JP2013524798A - 腫瘍性疾患を治療するための遺伝子組み換えパラミクソウイルス - Google Patents
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Abstract
Description
センダイウイルスは、約15kbのゲノムを有するマイナス鎖RNAウイルスである。そのゲノムの構成を図1に示す。6つの構造タンパク質の遺伝子は、3’−N−P−M−F−HN−L−5’の順序でウイルスゲノムRNA上に配置されている。最初の遺伝子の前には54のヌクレオチドを含むリーダー領域(ld)があり、最後の遺伝子の後には57ヌクレオチド長のトレーラー領域(tr)が続く。各遺伝子の下の数字は、bpで表した各遺伝子の長さに相当する。各遺伝子の転写において、該ウイルスのポリメラーゼは、遺伝子開始モチーフ(GS)と呼ばれる、3’末端に位置する保存配列からmRNAの合成を開始し、次いで非翻訳領域(UTR)、ウイルス遺伝子の読み枠(ORF)と進み、最後に遺伝子終止モチーフ(GE)でmRNAの合成を停止する。2つの発現ユニット間には、mRNAには組み込まれない3bpの保存された遺伝子間モチーフ(I)が見られる。
センダイウイルスのアクセサリータンパク質C’、C、Y1、Y2、VおよびWは、P遺伝子によってコードされる。Cタンパク質およびYタンパク質のORFは+1塩基分ずつシフトしている。Vタンパク質およびWタンパク質は、いわゆる編集部位(ES)に挿入されているGタンパク質の数に応じて作製される。アクセサリー遺伝子を有するP−ORF配列領域を図3に示す。数字は、PSVV10ベクター内の位置である。
アクセサリータンパク質の遺伝子に点変異を挿入するために、突然変異誘発PCRを行った。しかしながら、この方法に使用できるのはサイズが8kbまでのプラスミドに限られる。センダイウイルスのゲノムのP/V/C領域は、制限酵素EcoRIおよびSphIによってセンダイウイルスベクターpSVV10(19774bp)からクローニングベクターpSL1180(3422bp)中にサブクローン化した。これを実施するため、pSVV10(図2)とpSL1180の両ベクターを酵素EcoRIおよびSphIで消化し、pSVV10(2254bp)内の突然変異の対象となる上記領域をsPL1180(3303bp)のベクターバックボーンにライゲートした。生じたクローニングプラスミドpSL1180 SphI−Eco pSVV10のサイズは5557bpであった(図4参照)。
標的を定めた変異によってアクセサリー遺伝子C’、C、Y1およびY2の転写を防止することが必要である。編集部位の変異には、それ以上の編集を起こさせなくする効果もある。以下の概略図に、pSL1180のクローニング関連領域を、すべての遺伝子開始部位、編集部位とともに示す(配列番号19)。
突然変異誘発PCRにおいて、これらのプライマーを用いて以下の変異が生成した。
生じた変異プラスミドに変異が正確に挿入されているかどうかを確認した。変異領域全体を含むプライマースキームを図6に示す。上部の数字はオリジナルのベクターpsVV10(〜19kb)における位置情報を表し、下部の数字はpSL1180+pSVV10クローニングベクター(〜5.5kb)における位置情報を表す。
変異させた配列領域は、再クローニングすることによってセンダイウイルスの完全なcDNA配列を有するベクターに戻す必要があった。げっ歯動物の呼吸器においてトリプターゼ「クララ」によってのみ活性化される切断部位の代わりに遍在性F切断部位を有するウイルスを作製するため、ベクターpRS Id−EGFP Fmut(19958bp,Sascha Bossow,MPIミュンヘン)のeco−eco領域を使用した。これは、ヌクレオチド配列(GTTCCACAGTCGAGA;配列番号33)を有する、センダイウイルスのFタンパク質中の切断部位の代わりに、配列(CGTCGTCAGAAGAGA;配列番号34)を有する、ニューカッスル病ウイルスのFタンパク質の遍在性切断部位を含むものである。
パラミクソウイルス科のための「レスキュー」法によって、遺伝子組み換えウイルスを作製することができる。BSR−T7は構成的にT7 RNAポリメラーゼを発現する細胞であるが、ヘルパープラスミドおよびセンダイウイルスのcDNAをコードするプラスミドを、リポフェクションによってこの細胞に共導入した。T7プロモーターによって制御されるこれらのプラスミドは細胞内で転写され、いくつかのステップを経てウイルスタンパク質およびウイルスのマイナス鎖RNAゲノムを生じ、機能性ウイルスを生成する。
a)SeV Fmut:NDV切断部位を有するセンダイウイルスFushimi株
b)SeV Fmut dV:さらにV遺伝子およびW遺伝子に変異を有するa株
c)SeV Fmut dC:さらにC遺伝子およびC’遺伝子に変異を有するa株
d)SeV Fmut dCdY:さらにC遺伝子およびC’遺伝子ならびにY1遺伝子およびY2遺伝子に変異を有するa株
e)SeV Fmut dCdV:さらにC遺伝子およびC’遺伝子ならびにV遺伝子およびW遺伝子に変異を有するa株
f)SeV Fmut dCdYdV:さらにC遺伝子およびC’遺伝子、V遺伝子およびW遺伝子、ならびにY1遺伝子およびY2遺伝子に変異を有するa株
作製した組み換えセンダイウイルスについて、いくつかのレベルで広く特性決定を行った。ウイルスの複製は、形質転換されていないベロ細胞由来産生細胞、および腫瘍細胞、具体的には肝癌細胞(Hep3B、HuH7、PLC/PRF/5)、および数種類の非腫瘍細胞、具体的にはヒト線維芽細胞株MRC5や様々な提供者から得た初代ヒト肝細胞(PHH)等を用いて分析した。
1. 12のウェルに1×105個の細胞(500μl中)(ベロ細胞、肝癌細胞、MRC 5、PHHを使用し、いずれも1×105個から開始)を用意
2. 増殖
3. 培地を除去、PBSで1回洗浄
4. 250μlのOptiMEMを添加
5. ウイルスをOptiMEM(MOI 0.05)で希釈
6. 細胞に希釈したウイルスを添加
7. 6種のSeV変異体すべてを用いて感染(残った希釈物は凍結させ、開始値としての滴定を行う)
8. 37℃で1時間かけて感染
9. 細胞をPBSで2回洗浄
10. 1mlの新鮮培地(DMEM 5%FCS)を添加
11. 24、48、72、96時間後(感染開始からの時間)に上清中のウイルスを除去し、−80℃で保存(各200μl)
a. 培地で注意深く2回洗浄
b. 1000mlの培地(DMEM 5%FCS)を添加し、細胞をこすり取る
12. 溶解物を−80℃で凍結
13. 滴定のため融解
a. 37℃の水浴に2分間
b. 10〜15秒間のボルテックス
c. 小型遠心分離機で3000×gを2分間
14. 遠心分離
15. ベロ細胞における滴定(TCID50)
d. ウイルス希釈物を調製(1本目は常に希釈しない)
e. 96ウェルプレートに添加(プレートに常に新鮮培地を用意し4℃に調整)
f. 細胞をトリプシン処理
g. 2×104個/96ウェルとなるよう細胞を数えて添加
h. 3日後に力価を評価
1. 5×106個のHuH7腫瘍細胞を、Balb c nu/nuマウスの右脇腹に皮下注入した。
2. 腫瘍の容積が少なくとも100mm3に達した後、PBS100μl中のセンダイウイルスを腫瘍内へ投与した。
3. ウイルスの注射から2日後に、マウスを犠死させ、腫瘍を摘出した。
4. 腫瘍の一部をTissue Tackに包埋し、凍結させ、クリオトームを用いて薄切した。ウイルスによって発現されたGFPを、蛍光顕微鏡で直接検出した。
5. 腫瘍の別の部分をパラフィン包埋し、GFPを特異的抗GFP抗体によって検出した。
本発明者らは、野生型と比較してF遺伝子およびP遺伝子内に組み換えを有する様々な組み換えセンダイウイルスを用いて、抗腫瘍療法においてそれらを腫瘍崩壊ウイルスとして使用できることを実証できた。
配列番号1: SeV(Ohita株) F遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号2: SeV(Ohita株) Fタンパク質のアミノ酸配列
配列番号3: SeV(Ohita株) P遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号4: SeV(Ohita株) Pタンパク質のアミノ酸配列
配列番号5: SeV−WT プロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列
配列番号6: NDV Fタンパク質のプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列
配列番号7: SeV(Ohita株) C’遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号8: SeV(Ohita株) C’タンパク質のアミノ酸配列
配列番号9: SeV(Ohita株) C遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号10: SeV(Ohita株) Cタンパク質のアミノ酸配列
配列番号11: SeV(Hamamatsu株) V遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号12: SeV(Hamamatsu株) Vタンパク質のアミノ酸配列
配列番号13: SeV(Cantell株) W遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号14: SeV(Cantell株) Wタンパク質のアミノ酸配列
配列番号15: SeV(Ohita株) Y1遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号16: SeV(Ohita株) Y1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号17: SeV(52株) Y2遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号18: SeV(52株) Y2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号19: pSL1180のクローニング領域のヌクレオチド配列
配列番号20: PCRプライマー1のヌクレオチド配列
配列番号21: P遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号22: 変異したP遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号23: 変異したC遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号24: PCRプライマー2のヌクレオチド配列
配列番号25: P遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号26: Y1遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号27: 変異したY1遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号28: PCRプライマー3のヌクレオチド配列
配列番号29: P遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号30: 変異したP遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号31: 変異したV遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号32: 変異したW遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号33: SeV F遺伝子の切断部位のヌクレオチド配列
配列番号34: NDV F遺伝子の切断部位のヌクレオチド配列
Claims (19)
- 野生型(wt)と比較して、F遺伝子内に少なくとも第1の遺伝子組み換えを含み、P遺伝子内に少なくとも第2の遺伝子組み換えを含むことを特徴とする、遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 前記第1の遺伝子組み換えの結果として親和性が拡張されることを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 前記第2の遺伝子組み換えの結果として親和性が制限されることを特徴とする、請求項1または2に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 遺伝子組み換えセンダイウイルス(SeV)であることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 前記第1の遺伝子組み換えによってSeV wtプロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列が遍在性プロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列と置き換えられることを特徴とする、請求項4に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 前記遍在性プロテアーゼ切断部位がニューカッスル病ウイルス(NDV)のF遺伝子に由来することを特徴とする、請求項5に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 前記SeV wtプロテアーゼ切断部位がアミノ酸配列VPQSR(配列番号5)を含み、かつ/または前記遍在性プロテアーゼ切断部位がアミノ酸配列RRQKR(配列番号6)を含むことを特徴とする、請求項5または6に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 前記第2の遺伝子組み換えによって、P遺伝子のヌクレオチド配列にコードされる非構造アクセサリータンパク質の少なくとも1つが修飾されることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 前記第2の遺伝子組み換えによって、前記非構造アクセサリータンパク質の少なくとも1つが転写不可能となっていることを特徴とする、請求項8に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 前記第2の遺伝子組み換えによって、前記非構造アクセサリータンパク質の少なくとも1つにおいて開始コドンが機能破壊されていることを特徴とする、請求項9に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 前記非構造アクセサリータンパク質が、C’、C、Y1、Y2、VおよびWから成る群より選択されることを特徴とする、請求項8〜10のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 前記第2の遺伝子組み換えによって、少なくともC(Cおよび/またはC’)タンパク質ならびにY(Y1および/またはY2)タンパク質が修飾され、好ましくは機能破壊されていることを特徴とする、請求項11に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 前記第2の遺伝子組み換えによって、少なくともC(Cおよび/またはC’)タンパク質、Vタンパク質ならびにWタンパク質が修飾され、好ましくは機能破壊されていることを特徴とする、請求項11に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 前記第2の遺伝子組み換えによって、少なくともC(Cおよび/またはC’)タンパク質、Vタンパク質、Wタンパク質ならびにY(Y1および/またはY2)タンパク質が修飾され、好ましくは機能破壊されていることを特徴とする、請求項11に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 野生型(wt)と比較して少なくとも1つの導入遺伝子を含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 前記導入遺伝子が自殺遺伝子、もしくはそれ以外の細胞死誘導遺伝子または免疫刺激遺伝子であることを特徴とする、請求項15に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
- 請求項1〜16のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルスと薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、医薬品組成物。
- 腫瘍性疾患、好ましくは固形腫瘍の増殖、より好ましくは肝細胞癌の進行を治療および/または予防的に治療するための、請求項1〜16のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルスの使用。
- (1)請求項1〜16のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルスを提供すること、および(2)前記遺伝子組み換えパラミクソウイルスを薬学的に許容される担体を用いて製剤化することを含むことを特徴とする、腫瘍性疾患、好ましくは固形腫瘍の増殖、より好ましくは肝細胞癌の進行の治療および/または予防的治療のための医薬組成物を製造する方法。
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