CN116648622A - 用于诊断和监测败血症的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了对全血样品进行测试的快速和简单的方法，用于警示败血症或败血症休克的发生，并评估其进展和治疗反应，所述方法依赖于确定白细胞(主要是嗜中性粒细胞)的功能性，以通过化学发光测量定量来显示激发诱导的超氧阴离子产生。

Description

用于诊断和监测败血症的方法

技术领域

本发明涉及用于在个体中诊断败血症和监测败血症进展和治疗的快速体外方法。更具体地，所提供的方法依赖于白细胞(主要是嗜中性粒细胞)的响应性的测定以展示激发诱导的(challenge-induced)超氧阴离子产生，即响应体外活化产生“呼吸爆发”。虽然白细胞的这种活化是已知的并且通常被称为白细胞应对能力(leukocyte coping capacity，LCC)，但是本发明提供了在癌症诊断领域的新应用，其可以例如用于使用全血样品简单且快速地评估癌症状态，而无需分离。本发明已经显示出在测量的超氧阴离子(也称为“活性氧物质”)产生中具有高度显著差异，从而将败血症患者与健康志愿者区分开来。因此，可以设想，本发明通常应用于提供败血症(包括败血症休克)的快速指示性诊断。

败血症通常被定义为因宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍(国际败血症特别工作组，Singer等人，2016)。目前，对败血症发作或发生的临床评估需要评估多种临床标准，同时需要及时治疗。本发明允许快速的指示性诊断，其中最多可能怀疑感染但等待确认。来自败血症休克患者的全血样品表现出的LCC评分远超过来自健康志愿者的全血样品，这种差异惊人的巨大，以至于LCC评分被视为提供了区分败血症患者的直接手段。

这种方法可以应用于临床实践的许多领域，包括:i.)在医院重症监护室(ICU)中提供败血症筛查和治疗监测的快速方法，ii.)在事故和紧急(A&E)单位和iii.)在主要快速筛查败血症的救护车上，以及iv.)在全科医疗(GP)手术中作为诊断败血病(septicaemia)的潜在方法，败血病是一种血液细菌感染，可导致败血症。

它可以为调节败血症中的治疗性干预(例如剂量之间的时间间隔、药物剂量的改变或治疗形式的改变)提供快速且方便的指导。

背景技术

败血症是重症监护室(ICU)住院患者最常见的死亡原因之一。在这种情况下很难诊断，因为这些患者存在多种合并症和基础疾病(Novosad等人,2016；Vincent等人,2009.)。

败血症是一种医学紧急情况，描述了身体对感染过程的系统性免疫反应，可导致终末期器官功能障碍和死亡(Gyawali等人,2019)。败血症仍然是危重患者发病和死亡的主要原因之一(Kaukonen等人,2014)。

败血症的早期检测对于开始、维持和监测有效治疗至关重要。Kumar等人(2006)证明了低血压发作后有效抗生素开始时间的延迟与院内死亡率之间的明显联系。每延迟一小时，存活率平均下降约7％。在确认败血症或败血症休克的第一个小时内施用抗生素导致高达80％的存活率。

已知化学诱导剂(如佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA))可激活外周血样品中的嗜中性白细胞，由此可量化白细胞(主要是嗜中性粒细胞)产生活性氧的保留能力(Hu等人,CellSignal(1999)11,335-360)。通过化学发光检测测量活性氧物种产生以获得LCC评分的全血样品的这种使用形成了由Oxford MediStress Limited商业化以量化人和动物的生理应激的测试的基础；见源自已公开的国际申请WO2004/042395的欧洲专利号1558929和相关专利。然而，本文报道的数据第一次提供了相同类型的血液测试在确定败血症或败血症休克的发作和发生以及监测其治疗中非常不同的效用的证据；见实施例2。

因此，现在实现了体外诊断(IVD)的护理点(POC),其使用全血中的身体自身细胞(白细胞)作为败血症的生物指示器(称为Leukocyte ImmunoTestTM or LITTM)。白细胞对促炎和抗炎介质起反应，并从免疫和非免疫途径、心血管、自主、神经、激素、代谢和凝血获得信号。嗜中性粒细胞在体内的活动之一是产生活性氧物种(ROS)。这是杀死细菌的重要一步。所有这些系统都受到败血症的影响(Segal等人,2005)。然而，到目前为止，虽然已经知道败血症中免疫系统失调，但还不知道这如何影响嗜中性粒细胞保留的对全血样品中ROS产生的体外挑战的反应能力。

目前用于诊断脓毒症的技术通常使用对患者生命体征(特别是体温、心率、呼吸频率和血压)以及行为(意识模糊的体征)的临床观察。参见下表1，该表列出了英国国家临床卓越研究所(NICE)关于脓毒症风险分级的指南。

国际败血症特别工作组[Singer等人,(2016)JAMA,The Third InternationalConsensus Definitions for Sepsis and Septic Shock(Sepsis-3)]为疑似感染的成年患者提供了一种替代性的败血症筛查工具，这些患者可能预后不良，认可了需要进行序贯器官衰竭评估(SOFA)的重要性。称为“快速SOFA”(qSOFA)，它使用qSOFA评分来定义败血症，以确定疑似感染且预后不良的成年患者:呼吸频率≥22/min，精神状态改变(如格拉斯哥昏迷评分<15)和收缩压≤100mm Hg。

败血症休克(有时称为败血症-3)是一类败血症，其中特别严重的循环、细胞和代谢异常与显著更高的死亡风险相关。通过低血压(维持平均动脉压为65mm Hg或更高所需的血管压力)和血清乳酸增加>2mM的结合来识别[再次参见Singer等人,(2016)The ThirdInternational Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock(Sepsis-3)]。

然而，在危重患者中败血症的诊断是具有挑战性的，因为它可能因其他潜在疾病过程和先前使用抗生素使培养阴性而导致的炎症的存在而变得复杂。此外，依赖于培养的感染诊断是缓慢的。

发明内容

如上所述，现在已经令人惊讶地发现，可以使用简单的全血测试来获得免疫状态的快速定量测量，作为对患者中可能存在的败血症或败血症休克的指示性评估，其依赖于对白细胞激发诱导的超氧化物产生的测定；见实施例2。这种测试方案具有提供快速结果(在10分钟内)的优点，并且可以在医院病房或ICU(在患者附近)中进行，以评估嗜中性粒细胞功能并提供与败血症或败血症休克发展相关的免疫状态变化的警告。

现在公开的本发明的方法不仅快速，而且显著地使用全血而无需离心，因此细胞的敏感性保持完整，并且细胞保持相互之间、与红细胞、血液和血浆中的细胞因子的信号传递能力。

特别令人感兴趣的是，这种测试可以应用于来自败血症患者的血液样品，由此LCC评分可以与疾病状态相关联。这种评分在下文的临床背景中被称为LIT评分。例如，重要的是，它可以提供高风险败血症状态(根据例如疑似败血症风险分级的英国NICE指南的标准，如上定义的qSOFA评分，或败血症状态的等效分配的替代标准)或败血症休克的发作或发生的快速指示性诊断，或者使得能够确定这些。这种分级或分层方法被认为可用于监测疾病进展或治疗。

虽然本发明依赖于评估全血的总白细胞成分响应适当的体外化学激发而产生超氧化物的能力(通常称为白细胞应对能力(LCC)评分)，但由于这将主要由嗜中性粒细胞对这种外部刺激的能力来确定，因此也可以参考个体的嗜中性粒细胞功能水平。

在其最广泛的方面，本发明因此提供了一种在受试者中提供败血症或败血症休克的发作或发生的指示性诊断，或确定败血症或败血症休克的发作或发生的方法，其包括:

(a)使从所述受试者获得的全血样品与诱导物接触，该诱导物能够在适于刺激嗜中性粒细胞中超氧化物产生的条件下刺激嗜中性粒细胞中超氧化物的产生；

(b)在一段时间后，测定所述测试样品中超过基础的超氧化物产量的增加，以获得第一结果，以及

(c)将所述第一结果与第二对照物(comparator)结果(例如通过对健康个体的全血样品应用步骤(a)和(b)获得的阈值)进行比较，

由此指示或确定所述受试者中败血症或败血症休克的发作、存在或不存在。

一般而言，受试者将具有已知的能够引起败血症的因子感染(例如细菌或病毒感染)或者至少被怀疑具有这种感染。当本发明的方法至少提供了败血症或败血症休克的发展或存在的指示性诊断时，这可用于提示适当的医学干预，目的在于防止败血症或败血症休克或败血症或败血症休克严重程度的增加。如上所述，本发明的方法特别有用，例如作为高危败血症或败血症休克发作或发生的快速诊断测试；与在健康个体的血液样品中观察到的相比，在这些个体的血液样品中测定的超氧化物产生的增加具有这样的数量级，即直接指示或诊断了高危败血症或败血症休克的发作或发生。

附图说明

图1说明了来自对照临床试验的LIT评分的使用，其中将来自临床上确诊患有败血症的患者的LIT评分与来自健康对照组的LIT评分进行比较，如在实施例中进一步讨论的。使用的结果是用三份全血样品获得的平均值。箱线图显示了两组评分的中位数和四分位数范围。点状图显示了个体受试者的值以及两组的平均值(深色点表示)。

具体实施方式

在本发明的方法中，如上所述，通常使用超氧化物产生的化学发光检测。通常，当在短时间的诱导物激发后，通过常规化学发光测量法(例如，使用鲁米诺(luminol)和便携式发光计)测定超氧化物产量时，样品中的基础化学发光总是如此之低，以至于不需要考虑。因此在这些情况下，测量的总的相对光单位(relative light unit，RLU)可以等同于诱导的超氧化物产量并且与嗜中性粒细胞功能成正比。例如，当使用由Oxford MediStress提供的冷冻干燥的PMA/鲁米诺试剂进行全血样品的LCC评分，并根据使用该试剂的标准方案，在37.5℃下将样品孵育10分钟时，已经证明了这一点。换句话说，确定测试样品中“超过基础的超氧化物产量的增加”可以等同于在嗜中性粒细胞刺激期结束时(例如加入诱导物后10-30分钟)存在的超氧化物的简单一步量化。

比较步骤(c)可以使得能够直接诊断败血症或败血症休克，其中在步骤(b)中对于测试样品确定的超过基础的超氧化物产生超过通过将步骤(a)和(b)应用于来自健康个体的等效样品获得的阈值，但是应当理解，第二对照物结果可以是能够指示性诊断败血症或败血症休克或监测进展或治疗的任何替代对照物结果或阈值。

因此，确定败血症或败血症休克的存在可优选地延伸至提供疾病可能严重程度的预后指示。因此，第二对照物结果可以是预先确定的阈值，其被认为指示败血症和/或败血症休克的存在或不存在。

如上所述的本发明的方法可以在败血症或败血症休克治疗之后或期间应用，以确定治疗的有效性或监测治疗。在这种情况下，在步骤(c)中，可以将测试样品中超氧化物产生超过基础值的增加与第二个对照物样品中超氧化物产生超过基础值的增加进行比较，所述第二个对照物样品在治疗开始时或治疗期间的较早时间点取自受试者。为了本发明的目的从个体取得的样品通常将使得测试样品和任意对照物样品之间的心理应激的差异效应(differential effect)最小化。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种用于评估败血症或败血症休克受试者的治疗效果的方法，该方法包括以下步骤:

(i)使从经过一段时间的治疗后的患者获得的全血样品与诱导物接触，该诱导物能够在适于刺激嗜中性粒细胞中超氧化物产生的条件下刺激嗜中性粒细胞中超氧化物的产生；

(ii)在一段时间后，测定所述测试样品中超过基础的超氧化物产量的增加，以获得第一结果，以及

(iii)将所述第一结果与第二对照物结果进行比较，所述第二对照物结果来源于在治疗前或治疗期间的较早时间点从患者采集的全血样品，

由此，与对照物结果相比，所述测试样品中所诱导的超氧化物产量增加的减少表明，治疗对嗜中性粒细胞功能水平有抑制作用。

可以重复步骤(i)至(iii)，从而提供用于长期(“纵向”)监测败血症治疗对患者生理状态的效果的非常方便的手段。这种方法被设想为一种方便的手段，例如用于帮助临床医生在应用治疗时做出决策，例如剂量、剂量之间的时间间隔，这将建立在临床相关的细胞功能上，而不仅仅是计数细胞或观察结构。

在本发明的另一个实施方案中，具有如上定义的步骤(a)至(c)的本发明的方法可以应用于来自预期患有不同程度的败血症和/或败血症休克的患者的多个样品，并比较诱导的超氧化物产生的定量结果(LCC评分)用于通过与指示疾病进展的一个或多个标准相关联来为每个样品分配等级。这种分层将提供预定阈值，其可以在以下过程中用作第二对照物结果：将本发明的方法应用于来自疑似或已知患有败血症或败血症休克的患者的另外的样品中，以确定疾病进展、监测治疗效果或提供预后指标。

因此，本发明延伸至基于败血症进展或败血症休克的存在对败血症患者进行分级或评分的方法，其包括将上述本发明方法的步骤(a)至(c)应用于来自患者的全血样品，其中在步骤(c)中，将所述第一测试结果与一个或多个第二比较结果进行比较，每个第二对照物结果是与败血症进展或败血症休克的一个或多个标准相关的预定阈值。例如，可以将所述第一测试结果与败血症休克发作或发生的预定阈值进行比较。可以将患者的测试结果与一个或多个指示败血症严重程度的阈值进行比较，所述阈值基于对败血症进展的已知评分，例如根据上述NICE风险分级标准进展到中度至高度风险和/或高度风险。第二对照物结果可以是指示如上所述的不良预后风险的qSOFA标准的预定阈值。

用于本发明方法的样品是全血样品，在这种情况下，如上所述，超氧化物产量将更严格地等同于白细胞产生超氧化物的能力(或者说产生呼吸爆发的能力)。重要的是，这种方法避免了离心(已知离心会影响细胞反应性)，并且还避免了在玻璃载玻片上铺板细胞，这也可能影响功能性。使用传统的手指采血装置获得的小至约5-20μl(优选10μl)的血液样品将足够。

在某些情况下，如果需要或希望，可以通过参考样品中白细胞或嗜中性粒细胞的数量来校正为每个样品所测量的超过基础的超氧化物产量。例如，可以选择它来确定每10⁹个嗜中性粒细胞/l超过基础水平以上的激发诱导的超氧化物产生的增加，称为LIT-N评分；见实施例3。

如上所述，可以通过已知的简单化学发光测量，使用例如鲁米诺或异鲁米诺，来方便地测量超氧化物产生。合适的方案公开于例如Oxford MediStress的欧洲专利号1558929中。通常，将选择37-37.5℃的孵育温度并继续孵育预定时间，优选与最大化学发光测量一致或接近最大化学发光测量。如上所述，由Oxford MediStress提供的用于LCC测试的包含PMA和鲁米诺盐的冷冻干燥组合物使得能够在仅仅10分钟内获得来自手指点刺全血的合适测试结果，并且作为优选试剂用于实施例2中报告的测试。

虽然可以采用传统的发光计来检测化学发光，但是这种光检测器需要昂贵且易碎的光电倍增管。因此，可以优选使用替代的便携式光子检测器。特别地，例如，硅光电倍增器(Si-PM)可以是有利的。这种光子检测器被认为对于该目的而言更加稳健并且将更高的成本效益与足够的光子检测灵敏度相结合。作为CopingCapacityTM测试试剂盒的一部分，还可以从Oxford MediStress获得合适的手持式发光计，CopingCapacityTM测试试剂盒还提供如上所述的含有冻干PMA/鲁米诺的试剂组合物。

也可以提供合适的光子检测器作为移动电话的组件。这种用于化学发光检测的移动光度计之前已被提议作为移动化学平台的一部分(Roda等人,(2014)Anal.Chem.“Integrating Biochemiluminescence Detection on Smartphones；Mobile ChemistryPlatform for Point-of-Need Analysis”)，并且可以类似地用于在甚至远离任何外科手术或医院的位置实现本发明的方法，例如在与损伤相关的败血症的可能性很高的冲突地区。

应当理解，本发明的方法适用于被多种传染性病原体感染的患者，例如细菌、病毒、真菌或已知在严重情况下会诱导败血症的其他因子。

然而本发明的方法特别关注的是诊断败血症与监测人类患者中的败血症进展，或在治疗这些患者后提供败血症进展或消退的临床指标，但是应当理解，这种方法也应用于兽医领域特别是涉及其他哺乳动物的治疗。

因此，可以设想本发明的方法能够实现以下与败血症和败血症休克的管理和治疗相关的所有内容：

1.白细胞测试作为败血症和/或败血症休克的预测器。

2.使白细胞测试成为治疗有效性的客观标志。

3.使白细胞测试用作治疗的终点。

4.使白细胞测试能够平衡和调节治疗性干预(例如剂量水平和剂量之间的时间间隔)，优化细胞功能(而不仅仅是计数细胞或观察结构)。

5.使白细胞测试成为治疗期间的受控检查点

6.使白细胞测试能够优化治疗性干预

7.复发的早期预警

本发明的方法是:

·简单、易于使用—可在10分钟内获得结果、微创。

·方案单元可以是便携式的，而不是基于实验室的，从而最大限度地降低成本。

·能够基于临床上相关的嗜中性粒细胞功能的客观评估来整合治疗。

·促进真正个性化的客观患者护理。

与如上所述的使用的便利性特别相关的是，不需要分离血液样品以获得分离的白细胞或嗜中性粒细胞级分。用于执行本发明方法的血液样品可以直接与能够刺激嗜中性粒细胞中超氧化物产生的任意化学诱导物接触。诱导物可以优选为佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)，更特别是例如可从Sigma-Aldrich获得的微生物产物佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯。然而，可能使用的替代诱导物是众所周知的。它们包括N-甲酰基-Met-Leu-Phe(fLMP趋化肽)、酵母聚糖、脂多糖和肾上腺素。化学诱导物可以方便地以冷冻干燥的试剂组合物的形式储存，例如，作为颗粒(pellet)，用于溶解在合适的缓冲溶液例如磷酸盐缓冲溶液中。

如上所述，为了与高灵敏度相结合的额外便利，鲁米诺或异鲁米诺可以方便地与化学诱导物一起以单一试剂组合物提供，用于添加到样品中，例如上面提到的包含PMA和鲁米诺的市售冷冻干燥组合物。

在本发明的另一个方面，提供了一种被特别配置为实施如上所述的本发明方法的系统，该系统包括用于化学发光定量检测的光子检测器，例如便携式光度计或Si-PM，以及用于分析结果并被配置为提供与败血症或包括败血症休克在内的特定败血症状态的风险或发生相关的嗜中性粒细胞功能水平的警报的系统。如上所述，同样的系统也可以用于监测败血症或败血症休克治疗，并且另外提供有利于改变或停止治疗的期望的警报。

表1针对成人、儿童和12岁及以上疑似患有败血症的年轻人的风险分级工具

败血症:识别、诊断和早期处理

NICE指南NG51 https://www.nice.org.uk/guidance/ng51

以下非限制性实施例说明了本发明。

实施例：

实施例1：使用PMA激发法评估全血样品中嗜中性粒细胞功能水平的方案实施例

为了测量背景血液化学发光水平，将10μl全血转移到硅抗反射管中。在磷酸盐缓冲液中加入90μl稀释的10^-4M鲁米诺(5-氨基-2,3-二氢-1,4二氮杂萘二酮；Sigma-Aldrich)。然后轻轻摇动管。为了测量响应于PMA激发而产生的化学发光，加入20μl浓度为10^-3M的PMA(Sigma-Aldrich)。对于每个管，可以在发光计中每5分钟测量30秒化学发光，总共30分钟。当不在发光计中时，将管孵育在37.5℃，例如，在干式加热器中。

可以发现在37.5℃下孵育10分钟后的单次读取是方便且更优选的。

应当理解，可以用任意足够灵敏的光子检测器执行相同的激发测试，例如可以使用Si-PM。

实施例2：败血症患者与健康对照组的LIT评分比较

该研究由当地伦理委员会批准，并在英国伯明翰的NHS教学医院进行。招募了12名当地重症监护病房(ICU)的败血症患者和医院工作人员中20名健康志愿者参加该研究。在同意该研究之后，从每位患者一式三份地获得手指点刺的血液样品(10μl)并使用冷冻干燥的PMA/鲁米诺试剂组合物(可从Oxford MediStress商购获得)分析嗜中性粒细胞功能水平用于LCC评分。这涉及将血液与含有冷冻干燥的PMA/鲁米诺混合物的试剂的缓冲溶液(100μl)混合。在干式加热器中在37.5℃下孵育10分钟后，使用便携式发光计(3M Clean Trace(TM))测量，评估样品的活性氧物质的产生。从每个测试受试者获得一组样品(一式三份)。

通过将受试者分成两组(败血症或健康志愿者)来分析测试结果。参照qSOFA评分标准(呼吸频率≥22/min，精神状态改变，收缩压≤100mm Hg)，将所有败血症患者评分为败血症患者。所有败血症患者还表现出需要血管加压药的低血压，并且血清乳酸盐大于2mM。

将这些类别中每位患者的嗜中性粒细胞功能水平LCC评分进行平均(平均LIT评分)并绘制这些平均值，如图1所示。

结果：

-数据显示，这两个组的LIT评分存在非常显著的差异，败血症组的平均LIT评分大于健康志愿者组的10倍。

-败血症组的平均(平均值±SD)LIT评分为2526±1616，而“健康志愿者”组的平均±SD LIT评分为167±99。

-两个组的LIT评分存在显著的统计学差异(通过t检验)。

败血症组和健康组的平均值(SD)和中值(IQR)

组	N	平均值±SD	中值(IQR)
				健康组	18	167±99	153(112)
败血症组	12	2526±1616	2120(2024)

这些结果第一次证明，通过使用Oxford MediStress系统测量的LIT评分评估的嗜中性粒细胞功能水平可用作败血症发作的指示性测量，特别是，例如，可能需要在ICU中密切观察和治疗的高危败血症，以及用作监测败血症进展、干预和恢复的工具。

实施例3：使用与嗜中性粒细胞计数相关的LIT评分

还将LIT分数相对于败血症患者组血液样品中的嗜中性粒细胞计数作图，其中中性粒细胞计数表示为中性粒细胞×10⁹/l。取该线的梯度来确定LIT-N值，该值代表血液中嗜中性白细胞计数每增加1×10⁹/l，LIT的增加量。败血症患者的中位LIT-N值为115。

LIT-N评分也与ICU患者的28天死亡率相关。一名在相关时期死亡的非covid败血症患者的LIT-N评分在死亡前明显升高，为419分。

参考文献：

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Gyawali B,Ramakrishna K,Dhamoon AS.Sepsis:The evolution indefinition,pathophysiology,and management.SAGE Open Med.2019Mar 21；7:2050312119835043.doi:10.1177/2050312119835043.PMID:30915218；PMCID:PMC6429642.

Hu et al.Cell Signal(1999)11,335-360

Kaukonen K,Bailey M,Suzuki S,et al.Mortality related to severe sepsisand septic shock among critically Ill patients in Australia and New Zealand,2000–2012.JAMA 2014；311(13):1308–1316.

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Singer et al.(2016)The Third International Consensus Definitions forSepsisand Septic Shock(Sepsis-3)JAMA 315,801-810。

Claims (15)

1.一种在受试者中提供败血症或败血症休克的发作或发生的指示性诊断，或确定败血症或败血症休克的发作或发生的方法，其包括:

(a)使从所述受试者获得的测试全血样品与诱导物接触，该诱导物能够在适于刺激嗜中性粒细胞中超氧化物产生的条件下刺激嗜中性粒细胞中超氧化物的产生；

(b)在一段时间后，测定所述测试样品中超过基础的超氧化物产量的增加，以获得第一测试结果，以及

(c)将所述第一测试结果与第二对照物结果进行比较，

由此指示或确定所述受试者中败血症或败血症休克的发作、存在或不存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者已知患有能够引起败血症的因子的感染或怀疑患有这种感染。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二对照物结果是通过将步骤(a)和(b)应用于健康个体的全血样品而获得的。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于确定高危败血症或败血症休克的发作或发生的方法，其中高危败血症符合用于这种风险分级的英国NICE指南的标准、根据国际败血症特别工作组的用于这种败血症状态的qSOFA评分或用于败血症状态的等效分配的替代标准。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)至(c)在败血症或败血症休克治疗之后或期间应用，以确定治疗的有效性或监测治疗。

6.根据权利要求5所述的方法，其中在步骤(c)中，将所述测试样品中超过基础的超氧化物产生的增加与第二对照物样品中超过基础值的超氧化物产生的增加进行比较，所述第二对照物样品在治疗开始时或治疗期间的较早时间点取自受试者，其中与所述第二对照物结果相比，测试样品中诱导的超氧化物产生的减少指示了治疗对嗜中性粒细胞功能的抑制作用。

7.一种基于败血症进展或败血症休克的存在对败血症患者进行分级或评分的方法，其包括将权利要求1的方法应用于来自所述患者的全血样品，其中在步骤(c)中，将所述第一测试结果与一个或多个第二对照物结果进行比较，每个第二对照物结果是与败血症进展或败血症休克的一个或多个标准相关的预定阈值。

8.根据权利要求7所述的方法，其中将所述第一测试结果与高危败血症或败血症休克发作或发生的预定阈值进行比较。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中，测定每10⁹个嗜中性粒细胞/L的超氧化物产生超过基础值的增加，以获得LIT-N评分。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述能够刺激嗜中性粒细胞中超氧化物产生的诱导剂为佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)、N-甲酰基-Met-Leu-Phe(fLMP趋化肽)、酵母聚糖、脂多糖或肾上腺素。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述诱导剂是PMA。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过化学发光检测来检测超氧化物的产生。

13.根据权利要求12所述的方法，其中使用鲁米诺或异鲁米诺检测超氧化物的产生，并测量所得的化学发光。

14.根据权利要求13所述的方法，其中能够刺激嗜中性粒细胞中超氧化物产生的诱导剂是佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)，使用鲁米诺作为放大剂检测超氧化物产生，并测量所得的化学发光。

15.一种专门配置用于执行根据权利要求12至14中任一项所述的方法的系统，所述系统包括用于化学发光定量检测的光子检测器和用于分析结果的系统，所述系统被配置为提供与败血症或包括败血症休克的特定败血症状态的风险或发生相关的嗜中性粒细胞功能性水平的警报，优选地，其中所述光子检测器是便携式光度计。