ES2881664T3

ES2881664T3 - Virus Sendai genéticamente modificado para el tratamiento de enfermedades tumorales

Info

Publication number: ES2881664T3
Application number: ES11718679T
Authority: ES
Inventors: Ulrich Manfred Lauer; Michael Bitzer; Martina Zimmermann; Sorin Armeanu-Ebinger; Sascha Bossow; Wolfgang Neubert
Original assignee: Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2011-04-20
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2031-04-20
Also published as: CN103025755A; JP2013524798A; EP2560986A1; WO2011131703A1; EP2560986B1; DE102010018961B4; US9821016B2; US20130078219A1; DE102010018961A1; CN103025755B

Abstract

Virus Sendai modificado genéticamente (SeV) que, en comparación con el tipo salvaje (WT), presenta en su gen F al menos una primera modificación genética y en su gen P al menos una segunda modificación genética, en donde mediante la primera modificación genética reemplaza la secuencia de nucleótidos codificante de un sitio de escisión de la proteasa SeV-WT por una secuencia de nucleótidos codificante de un sitio de escisión de la proteasa ubicua, y en el que, mediante la segunda modificación genética, la secuencia de nucleótidos codificante de al menos una de las proteínas accesorias, no estructurales, codificadas por el gen P se modifica de tal manera que al menos una de las proteínas accesorias no estructurales está destruida funcionalmente.

Description

DESCRIPCIÓN

Virus Sendai genéticamente modificado para el tratamiento de enfermedades tumorales

La presente invención se refiere a un virus Sendai modificado genéticamente, a una composición farmacéutica que presenta este virus Sendai, al uso de un virus Sendai modificado genéticamente para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad tumoral y a un procedimiento para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad tumoral.

Visto estadísticamente, uno de cada tres europeos desarrollará cáncer en su vida. En Alemania, alrededor de 395.000 personas enferman de cáncer cada año, de ellas alrededor de 195.000 mujeres y 200.000 hombres. La mayoría de los casos se manifiestan en una edad superior a los 60 años.

Los tumores sólidos continúan planteando grandes desafíos a la oncología clínica. Se puede lograr una mejora significativa en el pronóstico de las enfermedades tumorales individuales casi exclusivamente mediante la introducción de nuevos principios terapéuticos integrados en conceptos multimodales.

Uno de estos nuevos principios terapéuticos se relaciona con el uso de virus replicantes para tratar tumores. Este enfoque se conoce como viroterapia u oncólisis. Numerosos virus poseen propiedades oncolíticas con replicación preferencial en diferentes células tumorales en comparación con la replicación reducida en células parenquimatosas sanas. Actualmente se están ensayando varios agentes viroterapéuticos en varios estudios clínicos.

Son de especial interés los virus de la familia Paramyxoviridae. Miembros importantes de esta familia de virus con envoltura se relacionan con el virus de la enfermedad de Newcastle, que pertenece al género de los avulavirus, el virus del sarampión, que pertenece al género de los morbilivirus, y el virus Sendai, que pertenece al género de los respirovirus.

Los paramixovirus presentan como genoma un ARN monocatenario negativo, es decir, una molécula de ARN que codifica genes o bien marcos de lectura abiertos ("Open Reading Frames"; ORF) en el modo de antisentido. En el caso del virus Sendai, una región de la cabeza 3' del genoma del ARN es seguida por los genes virales N (nucleocápside), P (fosfo), M (matriz), F (fusión), HN (hemaglutinina neuraminidasa) y L (grande), seguido por la región 5' de la cola.

Las proteínas N, P y L son necesarias para la expresión de los genes codificados por el ARN genómico y para la replicación autónoma del ARN. La proteína HN apoya la infección de determinados tipos de células. La llamada proteína de la matriz (M) es una proteína estructural asociada con la membrana en la partícula del virus.

La proteína F juega un papel central en la infección al inducir la fusión de la membrana celular necesaria para la infección inicial y la propagación del virus a las células vecinas. Ésta se sintetiza como un precursor F0 biológicamente inactivo en células infectadas por virus y se ancla en la envoltura lipídica del virus, que se origina en la membrana plasmática de la célula huésped. F0 se escinde en las subunidades activas F1 y F2 por una triptasa "Clara" ubicada en el tracto respiratorio de ratas y ratones y secretada por las células epiteliales bronquiales. F1 y F2 están en condiciones de fusionar las membranas celulares y, con ello, hacer que el virus infecte al huésped. La escisión de F0 representa, por lo tanto, un determinante decisivo para la infectividad y patogenicidad del virus Sendai La restricción de proteasa es un determinante importante por el cual una infección por el virus Sendai en ratones permanece restringida al tracto respiratorio y no puede conducir a una infección sistémica.

Kinoh et al. (2004), Generation of a recombinant Sendai virus that is selectively activated and lysis human tumor cells expressing matrix metalloproteinases Gene Ther. 11, págs. 1137-1145, proponen el uso de un virus Sendai modificado genéticamente para el tratamiento de enfermedades tumorales. El principio de la modificación genética consiste en la introducción de un sitio de escisión artificial en la proteína F viral, que puede ser reconocido y escindido por metaloproteinasas de la matriz específicas para el tumor y, por lo tanto, está destinado a permitir una replicación específica de tumor de los virus modificados. Además, el conocido virus Sendai modificado genéticamente presenta una deleción en la proteína M viral, lo cual conduce a un bloqueo de la liberación de virus de la progenie, de modo que el virus solo puede propagarse a través de contactos célula-célula por fusión. Este virus Sendai modificado también se da a conocer en el documento EP 1505 154.

Kinoh et al. (2009), Generation of optimized and urokinase-targeted oncolytic Sendai virus vectors applicable for various human malignancies, Gene Ther. 16, págs.392-403 describen un virus Sendai genéticamente modificado en el que está presente un truncamiento de aminoácidos en la proteína F viral, con lo cual se ha de aumentar la actividad de fusión. Además, la proteína F viral presenta la denominada "Secuencia Sensible al Activador de Plasminógeno Tipo Uroquinasa (uPA)" (SGRS), mediante la cual se ha de ampliar a una gran cantidad de tumores la capacidad de replicación de los virus mediante una escisión y activación de F0 por proteasas específicas para tumores.

Elankumaran et al. (2010), Type 1 Interferone sensitive recombinant Newcastle-Disease-Virus for oncolytic virotherapy, Journal of Virology, Publicación en línea, sugieren el uso de virus recombinantes de la enfermedad de Newcastle (rNDV) para uso como un agente anti-tumoral, que o bien presentan una mutación en la proteína V y se les denomina "rBC-Edit" o una mutación en la proteína F y se les denomina "rLaSota V.F.".

En el documento US 2009/0175826 se propone el uso de un virus de la enfermedad de Newcastle recombinante (rNDV) como agente oncolítico que presenta un transgén, el cual ha de inducir la apoptosis en líneas de células tumorales.

Sin embargo, los virus oncolíticos descritos en el estado de la técnica aún no se han acreditado. Está pendiente una aplicación clínica con una prueba de eficacia definida. En particular, los virus oncolíticos utilizados hasta ahora en el estado de la técnica presentan la desventaja de que también pueden infectar células no tumorales en gran medida y destruirlas. Además, no está claro en qué enfermedades tumorales se puede lograr un buen efecto de sistemas de virus individuales. Esto hace que los virus oncolíticos utilizados hasta ahora sean inutilizables para uso clínico.

Ante estos antecedentes, es misión de la presente invención proporcionar un virus oncolítico mejorado con el que se eviten en gran medida las desventajas de los virus oncolíticos utilizados hasta ahora. En particular, deben proporcionarse virus oncolíticos que pueden replicarse en células tumorales y destruirlas, pero que se replican en un grado fuertemente limitado en células no tumorales y cumplen así un aspecto de seguridad epidemiológica suficiente.

Este problema se resuelve proporcionando un virus Sendai (SeV) modificado genéticamente que, en comparación con el tipo salvaje (WT), presenta al menos una primera modificación genética en su gen F y al menos una segunda modificación genética en su gen P, por lo que mediante la primera modificación genética, la secuencia de nucleótidos codificante para el sitio de escisión de proteasa SeV-WT se reemplaza por una secuencia de nucleótidos codificante para un sitio de escisión de proteasa ubicuo, y la segunda modificación genética modifica la secuencia de nucleótidos codificante para al menos una de las proteínas accesorias, no estructurales codificadas por el gen P, de manera que al menos una de las proteínas accesorias, no estructurales se destruye funcionalmente.

Se entiende por un "paramixovirus" un virus que pertenece a la familia Paramyxoviridae y un virus que emergió de él a través de propagación. Los paramixovirus comprenden la subfamilia Paramyxovirinae con los géneros respirovirus, rubulavirus, avulavirus y morbilivirus, así como la subfamilia Neumovirinae con los géneros pneumovirus y metapneumovirus. Se pueden encontrar detalles sobre la taxonomía de los paramixovirus, por ejemplo, en Kneipe et al. (2007) Fields Virology, 5a edición, Lippincot Williams & Wilkins.

Como pudieron comprobar los inventores, según esta forma de realización preferida, básicamente cualquier cepa del virus Sendai es adecuada para la modificación según la invención. Cepas importantes, particularmente adecuadas, del virus Sendai son "Fushimi", "Harris", "Z-Strain", "Ohita", "Hamamatsu", "Cantell" y "52".

Los inventores han reconocido por primera vez que una modificación genética del gen F o bien de la proteína F con la supresión de la restricción de proteasa procura la propagación eficaz del virus en el tejido tumoral y, por lo tanto, puede infectarse un amplio espectro de tumores diferentes.

La secuencia de nucleótidos del gen F del virus Sendai se reproduce en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 1 y presenta la ID de Gen 1489775. La secuencia de aminoácidos de la proteína F del virus Sendai se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 2 y presenta los números de acceso a la base de datos BAA 24390.1 o NP_056877.

Los inventores también han reconocido que la segunda modificación genética en el gen P o bien la proteína P atenúa el virus. La modificación o bien mutación genética en el gen P desplaza los marcos de lectura de los genes o bien proteínas C', C, Y1, Y2. La proteína P, por el contrario, permanece completamente intacta.

La secuencia de nucleótidos del gen P del virus Sendai se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 3. La secuencia de aminoácidos de la proteína P se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 4 y presenta los números de acceso a la base de datos BAA 24386.1 y AAB 06279.

El gen P codifica diversas proteínas accesorias no estructurales con las designaciones C', C, Y1, Y2, V y W. Estas proteínas se crean mediante marcos de lectura solapantes y "edición de ARN". Las funciones exactas de las proteínas accesorias no estructurales aún no se han aclarado completamente en detalle, aunque se supone que pueden interactuar en la interacción con el sistema de defensa inespecífico de las células infectadas, tal como, por ejemplo, el sistema de interferón.

A diferencia de los virus de tipo salvaje, los paramixovirus modificados de acuerdo con la invención son capaces de replicarse independientemente en el tejido tumoral y destruirlo, sin que se observe restricción alguna a un tipo específico de células tumorales. Sorprendentemente, sin embargo, el virus según la invención solo es capaz de replicarse en un grado muy limitado en células no tumorales, por ejemplo, hepatocitos o fibroblastos humanos primarios. En consecuencia, el virus según la invención infecta las células tumorales sobre las células no tumorales con una preferencia muy alta. Daños al tejido normal se reducen significativamente, mientras que aumenta la amplitud terapéutica del virus.

Según la invención, se entiende por "modificación genética" un cambio preferentemente preestablecido en el genoma, la información genética o bien las proteínas codificadas del paramixovirus según la invención en comparación con el tipo salvaje, que puede introducirse, por ejemplo, por mutagénesis dirigida.

Según un perfeccionamiento preferido, la primera modificación genética se diseña de tal manera que resulta en una expansión del tropismo.

Esta medida tiene la ventaja de que el virus según la invención se vuelve independiente de proteasas específicas que, por ejemplo, solo se expresan en unos pocos tejidos o células tumorales. Así, por ejemplo, el virus Sendai de tipo salvaje depende de una triptasa que solo es expresada en las células epiteliales bronquiales y, por lo tanto, solo puede infectar estas células. El virus descrito en Kinoh et al. (2009; loc. cit.) es dependiente de la metaloproteinasa de matriz (MMP) y, por lo tanto, solo puede infectar células tumorales que expresan MMP. El virus perfeccionado según la invención, por el contrario, es capaz de infectar y lisar todas las células tumorales debido a la primera modificación genética en el gen F.

Según otra ejecución preferida, la segunda modificación genética se diseña de tal manera que da como resultado una restricción del tropismo.

Esta medida tiene la ventaja de que aumenta la seguridad de los virus y se reducen significativamente los efectos secundarios. El virus de acuerdo con la invención lisa selectivamente las células tumorales, por el contrario, las células sanas no lo hacen o solo lo hacen en una medida muy limitada. Los inventores han reconocido que, a través de una modificación genética preestablecida del gen P, es decir, una proteína no estructural, el modo de reacción de la célula que se ha de lisar se puede influir de tal manera que el virus se replica de manera determinada en las células tumorales. Este enfoque difiere del descrito por Kinoh et al. (2009; loc. cit.), en el que las partículas virales completas ya no pueden sintetizarse debido a una deleción del gen M, que codifica una proteína estructural. Sin embargo, la actividad de lisis también se ve afectada. Con el virus de acuerdo con la invención, ésta es sorprendentemente muy alta, limitado a las células tumorales.

Según la invención, mediante la primera modificación genética en el gen F, la secuencia de nucleótidos codificante para el sitio de escisión de la proteasa SeV-WT, que presenta la secuencia de aminoácidos VPQSR (SEQ ID N°5), se intercambia por una secuencia de nucleótidos codificante para un sitio de escisión de proteasa ubicua, preferiblemente a partir del gen F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), que presenta la secuencia de aminoácidos RRQKR (SEQ ID N26).

Mediante la modificación según la invención del sitio de escisión de la proteasa SeV-WT proteolítico en la proteína F se elimina la restricción de proteasa del tipo salvaje. La proteína F ahora puede ser escindida por proteasas ubicuas, como resultado de lo cual se logra una independencia de ciertas proteasas, eventualmente solo localizadas en el tracto respiratorio de ratones o pero también de proteasas productoras de tumores. Por lo tanto, el virus modificado genéticamente se puede emplear para un espectro más amplio de tumores, por lo que el riesgo de desarrollo de resistencia se reduce significativamente.

Según la invención, como resultado de la segunda modificación genética en el gen P, la secuencia de nucleótidos codificante de al menos una de las proteínas accesorias no estructurales codificadas por el gen P se modifica de tal manera que se destruye funcionalmente.

Estas medidas tienen la ventaja de que el virus modificado genéticamente según la invención está atenuado de tal manera que se restringe claramente la replicación en células no malignas y, por lo tanto, la infección de tejido sano. Los virus de acuerdo con la invención infectan, por consiguiente, las células tumorales de una manera más determinada y pueden lisarlas.

En este caso, se prefiere que las proteínas no estructurales accesorias se seleccionen del grupo que consiste en: C', C, Y1, Y2, V y W, siendo preferido que mediante la segunda modificación genética en el gen P estén modificadas o bien funcionalmente destruidas al menos las C'/C e Y1/Y2, más preferiblemente al menos las proteínas C'/ C, V y W, más preferiblemente al menos las proteínas C'/C, V, W e Y1/Y2.

Como pudieron establecer los inventores en un sistema modelo, los virus modificados de esta manera presentan una selectividad particularmente alta para las células tumorales y una replicación particularmente mala en células no tumorales.

La secuencia de nucleótidos del gen C' del virus Sendai se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 7 y presenta la ID de Gen AB005796.1. La secuencia de aminoácidos de la proteína C' del virus Sendai se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 8 y presenta el número de acceso a la base de datos BAA 24394.

La secuencia de nucleótidos del gen C del virus Sendai se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 9. La secuencia de aminoácidos de la proteína C del virus Sendai se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 10 y tiene el número de acceso a la base de datos BAA 24396.

La secuencia de nucleótidos del gen V del virus Sendai se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 11. La secuencia de aminoácidos de la proteína V del virus Sendai se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 12 y presenta el número de acceso a la base de datos BAA 20021.

La secuencia de nucleótidos del gen W del virus Sendai se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 13. La secuencia de aminoácidos de la proteína W del virus Sendai se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 14 y presenta el número de acceso a la base de datos AAX07444.

La secuencia de nucleótidos del gen Y1 del virus Sendai se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 15. La secuencia de aminoácidos de la proteína Y1 del virus Sendai se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 16 y tiene el número de acceso a la base de datos BAA 24388.

La secuencia de nucleótidos del gen Y2 del virus Sendai se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 17. La secuencia de aminoácidos de la proteína Y1 del virus Sendai se muestra en el listado de secuencias adjunto bajo SEQ ID N° 18 y tiene el número de acceso a la base de datos AAX07449.

Según un perfeccionamiento preferido, el virus según la invención presenta al menos un transgén en comparación con el tipo salvaje (WT), preferiblemente un gen suicida u otros genes que inducen la muerte celular o estimulan el sistema inmune.

Esta medida tiene la ventaja de que la citotoxicidad del virus según la invención para las células tumorales aumenta de nuevo, porque el producto del transgén contribuye adicionalmente a una destrucción reforzada de las células tumorales infectadas. También se incluyen transgenes con un efecto antitumoral.

Ante estos antecedentes, otro objeto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el paramixovirus modificado genéticamente según la invención, así como un soporte farmacéuticamente aceptable. Soportes farmacéuticamente aceptables se describen de forma exhaustiva en el estado de la técnica, por ejemplo en Bauer et al. (1999), Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, Kibbe et al. (2000) Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press. El contenido de las publicaciones antes mencionadas es el objeto de la presente divulgación. Se entiende que la composición farmacéutica puede presentar otros coadyuvantes y principios activos, tales como, por ejemplo, citostáticos.

Otro objeto de la presente invención se refiere al uso del paramixovirus modificado genéticamente según la invención para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad tumoral, preferiblemente una enfermedad de un tumor sólido, más preferiblemente una enfermedad del carcinoma hepatocelular.

Con alrededor de un millón de casos nuevos por año, el carcinoma hepatocelular representa una de las neoplasias malignas más comunes en todo el mundo. La terapia curativa mediante resección o trasplante de hígado solo es posible en unos pocos casos. Hasta ahora, hay una falta de conceptos convincentes de terapia alternativa, ya que existe una pronunciada resistencia a todos los agentes quimioterapéuticos testados hasta ahora. La invención proporciona aquí un remedio eficaz.

Otro objeto de la presente invención se refiere a un procedimiento para producir una composición farmacéutica para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad tumoral, preferiblemente una enfermedad de un tumor sólido, más preferiblemente una enfermedad del carcinoma hepatocelular, que presenta las siguientes etapas: (1) proporcionar el virus Sendai modificado genéticamente de la invención y (2) formular el virus Sendai modificado genéticamente en un soporte farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se explicará ahora con más detalle sobre la base de ejemplos de realización, de los que resultan otras características, ventajas y propiedades de la invención. Se hace referencia a las figuras adjuntas, en las que se representa lo siguiente:

Fig. 1 muestra la estructura genómica del virus Sendai;

Fig. 2 muestra la estructura del plásmido pSVV10 con el ADNc del virus Sendai;

Fig. 3 muestra los marcos de lectura abiertos (ORFs) de los genes accesorios no estructurales en el gen P;

Fig. 4 muestra la subclonación en el vector de clonación pSL1180;

Fig. 5 muestra el principio de mutagénesis por PCR;

Fig. 6 muestra el esquema del cebador para comprobar las mutaciones tras la mutagénesis por PCR;

Fig. 7 muestra el paso 1 de la reclonación, en el que el fragmento Sphl-EcoR mutado se separó por corte del vector de clonación pSL1180 Sph1-Eco pSVV10 y se clonó en un vector de virus Sendai pVV13;

Fig. 8 muestra el paso 2 de la reclonación; en el vector pSVV13, que carece de los ORFs para M, F, HN; esta zona se clonó con el sitio de escisión F modificado de pRS Id-E Fm a través de EcoRI; los vectores resultantes contenían la región P/C mutada y un sitio de escisión F ubicuo de NDV;

Fig. 9 muestra la replicación de los virus según la invención en células productoras de Vero y células de hepatoma (Hep3B, HuH7, PLC/PRF/5);

Fig. 10 muestra la replicación de los virus según la invención en células no tumorales (MRC-5, fibroblastos humanos; PHH, hepatocitos humanos primarios);

Fig. 11 muestra la multiplicación de los virus según la invención in vivo.

Ejemplos de realización

1. Estructura genómica de los virus Sendai

Los virus Sendai son virus de ARN de cadena negativa con un genoma de aproximadamente 15 kb. La estructura genómica se representa en la Fig. 1. Los genes de las seis proteínas estructurales se encuentran en el ARN genómico viral en la secuencia 3'-N-P-M-F-HN-L-5'. La región conductora (Id) que abarca 54 nucleótidos está ubicada delante del primer gen y detrás del último gen sigue la región de cola (tr) de 57 nucleótidos de longitud . Los números debajo de cada uno de los genes corresponden a la longitud del gen en pb. Para la transcripción de un solo gen, la polimerasa viral inicia la síntesis del ARNm en una secuencia conservada en el extremo 3', que se designa como motivo de inicio del gen (GS), seguido de una región no traducida (UTR), el marco de lectura abierto (ORF) del gen viral, y en última instancia el motivo de fin de gen (GE) en el que se detiene la síntesis de ARNm. Un motivo intergénico conservado (I) de 3 pb, que no se incorpora al ARNm, se encuentra entre dos unidades de expresión.

La base de la invención la forma el denominado plásmido pSVV10, más precisamente el plásmido pSVV10IdGFPMFHN con un tamaño de 19.774 pb, que codifica el ADNc del virus Sendai de la cepa Fushimi, ATCC VR-105. El plásmido se representa en la Fig. 2.

2. Representación detallada de las proteínas accesorias codificadas en el gen P.

Las proteínas accesorias C', C, Y1, Y2, V y W del virus Sendai son codificadas en el gen P. Los ORFs de las proteínas C e Y se desplazan en 1 base. Las proteínas V y W surgen dependiendo del número de proteínas G insertadas en el denominado sitio de edición (ES). La región de la secuencia P-ORF con los genes accesorios se muestra en la Fig. 3. en donde los números se refieren a la información en el vector PSVV10.

3. Subclonación en el plásmido de mutagénesis

Se realizó una mutagénesis por PCR para insertar mutaciones puntuales en los genes de las proteínas accesorias. No obstante, para este método solo se pueden usar plásmidos con un tamaño máximo de 8 kb. La región P/V/C del genoma del virus Sendai se determinó a partir del vector pSVV10 del virus Sendai (19774 pb) mediante las enzimas de restricción EcoRI y Sphl subclonado en el vector de clonación pSL1180 (3422 pb). Para ello, se utilizaron los dos vectores pSVV10 (Fig. 2) y pSL1180 digeridos con las enzimas EcoRI y Sphl y la región a mutar de pSVV10 (2254 pb) ligada con la cadena principal del vector de sPL1180 (3303 pb). El plásmido de clonación resultante pSL1180 SphI-Eco pSVV10 tiene un tamaño de 5557 pb; véase la Fig, 4.

4. Mutagénesis

Mediante mutación preestablecida se ha de prevenir la transcripción de los genes accesorios C', C, Y1 e Y2. Una mutación en el sitio de edición también significa que ya no se puede realizar la edición. La siguiente descripción general muestra la zona de clonación relevante de pSL1180 con todos los inicios de genes y el sitio de edición (SEQ ID NO. 19):

ACG GCTTCGGCTACACTTACCGC ATG 1GATCAAG^A T¿|CCTTCATTCTTAAAGAAGATTCTGAAGTTGAGAGG|GAG

G CGCCAGGAGGAAGAGAGTCGCTCTCGG ATG TTATCGGATTCCTCG ATG CTGTCCTGTCG AGTG A ACCAACTG ACA

TCGGAGGGGACAGAAGCTGGCTCCACAACACCATCAACACTCCCCAAGGACCAGGCTCTGCCCATAGAGCCAAAAGT GAG GGCGAAG GAG AAGTCTCAACACCGTCG ACCCAAGATAATCG ATCAGGTGAG GAGAG TAGAG TCTCTGG GAGAA CAAGCAAGCCAGAGG CAG AAGCACATGCTGG AAACCTTGATAAACAAAATATACACCGG GCCTTTG GGG GAAGAACT GGTACAAACTCTGTATCTCAGGATCTGGGCGATGGAGGAGACTCCGGAATCCTTGAAAATCCTCCAAATGAGAGAGG ATATCCGAGATCAGGTATTG AAGATG AAAACAGAGAG ATGG CTGCGCACCCTGATAAGAG GGG AGAAGACCAAGCT GAAGGACTTCCAGAAG AGGTACG AGGAG GTACATCCCTACCTG ATGAAG GAGAAGGTGGAG CAAG TAATAATGGAA GAAGCATGGAGCCTGGCAGCTCACATAGTGCAAGAG CTGGGGTCCTGGTGATTCCTAGCCCCGAACTCGAAGAG GCTGTGCTACGGAGGAACAAAAGAAGACCTACCAACAGTGGGTCCAAACCTCTTACTCCAGCAACCGTGCCTGGCACC CGGTCCCCACCGCTGAATCGTTACAACAGCACAGGGTCACCACCAGGAAAACCCCCATCTACACAGGATGAGCACATC AACTCTGGGGACACCCCCGCCGTCAGGGTCAAAGACCGGAAACCACCAATAGGGACCCGCTCTGTCTCAGATTGTCCA

g c c a a c g g c c g c c c a a t c c a c c c g g g t c t a g a g a c c g a c t {cCAAC AAAA A A G G GC ATAG G AG A G A ACA CATCATCTA

[tg |a a a g a g a t g g c t a c a t t g t t g a c g a g t c t t g g t g t a a t c c a g t c t g c t c a a g a a t t c g a g t c a t c c c g a g a c g c g a GTTATGTGTTTGCAAGACGTGCCCTAAAGTCTGCAAACTATGCAGAGATGACATTCAATGTATGCGGCCTGATCCTTTC TG CCGAG AAATCTTCCGCTCGTAAGGTAGATGAGAACAAACAACTGCTCAAACAGATCCAAGAGAGCGTGGAATCATT CCGGGATATTTACAAGAGATTCTCTGAGTATCAGAAAGAACAGAACTCATTGCTGATGTCCAACCTATCTACACTTCAT ATCATCACAGATAGAGGTGGCAAGACTGACAACACAGACTCCCTTACAAGGTCCCCCTCCGTTTTTGCAAAATCAAAA GAG AACAAGACTAAGGCTACCAGGTTTGACCCATCTATGGAGACCCTAGAAGATATGAAGTACAAACCGGACCTAATC CGAGAGGATGAATTTAGAGATGAGATCCGCAACCCGGTGTACCAAGAGAGGGACACAGAACCCAGGGCCTCAAACG CATCACGCCTCCTCCCCTCCAAAGAGAAGCCCACAATGCACTCTCTCAGGCTCGTCATAGAGAGCAGTCCCCTAAGCAG AGCTGAGAAAGCAGCATATGTGAAATCATTATCCAAG TGCAAGACAGACCAAGAG GTTAAGGCAGTCATGGAACTCG TAG AAGAGG ACATAGAG TCACTGACCAACTAG

ATG = INICIAR Y1 (DETENER A 647) marco de lectura de P/W/V 1

Se desarrollaron tres cebadores especiales que, por un lado, destruyen funcionalmente las secuencias de inicio de los genes para las proteínas accesorias, pero que, por otro lado, no provocan cambio alguno de aminoácidos en el marco de lectura P.

Cebador 1 (SeV C.ko):

5' CGCATGGATCAAGACGCCTTCATTCTAAAAGAAGATTCTGAAGTAGAGAGG 3 '(SEQ ID N° 20) P-aminoácidos inalterados:

Asj) le u Val

Seq. P Orig.: C3C ATCGATCAA^GCCnCAri£T¡]AAA6AAGAI fCIGAA êAOAGG (SEQ ID N221)

Cebador 2 (SeV Yko):

5' CTCTCGGACGTTATCGGATTCCTCGACGCTGTCCTG 3 '(SEQ ID N224)

P-aminoácidos inalterados:

Y-aminoácidos mutados:

INICIO INICIO

Secuencia orig ina l C TCTCGG¡ftTGjTTATCG GATTCC ~CG ¡ATGjCTG TCCTG (SEQ ID N526)

Cebador 3 (SeV Vko):

5' GACTCAACAAAGAAAGGCATAGGTGAGAACACATCATCTATG 3 '(SEQ ID N228)

P-aminoácidos inalterados:

Lys Lyí Gly

Seq. P Orig.: gactcaacâ £ a¿|ggc aia^ gagaacacaicatctato (SEQ ID N® 29)

Seq. Prim.: GAl lC A A fA ^E ¡A «.C A ,A^7tAGAACACATCATCr ato (SEQ ID N530)

Lys Lys Gly

Aminoácidos mutados de V y W:

lys lys G a r r e

Secuencia Vmodrfxada:GAC ^{ic a}« C A ^ iíAÁocQcA^AOOif-GAC.aACACAleatctato (5EQ ID N< 31)

|«1CI lys lys G H R PARADA

lys Lys G A PARADA

^{Secuencia W r o a f f e a d a : SAC *C A ACA EvAGÍ A M GGG GCA TAC |g}7^{¿| AGA ACA CAT CAT C IA IS fS E Q I D N ?}32 ⁾

!*2G)

Se produjeron las siguientes mutaciones con los cebadores en la mutagénesis por PCR: Mutaciones deseadas:

desconectar C v C: desconectar Y1 e Y2: desconectar s it io edición:

Sitio Edición^,

El "QuickChange Multi Site Directed Kit" de la razón social Stratagene® permite la inserción preestablecida de mutaciones puntuales en plásmidos de hasta 8 kb de tamaño en tres pasos sucesivos. En el primer paso, los cebadores de apareamiento erróneo dados para la reacción, que contienen mutaciones puntuales individuales, se unen a la cadena única desnaturalizada del molde. En este caso, se ha de tener en cuenta que todos los cebadores se unan a la misma cadena del molde. La PfuTurbo-polimerasa prolonga la secuencia complementaria desde los cebadores sin desplazar a los cebadores. La cadena de ADN recién generada contiene ahora las mutaciones y los distintos extremos colgantes, las denominadas "muescas", que son desplazadas apropiadamente por los componentes de la mezcla de enzimas.

En el segundo paso tiene lugar la digestión con Dpnl, por lo que se digiere específicamente ADN metilado y hemimetilado. Dado que los plásmidos que se encuentran en Escherichia coli se incrementaron, están dam metilados, solo se digiere el molde parental, pero no las copias resultantes de la PCR que contienen las mutaciones.

En el último paso, el ADNsc se transforma en células ultracompetentes XL10-Gold y allí se convierte in vivo en ADNdc. Los plásmidos pueden entonces aislarse de las bacterias y analizarse en busca de mutaciones insertadas mediante secuenciación. El principio de la mutagénesis por PCR se muestra en la Fig. 5,

El enfoque de mutagénesis se compone de la siguiente manera (Tabla 1):

Tabla 1: Enfoque de la mutagénesis por PCR de SeV para la generación de virus Sendai recombinantes con deleciones parciales en las proteínas accesorias

Componentes Vko Cko / Yko Cko / Yko / Vko 10 x Tampón de cambio rápido 2,5 pl 2,5 pl 2,5 pl

Solución rápida 0,75 pl 0,75 pl 0,75 pl

Mezcla de dNTP 1 Pl 1 Pl 1 pl

Mezcla de enzimas QuickChange Mutli 1 Pl 1 Pl 1 pl

Plásmido 100 ng 100 ng 100 ng

Cebador SeV Vko 0,9 pl - 0,9 pl

Cebador SeV Cko - 0,9 pl 0,9 pl

Cebador SeV Yko - 0,9 pl 0,9 pl

H2O hasta 25 pl hasta 25 pl hasta 25 pl

La mutagénesis por PCR es similar a una PCR convencional, solo que el tiempo de extensión es muy largo porque el vector completo tiene que complementarse y, por consiguiente, varía para cada uno de los vectores: dos minutos por kb; aquí: pSL1180 fragmento Eco-SphI de pSVV10 ~5,5 kb corresponde a una extensión de 11 minutos; véase la Tabla .2:

Tabla 2: Programa de mutagénesis por PCR

Mutagénesis por PCR

Activación de poiimerasa 95 01:00 mln

Desnaturalización 95 "C 01: OOmin

Reasociación 55 "C

Extensión (dependiente del molde) 65 °C 01: OOmin 35 ciclos

Extensió 72 *C 11: OOmin

4 'C 10:00 min

*

Directamente después de la amplificación, 1 pl de enzima de restricción Dpnl (10 U/pl) se añadió a la tanda de PCR, se resuspendió con la pipeta, se centrifugó brevemente y se digirió a 37°C durante una hora. El ADNcs resultante se transformó en células ultracompetentes XL10-Gold y se aisló de las bacterias mediante Miniprep como un plásmido mutado de ADNdc; véase la Tabla 3:

Tabla 3: Secuencia modificada por mutagénesis; * Kurutani et al. Genes to Cells, 1998 $ Gotoh et al. FEBS letters, 1999

C INICIO C INICIO C-PARADA C-PARADA

WT // ACG - // - / - ATG - / - - / - TTA - / - - / - TTG - //

c y c (-) -C- -A- -A-Kurotani * -A- -A-Gotoh$ G-- -A- -A-

Y1 INICIO Y2 INICIO

WT // ATGTTA - / / ................. / -ATG - //

Y1 e Y2 (-) -C- -C-Kurotani * -C - A- -C-Gotoh$ -C - A- -C-

Sitio edición ko PARADA PARADA

WT // ACAAAAAAG GGC ATA GGA GAG

Sitio edción --G - - A - T

1G -TGA-

2G -TGA-

Kurotani *

Gotoh$ --G- - A

5. Secuenciación

Los plásmidos mutados resultantes se verificaron para la correcta inserción de las mutaciones mediante secuenciación. Un esquema de cebador con la cobertura de la región de mutación completa se muestra en la Fig, 6. Los números superiores se refieren a datos de las posiciones en el vector original pSVV10 (~19 kb), los números inferiores se refieren a datos de las posiciones en el vector de clonación pSL1180 pSVV10 (5,5 kb).

6. Reclonación de las secuencias mutadas en un vector que codifica el virus Sendai completo

La región de secuencia mutada tuvo que reclonarse de nuevo en un vector con la secuencia de ADNc completa del virus Sendai. Dado que se debían producir virus que deberían tener un sitio de escisión F ubicuo en lugar del sitio de escisión que solo puede ser activado por la triptasa "Clara" en el tracto respiratorio de los roedores, la región Eco-Eco se derivó del vector pRS Id-EGFP Fmut (19958 pb, Sascha Bossow, MPI Munich). En lugar del sitio de escisión en la proteína F del virus Sendai con la secuencia de nucleótidos (GTTCCACAGTCGAGA; SEQ ID N° 33), éste contiene un sitio de escisión ubicuo para la proteína F del virus de la enfermedad de Newcastle con la secuencia (CGTCGTCAGAAGAGA; SEQ ID N234).

Los diferentes fragmentos Sphl-EcoRI mutados se cortaron primeramente del vector de clonación pSL1180 Sph1-Eco pSVV10 y se clonaron en un vector de virus Sendai pSVV13, que es similar al vector pSVV10, pero que carece de las regiones para el gen F y el gen HN. Las regiones ausentes para el gen F y el gen HN con el sitio de escisión modificado en el gen F de pRS Id-EGFP Fut se clonaron luego a través de EcoRI. Los vectores resultantes se denominaron pSeVmut. Los virus Sendai funcionales se producen con ayuda del método de "rescate" transfectando células BSR-T7. El paso 1 de la reclonación se representa en la Fig. 7 y el paso 2 de la reclonación se representa en la Fig. 8.

7. Producción de virus Sendai recombinantes

Mediante el método de "rescate" de Paramyxoviridae es posible producir virus modificados genéticamente. Para ello, se cotransfectaron células BSR-T7, que expresan constitutivamente la ARN polimerasa de T7, mediante lipofección con plásmidos auxiliares y plásmidos que codifican el ADNc del virus Sendai. Los plásmidos que se encuentran bajo un promotor T7 se transcriben en la célula, de modo que proteínas virales y genomas de ARN de cadena negativa viral se forman a través de varios pasos y surgen virus funcionales.

Células BSR-T7 (3x105 por pocillo de una placa con seis pocillos) se sembraron y cultivaron durante la noche a 37 °C. Para la transfección, se dispusieron 200 pl de DMEM con FuGENE 6 en un tubito (la cantidad de Fugene 6 correspondía a una proporción de 2 pl por pg de ADN) y se incubó durante cinco minutos. Después de agregar los componentes de ADN enumerados en la Tabla 4, se llevó a cabo otra etapa de incubación durante 25 minutos a temperatura ambiente.

Tabla 4: Componentes del ADN de un enfoque de "rescate"

Componente Cantidad de ADN

ADNcde SeV 7,5 M9

pTM-N 250 ng

pTM-P / C- 150 ng

pTM-L 50 ng

Las células BSR-T7 se lavaron dos veces con DMEM; luego se dispusieron 1,8 ml de medio DMEM FCS al 2%. La mezcla de transfección incubada se añadió gota a gota con agitación y las células se incubaron durante tres días a 33 °C. A continuación, las células BSR-T7 transfectadas se lavaron tres veces con 1 ml de DMEM cada vez para eliminar los residuos de plásmido. Se añadió 1 ml de medio reciente DMEM FCS al 2% a cada una de las tandas y los virus recién formados se recolectaron después de un día.

Antes de transferir a células Vero para su multiplicación, el sobrenadante que contenía virus se centrifugó a 300 rpm durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Células Vero preparadas con cuatro días de anticipación (disposición: 2x105 células por placa de 3,5 cm; Teórico: aprox. 106 células por placa de 3,5 cm el día de la infección) se lavaron dos veces con DMEM y se infectaron con 100 a 500 pl de sobrenadante BSR-T7 (hasta 500 pl de volumen de adsorción con medio de cultivo) durante una hora a 33 °C (cada 15 minutos) . Se retiró el inóculo, las células se lavaron dos veces con DMEM y se incubaron en 1 ml de medio de cultivo durante dos a cinco días a 33 °C con cambios diarios de medio. Tan pronto como el eGPF fue visible como una proteína marcadora codificada por virus en el microscopio de fluorescencia, se retiró el sobrenadante del cultivo. Con este pasaje de virus inicial, se produjeron otros pasajes (pasajes dos y tres) a mayor escala. Los títulos de la progenie del virus se cuantificaron mediante el método TCID⁵⁰cuantificado.

Se produjeron los siguientes virus Sendai genéticamente modificados o recombinantes según la invención:

a) SeV Fmut: cepa Fushimi del virus Sendai con sitio de escisión del NDV

b) SeV Fmut dV: como a, adicionalmente con mutaciones en los genes V y W

c) SeV Fmut dC: como a, adicionalmente con mutaciones en los genes C y C'

d) SeV Fmut dCdY: como a, adicionalmente con mutaciones en los genes C y C' y en los genes Y1 e Y2 e) SeV Fmut dCdV: como a, adicionalmente con mutaciones en los genes C y C', genes V y W

f) SeV Fmut dCdYdV: como a, adicionalmente con mutaciones en los genes C y C', genes V, W e Y1 e Y2

8. Caracterización de los virus Sendai recombinantes

Los virus Sendai recombinantes producidos se han caracterizado extensamente en varios niveles. Así, la replicación del virus se examinó en células productoras de Vero no transformadas, así como en células tumorales, especialmente en células de hepatoma (Hep3B, HuH7, PLC/PRF/5), así como en otras células no tumorales, tal como la línea celular de fibroblastos humanos MRC-5 y hepatocitos humanos primarios (PHH) de diferentes donantes.

Curvas de crecimiento

1. Disponer 1x105 células por 12 pocillos en 500 pl (se suministran Vero, células de hepatoma, MRC-5, PHH, asimismo partiendo de 1x105 células )

2. Permitir que crezca ÜN

3. Retirar el medio, lavar 1 vez con PBS

4. 250 pl de Optimem

5. Diluir virus en Optimem (MDI 0,05)

6. Agregar el virus diluido a las células

7. Infectar con las 6 variantes de SeV (congelar el resto de las diluciones y titular como valor inicial)

8. Infectar 1 h a 37 °C

9. Lavar 2 veces las células (PBS)

10. 1 ml de medio reciente (DMEM FCS al 5%)

11. Después de 24, 48, 72 h, 96 h (en cada caso después del inicio de la infección) retirar los virus del ÜS y almacenar a -80 °C (en cada caso 200 Ml)

a. Lavar 2 veces con cuidado con medio

b. 1000 ml de medio (DMEM FCS al 5%), raspar las células que contiene

12. Congelar lisados a -80 °C

13. Descongelar para titulación

a. 2 min en baño María a 37 °C

b. Agitar en vórtice durante 10-15 s

c. 2 minutos 3000 x g centrífuga pequeña

14. Centrifugar

15. Titulación en Veros (TCID⁵⁰)

d. Preparar diluciones de virus (la primera fila siempre sin diluir)

e. Agregar a placas de 96 pocillos (siempre colocar la placa nueva a 4 °C)

f. Tripsinizar las células

g. Contar y agregar 2x104 células / 96 pocillos

h. Evaluar el título después de 3 días.

En la Fig. 9 se muestra la replicación del virus en las células productoras de Vero y las células de hepatoma. En este caso se muestra una replicación extremadamente buena en las células productoras de Vero con títulos equiparables para todos los virus recombinantes generados con un rendimiento de virus entre 107 y 108 TCIDsü/ml.

La titulación de las partículas de virus se repitió en tres experimentos independientes, se indican el valor medio y la desviación estándar (IO = inóculo).

En las tres líneas celulares estándar humanas para el carcinoma hepatocelular HuH7, PLC/PRF/5 y Hep3B, se pudo demostrar que todos los virus recombinantes presentan una replicación extremadamente buena en las células tumorales. Se cumple, por consiguiente, un requisito previo decisivo para una actividad oncolítica relevante de los virus recombinantes según la invención.

Se examinó a modo de ejemplo, la línea celular de fibroblastos humanos MRC-5 y los hepatocitos humanos primarios (PHH) de varios donantes diferentes como células no tumorales. El resultado se muestra en la Fig. 10. En las variantes examinadas, la intensidad de la oncólisis depende de las deleciones en las proteínas accesorias. Los virus con una única deleción (SeV V Fmut dC, SeV V Fmut dV) perdieron solo moderadamente su capacidad para replicarse en células normales, mientras que los virus con dos o más deleciones (SeV Fmut dCdY, SeV Fmut dCdV, SeV Fmut dCdYdV) fueron eficaces ciertamente en células de hepatoma, es decir, células tumorales, y las destruyen, pero apenas se pueden observar infecciones en células normales.

La titulación de las partículas de virus se repitió en tres experimentos independientes (tres donantes diferentes en el caso de PHH). Se indican el valor medio y la desviación estándar (IO = inóculo).

En otro experimento, se examinó in vivo la propagación del virus.

1. A ratones Balb c nu / nu se les implantaron por vía subcutánea debajo del flanco derecho 5x106 células tumorales HuH7 2. Cuando se alcanza un volumen del tumor de al menos 100 mm3 se aplicó por vía intratumoral el virus Sendai en 100 Ml de PBS.

3. 2 días después de la inyección del virus, se sacrificaron los animales y se extirparon los tumores.

4. Una parte de los tumores se embutió en Tissue Tack, se congeló y se seccionaron con un criotomo. La GFP expresada por el virus se detectó directamente en el microscopio de fluorescencia.

5. Otra parte de los tumores se embutió en parafina y se detectó GFP con anticuerpos específicos anti GFP.

El resultado se representa en la Fig, 11. Pudo detectarse in vivo que las células tumorales son infectadas por el virus recombinante SeV Fmut y el virus es capaz de propagarse allí. Este hallazgo confirma que la replicación in vivo fuera de los pulmones, según se desea, es posible en el tejido tumoral. Los virus SeV Fmut son capaces de multiplicarse en tejido de xenoinjerto de hepatoma humano (HuH7), los virus D52 (variantes de tipo salvaje “Fushimi”) permanecen muy localizados después de la aplicación del virus intratumoral.

9. Conclusión

Con ayuda de diversos virus Sendai recombinantes, que han sido modificados genéticamente en su gen F y su gen P en comparación con el tipo salvaje, los inventores pudieron demostrar que estos pueden usarse como virus oncolíticos en terapia antitumoral.

Se enumeran las siguientes secuencias:

SEQ ID N° 1: Secuencia de nucleótidos del gen F de SeV (cepa "Ohita")

SEQ ID N° 2: Secuencia de aminoácidos de la proteína F de SeV (cepa "Ohita")

SEQ ID N° 3: Secuencia de nucleótidos del gen P de SeV (cepa "Ohita")

SEQ ID N° 4: Secuencia de aminoácidos de la proteína P de SeV (cepa "Ohita")

SEQ ID N° 5; Secuencia de aminoácidos del sitio de escisión de la proteasa SeV-WT

SEQ ID N° 6: Secuencia de aminoácidos del sitio de escisión de la proteasa de la proteína F de NDV

SEQ ID N° 7: Secuencia de nucleótidos del gen C' de SeV (cepa "Ohita")

SEQ ID N° 8: Secuencia de aminoácidos de la proteína C' de SeV (cepa "Ohita")

SEQ ID N° 9: Secuencia de nucleótidos del gen C de SeV (cepa "Ohita")

SEQ ID N° 10: Secuencia de aminoácidos de la proteína C de SeV (cepa "Ohita")

SEQ ID N° 11: Secuencia de nucleótidos del gen V de SeV (cepa "Hamamatsu")

SEQ ID N° 12: Secuencia de aminoácidos de la proteína V de SeV (cepa "Hamamatsu")

SEQ ID N° 13: Secuencia de nucleótidos del gen W de SeV (cepa "Cantell")

SEQ ID N° 14: Secuencia de aminoácidos de la proteína W de SeV (cepa "Cantell")

SEQ ID N° 15: Secuencia de nucleótidos del gen Y1 de SeV (cepa "Ohita")

SEQ ID N° 16: Secuencia de aminoácidos de la proteína Y1 de SeV (cepa "Ohita")

SEQ ID N° 17: Secuencia de nucleótidos del gen Y2 de SeV (cepa "52")

SEQ ID N° 18: Secuencia de aminoácidos de la proteína Y2 de SeV (cepa "52")

SEQ ID N° 19: Secuencia de nucleótidos de la región de clonación de pSL1180

SEQ ID N° 20: Secuencia de nucleótidos del cebador 1 de PCR

SEQ ID N° 21: Secuencia de nucleótidos del gen P

SEQ ID N° 22: Secuencia de nucleótidos del gen P mut.

SEQ ID N° 23: secuencia de nucleótidos del gen C mut.

SEQ ID N° 24: Secuencia de nucleótidos del cebador 2 de PCR

SEQ ID N° 25: Secuencia de nucleótidos del gen P

SEQ ID N° 26: Secuencia de nucleótidos del gen Y1

SEQ ID N° 27: Secuencia de nucleótidos del gen Y1 mut.

SEQ ID N° 28: Secuencia de nucleótidos del cebador 3 de PCR

SEQ ID N° 29: Secuencia de nucleótidos del gen P

SEQ ID N° 30: Secuencia de nucleótidos del gen P mut.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Virus Sendai modificado genéticamente (SeV) que, en comparación con el tipo salvaje (WT), presenta en su gen F al menos una primera modificación genética y en su gen P al menos una segunda modificación genética, en donde mediante la primera modificación genética reemplaza la secuencia de nucleótidos codificante de un sitio de escisión de la proteasa SeV-WT por una secuencia de nucleótidos codificante de un sitio de escisión de la proteasa ubicua, y en el que, mediante la segunda modificación genética, la secuencia de nucleótidos codificante de al menos una de las proteínas accesorias, no estructurales, codificadas por el gen P se modifica de tal manera que al menos una de las proteínas accesorias no estructurales está destruida funcionalmente.

2. Virus Sendai genéticamente modificado según la reivindicación 1, caracterizado por que el sitio de escisión de proteasa ubicuo procede del gen F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV).

3. Virus Sendai genéticamente modificado según la reivindicación 1, caracterizado por que el sitio de escisión de la proteasa SeV-WT presenta la secuencia de aminoácidos VPQSR (SEQ ID N° 5) y o el sitio de escisión de la proteasa ubicua presenta la secuencia de aminoácidos RRQKR (SEQ ID N° 6).

4. Virus Sendai genéticamente modificado según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que mediante la segunda modificación genética, al menos una de las proteínas accesorias no estructurales no es se puede transcribir.

5. Virus Sendai genéticamente modificado según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que en al menos una de las proteínas accesorias no estructurales, el codón de inicio está destruido funcionalmente.

6. Virus Sendai genéticamente modificado según la reivindicación 1, caracterizado por que las proteínas accesorias no estructurales se seleccionan del grupo que consiste en: C', C, Y1, Y2, V y W.

7. Virus Sendai genéticamente modificado según la reivindicación 6, caracterizado por que mediante la segunda modificación genética al menos las proteínas C (C y/o C') e Y (Y1 y/o Y2) están modificadas, preferiblemente destruidas funcionalmente.

8. Virus Sendai genéticamente modificado según la reivindicación 6, caracterizado por que mediante la segunda modificación genética al menos las proteínas C (C y/o C'), V y W están modificadas, preferiblemente están destruidas funcionalmente.

9. Virus Sendai genéticamente modificado según la reivindicación 6, caracterizado por que mediante la segunda modificación genética al menos las proteínas C (C y/o C'), V, W e Y (Y1 y/o Y2) están modificadas, preferiblemente están destruidas funcionalmente.

10. Virus Sendai genéticamente modificado según una de las reivindicaciones precedentes, que, en comparación con el tipo salvaje (WT), presenta al menos un transgén, que preferiblemente es un gen suicida u otro gen que induce la muerte celular o un gen inmunoestimulante.

11. Composición farmacéutica que comprende el virus Sendai genéticamente modificado según una de las reivindicaciones 1 a 10 y un soporte farmacéuticamente aceptable.

12. Uso de un virus Sendai modificado genéticamente para producir un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad tumoral, preferiblemente una enfermedad con un tumor sólido, más preferiblemente una enfermedad con un carcinoma hepatocelular, caracterizado por que el virus Sendai modificado genéticamente es el virus Sendai modificado genéticamente según una de las reivindicaciones 1 a 10.

13. Procedimiento para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad tumoral, preferiblemente de una enfermedad con un tumor sólido, más preferiblemente una enfermedad con el carcinoma hepatocelular, que comprende los siguientes etapas:

(1) proporcionar el virus Sendai genéticamente modificado según una de las reivindicaciones 1 a 10, y

(2) formular el virus Sendai genéticamente modificado en un soporte aceptable.