CN109791141B - 监测癌症复发和进展 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了对全血样品进行测试，用于警告癌症复发和评估癌症进展的快速且简单的方法，其依赖于白细胞(主要是嗜中性粒细胞)的功能测定，以用化学发光测量定量来展示激发诱导的超氧阴离子产生。

Description

监测癌症复发和进展
技术领域
本发明涉及用于在个体中预测癌症复发和监测癌症进展和治疗的体外方法。更具体地，所提供的方法依赖于白细胞(主要是嗜中性粒细胞)的功能的测定以展示激发诱导的(challenge-induced)超氧阴离子产生，即响应于体外活化产生“呼吸爆发”。虽然白细胞的这种活化是已知的并且通常被称为白细胞应对能力(leucocyte coping capacity，LCC)，但是本发明提供了在癌症诊断领域的新应用，其可以例如用于使用全血样品简单且快速地评估癌症状态，而无需分离。例如，已经显示本发明能够基于肿瘤大小快速且方便地对前列腺癌患者进行排序，并且能够将这些有转移的患者与没有转移和肿瘤体积相对较低的患者进行区分。
可以在癌症治疗之前或在癌症治疗期之后应用这种方法以评估治疗的有效性。它可以为调节治疗性干预(例如化疗疗程之间的时间间隔、药物剂量的改变或治疗形式的改变)提供快速且方便的指导。
背景技术
目前用于监测癌症进展的技术通常使用总血细胞计数，例如总白细胞计数(TotalLeukocyte Count，TLC)或嗜中性粒细胞绝对计数(Absolute Neutrophil Count，ANC)。这些分别给出了每体积血液中白细胞或嗜中性粒细胞的数量。虽然它们提供了特定细胞的总数，但它们没有告诉医生细胞的功能。此外，这些测试必须在医院、保健诊所或其他专业医疗机构进行，不适合作为自我测试。
已知化学疗法通过破坏产生嗜中性粒细胞的骨髓中的快速分裂的细胞而导致循环的嗜中性粒细胞群减少(一种称为嗜中性粒细胞减少症的病况)。实际上，嗜中性粒细胞减少症是化学疗法的主要剂量限制性毒性，并且是导致相对剂量强度(RDI)低的剂量延迟和减少的主要驱动因素(Lyman等人(2003)J.Clin.Oncol.21,4524-4531)。嗜中性粒细胞减少症与危及生命的感染风险以及可能影响治疗结果的化疗剂量减少和延迟有关(Crawford等人(2004)Cancer 100,228-237)。此外，研究人员已明确确定需要改进对早期乳腺癌患者进行排序的方法，以使他们的治疗更有效并减少因嗜中性粒细胞减少症引起的延迟(Silber等人(1998)Cancer,J.Clin.Oncol.16,2392-2400)。
现在已经令人惊讶地发现，可以使用简单的全血测试来获得癌症状态的快速定量测量，以指导治疗或提供对癌症复发的见解，其依赖于如上所述的对白细胞的激发诱导的超氧化物产生的测定。这样的测试方案具有另外的优点，即，它可以在癌症治疗期间应用而无改变，以评估嗜中性粒细胞功能并提供不期望的嗜中性粒细胞减少症的警告。
诸如佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbol myristate acetate，PMA)的化学诱导物众所周知用于激活外周血样品中的嗜中性粒细胞，由此可以将保留的产生超氧化物的能力量化为嗜中性粒细胞功能的量度(Hu等人Cell Signal(1999)11,335-360)。通过化学发光测量超氧化物产生以获得LCC评分的、使用全血样品进行的这种使用形成了由OxfordMediStress Limited商业化以量化人和动物的心理应激的测试的基础；见源自已公开的国际申请WO2004/042395的欧洲专利号1558929和相关专利。然而，本文报道的数据首次证明了相同类型的血液测试在癌症诊断中非常不同的效用。特别感兴趣的是，已经证明这种测试能够应用于来自前列腺癌患者的血液样品，由此LLC评分可以与疾病进展或持续缓解相关联；参见实施例2。这种排序或分层方法被认为同样适用于其他癌症，尤其是例如乳腺癌。
发明内容
如上所述，本发明依赖于评估全血的嗜中性粒细胞或优选总白细胞成分响应于适当的体外化学激发而产生超氧化物的能力。使用全血样品的这种量化的响应通常称为白细胞应对能力(LCC)评分。然而，由于这将很大程度上取决于嗜中性粒细胞针对这种外部刺激产生活性氧物质(ROS)的能力，因此或者可以参考个体的嗜中性粒细胞功能水平。具有较高嗜中性粒细胞功能水平的个体将具有更大的超氧化物产生潜能，并且在生理学上将具有更强的嗜中性粒细胞功能。
因此，在其最广泛的方面，本发明提供了一种在受试者中评估嗜中性粒细胞功能水平的方法，所述嗜中性粒细胞功能水平作为肿瘤或其他癌症(包括治疗一段时间后的癌症复发)的存在的指标，所述方法包括：
(a)使从所述受试者获得的包含嗜中性粒细胞的测试样品与诱导物接触，该诱导物能够在适于刺激嗜中性粒细胞中超氧化物产生的条件下刺激嗜中性粒细胞中超氧化物的产生；
(b)在一段时间后，测定所述测试样品中超过基础的超氧化物产量的增加，以获得第一结果，以及
(c)将所述第一结果与第二比较器(comparator)结果进行比较，
由此确定所述受试者中存在或缺乏能够影响嗜中性粒细胞功能的肿瘤或其他癌症。
通常，当在短时间的诱导物激发后，通过常规化学发光测量法(例如，使用鲁米诺(luminol)和便携式发光计)测定超氧化物产量时，样品中的基础化学发光总是如此之低，以至于不需要考虑。因此，在这些情况下，测量的总的相对光单位(relative light unit，RLU)可以等同于诱导的超氧化物产量并且与嗜中性粒细胞功能成正比。例如，当使用由Oxford MediStress提供的冷冻干燥的PMA/鲁米诺试剂进行全血样品的LCC评分，并根据使用该试剂的标准方案，在37.5℃下将样品孵育10分钟时，已经证明了这一点。换句话说，确定测试样品中“超过基础的超氧化物产量的增加”可以等同于在嗜中性粒细胞刺激期结束时(例如加入诱导物后10-30分钟)存在的超氧化物的简单一步量化。
确定肿瘤或其他癌症的存在可以优选地扩展到确定肿瘤或其他癌症就大小和/或进展程度(包括转移)的一个或多个其他临床指标而言的排序或状态。因此，第二比较器结果可以是预定阈值，该预定阈值被认为等同于例如具有已知类型癌症的患者的样品的特定癌症分层状态，例如，大小或转移。
不希望受理论束缚，该方法的有效性可能与充当免疫活性部分的癌症有关。
应该认识到，第二比较器结果可以对应于对照样品中的诱导的超氧化物产生，该对照样品来自在提供样本之前已知是健康的(理想地，在放松状态下的)相同物种的不同受试者(例如，一个健康的人)。它可以是从癌症治疗一段时间后并且已知处于缓解期的同一个体取得的样品。为了本发明的目的从个体取得的样品将使得测试样品和任意比较器样品之间的心理应激的差动效应(differential effect)最小化。
在本发明的一个实施方案中，如上所述的本发明的方法可以应用于来自预期具有特定癌症类型的不同进展程度(包括治疗后可能的缓解)的患者的多个样品，并比较诱导的超氧化物产生的定量结果，优选LCC评分，用于通过与指示疾病进展的一个或多个标准(例如预期转移和无转移)相关联来为每个样品分配等级。实施例2说明了使用来自前列腺癌患者的多个样品进行的这种分层方法。这种分层将提供预定阈值，其可以在以下过程中用作第二比较器结果：将本发明的方法应用于来自疑似患有或已知患有相同癌症的患者的另外的样品中，以确定癌症状态或在有效治疗后检查这种癌症的复发。
用于本发明方法的样品优选是全血样品，在这种情况下，如上所述，超氧化物产量将更严格地等同于白细胞产生超氧化物的能力(或者说产生呼吸爆发的能力)。重要的是，这种方法避免了离心(已知离心会影响细胞反应性)，并且还避免了在玻璃载玻片上铺板细胞，这也可能影响功能性。使用传统的手指采血装置获得的小至约10-30μl的血液样品将足够。
如上所述，可以通过已知的简单化学发光测量，使用例如鲁米诺或异鲁米诺，来方便地测量超氧化物产生。合适的方案公开于例如Oxford MediStress的欧洲专利号1558929中。通常，将选择37-37.5℃的孵育温度并继续孵育预定时间，优选与最大化学发光测量一致或接近最大化学发光测量。如上所述，由Oxford MediStress提供的用于LCC测试的包含PMA和鲁米诺盐的冷冻干燥组合物使得能够在仅仅10分钟内获得来自手指点刺全血的合适测试结果，并且作为优选试剂用于实施例2中报告的测试。
虽然可以采用传统的发光计来检测化学发光，但是这种光检测器需要昂贵且易碎的光电倍增管。因此，可以优选使用替代的光子检测器。特别地，例如，硅光电倍增器(Si-PM)可以是有利的。这种光子检测器被认为对于该目的而言更加稳健并且将更高的成本效益与足够的光子检测灵敏度相结合。作为CopingCapacityTM测试试剂盒的一部分，还可以从Oxford MediStress获得合适的手持式发光计，CopingCapacityTM测试试剂盒还提供如上所述的含有冻干PMA/鲁米诺的试剂组合物。
如果需要或希望，可以通过参考样品中白细胞或嗜中性粒细胞的数量来校正为每个样品所测量的超过基础的超氧化物产量。由于如上所述，可以预期嗜中性粒细胞负责超过基础的超氧化物产量的大部分，针对体外诱导的诱导的、超过基础的白细胞的残余能力可称为“嗜中性粒细胞功能水平”，并将在下文中如此提及。
附图说明
图1示出了使用LCC评分、参照最大癌核心长度(maximum cancer core length，MCCL)和存在或不存在转移，来对前列腺癌患者进行分层。
具体实施方式
本发明的方法特别关注的是监测人类癌症患者中的癌症进展，或在治疗这些患者后提供癌症复发的指标，但是应当理解，它也应用于兽医领域特别是涉及其他哺乳动物的癌症治疗。
如上所述，用于在受试者中评估肿瘤或其他癌症的存在的本发明的方法包括可同样用于评估癌症治疗在治疗期间对癌症患者的嗜中性粒细胞功能水平的影响的步骤：
(i)使从患者获得的包含嗜中性粒细胞的测试样品(优选全血样品)与诱导物接触，该诱导物能够在适于刺激嗜中性粒细胞中超氧化物产生的条件下刺激嗜中性粒细胞中超氧化物的产生；
(ii)在一段时间后，测定所述测试样品中超过基础的超氧化物产量的增加，以获得第一结果，以及
(iii)将所述第一结果与第二比较器结果进行比较，
由此，与对照结果相比，所述测试样品中所诱导的超氧化物产量增加的减少表明，治疗对嗜中性粒细胞功能水平有抑制作用。
应当理解的是，对照结果可以源自在所述治疗之前或期间的较早时间点从同一患者取得的样品。
可以重复步骤(i)至(iii)，从而提供用于长期(“纵向”)监测癌症治疗对患者生理状态的效果的非常方便的手段。这种方法被设想为一种方便的手段，例如用于帮助临床医生在癌症治疗中应用化学疗法和/或放射疗法时做出决策，例如化疗和/或放疗疗程之间的时间间隔，这将建立在临床相关的细胞功能上，而不仅仅是计数细胞或观察结构。
因此，重要的是，本发明使得能够提供试剂盒组分的单一组合，其既用于癌症诊断和排序，又用于监测同一患者在癌症治疗期间不希望的嗜中性粒细胞功能消耗。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种评估癌症治疗后的受试者中嗜中性粒细胞功能水平的方法，所述嗜中性粒细胞功能水平作为与癌症复发相关的生理状态变化的指标，所述方法包括：
(a)使从所述受试者获得的包含嗜中性粒细胞的测试样品(优选全血样品)与诱导物接触，该诱导物能够在适于刺激嗜中性粒细胞中超氧化物产生的条件下刺激嗜中性粒细胞中超氧化物的产生；
(b)在一段时间后，测定所述测试样品中超过基础的超氧化物产量的增加；
(c)将所述测试样品中超过基础的超氧化物产量的增加与同一时间点和相同条件下的第二比较器样品中超过基础的超氧化物产量的增加进行比较，所述第二比较器样品是在癌症治疗后并且受试者被认为处于癌症缓解期的较早时间点采集的样品，
其中，与所述第二比较器样品相比，所述测试样品中所诱导的超氧化物产量增加表明癌症复发。
因此，可以设想本发明的方法能够实现以下与癌症管理和治疗相关的所有内容：
1.使白细胞测试成为癌症侵袭和复发的预测因子。
2.使白细胞测试成为治疗有效性的客观标志。
3.使白细胞测试用作治疗的终点。
4.使白细胞测试能够平衡和调节治疗性干预(例如化疗疗程和放疗疗程之间的时间间隔)，优化细胞功能(而不仅仅是计数细胞或观察结构)。
5.使白细胞测试成为治疗期间的受控检查点
6.使白细胞测试成为癌症治疗期间微环境的传感器
7.使白细胞测试能够优化癌症期间的治疗性干预
其他潜在用途和一些现在值得注意的潜在益处是：
·可用于癌症的早期检测。
·可用作家用监视器以确定最佳响应。
·可以调整生活方式(食物、运动、放松技术)以确定最佳响应(个性化的最佳结果)。
·可以帮助定制癌症的治疗(个性化医疗)；例如，但不仅仅是用替代疗法优化传统医疗。
·可用于结合替代药物方法(例如饮食与传统方法)。
·可以结合并优化癌症的整体治疗(生活方式、传统方案和替代方案)。
·可以定期进行家庭监测，以监测、优化和跟踪治疗的效果。
·可作为缓解期后复发的早期预警。
·简单、易于使用—可在10分钟内获得结果、微创。
·方案单元可以是便携式的，而不是基于实验室的，从而最大限度地降低成本。
·能够基于临床上相关的嗜中性粒细胞功能的客观评估来整合治疗(传统、替代、生活方式)的首个技术。
·促进真正个性化的客观癌症护理。
设想本发明的方法可广泛应用于多种癌症，例如乳腺癌、卵巢癌和其他癌症类型。这些方法可以找到与例如前列腺癌有关的特殊应用。
与如上所述的使用的便利性特别相关的是，不需要分离血液样品以获得分离的白细胞或嗜中性粒细胞级分。用于执行本发明方法的血液样品可以直接与能够刺激嗜中性粒细胞中超氧化物产生的任意化学诱导物接触。诱导物可以优选为佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)，更特别是例如可从Sigma获得的微生物产物佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯。然而，可能使用的替代诱导物是众所周知的。它们包括N-甲酰基-Met-Leu-Phe(fLMP趋化肽)、酵母聚糖、脂多糖和肾上腺素。化学诱导物可以方便地以冷冻干燥的试剂组合物的形式储存，例如，作为颗粒(pellet)，用于溶解在合适的缓冲溶液例如磷酸盐缓冲溶液中。
为了获得额外的便利性和高灵敏度，如上所述，将超氧化物产量与使用合适放大器如鲁米诺或异鲁米诺的化学发光信号测量相关联(参见EP 1558929和Hu等人(1999)CellSignal 11,355-360)。鲁米诺或异鲁米诺可以方便地与化学诱导物一起以单一试剂组合物提供，用于添加到样品中，例如上面提到的包含PMA和鲁米诺的市售冷冻干燥组合物。对于每个样品，可以在合适的时间点使用常规便携式发光计测量在添加的诱导物存在下的化学发光。然而，如上所述，可以优选使用替代的更先进的光子检测器，例如，特别是硅光电倍增管。
在本发明的另一方面，提供了一种用于执行如上所述的方法的系统，其包括光检测器，例如便携式发光计或Si-PM，以及一种用于分析结果以提供与癌症风险或癌症状态(例如转移性癌症)相关的嗜中性粒细胞功能水平的警报的系统。相同的系统也可以用于如上所述监测癌症治疗，并且另外提供低嗜中性粒细胞功能的警报，有利于改变或停止癌症治疗的诉求。
如上所述，现在已经表明，如上所述用于检测癌症存在的本发明方法的步骤(a)至(c)如果应用于来自具有特定癌症类型的不同进展程度(包括治疗后可能的缓解)的患者的多个样品，将提供这样的结果，该结果可用于通过与指示疾病进展的一个或多个标准相关联来对每位癌症患者进行排序。例如，这样的标准可以是一个或多个肿瘤大小范围，例如，最大癌核心长度(MCCL)范围、转移和无转移。通过这种方式，LLC评分可用于对癌症进行分层以评估疾病严重程度。例如，对来自前列腺癌患者的全血样品进行这种分析的应用已经证实，来自患有转移性前列腺癌的患者的样品的LCC评分显著高于来自处于缓解期的患者或具有低等级非转移性前列腺癌(等同于MCCL小于4毫米)的患者的全血样品的LCC评分。可以预测这种癌症状态排序同样适用于其他肿瘤类型，例如，乳腺癌，并能够确定用于确定肿瘤进展或复发的LCC评分阈值。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，提供了评估疑似患有或已知患有肿瘤的受试者或先前已知处于肿瘤缓解期的受试者中的癌症状态的方法，其包括：
(a)使从所述受试者获得的包含嗜中性粒细胞的测试样品(优选全血样品)
与诱导物接触，该诱导物能够在适于刺激嗜中性粒细胞中超氧化物产生的条件下刺激嗜中性粒细胞中超氧化物的产生；
(b)在一段时间后，测定所述测试样品中超过基础的超氧化物产量的增加，以获得第一结果，以及
(c)将所述第一结果与第二比较器结果进行比较，所述第二比较器结果是预定阈值，其与等同于癌症状态的一个或多个标准(例如，尺寸范围和/或转移)
相关，由此确定癌症状态。
可以将癌症状态评估为无肿瘤，例如肿瘤持续缓解。它可以等同于存在符合定义肿瘤进展程度(例如，进展为转移)的一个或多个标准的肿瘤。这种方法可能特别优选用于快速评估肿瘤(例如，前列腺或乳腺癌肿瘤)是否已进展至转移。
以下非限制性实施例说明了本发明。
实施例
实施例1：使用PMA激发来评估全血样品中嗜中性粒细胞功能水平的方案的实施例
为了测量背景血液化学发光水平，将10μl全血转移到硅抗反射管中。加入90μl在磷酸盐缓冲液中稀释的10-4M鲁米诺(5-氨基-2,3-二氢酞嗪(5-amino-2,3-dihydrophalazine)；Sigma)。然后轻轻摇动管。为了测量响应于PMA激发而产生的化学发光，加入20μl浓度为10-3M的PMA(Sigma)。对于每个管，可以在发光计中每5分钟测量30秒化学发光，总共30分钟。当不在发光计中时，将管孵育在37.5℃，例如，在干式加热器中。
可以发现在37.5℃下孵育10分钟后的单次读取是方便且更优选的。
应当理解，可以用任意足够灵敏的光子检测器执行相同的激发测试，例如可以使用Si-PM。
实施例2：使用LCC评分对前列腺癌患者进行分层
该研究得到了当地伦理委员会的批准，并在伦敦的NHS教学医院进行。该研究招募了70名在挽救治疗前进行根治性前列腺放疗后生化失败的男性。在同意该研究之后并且在进行全身多参数MRI(whole-body multi-parametric MRI，WB-MRI)之前，从每位患者一式三份地获得手指点刺的血液样品(10微升)并使用冷冻干燥的PMA/鲁米诺试剂组合物(可从Oxford MediStress商购获得)分析嗜中性粒细胞功能水平用于LCC评分。这涉及将血液与含有冷冻干燥的PMA/鲁米诺混合物的试剂的缓冲溶液(100微升)混合。在干式加热器中在37.5℃下孵育10分钟后，使用便携式发光计(3M Clean Trace(TM))测量，评估样品的活性氧物质的产生。从每个测试受试者获得一组样品(一式三份)。
通过根据疾病严重程度(“疾病显著性(disease significance)”)将测试受试者分组成不同类别，来分析测试结果。分类是：
-无转移，不太可能复发
-无转移，最大癌核心长度(MCCL)<4mm
-MCCL在4mm和10mm之间
-MCCL>10mm
-转移
将这些类别中每位患者的嗜中性粒细胞功能水平评分进行平均(平均值)并将这些平均值绘制在条形图上，如图1所示。
结果：
-数据显示LCC评分与疾病严重程度增加之间存在很强的相关性。
-17/18名LCC评分>450的患者有等同于MCCL>4或转移的明显疾病。
-在来自具有转移的患者的样品和来自没有癌症或癌症级别低(无转移/无复发或MCCL<4)的患者组的样品之间，显示出了统计学显著性差异(通过t-检验)。
这些结果首次表明，使用Oxford MediStress系统测量的LCC评分评估的嗜中性粒细胞功能水平可用于参照进展状态的标准对肿瘤进行分层，并指出特别关注的是，例如使用LCC评分作为快速区分具有转移可能性的晚期前列腺癌与无癌症或低级别癌症的手段。

Claims (3)

1.一种专门配置用于确定疑似患有或已知患有癌症的受试者或先前已知处于癌症缓解期的受试者中的癌症状态的系统，其中所述确定包括:
(a)在PMA能够刺激从所述受试者获得的全血样品中嗜中性粒细胞产生超氧化物的条件下，将所述样品与PMA和鲁米诺接触；
(b)在选定时间段后测量步骤(a)产生的化学发光，其中步骤(a)测量的化学发光水平与对照全血样品在相同条件下通过与PMA和鲁米诺接触测量的化学发光水平相比，基于肿瘤大小的癌症状态的进展或转移的进展将与增加的化学发光相关，所述对照全血样品获自未患癌症的受试者，
所述系统包括用于在步骤(b)中定量测量化学发光的光子检测器以及用于分析结果的系统，所述系统被配置为提供与感兴趣的癌症状态相关的嗜中性粒细胞功能水平的警报，所述感兴趣的癌症状态选自无肿瘤、肿瘤大小范围、转移或无转移。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述光子检测器是便携式发光计。
3.根据权利要求1或2所述的系统，其中，所述癌症是前列腺癌。
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