代谢活性是由于年龄。

在一个实施例中，软骨和/或椎间盘组织病变是选自关节炎、不希望的骨生成和/或钙化的炎性或退行性关节病。

在一个实施例中，关节炎是骨关节炎。

在另一个实施例中，关节炎是类风湿性关节炎。

在一个实施例中，软骨和/或椎间盘组织病变是骨质疏松。在一个实施例中，软骨和/或椎间盘组织是骨质溶解。

在一个实施例中，软骨和/或椎间盘组织病变是机械性损伤。

在一个实施例中，受试者是任选选自人、马、牛、山羊或狗的哺乳动物。在一个实施例中，受试者是人。

已显示BMP受体II表达的丧失在小鼠模型中引起内皮炎症和动脉粥样硬化。连接N已显示结合BMP II型受体，并且在本文中显示抑制NFκB活化。相应地，进一步方面是减轻内皮炎症和/或动脉粥样硬化的症状和/或治疗患有内皮炎症和/或动脉粥样硬化的受试者的方法，该方法包括给有此需要的受试者施用本文描述的经分离的连接N片段多肽、重组细胞、经诱导的软骨和/或椎间盘细胞和/或药物组合物。

在一个实施例中，将经分离的多肽、重组细胞和/或药物组合物在支架中施用于受试者。

经分离的连接N多肽、重组细胞、经诱导的细胞或药物组合物可经皮和/或在组织病变部位附近或在组织病变部位处施用于受试者。对于椎间盘组织病变，可通过椎间盘内注射例如注射到NP、AF任选内部AF内，将经分离的连接N片段多肽、重组细胞和/或经诱导的细胞施用、植入或移植到受试者内。对于关节病变，可通过注射到受累区域内，将经分离的连接N片段多肽、重组细胞和/或经诱导的细胞施用、植入或移植到受试者内。在一些实施例中，例如如软骨镶嵌术中完成的自体细胞和/或组织被切除，如所述的处理且再植入。

在一个实施例中，可通过注射到滑液内，将经分离的连接N片段多肽、重组细胞和/或经诱导的细胞施用、植入或移植到受试者内。在一个实施例中，当受试者具有植入支架例如以修复损害时，施用可通过注射到/引入包埋的植入支架内来进行。

在一个实施例中，包含软骨细胞和/或MSC和/或经诱导的细胞的现有的离体支架还可浸渍有经分离的连接N多肽、包含本文描述的连接N片段产物的组合物。支架随后可注射到有此需要的受试者内。

椎间盘和软骨修复可通过间充质MSC和连接N补充得到增强，以使细胞外基质产生达到最大。

在一个实施例中，经分离的连接N片段多肽、重组细胞、经诱导的细胞和/或包含前述中的一种或多种的组合物用于修复椎间盘损害。天然椎间盘退变可涉及裂缝的产生。为了修复此类损害，连接N片段和干细胞可在可聚合支架中植入，所述可聚合支架将填充损害且允许所引入试剂的均匀分布。

在一个进一步的实施例中，经分离的多肽或包含经分离的多肽的药物组合物在组合疗法中施用。

在一个实施例中，受试者已接受任选如本文描述处理或未经处理的植入物。受试者例如施用本文描述的经分离的多肽，以增加蛋白聚糖产生。

在一个实施例中，该方法还包括使细胞或组织接触与本文描述的经分离的多肽、重组细胞或组合物组合的MSC，或者给受试者施用与本文描述的经分离的多肽、重组细胞或组合物组合的MSC。

上文公开内容一般描述了本专利申请。更全面的理解可通过参考下述具体实例而获得。这些实例仅为了举例说明的目的而描述，并且不预期限制本专利申请的范围。考虑了如环境可建议或致使方便的以等价形式和置换的变化。尽管本文已采用具体术语，但此类术语预期以描述性含义而不是用于限制的目的。

下述非限制性实例是本公开内容的举例说明：

实例

实例1

目前，不存在预防、停止或甚至延缓起于椎间盘退变的背痛的治疗。先前研究已显示连接N可充当生长因子且刺激IVD中的蛋白聚糖和胶原合成。然而，涉及调节细胞活性的连接N中的序列并未得到充分了解。为了测定椎间盘细胞是否可蛋白酶解地加工连接N，使人椎间盘细胞经过48小时时期暴露于天然连接N，并且如下文进一步描述的，质谱法分析揭示跨越残基1至8的肽在AF细胞而非NP细胞的存在下生成。连接N1-8在IL-1βNP和AF细胞的存在下显著诱导蛋白聚糖产生，证实生物学效应在该肽的前8个氨基酸中得到维持，并且指示该效应在炎性环境中持续。

连接N在调节细胞活性中的独特效应提示序列和/或基序特异性相互作用。然而，较不明确的是连接N在生物系统中是否是稳定的。还研究了连接N在生物系统中的命运。

方法与材料

材料

链霉蛋白酶来自Calbiochem(Darmstadt，德国)。胶原酶1A、GlutaMAX、NaCl和甲酸购自Sigma(St.Louis,MO,USA)。低粘度海藻酸盐(Keltone LV)得自Kelco Chemical Co.(San Diego,CA,USA)。青霉素/链霉素、硫酸庆大霉素、两性霉素B、达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)和胎牛血清(FCS)得自Gibco(Burlington,ON，加拿大)。制备海藻酸盐珠子的20G 1 1/2英寸针得自BD syringes,(Concord,ON，加拿大)。HPLC级别乙腈购自Rathburn(Walkerburn，苏格兰)。胰蛋白酶Gold质谱法级别购自Promega(Madison,WI,USA)。具有整合的0.2mL Glass-Micro-Insert,15mm顶部的TopSert,TPX-Short Thread-Vial,32x11.6mm购自Skandinaviska GeneTec AB(

瑞典)。Vydac UltraMicro

Silica C18

柱购自The Nest Group(Southborough,MA,USA)。测序级别胰凝乳蛋白酶购自Roche Diagnostics GmbH(Mannheim,德国)。³⁵SO₄,2mCi，稳定化水溶液购自PerkinElmer(Montreal,Quebec，加拿大)。NUNC 6孔培养板购自Corning Inc.(Edmonton,Alberta,加拿大)。MMP 3、7、12、13，ADAMTS 4、5来自R&D Systems(Minneapolis,MN)。HTRA1来自Thermo Scientific(Waltham,MA)。提供了组织蛋白酶K、B和L。

连接N肽

连接N，DHLSDNYTLDHDRAIH(SEQ ID NO:15)；逆转连接N，HIARDHDLTYNDSLHD(R-Link N)(SEQ ID NO:16)，混杂的连接N，DLNRAHLHIDYHTDSD(S-Link N)(SEQ ID NO:17)，连接N前8个肽残基DHLSDNYT(Link N 1-8)(SEQ ID NO:2)，以及第二8肽残基，LDHDRAIH(LinkN 9-16)(SEQ ID NO:18)，由CanPeptide(Pointe Claire,QC，加拿大)合成。使用来自Institut Pasteur,Paris，法国(http://mobyle.pasteur.fr)的生物信息学工具，设计混杂的16个氨基酸的肽序列。序列选择为模拟连接N的总体特性，例如原始肽的等电点和溶解度。肽原液(10mg/mL)在补充有HEPES的DMEM中进行制备，并且在使用前将pH调整至7.4。

组织源

人胸腰脊柱通过Transplant Quebec器官捐赠计划获取。椎间盘得自7个供体，1个男性和6个女性，具有29.6岁的平均年龄以及16至47岁的年龄范围(表1)。从研究中排除具有近期化学疗法、对脊柱的放射疗法或显著长期瘫痪的供体。脊柱获取在死亡8小时内执行。在研究中不包括具有钙化和椎间盘高度丧失的椎间盘。所有程序均得到MontrealGeneral Hospital的机构审查委员会批准。

来自18-27月龄阉牛的牛尾在宰杀6小时内得自当地屠宰场。

人和牛IVD细胞的分离

使人和牛IVD与毗邻椎体分开，并且对于牛IVD分成NP和AF，对于人IVD分成NP和内部纤维环(iAF)。来自人外部纤维环(oAF)的组织不用于本研究中的细胞分离。如先前描述的(63)，从每个区域中酶促分离细胞。简言之，将NP和AF组织分割成大约2-mm厚的小片，在含有50μg/mL庆大霉素、100ug/mL青霉素、100U链霉素和0.25μg/mL两性霉素B的PBS中洗涤两次，随后用0.2％链霉蛋白酶消化1小时，随后为对于NP以0.01％并且对于AF组织以0.04％的胶原酶IA型在无血清DMEM中消化4小时。

人IVD细胞的单层培养物

为了评估连接N的稳定性，将来自NP和AF区域的新鲜分离的人细胞在6孔培养板中以250,000细胞/孔的密度铺平板。细胞在37℃、5％CO₂下在3mL DMEM中进行培养，所述DMEM含有4.5g/L葡萄糖并且补充有10％FCS、25mmol/L HEPES、50μg/mL硫酸庆大霉素、0.25μg/mL两性霉素B、50μg/mL L-抗坏血酸盐和2mmol/L GlutaMAX。孔在暴露于连接N(1μg/mL)前静置2天。在固定时间点(0小时、6小时、12小时、24小时、36小时和48小时)收集200μL培养基。还在不存在细胞的情况下，在相同时间点研究肽的稳定性。

连接N的蛋白酶处理

使300μg连接N1-16在10种不同的蛋白酶的存在下温育30分钟、2和24小时。用于MMP 3、7、12、13，ADAMTS 4、5，HTRA1的缓冲液由50mM Tris-HCl、200mM NaCl、5mM CaCl₂、0.01％Rapigest组成。对于组织蛋白酶K、B和L，消化缓冲液由2.5mM DTT、0.15％硫酸软骨素A、0.1M乙酸钠，pH 5.5组成。

质谱法

根据标准方案(Harvard Apparatus,Holliston,MA)，在C18旋转柱上纯化从上文描述的单层培养物收集的25μL培养基样品或肽消化物。洗脱的肽在20μL 2％乙腈和0.2％甲酸(FA)中重构。注射样品，并且使用三重四极杆质谱仪TSQ Vantage^TM(ThermoScientific,Waltham,MA)进行定量，所述质谱仪配备简单的纳米-LC系统(ThermoScientific)。质谱仪以SRM模式进行操作，其中Q1和Q3设为单位分辨率(FWHM 0.7Da)。使用+1,700V的喷雾电压，伴随270℃的加热离子转移设置用于去溶剂化。使用Xcalibur软件(版本2.1)获得数据。使用的移动相为A(在水中的0.1％FA)和B(在0.1％FA中的100％乙腈)。分离在填充有Reprosil-Pur C18-AQ树脂(3μm，Dr.Maich GmbH，瑞士)的10μm尖端、75μm x15cm毛细管柱(PicoTip^TM发射器，New Objective,Woburn,MA)上执行。注射1μL样品，并且使用97％移动相A 5分钟、85％A 8分钟、65％A 42分钟和19％A 45-50分钟的梯度，以300nL/分钟的流速执行分离。

用于连接N肽的多重反应监控方法(MRM)得到开发，优化且与来自转变的峰面积总和一起使用，连接1-16转变：641.30(3+)-->863.41(y7),641.30-->748.38(y6),641.30-->611.33(y5)和641.30-->682.28(b6)，连接1-8转变：964.40(1+)-->845.43(b7)-->682.87(b6)-->568.23(b5)-->453.20(b4)-->712.31(y6)-->849,37(y7)，连接9-16转变：488.75(2+)-->821.43(b7)-->708.34(b6)-->496.30((y4)-->611.32(y5)-->748.38(y6)。使用Skyline 1.4软件(MacCoss Lab Software,University of Washington,Seattle,WA)分析MRM数据。

如先前描述的(64)，还通过将8μL样品注射到与电喷射离子肼质谱法联机的反相液相色谱系统(LC ESI MS)上运行发现实验，以便鉴定肽的任何断裂。

在3D支架中的IVD细胞培养

为了比较对各种连接N肽的代谢应答，如先前描述的(65)，将来自NP和AF区域的新鲜分离的人细胞和牛细胞嵌入1.2％海藻酸盐珠子中。在海藻酸盐珠子中的细胞在37℃、5％CO₂下在DMEM中进行培养，所述DMEM含有4.5g/L葡萄糖并且补充有10％FCS、25mmol/LHEPES、50μg/mL硫酸庆大霉素、0.25μg/mL两性霉素B、50μg/mL L-抗坏血酸盐和2mmol/LGlutaMAX。使珠子稳定7天，并且在进一步处理之前，通过

测定来评价细胞活力。随后在0.5mL DMEM中在等摩尔浓度的连接N(1μg/mL)、R-连接N(1μg/mL)、S-连接N(1μg/mL)、连接N1-8(0.5μg/mL)或连接N 9-16(0.5μg/mL)的存在下，在48孔板中培养5粒珠子/孔。将25μCi/mL ³⁵SO₄加入培养基中，以允许评价蛋白聚糖合成(66)。另外，使珠子暴露于单独的IL-1β(10ng/mL)或肽和IL-1β的组合48小时(51)。在培养期结束时，收集培养基且在18.2Ω(

3)时针对miliQ水彻底透析，随后为用1M MgSO₄冷追踪2小时，以去除任何剩余的未掺入的³⁵SO₄。使用β闪烁计数器(Beckman Coulter LS6500,BeckmanCoulter,Mississauga，加拿大)来测量³⁵SO₄掺入。

统计分析

执行单尾配对t检验，并且值p≤0.05视为显著的。

结果

16个氨基酸的连接N肽已知在经分离的椎间盘细胞和完整的人椎间盘中诱导蛋白聚糖合成，并且还在兔椎间盘穿刺退变模型中增加椎间盘高度(34、31、29)。然而，并不明确该效应是严格序列依赖性的还是归于肽的总体特性。合成了肽的三种变体以解决这点：天然(连接N)、逆转的(R-连接N)和混杂的(S-连接N)，并且³⁵SO₄掺入用于评价响应肽的蛋白聚糖合成。使牛和人NP和AF细胞暴露于1μg/mL肽48小时。牛细胞显示响应连接N在蛋白聚糖合成中的统计上显著的增加(NP p＝0.03,AF p＝0.03)，但当细胞暴露于逆转或混杂的肽时，未观察到效应(图1a)。人细胞显示相似趋势，具有响应天然连接N的显著增加(NP p＝0.008,AF p＝0.02)，并且不响应混杂或逆转的肽，从而指示序列特异性应答(图1b)。与NP细胞相比较，牛和人AF细胞两者均显示朝向更强应答的趋势。

肽稳定性或维持的活性是重要的，以便确保持续的治疗效应。因此，执行质谱法分析以评估溶液中的连接N的稳定性。分子量为1922Da的天然连接N在37℃下在培养基中温育48小时，并且使用靶向质谱法定量肽强度直到48小时。在该时间段未发现1922Da连接N肽的丧失(图2)，从而指示该肽在溶液中在37℃下是稳定的。

代谢活性的细胞具有加工短肽且由此可能改变其生物效应的潜力(67-69)。为了测定椎间盘细胞是否可蛋白酶解地加工连接N，使单层中的人椎间盘细胞经过48小时时期暴露于天然连接N，并且定量1922Da肽的峰面积强度，以便评价其命运。发现该肽在NP细胞的存在下稳定至少48小时(图3a)。然而，在AF细胞的存在下到6小时检测到连接N中的减少，并且在48小时后仅存在痕量，从而证实AF细胞具有加工连接N肽的能力。

为了鉴定连接N的加工产物，分析范围为0–1930Da的质谱中较短肽的存在。当比较来自NP和AF细胞的含有连接N的培养基时，显而易见的是质量为964.4Da的肽在AF细胞培养基中累积(图4a)。相同肽在NP细胞培养基中仅以极低水平存在(图4a)。964.4肽在2个不同保留时间时从柱中洗脱。该现象有时观察到且最可能是由于起因于高浓度在柱上的肽沉淀。代表氨基酸1-8或4-11的天然16个氨基酸的连接N的两个分开部分，可潜在生成具有该质量的肽(图4b)。串联质谱法分析证实跨越残基1至8的肽在AF细胞的存在下生成，但未发现肽9-16的痕迹(图4c)。

设计用于生物处理的肽的维持活性具有更大重要性，并且连接N通过AF细胞的加工可潜在改变其生物效应。为了评估这点，合成对应于氨基酸序列1-8(连接N1-8)和9-16(连接N 9-16)的两种肽，并且其对蛋白聚糖合成的作用与天然人连接N的那种相比较。使用³⁵SO₄掺入评估蛋白聚糖合成，并且使牛和人NP和AF细胞暴露于等摩尔浓度的肽48小时。当牛细胞暴露于单独的连接N1-8时，观察到与天然肽相同量级的³⁵SO₄掺入中的统计上显著的增加(NP p＝0.006和AF p＝0.007)，然而，对于连接N 9-16未观察到效应(图5a)。人细胞显示相似趋势，具有响应连接1-8的显著增加(NP p＝0.004和AF p＝0.01)，但对连接N 9-16无应答，从而指示生物效应对于在肽的前8个氨基酸中保持的序列是特异性的(图5b)。牛和人AF细胞均显示与NP细胞相比较更强的应答。

为了测定负责切割连接1-16的蛋白酶，用10种不同蛋白酶的消化进行30分钟、2和24小时。测试的蛋白酶为MMP 3、7、12、13，ADAMTS4、5，HTRA1，以及组织蛋白酶K、B和L。使用质谱法定量1922Da，连接1-16肽的峰面积强度。峰的强度在30分钟后已显著减小，并且在与组织蛋白酶K的2和24小时温育时几乎无法检测，然而，它不受MMP 3、7、12、13，ADAMTS 4、5，HTRA1，以及组织蛋白酶B和L影响(2小时时间点显示于图6的A)中)。MRM方法设置为评估m/z964.4Da(+1)连接1-8是否随着1922Da肽的强度消失而出现。该方法证实连接1-8通过组织蛋白酶K在2小时后生成(图6的B))。为了评估组织蛋白酶K是生成在氨基酸8和9之间的切割，还是连接1-16在残基8-16区域内的几个位点处被加工，还对于m/z 488.75Da(2+)连接9-16肽设置MRM方法。分析显示在2小时后连接9-16的存在，从而证实连接N通过氨基酸8和9之间的单一切割进行加工(图6的C))。

因为椎间盘退变与体内炎症因子的存在紧密联系(51)，并且天然连接N已知在炎性环境中同样良好地起作用(34)，所以在IL-1β的存在下评估对肽的应答，以测定其生物效应在炎性环境中是否得到维持。使用³⁵SO₄掺入评估蛋白聚糖合成。在牛NP和AF细胞中，在IL-1β的存在下，连接N1-8显著诱导蛋白聚糖生产至与天然连接N相同的程度(NP p＝0.006和AF p＝0.013)(图7的(A))。相同趋势在人细胞中发现，具有对连接N1-8显著增加的应答(NP p＝0.002和AF p＝0.004)以及对连接N 9-16无应答(图7的(B))，从而证实生物效应在肽的前8个氨基酸中得到维持，并且指示该效应在炎性环境中持续。

讨论

先前已报道连接N可在软骨细胞(70)、体外IVD细胞和离体的完整人IVD(19,20)中刺激胶原和蛋白聚糖合成，以及在椎间盘退变的兔模型中增加椎间盘高度(31)。然而，不知道天然连接N在生物系统中如何稳定。本研究证实AF细胞具有蛋白酶解地加工连接N肽的能力，导致跨越氨基酸残基1-8的片段。数据还指出生物活性序列在该片段内得到保存，并且即使在炎性环境中，肽也能够增加NP和AF细胞两者中的蛋白聚糖合成。AF细胞证实比NP细胞更强的超过基线的蛋白聚糖增加。然而，用所使用的方法无法评估产生的绝对浓度。NP细胞可能具有更高的基线生产，导致在有和无连接N暴露的情况下均更高的蛋白聚糖总浓度。逆转或混杂的连接N肽以及连接N的残基9-16不具有生物效应。

Wang等人先前已报道：当他们评估许多较短的连接N衍生肽(33)，包括跨越氨基酸残基1-12的肽时，连接N的刺激效应丧失。相比之下，此处发现跨越连接N的残基1-8的肽是活性的。与本文结果一致，他们发现逆转或混杂的肽无效应。并不明确残基1-12肽为何在他们的系统中无活性，但可能涉及使用的不同条件。Wang等人使用不依赖于大小的100ng/mL的不同肽。

测定存在16个氨基酸的天然连接N的最佳浓度1μg/mL，因此使用该浓度，并且为了维持等摩尔浓度，使用0.5μg/mL的8个残基的较短肽。Wang等人测量细胞裂解产物中的细胞相关的硫酸化GAG，而在本文中测量释放到培养基内的GAG中的放射性硫酸盐的掺入。所使用的细胞源也是不同的，Wang等人从在脊柱融合术的手术期间提取的退变椎间盘组织中分离细胞，并且在将它们转移到3D培养物内之前，在单层培养中扩增细胞，这个程序可能已改变细胞的表型且由此改变细胞的应答。

Abbott等人(71)已证实来自退变人椎间盘的单层扩增细胞较不良好地响应天然连接N，仅具有聚集蛋白聚糖信使水平的低上调和MMP3信使水平的强诱导(71、18)。在Wang等人研究中使用的连接N剂量再次低于测定的最佳剂量，在这种情况下为10倍低(71)。本文测试的细胞从具有轻微退变的器官供体中分离，并且为了维持表型，细胞不在单层中扩增。这种差异以及所评估的细胞并非来自严重退变的手术摘除的椎间盘的事实可能解释了不同结果。具有严重退变的椎间盘可能没有足够的细胞以提供可检测的治疗应答。由于大体形态的丧失，还难以分离手术摘除的退变椎间盘的不同区域，使得难以区分NP和AF细胞之间的差异。另外，细胞得率在严重退变的椎间盘中很低，并且必须扩增细胞以增加细胞数目，这可能影响细胞的表型(72)。

椎间盘退变的早期事件和标志是聚集蛋白聚糖的丧失，并且在退变早期中使用的任何治疗剂必须增加其合成。因此，在本文中，聚焦于聚集蛋白聚糖合成作为读出，以评估连接N片段的有益效应。然而，体内椎间盘退变与椎间盘基质中增加的分解代谢强烈相关。该过程涉及可能也在疾病过程中早期表达的各种细胞因子和蛋白酶的上调(17、53)。生物活性试剂必须具有逆转或延缓椎间盘中的退变过程的能力，以在该分解代谢环境中发挥其合成作用。该数据指示连接1-8具有这些特性。

还发现尽管连接N通过AF细胞进行加工，但活性序列保持完整。连接N在残基8-9之间的组织蛋白酶K切割导致两种肽，连接1-8和连接9-16，而MMP 3、7、12、13，ADAMTS 4、5，HTRA1，以及组织蛋白酶B和L未能加工连接N。已提出了组织蛋白酶K在椎间盘退变中的作用(55、73)。不知道连接1-8是否在退变椎间盘的细胞外基质中生成。

已显示连接N通过BMP II型受体起作用，并且受体活化导致Smad1/5信号传导以及BMP-4和BMP-7信使水平的上调(32)。BMP II型受体是描述为连接N的配偶体的唯一受体。因此可能连接1-8与相同受体相互作用，因为两种肽均诱导蛋白聚糖合成至相似程度。如果如此，则将预期连接N还具有连接N的其他代谢特性，例如下调金属蛋白酶表达的能力。

连接N1-8是用于治疗退变性椎间盘疾病的有希望的生物活性物质。可获益于这种治疗的患者包括例如具有早期椎间盘退变的那些，例如其中AF在主要胶原降解已发生之前保持完整。由于在椎间盘中保留的细胞的低数目和严重破坏的ECM，超过汤普森3级的退变可能需要手术治疗。然而，连接N1-8可能仍可用于具有这些更高级别退变的个体中，其中它可用于延迟融合术后的邻近节段椎间盘疾病(74-76)。在疗法中使用这种较短的8个氨基酸的肽而不是原始16个氨基酸的连接N的一个优点可为生产成本。小尺寸也可能更顺应体内递送。

表1：人椎间盘(IVD)供体的鉴定。

ICH＝颅内出血，MVA＝机动车事故，CVA＝脑血管意外。

实例2

如先前证实的，连接N通过MMP切割从连接蛋白中释放。它在关节和椎间盘两者中产生，并且促进通过椎间盘(NP和AF)和关节软骨(软骨细胞)细胞的聚集蛋白聚糖/胶原合成。

与用单独的培养基注射的椎间盘相比较，在器官培养物中的人椎间盘的连接N刺激据报道增加蛋白聚糖合成1.15至大于7倍。蛋白聚糖合成在连接N刺激后9天可检测。

在椎间盘退变的兔模型中，在L2/3环形穿刺后2周，以在10微升盐水中100微克浓度的连接N的连接N注射在连接N感染后14周显著增加IVD椎间盘高度。聚集蛋白聚糖mRNA在AF和NP细胞(特别是AF细胞中)显著增加。同样，MMP-3和ADAMTS-4蛋白酶表达显著降低。证实连接N保留在人椎间盘中，并且仅通过终板而不是AF缓慢丧失。连接N的特异性是序列依赖性的，因为混杂的连接N或逆转的连接N在人NP细胞或人iAF细胞中没有作用。参见例如参考文献29和34。

如图3a-图3b中所示和如上所述，测试了在NP和AF的存在下连接N在培养中的稳定性。连接N通过AF细胞而不是NP细胞进行加工。

图4b和图4c显示了通过质谱法鉴定的可能的连接N片段。在与各种不同的蛋白酶温育后连接N肽1-16的多重反应监控发现：信号仅在组织蛋白酶K温育的存在下丧失(图6的A))。这对应于如图6的B)和图6的C)中所示的峰的出现。当与人NP细胞和人iAF细胞接触时，连接N1-8而不是连接N 9-16对于诱导蛋白聚糖合成是活性的(图7的(A))。与全长连接N相比较，连接N1-8显示相似或更佳的活性(图7的(B))。连接N和连接N1-8而不是连接N 9-16可在炎性环境中促进蛋白聚糖合成。

这些结果显示聚集蛋白聚糖产生在NF和AF细胞两者中是增加的，连接N保留在椎间盘中，并且仅通过终板而不是AF缓慢丧失。连接N通过AF细胞而不是NP细胞进行加工。连接N通过组织蛋白酶K进行切割，从而生成1-8片段，并且通过AF细胞产生的连接N片段是活性的。连接N和片段在炎性环境中起作用。

实例3

方法学：

骨关节炎(OA)软骨得自具有知情同意的经历全膝关节置换术的四个供体，并且由每个供体制备OA软骨-骨外植体和OA软骨细胞。正常人软骨细胞(PromoCell,Heidelberg，德国)和牛关节软骨(12个月)用作对照。

外植体制备和处理

大约1cm²的软骨外植体由相同供体进行制备，并且包括具有皮质骨的软骨。外植体在补充有10％热灭活FBS的DMEM中进行培养。在标准培养条件下7天后，使外植体暴露于：IL-1β(5ng/ml)、连接N(1μg/ml)且共暴露于IL1β+连接N共21天，其中每三天更换培养基。

组织加工和分析

从每个外植体的不同区域中分离3mm直径的软骨塞。通过蛋白质印迹评估Col II、Agg、Col X和MMP-13的表达。简言之，软骨塞用15个体积(v/w)含有蛋白酶抑制剂的4-M盐酸胍(GuCl)、100-mM乙酸钠，pH 7.4在4℃下提取48小时。用9个体积乙醇沉淀用于蛋白质印迹分析的100μl等分试样，并且在37℃下与50mU角质素酶I(Seikagaku)一起温育一小时，随后为在37℃下与20mU软骨素酶ABC(Seikagaku)的过夜温育。软骨基质组分通过SDS/PAGE在4–20％梯度凝胶(Bio-Rad)上在还原条件下进行分辨，并且转移至0.2um PVDF膜用于免疫印迹。使用识别氨基末端G1的兔多克隆抗体(抗G1)检测聚集蛋白聚糖。用抗Col II和抗MMP13兔多克隆抗体(Abcam)识别Col II和MMP-13，而X型胶原用抗Col X小鼠单克隆抗体(Sigma)进行识别。

使用1,9-二甲基亚甲蓝(DMMB)染料结合测定，来定量组织中的总糖胺聚糖(GAG，占优势的聚集蛋白聚糖)含量。

OA软骨细胞分离和培养

通过用0.125％链霉蛋白酶随后为0.2％胶原酶的序贯消化，从每个膝盖的软骨中回收OA软骨细胞。在分离后，细胞在补充有10％热灭活的FBS和1％链霉素的DMEM中进行扩增。

NFkB信号传导

将OA和正常软骨细胞转移到6孔板，并且生长至90％汇合。使细胞血清剥夺过夜且在37℃下在培养基中温育10分钟，所述培养基含有IL-1β(5ng/ml)、连接N(1μg/ml)或两者的组合。细胞在RIPA(放射免疫沉淀测定)缓冲液以及蛋白酶混合物II(Sigma)和磷酸酶(ThermoScientific)抑制剂中进行裂解。裂解产物在4-20％梯度凝胶(Bio-Rad)上在还原条件下进行电泳，并且转移至0.2um PVDF膜。印迹用抗磷酸-NFkB抗体(Cell Signaling)进行探测，并且NFkB(Cell Signaling)和GAPDH(Sigma)用于标准化。

结果：

在OA外植体和软骨细胞中，连接N在IL-1β的存在下显著诱导蛋白聚糖生产。在OA软骨中，观察到蛋白聚糖合成中的显著增加，响应连接N保留在基质中。对于Col II获得相似结果。连接N还压制MMP-13活化和Col X表达。有利的是，在OA和正常软骨细胞中，IL-1β诱导的NF-κB活化被连接N剂量依赖性压制。

图8证实GAG在用连接N处理的OA外植体中得到保留。GAG保留计算为对照(CTL)外植体的保留％。

图8证实在OA外植体和软骨细胞中，连接N在IL-1β的存在下显著诱导蛋白聚糖产生。

图9证实在OA软骨中，观察到聚集蛋白聚糖合成中的显著增加，并且响应连接N保留在基质中。对于Col II获得相似结果。

图10证实连接N压制IL-1β诱导的MMP-13活化(图10的(A))和Col X表达(图10的(B))，并且图11证实IL-1β诱导的NF-kB活化在正常人软骨细胞(图11的A))和OA软骨细胞(图11的B))中被连接N剂量依赖性压制。

相应地，连接N刺激骨关节炎软骨中的蛋白聚糖保留，并且可在炎性环境中刺激蛋白聚糖和胶原。连接N可压制骨关节炎软骨中的活性形式的MMP-13，并且连接N压制IL-1β诱导的蛋白酶表达，并且不希望受理论束缚，例如通过NFkB的下调。

OA与体内炎性细胞因子的存在紧密联系。证实连接N可在炎性环境中在椎间盘中诱导蛋白聚糖合成。然而，不知道连接N是否可恢复炎性环境中的骨关节炎软骨中的蛋白聚糖含量。为了测试这点，将来自骨关节炎软骨的人外植体与连接N、在IL-1β的存在下、与连接N和IL-1β的组合或单独的培养基一起培养21天。通过DMMB测定来定量可提取的蛋白聚糖的浓度。当针对对照标准化时，连接N增加外植体的GAG含量至约50％。当与对照相比较时，IL-1β减少蛋白聚糖浓度。然而，当针对对照标准化时，连接N在IL-1β的存在下将外植体的GAG含量增加至约30％。这指示在软骨退变期间，连接N具有恢复蛋白聚糖的潜力，并且该效应在炎性环境中得到维持。

接下来使用针对G1结构域的抗体分析连接N对组织中的聚集蛋白聚糖合成和保留的作用。在不存在补充物的情况下将外植体培养21天后，外植体显示弱的含有聚集蛋白聚糖G1的片段。伴随连接N补充，含有聚集蛋白聚糖G1的片段的含量显著增加(P<0.0001)。当外植体用单独的IL-1进行处理时，与对照的那种相比较，含有聚集蛋白聚糖G1的片段的染色强度是相似的，尽管观察到少数较低分子量片段，而连接N和IL-1的补充将数量显著增加至与单独的连接N处理的外植体可比较的水平。

因为由于进行中的基质代谢，G1结构域条带在体内通过软骨中的蛋白聚糖酶和MMP活性而产生，所以接下来测试连接N对炎性环境中的MMP-13表达的作用。在单独的连接N、单独或连同连接N的Il-1的不存在或存在下培养外植体后，通过蛋白质印迹来分析MMP-13表达。在不存在补充物的情况下培养外植体21天后，外植体显示弱活性MMP-13。当与对照相比较时，连接N显著诱导活性MMP-13。伴随Il-1补充，活性MMP-13增加超过通过连接N刺激的那种。相比之下，当与单独的IL-1β相比较时，在IL-1β的存在下加入连接N导致活性形式的MMP-13数量中的减少。因此，在炎性环境中，连接N压制活性形式的MMP-13。

软骨修复还要求胶原产生，以生成稳定基质。因此，评价近期产生的可提取的II型胶原的水平。从骨关节炎对照外植体中提取的II型胶原的数量低于连接N补充的外植体中，尽管并不显著。当外植体用单独的Il-1进行处理时，当与对照外植体相比较时，II型胶原的数量显著减少。相比之下，当与单独的IL-1β相比较时，在IL-1β的存在下加入连接N导致II型胶原数量中的增加。因此，连接N不仅在炎性环境中刺激聚集蛋白聚糖产生，还刺激II型胶原的产生。

几项研究已显示编码促炎细胞因子和基质降解酶的许多基因受转录因子核因子-κB(NF-κB)调节。使用连接N压制NF-κB活化级联可下调促炎介质的表达。

接下来评价在正常软骨细胞中连接N对通过IL-1的NF-κB活化的作用。在各种浓度的连接N的存在或不存在下，用IL-1β刺激正常软骨细胞。使用对P-P65(NF-kB)特异性的抗体，通过蛋白质印迹测定磷酸化的NF-κB RelA(p65)的刺激。在不存在IL-1β的情况下培养软骨细胞后，软骨细胞未显示P-P65(NF-kB)蛋白质。伴随连接N补充，未观察到对P-P65(NF-kB)蛋白质的作用。如预期的，P-P65(NF-kB)在用IL-1β刺激后是显著的。连接N显著抑制IL-1β以剂量依赖性方式刺激P-P65(NF-kB)-100ng连接N非常类似于1000ng连接N。当使用来自OA患者的软骨细胞时，观察到相似结果。该数据证实连接N压制IL-1β介导的NF-kB活化，并且可通过抑制NF-κB信号传导来压制IL-1β刺激的MMP-13和炎性细胞因子。

讨论

关节软骨体系结构通过合成代谢和分解代谢因子保持完整和有功能，所述合成代谢和分解代谢因子作用于软骨细胞，所述软骨细胞依次又通过平衡合成和降解来维持组织稳态。当平衡转向分解代谢时，胶原和聚集蛋白聚糖的降解和丧失、软骨下骨重塑和滑膜炎症表征骨关节炎。先前已报道连接N可刺激软骨细胞中的胶原和蛋白聚糖合成。然而，不知道连接N是否可在炎性环境中恢复骨关节炎软骨中的蛋白聚糖和胶原含量。本文结果证实在早期OA中，连接N具有恢复蛋白聚糖和胶原含量的潜力。数据还指示即使在炎性环境中，连接N也可压制蛋白酶解，通过抑制NF-κB信号传导来增加蛋白聚糖和胶原合成。

连接N，一种生物活性因子，已证实具有刺激椎间盘修复的潜力。已鉴定在体外使用经分离的IVD细胞来诱导胶原和蛋白聚糖信使水平，并且已报道增加放射性³⁵SO₄掺入新近合成的蛋白聚糖内(6、16、18)。事实上，离体注射到完整的人IVD内的连接N导致在新近合成的蛋白聚糖中放射性³⁵SO₄的增加掺入，并且当注射到椎间盘退变的针刺模型中的兔椎间盘内时，导致椎间盘高度的部分恢复。结果指出连接N可刺激来自OA患者的软骨细胞中的蛋白聚糖和胶原表达，与恢复软骨的功能特性的功能作用一致。

连接N压制软骨细胞中的P-P65(NF-kB)活化。NF-kB信号传导途径在体内关节炎的发展和进展中起积极作用(19,20)。事实上，我们的研究显示在用IL-1b刺激后在关节软骨细胞中的NF-kB活化，其在关节软骨的分解代谢中起重要作用。NF-kB表达与胶原酶-3(金属蛋白酶(MMP)-13)和基质溶解素1(MMP-3)水平关联。此外，在用II型胶原免疫的DBA/1小鼠中，在关节炎早期的软骨破坏期间，在软骨细胞中显示了对核NF-kB定位的转变。本文结果显示用IL-1b的刺激促使关节软骨细胞中的NF-kB活化的刺激。

为了具有功能基质，刚放下的基质必须进行重塑。这涉及各种蛋白酶的上调。在该研究中，当与对照相比较时，连接N显著压制活性MMP-13。因此，为了就其在软骨内的新功能重塑新近合成的ECM，需要蛋白酶的上调。补充有连接N的人椎间盘细胞在体外和椎间盘退变的兔体内模型中上调蛋白酶。因此，连接N看起来在刺激软骨修复中是有效的，涉及椎间盘ECM重塑以恢复软骨的功能。

NF-kB抑制剂减少关节炎中通过MMP的关节软骨降解的潜在用途已得到描述。使用非类固醇抗炎药(NSAID)、糖皮质激素和不同试剂的有利结果证实减少的NF-kB活化。然而，NSAID的使用可导致胃肠道副作用，并且当靶向基因表达仅在单一器官中被抑制时，反义和转录因子诱杀策略中的特异性缺乏提出重大挑战。此外，蛋白质递送、免疫原性和治疗成本的问题已限制了完整蛋白质用于疗法的现实前景。

实例4

早期椎间盘退变的器官培养模型，涉及蛋白聚糖耗尽但没有基本胶原破坏，用于研究基于分子和细胞的疗法的效应，其中使用连接N作为经济生长因子类似物和间充质干细胞(MSC)作为细胞补充物。

材料与方法

间充质干细胞培养

从骨髓中收获的人MSC得自Lonza(Basel，瑞士)。根据供应商，细胞对于CD105、CD166、CD29和CD44是阳性的，并且对于CD14、CD34和CD45是阴性的。另外，细胞被证实能够分化成成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞谱系。所有细胞均在达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中扩增，所述DMEM补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，并且在四次传代内使用(19、20)。所有培养试剂均来自Wisent Inc.(St-Bruno，加拿大)。

间充质干细胞标记和跟踪

遵循供应商的说明书，用PKH67(Sigma-Aldrich,Oakville，加拿大)标记MSC。简言之，用不含FBS的DMEM洗涤2x10⁶ MSC，并且以400g离心5分钟作为松散团块收集。将团块重悬浮于稀释剂C中，并且与染料溶液快速混合。细胞/染料悬浮液随后温育5分钟，其后通过添加等体积FBS停止反应。细胞的活力通过用台盼蓝染色进行测量。等分试样在单层(Sarstedt,Saint-Léonard，加拿大)中培养两天，以跟踪标记效率。将细胞的剩余部分重悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Wisent)或补充有1mg/mL连接N(CanPeptide,Montreal，加拿大)的PBS中。随后将细胞悬浮液注射到用胰蛋白酶预处理的牛椎间盘内，以诱导退变(21)。

椎间盘分离和培养

如先前描述的(21、22)，从24至30月龄阉牛的尾部中分离最大的前3-4个尾椎间盘。简言之，将尾部剥离皮肤、肌肉和韧带，并且去除每个节段的椎弓根。去除软骨终板的骨和邻近钙化部分，使得椎间盘的表面是柔软弹性的，不含可检测的钙化组织。椎间盘在PBS(所述PBS补充有1,000U/mL青霉素、1,000μg/mL链霉素和0.25μg/mL两性霉素B(GIBCO,Burlington，加拿大))中清洗后，使它们在含有50mL培养基(具有2mM Glutamax和25mMHepes的DMEM，补充有5％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μg/mL L-抗坏血酸盐)的无菌80mL样本容器(STARPLEX Scientific,Etobicoke，加拿大)中预条件化3天。通过使用28G1/2针，将溶解于75μL PBS的100μg胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)单次注射到椎间盘的中心来诱导退变(21)。将针置于椎间盘顶部以测量到达中心所需的距离，并且随后插入至相同深度。一旦位于中心，就缓慢注射胰蛋白酶溶液，并且随后将针逐渐抽出以避免回流。随后在注射在75μL PBS最终体积中的MSC(10⁵细胞)、连接N(75μg)、或MSC(10⁵细胞)和连接N(75μg)的组合之前，将椎间盘培养另外4天。连接N浓度基于用于分离的牛椎间盘细胞的最佳剂量(1μg/ml)，假定牛椎间盘的平均体积为7.5mL。所使用的MSC数目基于Liebscher等人的研究(23)，其测量健康人椎间盘的细胞密度。在健康成人椎间盘中发现的大约一半数目的细胞用于该研究中，以便避免由于营养素剥夺对细胞存活的潜在有害作用，因为牛椎间盘已经具有高细胞密度。对于所有实验条件，注射七个椎间盘。七个胰蛋白酶处理的椎间盘用单独的PBS进行注射，以充当退变对照且验证胰蛋白酶在降解NP的蛋白聚糖含量中是活性的。七个椎间盘不含任何注射地进行培养，以充当非退变对照。椎间盘随后培养14天，并且培养基每3天进行更换。

通过显微镜检查和组织学分析椎间盘

在培养结束时，使用内部设计的由两个切片机刀片组成的切割工具，通过椎间盘的中心获得两个切片(21)。这给出宽约3cm(椎间盘直径)和高1cm(椎间盘高度)的两个厚750μm的切片。一个切片固定在无福尔马林的固定剂(Accustain,Sigma-Aldrich)中用于组织学分析。固定样品在石蜡中包埋，并且切割5-μm厚的切片，并且用苏木精和番红O-坚牢绿进行染色(24)。另一个切片新鲜使用以研究MSC在椎间盘组织中的分布。使用倒置共焦激光扫描显微镜(CLSM,Zeiss LSM 510)，显现建群椎间盘的标记的干细胞。使二十个连续6μm切片成像，并且将CLSM堆拆分成单一图像。

细胞外ECM蛋白质和蛋白聚糖的提取

收集剩余髓核(NP)组织，并且记录湿重(21)。将组织切割成小片且悬浮于14个体积的提取缓冲液[4M盐酸胍、50mM乙酸钠、pH 5.8、10mM EDTA、

(Roche,Laval，加拿大)中，用于蛋白质和蛋白聚糖提取。组织伴随连续搅拌在4℃下提取48小时，并且通过在4℃下以12,000g离心30分钟来澄清提取物。将上清液收集且贮存于-80℃下用于进一步分析。

GAG分析

通过经修改的二甲基亚甲蓝(DMMB)染料结合测定，定量组织提取物中的硫酸化糖胺聚糖(GAG)(25、26)。将样品稀释以落入标准曲线的线性范围的中间。将与组织提取物相等体积的提取缓冲液加入标准曲线，以补偿可能的干扰。

通过琼脂糖凝胶电泳的蛋白聚糖分析

通过琼脂糖凝胶电泳分析蛋白聚糖组成(27)。在椎间盘提取物的10μL等分试样中的蛋白聚糖用无水乙醇进行沉淀，并且溶解于蒸馏水中。将样品与样品缓冲液(0.1M Tris-HCl、0.768M甘氨酸、0.01％溴酚蓝、1.2％甘油、0.05％SDS，pH 8.3)混合，并且煮沸10分钟。通过在1.2％琼脂糖凝胶中的电泳分离蛋白聚糖。凝胶用在具有0.5％(w/v)Triton X 100的3％乙酸中的0.02％(w/v)甲苯胺蓝进行染色，并且用3％乙酸随后为蒸馏水进行脱色。

通过蛋白质印迹的聚集蛋白聚糖和II型胶原分析

通过添加9个体积的无水乙醇沉淀在椎间盘提取物的10μL等分试样中的蛋白质和蛋白聚糖，在95％乙醇中洗涤两次，并且最后冻干。将用于分析II型胶原的样品溶解于蒸馏水中。将用于分析聚集蛋白聚糖的样品溶解于缓冲液(0.05M Tris-HCl，具有0.03M乙酸钠，pH 7.4，

)中，并且通过角质素酶I和软骨素酶ABC(Amsbio,Lake Forest,CA,US)进行消化。将来自相同处理组的样品合并，与SDS样品缓冲液混合，并且煮沸10分钟。随后在还原条件下，通过SDS-PAGE(4–12％

凝胶)分离蛋白质。将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜，其用在具有0.2％Tween 20的PBS(封闭缓冲液)中的1％BSA进行封闭。随后使它们在4℃下与在封闭缓冲液中以1:2,000稀释度的一抗一起温育过夜，随后与缀合了辣根过氧化物酶的二抗(1:5,000稀释度，Sigma-Aldrich)一起在封闭缓冲液中温育。识别胶原II型的一抗来自Abcam(Toronto，加拿大)；识别聚集蛋白聚糖G1结构域的一抗如先前所述进行制备(28)。结合的抗体通过化学发光(GE Healthcare Baie d’Urfe加拿大)进行显现，并且使用Bio-Rad VersaDoc图像分析系统(Bio-Rad,Mississauga，加拿大)进行分析。

统计分析

通过使用GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.La Jolla,CA USA)，通过使用方差分析随后为Fisher受保护的最小显著差异事后检验执行统计分析。结果呈现为使用来自不同牛尾的椎间盘的七次独立实验的平均值±标准差(SD)。当p<0.05时，差异视为统计上显著的。

结果

已知连接N诱导通过经分离的椎间盘细胞和在退变兔椎间盘中的蛋白聚糖合成，并且在体外增强MSC的软骨形成(20、29-32)。然而，不知道连接N或MSC单独是否可恢复具有早期退变的较大椎间盘中的蛋白聚糖含量。同样不知道连接N和MSC的组合是否具有附加效应。为了测试这点，用单独的连接N或MSC或连接N和MSC的组合处理具有蛋白酶解诱导的聚集蛋白聚糖耗尽的牛椎间盘。椎间盘在处理后培养2周时期，并且通过DMMB测定来定量可提取的聚集蛋白聚糖的浓度(图12)。如果没有干预，退变椎间盘中的GAG含量下降至非退变对照中的约50％。相比之下，与退变对照椎间盘中的GAG含量相比较，连接N和MSC单独或组合地显著增加椎间盘的GAG含量(p<0.05)。经处理的椎间盘中的蛋白聚糖浓度类似于非退变椎间盘中的那种。然而，在处理组中未观察到统计显著性(p>0.05)。这指出在早期退变中，单独的连接N或MSC具有将蛋白聚糖恢复至其原始水平的潜力，并且通过组合疗法未实现附加益处。

具有相等的蛋白聚糖含量不一定暗示结构与正常椎间盘中的那种相同。为了解决这点，通过琼脂糖凝胶电泳分析提取的蛋白聚糖。经处理的椎间盘中的尺寸分布和染色强度等价于非退变的对照椎间盘中的那种，而染色强度在退变对照椎间盘中更低(图13)。数据证实在经处理的椎间盘中产生的新近合成的蛋白聚糖具有与非退变椎间盘的那些相同的尺寸范围。

另外，完整的聚集蛋白聚糖核心蛋白的存在和丰度通过SDS-PAGE进行评估。与非退变对照椎间盘相比较，质量大于250kDa的完整的聚集蛋白聚糖核心蛋白在退变对照椎间盘中显著更低(p<0.05)，而连接N和/或MSC的注射将数量显著增加至与非退变对照椎间盘可比较的水平(图14)。

椎间盘修复还需要胶原产生以生成稳定基质。因此，评价近期产生的可提取的II型胶原的水平(图15)。从退变对照椎间盘中提取的II型胶原数量显著低于非退变对照椎间盘中。当椎间盘用MSC和/或连接N进行注射时，II型胶原的数量增加至与非退变对照椎间盘中检测到的那种相似的水平。因此，连接N和MSC两者均不仅刺激聚集蛋白聚糖生产，还刺激II型胶原的生产。

组织学分析用于评估修复组织内的蛋白聚糖分布。组织切片的番红O和坚牢绿染色证实在退变对照椎间盘中的蛋白聚糖的均匀丧失，在其中发现很少的番红O(红色)染色(图16)。结果进一步证实在退变对照椎间盘中的蛋白聚糖含量在NP区域各处被耗尽。在用MSC或连接N单独或一起处理的椎间盘中，番红O染色的强度和分布显示在NP区域各处的均匀分布，类似于非退变对照椎间盘的那种。因此，新近合成的蛋白聚糖能够在ECM各处扩散，并且恢复即使在与细胞遥远的区域中的组织含量。

为了MSC诱导的修复过程持续，注射的干细胞需要保持活力且分布在修复组织各处。为了解决这点，将MSC用PKH67标记(图17A、B)，且在单层中培养两天，以评估标记效率和染料持续性。当注射到胰蛋白酶处理的椎间盘内之前，将细胞标记且悬浮于PBS或连接N/PBS溶液中时，MSC活力高于90％。为了评估注射的MSC在椎间盘的ECM中是否存活且整合，通过共焦显微镜检查跟踪细胞。在两周器官培养期后，发现标记的MSC分布在NP区域各处(图17C、D)，从而指出可持续修复过程的可行性。

讨论

在本文研究中，早期椎间盘退变的器官培养模型用于研究基于分子和细胞的疗法恢复IVD蛋白聚糖含量的潜力。连接N用作分子试剂并且MSC用作细胞补充物。退变椎间盘用疗法分开或组合进行处理，并且结果揭示连接N或MSC单独具有恢复组织蛋白聚糖的能力，并且通过两者的组合未观察到附加效应。

先前工作已证实连接N刺激椎间盘修复的潜力(20、29、31-35)。尽管连接N如本文显示的通过AF细胞进行切割，但所得到的N末端8个氨基酸的肽看起来是蛋白酶解稳定的，并且保留生物活性。在体外利用经分离的IVD细胞的研究显示连接N可诱导胶原和蛋白聚糖信使水平，并且导致放射性³⁵SO₄增加掺入新近合成的蛋白聚糖内(34、35)。另外，离体注射到完整人IVD内的连接N(34)导致放射性³⁵SO₄在新近合成的蛋白聚糖中的增加掺入，并且当在椎间盘退变的针刺模型中注射到兔椎间盘内时，连接N导致椎间盘高度的部分恢复(31)。在本文研究中使用的模型模拟年轻人中的早期退变，其中组织具有可响应连接N刺激的足够数目的细胞。相比之下，缩小的细胞数目、细胞老化和可能的炎性环境另一方面通常表征人椎间盘退变。来自我们团体的先前工作已显示连接N在炎性环境中同样有力(34)。在该阶段，可能还需要供应能够合成椎间盘ECM的另外的细胞。

不存在其中可收获自体IVD细胞且用作IVD修复的细胞源的良性位点，留下MSC作为有吸引力的选项。MSC用于IVD修复的潜在用途已在小型动物中得到描述(36-38)。在兔中的有利结果证实增加的椎间盘高度，以及ECM沉积和水合。然而，尤其当MSC不含支架或不含AF密封施用时，在兔中的其他研究报道骨赘形成(39)。因为已知连接N在体外促进软骨形成且减少人MSC的骨生成，所以它可能是用于组合疗法的理想候选物(20)。除动物研究之外，小规模的人临床试验已报道改善的疼痛和残废得分(40)。在临床试验中未发现椎间盘高度的增加，但可检测通过MRI测量的水合的增加。本文结果指示MSC补充可为早期退变中的可行选项。然而，因为终板钙化与退变相关(41)，所以有待观察退变椎间盘中所得到的妥协的营养途径是否将支持另外细胞的代谢活性(42、43)。

目前模型不导致裂缝的生成，仅分子耗尽，而天然椎间盘退变通常涉及裂缝的产生。为了修复此类损害，可能需要注射在可聚合支架中的连接N和干细胞，所述可聚合支架将填充损害且允许治疗试剂的均匀分布。

表2.椎间盘的随机化

实例5

使用牛椎间盘器官培养物进行另外的测试。图18证实在连接N1-8处理后2周时，连接N1-8在退变的牛椎间盘中诱导蛋白聚糖合成、聚集蛋白聚糖和II型胶原表达中的统计上显著的增加。

证实连接N和包含氨基酸1-8的片段可恢复退变椎间盘中的聚集蛋白聚糖水平。

实例6

人连接N[DHLSDNYTLDHDRAIH](SEQ ID NO:15)可在体外和体内均刺激通过椎间盘(IVD)细胞的细胞外基质生物合成。迄今为止，不存在关于牛连接N[DHHSDNYTVDHDRVIH](SEQ ID NO:5)对椎间盘细胞的作用的报道。本研究的目的是比较牛连接N(BLN)与人连接N(HLN)对牛纤维环(AF)和髓核(NP)细胞的作用。

方法：从来自健康的22-24月龄阉牛的尾椎间盘的NP和AF区域中分离的细胞立即包埋在1.2％海藻酸盐珠子中，用于蛋白聚糖合成和基因表达，或在单层中培养用于蛋白质提取。使珠子在补充有1μg/ml HLN或BLN的培养基中温育18天。分析硫酸化糖胺聚糖(GAG)释放。在培养7和14天后，对于聚集蛋白聚糖(AGG)、ADAMTS-4和ADAMTS-5执行定量PCR。使用针对P-Smad1/5和P-Smad2的特异性抗体，通过免疫印迹分析Smad活化。

结果：在NP和AF细胞两者中，与BLN和HLN一起温育导致增加的GAG释放到培养基内。与对照培养基相比较，GAG释放在与BLN或HLN一起温育的AF细胞中显著更高。然而，当与HLN一起温育时，NP细胞具有显著和一致的GAG释放增加。在AF细胞中，两种连接N补充均诱导Smad1/5的快速活化(<10分钟)，其经过6小时过程下降到对照水平以下。在NP细胞中，Smad1/5看起来延迟，在30分钟后开始且随着时间过去继续增加。

BLN能够通过Smad1/5的活化刺激牛IVD细胞中的GAG释放。在AF细胞中通过BLN的Smad1/5的快速活化可解释我们的发现：AF细胞在促进GAG合成中比NP细胞更佳地响应BLN补充；两种肽均具有为设计为刺激椎间盘修复的任何试剂所需的特点。

进一步的细节在实例7中找到。

实例7

椎间盘(IVD)是由富含蛋白聚糖的中央髓核(NP)周围的外周富含胶原的纤维环(AF)组成的复合结构[77]。它们抵抗压缩，因为它们具有高含量的蛋白聚糖聚集蛋白聚糖，其与透明质酸盐相互作用以产生大蛋白聚糖聚集体。这些相互作用通过连接蛋白的进一步相互作用得到稳定(图19)[78、79]。驻于AF和NP中的椎间盘细胞通过代谢过程调节IVD的稳态，从而维持合成代谢和分解代谢因子之间的平衡，并且控制基质分子和降解酶的表达。由于耗尽的合成和增加的降解两者，这种稳态代谢的失衡导致IVD基质的组成和结构中的生物化学改变，其中聚集蛋白聚糖对蛋白酶解损伤和丧失特别敏感。细胞外基质(ECM)的进行性分解与椎间盘退变紧密相关[80]。

IVD退变在腰痛的病因学中起主要作用，所述腰痛可显著影响超过一半人口[53、81-82]。因此，对于腰痛疗法，逆转退变过程和修复退变IVD(恢复退变IVD的结构或功能)是关键的。后来，已提出细胞或生长因子疗法以诱导IVD修复[83-86]。几项研究已提出使用生长因子以刺激细胞代谢且改变组织稳态至合成代谢状态(基质合成)，从而逆转退变过程。

椎间盘修复可通过生长因子补充例如骨形态发生蛋白质(BMP)和转化生长因子-β(TGFβ)得到增强。这些生长因子可直接应用于使细胞外基质生产达到最大且促进组织再生。作为生长因子的经济替代物，可能能够使用连接N用于组织再生。人连接N肽[DHLSDNYTLDHDRAIH](SEQ ID NO:15)是连接蛋白的N末端肽，所述连接蛋白是稳定聚集蛋白聚糖G1结构域和透明质酸盐之间的非共价相互作用的糖蛋白(图19)。人连接N可在体外刺激人关节软骨和牛IVD细胞中的胶原和蛋白聚糖合成[87-88、35]，并且可在体内增加椎间盘退变的兔模型中的椎间盘高度[31]。先前研究已显示连接N还可减少X型胶原(软骨细胞增生的标记物[89])的表达，并且刺激II型胶原(软骨和椎间盘ECM形成的标记物[90])的表达。因此，连接N具有与干细胞一起使用以促进IVD修复所需的ECM形成的潜力。

迄今为止，不存在关于牛连接N[DHHSDNYTVDHDRVIH](SEQ ID NO:5)对椎间盘细胞的作用的报道。本研究的目的是比较牛连接N(BLN)和人连接N(HLN)对牛IVD细胞的作用，以便测定如BLN序列中出现的残基置换(以粗体标记)是否改变连接N功能。

材料与方法

牛椎间盘细胞分离

来自健康的20-24月龄阉牛的尾骨IVD在宰杀后2-3小时得自当地屠宰场。使IVD与其邻近椎体分开，并且如先前描述的[88]，通过用0.2％链霉蛋白酶随后为0.125％胶原酶消化的序贯消化，从NP和AF区域中分离细胞。在分离后，NP和AF细胞立即包埋在海藻酸盐珠子中或在6孔板中铺平板用于蛋白质提取。

海藻酸盐包埋

在分离后，将NP和AF细胞以2百万细胞/ml的浓度重悬浮于1.2％海藻酸盐(溶解于0.15M NaCl中)中。选择海藻酸盐以评价在不存在广泛细胞增殖的情况下对基质生产的作用[91-92]。细胞悬浮液小滴通过18号针释放到102mM氯化钙溶液内，并且静置聚合10分钟。海藻酸盐珠子随后在培养基(补充有10％胎牛血清和抗生素的达尔贝科改良伊格尔培养基高糖)中稳定7天。

海藻酸盐珠子的培养和处理

在稳定后，将海藻酸盐珠子以9粒珠子/孔的密度置于24孔板中，并且在补充有1μg/ml HLN或BLN的培养基(CanPeptide,Montreal)中温育18天。在单独的培养基中培养相同时间段的珠子用作对照(CTL)。基于下述发现选择BLN和HLN补充的浓度：1μg/ml连接N诱导在刺激椎间盘细胞中的蛋白聚糖合成方面的最大应答[93]。每第三天更换培养基达18天，以便允许在不同连接N补充下任何表型变化发生的足够时间。

椎间盘细胞的培养和处理

AF和NP细胞在培养基(补充有10％胎牛血清和抗生素的达尔贝科改良伊格尔培养基高糖)中扩增到6孔板(7.5x10⁵细胞/孔)内，直至达到80-90％汇合。细胞在无血清培养基中预温育过夜，随后在1μg/ml HLN或BLN中温育不同时间点直到6小时。在单独的培养基中温育的细胞用作对照(CTL)。

细胞活力

使用活/死荧光测定(

Invitrogen)，在第18天时在海藻酸盐珠子上评价细胞活力，并且通过荧光显微镜检查进行显现。

蛋白聚糖含量

含或不含连接N的海藻酸盐珠子的培养基每第三天进行更换，并且使用1,9-二甲基亚甲蓝(DMMB)染料结合测定，来分析释放到培养基内的硫酸化糖胺聚糖(GAG，占优势的聚集蛋白聚糖)[94]。不测量海藻酸盐中的GAG保留，因为海藻酸盐是与DMMB反应且因此干扰测定的聚阴离子。

总RNA分离和基因表达

在第7天和第14天时，将海藻酸盐珠子重悬浮于柠檬酸盐缓冲液中，并且回收细胞用于基因表达。遵循制造商的说明书，使用Trizol(Invitrogen,Burlington,ON，加拿大)从椎间盘细胞中提取总RNA。使用Superscript^TM First Strand cDNA合成试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，将一微克总RNA逆转录成cDNA。在逆转录后，应用实时PCR以定量分析聚集蛋白聚糖(AGG)、ADAMTS-4和ADAMTS-5的信使水平。使用基因特异性引物扩增一微升cDNA(表3)。最初，使靶基因的表达对18S rRNA表达水平标准化，并且随后使连接N温育的珠子的表达针对对照珠子标准化。

蛋白质表达

温育的AF和NP细胞随后在缓冲液(pH 7.4)中进行裂解，所述缓冲液含有10mMHEPES、50mM Na₄P₂O₇、50mM NaF、50mM NaCl、5mM EDTA、5mM EGTA、2mM Na₃VO₄、1％Triton X-100(全部来自Sigma-Aldrich)、以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics,Laval,QC，加拿大)。蛋白质在10％丙烯酰胺凝胶上分开，并且转移至PVDF膜用于蛋白质印迹，以使用针对P-Smad1/5、P-Smad2、Smad1和Smad2的特异性抗体(Cell SignalingTechnology,Danvers,MA)测量蛋白质表达。膜在ESL化学发光试剂(GE Healthcare,Piscataway,NJ)中进行温育，并且使用Molecular Imager VersaDoc^TM MP 4000 System(Bio-Rad Canada,Mississauga,ON，加拿大)进行扫描。使用ImageJ软件程序，通过光密度法定量条带强度。Smad1/5和Smad2的磷酸化针对相应的Smad1和Smad2总形式进行标准化。

统计分析

所有实验均一式三份执行，并且用三个独立培养物重复。通过重复测量ANOVA随后为Tukey's多重比较检验，来评价在每个时间点时的处理和培养期效应以及在实验组(CTL、BLN和HLN)中的差异显著性。小于0.05的P值视为统计上显著的。

结果

海藻酸盐珠子活力

细胞种植的海藻酸盐支架在培养中维持18天的时期，以便验证1μg/ml HLN或BLN的补充对于AF和NP细胞的活力无害。对于补充有HLN或BLN的支架，细胞活力维持在>98％(图20)。

牛和人连接N对蛋白聚糖合成的作用

对于与或不与连接N一起温育的NP和AF细胞两者，GAG进入培养基内的释放速率随着时间过去而增加(图21和22)。NP细胞趋于显示出与AF细胞的那种相似的总GAG释放。

通过补充有1μg/ml HLN的NP细胞的GAG释放在所有时间点均显著高于对照(对于第3天，p<0.05，并且对于第6、9、12、15、18天，p<0.0001)。当与通过补充有BLN的NP细胞的GAG释放相比较时，这个差异仅在第12天时开始是显著的(p<0.05)。相比之下，在通过补充有BLN的NP细胞的GAG释放与对照相比较之间未观察到统计显著性，尽管观察到朝向增加的趋势(图21)。

对于补充有1μg/ml HLN的AF细胞，GAG释放从第6天开始显著高于对照(对于第6天，p<0.05，并且对于第9、12、15、18天，p<0.0001)，而对于补充有1μg/ml BLN的那些，GAG释放从第9天开始显著高于对照(p<0.001)(图22)。最后，尽管GAG释放在所有时间点时在补充有HLN的AF细胞中趋于高于BLN的那种，但仅在第18天时该差异是显著的。

类似于我们先前实验的结果[95]，发现大多数GAG合成在培养基中释放，在海藻酸盐珠子中具有最低限度保留。GAG释放因此是蛋白聚糖合成的量度，并且看起来BLN也可能刺激GAG释放。

牛或人连接N对基质代谢的作用

为了研究BLN或HLN对蛋白聚糖和蛋白酶表达的作用，使牛细胞种植的海藻酸盐支架暴露于1μg/mL连接N，并且对于AGG、ADAMTS-4和ADAMTS-5评估相对基因表达。结果相对于未暴露于连接N的细胞(CTL)表示。当与对照相比较时，两种连接N处理均导致NP细胞中的AGG基因表达中的增加，然而，对于HLN温育，这种增加更大并且是统计上显著的(p＝0.0107)(图23)。在AF细胞中，与对照相比较，AGG表达响应HLN温育而上调(p＝0.0257)，但在BLN与对照相比较之间未观察到显著效应(p>0.1)。

尽管在第7天时，未观察到NP细胞的ADAMTS-4表达中的重要变化，但在第14天时，表达指出不显著的减少趋势(图24的(B))。相比之下，对于AF细胞，对于BLN和HLN温育两者均观察到mRNA ADAMTS-4表达中的增加，尽管差异与对照相比较并不显著(图24的(A))。

在第7天时，响应HLN温育，ADAMTS-5表达对于AF和NP细胞两者均上调。然而，这种增加仅对于AF细胞是显著的(p＝0.0149)。当与对照相比较时，响应BLN温育，ADAMTS-5表达在AF细胞中是下调的(p＝0.0329)，并且在NP细胞中是上调的(p＝0.0058)(图24的(C)和图24的(D))。

经典Smad介导的信号传导作为牛椎间盘细胞中的人和牛连接N功能的调节物

为了解释BLN和HLN通过其在牛NP和AF细胞中诱导合成代谢应答的分子机制，我们研究BLN和HLN是否活化Smad1/5蛋白质作为Smad经典信号传导途径的主要转导物。

蛋白质印迹结果揭示HLN在5分钟内活化牛AF细胞中的Smad1/5，而用BLN的活化在10分钟内发生，在30分钟时达到最大活化(图25)。对于两种连接N补充，AF细胞中的Smad1/5水平在6小时后下降至对照水平以下。在NP细胞中，BLN和HLN补充在30分钟后显著刺激Smad1/5，并且随着时间过去继续增加。然而，对于两种IVD细胞，HLN看起来在Smad1/5活化方面比BLN更有效。

在AF细胞中，在HLN或BLN中的温育看起来诱导轻微增加的Smad2活化直到三小时。相比之下，在连接N中温育的NP细胞中未检测到Smad2活化(图26)。

讨论

先前研究已显示连接N可充当生长因子，且在体外在牛IVD细胞中刺激蛋白聚糖和胶原合成[88、35]，并且可在体内椎间盘退变的兔模型中增加椎间盘高度[31]。连接N还可在3D支架中以及在完整的人椎间盘中刺激通过人椎间盘细胞的蛋白聚糖合成[93]。本文数据指示HLN在NP细胞中的所有时间点和在AF细胞中从第6天开始显著刺激蛋白聚糖合成。补充有BLN的NP细胞显示朝向蛋白聚糖合成增加的趋势，其并不显著。有利的是，补充有BLN的AF细胞的GAG释放从第9天向前显著高于对照，提示BLN在刺激蛋白聚糖合成方面在AF细胞中比NP细胞中更有效。另外，HLN在牛NP细胞中在14天后能够下调ADAMTS-4表达，但在AF细胞中并不显著影响ADAMTS-4表达。BLN在NP细胞中在14天后对ADAMTS-4表达没有显著作用，尽管在AF细胞中观察到朝向增加的趋势。BLN在AF细胞中能够下调ADAMTS-5，同时在14天后在NP细胞中上调ADAMTS-5。最后，BLN和HLN通过Smad1/5信号传导途径刺激通过NP和AF细胞的蛋白聚糖合成。

先前，我们发现尽管细胞增殖在海藻酸盐中不预期是广泛的[91-92]，但它可促成GAG生产中的变化。在该研究中，我们分析聚集蛋白聚糖的信使水平和累积蛋白聚糖释放，并且发现与对照相比较，与连接N一起温育的AF和NP细胞两者的GAG释放增加，如聚集蛋白聚糖的mRNA表达一样。我们发现的通过NP和AF细胞的GAG合成中的相似性，以及在蛋白酶解分离期间AF细胞的增加的存在和存活，可意指AF细胞可充当NP细胞的功能替代物，这对于组织工程可能是有益的。

BLN在NP中刺激ADAMTS-5同时在AF中下调ADAMTS-5的事实可通过下述事实加以解释：修复涉及椎间盘ECM的重塑，并且重塑涉及蛋白酶解。因此，不存在对修复期间的蛋白酶解的完全不存在的需要，只要基质合成超过周转即可。HLN和BLN可刺激蛋白聚糖生产以帮助恢复椎间盘功能。HLN在牛AF细胞中在5分钟内立即活化Smad1/5，而用BLN的活化在30分钟内逐渐发生的事实，提示HLN活化可为直接的，而BLN的活化可为间接的。间接活化还可以是对于NP细胞的情况，其中使用BLN和HLN的补充在30分钟后显著刺激Smad1/5，并且对于测试期(6小时)的持续时间继续增加。因此，在AF和NP中的BLN以及在NP中的HLN可活化其他分子，其依次又刺激蛋白聚糖合成。

在AF细胞中Smad1/5通过BLN在10分钟内的快速活化可解释我们的这一发现：AF细胞在促进蛋白聚糖合成方面比NP细胞更佳地响应BLN补充。先前研究已显示当用TGF-β进行刺激时，来自牛椎间盘的AF细胞产生比NP细胞更多的蛋白聚糖[96]。然而，并非总是如此，因为NP和AF细胞能够以相似方式响应[97]。连接N直接刺激Smad1/5的能力可由于年龄中的差异而改变。在年轻的椎间盘中，NP是蛋白聚糖的主要源。然而，随着年龄和退变观察到AF中增加的蛋白聚糖含量[96、98]，可能是通过Smad1/5信号传导的直接活化。

尽管，两种肽均具有为设计为刺激椎间盘修复的任何试剂所需的特点，但HLN补充可能是用于治疗在其早期期间的椎间盘退变的更佳选项，此时AF仍是完整的。这个规律假定完整AF用于最佳修复，以便防止由于与蛋白聚糖积累潜在相关的肿胀增加的NP突出。

BLN可通过Smad1/5信号传导的间接活化在体外在NP和AF细胞两者中刺激蛋白聚糖产生。因此，原则上，BLN补充也可为用于治疗椎间盘退变的选项。浓度为1ug/ml的HLN在刺激蛋白聚糖合成方面有效，并且可在AF中直接活化Smad1/5信号传导，所述AF是伴随年龄和退变的蛋白聚糖合成的主要源。

缩写列表

18S rRNA：18S核糖体RNA；ADAMTS；具有凝血酶敏感蛋白样重复的解聚素和金属蛋白酶；AGG：聚集蛋白聚糖；AF：纤维环；BLN：牛连接N；BMP：骨形态发生蛋白；DMMB：1,9-二甲基亚甲蓝；ECM：细胞外基质；GAG：硫酸化糖胺聚糖；HA：透明质酸盐；HLN：人连接N；IVD：椎间盘；LP：连接蛋白；NP：髓核；PCR：聚合酶链反应；RT：逆转录；TGFβ：转化生长因子-β。

表3.用于评价基因表达的寡核苷酸引物

实例8

图27是一系列细胞染色和免疫印迹，其显示IVD中的NGF表达在NP和AF细胞两者中随着退变而增加。图28证实连接N压制AF细胞中TNFα诱导的神经营养因子(NGF、BDNF)和P物质(TAC1)的基因表达。图29证实连接N压制AF细胞中IL-1β诱导的神经营养因子(NGF、BDNF)和P物质(TAC1)的表达。图30和31证实连接N的效应通过减少神经营养因子和SP受体的水平来介导。

图32显示连接N能够在4级人AF细胞中抑制IL-1β诱导的NGF释放。图33证实连接N(10μg/ml)补充在穿刺后24小时减少来自受损牛椎间盘的P物质释放。

证实人IVD中的NGF表达随着退变而增加。连接N减少来自机械性损伤的IVD的P物质释放。连接N显著压制AF细胞中TNFα和IL-1β诱导的神经营养因子基因表达和神经营养因子受体。

实例9

更小的片段就活性进行测试。测试了SEQ ID NO:1的氨基酸1-4、4-8和3-6的片段。测试例如由氨基酸1-7、1-6、1--5等组成的越来越小的片段，直至活性丧失时。测试缺失来自NH2末端的氨基酸的相似的更小片段，例如测试由氨基酸2-8、3-8、4-8、5-8等组成的更小片段。如其他实施例中所述的PCR分析和/或35S可用作读出。

实例10

连接N片段可包括在下表中的物种之一中发现的一种或多种氨基酸变化。

关于不同物种的连接N的序列的表。

虽然本专利申请已参考目前视为优选实例的内容进行描述，但应理解本专利申请并不限于所公开的实例。相反，本专利申请意欲涵盖在所附权利要求的精神和范围内包括的各种修饰和等价排列。

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Claims (19)

1.一种经分离的多肽，所述经分离的多肽由选自DHLSDNYT(SEQ ID NO:2)和DHHSDNYT(SEQ ID NO:3)的序列组成。

2.根据权利要求1所述的经分离的多肽，其中所述多肽缀合至免疫球蛋白Fc部分或白蛋白。

3.一种经分离的核酸，所述经分离的核酸编码根据权利要求1或2所述的多肽。

4.一种载体，所述载体包含根据权利要求3所述的经分离的核酸。

5.一种重组细胞，所述重组细胞表达根据权利要求1或2所述的多肽。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其中所述细胞是软骨细胞谱系细胞、间充质干细胞或椎间盘细胞。

7.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1或2所述的经分离的多肽以及药学可接受的载体或稀释剂。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含由生物相容性材料形成的支架，所述生物相容性材料包含根据权利要求1或2所述的经分离的多肽。

9.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求5或6所述的重组细胞以及药学上可接受的载体或稀释剂。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含由生物相容性材料形成的支架，所述生物相容性材料包含根据权利要求5或6所述的重组细胞。

11.根据权利要求1或2所述的经分离的多肽在制备用于诱导软骨、软骨细胞或椎间盘细胞或者包含软骨、软骨细胞或椎间盘细胞的组织中的基质合成的药物中的用途，所述用途包括在诱导蛋白聚糖和胶原合成的条件下，使所述软骨、软骨细胞或椎间盘细胞与有效量的根据权利要求1或2所述的经分离的多肽一起温育或培养，从而产生具有增加的基质合成的经诱导的软骨、软骨细胞或椎间盘细胞。

12.根据权利要求1或2所述的经分离的多肽在制备用于产生用于植入受试者内的软骨、软骨细胞或椎间盘组织的药物中的用途，所述用途包括在诱导蛋白聚糖和胶原合成的条件下，使所述软骨、软骨细胞或椎间盘细胞与有效量的根据权利要求1或2所述的经分离的多肽一起温育或培养，从而产生具有增加的基质合成的经诱导的软骨、软骨细胞或椎间盘细胞，其中基本上纯的经诱导的软骨、软骨细胞或椎间盘细胞群体被生产，并且其中“基本上纯的”指就构成总细胞群体的细胞而言，至少65％纯的细胞群体。

13.根据权利要求1或2所述的经分离的多肽在制备用于减轻与软骨或椎间盘病症相关的疼痛的药物中的用途，其中所述药物施用于有此需要的受试者。

14.根据权利要求1或2所述的经分离的多肽在制备用于治疗软骨或椎间盘病症的药物中的用途，其中所述药物施用于有此需要的受试者。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述软骨或椎间盘病症是椎间盘退变，或是炎性或退行性关节病，其中所述炎性或退行性关节病包括关节炎、不希望的骨生成和/或钙化。

16.根据权利要求5或6所述的重组细胞在制备用于减轻与软骨或椎间盘病症相关的疼痛的药物中的用途，其中所述药物施用于有此需要的受试者。

17.根据权利要求5或6所述的重组细胞在制备用于治疗软骨或椎间盘病症的药物中的用途，其中所述药物施用于有此需要的受试者。

18.根据权利要求7-10任一项所述的药物组合物在制备用于减轻与软骨或椎间盘病症相关的疼痛的药物中的用途，其中所述药物施用于有此需要的受试者。

19.根据权利要求7-10任一项所述的药物组合物在制备用于治疗软骨或椎间盘病症的药物中的用途，其中所述药物施用于有此需要的受试者。

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