ES2882113T3 - Vacuna para adenovirus aviar - Google Patents

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Anna Schachner
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Abstract

Vacuna que comprende proteína de fibra 2 de Adenovirus aviar C (FAdV-C) para su utilización en la prevención del síndrome de hepatitis-hidropericardio (SHH) en aves, de forma preferente en aves de corral, especialmente en pollos de engorde; en la que la vacuna es una vacuna de subunidades.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna para adenovirus aviar
La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones (formulaciones) para la prevención del síndrome de hepatitis - hidropericardio (SHH).
El SHH es una enfermedad infecciosa de los pollos, que se caracteriza por una alta mortalidad y pérdidas económicas graves, principalmente en los pollos de engorde. Después de los primeros informes de la enfermedad en 1987 desde Pakistán, se han documentado brotes principalmente en países de Asia, América Central y América del Sur. Las conjeturas iniciales apuntaban a la participación de un agente desconocido, además de un adenovirus que se modificó posteriormente al reproducirse la enfermedad en aves específicas libres de patógenos tras la infección oral con cepas C virulentas de adenovirus aviar (FAdV).
Los adenovirus aviares son miembros de la familia Adenoviridae y género Aviadenovirus. Se han reconocido a la fecha cinco especies (FAdV-A a FAdV-E) y 12 serotipos (FAdV-1 a 8a y de 8b a 11), identificados mediante la prueba de neutralización cruzada.
Los adenovirus son partículas no encapsuladas con un genoma de ADN bicatenario y un diámetro de 70 a 90 nm. Las principales proteínas estructurales de un adenovirus son hexones y pentones, que constituyen una cápside icosaédrica de 252 subunidades (capsómeros), donde los hexones forman las facetas y los pentones cubren los vértices del icosaedro. La base del pentón ancla la proteína de la fibra en forma de antena, cuyo dominio de cabeza distal, denominado perilla (“knob”), alberga el sitio de unión al receptor y es por ende esencial para iniciar la fijación del virus a la célula huésped.
La cápside de FAdV se caracteriza por una peculiaridad morfológica de dos proteínas de fibra asociadas con la base de cada pentón, mientras que los adenovirus de mamíferos incluyen sólo una proteína de fibra por vértice. Si bien la existencia de fibras duales es común a todas las FAdV, dos fibras de diferente secuencia y longitud, cada una codificada por un gen separado, son una característica específica de FAdV-1 (FAdV-A) (Hess et al., J. Mol. Biol. 252 (1995), 379-385). En base al hallazgo novedoso de dos genes separados que codifican fibras en un aislado FAdV-C, se ha demostrado recientemente que esto refleja, entre todas las especies FAdV con proteínas de fibra de igual longitud, una característica que se atribuye exclusivamente a los miembros de FAdV-C (Marek et al., Vet. Microbiol.
156 (2012), 411-417).
La caracterización de la perilla como dominio de unión al receptor ha establecido la molécula de fibra como un factor crítico que se asocia con las propiedades de infección de los adenovirus, tales como alteraciones en el tropismo tisular y virulencia. Sin embargo, existen aún muchas interrogantes con respecto a la funcionalidad individual de las fibras duales presentes en las FAdV, particularmente en el contexto de la interacción con los receptores de la célula huésped.
Como estructuras principales de la cápside expuestas en la superficie, la fibra y el hexón son mediadores claves de la antigenicidad en los adenovirus y portadores de una panoplia de epítopos de especificidad de subgrupos y tipos. También se ha demostrado que los anticuerpos específicos de hexón y fibra dan cuenta de la mayor parte de la actividad neutralizante en la respuesta humoral de los mamíferos contra el adenovirus. Recientemente, ensayos in vitro demostraron diferentes grados de capacidad neutralizante de los anticuerpos generados contra las proteínas de hexones y fibras recombinantes del virus del síndrome de la caída de la postura (EDSV, egg-drop syndrome virus (DAdV-A = DAdV-1)).
Debido a sus propiedades antigénicas, las estructuras de la cápside del adenovirus se han propuesto como candidatas potenciales para el diseño de vacunas en base a epítopos.
Las estrategias para combatir el SHH se han concentrado en la prevención de la infección y en la provisión de vacunas atenuadas de adenovirus aviar (WO 03/039593) o vacunas inactivadas a partir de homogeneizados de hígado infectados (Anjum et al., 1990) o virus desarrollado en células primarias (Alvarado et al., 2007). Sin embargo, debido a la presencia ubicua de los FAdV, la aplicación de tales vacunas convencionales y la verificación de la eficacia de la vacunación tiene un uso limitado debido a la falta de discriminación entre la vacunación y la infección. Una vacuna de subunidades contra el SHH con sustento en la base del pentón (expresada en E. coli) se sugirió recientemente (Shah et al., (Vaccine 30 (2012); 7153-7156)); sin embargo, generalmente es difícil detectar los anticuerpos como indicador de la inmunización exitosa debido a la omnipresencia de otros adenovirus aviares. La Patente US 2011/165224 A1 da a conocer cepas FAdV aisladas de serotipos específicos para inducir inmunidad protectora. Estas composiciones contienen virus completos (vivos o muertos), no vacunas de subunidades o proteínas de FAdV aisladas. Griffin et al. (J. Gen. Virol. 92 (2011); 1260-1272) divulgan análisis de potencial de codificación y transcripción de FAdV-4. Se especula que la fibra 2 de FAdV-4 (fibra corta), que se “prevé que codifica la proteína” (pero no se demuestra que se exprese), podría unir un receptor y determinar el tropismo tisular de FAdV-4, “conduciendo tal vez a las características clínicas únicas asociadas con la infección de FadV-4 virulento”. Los autores señalan correctamente que tanto el FAdV-1 aviar como los serotipos entéricos humanos HAdV-40 y HAdV-41 (=HAdV-F), contienen dos genes de fibra. Sin embargo, hay diferencias significativas: mientras que en FAdV-1, como en todas los AdV aviares, se ensamblan siempre dos fibras por base del pentón, sólo hay una fibra en los HAdV-F. Por otra parte, diferentes cantidades de ambas fibras se ensamblan en el virión de HAdV-F aun cuando la expresión es la misma en el nivel de ARNm (Song et al., Virology 432 (2012), 336-342). Esto muestra que ambas fibras tienen diferentes funciones en el virión ensamblado (esto se ha comprobado en los estudios de receptores). Por otra parte, Tan et al. (J. Gen. Virol. 82 (2001), 1465-1472) han demostrado que la fibra 2 está implicada en el ensamblaje de virus y en la interacción con un receptor celular desconocido. Dado que FAdV-1 comprende, a diferencia de todos los demás FAdV, dos fibras de longitudes completamente diferentes, tales resultados no pueden ser transferidos a otros serotipos.
Marek et al. (Vet. Microbiol. 156 (2012); 411-417) divulgan el hecho que dos genes de fibra de aproximadamente la misma longitud están presentes en FAdV-C, mientras que otros serotipos sólo tienen un gen de fibra. Si bien se menciona que las “fibras de FAdV juegan un papel importante en la infectividad y patogenicidad de FadV“ (demostrado en 1996), esta afirmación fue identificada por Marek et al. como “puramente especulativa1 en lo que se refiere a FAdV-C. Además, la probabilidad que las proteínas de fibra estén involucradas en la infectividad y patogenicidad no implica automáticamente la aplicación eficaz de proteínas recombinantes como vacuna.
Fingerut et al. (Vaccine 21 (2003); 2761-2766) divulgan una vacuna de subunidades contra el síndrome de la caída de la postura del adenovirus utilizando parte de su proteína de fibra.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una vacuna segura y específica para la prevención eficiente del SHH en las aves, especialmente en las aves de corral. La vacuna debe ser fácil de producir y rentable y ser adecuada para la administración sobre una base industrial. La inmunización eficaz con la vacuna debe detectarse y confirmarse con facilidad.
Por lo tanto, la presente invención da a conocer una vacuna que comprende una proteína de fibra-2 de Adenovirus C Aviar (FAdV-C) para su utilización en la prevención del síndrome de hepatitis-hidropericardio (SHH) en las aves, de forma preferente, en aves de corral, especialmente en pollos de engorde; en la que la vacuna es una vacuna de subunidades.
La presente invención proporciona la enseñanza que la proteína de fibra-2 de FAdV-C es una vacuna de subunidades eficaz que protege completamente a las aves, en especial los pollos, del SHH. Este hallazgo fue notable porque la proteína de fibra-1 de FAdV-C, así como también las vacunas de subunidades derivadas de hexón (bucle 1 de hexón), no mostraron un efecto protector. Es evidente que las presentes vacunas con subunidades aisladas, es decir, las proteínas individuales aisladas o fragmentos de proteínas, difieren en esencia de las vacunas en que se basan en virus vivos, atenuados o muertos (completos). En consecuencia, la presente invención da a conocer una estrategia completamente novedosa y, en vista de las enseñanzas presentes en el presente campo para proteínas de fibra y derivadas de hexón en FAdV, sorprendentemente eficaz para la vacunación de las aves con el fin de gestionar la prevención del SHH, IBH y GE.
Para la presente invención, puede utilizarse cualquier proteína de fibra-2 de FAdV-C. En los ejemplos de la presente invención, la proteína de fibra-2 de la cepa de referencia KR5 se utilizó como referencia (entrada UniProt H8WQW9); sin embargo, pueden utilizarse también otras secuencias de proteína de fibra 2 de FAdV-C, por ejemplo, de cepas de referencia ON1 (GU188428 = NC_015323) o CFA20 (AF160185) o cualquier otro aislado de campo de FadV-C, por ejemplo, aislados IV37, K99-97, K388-95, K88-95, K31, Peru53, Peru54, c344, K1013, AG234, C2B, 09-584, 09­ 8846, 09-2602, 922-1, Da60, K1013QT e INT4 (como describen Marek et al, Vet. Microbiol. 156 (2012), 411-417); correspondiente a las entradas UniProt H8WG65, H8WG69, H8WG72, H8WG77, H8WG70, H8WG73, H8WG66, H8WG76, H8WG60, H8WG61, H8WG62, H8WG75, H8WG67, H8WG78, H8WG63, H8WG68, H8WG64, H8WG74, H8WG71, H8WQZ7, H8WQZ2, H8WQW9, Q0GH78, O55281 y F2VJI5.
El término “proteína de fibra-2” se acepta en el presente campo de la tecnología. Todas las proteínas de fibra, especialmente el subgrupo de proteínas de fibra-2, están unidas por una secuencia de aminoácidos característica que da como resultado una estructura característica con motivos de aminoácidos específicos y conservados.
Los fragmentos inmunogénicos pueden ser cualquier polipéptido de una proteína de fibra-2 de un aislado de FAdV-C de origen natural con una longitud mínima de 7 residuos de aminoácidos, de forma preferente, con una longitud mínima de 8 residuos de aminoácidos, especialmente con una longitud mínima de 9 residuos de aminoácidos. Estas longitudes mínimas proporcionan suficiente unión al MHC. Los motivos adecuados pueden verificarse experimentalmente o por medio de predicción computarizada (véase, por ejemplo, Wallny et al., PNAS 103 (2006), 1434-1439; Huo et al., PLoS ONE 7 (2012): e39344. doi:10.1371). Por consiguiente, las longitudes preferentes de los fragmentos inmunogénicos son de 7 a 100 aminoácidos, de forma preferente, de 8 a 50 aminoácidos, de forma más preferente, de 8 a 20 aminoácidos, especialmente de 8 a 16 aminoácidos. Por ejemplo, los fragmentos inmunogénicos pueden contener octapéptidos o nonapéptidos en base a los motivos de unión a péptidos de moléculas clase I de MHC de pollos que pertenecen a los haplotipos B4, B12, B15 y B19 (Wallny et al., 2006;. Huo et al., 2012). Los motivos fueron los siguientes: B4: x-(D o E)-x-x-(D o E)-x-x-E; B12: x-x-x-x-(V o I)-x-x-V y x-x-x-x-(V o I)-x-x-x(V); B15: (K o R)-R-x-x-x-x-x-Y y (K o )-R-x-x-x-xx-x-Y; B19: x-R-x-x-x-x-x-(Y, P, L, F) y x-R-x-x-x-x-x-x-(Y, P, L, F).
La proteína fibra-2 tiene un dominio de cola (aminoácidos 1 a 65), un dominio de eje (aminoácidos 66 a 276) y un dominio de cabeza (aminoácidos 277 a 479); todos los números de secuencia de aminoácidos en esta especificación general se basan en la proteína de fibra-2 de la cepa de referencia KR5 (UniProt H8WQW9; Marek et al., 2012)). Los fragmentos inmunogénicos preferentes de la presente invención contienen los siguientes motivos (en base a la numeración de aminoácidos de acuerdo con la fibra-2 de KR5): de 400 a 450, de forma preferente, de 410 a 440, de forma más preferente, de 420 a 440; de 70 a 95, de forma preferente, 75 a 93, especialmente, de 75 a 90; de 20 a 70, de forma preferente, de 25 a 65, especialmente de 45 a 65 y de 25 a 47; de 200 a 225, de 265 a 290, de 350 a 385, de 460 a 480, de 165 a 190, de 320 a 350 y de 290 a 320.
Ejemplos de fragmentos inmunogénicos son los fragmentos que comprenden una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos de proteína de fibra-2 (una vez más de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de fibra-2 de KR5 y según la alineación en la figura 5):
L a s más p r e f e r e n t e s : 421 a 435 254 a 268 405 a 419 23 a 37 422 a 436 78 a 92 406 a 420 24 a 38 423 a 437 424 a 438 407 a 421 22 a 36 424 a 438 424 a 438 408 a 422 25 a 39 425 a 439 79 a 93 409 a 423 21 a 35 426 a 440 77 a 91 69 a 83 424 a 438 427 a 441 423 a 437 255 a 269 254 a 268 423 a 437 26 a 40 20 a 34 423 a 437 253 a 267 403 a 417 325 a 339 424 a 438 425 a 439 404 a 418 355 a 369
425 a 439
423 a 437
45 a 59
46 a 60
47 a 61
48 a 62
49 a 63
50 a 64
51 a 65
326 a 340
255 a 269
326 a 340
A l t a m e n t e 207 a 221 426 a 440 308 a 322 p r e f e r e n t e s : 208 a 222 324 a 338 283 a 297 24 a 438 209 a 223 167 a 181 71 a 85 6 a 40 210 a 224 168 a 182 425 a 439 7 a 41 267 a 281 169 a 183 426 a 440 28 a 42 268 a 282 170 a 184 77 a 91 29 a 43 269 a 283 171 a 185 422 a 436 30 a 44 270 a 284 172 a 186 68 a 82 31 a 45 271 a 285 173 a 187 426 a 440 32 a 46 272 a 286 356 a 370 282 a 296 75 a 89 273 a 287 70 a 84 426 a 440 76 a 90 353 a 367 353 a 367 356 a 370 77 a 91 354 a 368 192 a 206 281 a 295 78 a 92 355 a 369 54 a 68 284 a 298 79 a 93 356 a 370 55 a 69 78 a 92 80 a 94 357 a 371 322 a 336 310 a 324 81 a 95 358 a 372 323 a 337 311 a 325 354 a 368 359 a 373 324 a 338 53 a 67 283 a 297 69 a 83 325 a 339 183 a 197 425 a 439 76 a 90 326 a 340 313 a 327 422 a 436 425 a 439 422 a 436 314 a 328 325 a 339 327 a 341 422 a 436 315 a 329 282 a 296 68 a 82 327 a 341 316 a 330 422 a 436 252 a 266 56 a 70 317 a 331 253 a 267 309 a 323 294 a 308 318 a 332 423 a 437 442 a 456 295 a 309 319 a 333 322 a 336 256 a 270 296 a 310 52 a 66 323 a 337 426 a 440 297 a 311 252 a 266 324 a 338 68 a 82 298 a 312 183 a 197 325 a 339 69 a 83 299 a 313 297 a 311 326 a 340 70 a 84 300 a 314 422 a 436 327 a 341 71 a 85 355 a 369 328 a 342 328 a 342 72 a 86 325 a 339 59 a 73 70 a 84 73 a 87 191 a 205 60 a 74 425 a 439 74 a 88 355 a 369 61 a 75 423 a 437 464 a 478 71 a 85 62 a 76 424 a 438 465 a 479 441 a 455 63 a 77 204 a 218 310 a 324 421 a 435 64 a 78 205 a 219 80 a 94 256 a 270 65 a 79 206 a 220 443 a 457 79 a 93 463 a 477 a 198 188 a 202 a 268 76 a 90 a 323 194 a 208 a 221 77 a 91 a 57 326 a 340 a 338 193 a 207 a 66 79 a 93 a 67 282 a 296 a 68 69 a 83 a 69 184 a 198 a 70 298 a 312 a 71 23 a 37 a 72 70 a 84 a 199 379 a 393 a 337 283 a 297 a 458 296 a 310 a 338 283 a 297
Figure imgf000006_0001
a 370
a 92
a 220
a 378
a 390
a 391
a 392
t o 393
t o 394
t o 395
t o 396
t o 85
t o 206
t o 392
t o 435
t o 206
t o 311
t o 196
t o 197
t o 198
t o 199
t o 200
P r e f e r e n t e s 283 a 297 127 a 141 355 a 369 424 a 438 284 a 298 186 a 200 425 a 439 354 a 368 285 a 299 465 a 479 421 a 435 27 a 41 286 a 300 310 a 324 206 a 220 426 a 440 284 a 298 257 a 271 283 a 297 255 a 269 440 a 454 421 a 435 80 a 94 282 a 296 261 a 275 323 a 337 308 a 322 357 a 371 310 a 324 208 a 222 312 a 326 193 a 207 251 a 265 378 a 392 91 a 105 261 a 275 363 a 377 72 a 86 92 a 106 307 a 321 207 a 221 93 a 107 93 a 107 352 a 366 24 a 38 207 a 221 94 a 108 354 a 368 319 a 333 320 a 334 95 a 109 75 a 89 282 a 296 86 a 100 96 a 110 261 a 275 182 a 196 458 a 472 97 a 111 295 a 309 260 a 274 459 a 473 69 a 83 44 a 58 22 a 36 460 a 474 424 a 438 207 a 221 293 a 307 461 a 475 169 a 183 169 a 183 428 a 442 462 a 476 165 a 179 253 a 267 429 a 443 281 a 295 166 a 180 311 a 325 296 a 310 280 a 294 101 a 115 292 a 306 168 a 182 281 a 295 102 a 116 185 a 199 260 a 274 77 a 91 103 a 117 464 a 478 318 a 332 205 a 219 104 a 118 465 a 479 78 a 92 308 a 322 105 a 119 283 a 297 309 a 323 193 a 207 106 a 120 423 a 437 79 a 93 204 a 218 107 a 121 206 a 220 191 a 205 261 a 275 191 a 205 42 a 56 192 a 206 260 a 274 298 a 312 287 a 301 193 a 207 170 a 184 259 a 273 288 a 302 194 a 208 377 a 391 423 a 437 289 a 303 195 a 209 282 a 296 309 a 323 290 a 304 196 a 210 167 a 181 205 a 219 291 a 305 197 a 211 190 a 204 261 a 275 292 a 306 282 a 296 310 a 324 357 a 371 293 a 307 28 a 42 189 a 203 256 a 270 357 a 371 317 a 331 190 a 204 291 a 305 280 a 294 245 a 259 309 a 323 295 a 309 281 a 295 206 a 220 284 a 298 327 a 341 282 a 296 67 a 81 76 a 90 294 a 308 a 184 258 a 272 443 a 457 161 a 175 a 297 328 a 342 307 a 321 162 a 176 a 361 203 a 217 81 a 95 163 a 177 a 435 322 a 336 29 a 43 355 a 369 a 222 128 a 142 94 a 108 204 a 218 a 295 262 a 276 311 a 325 421 a 435 a 205 85 a 99 284 a 298 406 a 420 a 258 55 a 69 421 a 435 118 a 132 a 478 452 a 466 80 a 94 71 a 85 a 71 75 a 89 72 a 86 294 a 308 a 72 422 a 436 202 a 216 346 a 360 a 439 77 a 91 79 a 93 426 a 440 a 362 353 a 367 323 a 337 280 a 294 a 363 321 a 335 281 a 295 45 a 59 a 364 28 a 42 312 a 326 290 a 304 a 365 78 a 92 87 a 101 297 a 311 a 366 262 a 276 28 a 42 320 a 334 a 298 453 a 467 281 a 295 119 a 133 a 393 123 a 137 285 a 299 20 a 34 a 325 124 a 138 465 a 479 21 a 35 a 341 125 a 139 356 a 370 22 a 36 a 274 126 a 140 194 a 208 23 a 37 a 196 127 a 141 309 a 323 24 a 38 a 459 128 a 142 306 a 320 25 a 39 a 276 129 a 143 252 a 266 404 a 418 a 436 265 a 279 306 a 320 442 a 456 a 69 266 a 280 443 a 457 289 a 303 a 464 320 a 334 405 a 419 281 a 295 a 465 321 a 335 54 a 68 170 a 184 a 466 366 a 380 41 a 55 258 a 272 a 467 367 a 381 204 a 218 259 a 273 a 468 368 a 382 24 a 38 260 a 274 a 469 369 a 383 380 a 394 261 a 275 a 470 370 a 384 251 a 265 262 a 276 a 324 371 a 385 208 a 222 263 a 277 a 84 372 a 386 348 a 362 264 a 278 a 222 284 a 298 157 a 171 442 a 456 a 367 322 a 336 158 a 172 443 a 457 a 219 246 a 260 159 a 173 444 a 458 a 342 260 a 274 160 a 174 445 a 459 a 460 262 a 276 308 a 322 117 a 131 a 461 376 a 390 444 a 458 70 a 84 a 462 21 a 35 254 a 268 346 a 360 a a
361 311 325 195 a 209 310 a 324 a a
200 170 184 126 a 140 25 a 39 a 82 294 a 308 189 a 203 29 a 43. a 417 54 a 68 93 a 107 465 a 479 a 227 29 a 43 295 a 309 292 a 306 a 39 298 a 312 192 a 206 345 a 359 a a
41 364 378 194 a 208 164 a 178 a 273 290 a 304 227 a 241 137 a 151 a 41 259 a 273 71 a 85 263 a 277 a 183 205 a 219 70 a 84 209 a 223 a 421 92 a 106 23 a 37 305 a 319 a 335 280 a 294 316 a 330 171 a 185 a a
379 28 42 1 a 15 136 a 150 a a
456 33 47 206 a 220 280 a 294 a 313 34 a 48 293 a 307 66 a 80 a a
241 35 49 56 a 70 67 a 81 a 322 36 a 50 1 a 15 181 a 195 a 323 37 a 51 243 a 257 358 a 372 a a
324 38 52 369 a 383 284 a 298 a 325 205 a 219 325 a 339 295 a 309 a 326 80 a 94 225 a 239 325 a 339 a 391 39 a 53 226 a 240 129 a 143 a 86 40 a 54 227 a 241 94 a 108 a 43 245 a 259 228 a 242 307 a 321 a 362 262 a 276 229 a 243 291 a 305 a 321 426 a 440 230 a 244 251 a 265 a 359 69 a 83 231 a 245 252 a 266 a 360 280 a 294 76 a 90 253 a 267 a 361 312 a 326 349 a 363 254 a 268 a 375 464 a 478 378 a 392 255 a 269 a 376 319 a 333 451 a 465 256 a 270 a 377 354 a 368 296 a 310 257 a 271 a 378 187 a 201 69 a 83 288 a 302 a 379 322 a 336 356 a 370 285 a 299 a a
183 325 339 228 a 242 254 a 268 a 325 308 a 322 76 a 90 228 a 242 a 182 67 a 81 71 a 85 257 a 271 319 a 333
440 a 454
La vacuna, según la presente invención, contiene, de forma preferente, una proteína de fibra-2 de FAdV-C, seleccionada entre las entradas de secuencias UniProt H8WG65, H8WG69, H8WG72, H8WG77, H8WG70, H8WG73, H8WG66, H8WG76, H8WG60, H8WG61, H8WG62, H8WG75, H8WG67, H8WG78, H8WG63, H8WG68, H8WG64, H8WG74, H8WG71, H8WQZ7, H8WQZ2, H8WQW9, Q0GH78, O55281 y F2VJI5, así como también las secuencias de proteína proporcionadas en la figura 5 y la tabla 3, en especial H8WQW9; o secuencias inmunogénicas, como mínimo, con el 80, de forma preferente, como mínimo, el 90, especialmente, como mínimo, el 95 % de identidad de aminoácidos (en base a la alineación con el programa Clustal Omega; la identidad se calcula según la relación de aminoácidos idénticos dividida por el número total de aminoácidos (de la secuencia más corta, si las secuencias no tienen la misma longitud), por 100 (para %)). Por ejemplo, los residuos de aminoácidos en la posición (basados en la secuencia KR5 H8WQW9) 29, 31, 36, 91, 93, 114, 115, 213, 219, 232, 235, 279, 291, 294, 295, 299, 300, 302 a 307, 319, 324, 329, 343, 338, 343 a 346, 372, 378, 380, 391, 393, 400, 403, 405, 406, 411, 413, 421, 427, 433, 435, 439, 453, 459, 476 o 478 pueden cambiarse (como lo demuestran los aislados de secuencias UniProt H8WG65, H8WG69, H8WG72, H8WG77, H8WG70, H8WG73, H8WG66, H8WG76, H8WG60, H8WG61, H8WG62, H8WG75, H8WG67, H8WG78, H8WG63, H8WG68, H8WG64, H8WG74, H8WG71, H8WQZ7, H8WQZ2, H8WQW9, Q0GH78, O55281 y F2VJI5); o la supresión de secuencias, tales como en el extremo N (por ejemplo, hasta la posición 21), de 123 a 139, de 250 a 272, 364 o en el extremo C, por ejemplo, las posiciones 464 a 479 (como también lo demuestran las secuencias UniProt anteriores; alineaciones realizadas por el software de alineación UniProt (programa Clustal Omega)). Además, las variaciones, supresiones e inserciones de aminoácidos que se producen naturalmente se ejemplifican en la figura 5 y se pueden derivar de las secuencias de la tabla 3.
De forma preferente, la vacuna según la presente invención comprende, además, un adyuvante, de forma preferente, seleccionado del grupo que consiste en adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, hidróxido de aluminio, Bordetella pertussis, saponina, dipéptido de muramilo, copolímero de etileno acetato de vinilo, aceite, un aceite vegetal o un aceite mineral, en particular aceite de cacahuete o aceite de silicona y combinaciones de los mismos.
Los adyuvantes son sustancias que potencian la respuesta inmune a los inmunógenos. Los adyuvantes pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas, por ejemplo, Quil A, emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite-en-agua, emulsión de agua en aceite en agua. La emulsión puede basarse, en particular, en aceite de parafina líquida ligera (tipo Farmacopea Europea); aceite de isoprenoide, tal como escualano o escualeno; aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos o alcoholes grasos ramificados, en particular ésteres de ácido isoesteárico. El aceite se utiliza en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes son, de forma preferente, surfactantes no iónicos, en particular ésteres de sorbitano, de manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), de glicerol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, que son opcionalmente etoxilados, y bloques de copolímeros de polioxipropileno-polioxietileno, en particular, productos Pluronic(R), especialmente L121. Por ejemplo, la vacuna que contiene adyuvante se prepara de la siguiente manera: de 50 a 90 v/v de fase acuosa que comprende el inmunógeno se emulsionan en del 1 al 10 % p/v de oleato de anhidromanitol, del 1 al 10 % p/v de ácido oleico etoxilado con 11 EO (óxido de etileno) y del 5 al 40 % v/v de aceite de parafina líquida ligera (tipo Farmacopea Europea) con la ayuda de un turbomezclador emulsionante. Un procedimiento alternativo para preparar la emulsión consiste en emulsionar, por pasajes a través de un homogeneizador de alta presión, una mezcla del 1 al 10% p/v de escualeno, del 1 al 10 % p/v de Pluronic(R) L121, del 0,05 al 1 % p/v de un éster de ácido oleico y de un anhidrosorbitol etoxilado con 20 EO, del 50 al 95 % v/v de la fase acuosa que comprende el inmunógeno. También es posible formular con polímeros sintéticos (por ejemplo, homopolímeros y copolímeros de ácido láctico y glicólico, que se han utilizado para producir microesferas que encapsulan inmunógenos, por ejemplo, microesferas biodegradables). Un ejemplo adicional de un adyuvante es un compuesto seleccionado entre los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo. Los compuestos adyuvantes ventajosos son los polímeros de ácido acrílico o metacrílico que son reticulados, en especial con éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen por el término carbómero, por ejemplo, polímeros acrílicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene, como mínimo, 3 grupos hidroxilos, de forma preferente no más de 8, donde los átomos de hidrógeno , como mínimo, de tres hidroxilos se reemplazan con radicales alifáticos insaturados que tienen, como mínimo, 2 átomos de carbono. Los radicales preferentes son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener ellos mismos otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos que se venden bajo el nombre Carbopol(R) (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son particularmente apropiados. Se reticulan con una sacarosa de alilo o con pentaeritritol de alilo. Entre ellos, se pueden mencionar Carbopol(R) 974P, 934P y 971P. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo, los copolímeros eMa (R) (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno, lineales o reticulados, por ejemplo, reticulado con éter de divinilo, son preferentes. La disolución de estos polímeros en agua da como resultado una solución ácida que se neutralizará, de forma preferente, a pH fisiológico, con el fin de producir la solución adyuvante a la que se incorporará la composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna. Los grupos carboxilo del polímero están entonces parcialmente en forma de COO-.
De forma preferente, se prepara una solución de adyuvante según la presente invención en agua destilada, de forma preferente, en presencia de cloruro de sodio, teniendo la solución obtenida un pH ácido. Esta solución madre se diluye añadiéndole la cantidad deseada (para obtener la concentración final deseada), o una parte sustancial de la misma, de agua cargada con NaCl, de forma preferente solución salina fisiológica (NaCl 9 g/l) de una vez en varias porciones con neutralización concomitante o posterior (pH 7,3 a 7,4), de forma preferente, con NaOH. Esta solución a pH fisiológico se utilizará tal cual para mezclarla con la vacuna, que puede almacenarse especialmente en forma liofilizada, líquida o congelada. A partir de esta divulgación y el conocimiento de la técnica, el experto en la materia puede seleccionar un adyuvante adecuado, si lo desea, y la cantidad del mismo a emplear en una composición inmunológica, inmunogénica o de vacuna según la presente invención, sin excesiva experimentación.
En consecuencia, la vacuna según la presente invención comprende, de forma preferente, un diluyente y/o vehículo aceptable farmacéuticamente, de forma preferente seleccionado del grupo que consiste en agua para inyección, solución salina fisiológica, medio de cultivo tisular, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, especialmente aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo.
La proteína de fibra 2 de FAdV-C puede producirse por cualquier sistema de expresión adecuado. De forma preferente, la producción se efectúa en un sistema de expresión eucariota. Los sistemas de expresión específicamente preferentes son un sistema de expresión de baculovirus, un sistema de expresión de E. coli o un sistema de expresión de Pichia pastoris. Sin embargo, prácticamente cualquier sistema de expresión o vector adecuado puede utilizarse en la producción de la vacuna proporcionada por la presente invención. A modo de ilustración, dichos sistemas de expresión o vector adecuados pueden seleccionarse, de acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso específico, a partir de plásmidos, bácmidos, cromosomas artificiales de levadura (YAC), cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas artificiales bacteriófagos en base a P1 (PAC), cósmidos o virus, que pueden tener además un origen de replicación heteróloga, por ejemplo, bacteriano o de levadura, de modo que pueda amplificarse en bacterias o levaduras, así como también un marcador utilizable para seleccionar las células transfectadas diferentes del gen o genes de interés. Estos sistemas de expresión o vectores pueden obtenerse por procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.
Las vacunas según la presente invención pueden producirse en cantidades industriales; la dosis de vacuna individual que se administra a los animales puede estar en los intervalos que se aplican también para otras vacunas. De forma preferente, la proteína de fibra-2 de FAdV-C o un fragmento inmunogénico de la misma está contenida en la vacuna en una cantidad de 0,1 |xg/ml a 10 mg/ml, de forma preferente, de 1 |xg/ml a 1 mg/ml, especialmente de 10 a 100 |xg/ml.
En una forma preferente, la vacuna según la presente invención consiste en
-proteína de fibra-2 de FAdV-C, de forma preferente en una cantidad de 0,1 |xg a 10 mg, de forma preferente de 1 |xg a 1 mg, especialmente de 10 a 100 |xg y
-un vehículo y/o diluyente y/o adyuvante aceptable farmacéuticamente.
La vacuna según la presente invención comprende, de forma preferente, un vehículo aceptable farmacéuticamente, en especial si se proporciona como producto de vacuna que se vende comercialmente. Los vehículos adecuados pueden ser tanto acuosos como no acuosos. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como el aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo.
La presente invención da a conocer un procedimiento eficaz para prevenir el SHH en las aves. En consecuencia, la presente invención se refiere, en otro aspecto, a un procedimiento para prevenir el SHH en las aves, de forma preferente, en aves de corral, especialmente en aves reproductoras, que comprende administrar a las aves de corral, especialmente a las aves reproductoras, una vacuna que contiene proteína fibra-2 de FAdV-C o un fragmento inmunogénico de la misma. La vacuna se administra a las aves en una cantidad eficaz en un punto adecuado en el tiempo. Las formas típicas de administración son por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, in ovo o intracloacal. De forma preferente, la vacunación en los pollos se efectúa en la semana 17 a 19, especialmente en la semana 18 de vida.
Una ventaja específica de la presente invención es que la vacunación de las aves reproductoras proporciona protección suficiente a la progenie, especialmente a los pollos de engorde, para garantizar la suficiente protección, por ejemplo, como mínimo, hasta 30, de forma preferente, como mínimo, 40, especialmente, como mínimo, 60 días, a la progenie de los animales vacunados. Por lo tanto, es ventajoso que la presente invención proporcione protección suficiente a los pollos de engorde mediante la vacunación de las aves reproductoras. En consecuencia, la protección de los pollos de engorde se efectúa mediante la inmunización de las aves de corral reproductoras, especialmente en los pollos.
También se da a conocer un kit que comprende una proteína de fibra-2 de FAdV-C o un fragmento inmunogénico de la misma inmovilizados sobre una superficie sólida. De forma preferente, el kit es un kit serológico para la detección de anticuerpos anti-fibra-2 en las muestras, especialmente muestras de sangre de animales. Este kit es especialmente adecuado para la presente invención para detectar la eficacia de la vacunación al determinar los anticuerpos anti-fibra-2 específicos en los animales vacunados. En el transcurso del establecimiento de la presente invención se encontró que la detección específica de los anticuerpos anti-fibra-2 en los animales vacunados es difícil o incluso imposible mediante los kits de prueba FAdV disponibles en el mercado, especialmente FAdV-ELISA, o mediante las pruebas comunes de neutralización de suero (SNT, serum neutralization tests). Se observó que sólo la detección con pruebas específicas de fibra-2 (por ejemplo, Fib-2 ELISA y similares) era posible. Esto se debía al tipo de especificidad y la capacidad no neutralizante de los anticuerpos que se obtiene mediante la vacunación según la presente invención. Sin embargo (y aún más notable), se proporciona protección suficiente con la vacuna según la presente invención.
Esto demuestra que existía también la necesidad de proporcionar una prueba específica y un sistema de pruebas para establecer si se proporciona la protección (al determinar la presencia de anticuerpos específicos contra la proteína de fibra-2 de FAdV-C). Esto podría proporcionarlo el kit según la presente invención que, a diferencia de las FAdV-ELISA y SNT disponibles en el mercado (que podrían producir resultados negativos falsos), confirman con éxito y de forma fiable la eficacia de la vacunación. El kit de la presente invención proporciona también un medio para detectar la infección con virus FAdV, porque la proteína de fibra 2 de FAdV-C es muy específica para los virus individuales. Además, el kit según la presente invención también es adecuado para determinar si la protección de los anticuerpos todavía está presente en la progenie de los animales vacunados o si se indica una inmunización activa de la progenie.
De forma preferente, el kit según la presente invención comprende, además, medios para detectar la unión de un anticuerpo a la proteína de fibra-2 de FAdV-C inmovilizada o el fragmento inmunogénico inmovilizado de la misma, de forma preferente un anticuerpo que es específico para los anticuerpos de las aves, especialmente un anticuerpo anti-IgG de pollo o un anticuerpo anti-IgG de pavo. Por supuesto, cualquier medio de detección adecuado (captura) para el evento de unión entre la proteína de fibra 2 y un anticuerpo de las aves vacunadas es adecuado para el presente kit; sin embargo, los anticuerpos (secundarios) o fragmentos de anticuerpos (secundarios) adecuados que son capaces de unirse a los anticuerpos anti-fibra-2 para ser detectados en una muestra (sangre) de las aves vacunadas son preferentes específicamente.
Es preferente específicamente proporcionar un kit de prueba en fase sólida con un agente marcado que detecta el evento de unión a la proteína de fibra-2 inmovilizada. En consecuencia, el agente de detección para el evento de unión, especialmente el anticuerpo anti-IgG de pollo o el anticuerpo anti-IgG de pavo, es un agente marcado, en especial un anticuerpo marcado. Por ejemplo, el agente (anticuerpo/fragmento de anticuerpo) se marca con un marcador colorígeno, fluorescente, luminiscente o radiactivo.
Por lo tanto, los marcadores adecuados son, por ejemplo, compuestos fluorescentes, compuestos isotópicos, compuestos quimioluminiscentes, marcadores de punto cuántico, biotina, enzimas, reactivos electrodensos y haptenos o proteínas para los que hay disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales. Los diversos medios de detección incluyen, pero sin limitación a los mismos, medios espectroscópicos, fotoquímicos, radioquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos.
El marcador puede ser una sustancia química, péptido o molécula de ácido nucleico, aunque no se limita a ello. Otros marcadores detectables incluyen isótopos radioactivos tales como 32P, marcadores luminiscentes, tales como los fluorocromos, marcadores de densidad de electrones u ópticos, etc., o etiquetas de epítopo, tales como el epítopo FLAG o el epítopo HA, biotina, avidina, y etiquetas de enzimas, tales como peroxidasa de rábano picante, 6-galactosidasa, etc. El marcador puede estar unido a un péptido durante o después de su síntesis. Existen muchos marcadores y procedimientos de marcaje diferentes conocidos por los expertos normales en la técnica. Los ejemplos de los tipos de marcadores que se pueden utilizar en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, metales coloidales, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes. Los expertos en la técnica conocerán otros marcadores adecuados para los agentes (anticuerpos/fragmentos de anticuerpos) descritos en el presente documento o podrán determinarlos, usando experimentación de rutina. Además, el acoplamiento o la conjugación de estos marcadores a los péptidos de la presente invención se pueden realizar utilizando técnicas estándar comunes para los expertos en la técnica.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguiente ejemplos y figuras, no obstante, sin estar limitada a los mismos.
Figura 1. Tasas de supervivencia de las aves del grupo I (vacunadas con Fib-1), grupo II (vacunadas con Fib-2) y grupo III (vacunadas con Hex L1), junto con los grupos IV (control positivo) y V (control negativo), después de la infección con la cepa FAdV AG234 virulenta.
Figura 2. Lesiones patológicas que se manifiestan por necrosis focales en el hígado y el saco pericárdico lleno de líquido de color pajizo en un ave del grupo de control positivo IV que murió 3 días después de la inoculación (d.p.c.). Figura 3. Resultados de la investigación de anticuerpos según fueron detectados por (a) FAdV Grupo-1 El iSa comercial (resultados indicados como relación muestra a positivo (S/P) del valor OD medio de un máximo de diez sueros analizados de cada grupo, comenzando las mediciones el día 21 (antes de la inoculación), (b) prueba de neutralización de suero (SNT) (resultados indicados como títulos medios transformados de log2 de un máximo de diez sueros analizados de cada grupo, comenzando mediciones el día 21; los títulos < 3 se consideraron negativos) y (c) ELISA personalizada utilizando proteína de Fib-2 recombinante (resultados indicados como valores OD medios medidos a partir de los sueros de todas las aves vacunadas con Fib-2, así como también las aves de control positivo y negativo, comenzando el día 7).
Figura 4. Inmunotransferencias de proteínas KR5 recombinantes purificadas incubadas con sueros de pollos recogidos el día 21 de vida (preabsorbidos con polvo de célula de insecto, diluidos 1:2000). A, carriles 1,2 y 3 Fib-1 purificada incubada con sueros de aves vacunadas con Fib-1. B, carriles 1, 2 y 3 Fib-2 purificada incubada con sueros de aves vacunadas con Fib-2. C, carriles 1, 2 y 3 Hex L1 purificado incubado con sueros de aves vacunadas con Hex L1. D, carril 1 Hex L1 purificado, carril 2 Fib-1 purificada, carril 3 Fib-2 purificada, incubados con suero de un ave del grupo de control positivo (vacunada con material celular de insecto purificado no infectado). E, carril 1 Hex L1 purificado, carril 2 Fib-1 purificada, carril 3 Fib-2 purificada, incubados con suero de un ave del grupo de control negativo (no vacunada). Las proteínas se detectaron mediante anticuerpos séricos en la medida que las bandas migraron a tamaños de peso molecular estimado de 51 kDa (Fib-1), 56 kDa (Fib-2) y 36 kDa (Hex L1). Figura 5. Alineación de las proteínas de fibra según la presente invención (Fib-2 de FAdV-C).
Ejemplos
En los ejemplos de la presente invención, fibra-1, fibra-2 y la región de bucle-1 del hexón de una cepa de referencia FAdV-C (KR5) se expresaron de forma recombinante en el sistema de baculovirus. En un ensayo de vacunación, la eficacia de estos componentes de cápside para inducir inmunidad protectora en los pollos se evaluó inoculando las aves con FadV virulento. Por lo tanto, este es el primer estudio de su tipo que emplea ambas proteínas de fibra de forma individual en un experimento in vivo con el objetivo de esclarecer aún más la importancia funcional de las proteínas de cápside FAdV investigadas en el proceso de infección y dirigir su uso potencial como vacunas de subunidades candidatas para el control del SHH.
1. Materiales y procedimientos
1.1. Propagación del virus y extracción de ADN
La cepa de referencia KR5 de FAdV-C (= FAdV-4) y el virus de inoculación AG234 se propagaron en las células primarias del hígado de embriones de pollo (CEL) de acuerdo con un protocolo descrito por Schat y Sellers, Manual de laboratorio para el aislamiento e identificación de patógenos aviares,(2008), 195-203). El título viral se determinó según el procedimiento de Reed y Muench (Am. J. Hyg. 27 (1938), 493-497) por titulación de punto final. La extracción de ADN a partir del sobrenadante de cultivo celular se llevó a cabo con el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania).
1.2. Clonación y expresión de proteína inicial
Los cebadores se diseñaron sobre la base de la secuencia de KR5 genómica completa (número de acceso GenBank HE608152) y contenían sitios de restricción 5’ terminales para la clonación en el vector de transferencia pFastBac (Invitrogen, Viena, Austria) (tabla 1). Las regiones completas de codificación para fibra-1 y fibra-2 (nucleótidos 30438 a 31739 y 31723 a 33162, respectivamente) y la región de bucle-1 del hexón (nucleótidos 20481 a 21366) se amplificaron a partir de la cepa de referencia KR5 de FAdV-C utilizando una ADN polimerasa de corrección de pruebas (Invitrogen, Viena, Austria). Después de la clonación intermedia en el vector pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) y la digestión con BamHI/StuI (Fib-1), StuI/XbaI (Fib-2) y NcoI/XhoI (Hex L1), los fragmentos se ligaron al vector pFastBac escindido en los respectivos sitios de restricción. Después de determinar la correcta inserción de cada producto en pFastBac por secuenciación, el constructo se transformó en células DH10Bac de E. coli competentes (Invitrogen, Viena, Austria). El ADN de baculovirus recombinante fue aislado de las colonias transformadas utilizando el kit S.N.A.P. Miniprep (Invitrogen, Viena, Austria). Los genes de interés se expresaron en células Sf9 de Spodoptera frugiperda (Invitrogen, Viena, Austria) como proteínas de fusión His-tag de acuerdo con el protocolo del fabricante.
1.3. Identificación de proteínas recombinantes
Para verificar la expresión de las proteínas recombinantes y optimizar las condiciones de expresión, se llevó a cabo SDS-PAGE en las fracciones solubles y unidas a la membrana del lisado celular, recolectadas de cultivos monocapa de Sf9 infectados en diferentes intervalos de tiempo (24, 48, 72, 96 horas) después de la infección. Las proteínas recombinantes se identificaron mediante inmunotransferencia utilizando anticuerpo anti polihistidina (Sigma-Aldrich, Viena, Austria). Las células Sf9 no infectadas se procesaron de la misma manera para servir como control negativo.
1.4. Expresión y purificación de proteínas recombinantes
Para la expresión, los cultivos en suspensión de Sf9 (50 ml) se infectaron con baculovirus recombinante amplificado en una MOI de 3. Los cultivos recolectados después de 72 horas de la inoculación en una incubadora de agitación se concentraron por centrifugación durante 5 minutos a 3500 rpm. El sedimento celular resultante se rompió mediante resuspensión en solución tampón de lisis (que contenía de fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 20 a 40 mM, 0,2 mg/ml de lisozima, 20 mg/ml de ADNasa, MgCl21 mM, PMSF 1 mM e inhibidores de proteinasas) y sonicación, con la posterior incubación en hielo durante 1 hora. Los sobrenadantes clarificados obtenidos por centrifugación de los lisados celulares crudos a 14000 rpm durante 20 minutos a 4 °C se utilizaron para la purificación en columnas de cromatografía de afinidad (His GraviTrap, GE Healthcare, Freiburg, Alemania). La proteína L1 del hexón presentada como material insoluble en la fracción de sedimento se solubilizó con solución tampón de fosfato que contenía urea 8 M. La muestra filtrada de 0,45 pm se cargó en columnas equilibradas con solución tampón de fosfato que contenía urea 8 M y la proteína se eluyó después de lavar por etapas las columnas con concentraciones decrecientes de urea. Las muestras de cada fracción de purificación se analizaron posteriormente para detectar la presencia de las proteínas de interés mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia. Antes de la administración in vivo, las proteínas recombinantes fueron trasladadas a PBS estéril (Gibco/Invitrogen, Viena, Austria) mediante intercambio de solución tampón en casetes de diálisis Slide-A-Lyzer 7K (Thermo Scientific, Viena, Austria). La proteína L1 Hex se procesó adicionalmente a través de columnas de centrifugado de exclusión de tamaño Ultra-15 Amicon (Millipore, Viena, Austria) para eliminar las proteínas de células de insectos eluidas y concentrar la proteína diana. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante ensayo de Bradford (Thermo Scientific, Viena, Austria).
1.5. Experimento animal
Un total de 112 pollos SPF (libres de patógenos específicos) (Valo, Lohmann Tierzucht GmbH, Cuxhaven, Alemania) se dividió en cinco grupos que fueron alojados por separado en unidades aislantes (Montair Andersen bv, HM 1500, Sevenum, Países Bajos). En primer día de vida, se administró una inyección de 500 pl por vía intramuscular a cada animal, que contenía 50 pg de la proteína recombinante, el grupo I (n = 26) recibió fibra-1 (Fib-1), el grupo II (n = 28) recibió fibra-2 (Fib-2) y el grupo III (n = 26) recibió bucle-1 de hexón (Hex L1), se mezcló 1:1 con adyuvante GERBU LQ #3000 (GERBU Biotechnik GmbH, Heidelberg, Alemania; una suspensión acuosa estéril de partículas lipídicas con excipientes y emulsionantes).
De igual modo, las aves del grupo IV (n = 23) fueron inyectadas con material purificado y dializado de células no infectadas de insectos para servir como control positivo. Las aves del grupo V (n = 9) fueron tratadas como control negativo y recibieron una inyección de 500 pl e PBS estéril.
El día 21 de vida, los animales de los grupos I a IV fueron inoculados por vía intramuscular con 200 pl de dosis infecciosa de cultivo de 107 células al 50% (TCID5ü)/ml del virus AG234 FAdV-C virulento. A las aves del grupo de control negativo se les administró la misma cantidad de PBS estéril por vía intramuscular.
Una vez inoculadas, las aves se monitorearon diariamente para detectar signos clínicos. Se realizó necropsia en todos los animales que murieron o tuvieron que ser sacrificados en el curso del estudio. Las muestras tomadas a intervalos regulares incluyeron sangre (recolectada los días 7, 11, 14, 21, 28, 35 y 42) para la detección de anticuerpos e hisopos cloacales (recolectados los días 21, 28 y 35) o tejido del intestino grueso (tomado en día 42) para la detección de la excreción de virus a intervalos regulares.
Todas las aves restantes fueron sacrificadas al concluir el experimento el día 42 de vida.
El ensayo y todos los procedimientos incluidos en las aves experimentales fueron analizados y aprobados por el comité de ética institucional y autorizados por el gobierno austriaco (número de licencia BMWF-68.205/0196-I I/3b/2012).
1.6. Respuesta de los anticuerpos
Prueba de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) de FAdV disponible en el mercado
El kit de prueba de anticuerpos de FAdV de grupo 1 disponible en el mercado se obtuvo de BioChek (Reeuwijk, Holanda) para medir los niveles de anticuerpos en sueros de cada grupo antes (día 21) y después de la inoculación (días 28, 35 y 42).
Prueba de neutralización de suero (SNT)
Los sueros de prueba fueron inactivados a 56 °C durante 30 minutos. Se prepararon células CEL a partir de embriones de pollo de 14 días de edad y se cultivaron en placas de 96 pocillos (Sarstedt, Wiener Neudorf, Austria) con una densidad de 1 x 106 células/ml. El ensayo se realizó según un procedimiento de suero diluido de virus constante utilizando 100 TCID50/100 pl KR5. Las placas fueron inoculadas a 37 °C en CO2 al 5 % y se investigó su CPE después de 5 días.
ELISA de Fib-2
Después de predeterminar las diluciones óptimas de virus y suero mediante titulaciones en tablero de ajedrez, se recubrieron placas ELISA de 96 pocillos (Nunc Medisorb, Roskilde, Dinamarca) con 100 pl de proteína de Fib-2 recombinante purificada por afinidad por pocillo, se diluyeron en solución tampón de recubrimiento (Na2CO30,015 M, NaHCO30,035 M, pH 8,4) a una concentración final de 0,05 pg/ml. Después de 24 horas, las placas fueron lavadas y se añadió 100 pl de los sueros de prueba, diluidos 1:100 en solución tampón de bloqueo (Bloque de Inicio T20 PBS, Thermo Scientific), a cada pocillo durante 1 hora. Después de una etapa de lavado, se añadieron 100 pl de anti-IgG-HRP de pollo de cabra (Southern Biotechnology, Birmingham, EE.UU.), diluido 1:5000 en PBS- tween 20 al 0,05 % v/v (Calbiochem, Darmstadt, Alemania), a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora. Después de otra etapa de lavado, se añadieron 100 pl de sustrato de TMB (tetrametilbencidina) (Calbiochem, Darmstadt, Alemania) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 15 minutos en la oscuridad. La reacción se detuvo con 100 pl de ácido sulfúrico 0,5 M/pocillo y la densidad óptica (OD) de cada pocillo se midió con un lector de ELISA (Sunrise-Basic, Tecan, Grodig, Austria) a una longitud de onda de 450 nm.
Se incluyó en cada placa un control positivo y un control negativo. Todos los sueros se sometieron a prueba por duplicado y la OD se indica como el valor medio de los duplicados. Un valor de corte provisional se estableció como la media aritmética de todos los valores de OD más tres veces la desviación estándar determinada a partir de muestras de suero del grupo de control negativo.
1.7. Análisis de transferencia western
Las proteínas recombinantes purificadas Fib-1, Fib-2 y Hex L1 se hirvieron durante 5 minutos en solución tampón de muestra que contenía el 4 % de SDS y el 10 % de mercaptoetanol y se separaron mediante SDS-PAGE al 12 % y se electrotransfirieron sobre membrana de transferencia BioTrace PVDF (Pall, Viena, Austria). Después de 3 horas de bloqueo con el 3 % (p/v) de leche desnatada, la membrana se cortó en tiras que se incubaron por separado en los sueros de prueba (preabsorbidos con el 1 % de polvo de células Sf9, diluidas 1:2000) durante 1 hora. Después de varios lavados con PBS- tween 20 al 0,05 %, las tiras de membrana se incubaron durante 1 hora con conjugado de anti-IgG-HRP de pollo de conejo (Sigma-Aldrich, Viena, Austria) diluido 1:2500, seguido de varios lavados e incubación con sustrato Clarity Western ECL (Bio-Rad Laboratories GmbH, Viena, Austria). La visualización se realizó en una película de rayos x (Super RX, Fuji, Japón) después de la exposición durante 12 segundos.
1.8. PCR en tiempo real (rt) a partir de hisopos cloacales e intestino
La excreción de virus de inoculación fue investigado a partir de hisopos cloacales tomados los días 7 y 14 después de la inoculación (p.c.) y muestras de tejidos tomadas del intestino grueso al concluir el estudio (día 21 p.c.) de cinco aves de cada grupo, utilizando un ensayo PCR rt basado en el gen 52K, después de la extracción de ADN con un sistema comercial (Qiagen, Hilden, Alemania) (Günes et al., J. Virol. Meth. 183 (2012), 147-153).
2. Resultados
2.1. Expresión de proteínas
Los cultivos de células Sf9 mostraron cambios morfológicos característicos en 48 - 96 horas después de la inoculación con baculovirus recombinante. Las proteínas recombinantes fueron detectadas mediante SDS-PAGE y transferencia western a medida que las bandas migraron a tamaños de peso molecular estimado de 51 kDa (Fib-1), 56 kDa (Fib-2) y 35 kDa (Hex L1) con la expresión máxima alrededor de 72 horas después de la inoculación. Además, el análisis de expresión mostró que grandes fracciones de Fib-1 y FIB-2 se expresaron como proteínas solubles en el sobrenadante, mientras que la proteína Hex L1 se encontró, de forma preferente, en el sedimento. 2.2. Protección de proteínas recombinantes contra FadV virulento
Después de la inoculación, se observaron claras diferencias en la gravedad de los signos clínicos y las tasas de mortalidad entre los grupos individuales (figura 1). Se encontró que la diferencia en la mortalidad entre los grupos era altamente significativa mediante análisis de chi-cuadrado (%2=46; p<0,01) y se indicaron, además, diferencias significativas en la comparación de la mortalidad entre pares entre el grupo vacunado con Fib-2 y todos los otros grupos inoculados (prueba de chi-cuadrado corregida por Bonferroni).
El comienzo de la mortalidad se registró el día 3 p.c., en coincidencia con el máximo general de mortalidad. Se observaron aves muertas hasta el día 5 p.c., y después de ello no murieron más animales. Después de la infección con el virus virulento, las aves del grupo IV (control positivo) mostraron una depresión clínica grave que se hizo evidente cuando se apiñaron con las plumas erizadas, y 18 de los 23 animales (78 %) murieron. En contraste, las aves en el grupo II (vacunadas con Fib-2) no presentaron síntomas clínicos aparentes y sólo se registró un animal muerto de los 28 el día 3 p.c. después de la inoculación. Las aves del grupo I (vacunadas con Fib-1) mostraron parcialmente síntomas clínicos y 10 de los 26 animales murieron, lo que resultó en una mortalidad general del 38 %.
En el grupo III (vacunadas con Hex L1), la gravedad de la afección clínica fue comparable con la del grupo de control positivo y 19 de los 26 animales (73 %) murieron. La necropsia reveló lesiones graves en el corazón y el hígado de todos los animales encontrados muertos o aquellos que tuvieron que ser sacrificados durante el experimento. Los hallazgos característicos incluyeron líquido de color pajizo en el saco pericárdico y necrosis focal en los hígados (figura 2).
Los animales supervivientes de los grupos afectados clínicamente experimentaron una recuperación total a los 26 días de vida. No se registraron más lesiones en ninguno de los animales supervivientes al concluir el experimento el día 42 de vida. En el grupo V (control negativo), no se observaron signos clínicos en ningún momento del experimento y no hubo lesiones patológicas al concluir el estudio.
2.3. Detección de anticuerpos
ELISA disponible en el mercado y SNT de FAdV
No se detectaron anticuerpos con ELISA disponible en el mercado y SNT antes de la inoculación el día 21 en ninguno de los grupos (figura 3a y 3b). Después de la inoculación, las aves de los grupos I-IV desarrollaron un aumento en los niveles de anticuerpos detectables mediante ELISA disponible en el mercado y SNT. En los grupos vacunados, los anticuerpos medidos por ELISA disponible en el mercado aumentaron hasta 7 d.p.c. y después de ello disminuyeron gradualmente, mientras que los niveles de anticuerpos en el grupo de control positivo mostraron un aumento continuo hasta concluir el experimento. El desarrollo de anticuerpos neutralizantes p.c. aumentó de forma continuada en los grupos I - IV obteniéndose los títulos más altos en las aves no vacunadas.
No se detectaron anticuerpos en los animales de control negativo en ninguno de los puntos temporales sometidos a prueba durante el experimento.
ELISA de Fib-2
Para investigar una respuesta específica a los anticuerpos contra Fib-2 antes y después de la inoculación, se desarrolló un ELISA personalizado utilizando proteína purificada recombinante. A comenzar las mediciones en las aves vacunadas con Fib-2 el día 7, el ELISA detectó primero un aumento del valor OD medio por encima del valor límite determinado el día 11 y alcanzó un máximo el 7 d.p.c. (figura 3b). Hasta concluir el experimento, los niveles de anticuerpos Fib-2 medios disminuyeron sólo ligeramente. Debe destacarse que la respuesta a los anticuerpos de las aves que no sobrevivieron la inoculación fue sólo 0,21 y discrepó significativamente de todas las demás aves.
Las aves del grupo de control positivo dieron negativo para los anticuerpos Fib-2 el día 21. Sin embargo, los sobrevivientes desarrollaron una fuerte respuesta anti-Fib-2 p.c., alcanzando el nivel de las aves vacunadas al final del experimento.
Los sueros obtenidos del grupo de control negativo antes y después de la inoculación dieron negativo en el ELISA de Fib-2 (figura 3c), al igual que los sueros de los grupos vacunados con Fib-1 y Hex L1.
2.4. Transferencia western
Las inmunotransferencias con sueros de tres aves de cada grupo I-III obtenidas el día 21 después de la administración de proteínas recombinantes confirmaron la presencia de anticuerpos contra Fib-1, Fib-2 y Hex L1, respectivamente (figura 4). No se detectaron anticuerpos en los sueros de un ave del grupo de control positivo y negativo cuando se sometió a prueba contra cada una de las proteínas recombinantes purificadas en la inmunotransferencia.
2.5. Excreción de virus
No se detectó excreción de virus en ninguna de las muestras tomadas de animales de control negativo (tabla 2). Después de la inoculación, se observó excreción viral en todas las aves analizadas de los grupos I-IV, en 7 d.p.c con ninguna diferencia evidente en la carga viral entre las aves vacunadas con proteínas y aquellas de control positivo. La eliminación del virus (“shedding”) se verificó hasta concluir el experimento y la mayoría de las aves registraron positivo para la excreción de virus en las heces. El intestino grueso de la mitad de las aves infectadas fue positivo al concluir el estudio, con aves positivas en cada uno de los grupos I-IV.
3. Análisis
Si bien los adenovirus humanos se han estudiado bien en términos moleculares para su utilización como vectores de vacunas y terapias génicas, el entendimiento actual de la interacción de FAdV-huésped y las moléculas involucradas sigue siendo limitado. La interacción entre el capsómero y la célula huésped se ha establecido como el factor crítico en la formación de la inmunidad del huésped, haciendo que las proteínas de cápside del adenovirus sean candidatos interesantes para el desarrollo de vacunas de subunidades. En lo que respecta a la prevención del SHH, la base de pentón expresada en E. coli se propuso recientemente como un potencial antígeno de subunidades. En el presente estudio, la eficacia de la inmunización de subunidades de fibra derivada de FAdV-C se investigó utilizando por primera vez el hallazgo novedoso de dos genes distintos que codifican fibra en FAdV-C. Además, se investigó el bucle-1 de hexón, una estructura expuesta en superficie con potencial inmunogénico.
La elección del sistema de expresión de baculovirus se basó en pruebas de posibles modificaciones postraduccionales de tales proteínas de adenovirus.
Tras la inoculación con la cepa AG234 virulenta, se observaron diferentes grados de protección en pollos vacunados con proteínas de cápside de FAdV recombinantes. Si bien se detectaron anticuerpos específicos de Hex L1 antes de la inoculación, no se pudo comprobar que esta proteína fuese un antígeno de subunidades eficaz en nuestro estudio. En comparación, una respuesta inmune dirigida contra Fib-2 es muy eficaz, ya que evita los signos clínicos de enfermedad. Esto podría indicar un papel clave de la proteína Fib-2 en las etapas iniciales de la infección, posiblemente al mediar la adhesión a los receptores celulares del huésped. La adhesión celular a través de la unión de fibra al receptor de virus de Coxsackie y adenovirus (CAR) ubicuamente presente es un mecanismo bien conocido en los adenovirus humanos. Sin embargo, el conocimiento sobre la interacción CAR-fibra deriva principalmente de los estudios in vitro y el papel de CAR como receptor primario para la entrada de adenovirus en la célula huésped es cada vez más cuestionado. En este contexto, se sugirió que la unión a los receptores primarios específicos para células aviares, pero no de mamíferos, era mediada por la fibra corta de CELO. Los datos filogenéticos anteriores muestran un mayor grado de parentesco de la Fib-2 de FAdV-C con el gen de fibra corta de CELO y el gen de fibra única que se encuentra en otras especies FAdV, en comparación con Fib-1. En base a esta información, junto con el hallazgo real de respuesta inmune altamente eficaz dirigido contra Fib-2 de FAdV-C, Fib-2 podría servir como ligando principal para la inducción de una vía de infección dependiente de la célula huésped. Se detectaron anticuerpos generados contra Fib-2 después de la vacunación, con la excepción de un ave, lo que indica una correlación con la protección, en contraste con el ELISA disponible en el mercado que no pudo detectar anticuerpos antes de la inoculación. Obviamente, la especificidad de tipo del antígeno de fibra da como resultado una incompatibilidad de unión de los anticuerpos inducidos en el sistema de prueba ELISA disponible en el mercado. Los resultados obtenidos con SNT indican que los anticuerpos dirigidos contra Fib-2 no poseen capacidad neutralizante, lo que está de acuerdo con las observaciones previamente reportadas de actividad de neutralización de suero débil o carente obtenida por la fibra si se administra como componente de virus aislado.
El virus de inoculación se detectó en hisopos cloacales de los grupos I-IV por igual, lo que demuestra que la vacunación no impide la excreción y presencia del virus, incluso en aves protegidas de la enfermedad clínica. Este hallazgo se apoya en un estudio previo que informa la excreción de virus de inoculación incluso en aves totalmente protegidas a nivel clínico con una vacuna FAdV atenuada viva (Schonewille et al., Aviar Dis. 54 (2010), 905-910). En resumen, la identificación de cepas virulentas de FAdV-C como agentes causantes del SHH, junto con las limitaciones que enfrentan las vacunas inactivadas actualmente empleadas, abogan por el desarrollo de estrategias de inmunización de última generación. Los hallazgos presentados en la presente invención muestran una alta eficacia de la proteína Fib-2 recombinante para el desarrollo de una vacuna de subunidades eficaz y segura.
Tablas
Tabla 1: Cebadores utilizados.
Nombre Secuencia (5’-3’) Posición Propósito
del
cebador
KR5-b 5'-GGATCCATGTCGGCCCTAATCG-3' 30438 - 30453 a Amplificación del gen de fibra-1 Fib-1 f de la cepa KR5 y clonación en el vector pFastBac
KR5-b 5'-AGGCCTTTAGGGGCTCGGAGC-3' 31725 - 31739 a Amplificación del gen de fibra-1 Fib-1 r de la cepa KR5 y clonación en el vector pFastBac
KR5-b 5'-AGGCCTATGCTCCGAGCCCCTA-3' 31723 - 31738 a Amplificación del gen de fibra-2 Fib-2 f de la cepa KR5 y clonación en el vector pFastBac
KR5-b 5'-TCTAGATTACGGGACGGAGGCTG-3' 33146 - 33162 a Amplificación del gen de fibra-2 Fib-2 r de la cepa KR5 y clonación en el vector pFastBac
FAV f 5'- 20481 - 20502 a Amplificación de la región del AATTCCATGGACAAGTTCAGGCAGACGGT gen de bucle-1 del hexón de la CGT-3' cepa KR5 y clonación en el vector pFastBac
FAV r 5'- 21347 - 21366 a Amplificación de la región del TAACTCGAGCTAGTGATGCCGGGACATCAT gen de bucle-1 del hexón de la Nombre Secuencia (5’-3’) Posición Propósito
del
cebador
-3' cepa KR5 y clonación en el vector pFastBac
52K-fw 5'-ATGGCKCAGATGGCYAAGG-3' 13075 - 13093 b Amplificación del gen 52k en rt-PCR
52K-rv 5'-AGCGCCTGGGTCAAACCGA-3' 13250 - 13232 b Amplificación del gen 52k en rt-PCR
a Se indica la posición para la secuencia de KR5 genómica completa (HE608152).
b Se indica la posición para la secuencia de CELO genómica completa (U46933).
Tabla 2: Detección de excreción viral en muestras de hisopos cloacales (tomadas los días 21,28 y 35) y tejido del intestino grueso (tomado el día 42) mediante PCR en tiempo real de cinco aves de cada grupo. Los resultados se muestran como número de muestras positivas/número de muestras analizadas.
Figure imgf000018_0001
Tabla 3: Lista de ejemplos de proteínas de fibra utilizables según la presente invención:
Gen de fibra 1 Punjab de aislado de adenovirus aviar 4, cds completa
ADN lineal 1.386 pb
DQ864436.1 GI:112735223
Gen de fibra 2 Punjab de aislado de adenovirus aviar 4, cds completa
ADN lineal 1.386 pb
DQ864434.1 GI:112735219
Gen de fibra corta de adenovirus aviar 4, cds completa
ADN lineal 1.482 pb
AY340863.1 GI:33359662
Gen de proteína de fibra corta de adenovirus aviar 10, cds completa
ADN lineal 1.496 pb
AF007579.1 GI:2674070
Gen de fibra corta Kr-Yeoju de aislado de adenovirus aviar 4, cds completa
ADN lineal 1.425 pb
HQ709232.1 GI:318040046
Gen de fibra corta Kr-Gunwi de aislado de adenovirus aviar 4, cds completa
ADN lineal 1.425 pb
HQ709231.1 GI:318040044
Gen de fibra corta Kr-Andong de aislado de adenovirus 4, cds completa
ADN lineal 1.425 pb
HQ709230.1 GI:318040042
Gen de fibra corta Kr-Changnyeong de aislado de adenovirus aviar 4, cds completa
ADN lineal 1.425 pb
HQ709229.1 GI:318040040
Gen sf parcial de adenovirus aviar para proteína de fibra corta, aislado OTE
ADN lineal 1.197 pb
FN557186.1 GI:315455213
Gen sf parcial de adenovirus aviar para proteína de fibra corta, aislado 08-5769
ADN lineal 1.197 pb
FN557185.1 GI:315455211
Gen sf parcial de adenovirus aviar para proteína de fibra corta, aislado 08-3622
ADN lineal 1.197 pb
FN557184.1 GI:315455209
Gen de proteína de fibra Bareilly de aislado de adenovirus aviar 4, cds completa
ADN lineal 1.437 pb
FJ949088.1 GI:238683632
Gen pVIII de adenovirus aviar C, gen de U-exón, gen de fibra-1, gen de fibra-2 y ORF22, aislado C2B
ADN lineal 4.345 pb
HE608154.1 GI:381214073
Gen pVIII de adenovirus aviar C, gen de U-exón, gen de fibra-1, gen de fibra-2 y ORF22, aislado AG234
ADN lineal 4.321 pb
HE608153.1 GI:381214067
Genoma completo de adenovirus aviar C, aislado KR5
ADN lineal 45.810 pb
HE608152.1 GI:381214017
Gen de fibra-2 parcial de adenovirus aviar C, aislado K388-95
ADN lineal 1.395 pb
FR872927.1 GI:381214013
Gen de fibra-2 parcial de adenovirus aviar C, aislado 09/8846
ADN lineal 1.440 pb
FR872926.1 GI:381214011
Gen de fibra-2 parcial de adenovirus aviar C, aislado 09/584
ADN lineal 1.440 pb
FR872925.1 GI:381214009
Gen de fibra-2 parcial de adenovirus aviar C, aislado 09/2602
ADN lineal 1.329 pb
FR872924.1 GI:381213952
Gen de fibra-2 parcial de adenovirus aviar C, aislado K99-97
ADN lineal 1.340 pb
FR872923.1 GI:381213950
Gen de fibra-2 parcial de adenovirus aviar C, aislado Peru54
ADN lineal 1.421 pb
FR872922.1 GI:381213948
Gen de fibra-2 parcial de adenovirus aviar C, aislado Peru53
ADN lineal 1.416 pb
FR872921.1 GI:381213946
Gen de fibra-1 parcial de adenovirus aviar C, aislado K1013
ADN lineal 1.184 pb
FR872898.1 GI:381213900
Gen de fibra-1 parcial de adenovirus aviar C, aislado 922/1
ADN lineal 1.311 pb
FR872897.1 GI:381213898
Gen de fibra-1 parcial de adenovirus aviar C, aislado C2B
ADN lineal 1.302 pb
FR872896.1 GI:381213896
Gen de fibra-1 parcial de adenovirus aviar C, aislado DA60
ADN lineal 1.302 pb
FR872895.1 GI:381213894
Gen de fibra-1 parcial de adenovirus aviar C, aislado KR5
ADN lineal 1.302 pb
FR872894.1 GI:381213892
Gen de fibra-1 parcial de adenovirus aviar C, aislado INT4 (AG234 transferido de células QT) ADN lineal 1.188 pb
FR872893.1 GI:381213890
Gen de fibra-1 parcial de adenovirus aviar C, aislado AG234
ADN lineal 1.302 pb
FR872892.1 GI:381213888
Gen de fibra-1 parcial de adenovirus aviar C, aislado K31
ADN lineal 1.181 pb
FR872891.1 GI:381213886
Gen de fibra corta Kr-Yeoju de aislado de adenovirus aviar 4, cds completa
ADN lineal 1.425 pb
HQ709232.1 GI:318040046
Gen de fibra corta Kr-Gunwi de aislado de adenovirus aviar 4, cds completa
ADN lineal 1.425 pb
HQ709231.1 GI:318040044
Gen de fibra corta Kr-Andong de aislado de adenovirus aviar 4, cds completa
ADN lineal 1.425 pb
HQ709230.1 GI:318040042
Gen de fibra corta Kr-Changnyeong de aislado de adenovirus aviar 4, cds completa ADN lineal 1.425 pb
HQ709229.1 GI:318040040
Gen sf parcial de adenovirus aviar para proteína de fibra corta, aislado OTE
ADN lineal 1.197 pb
FN557186.1 GI:315455213
Gen sf parcial de adenovirus aviar para proteína de fibra corta, aislado 08-5769
ADN lineal 1.197 pb
FN557185.1 GI:315455211
Gen sf parcial de adenovirus aviar para proteína de fibra corta, aislado 08-3622
ADN lineal 1.197 pb
FN557184.1 GI:315455209
Gen de proteína de fibra Bareilly de aislado de adenovirus aviar 4, cds completa
ADN lineal 1.437 pb
FJ949088.1 GI:238683632
Gen de fibra corta de adenovirus aviar 4, cds completa
ADN lineal 1.482 pb
AY340863.1 GI:33359662
Gen de fibra 1 Punjab de aislado de adenovirus aviar 4, cds completa
ADN lineal 1.386 pb
DQ864436.1 GI:112735223
Gen de fibra 2 Punjab de aislado de adenovirus aviar 4, cds completa
ADN lineal 1.386 pb
DQ864434.1 GI:112735219
Gen de proteína de fibra corta de adenovirus aviar 10, cds completa
ADN lineal 1.496 pb
AF007579.1 GI:2674070
Se indica la naturaleza de la secuencia, las especies/serotipos de FAdV, la longitud de la secuencia, el número de acceso GenBank y la versión para cada una de las secuencias.
Tabla 4: Lista de especies en el género Aviadenovirus:
Adenovirus de halcón A
Adenovirus de halcón 1 [AY683541] (FaAdV-1)
Adenovirus aviar A
Adenovirus aviar 1 (CELO) [U46933 =_ AC_000014] (FAdV-1)
Adenovirus aviar B
Adenovirus aviar 5 (340) [AF508952] (FAdV-5)
Adenovirus aviar C
Adenovirus aviar 4 (ON1) [GU188428 = NC_015323] (FAdV-4)
Adenovirus aviar 10 (CFA20) [AF160185] (FAdV-10)
Adenovirus aviar D
Adenovirus aviar 2 (P7-A) [AF339915] (FAdV-2)
Adenovirus aviar 3 (75) [AF508949] (FAdV-3)
Adenovirus aviar 9 (A2-A) [AF083975 = AC_000013] (FAdV-9)
Adenovirus aviar 11 (380) [AF339925] (FAdV-11)
Adenovirus aviar E
Adenovirus aviar 6 (CR119) [AF508954] (FAdV-6)
Adenovirus aviar 7 (YR36) [Af508955] (FAdV-7)
Adenovirus aviar 8a (CFA40) [AF155911] (FAdV-8a)
Adenovirus aviar 8b (764) [AF508958] (FAdV-8b)
Adenovirus de ganso
Adenovirus de ganso 1 (GoAdv-1)
Los nombres de las especies están en cursiva; los nombres de tipos y aislados ( ) están en caracteres latinos. También se indican los números de acceso de secuencia [ ] y las abreviaturas asignadas ( ).

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Vacuna que comprende proteína de fibra 2 de Adenovirus aviar C (FAdV-C) para su utilización en la prevención del síndrome de hepatitis-hidropericardio (SHH) en aves, de forma preferente en aves de corral, especialmente en pollos de engorde;
en la que la vacuna es una vacuna de subunidades
2. Vacuna para la utilización, según la reivindicación 1, que comprende, además, un adyuvante seleccionado, de forma preferente, entre el grupo que consiste en adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, hidróxido de aluminio, Bordetella pertussis, saponina, dipéptido de muramilo, copolímero de etileno acetato de vinilo, aceite, un aceite vegetal o un aceite mineral, en particular, aceite de cacahuete o aceite de silicona, y combinaciones de los mismos.
3. Vacuna, según la reivindicación 1 o 2, en la que la proteína de fibra-2 de FAdV-C se selecciona entre las secuencias de proteína que se proporcionan en la figura 5.
4. Vacuna para la utilización, según la reivindicación 3, en la que la proteína de fibra-2 de FAdV-C es la secuencia de proteína FIBER-2_KR5 que se proporciona en la figura 5.
5. Vacuna para la utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende, además, un diluyente y/o vehículo aceptable farmacéuticamente, seleccionado, de forma preferente, entre el grupo que consiste en agua para inyección, solución salina fisiológica, medio de cultivo tisular, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, especialmente aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, especialmente oleato de etilo
6. Vacuna, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína de fibra-2 de FAdV-C se ha producido de forma recombinante, en un sistema de expresión de baculovirus.
7. Vacuna para la utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la proteína de fibra-2 de FAdV-C está contenida en una cantidad de 0,1 |xg/ml a 10 mg/ml, de forma preferente, de 1 |xg/ml a 1 mg/ml, especialmente, de 10 a 100 |xg/ml.
8. Vacuna para la utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que consiste en
-proteína de fibra-2 de FAdV-C, de forma preferente en una cantidad de 0,1 |xg a 10 mg, de forma preferente, de 1 |xg a 1 mg, especialmente, de 10 a 100 |xg; y
-un vehículo y/o diluyente y/o adyuvante aceptable farmacéuticamente.
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