ES2881810T3 - Seguimiento de la recurrencia y progresión del cáncer - Google Patents
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Abstract
Un método para evaluar el estado del cáncer en un sujeto que se sospecha o se conoce que tiene cáncer, o un sujeto que se conoce que está en remisión del cáncer, dicho método comprende: (a) poner en contacto una muestra de sangre total de prueba obtenida de dicho sujeto con un inductor capaz de estimular la producción de superóxido en neutrófilos bajo condiciones adecuadas para tal estimulación en dicha muestra; (b) determinar el aumento de la producción de superóxido por encima del nivel basal en dicha muestra de prueba después de un período de tiempo para obtener un primer resultado y (c) comparar dicho primer resultado con un segundo resultado de comparación que es un umbral predeterminado que se correlaciona con uno o más criterios que se equiparan con un estado del cáncer, de manera que se determina el estado del cáncer; dichos uno o más criterios se seleccionan entre ausencia de tumor, un intervalo de tamaño de tumor, metástasis o sin metástasis y dicho inductor capaz de estimular la producción de superóxido en neutrófilos es el forbol-miristato-acetato (PMA), la producción de superóxido se detecta mediante el uso de luminol como amplificador y se mide la quimioluminiscencia resultante, de manera que dichas condiciones de la etapa (a) son tales que la clasificación de la progresión del cáncer sobre la base del tamaño del tumor o la progresión a metástasis se asociará con un aumento de la quimioluminiscencia por encima del nivel basal.
Description
DESCRIPCIÓN
Seguimiento de la recurrencia y progresión del cáncer
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos in vitro para predecir la recurrencia del cáncer y el seguimiento de la progresión y el tratamiento del cáncer en los individuos. Más particularmente, se proporcionan métodos que se basan en la determinación de la funcionalidad de los leucocitos (principalmente neutrófilos) para mostrar la producción del anión superóxido inducida por exposición, es decir, producen un "estallido respiratorio" en respuesta a la activación in vitro. Si bien dicha activación de los leucocitos es conocida y a menudo se denomina capacidad de afrontamiento de leucocitos (LCC), la invención proporciona una nueva aplicación en el campo del diagnóstico del cáncer, más en particular para evaluar de forma sencilla y rápida el estado del cáncer mediante el uso de muestras de sangre total sin necesidad de fraccionamiento. Se ha demostrado, por ejemplo, que la invención permite una clasificación rápida y conveniente de los pacientes con cáncer de próstata sobre la base del tamaño del tumor y que permite distinguir a los pacientes con metástasis de los pacientes sin metástasis y con un volumen tumoral relativamente bajo.
Tal metodología se puede aplicar antes del tratamiento del cáncer o después de un período de tratamiento del cáncer para evaluar la eficacia de la terapia. Puede proporcionar una guía rápida y conveniente para moderar las intervenciones terapéuticas, por ejemplo, el intervalo de tiempo entre las sesiones de quimioterapia, el cambio de la dosis del fármaco o el cambio de la forma de tratamiento.
Antecedentes de la invención
Las técnicas actuales para dar seguimiento a la progresión del cáncer a menudo usan recuentos sanguíneos totales, como el recuento total de leucocitos (TLC) o el recuento absoluto de neutrófilos (ANC). Estos dan el número de leucocitos o neutrófilos, respectivamente, por volumen de sangre. Si bien proporcionan un número total de células específicas, no le dicen nada al médico sobre la funcionalidad de las células. Además, estas pruebas deben realizarse en un hospital, una clínica de atención médica u otro entorno de atención médica profesional y no son adecuadas para el automonitoreo.
Se conoce que la quimioterapia causa una reducción en la población de neutrófilos circulantes (una condición conocida como neutropenia) al destruir las células que se dividen rápidamente en la médula ósea que producen neutrófilos. De hecho, la neutropenia es la principal toxicidad limitante de la dosis de quimioterapia y el principal impulsor de los retrasos y reducciones de la dosis que dan como resultado una baja intensidad de dosis relativa (RDI) (Lyman y otros (2003) J. Clin. Oncol. 21, 4524-4531.) La neutropenia se asocia con el riesgo de infecciones potencialmente mortales, así como con reducciones de la dosis de quimioterapia y retrasos que pueden comprometer los resultados del tratamiento (Crawford y otros (2004) Cancer 100, 228-237). Además, los investigadores han identificado claramente la necesidad de métodos mejorados para clasificar a los pacientes con cáncer de mama en estadio temprano a fin de hacer que su terapia sea más eficiente y reducir los retrasos debidos a la neutropenia (Silber y otros (1998) Cancer, J. Clin. Oncol. 16, 2392-2400).
Sorprendentemente, se ha descubierto ahora que se puede usar una simple prueba de sangre total para obtener una medida cuantitativa rápida del estado del cáncer, ya sea para guiar el tratamiento o para proporcionar información sobre la recurrencia del cáncer basándose en la determinación de la producción de superóxido inducida por exposición por los leucocitos como se discutió anteriormente. Dicho protocolo de prueba tiene la ventaja adicional de que se puede aplicar sin cambios durante el tratamiento del cáncer para evaluar la función de los neutrófilos y advertir sobre la neutropenia indeseable.
Los inductores químicos como el forbol-miristato-acetato (PMA) son bien conocidos por activar los neutrófilos en muestras de sangre periférica, de manera que la capacidad retenida para la producción de superóxido se puede cuantificar como una medida de la funcionalidad de los neutrófilos (Hu y otros Cell Signal (1999) 11, 335-360). Dicho uso con muestras de sangre total con la medición de la producción de superóxido por quimioluminiscencia para obtener una puntuación de LCC constituye la base de una prueba comercializada por Oxford MediStress Limited para cuantificar el estrés psicológico en humanos y animales; ver la patente europea no. 1558929 y las patentes relacionadas que se derivan de la solicitud internacional WO2004/042395 publicada. Sin embargo, los datos presentados en este documento proporcionan por primera vez evidencia de una utilidad muy diferente del mismo tipo de análisis de sangre en el diagnóstico de cáncer. Es de especial interés que se ha demostrado que tal prueba puede aplicarse a muestras de sangre de pacientes con cáncer de próstata, de manera que la puntuación de LCC puede correlacionarse con la progresión de la enfermedad o la remisión continuada; vea el Ejemplo 2. Se considera que tal método de clasificación o estratificación es igualmente aplicable a otros tipos de cáncer, especialmente, por ejemplo, al cáncer de mama.
La exposición de los leucocitos a inductores químicos se ha empleado previamente en una variedad de estudios de investigación, pero muchos de ellos han empleado células aisladas y ninguno de estos estudios ha proporcionado
evidencia para, o sugerido, que las puntuaciones de LCC obtenidas con muestras de sangre total de pacientes con cáncer puedan usarse como un indicador del estado del cáncer como ahora se enseña. Por ejemplo, Kaffenberger y otros (1992) Clin. Immunol. Inmunopath. 64, 57-62 se refiere al uso de PMA con leucocitos polimorfonucleares humanos (PMN) aislados de muestras de sangre total mediante un procesamiento extenso y mediante el uso de DCFH-DA para la detección de fluorescencia. Esto es en el contexto del análisis del tiempo de sobrevivencia (pronóstico) en pacientes diagnosticados con carcinomas avanzados de cabeza y cuello. El análisis de sobrevivencia sugirió un mejor pronóstico en los no respondedores con cáncer avanzado.
Trulson y otros (1989) Am. J. Clin. Pathol. 91, 441-445 incluye algunos resultados para el uso de un inductor diferente, zymosan, con luminol añadido a muestras de sangre de pacientes con cáncer. Sin embargo, se sugirió que las muestras de pacientes sin metástasis proporcionan una quimioluminiscencia mejorada con luminol significativamente mayor en comparación con las muestras de pacientes en los que la metástasis era detectable. Shkapova y otros (2010) Bulletin Exper. Biol. Med. 149, 239-241 informa de estudios sobre la evaluación de la funcionalidad de los neutrófilos en suspensiones de leucocitos obtenidas de muestras de sangre de pacientes con cáncer de células renales diseminado conocido, mediante el uso nuevamente de zymosan como inductor de neutrófilos.
Schepetkin y otros (1991) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117, 172-174 informa estudios que analizan la capacidad del factor de necrosis tumoral a y del zymosan para inducir especies reactivas del oxígeno en neutrófilos aislados de muestras de sangre de pacientes con cáncer gástrico y donantes sanos.
Lejeune y otros (1998) Brit. J. Haematol. 102, 1284-1291 informa estudios de PMN aislados de niños con leucemia linfoblástica aguda para evaluar el efecto de la quimioterapia sobre la funcionalidad de los neutrófilos.
Como se discute a continuación, la presente invención proporciona un medio conveniente no solo para detectar el cáncer, sino también para evaluar rápidamente el estado del cáncer mediante el empleo de muestras de sangre total, PMA y luminol. El aumento de la quimioluminiscencia por encima del nivel basal se correlaciona con la clasificación de la progresión del cáncer sobre la base del tamaño del tumor o la progresión a metástasis.
Resumen de la invención
Como se indicó anteriormente, la invención se basa en evaluar la capacidad del componente leucocitario total de la sangre total para producir superóxido en respuesta a una exposición química adecuada con PMA in vitro. Esta respuesta cuantificada con muestras de sangre total se denomina comúnmente puntuación de la capacidad de afrontamiento de leucocitos (LCC). Sin embargo, dado que esto estará determinado en gran medida por la capacidad de los neutrófilos para que dicha estimulación externa produzca especies reactivas del oxígeno (ROS), alternativamente se puede hacer referencia al nivel de funcionalidad de los neutrófilos del individuo. Los individuos con un mayor nivel de funcionalidad de los neutrófilos tendrán una mayor producción potencial de superóxido y, fisiológicamente, tendrán una mayor función de los neutrófilos.
En su aspecto más amplio, la presente invención proporciona un método para evaluar el estado del cáncer en un sujeto que se sospecha o se conoce que tiene cáncer, o un sujeto que se conoce previamente que está en remisión del cáncer, dicho método comprende:
(a) poner en contacto una muestra de sangre total de prueba obtenida de dicho sujeto con un inductor capaz de estimular la producción de superóxido en neutrófilos bajo condiciones adecuadas para tal estimulación en dicha muestra;
(b) determinar el aumento de la producción de superóxido por encima del nivel basal en dicha muestra de prueba después de un período de tiempo para obtener un primer resultado y
(c) comparar dicho primer resultado con un segundo resultado de comparación que es un umbral predeterminado que se correlaciona con uno o más criterios que se equiparan con el estado del cáncer, de manera que se determina el estado del cáncer;
dichos uno o más criterios se seleccionan entre ausencia de tumor, un intervalo de tamaño de tumor, metástasis o sin metástasis y
dicho inductor capaz de estimular la producción de superóxido en neutrófilos es el forbol-miristato-acetato (PMA), la producción de superóxido se detecta mediante el uso de luminol como amplificador y se mide la quimioluminiscencia resultante,
de manera que dichas condiciones de la etapa (a) son tales que la clasificación de la progresión del cáncer sobre la base del tamaño del tumor o la progresión a metástasis se asociará con un aumento de la quimioluminiscencia por encima del nivel basal.
Comúnmente, cuando la producción del superóxido se determina después de un corto período de exposición al inductor mediante la medición de la quimioluminiscencia convencional, por ejemplo, mediante el empleo de luminol y un luminómetro portátil, la quimioluminiscencia basal será invariablemente tan baja en las muestras que no requerirá ser considerada. Por tanto, en estas circunstancias, las mediciones totales de las unidades de luz relativa (RLU) pueden equipararse con la producción de superóxido inducida y como directamente proporcionales a la funcionalidad de los neutrófilos. Se ha establecido que esto se aplica, por ejemplo, cuando se usa el reactivo PMA/luminol liofilizado suministrado por Oxford MediStress para la puntuación de LCC de muestras de sangre total y se incuba la muestra durante 10 minutos a 37,5 °C de acuerdo con el protocolo estándar para el uso de este reactivo. En otras palabras, "determinar el aumento de la producción de superóxido por encima del nivel basal" en la muestra de prueba puede equipararse con una simple cuantificación en una etapa del superóxido presente al final del período de estimulación de los neutrófilos, por ejemplo, 10-30 minutos después de la adición del inductor.
Sin pretender imponer ninguna teoría, la eficacia del método puede estar relacionada con los tipos de cáncer que actúan como una fracción inmunológicamente activa.
Se reconocerá que el segundo resultado de comparación puede corresponder a la producción de superóxido inducida en una muestra control de un sujeto diferente de la misma especie que se conoce que está sano, por ejemplo, un ser humano sano, idealmente en una situación relajada antes del suministro de la muestra. Puede ser una muestra tomada del mismo individuo después de un período de tratamiento contra el cáncer y que se conoce que está en remisión. Las muestras tomadas de individuos para el propósito de la presente invención se tomarán de manera que se minimicen los efectos diferenciales del estrés psicológico entre la muestra de prueba y cualquier muestra de comparación.
A los efectos de la presente invención, se pueden obtener puntuaciones de LCC para una pluralidad de muestras de pacientes que se espera que tengan varios grados de progresión de un tipo de cáncer en particular, incluida la posible remisión después del tratamiento, y la comparación de los resultados de la cuantificación de la producción de superóxido inducida, la puntuación de LCC, usadas para asignar a cada muestra un orden por correlación con uno o más criterios indicativos de la progresión de la enfermedad, por ejemplo, metástasis esperadas y sin metástasis. Un método de estratificación de este tipo que usa una pluralidad de muestras de pacientes con cáncer de próstata se ilustra en el Ejemplo 2. Dicha estratificación proporcionará umbrales predeterminados que pueden emplearse como un segundo resultado de comparación al aplicar un método de la invención a más muestras de pacientes que se sospecha o se conoce que tienen el mismo cáncer para determinar el estado del cáncer o para verificar la recurrencia de dicho cáncer después de un tratamiento eficaz.
Las muestras empleadas para un método de la invención son muestras de sangre total. Por tanto, como se indicó anteriormente, la producción de superóxido se equiparará estrictamente de manera más general con la capacidad de los leucocitos para producir el superóxido (o dicho alternativamente, la capacidad para producir un estallido respiratorio). Es importante señalar que dicha metodología evita la centrifugación, que se conoce que afecta la reactividad celular, y también el plaqueado de células en portaobjetos de vidrio, lo que también puede afectar la funcionalidad. Bastarán muestras de sangre tan pequeñas como aproximadamente 10-30 pl obtenidas mediante el uso de un dispositivo convencional de punción del dedo.
Como ya se señaló anteriormente, la producción de superóxido se mide convenientemente mediante la medición de quimioluminiscencia simple conocida mediante el uso de luminol. Los protocolos adecuados se describen, por ejemplo, en la patente europea no. 1558929 de Oxford MediStress. Generalmente, se elegirá una temperatura de incubación de 37- 37,5 °C y se continuará la incubación durante un tiempo predeterminado, preferentemente consistente con la medición de quimioluminiscencia máxima o casi máxima. Como se mencionó anteriormente, la composición liofilizada que comprende PMA y sal de luminol suministrada por Oxford MediStress para las pruebas de LCC permite obtener resultados de prueba adecuados de una punción en el dedo de sangre total en solo 10 minutos y se usó para las pruebas informadas en el Ejemplo 2 como reactivo preferido.
Aunque puede emplearse un luminómetro convencional para la detección de la quimioluminiscencia, tales detectores de luz requieren tubos fotomultiplicadores costosos y frágiles. Por tanto, puede preferirse el uso de un detector de fotones alternativo. En particular, se puede favorecer, por ejemplo, un fotomultiplicador de silicio (Si-PM). Dicho detector de fotones se considera más robusto para este propósito y para combinar una mayor rentabilidad con una sensibilidad suficiente para la detección de fotones. Un luminómetro de mano adecuado está disponible nuevamente en Oxford MediStress como parte del kit de prueba CopingCapacity™, que también proporciona una composición de reactivo que contiene PMA/luminol liofilizado como se indicó anteriormente.
Si es necesario o se desea, la producción de superóxido por encima del nivel basal medido para cada muestra puede corregirse por referencia al número de leucocitos o neutrófilos en la muestra. Como se indicó anteriormente, se puede esperar que los neutrófilos sean responsables de la mayor parte de la producción de superóxido por encima del nivel basal, la capacidad residual de los leucocitos por encima del nivel basal para la inducción inducida in vitro puede denominarse "nivel de funcionalidad de los neutrófilos" y así se denominará en lo sucesivo.
Breve descripción de la figura
La Figura 1 ilustra el uso de puntuaciones de LCC para estratificar a los pacientes con cáncer de próstata con referencia a la longitud máxima del núcleo del cáncer (MCCL) y la presencia o ausencia de metástasis.
Descripción detallada
Los métodos de la invención son de especial interés para seguir la progresión del cáncer en pacientes humanos con cáncer o para proporcionar un indicador de la recurrencia del cáncer después del tratamiento de dichos pacientes, pero se apreciará que también tienen aplicación al tratamiento del cáncer en el campo veterinario, especialmente en relación con otros mamíferos.
Como se indicó anteriormente, se emplea un método de la invención para evaluar el estado del cáncer en un sujeto que se sospecha o se conoce que tiene cáncer, o un sujeto que se conoce previamente que está en presencia de un cáncer. El método comprende:
(a) poner en contacto una muestra de sangre total de prueba, que comprende neutrófilos, obtenida del paciente con un inductor capaz de estimular la producción de superóxido en neutrófilos bajo condiciones adecuadas para tal estimulación en dicha muestra;
(b) determinar el aumento de la producción de superóxido por encima del nivel basal en dicha muestra de prueba después de un período de tiempo para obtener un primer resultado y
(c) comparar dicho primer resultado con un segundo resultado de comparación. Este segundo resultado de comparación es un umbral predeterminado que se correlaciona con uno o más criterios que se equiparan con un estado del cáncer, de manera que se determina el estado de cáncer. Los criterios se seleccionan entre ausencia de tumor, un intervalo de tamaño de tumor, metástasis o sin metástasis. El inductor usado es PMA con detección de la producción de superóxido mediante el uso de luminol y medición de la quimioluminiscencia resultante. Las condiciones de la etapa (a) anterior son tales que la clasificación de la progresión del cáncer sobre la base del tamaño del tumor o la progresión a metástasis se asociará con un aumento de la quimioluminiscencia por encima del nivel basal.
El estado del cáncer puede evaluarse como ausencia de tumor, por ejemplo, remisión continua. Puede equipararse con la presencia de un tumor que cumple con uno o más criterios que definen un grado de progresión del tumor, por ejemplo, progresión a metástasis. Un método de este tipo puede ser especialmente preferido para la evaluación rápida de si un tumor, como un tumor de cáncer de próstata o de mama, ha avanzado a metástasis o no.
Ahora también se describe un método para evaluar en un sujeto la presencia de un tumor u otro tipo de cáncer que comprende etapas que pueden aplicarse igualmente para evaluar el efecto del tratamiento del cáncer sobre el nivel de funcionalidad de los neutrófilos de un paciente con cáncer durante el tratamiento:
(i) poner en contacto una muestra de prueba, preferentemente una muestra de sangre total, que comprende neutrófilos obtenidos del paciente con un inductor capaz de estimular la producción de superóxido en neutrófilos en condiciones adecuadas para tal estimulación;
(ii) determinar el aumento de la producción de superóxido por encima del nivel basal en dicha muestra de prueba después de un período de tiempo para obtener un primer resultado y
(iii) comparar dicho primer resultado con un segundo resultado de control,
de manera que la reducción del aumento inducido en la producción de superóxido en dicha muestra de prueba en comparación con el resultado de control es indicativa del efecto depresivo del tratamiento sobre el nivel de funcionalidad de los neutrófilos.
Se apreciará que el resultado de control puede derivarse de una muestra tomada del mismo paciente en un momento temprano antes o durante dicho tratamiento.
Las etapas (i) a (iii) pueden repetirse de esta manera para proporcionar un medio muy conveniente para el seguimiento a largo plazo ("longitudinal") del efecto del tratamiento del cáncer sobre el estado fisiológico del paciente. Dicha metodología se concibe como un medio conveniente, por ejemplo, para ayudar a los médicos a tomar decisiones en la aplicación de la quimioterapia y/o radioterapia para el tratamiento del cáncer, por ejemplo, el intervalo de tiempo entre las sesiones de quimioterapia y/o radioterapia que se basará en la función celular clínicamente relevante en lugar de un simple conteo de las células o análisis de la estructura.
Por tanto, es importante señalar que la descripción permite que se proporcione una combinación única de componentes de kit tanto para el diagnóstico como para la clasificación del cáncer y para el seguimiento en el mismo paciente del agotamiento no deseado de la función de los neutrófilos durante el tratamiento del cáncer.
La descripción también proporciona un método para evaluar el nivel de funcionalidad de los neutrófilos en un sujeto después del tratamiento del cáncer como un indicador del cambio del estado fisiológico asociado con la recurrencia del cáncer que comprende:
(a) poner en contacto una muestra de prueba, preferentemente una muestra de sangre total, que comprende neutrófilos obtenidos de dicho sujeto con un inductor capaz de estimular la producción de superóxido en neutrófilos en condiciones adecuadas para tal estimulación;
(b) determinar el aumento de la producción de superóxido por encima del nivel basal en dicha muestra de prueba después de un período de tiempo;
(c) comparar el aumento en la producción de superóxido por encima del nivel basal en dicha muestra de prueba con el aumento en la producción de superóxido por encima del nivel basal en una segunda muestra de comparación en el mismo momento y bajo las mismas condiciones, dicha segunda muestra de comparación es una muestra tomada en un momento temprano después del tratamiento del cáncer y mientras se considera que el sujeto está en remisión del cáncer,
en donde el aumento de la producción de superóxido inducida en dicha muestra de prueba en comparación con dicha segunda muestra de comparación es indicativo de la recurrencia del cáncer.
Por lo tanto, se puede concebir que la metodología ahora descrita permite todo lo siguiente en relación con la gestión y el tratamiento del cáncer:
1. Prueba de leucocitos como un predictor de la agresión y recurrencia del cáncer.
2. Prueba de leucocitos como marcador objetivo de la eficacia de las terapias.
3. Uso de una prueba de leucocitos como un criterio de valoración de las terapias.
4. Prueba de leucocitos para equilibrar y moderar las intervenciones terapéuticas (por ejemplo, el intervalo de tiempo entre las sesiones de quimioterapia y las sesiones de radioterapia) mediante la optimización de la función celular (en lugar de simplemente contar las células o analizar la estructura).
5. Prueba de leucocitos como un punto de control controlado durante las terapias
6. Prueba de leucocitos como sensor del microambiente durante la terapia contra el cáncer
7. Prueba de leucocitos para optimizar la intervención terapéutica durante el cáncer
Otros usos potenciales y algunos beneficios potenciales que ahora se señalan son:
• Puede usarse para la detección temprana de varios tipos de cáncer.
• Puede usarse como monitor doméstico para determinar las respuestas óptimas.
• El estilo de vida (comida, ejercicio, técnicas de relajación) se puede ajustar para determinar la respuesta óptima (resultados óptimos personalizados).
• Puede ayudar al tratamiento personalizado de tipos de cáncer (medicina personalizada); por ejemplo, pero no exclusivamente, a optimizar la medicina tradicional con terapias alternativas.
• Puede usarse para combinar enfoques medicinales alternativos (por ejemplo, enfoques dietéticos con tradicionales).
• El tratamiento holístico de los tipos de cáncer (estilo de vida, regímenes tradicionales y alternativos) se puede combinar y optimizar.
• El seguimiento domiciliario se puede realizar de forma regular para monitorear, optimizar y seguir la eficacia de los tratamientos.
• Puede servir como una advertencia temprana de recurrencia después de la remisión.
• Simple, fácil de usar - los resultados se pueden obtener en 10 minutos, mínimamente invasivo.
• La unidad para el protocolo puede ser portátil, no basada en laboratorio, de esta manera se minimiza el costo.
• Primera técnica que permite la integración de los tratamientos (tradicional, alternativo, estilo de vida) basada en la evaluación objetiva de la funcionalidad de los neutrófilos clínicamente relevante.
• Facilita una atención oncológica objetiva verdaderamente personalizada.
Se concibe que los métodos de la invención para evaluar el estado del cáncer sean ampliamente aplicables a una variedad de tipos de cáncer tales como cáncer de mama, cáncer de ovario y otros tipos de cáncer. Tales métodos pueden encontrar una aplicación especial en relación con, por ejemplo, el cáncer de próstata.
De particular relevancia para su uso de forma conveniente, como se indicó anteriormente, es que no hay necesidad de fraccionar las muestras de sangre para obtener una fracción aislada de leucocitos o neutrófilos. Las muestras de sangre para llevar a cabo un método de la invención, como se reivindica ahora, se ponen en contacto directamente con el inductor químico forbol-miristato-acetato (PMA) capaz de estimular la producción de superóxido en neutrófilos. Más particularmente, por ejemplo, puede emplearse el producto microbiano forbol 12-miristato 13-acetato (obtenible de Sigma). El inductor químico puede almacenarse convenientemente en forma de una composición de reactivo liofilizado, por ejemplo, como un gránulo, para su disolución en una solución tampón apropiada, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.
Para mayor comodidad, junto con una alta sensibilidad, como se indicó anteriormente, la producción de superóxido está relacionada con la medición de la señal de quimioluminiscencia mediante el uso de luminol (ver el documento EP 1558929 y Hu y otros (1999) Cell Signal 11, 355-360). El luminol puede suministrarse convenientemente con el inductor químico en una única composición de reactivo para la adición a las muestras, como se ejemplifica mediante la composición liofilizada disponible comercialmente que comprende PMA y luminol indicada anteriormente. Para cada muestra, la quimioluminiscencia en presencia del inductor añadido puede medirse mediante el uso de un luminómetro portátil convencional en un momento adecuado. Sin embargo, como se indicó anteriormente, se puede preferir el uso de un detector de fotones alternativo más avanzado, por ejemplo, especialmente un fotomultiplicador de silicio.
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un sistema configurado para llevar a cabo un método de la invención como se discutió anteriormente que comprende un detector de luz tal como un luminómetro portátil o Si-PM y un sistema para analizar los resultados para proporcionar una alerta para un nivel de funcionalidad de los neutrófilos asociado con un estado del cáncer, por ejemplo, cáncer metastásico. El mismo sistema también puede emplearse en el seguimiento del tratamiento del cáncer como se discutió anteriormente y proporcionar una alerta adicional para una función de neutrófilos baja que favorezca la conveniencia de cambiar o detener el tratamiento del cáncer.
Los resultados de quimioluminiscencia proporcionados por un método de clasificación del estado del cáncer de la invención se usan para clasificar a los pacientes con cáncer por correlación con uno o más criterios indicativos de la progresión de la enfermedad. Por ejemplo, tales criterios pueden ser uno o más intervalos de tamaño del tumor, por ejemplo, un intervalo de longitud máxima del núcleo del cáncer (MCCL), metástasis y sin metástasis. De esta manera, las puntuaciones de LLC pueden usarse para estratificar los tipos de cáncer y evaluar la gravedad de la enfermedad. La aplicación de dicho análisis a muestras de sangre total de pacientes con cáncer de próstata ha establecido, por ejemplo, que las puntuaciones de LCC para muestras de pacientes con cáncer de próstata metastásico son significativamente más altas que para muestras de sangre total de pacientes en remisión o con cáncer de próstata no metastásico de bajo grado como se equipara con un MCCL de menos de 4 mm. Se puede predecir que tal clasificación del estado del cáncer sea igualmente aplicable a otros tipos de tumores, por ejemplo, cáncer de mama, y que permita la determinación de los umbrales de puntuación de LCC para que se utilicen para determinar la progresión o recurrencia del tumor.
Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Ejemplo del protocolo para el uso de la exposición a PMA para evaluar el nivel de funcionalidad de los neutrófilos en muestras de sangre total
Para medir el nivel de quimioluminiscencia de fondo de la sangre, se transfieren 10 pl de sangre total a un tubo antirreflectante de silicio. Se añaden 90 pl de 10-4 M luminol (5-amino-2,3-dihidrofalazina; Sigma) diluido en tampón fosfato. Luego, el tubo se agita suavemente. Para medir la quimioluminiscencia producida en respuesta a la exposición a PMA, se añaden 20 pl de PMA (Sigma) a una concentración de 10-3 M. Para cada tubo, se puede medir la quimioluminiscencia durante 30 segundos cada 5 minutos en un luminómetro, durante un total de 30 minutos. Cuando no están en el luminómetro, los tubos se incuban a 37,5 °C, por ejemplo, en un calentador de bloque seco. Una sola lectura después de la incubación a 37,5 °C durante 10 minutos puede resultar conveniente y más preferible.
Se apreciará que se pueda realizar la misma prueba de exposición con cualquier detector de fotones suficientemente sensible, por ejemplo, se puede emplear un Si-PM.
Ejemplo 2: Estratificación de pacientes con cáncer de próstata mediante el uso de puntuaciones de LCC
El estudio fue aprobado por un comité de ética local y realizado en un hospital universitario del NHS en Londres. Se reclutó para el estudio a 70 hombres con insuficiencia bioquímica después de radioterapia de próstata radical antes de la terapia de rescate. Después de dar su consentimiento para el estudio y antes de someterse a una resonancia magnética multiparamétrica de cuerpo entero (WB-MRI), se obtuvieron muestras de sangre por punción digital (10 microlitros) de cada paciente por triplicado y se analizaron para determinar el nivel de funcionalidad de los neutrófilos mediante el uso del reactivo liofilizado de composición PMA/luminol disponible comercialmente en Oxford MediStress para la puntuación de LCC. Esto implicó mezclar la sangre con una solución tamponada (100 microlitros) de reactivos que contenían la mezcla liofilizada de PMA/luminol. Después de la incubación en un calentador de bloque seco durante 10 minutos a 37,5 °C, se evaluó la producción de especies reactivas del oxígeno en la muestra, medida mediante el uso de un luminómetro portátil (3M Clean Trace™). Se obtuvo un conjunto de muestras (por triplicado) de cada sujeto de prueba.
Los resultados de las pruebas se analizaron mediante el agrupamiento de los sujetos de prueba en varias categorías de acuerdo con la gravedad de la enfermedad ("significación de la enfermedad"). Las categorías fueron:
- Sin metástasis, es improbable que vuelva a aparecer
- Sin metástasis, longitud máxima del núcleo del cáncer (MCCL) < 4 mm
- MCCL entre 4 mm y 10 mm
- MCCL > 10 mm
- Metástasis
Las puntuaciones para el nivel de funcionalidad de los neutrófilos para cada paciente en estas categorías se promediaron (media) y estos promedios se representaron en un gráfico de barras como se muestra en la Figura 1 Resultados:
- Los datos muestran una fuerte correlación entre la puntuación de LCC y el aumento de la gravedad de la enfermedad.
- 17/18 pacientes con puntuaciones de LCC > 450 tenían una enfermedad significativa que se equiparaba con MCCL > 4 o metástasis.
- Se demostró una diferencia estadísticamente significativa (mediante la prueba t) entre las muestras de pacientes con metástasis y las muestras del grupo de pacientes sin metástasis o con cáncer de grado bajo (sin metástasis/sin recurrencia o MCCL < 4).
Estos resultados demuestran por primera vez que el nivel de funcionalidad de los neutrófilos evaluado por la puntuación de LCC medida mediante el uso del sistema Oxford MediStress puede usarse para estratificar tumores con referencia a criterios de estado de progresión y señalan un interés especial, por ejemplo, en el uso de puntuaciones de LCC como medio para distinguir rápidamente el cáncer de próstata avanzado con probabilidad de metástasis, del cáncer de grado bajo o nulo.
Claims (6)
1. Un método para evaluar el estado del cáncer en un sujeto que se sospecha o se conoce que tiene cáncer, o un sujeto que se conoce que está en remisión del cáncer, dicho método comprende:
(a) poner en contacto una muestra de sangre total de prueba obtenida de dicho sujeto con un inductor capaz de estimular la producción de superóxido en neutrófilos bajo condiciones adecuadas para tal estimulación en dicha muestra;
(b) determinar el aumento de la producción de superóxido por encima del nivel basal en dicha muestra de prueba después de un período de tiempo para obtener un primer resultado y
(c) comparar dicho primer resultado con un segundo resultado de comparación que es un umbral predeterminado que se correlaciona con uno o más criterios que se equiparan con un estado del cáncer, de manera que se determina el estado del cáncer;
dichos uno o más criterios se seleccionan entre ausencia de tumor, un intervalo de tamaño de tumor, metástasis o sin metástasis y
dicho inductor capaz de estimular la producción de superóxido en neutrófilos es el forbol-miristato-acetato (PMA), la producción de superóxido se detecta mediante el uso de luminol como amplificador y se mide la quimioluminiscencia resultante,
de manera que dichas condiciones de la etapa (a) son tales que la clasificación de la progresión del cáncer sobre la base del tamaño del tumor o la progresión a metástasis se asociará con un aumento de la quimioluminiscencia por encima del nivel basal.
2. Un método como se reivindicó en la reivindicación 1 para evaluar el estado del cáncer de próstata en un ser humano.
3. Un método como se reivindicó en la reivindicación 2 en donde dicho estado del cáncer es avanzado a metástasis o sin metástasis.
4. Un método como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la quimioluminiscencia se mide mediante el uso de un luminómetro portátil.
5. Un sistema configurado específicamente para llevar a cabo un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, dicho sistema comprende un detector de fotones para la detección cuantitativa de la quimioluminiscencia y un sistema para analizar los resultados y configurado para proporcionar una alerta para un nivel de funcionalidad de neutrófilos asociado con un estado del cáncer de interés seleccionado entre ausencia de tumor, un intervalo de tamaño de tumor, metástasis o sin metástasis.
6. Un sistema como se reivindicó en la reivindicación 5, en donde dicho detector de fotones es un luminómetro portátil.
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