ES2879931T3 - Composiciones para tratar o prevenir la enfermedad por radiación y el síndrome GI - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-ceramida, o un fragmento biológicamente activo del mismo, y un antibiótico que sea eficaz contra bacterias gramnegativas, para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad en un animal, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad por radiación y síndrome GI por radiación.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones para tratar o prevenir la enfermedad por radiación y el síndrome GI

Referencia cruzada a solicitud relacionada

La presente solicitud reivindica beneficio de la Solicitud Provisional N.° de Serie 61/651.729, presentada el 25 de mayo de 2012.

Declaración de interés gubernamental

La presente invención se realizó con soporte del Gobierno con la Subvención N.° CA85704 otorgada por el National Institutes of Health. El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.

Antecedentes

La radiación sigue siendo uno de los tratamientos más eficaces para una amplia diversidad de células malignas; sin embargo, las células sanas de la médula ósea, el folículo piloso, la epidermis y el tracto gastrointestinal son extremadamente sensibles a la muerte celular por radiación, limitando el uso eficaz de esta terapia para el tratamiento del cáncer. El síndrome de radiación gastrointestinal (GI) es una consecuencia típica de la enfermedad por radiación y es una toxicidad letal importante que puede producirse después de radiación/incidente nuclear. La posibilidad de un desastre radiológico por detonación nuclear o accidente ha existido desde hace mucho tiempo, sin embargo, la amenaza de ataque con un dispositivo de dispersión de radiación ha aumentado la urgencia de contramedidas médicas de radiación (MRC, por sus siglas en inglés) seguras y eficaces. El Proyecto BioShield Act y el Departamento de Salud y Servicios Humanos estiman que un mitigador eficaz de MRC debe ser eficaz incluso cuando se administra 24 horas después de un desastre nuclear, ya que representa el tiempo mínimo necesario para movilizar el tratamiento a una parte significativa de la población urbana. El Síndrome de Radiación Gastrointestinal (GI) (RGS, por sus siglas en inglés) es una toxicidad letal importante que implica la destrucción del compartimento de células madre intestinales dentro de las unidades de cripta/vellosas, dando como resultado la denudación de la mucosa, la pérdida de adsorción de nutrientes y la susceptibilidad a la infección por la flora bacteriana residente. Clínicamente, el RGS se presenta con anorexia, vómitos, diarrea, deshidratación, infección sistémica y, en casos extremos, choque séptico y muerte. A pesar del extenso estudio de los efectos de la radiación en el tejido normal, no se dispone de un mitigador profiláctico o terapéutico eficaz del Síndrome de Radiación GI para los socorristas, personal militar o trabajadores de remediación que ingresen a un área contaminada.

El trasplante de células madre hematopoyéticas (incluyendo trasplantes de médula ósea, donaciones de células madre de sangre periférica y células madre de la sangre del cordón umbilical) es otra forma de tratar el cáncer avanzado; sin embargo, los trasplantes de tejido con frecuencia evocan diversas respuestas inmunitarias en el hospedador, lo que da como resultado el rechazo del injerto y la enfermedad de injerto contra hospedador ("EICH"). La EICH es un tipo de enfermedad autoinmunitaria mediada por células T. Los trasplantes de células madre hematopoyéticas, especialmente los trasplantes de médula ósea, se usan actualmente para tratar una serie de enfermedades malignas y no malignas incluyendo leucemias agudas y crónicas, mielomas, tumores sólidos (R. J. Jones, Curr Opin Oncol 3 (2), 234 (1991); G. L. Phillips, Prog Clin Biol Res 354B, 171 (1990)), anemias aplásicas e inmunodeficiencias graves (^r .P. Gale, R. E. Champlin, S. A. Feig et al., Ann Intern Med 95 (4), 477 (1981); G. M. Silber, J. A. Winkelstein, R. C. Moen et al., Clin Immunol Immunopathol 44 (3), 317 (1987)). El régimen de acondicionamiento necesario antes del trasplante, diseñado para extirpar o suprimir el sistema inmunitario del paciente, hace que el paciente sea susceptible a una recaída o infección neoplásica. Se ha demostrado que un anticuerpo anti-ceramida previene el síndrome por radiación gastrointestinal en ratones (Rotolo et al., J.Clin.Invest. 122(5), 1786 (2012)). El documento US 2010/183749 se refiere a antibióticos en el tratamiento de la enfermedad por radiación y el síndrome por radiación GI.

Desafortunadamente, el uso reciente de donantes no emparentados y de HLA no idénticos ha aumentado la incidencia de EICH. Aunque la extracción de células T del injerto de médula ósea del donante mejora la EICH, esta estrategia aumenta las tasas de fracaso del injerto y disminuye notablemente el efecto injerto contra tumor terapéuticamente beneficioso. Como tal, la supervivencia general no mejora. Además, a pesar de los fuertes datos preclínicos, los intentos de mejorar los resultados de la EICH disminuyendo la acción de las citocinas inflamatorias mediante la adición de antagonistas del TNF a los corticosteroides, las normas asistenciales para la EICH aguda, ha proporcionado un beneficio terapéutico limitado.

Por lo tanto, existe una necesidad urgente de estrategias alternativas para reducir la incidencia y la gravedad de enfermedad por radiación, síndrome GI, EICH y otras enfermedades autoinmunitarias donde el daño gastrointestinal conduce a morbilidad/mortalidad por sepsis en un animal, así como afecciones caracterizadas por altos niveles de apoptosis endotelial.

Sumario de la invención

Los solicitantes han determinado que las técnicas anteriores padecen una o más deficiencias, incluyendo la escasez de medios eficientes para prevenir y tratar enfermedades en animales tales como síndrome GI, EICH, enfermedad por radiación y determinadas enfermedades autoinmunitarias asociadas a daño GI, así como afecciones caracterizadas por altos niveles de apoptosis endotelial y enfermedades asociadas a la formación de plataformas ricas en ceramidas (CRP, por sus siglas en inglés) (en lo sucesivo en el presente documento, las "enfermedades enumeradas"). Aunque la mayoría de los métodos se usarán para tratar (incluyendo "mitigar") una enfermedad enumerada, si el tratamiento se administra lo suficientemente temprano, por ejemplo, antes de la irradiación del sujeto o antes de que el sujeto reciba un injerto, entonces la enfermedad correspondiente (síndrome GI o EICH, respectivamente), puede prevenirse.

De acuerdo con un primer aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-ceramida o un fragmento biológicamente activo del mismo, y un antibiótico que es eficaz contra bacterias gramnegativas, para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad en un animal, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad por radiación y síndrome GI por radiación. Las realizaciones se proporcionan por las reivindicaciones dependientes. También se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-ceramida o un fragmento biológicamente activo del mismo y un antibiótico que es eficaz contra bacterias gramnegativas, formulada en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se describen, pero no se reivindican, métodos para prevenir o tratar una enfermedad enumerada en un animal mediante la administración de una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de al menos un antibiótico que se dirige a bacterias gramnegativas junto con un anticuerpo anti-ceramida, o un fragmento biológicamente activo del mismo. Los antibióticos para su uso en las realizaciones incluyen antimicrobianos de amplio espectro que abarcan tanto organismos grampositivos como gramnegativos, incluyendo quinolonas (Baytril, ciprofloxacina), cefalosporinas (cefepima, ceftazidina) o aminoglucósidos (gentamicina, amikacina) junto con una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquier anticuerpo anti-ceramida. Los anticuerpos anti-ceramida incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-ceramida humanizados tales como h2A2, o anticuerpos anti-ceramida completamente humanos. Otros anticuerpos que son útiles en las realizaciones de la invención incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, 1H4, 15D9, 5H9 y 2A2 y versiones humanizadas de los mismos, y anticuerpos IgM de h2A2 y 2A2), policlonales o genéticamente modificados anti-ceramida, o un fragmento biológicamente activo de los mismos. Los anticuerpos monoclonales, en determinadas realizaciones, puede reaccionar de forma cruzada con ceramida. El anticuerpo de ratón 2A2 se ha depositado en la ATCC. Tiene la Referencia de Identificación por Depositante de Célula de mieloma fusionada con células de bazo de ratón Balb/c: 2A2.1.1.1.1. y la designación de depósito de patente ATCC ® PTA-13418.

Las cantidades profiláctica y terapéuticamente eficaces del anticuerpo anti-ceramida son de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100mg/kg y de aproximadamente 100mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg. Las cantidades profiláctica y terapéuticamente eficaces de uno o más antibióticos que se administran con el anticuerpo anti-ceramida varían ampliamente dependiendo del antibiótico, la formulación, la vía de administración, etc., pero también puede variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de aproximadamente 100 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg. El antibiótico y el anticuerpo pueden administrarse simultáneamente, por ejemplo, en una única formulación farmacéutica, o secuencialmente. "Agentes terapéuticos" en el presente documento se refiere a los anticuerpos y mimótopos anti-ceramida y los antibióticos dirigidos a bacterias gramnegativas.

Los antibióticos de quinolona para su uso en diversas realizaciones se seleccionan del grupo que incluye Enrofloxacina (es decir, Baytril), Ciprofloxacina (es decir, Cipro y Proquin), Enoxacina (es decir, Penetrex), Gatifloxacina es decir, Gatiflo, Tequin y Zymar), Gemifloxacina (es decir, Factive), Levofloxacina (es decir, Levaquin), Lomefloxacina (es decir, Maxaquin), Moxifloxacina (es decir, Avelox), Norfloxacina (es decir, Noroxin), Ofloxacina (es decir, Floxin), Prulifloxacina, Sparfloxacina (es decir, Zagam), Trovafloxacina/Altrofloxacina (es decir, Trovan), Danofloxacina (es decir, A180), Difloxacina (es decir, Dicural), Marbofloxacina (es decir, Orbax), Orbifloxacina (es decir, Zeniquin), Ácido naldíxico (es decir, NegGram), Cinoxacina (es decir, Cinobac), Flumequina, Ácido nalidíxico, Ácido oxolínico, Ácido pipemídico, Ácido piromídico, Rosoxacina, Fleroxacina, Pefloxacina, Rufloxacina, Balofloxacina, Grepafloxacina, Pazufloxacina, Temafloxacina, Tosufloxacina, Besifloxacina, Clinafloxacina, Garenoxacina, Sitafloxacina, Ibafloxacina, Pradofloxacina y Sarafloxacina.

Además de los anticuerpos, los mimótopos de uno o más epítopos de ceramida o compuestos químicos con esencialmente la misma unión que los mimótopos (es decir, derivados de la selección de bibliotecas de estructura principal química) pueden administrarse en cantidades terapéuticamente eficaces.

Para mitigar una o más de las enfermedades enumeradas, los agentes terapéuticos pueden administrarse antes de que se manifiesten los síntomas de la enfermedad (tal como en el caso de la EICH y ciertas enfermedades autoinmunitarias definidas) o después de la exposición a la radiación (como en el caso de la enfermedad por radiación o el síndrome GI). Al mitigar ciertas enfermedades enumeradas, los agentes terapéuticos pueden administrarse antes o después de la irradiación o antes o después de recibir un injerto, por ejemplo, un trasplante de células madre hematopoyéticas. Si el tratamiento se administra lo suficientemente temprano, por ejemplo, antes de la irradiación del sujeto o antes de que el sujeto reciba un injerto, entonces la enfermedad correspondiente (síndrome GI o EICH, respectivamente), puede prevenirse.

Se proporciona una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9. La composición farmacéutica puede comprender cantidades profiláctica o terapéuticamente eficaces de un anticuerpo anti-ceramida tales como h2A2, incluyendo un anticuerpo monoclonal tales como 1H4, 15D9, 5H9 y 2A2 y versiones humanizadas de los mismos, e IgM h2A2 y 2A2, un anticuerpo policlonal, genéticamente modificado o completamente humano, o un fragmento biológicamente activo del mismo o una estatina, o imipramina, y uno o más de los antibióticos enumerados descritos en este documento que tratan o previenen infecciones bacterianas gramnegativas, incluyendo antibióticos de base amplia, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Aún otros aspectos, características y ventajas de la invención serán fácilmente evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, simplemente ilustrando una serie de realizaciones e implementaciones particulares. La invención también es capaz de otras realizaciones diferentes, y sus diversos detalles pueden modificarse en diversos aspectos obvios. En consecuencia, los dibujos y la descripción han de considerarse ilustrativos por naturaleza y no como restrictivos.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se ilustra a modo de ejemplo y no a modo de limitación, en las figuras de los dibujos adjuntos y en las cuales los mismos números de referencia se refieren a elementos similares y en las cuales:

FIGURA 1. El Ab 2A2 monoclonal purificado administrado 24 horas después de la irradiación corporal subtotal (SBI) de 15,5 Gy mejora la supervivencia del ratón.

FIGURA 2. La enrofloxacina (Baytril) administrada 24 horas después de 15,5 Gy de SBI mejora la supervivencia del ratón. (A) A partir de las 24 horas siguientes a la exposición, a los ratones C57BL/6 irradiados se les administró un estimado de 3 mg/día de Baytril en su agua de bebida. La supervivencia de los animales se calculó mediante el método de límite de producto de Kaplan-Meier. La necropsia de todos los animales que murieron en este estudio reveló la denudación de la mucosa GI indicativa del síndrome de radiación GI.

FIGURA 3. Ab 2A2 monoclonal purificado y Baytril se sinergizan para mitigar el síndrome GI después de 15,5 Gy de SBI. (A) Se administró IgM 2A2 purificada (1000 |jg) mediante inyección intravenosa en la vena de la cola 24 horas después de la irradiación y se administró un estimado de 3 mg/día de Baytril en el agua de bebida. La supervivencia de los animales se calculó mediante el método de límite de producto de Kaplan-Meier. La necropsia de todos los animales que murieron en este estudio reveló la denudación de la mucosa GI indicativa del síndrome de radiación GI.

FIGURA 4. Un gráfico de la estrategia usada para generar novedosos anticuerpos anti-ceramida con potente actividad in vivo.

FIGURA 5. h2A2 se une preferencialmente a ceramida. Las placas de ELISA Maxisorp se recubrieron durante la noche a 4 °C con BSA conjugado a carboxiceramida C¹⁶ o BSA solo. Después del bloqueo con 2 mg/ml de solución de leche desnatada, se añadió h2A2 biotinilado a la placa durante 2 h a temperatura ambiente a la concentración indicada. La unión se determinó tras la detección con estreptavidina conjugada con HRP y la cuantificación de la señal mediante un lector de placas.

FIGURA 6. h2A2 muestra una unión a ceramida superior que m2A2. El ELISA se realizó como se describe en la FIGURA 1. La unión de IgG humanizada o IgM de ratón se detectó con anticuerpo secundario anti-HRP humano o anti-HRP de ratón.

FIGURA 7. h2A2 inhibe la apoptosis de células Jurkat. A células Jurkat ajustadas a 1x106 células/ml en medio RPMI que contenía FBS al 10% se administraron h2A2 o anticuerpo anti-ceramida m2A2 y se expusieron a irradiación gamma de 10 Gy. Las células se fijaron después de 16 horas y la apoptosis se cuantificó mediante tinción con bisbencimida de Hoeschst. Los datos se presentan como porcentaje de inhibición de la apoptosis de células que no recibieron Mab.

FIGURA 8. h2A2 mejora la supervivencia de las células madre de la cripta después de la exposición a radiación letal. Se administró anticuerpo monoclonal h2A2 a ratones macho C57B1/6 de 6-10 semanas de edad 15 minutos antes de la irradiación de cuerpo completo con 15 Gy. Los animales se sacrificaron 3,5 días después de la irradiación y los tejidos se procesaron para el ensayo de microcolonia de criptas. Se recolectaron secciones proximales de yeyuno para seccionar. Las secciones intestinales se tiñeron con H&E y las criptas supervivientes se cuantificaron de acuerdo con el método de Withers y Elkund. Se puntuaron múltiples secciones de al menos 3 ratones por punto de datos.

FIGURA 9. h2A2 protege las células madre de la cripta de forma similar a m2A2. A los ratones se les administró anticuerpo monoclonal h2A2 o m2A215 minutos antes de la irradiación de cuerpo completo con 15 Gy, y el ensayo de microcolonia se realizó como se describe.

FIGURA 10. h2A2 mitiga la muerte de las células madre de la cripta. A los ratones se les administró h2A2 15 minutos antes o hasta 48 horas después de la irradiación de cuerpo completo con 15 Gy y el ensayo de microcolonia se realizó como se describe.

FIGURA 11. h2A2 es un radioprotector o mitigador eficaz cuando se administra mediante inyección intraperitoneal. A los ratones se les administró h2A2 15 minutos antes o hasta 48 horas después de la irradiación de cuerpo completo con 15 Gy y el ensayo de microcolonia se realizó como se describe.

FIGURA 12. h2A2 protege a los animales de RGS letal. A los ratones se les administró h2A2 15 min antes de la exposición a 15 Gy. Se controló la supervivencia de los animales y se sacrificaron cuando estaban moribundos. Se realizó un análisis de supervivencia actuarial de Kaplan-Meier. Se incluyeron al menos 5 ratones en cada grupo.

Descripción detallada

Ahora se ha descubierto que la administración de un anticuerpo anti-ceramida junto con un antibiótico que se dirige a las bacterias gramnegativas da como resultado una sinergia inesperada en la prevención, mitigación y tratamiento de EICH, enfermedad por radiación, síndrome GI, aquellas enfermedades autoinmunitarias donde el daño gastrointestinal conduce a morbilidad/mortalidad por sepsis en un animal y otras enfermedades que están asociadas a la producción de CRP (las "enfermedades enumeradas"), incluyendo enfermedades mediadas por la muerte inducida por linfocitos T citolíticos (CTL) y/o por daño a la microvasculatura endotelial. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, policlonal, modificado por ingeniería genética, humanizado o completamente humano, o un fragmento biológicamente activo del mismo tal como un fragmento Fv o anticuerpos de dominio único. Además de los anticuerpos, los mimótopos que se unen a ceramida o compuestos químicos con esencialmente la misma unión que los mimótopos pueden administrarse en cantidades terapéuticamente eficaces. Los métodos de tratamiento, mitigación o prevención de una enfermedad enumerada mediante la administración de cantidades terapéuticas o profilácticas de un anticuerpo anticeramida o fragmento biológicamente activo o variante del mismo o mimótopo, junto con cantidades profiláctica o terapéuticamente eficaces de un antibiótico que se dirige a bacterias gramnegativas se describen pero no se reivindican. Los antibióticos útiles incluyen antimicrobianos de amplio espectro que abarcan tanto organismos grampositivos como gramnegativos, tales como quinolonas (Baytril, ciprofloxacina), cefalosporinas (cefepima, ceftazidina) y aminoglucósidos (gentamicina, amikacina). El anticuerpo, el antibiótico y los mimótopos (en el presente documento "los agentes terapéuticos") pueden administrarse antes o después de la irradiación o un trasplante de tejido, o tras el diagnóstico de síndrome G i, EICH, una enfermedad autoinmunitaria que implica daño al intestino u otra enfermedad asociada a la formación de CRP. Los agentes terapéuticos pueden administrarse simultáneamente o en diferentes momentos y por diferentes vías.

Otras realizaciones se dirigen a composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-ceramida o un fragmento biológicamente activo del mismo, junto con un antibiótico que se dirige a las bacterias gramnegativas, incluyendo antibióticos de amplio espectro.

En la siguiente descripción, con el fin de explicación, se exponen numerosos detalles específicos con el fin de proporcionar una comprensión exhaustiva de la presente invención. Será evidente, sin embargo, para un experto en la materia que la presente invención puede ponerse en práctica sin estos detalles específicos.

La invención se describe con referencia a realizaciones específicas. Será, sin embargo, evidente que pueden realizarse diversas modificaciones y cambios. La memoria descriptiva y los dibujos deben considerarse, en consecuencia, en un sentido ilustrativo más que restrictivo. La invención se ilustra en el presente documento mediante los experimentos descritos anteriormente y mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes. Aunque se emplean términos específicos, se usan como en la técnica a menos que se indique de otro modo.

Los siguientes términos como se usan en el presente documento tienen los significados correspondientes que se dan aquí.

1. Definiciones

Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, proteína y ácido nucleico, química e hibridación descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y de uso común en la técnica. Los métodos y las técnicas de la presente invención se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992 y Suplementos hasta 2002); Harlow y Lan, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); Principles of Neural Science, 4a ed., Eric R. Kandel, James H. Schwart, Thomas M. Jessell editores. McGraw-Hill/Appleton & Lange: Nueva York, N. Y. (2000). A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia.

"Antibióticos para su uso en la presente invención" como se usa en el presente documento, significa cualquier antibiótico que sea eficaz contra bacterias gramnegativas, incluyendo antimicrobianos de amplio espectro que abarcan tanto los organismos grampositivos como los gramnegativos. Estos incluyen quinolonas (Baytril, ciprofloxacina), cefalosporinas (cefepima, ceftazidina) o aminoglucósidos (gentamicina, amikacina). En experimentos recientes, se demostró que Baytril mejoró la supervivencia del síndrome GI, mientras que sulfatrim (sulfonamida y trimetoprim) no tuvo ningún efecto. Esto indica que los antimicrobianos de amplio espectro que abarcan los organismos gramnegativos pueden ser más efectivos que los antibióticos que se dirigen específicamente a las bacterias gramnegativas.

"Enfermedades autoinmunitarias" que entran dentro del alcance de las enfermedades enumeradas como se usan en el presente documento, significan, pero no se limitan a EICH y aquellas enfermedades autoinmunitarias acompañadas de daño GI.

"Cantidad eficaz" como se usa en el presente documento, significa una cantidad de un agente terapéutico, que produce un efecto deseado.

"Enfermedad enumerada" como se usa en el presente documento, significa cualquier enfermedad que pueda tratarse (incluyendo mitigarse) o prevenirse mediante la administración de un tratamiento de acuerdo con una realización de la invención. Las enfermedades enumeradas incluyen Enfermedad por radiación, EICH, síndrome GI y una enfermedad autoinmunitaria asociada a daño GI, o enfermedades y afecciones caracterizadas por altos niveles de apoptosis endotelial que incluyen, artritis reumatoide y esclerosis múltiple. También se incluyen enfermedades asociadas a la formación de CRP y enfermedades mediadas por la muerte inducida por linfocitos T citolíticos (CTL) y/o por daño a la microvasculatura endotelial.

"Síndrome gastrointestinal (GI)" como se usa en el presente documento significa que el síndrome completo se producirá normalmente con una dosis superior a aproximadamente 10 Gy (1000 rads), aunque algunos síntomas pueden aparecer tan bajos como 6 Gy o 600 rads.

"Mimótopo" como se usa en el presente documento, significa una macromolécula, a menudo un péptido, que imita la estructura de un epítopo. Debido a esta propiedad, provoca una respuesta de anticuerpos similar a la provocada por el epítopo. Un anticuerpo para un antígeno epítopo dado reconocerá un mimótopo que imita ese epítopo. Los mimótopos se obtienen comúnmente a partir de bibliotecas de presentación de fagos mediante bioinmunoadsorción. Los mimótopos son útiles para iniciar una respuesta inmunitaria en el sujeto que le hace generar anticuerpos anticeramida endógenos que tratarían la enfermedad enumerada.

"Mitigar una enfermedad" como se usa en el presente documento, significa reducir o mejorar una enfermedad o síntoma de una enfermedad. Por ejemplo, la enfermedad por radiación puede mitigarse administrando un agente terapéutico después de la exposición pero antes de la expresión fenotípica de la enfermedad (es decir, antes de la aparición de los síntomas de la enfermedad). La mitigación incluye hacer que los efectos de la enfermedad sean menos graves evitando, conteniendo, reduciendo o eliminando o un síntoma de ella. Mitigar una enfermedad enumerada como se describe en el presente documento entra dentro de la definición de "tratar" una enfermedad enumerada antes de que se produzcan los síntomas. Las cantidades de agentes terapéuticos que mitigan una enfermedad se denominan en el presente documento "cantidades terapéuticamente eficaces".

"Cantidad profilácticamente eficaz" como se usa en el presente documento, significa una cantidad de un agente terapéutico, que, cuando se administra a un sujeto, tendrá el efecto profiláctico previsto, por ejemplo, prevenir o retrasar la aparición (o reaparición) de una enfermedad o conjunto de uno o más síntomas, o reducir la probabilidad de aparición (o reaparición) de la enfermedad o conjunto de síntomas. El efecto profiláctico completo no se produce necesariamente mediante la administración de una dosis y puede producirse solo después de la administración de una serie de dosis. Por lo tanto, puede administrarse una cantidad profilácticamente eficaz en una o más administraciones.

"Agentes profilácticos, mitigantes y terapéuticos" como se usa en el presente documento significa cualquier anticuerpo anti-ceramida y también antimicrobianos de amplio espectro que abarcan organismos gramnegativos, tales como quinolonas (Baytril, ciprofloxacina), cefalosporinas (cefepima, ceftazidina) o aminoglucósidos (gentamicina, amikacina).

"Sujeto" como se usa en el presente documento, significa un organismo que es un objeto de un método o material, incluyendo mamíferos, por ejemplo, seres humanos, perros, vacas, caballos, canguros, cerdos, ovejas, cabras, gatos, ratones, conejos, ratas y animales no humanos transgénicos. Los sinónimos usados en el presente documento incluyen "paciente" y "animal".

"Cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en el presente documento significa una cantidad de un agente terapéutico que logra un efecto terapéutico pretendido en un sujeto, por ejemplo, eliminar o reducir o mitigar la gravedad de una enfermedad o el conjunto de uno o más síntomas. El efecto terapéutico completo no se produce necesariamente mediante la administración de una dosis y puede producirse solo después de la administración de una serie de dosis. Por lo tanto, puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz en una o más administraciones.

"Tratar" como se usa en el presente documento significa tomar medidas para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos, incluyendo mitigar, aliviar o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad; disminuir la extensión de la enfermedad; retrasar o ralentizar la progresión de la enfermedad; mejorar y paliar o estabilizar una métrica (estadística) de la enfermedad. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una afección o enfermedad o síntoma de las mismas y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de una afección o enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la afección o enfermedad. "Tratamiento" se refiere a las etapas tomadas. Puede incluir cualquier tratamiento de una afección o enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) evitar que la afección o enfermedad o síntoma de la misma se produzca en un sujeto que puede estar predispuesto a la afección o enfermedad, pero aún no se ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la afección o enfermedad o síntoma de la misma, tal como, deteniendo su desarrollo; y (c) mitigar, aliviar o mejorar la afección o enfermedad o síntoma de la misma, tal como, por ejemplo, provocando la regresión de la afección o enfermedad o síntoma de la misma.

2. Visión general

La ceramida de la superficie celular extracelular es necesaria para la apoptosis por radiación

Durante mucho tiempo se ha aceptado que el compartimento clonogénico de la mucosa gastrointestinal (GI) es la diana directa y específica del daño GI inducido por radiación. Caracterizado clínicamente por anorexia, vómitos, diarrea, deshidratación, infección sistémica y, en casos extremos, choque séptico y muerte, el síndrome de radiación gastrointestinal (GI) implica la destrucción de unidades de criptas/vellosas, pérdida de la integridad de la mucosa e infección por flora enterobacteriana residente (Véanse Hendry, J.H., Potten C.S., Roberts N.P. The gastrointestinal syndrome and mucosal clonogenic cells: relationships between target cell sensitivities, LD50 and cell survival, and their modification by antibiotics. Radiat Res. 1983; 96 (1): 100-112; Hendry, J.H., Roberts S.A., Potten C.S. The clonogen content of murine intestinal crypts: dependence on radiation dose used in its determination. Radiat Res. 1992; 132 (1): 115-119; Potten C.S., A comprehensive study of the radiobiological response of the murine (BDF1) small intestine. Int. J. Radiat Biol. 1990; 58 (6): 925-973.) ). Aunque la radiobiología convencional considera las roturas de ADN bicatenario no reparadas o mal reparadas en clonógenos de células madre (SCC) como lesiones autónomas que conducen a una lesión tisular irreversible, los estudios recientes de los presentes inventores han desafiado este paradigma, presentando evidencia genética de que el daño endotelial agudo también juega un papel importante en la lesión del tracto GI (Paris F., et al., Endothelial apoptosis as the primary lesion initiating intestinal radiation damage in mice. Science. 2001; 293 (5528): 293-297; Rotolo J.A., Kolesnick R., Fuks Z. Timing of lethality from gastrointestinal syndrome in mice revisited. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2009; 73 (1): 6-8; Rotolo J.A., et al., Bax and Bak do not exhibit functional redundancy in mediating radiation-induced endothelial apoptosis in the intestinal mucosa. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2008; 70 (3): 804-815). A los pocos minutos de la exposición a la radiación, se activa la esfingomielinasa del ácido endotelial (ASMasa), catalizando la generación de ceramida en la membrana plasmática externa del endotelio de ratón y humano para iniciar la señalización apoptótica (Stancevic B., Kolesnick R., Ceramiderich platforms in transmembrane signaling. FEBS Lett. 2010; 584 (9): 1728-1740; Truman J.P., et al. Endothelial membrane remodeling is obligate for anti-angiogenic radio sensitization during tumor radiosurgery. PLoS One. 2010; 5 (9)). El endotelio muestra 20 veces más ASMasa que otras células de mamíferos, casi exclusivamente en forma secretora, lo que los hace particularmente vulnerables a la apoptosis inducida por ceramidas (Marathe S., et al. Human vascular endothelial cells are a rich and regulatable source of secretory sphingomyelinase. Implications for early atherogenesis and ceramide-mediated cell signaling. J. Biol. Chem. 1998; 273 (7): 4081-4088; Santana P., et al., Acid sphingomyelinase-deficient human lymphoblasts and mice are defective in radiation-induced apoptosis. Cell. 1996; 86 (2): 189-199.) La evidencia preliminar indica que el compromiso vascular, como consecuencia de la apoptosis de las células endoteliales, perjudica la reparación del daño del ADN del SCC lesionado por radiación, resultando en la desaparición de SCC. En varias cepas de ratones, la apoptosis endotelial se produce entre 8 y 15 Gy, que abarca dosis que provocan lesiones del tracto GI tanto subletales (<14Gy) como letales (>15Gy) (5), que comienzan en 1 hora y alcanzan un máximo de 4 a 6 horas después de la irradiación (Maj J.G., Paris F., Haimovitz-Friedman A, Venkatraman E., Kolesnick R., Fuks, Z. Microvascular function regulates intestinal crypt response to radiation. Cancer Res. 2003; 63 (15): 4338-4341.) La atenuación de la apoptosis del endotelio intestinal por inactivación genética de la generación de ceramidas mediada por ASMasa mejora la supervivencia de SCC, facilitando la reparación del daño de las criptas y el rescate de animales de la letalidad GI (Paris, F., et al. Endothelial apoptosis as the primary lesion initiating intestinal radiation damage in mice. Science. 2001; 293 (5528): 293-297); Rotolo, J.A., et al. Bax and Bak do not exhibit functional redundancy in mediating radiation-induced endothelial apoptosis in the intestinal mucosa. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2008; 70 (3): 804-815.) Estas observaciones proporcionan la base para desarrollar un anticuerpo monoclonal anti-ceramida neutralizante como posible contramedida contra la radiación. La radiación se dirige tanto a la microvasculatura gastrointestinal como a las células madre de las criptas en proliferación. La apoptosis del endotelio microvascular en las vellosidades es una lesión importante del síndrome GI, que se produce aproximadamente 4 horas después de la radiación. La apoptosis endotelial convierte las lesiones en clonógenos de la cripta de subletales a letales, dando como resultado la pérdida de criptas regenerativas y promoviendo la toxicidad GI. También se ha descubierto que la lesión endotelial se acopla a la reparación del daño del ADN en el compartimento de las células madre, lo que hace que la letalidad gastrointestinal sea un evento sintético resultante del daño directo a los clonógenos de las células madre junto con la disfunción vascular.

La fisiopatología del síndrome GI, también llamado síndrome de radiación gastrointestinal (GI) (RGS) requiere el agotamiento de clonógenos de células madre (SCC) dentro de las Criptas de Lieberkühn, necesario para la regeneración del epitelio intestinal después de la lesión. Sin embargo, la muerte reproductiva de SCC no es exclusivamente un resultado del daño del ADN, sino que está críticamente acoplada a la apoptosis de células endoteliales inducida por ceramidas dentro de la red microvascular de la mucosa. La ceramida generada en la superficie del endotelio se fusiona para formar plataformas ricas en ceramidas (CRP) que transmiten una señal apoptótica (Stancevic B., Kolesnick R. Ceramide-rich platforms in transmembrane signaling. FEBS Lett. 2010; 584 (9): 1728-1740; Haimovitz-Friedman A., et al. Ionizing radiation acts on cellular membranes to generate ceramide and initiate apoptosis. J Exp Med. 1994; 180 (2): 525-535; Verheij M., et al. Requirement for ceramide-initiated SAPK/JNK signaling in stress-induced apoptosis. Nature. 1996; 380 (6569): 75-79; Liao W.C., et al. Ataxia telangiectasia-mutated gene product inhibits DNA damage-induced apoptosis via ceramide synthase. J Biol Chem. 1999: 274 (25): 17908­ 17917). Los presentes inventores han demostrado que las CRP son susceptibles de inactivación farmacológica, específicamente inhibición farmacológica de la formación de PCR con un anticuerpo contra el daño endotelial atenuado por ceramida, aumento de la supervivencia del clonógeno de células madre de la cripta y, por lo tanto, aumento de la regeneración de tejidos, incluso después de dosis letales de radiación. Véanse Rotolo, et al., Anti-ceramide antibody prevents the radiation gastrointestinal syndrome in mice, J Clin Invest. 2012; 122(5):1786-1790 y Rotolo, et al., Solicitud de Patente de EE.UU. N.° de Serie 12/599.280.

En estudios iniciales la radiación ionizante (10 Gy) indujo un rápido aumento en la actividad enzimática de BAEC ASMasa mientras que concomitantemente aumentaba la ceramida celular en 1 minuto de estimulación. No se detectó un aumento simultáneo de la actividad esfingomielinasa neutra o ceramida sintasa, confirmando que la generación de ceramidas inducida por radiación fue mediada por ASMasa. La formación de plataformas ricas en ceramidas (CRP) se detectó tan pronto como 30 segundos después de la irradiación y fue dependiente de la dosis al minuto 1, alcanzando un máximo a 11 Gy (P < 0,001) con una DE50 de aproximadamente 5 Gy. La preincubación de BAEC con MID 15B4 (un anticuerpo anti-ceramida disponible en el mercado), una estrategia conocida para neutralizar la ceramida de la superficie celular y bloquear la coalescencia inducida por ceramida en otros tipos celulares (Rotolo J.A., Zhang J., Donepudi M., Lee H., Fuks Z., Kolesnick R. Caspase-dependent and - independent activation of acid sphingomyelinase signaling. J Biol Chem. 2005; 280 (28): 26425-26434; Grassmé H., et al. CD95 signaling via ceramide-rich membrane rafts. J Biol Chem. 2001; 276 (23): 20589-20596; Grassmé H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 2003; 9 (3): 322-330; Goggel R., et al. PAF-mediated pulmonary edema: a new role for acid sphingomyelinase and ceramide. Nat Med. 2004; 10 (2): 155­ 160), inhibió la formación de CRP inducida por radiación en un intervalo de dosis que es prácticamente idéntico al publicado para la inducción de apoptosis inducida por radiación en BAEC (Fuks Z., et al. Basic fibroblast growth factor protects endothelial cells against radiation-induced programmed cell death in vitro and in vivo. Cancer Res. 1994; 54 (10): 2582-2590.) La neutralización de la ceramida superficial y la inhibición de PCR atenuaron la apoptosis inducida por 10 Gy en un 71 % durante hasta 8 horas después de la estimulación.

Los presentes inventores también informaron una inhibición similar de anticuerpos anti-ceramida de la formación de CRP inducida por radiación (5-20 Gy) y apoptosis en linfocitos T Jurkat donde la preincubación de células T Jurkat con anti-ceramida MID15B4 (1 microgramo/ml) 15 minutos antes de 10 Gy IR atenuó la generación de plataformas. También se demostró que el secuestro de ceramida protegía la mucosa intestinal C57BL/6 contra la apoptosis del endotelio microvascular inducida por radiación, la muerte de las células madre de la cripta y la toxicidad GI letal. Solicitud de patente de EE.UU. N.° de serie 12/599.280.

La IgM anti-ceramida monoclonal de ratón de los presentes inventores, denominada 2A2, tiene una afinidad específica por la ceramida. 2A2 inhibe la formación de CRP y la apoptosis mediada por ceramidas e inhibió de forma dependiente de la dosis la apoptosis de células endoteliales in vivo. La administración intravenosa de 2A2 (1.000 jg/25 g de ratón) a ratones C57BL/6 15 minutos antes de la DL100 de la irradiación de cuerpo entero (WBI) de 15 Gy redujo el pico de apoptosis endotelial dentro de la microvasculatura de la lámina propia en un 83 %. Por lo tanto, 2A2 fenocopia la inhibición genética de la apoptosis endotelial intestinal inducida por radiación conferida por la deleción de ASMasa en ratones ASMasa-l-. Tan solo 50 |jg de anticuerpo 2A2/25 g de ratón aumentó el número de criptas supervivientes (P < 0,05), mientras que la protección máxima se logró con 1.000 jg de anticuerpo 2A2/25 g de ratón, que es 40 mg/kg. La administración de 2A2 fue sin toxicidad. El 100 % de los animales que recibieron 2A2 se salvaron de la letalidad del síndrome GI por radiación con una irradiación corporal total de 15 Gy. Por el contrario, l 100 % de los animales que recibieron IgM irrelevante (control de isotipo) o ningún anticuerpo (solo vehículo) murieron consistentemente con mucosa intestinal desnuda y evidencia clínica de letalidad por síndrome GI por radiación. A la dosis DL50 de 14 Gy de irradiación corporal total, 2A2 más trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) salvó el 100 % de los animales irradiados. Incluso a la dosis de radiación muy alta de 17 Gy de irradiación corporal total, 2A2 protegió el 50 % de los tractos GI, ya que el 25 % de los ratones pretratados con 2A2 sobrevivieron hasta el infinito, y el 33 % de los que sucumbieron murieron con tractos GI intactos. Algunos estudios adicionales demostraron que HSCT no contribuyó a los efectos protectores de 2A2.

Por lo tanto, el anticuerpo monoclonal 2A2 es un prototipo de una nueva clase de terapéuticos anti-ceramida (Rotolo J.A., Kolesnick R., Pasqualini R., Arap W., inventores: Sloan Kettering Institute For Cancer research, cesionario. Methods for treating and preventing GI syndrome and graft versus host disease. Solicitud de Patente de EE.UU. N.° de Serie 12/599.280, 6 de mayo de 2008), que pueden usarse como una contramedida eficaz contra el síndrome GI por radiación letal.

Recientemente los presentes inventores identificaron un nuevo anticuerpo 2A2 humanizado que tiene una afinidad de unión aún mayor por la ceramida que el anticuerpo 2A2 de ratón original. Los detalles de la fabricación de este anticuerpo y su secuencia se establecen en los Ejemplos a continuación.

3. Antecedentes

La señalización de ceramida es importante en muchas especies

La agrupación en balsa mediada por ceramidas es un sitio de transducción de señales para la internalización de bacterias y patógenos. (D. A. Brown y E. London, Annu Rev Cell Dev Biol 14, 111 (1998); J. C. Fanzo, M. P. Lynch, H. Phee et al., Cancer Biol Ther 2 (4), 392 (2003); S. Lacour, A. Hammann, S. Grazide et al., Cancer Res 64 (10), 3593 (2004); Semac, C. Palomba, K. Kulangara et al., Cancer Res 63 (2), 534 (2003); A. B. Abdel Shakor, K. Kwiatkowska y A. Sobota, J Biol Chem 279 (35), 36778 (2004); H. Grassme, V. Jendrossek, J. Bock et al., J Immunol 168 (1), 298 (2002); M. S. Cragg, S. M. Morgan, H. T. Chan et al., Blood 101 (3), 1045 (2003); D. Scheel-Toellner, K. Wang, L. K. Assi et al., Biochem Soc Trans 32 (Pt 5), 679 (2004); D. Delmas, C. Rebe, S. Lacour et al., J Biol Chem 278 (42), 41482 (2003); y C. Bezombes, S. Grazide, C. Garret et al., Blood 104 (4), 1166 (2004)). Las propiedades biofísicas únicas de la ceramida la hacen competente en la formación de dominios de señalización denominados plataformas ricas en ceramida (CRP) que poseen una función general en la transducción de señales para diversos estímulos. Esta teoría también está respaldada por el hecho de que las CRP se forman en respuesta a diversos estímulos celulares de alguna manera no relacionados (véase la Tabla 1).

T l 1: F rm i n l f rm ri n r mi n i m i l i .

_________________ continuación

La combinación de antibióticos dirigidos a bacterias gramnegativas y anticuerpo anti-ceramida tiene un efecto terapéutico sinérgico

Las CRP median diversas patologías de enfermedades. Ahora se ha descubierto que la administración de un anticuerpo anti-ceramida, tal como 2A2 o 2A2 humanizado, junto con (aunque no necesariamente simultáneamente con) un antibiótico de base amplia o un antibiótico dirigido a bacterias gramnegativas logra resultados significativamente mejorados en el tratamiento de las enfermedades enumeradas, en comparación con la administración de un anticuerpo anti-ceramida solo. Esto es particularmente eficaz en el tratamiento del síndrome GI, EICH, enfermedad por radiación y determinadas enfermedades autoinmunitarias asociadas a daño GI, así como otras afecciones que también se caracterizan por altos niveles de apoptosis endotelial y/o la formación de plataformas ricas en ceramidas (CRP). Estas enfermedades se listan en la Tabla 2; todas estas enfermedades se denominan en lo sucesivo colectivamente las "enfermedades enumeradas".

Es importante enfatizar que hay múltiples rutas en una célula para producir ceramida en diferentes compartimentos. En una publicación anterior, p Ct /Us 08/62789, correspondiente al N.° de serie de EE.UU. 12/599.280, se demostró que la ceramida de la superficie celular generada por ASMasa es responsable de provocar el síndrome GI por radiación a través del daño a la microvasculatura endotelial (un sello distintivo del síndrome GI). Los estudios in vivo relacionados demostraron que inhibir o secuestrar la ceramida de la superficie celular generada por ASMasa mediante la infusión de anticuerpos anti-ceramida después de la radiación letal con 15 Gy inhibió la agrupación en balsa mediada por ceramida, anulando de esta manera la apoptosis endotelial y mejorando la supervivencia de las criptas. Esto redujo de esta manera la letalidad de las células madre GI y mejoró la supervivencia general de los animales.

El documento PCT/US08/62789 también desveló resultados que muestran por primera vez que se requiere ceramida generada por ASMasa para la EICH aguda. EICH, la principal complicación del trasplante de células madre hematopoyéticas, es un trastorno de tipo autoinmunitario único que surge de la diferenciación y activación de células T de donantes alorreactivas infundidas en un hospedador con inmunoablación. En la EICH aguda, el reconocimiento de los aloantígenos (mayor o menor desajuste) del hospedador por las células T del donante inicia una respuesta inmunitaria adaptativa que incluye daño incipiente al tejido del hospedador y generación de citocinas de tipo I (IFN-gamma e IL-2). Esto da como resultado la expansión y activación clonal de CTL, que junto con una "tormenta de citocinas" dependiente de macrófagos en desarrollo compuesta por citocinas inflamatorias (TNF-a e IL-1p) induce la apoptosis en un grupo selecto de células diana y el consiguiente daño a los órganos diana asociados (hígado, intestinos y piel) (D. A. Wall, anteriormente citado; G. F. Murphy, D. Whitaker, J. Sprent et al., Am J Pathol 138 (4), 983 (1991); D. A. Wall y K. C. Sheehan, Transplantation 57 (2), 273 (1994); G. R. Hill, W. Krenger y J. L. Ferrara, Cytokines Cell Mol Ther 3 (4), 257 (1997); J. L. Ferrara, Bone Marrow Transplant 21 Suppl 3, S13 (1998); A. C. Gilliam, D. Whitaker-Menezes, R. Korngold et al., J Invest Dermatol 107 (3), 377 (1996)).

La quimioterapia y la radiación de dosis alta que se usan en el tratamiento de muchos tipos de leucemia y linfomas también matan las células madre de la médula ósea que se dividen rápidamente, dando como resultado inmunoablación y necesitando la reconstitución de elementos hematopoyéticos. La EICH es la principal complicación asociada a dicho trasplante de células madre hematopoyéticas en pacientes con cáncer. El documento PCT/US08/62789 también explica que la ceramida generada por ASMasa es necesaria para la EICH aguda y otras enfermedades autoinmunitarias mediadas por células T asociadas a un aumento de citocinas proinflamatorias, cuyas enfermedades también podrían tratarse mediante los métodos y composiciones descritos en el presente documento.

Existe un hilo conductor de un requisito para la ceramida generada por ASMasa para la letalidad inducida por radiación, síndrome GI, EICH aguda y otras enfermedades autoinmunitarias mediadas por células T. En los estudios descritos aquí, la letalidad por radiación se usó como modelo para tratar todas estas enfermedades. El síndrome GI por radiación es la patología G i mejor definida porque es rápida, altamente reproducible y tiene un ensayo in vivo predictivo, el ensayo clonogénico de Withers y Elkind, que define en detalle la respuesta clonogénica de las células madre a la lesión. La EICH y el síndrome Gl por radiación representan procesos patológicos que implican daño mediado por ASMasa en el compartimento endotelial acoplado al compartimento epitelial (aunque el mecanismo de activación de ASMasa difiere entre los dos). En todos los experimentos de radiación descritos en las Figuras 1-3 se irradiaron ratones C57B1/6 macho con una dosis letal de 15,5 Gy de irradiación corporal subtotal (SBI). En los experimentos descritos en las Figuras 5-11 los animales se irradiaron con 15 Gy de irradiación corporal total, y en la FIGURA 12 el animal se irradió con 16 Gy de SBI). Los detalles de los Materiales y métodos se exponen en el Ejemplo 1.

4. Sumario de resultados y realizaciones específicas de la invención

Como se muestra en la FIGURA 1, cuando el anticuerpo anti-ceramida 2A2 monoclonal purificado se administró por sí solo 24 horas después de la irradiación, la supervivencia de los ratones mejoró significativamente. La terapia con anticuerpos funciona mejor cuando se administra de inmediato o tan pronto como sea posible, preferentemente dentro de las 2 horas anteriores a la irradiación. En otro experimento, los ratones irradiados fueron tratados con el antibiótico quinolónico Enrofloxacina (en lo sucesivo en el presente documento también "Baytril"), una flouroquinolona con efectividad demostrada contra bacterias gramnegativas y grampositivas en las fases estacionaria y de crecimiento de la replicación bacteriana. A los ratones se les dio acceso libre a agua potable que contenía 0,57 mg/ml de Baytril 24 horas después de la irradiación. Basándose en la estimación de aproximadamente 6 ml de agua potable consumida diariamente por 25 g de ratones C57BL/6, la cantidad diaria de Baytril consumida fue de aproximadamente 3 mg/por animal por día. Mientras que el 100 % de los ratones no tratados murieron el día 9, aproximadamente el 25 % de los ratones tratados con enrofloxacina sobrevivieron durante los 80 días de duración del estudio. FIGURA 2.

En un tercer experimento, se administraron Ab 2A2 monoclonales tanto aislados como purificados y Baytril (3 mg/por animal por día) 24 horas después de la irradiación. Los resultados mostraron que esta combinación de anticuerpo anticeramida/tratamiento con antibiótico tuvo un efecto sinérgico en la mitigación/tratamiento del síndrome Gl en ratones irradiados. Sin tratamiento, el 100% de los ratones no tratados murieron el día 6 después de la irradiación. Sin embargo, el 75 % de los ratones tratados con la terapia de combinación Ab 2A2 y Baytril sobrevivieron durante la duración del estudio, un aumento de más de 3 veces la supervivencia lograda con 2A2 o antibiótico solo. FIGURA 3. Se esperan resultados aún mejores si el tratamiento se administra antes.

Basándose en estos resultados, se describe un método para prevenir o tratar o prevenir una enfermedad enumerada (EICH, enfermedad por radiación, síndrome Gl y determinadas enfermedades autoinmunitarias) en un animal, administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-ceramida y ya sea Baytril (u otro antibiótico quinolónico) o combinaciones de antibióticos seleccionados de la Tabla 1 o cualquier antibiótico de amplio espectro que sea eficaz contra antibióticos gramnegativos. Los agentes profilácticos y terapéuticos descritos en el presente documento para terapia de combinación pueden administrarse en el mismo día o en días consecutivos y pueden administrarse antes o después de la radiación o el trasplante de injerto. Cuando el tratamiento no se inicia antes de la radiación o el trasplante, por ejemplo, el tratamiento debe iniciarse lo antes posible después de que se sospeche o se diagnostique la enfermedad enumerada. Para mitigar la enfermedad por radiación, síndrome Gl o EICH, los agentes terapéuticos deben administrarse antes de la radiación o el trasplante o dentro de las primeras 24 horas después de la exposición a la radiación o el trasplante.

También se espera que los antibióticos distintos de las quinolonas tengan un efecto sinérgico cuando se administran junto con un anticuerpo anti-ceramida, y esto puede probarse usando experimentación rutinaria. Los antibióticos que pueden usarse en realizaciones de la invención incluyen quinolonas (Baytril, ciprofloxacina), cefalosporinas (cefepima, ceftazidina) o aminoglucósidos (gentamicina, amikacina) que son terapéuticamente eficaces para mitigar enfermedades por radiación como el síndrome Gl. Brook I, Elliot T B, Ledney GD, Shomaker MO, Knudson GB. Management of post-irradiation infection: lessons learned from animal models. Mil Med. 2004; 169:194-7.

La experimentación rutinaria determinará la cantidad terapéuticamente eficaz óptima de antibiótico y anticuerpo anticeramida a usar. Las cantidades profiláctica y terapéuticamente eficaces tanto del anticuerpo anti-ceramida como del antibiótico son de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg y de aproximadamente 100 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg.

Se prefieren anticuerpos completamente humanos o humanizados para un sujeto humano. Para los anticuerpos, una cantidad terapéutica o profiláctica varía normalmente y puede ser una cantidad suficiente para alcanzar niveles de agente terapéutico en suero normalmente entre aproximadamente 1 microgramo por mililitro y aproximadamente 10 microgramos por mililitro en el sujeto. Como se muestra a continuación, la preincubación de células Jurkat con anticuerpo monoclonal anti-ceramida 2A2 (25-100 microgramos/ml) inhibió la apoptosis inducida por 8 Gy. En el contexto de la presente invención, los anticuerpos anti-ceramida son un tipo de anticuerpo neutralizante que previene la apoptosis inducida por ceramida. Además del anticuerpo monoclonal anti-ceramida 2A2, los presentes inventores anteriormente informaron de otros tres isotipos de anticuerpos monoclonales anti-ceramida, incluyendo mAb 15D9, que es IgM, k; y mAb 1H4 y 5H9, que son anticuerpos IgG3, k (descritos en detalle en la solicitud de EE.UU. publicada N.° 12/599280; 2010/0239572). En la presente invención puede usarse cualquier anticuerpo anti-ceramida, incluyendo anticuerpos mono y policlonales y fragmentos biológicamente activos de los mismos.

La dosis terapéutica óptima de un antibiótico puede determinarse con experimentación de rutina con la orientación de la bibliografía sobre el tratamiento de la enfermedad por radiación, EICH y síntomas relacionados. Se ha descrito la gestión de una infección establecida o sospechada después de la exposición a radiación (caracterizada por neutropenia y fiebre). El paciente que desarrolla neutropenia después de la radiación es susceptible a daños por irradiación en otros tejidos, tales como el tracto gastrointestinal, los pulmones y el sistema nervioso central. Estos pacientes generalmente se tratan con terapia empírica de amplio espectro con dosis altas de uno o más de los antibióticos enumerados tan pronto como sea posible, incluso antes de que aparezcan los síntomas, pero al menos una vez que se detecta fiebre. Las cantidades profilácticas y terapéuticas de los antibióticos administrados para tratar o prevenir el daño GI posterior a la radiación son bien conocidas en la técnica y pueden aplicarse a realizaciones de los presentes métodos. Donnelly EH, Nemhauser JB, Smith JM, et al. (junio de 2010). "Acute radiation syndrome: assessment and management" South. Med. J. 103(6): 541-PMID2071013; Baranov AE, Rozhdestvenskií LM, Radiats Biol Radioecol. PMID: 18689253, mayo-junio de 2008; 48(3):287-302, The analytical review of the schemes of the acute radiation disease treatment used in experiment and in clinic; Brook I, Ledney D (1992). "Quinolone therapy in the management of infection after irradiation" Crit Rev Microbiol: 18235-46. Los antimicrobianos descritos anteriormente incluyen aquellos que se dirigen a organismos aeróbicos gramnegativos (es decir, Enterobacteriaceae, Pseudomonas) que representan más de las tres cuartas partes de los aislamientos que provocan sepsis. Las bacterias grampositivas aerobias y facultativas (principalmente estreptococos alfa-hemolíticos) provocan sepsis en aproximadamente una cuarta parte de las víctimas.

Los antibióticos quinolónicos incluyen Ciprofloxacina (Cipro, Proquin y otros) Enoxacina (Penetrex y otros) Gatifloxacina (Gatiflo, Tequin, Zymar y otros) Gemifloxacina (Factive y otros) Levofloxacina (Levaquin y otros) Lomefloxacina (Maxaquin y otros) Moxifloxacina (Avelox y otros) Norfloxacina (Noroxin y otros) Ofloxacina (Floxin y otros) Prulifloxacina Sparfloxacina (Zagam y otros) Trovafloxacina/Altrofloxacina (Trovan y otros) Danofloxacina (A180 y otros) Difloxacina (Dicural y otros) Marbofloxacina (Orbax y otros) Orbifloxacina (Zeniquin y otros) Quinolonas (clase "parental" más antigua) Ácido naldíxico (NegGram y otros) Cinoxacina (Cinobac y otros).

El trabajo anterior también mostró que las estatinas (por ejemplo, nistatina) tenían efectos beneficiosos en la reducción de la apoptosis en modelos in vitro de EICH. Por lo tanto ciertas otras realizaciones de la invención están dirigidas a anticuerpos anti-ceramida y antibióticos junto con una o más estatinas para su uso en la presente invención. Una descripción de las estatinas para el tratamiento de la apoptosis se expone en el N.° de Serie de EE.UU. N.° 12/599.280. Las estatinas incluyen, en orden alfabético (los nombres de las marcas varían en los diferentes países)

En otras realizaciones adicionales, el inhibidor de ASMasa imipramina se incluye con el anticuerpo anti-ceramida o fragmento biológicamente activo del mismo, y el antibiótico. En el documento con N.° de serie de EE.UU. 12/599.280 se demostró que se requiere ceramida generada por ASMasa tanto para el daño de la microvasculatura endotelial como para la muerte mediada por células T. Inhibir o secuestrar la ceramida generada por ASMasA mediante la administración de anticuerpos anti-ceramida in vivo, reduce el daño inducido por la radiación y puede usarse para tratar o prevenir el síndrome GI y la EICH. La ASMasa puede bloquearse con imipramina. En otra realización, los ácidos nucleicos antisentido se administran junto con los antibióticos y anticuerpos anti-ceramida de la invención reivindicada. Los datos que respaldan la inhibición de ASMasa con imipramina o ácidos nucleicos antisentido se publicaron en The Journal of Biological Chemistry (2005), 280, 26425-26434.

Anticuerpos h2A2

La humanización del anticuerpo 2A2 de ratón se describe en los ejemplos siguientes. Los experimentos de ELISA revelaron que h2A2 se une preferentemente a ceramida (FIGURA 5) y que la unión de h2A2 a ceramida excedía significativamente la del anticuerpo m2A2 parental de la FIGURA 6 y era comparable a la unión observada con IgM monoclonal anti-ceramida MID15B4 disponible en el Mercado (Enzo Life Sciences), cuyo anticuerpo también puede usarse en realizaciones de la invención. La actividad biológica in vitro de h2A2 IgG1 se determinó usando linfocitos T Jurkat humanos que fueron expuestos a radiación ionizante de 10 Gy en presencia o ausencia de h2A2 IgG1. Se usó m2A2 IgM como control positivo en estos experimentos. Los resultados indicaron que h2A2 inhibía la apoptosis de células Jurkat inducida por radiación de una manera dependiente de la dosis. De manera importante, la inhibición de la apoptosis se desplaza a la izquierda en comparación con la IgM 2A2 murina parental, lo que indica que el anticuerpo recombinante h2A2 es más potente. Estos datos demuestran que h2A2 es biológicamente activo y sugieren que la IgG1 humanizada recombinante será eficaz in vivo. FIGURA 7.

Se administraron dosis crecientes de h2A2 (50-1000 microgramos/ratón) a ratones C57BL/6 15 minutos antes de la irradiación corporal total de 15 Gy. La comparación directa de la eficacia de h2A2 frente a m2A2 en las criptas supervivientes indicó que h2A2 es igualmente eficaz que m2A2 como profiláctico para RGS. FIGURAS 8-9. Se informó que h2A2 es un mitigador muy eficaz de la letalidad de las criptas, mostrando efectividad incluso cuando se administra hasta 30 horas después de los 15 Gy (FIGURA 10) y es tan eficaz cuando se administra IP como cuando se administra IV (FIGURA 11). La inyección de IP puede ser preferible en situaciones de desastre, ya que los trabajadores de la salud capacitados que deben administrar un medicamento por vía intravenosa pueden no estar fácilmente disponibles.

Los ratones C57BL/6 expuestos a irradiación corporal subtotal de 16 Gy, se les administró h2A2 15 minutos antes de la exposición a la radiación y se siguió la supervivencia. El 100 % de los animales tratados con h2A2 sobrevivieron al menos 15 días, mientras que el 100 % de los animales no tratados murieron el día 8 después de la exposición, cada muerte con autopsia confirmó la denudación de la mucosa GI y el colapso de las unidades de cripta-vellos. FIGURA 12. Por lo tanto, el anticuerpo h2A2 o fragmentos del mismo, son adecuados para su uso en realizaciones de la presente invención.

Formulaciones farmacéuticas

Determinadas realizaciones están dirigidas a formulaciones farmacéuticas de los antibióticos y anticuerpos enumerados como se definen en las presentes reivindicaciones. Estas composiciones farmacéuticas son adecuadas para su administración a un sujeto que necesite profilaxis o terapia. El sujeto es preferiblemente un ser humano, pero también puede ser un no humano. Un sujeto adecuado puede ser un individuo que se sospecha que tiene, se ha diagnosticado con, o está en riesgo de desarrollar, una de las enfermedades enumeradas. Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada del anticuerpo y el antibiótico dependerán del tipo de enfermedad a tratar, la gravedad y la evolución de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, la vía de administración, la farmacocinética del agente, el historial clínico del paciente y la respuesta a los nuevos fármacos (anticuerpo 2A2 etc.) y el criterio del médico a cargo.

Como se ha mencionado anteriormente, la cantidad de anticuerpo anti-ceramida a administrar varía de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg y la cantidad típica de antibiótico varía de aproximadamente 0,1 mg/kg a 1000 mg/kg. Esta cantidad varía normalmente y puede ser una cantidad suficiente para alcanzar niveles de agente terapéutico en suero para cada agente terapéutico que están normalmente entre aproximadamente 1 microgramo por mililitro y aproximadamente 10 microgramos por mililitro en el sujeto. Sin embargo, los niveles séricos que provocan la respuesta deseada variarán. Los agentes terapéuticos de la invención pueden administrarse mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que los síntomas se reducen o eliminan lo suficiente. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales, y puede usarse para ajustar la dosis para lograr un efecto terapéutico.

Las composiciones terapéuticas pueden contener, por ejemplo, aditivos empleados normalmente como aglutinantes, cargas, vehículos, conservantes, agentes estabilizantes, emulsionantes, tampones y excipientes como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones contienen normalmente el 1 % -95 % de principio activo, preferentemente el 2 % -70 % de principio activo. Las formulaciones también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente los que tienen actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Dichas moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto. Por ejemplo, el anticuerpo 2A2 y las combinaciones de antibióticos podrían formularse para incluir además una estatina o imipramina.

También pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen los anticuerpos o fragmentos, nistatina, imipramina o combinaciones de los mismos, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (alcohol vinílico)), polilactidas, copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etilvinilacetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como la serie LUPRON DEPOT (microesferas inyectables compuestas por un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y poli-ácido D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como etilvinilacetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.

Los agentes terapéuticos pueden estar presentes en las composiciones farmacéuticas en forma de sales de ácidos farmacéuticamente aceptables o en forma de bases o en forma amorfa o en formas cristalinas, incluyendo hidratos y solvatos. Las sales farmacéuticamente aceptables de los agentes terapéuticos descritos en el presente documento incluyen aquellas sales derivadas de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de sales ácidas adecuadas incluyen sales de acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, alcanforato, alcanforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, glicolato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Otros ácidos, tales como oxálico, aunque en sí mismos no son farmacéuticamente aceptables, pueden emplearse en la preparación de sales útiles como productos intermedios en la obtención de sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio y potasio), metales alcalinotérreos (por ejemplo, magnesio), sales de amonio y N+(alquilo C-m )⁴. Se anticipa que alguna realización incluya la cuaternización de cualquier grupo que contenga nitrógeno básico de los agentes terapéuticos descritos en el presente documento. Pueden obtenerse productos solubles o dispersables en agua o aceite mediante dicha cuaternización.

Los agentes terapéuticos incluyen todas las formas estereoquímicas de los agentes terapéuticos (es decir, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico). Por lo tanto, los enantiómeros individuales, las mezclas racémicas y los diastereómeros de los agentes terapéuticos están dentro del alcance de la invención. También están dentro del alcance de la invención los isómeros estéricos y los isómeros posicionales de los agentes terapéuticos. Los agentes terapéuticos de algunas realizaciones también pretenden incluir compuestos que difieren únicamente en la presencia de uno o más átomos enriquecidos isotópicamente. Por ejemplo, los agentes terapéuticos en los que uno o más hidrógenos se reemplazan por deuterio o tritio, o el reemplazo de uno o más carbonos por carbono enriquecido en 13C o 14C está dentro del alcance de esta invención.

Los agentes terapéuticos de algunas realizaciones se administran en una composición farmacéutica que incluye un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador, adyuvante o vehículo no tóxico que no destruye ni disminuye significativamente la actividad farmacológica del agente terapéutico con el que está formulado. Los portadores, adyuvantes o vehículos abarcan cualquiera de los vehículos líquidos convencionales aceptados farmacéuticamente, tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, así como emulsiones como una emulsión de aceite/agua o una emulsión de triglicéridos. Los vehículos sólidos pueden incluir excipientes tales como almidón, leche, azúcar, determinados tipos de arcilla, ácido esteárico, talco, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Los vehículos pueden incluir también aditivos aromatizantes y colorantes u otros ingredientes. Las formulaciones de la combinación de algunas realizaciones pueden prepararse mediante métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica y descritos en el presente documento. Los vehículos farmacéuticos aceptables ilustrativos se han analizado anteriormente.

Las composiciones farmacéuticas se formulan preferentemente para administración IV, intramuscular o subcutánea. Cuando los antibióticos se administran por separado del anticuerpo, puede administrarse por cualquier vía conocida en la técnica para administrar antibióticos, incluyendo administración oral.

Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con técnicas conocidas en la materia usando agentes de dispersión o humectación y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico y parenteralmente aceptable, por ejemplo como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Adicionalmente, como disolvente o medio de suspensión se emplean convencionalmente aceites no volátiles estériles.

Las formas de dosificación oralmente aceptables (que son adecuadas para antibióticos administrados por separado de los anticuerpos), incluyen formas sólidas tales como cápsulas y comprimidos. Los agentes aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles pueden estar comprendidos como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tales como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tales como almidón o lactosa, un agente disgregante tales como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tales como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tales como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tales como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tales como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.

Las soluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica, IV, IM o subcutánea puede comprender los siguientes componentes: un diluyente estéril tales como agua para inyección, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral puede estar contenida en ampollas, jeringas desechables o viales multidosis hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para inyección comprenden soluciones o dispersiones acuosas estériles (en los casos donde sean hidrosolubles) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados comprenden solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL.™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición ha de ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que pueda inyectarse fácilmente. Debería ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula seleccionado en caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Puede lograrse la prevención de la acción de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En algunos casos, los agentes isotónicos están incluidos en la composición, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico. Puede lograrse la absorción prolongada de una composición inyectable incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad especificada en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y otros ingredientes seleccionados de los enumerados anteriormente u otros conocidos en la técnica. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación comprenden secado al vacío y secado por congelación que proporcionan un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de los mismos previamente esterilizado por filtración.

Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases para supositorios convencionales, tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para suministro rectal.

Fragmentos y variantes biológicamente activos

"Fragmentos biológicamente activos" de un anticuerpo anti-ceramida como se usa en el presente documento, significa cualquier fragmento que conserva la afinidad de unión por la ceramida. Los fragmentos retienen una o más regiones CDR del anticuerpo original. Las CDR son los sitios del anticuerpo que se unen al antígeno (por ejemplo, en el presente caso ceramida) y en la mayoría de los casos son exclusivos de ese anticuerpo. Para que un fragmento retenga la unión al antígeno, necesitaría tener al menos uno de estos CDR. Los fragmentos biológicamente activos también pueden contener variaciones menores siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos el 75 %, más preferentemente al menos el 80 %, el 90 %, el 95 %, y más preferentemente 99 % de identidad de secuencia y la molécula conserva su afinidad por unirse a ceramida.

Las "variantes" de un anticuerpo anti-ceramida o un fragmento del mismo incluyen modificación o modificaciones de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos descritos en el presente documento que pueden, por ejemplo, mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo con el propósito previsto de tratar o mitigar una enfermedad enumerada. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo pueden prepararse introduciendo cambios apropiados en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo, o mediante síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de, restos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Puede realizarse cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, con la condición de que la construcción final posea la afinidad deseada por la ceramida. Las alteraciones de aminoácidos pueden introducirse en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo objeto en el momento en que se realiza la secuencia.

Anticuerpos

Un "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una porción de unión a antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto para la unión específica. Las partes de unión a antígeno pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana, (b) anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos recombinantes y (c) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de, y están relacionadas con, secuencias de VH y Vl de línea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo. Las porciones de unión a antígeno incluyen, entre otros, Fab, Fab', F(ab')² , Fv, dAb y fragmentos de la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir la unión del antígeno específico a la ceramida diana. También se incluye en la definición de anticuerpos el SuperAnticuerpo, incluyendo aquellos conjugados químicamente con el péptido T15 o modificados genéticamente en una estructura de IgG1 humana (véase Y. Zhao, D. Lou, J. Burkett y H. Kohler. Enhanced Anti-B-cell Tumor Effects with Anti-CD20 SuperAntibody. J Immunotherapy, 25: 57-62, 2002. El subtipo de inmunoglobulina puede ser cualquier subtipo; normalmente se usan IgG e IgM, pero IgA, IgE, etc. también pueden ser eficaces.

Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina de origen natural, cada tetrámero se compone de dos pares de cadenas polipeptídicas idénticas, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras k y A. Las cadenas pesadas se clasifican como M, 6, y, a o £ y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente.

Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo de modo que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión. Las cadenas de inmunoglobulina exhiben la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean mediante las regiones marco, lo que permite la unión a un epítopo específico. Véase, en general, Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). El término "epítopo" significa un determinante capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos consisten normalmente en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas, tales como cadenas laterales de aminoácidos o glucídicas y, habitualmente, tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que se pierde la unión del primero pero no la del segundo en presencia de disolventes desnaturalizantes. Desde el extremo N al extremo C, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991) o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901 917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878883 (1989)).

La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR procedentes de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias estructurales humanas. Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se usan en el presente documento se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad y afinidad de unión única por un epítopo particular.

En consecuencia, la expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que muestran una especificidad de unión única que tiene regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada y un transgén de cadena ligera humanas fusionados a una célula inmortalizada. Los anticuerpos monoclonales para su uso en las realizaciones de la presente invención se describen a continuación.

Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que consiste en dominios VL, VH, CL y CH I; un fragmento F(ab^')2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544546, 1989) consiste en un dominio VH. Un anticuerpo monocatenario (scFv) es un anticuerpo en el que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes a través de un enlazador sintético que les permite fabricarse como una única cadena proteica (Bird et al., Science 242:423426, 1988 y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:58795883, 1988). Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos, en los que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero que usan un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:64446448, 1993 y Poljak, R. J., et al., Structure 2:1121 1123, 1994). Una o más CDR pueden incorporarse en una molécula covalentemente o no covalentemente para hacerla biespecífica. También pueden usarse anticuerpos biespecíficos que tienen un sitio de combinación de un anticuerpo anti-ceramida y un segundo sitio dirigido a un segundo antígeno para mejorar el direccionamiento a las células T, etc. Una inmunoadhesina puede incorporar la o las CDR como parte de una cadena polipeptídica más grande, puede enlazar covalentemente la o las c Dr a otra cadena polipeptídica o puede incorporar la o las CDR no covalentemente. Las CDR permiten que la inmunoadhesina se una específicamente a un antígeno particular de interés.

Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si existe más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina de origen natural tiene dos sitios de unión idénticos, un anticuerpo monocatenario o fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene dos sitios de unión diferentes.

Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que (1) no está asociado con componentes asociados de forma natural, incluyendo otros anticuerpos asociados de forma natural, que lo acompañan en su estado natal, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente o (4) no se encuentra en la naturaleza. Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tengan especificidades antigénicas diferentes. Por otra parte, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos. En una realización de la invención, una combinación de anticuerpos anti-ceramida "aislados" que tienen diferentes especificidades se combina en una composición bien definida. Las realizaciones de la invención usan anticuerpos aislados.

Las expresiones "anticuerpo humano" o "anticuerpo humanizado" incluyen todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Se prefieren los anticuerpos humanizados para el tratamiento de seres humanos. Un anticuerpo humanizado es aquel que deriva de una especie no humana, en el cual ciertos aminoácidos en el marco y dominios constantes de las cadenas pesada y ligera se han mutado para evitar o anular una respuesta inmunitaria en humanos. Alternativamente, puede producirse un anticuerpo humanizado fusionando los dominios constantes de un anticuerpo humano con los dominios variables de una especie no humana. Pueden encontrarse ejemplos de cómo producir anticuerpos humanizados en las patentes de EE.u U. N.° 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293. Los métodos para preparar el anticuerpo h2A2 se encuentran en los Ejemplos.

La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos diferentes.

Los expertos en la materia pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos siguiendo las enseñanzas de esta memoria descriptiva. Los extremos amino y carboxi preferidos de los fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparación de los datos de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o patentadas. Preferentemente, se usan métodos de comparación informatizados para identificar motivos de secuencia o dominios de configuración de proteínas predichos que se produzcan en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al. Science 253:164 (1991).

Anticuerpo IgM monoclonal anti-ceramida

Un diagrama de flujo de la estrategia usada para generar novedosos anticuerpos anti-ceramida con potente actividad in vivo se muestra en la FIGURA 4. Los anticuerpos monoclonales, incluyendo 2A2, se elaboraron usando métodos conocidos en la técnica y se describen con más detalle en el documento PCT/US08/62789. Para producir el anticuerpo, se desarrolló un antígeno de ceramida que era lo suficientemente inmunogénico como para generar una fuerte respuesta de anticuerpos de un hospedador inoculado. La ceramida conjugada con BSA se generó sintetizando ácido graso C¹⁶ conjugado a BSA sobre una base esfingoide. La validación del antígeno para la detección de anticuerpos se realizó mediante ensayo ELISA, en el cual se fijaron cantidades decrecientes de antígeno a una placa. Después de bloquear cada pocillo, la placa se incubó después con anticuerpo anti-ceramida MID15B4 (1:100) disponible en el mercado en Axxora LLC, San Diego, California seguida de IgM anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP). La DO se evaluó tras la administración de sustrato de HRP a 650 nm. El ELISA de ceramida-BSA identificó una actividad de unión mejorada en el sobrenadante n.° 3673 después de la inmunización de ratones con células de sarcoma de Kaposi. La actividad de unión permaneció después de la inmortalización de las células B productoras de anticuerpos, lo que permitió el aislamiento de IgM 2A2 monoclonal con actividad de unión anti-ceramida (no mostrado). La inmunización con células de sarcoma de Kaposi estaba destinada a generar una fuerte respuesta inmune que daría como resultado la generación de un panel de células B productoras de anticuerpos. El sobrenadante que contiene el anticuerpo de los hibridomas generados a partir de estas células B se cribó después contra el ELISA de ceramida-BSA. Se aislaron los sobrenadantes que dieron positivo en el ensayo, finalmente resultando en la purificación del clon 2A2.

El anticuerpo monoclonal 2A2 purificado se aisló del sobrenadante n.° 3673. El ELISA reveló que la IgM monoclonal de ratón 2A2 se unía a BSA-ceramida. El ELISA mostró una capacidad de unión significativamente mayor de 2A2 frente a IgM de control. Los métodos para humanizar el anticuerpo y otros se establecen en el Ejemplo 1.

También se describe una composición que comprende un anticuerpo anti-ceramida, preferentemente humanizado, tal como h2A2, y un antibiótico enumerado tal como un antibiótico de quinolona. Las composiciones de Anticuerpo/Antibiótico incluyen opcionalmente (1) una estatina en una cantidad que disminuye los niveles de colesterol circulante aumentando de esta manera la efectividad del anticuerpo anti-ceramida y/o (2) imipramina, un inhibidor de ASMasa usado actualmente como un agente antidepresivo.

Otros anticuerpos monoclonales, producidos en ratones que fueron inmunizados con BSA-ceramida, mostraron efectos protectores dependientes de la dosis comparables a los de 2A2 cuando se cribaron en un ensayo de inhibición de la apoptosis de células Jurkat. Estos incluyen mAb 15D9, que es IgM, k y 1H4 y 5H9, que son IgG3, k.

La inmunización de los ratones hospedadores con células de sarcoma de Kaposi generó anticuerpos monoclonales anti-ceramida eficaces con efectos terapéuticos espectaculares, como se muestra, por ejemplo, con el anticuerpo 2A2.

5. Ejemplos

Ejemplo 1: Materiales y métodos

La letalidad de los clonógenos de células madre gastrointestinales se evalúa mejor por el número de criptas que sobreviven 3,5 días después de la exposición a la radiación, que disminuye exponencialmente a medida que aumenta la dosis (C. S. Potten y M. Loeffler, Development 110 (4), 1001 (1990), H. R. Withers, Cancer 28 (1), 75 (1971) y J. G. Maj, F. Paris, A. Haimovitz-Friedman et al., Cancer Res 63, 4338 (2003)). Las criptas que contienen células madre supervivientes proliferan a un ritmo acelerado, produciendo criptas regenerativas típicas que se parten o brotan para generar nuevas criptas, hasta que la mucosa intestinal recupere una arquitectura normal. Los experimentos de irradiación corporal total (TBI) en varios modelos de ratón han demostrado que el número de células madre de la cripta supervivientes después de la exposición a 8-12 Gy suele ser suficiente para apoyar una recuperación completa de la mucosa. A dosis más altas, sin embargo, la pérdida masiva de clonógenos de células madre puede conducir a un colapso casi total del sistema cripta-vellosidad, denudación de la mucosa y muerte animal por síndrome gastrointestinal. Los estudios de autopsia de ratones C57BL/6 expuestos a TBI revelaron que el 25 % de los ratones expuestos a 14 Gy y el 100 % de los expuestos a 15 Gy sucumbieron al síndrome GI a 6,8+/-0,99 días, prediciendo una DL50 para muerte GI entre 14 y 15 Gy. Se usó una dosis de 15 Gy en los experimentos descritos en el presente documento. El subtotal se usó para los estudios de supervivencia, como se describe en el siguiente párrafo.

Se colocaron ratones macho C57BL/6 (6-8 semanas de edad) en un inmovilizador de plexiglás ventilado con cabeza/patas delanteras y patas traseras/cola cubiertas por un escudo de plomo, y se expusieron a 15,5 Gy o 16 Gy de irradiación corporal subtotal (SBI) (Philips MG-324 Unidad de rayos X a una tasa de dosis de 118,3 cGy/min, 50 cm de distancia entre la fuente y la piel). Se administró IgM 2A2 purificada (1000 |jg) mediante inyección intravenosa en la vena de la cola 24 horas después de la irradiación. A partir de las 24 horas siguientes a la exposición, los ratones tuvieron acceso libre a agua potable que contenía 0,57 mg/ml de Baytril, una flouroquinolona con efectividad demostrada contra bacterias gramnegativas y grampositivas en las fases estacionaria y de crecimiento de la replicación bacteriana. Basándose en la estimación de 6 ml de agua potable consumida diariamente por 25 g de ratones C57BL/6, el consumo diario de Baytril se estima en 3 mg/día.

Radiación y preparación de tejidos

TBI (irradiación corporal total) se usó solo para estudios de protección, SBI para estudios de mitigación se entregó con una unidad Shepherd Mark-I (Modelo 68, SN643) funcionando con fuentes de 137Cs. La velocidad de dosis fue de 2,12 Gy/min. Para recolectar muestras de intestino delgado, los ratones se sacrificaron por asfixia por hipercapnia y se obtuvieron segmentos de 2,5 cm del yeyuno proximal a 2 cm del ligamento de Trietz. Las muestras de tejido se fijaron mediante incubación durante la noche en formaldehído tamponado neutro al 4 % y se incluyeron en bloques de parafina. Para evaluar las respuestas del tejido intestinal a la radiación, se obtuvieron cortes transversales de la circunferencia yeyunal completa (5 micrómetros de espesor) por microtomía de los bloques de parafina, se adhirieron a portaobjetos tratados con polilisina y desparafinado por calentamiento a 90 grados Celsius durante 10 minutos y a 60 grados Celsius durante 5 minutos, seguido de dos lavados con xileno durante 5 minutos y teñido con hematoxilina y eosina de acuerdo con un protocolo convencional. Para determinar las causas de muerte después de TBI, las autopsias se realizaron dentro de los 60 minutos de la muerte del animal o cuando los animales con enfermedades terminales que mostraban un patrón de respiración agónica fueron sacrificados por asfixia por hipercapnia. Se recolectaron muestras de tejido de todos los animales, se fijaron en formaldehído y se tiñeron con hematoxilina.

Supervivencia de los ratones después de la irradiación y designación de los descubrimientos de la autopsia.

La supervivencia actuarial de los animales se calculó mediante el método de límite de producto de Kaplan-Meier. Los animales con enfermedades terminales que mostraban un patrón de respiración agónica se sacrificaron mediante asfixia por hipercapnia y se evaluaron mediante necropsia para determinar la causa de la muerte. Las muestras intestinales se fijaron en formaldehído y se tiñeron con hematoxilina. El daño gastrointestinal puede diagnosticarse como la causa de la muerte cuando el intestino delgado muestra una mucosa desnuda sin casi ningún vello o criptas aparentes o cuando la mucosa muestra una reparación mucosa limitada (Kaplan, E.L. y P. Meier, Nonparametic estimation from incomplete observations. J of the American Statistical Association, 1958. 53: p. 457-48; Rotolo, J.A., et al., Bax and Bak do not exhibit functional redundancy in mediating radiation endothelial apoptosis in the intestinal mucosa. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2008. 70(3): p. 804-15).

Ejemplo 2:

Métodos para producir el anticuerpo 2A2 humanizado

Los métodos para preparar el Anticuerpo 2A2 de ratón monoclonal se describen en el documento PCT/US08/62789.

Se realizó la humanización de 2A2 para generar un anticuerpo monoclonal 2A2 (h2A2) humanizado mediante el método de injerto de CDR. Habitualmente, los anticuerpos de roedores pueden ser inmunogénicos para los humanos y provocar efectos secundarios muy graves incluyendo la respuesta HAMA (anticuerpos humanos anti-ratón) o el choque anafiláctico. Con este enfoque de injerto c Dr , los bucles de CDR que constituyen el sitio de unión al antígeno del Mab de ratón se injertan en las correspondientes regiones estructurales humanas. Inicialmente, se determinaron las secuencias variables de cadena ligera y pesada de m2A2. Para ello, se recolectaron células de hibridoma m2A2 mediante centrifugación y se extrajo el a RN total de las células. Se usó ARN total para la síntesis de ADNc y se aislaron los genes de la región V de 2A2 usando conjuntos de cebadores convencionales.

Para identificar VL y VH humanos homólogos a los de 2A2, las regiones variables de 2A2 se compararon con regiones variables de secuencias de la línea germinal humana usando la base de datos en línea VBASE. Como resultado, se encontraron dos secuencias VL y VH de la línea germinal humana. Las siguientes secuencias son cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) variables del ratón 2A2, secuencias de la línea germinal humana y regiones homólogas de estas secuencias de ratón y humanas:

SEQ ID NO. 1: Cadena pesada variable (VH) de 2A2 de ratón

FR1 CDR1 FR2 CDR2

EVOLOOSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTNYWMHWVKORPVOGLEWIGAIYPGDSDTSYNOKFKG

FR3 CDR3 FR4 KAKLTAVTSTSTAFMELSSLTNEDSAVYYCTGLYYGYDWGOGTTLTVSS

SEQ ID NO. 2: Línea germinal humana 2A2 Cadena pesada variable del anticuerpo 2A2

FR1 CDR1 FR2 CDR2

QVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGOGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRV

TMTRDTSTSTVYMELSSL FR3 FR4 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARWGQGTTVTVSS

Regiones homólogas de la cadena pesada variable 2A2 de ratón del anticuerpo 2A2; con línea germinal humana cadena muy pesada 2A2

FR1 CDR1 FR2 CDR2

VQL QSG PGASVK+SCKASYTFT Y+MH WV+Q P QGLEW+G I P TSY

QKF G

FR3 CDR3 FR4

T TSTST MELSSL ED+AVYYC WGQGTT+TVSS

**Nótese que "+" significa que el aminoácido en ese lugar no es idéntico pero tiene algunas propiedades similares.

SEQ ID NO. 3: Cadena ligera variable (VL) de 2A2 de ratón

FR1 CDR1 FR2 CDR2

DVLMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLIDSDGKTFLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDS

FR3 CDR3 FR4 GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYYCWOGTHFPYTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO. 4: Línea germinal humana Ligera variable (VL) de 2A2

FR1 CDR1 FR2 CDR2

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNWDS

FR3 CDR3 FR4 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMOGTHWPTFGOGTKLEIKR

Regiones homólogas de la cadena LIGERA variable 2A2 de ratón del anticuerpo 2A2; con línea germinal humana cadena muy pesada 2A2

FR1 CDR1 FR2 CDR2

DV+MTQ+PL+L VT+GQPASISC SSQ SL+ SDG T+LN W QRPGQSP+RLIY VS DS

FR3 CDR3 FR4 GVPDRF+GSGSGTDFTLKISRVEAED+G+YYC QGTH+P T FG GTKLEIKR

**Nótese que "+" significa que el aminoácido en ese lugar no es idéntico pero tiene algunas propiedades similares.

Se encontró que la secuencia VH de 2A2 seleccionada era la más homóloga al gen V humano 1-46 de la familia VH1 y al gen J humano JH6. Se encontró que la secuencia VL de 2A2 seleccionada era la más homóloga con el gen V A1 humano de la familia Vk2 y el gen Jk2 humano J. Las secuencias de CDR m2A2 se injertaron en estos VL y VH, de tal manera que cada una de las secuencias sintetizadas contenía tres CDR de ratón en las secuencias marco humanas seleccionadas. Como 2A2 Mab es originalmente una IgM murina, el Mab h2A2 se convirtió al formato IgG1. Los Mabs IgG1 tienen muchos beneficios sobre los IgM, incluyendo que IgG1 es el Mab más abundante en suero (9 mg/ml), su vida media (21 días) es más larga que la de cualquier otro anticuerpo y, actualmente, muchos anticuerpos terapéuticos comerciales tienen formato IgG1. Para construir IgG1 2A2 humanizado en un vector de expresión de mamífero, se usaron los vectores pOptiVEC y pcDNA 3.3 (Invitrogen). La Figura 13 es un breve mapa vectorial.

Como se muestra en la Figura 13, el vector contiene el promotor/potenciador temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV) para la expresión de alto nivel de proteínas recombinantes en una amplia gama de células de mamíferos. Las cadenas ligeras y pesadas variables humanas que contienen las tres CDR de 2A2 de ratón se sintetizaron y se unieron a la cadena ligera y pesada constante humana mediante PCR. La cadena ligera 2A2 humanizada se clonó en pcDNA3.3 TOPO y la cadena pesada 2A2 humanizada se clonó en el vector de expresión del anticuerpo pOptiVEC TOPO. Las secuencias de IgG1 2A2 humana se muestran a continuación. El primer aminoácido (arginina, sombreado de color rojo) de la cadena ligera constante humana se eliminó durante la construcción de la cadena ligera humanizada completa. Después de la construcción de estos vectores de expresión de Ab 2A2 humanos, los plásmidos de ADN se cotransfectaron en células DG44 derivadas de CHO, DHFR negativas para crear una línea celular estable que produzca el anticuerpo hIgG1 2A2.

SEQ ID NO.5: SECUENCIA DE ADN DE CADENA PESADA 2A2 HUMANIZADA

ATGGACTGGACCTGGAGGGTCTTCTGCTTGCTGGCTGTAGCTCCAGGTGCTCACT

CCCAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGA

A GGTGTCCTGCAA GGCTTCTGGCTA CA CCTÍTA CCAA CIA CTGGA TGCA CTGGGTAA G

ACAGGCGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATGGGCGCTATTTATCCTGGAGATAGTGA

TACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCCGGGTCACAATGACTCGAGACACATCCACC

AGCACTGTCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGAAGTGAGGACACTGCGGTCTATTACT

GTGCACGCCTTTACTACGGCTACGACTGGGGCCAAGGCACCACTGTCACAGTCTCCT

CAGCCAGCACGAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCAC

CTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACC

GGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC

GGCTGTCCT ACAGTCCTC AGGACTCT ACTCCCTC AGC AGCGTGGTGACCGTGCCC

TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGC

A AC ACC A AGGTGG AC A AG A A AGTT GA GCCGAAA TCTTGTGA CAAAA CTCA CAGATG

CCCACCGrGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC

CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTG

GTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC

GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAG

CACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGC

AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAA

ACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCC

CCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA

GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAG

AACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCT

ACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT

GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC

TGTCCCCGGGTAAA TGA

Primer subrayado: secuencia líder

Primera cursiva: secuencia de cadena pesada variable

Segundo subrayado: Secuencia CH1

Segunda cursiva: secuencia bisagra

Tercer subrayado: Secuencia CH2 y CH3

SEQ ID NO. 6 SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE CADENA PESADA 2A2 HUMANIZADA

MDWTWRYFCLLA VAPGAHS \ OVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHW

VRQAPGQGLEWMGAIYPGDSDTSYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYY

CARL YYG YD WGOGTTVTVSS] AS TKGPS YFPL APS S KS TS GGT A ALGCLYKD YFPEP YT

V S WN S G ALT S G VHTFP A VLOS S GLY S LS S V VT VPS S S LGT OT YICN VNHKPS NTKVD

K K V EPKS CDKTHTCPPCP APELLGGPS VFLFPPKPKDTLMIS RTPE YTC V Y VD V S HED

PEVKFNWY VDG VEVHN AKTKPREEO YN S T YRV V S VLT VLHOD WLN GKE YKCKV S

NKALPAPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE

SNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQOGNVFSCSVMHEALHNHYTO

KSLSLSPG

Primer subrayado: secuencia líder

Secuencia entre corchetes = secuencia de cadena pesada variable

NYWMH=CDR

LYYGYD=CDR

Segundo subrayado: Secuencia CH1

Segunda cursiva: secuencia bisagra

Tercer subrayado: Secuencia CH2 y CH3

SEQ ID NO. 7: SECUENCIA DE ADN DE CADENA LIGERA 2A2 HUMANIZADA

ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCCCAGGATCCA

GTGGGGATGTTGTGA EGA CCCAA TCTCCA CTCTCTITGCCGGTTA CCCITGGA CAA CC

AGCCTCCATCTCTTGCAA GTCAA GTCAGA GCCTCA TA GATAGTGATGGAAA GA CA TTTT

TGAA TTGGTTCCAA CA GA GGCCA GGCCA GTCTCCAA GGCGCCTAA TCTA TCTGGTGTC

TAAA CTGGA CTCTGGA GTCCCTGA CA GGTTCTCTGGCA GTGGA TCA GGGA CA GA TTI C

ACTCTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAG

GTA CA CA TTTTCCGTA CACGTTCGGA CAGGGGA CCAA GCTGGAAA TAAAACGGA CGGT

GGCTGCA CCA TCTGTCTTCA TCITCCCGCCA TCTGA TGA GCA GTTGAAÁ TCTGGAACT

GCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAA TAA CTTCTA TCCCA GA GA GGCCAAA GTA CA GTGGA

AGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACA

GCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACG

A GAAA CA CAAA GTCTA CGCCTGCGAA GTCA CGCA TCA GGGCCTGA GTTCGCCCGTCA

CAAA GAGCTTCAA CAGGGGAGAGTGTTAA

Primer subrayado: secuencia líder

Primera cursiva: secuencia de cadena ligera variable

Segundo subrayado: Aminoácido eliminado

Segunda cursiva: secuencia constante de cadena ligera kappa

SEQ ID NO. 8: SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE LA CADENA LIGERA 2A2 HUMANIZADA

MRLPAOLLGLLMLWVPGSSGrDVVMTOSPLSLPVTLGOPASISCKSSOSLIDSDGKT

FLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC

W O G TfíFPYTFG Q G TKT E\K]RTVAA PSVF1FPPSDF.QJ .KSGTA SWCTJNNFYPRFA KVO

WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS

FNRGEC

Primera secuencia subrayada = secuencia líder

Corchetes = secuencia de cadena ligera variable

KSSQSLIDSDGKTFLNW = secuencia CDR

LVSKLDS = secuencia CDR

WQGTHFPYT = secuencia CDR

Segunda secuencia subrayada = aminoácido eliminado

Primera cursiva: secuencia constante de cadena ligera kappa

Para obtener líneas celulares que produzcan altos niveles de anticuerpos, se seleccionó un conjunto de células transfectadas de manera estable realizando dos rondas de selección usando medio CD OptiCHO y medio CD OptiCHO con 500 ^g/ml de Geneticina, seguido de la selección de amplificación genómica de MTX y dos rondas de selección clonal de una sola célula en medio semisólido en una placa de 96 pocillos. Se examinaron los niveles de expresión de anticuerpos mediante cuantificación del ensayo ELISA y se aumentaron lentamente las líneas de células h2A2IgG1-CHO seleccionadas (G3A10, C5G6 y D5F11).

La producción de anticuerpo recombinante IgG1 h2A2 in vitro se realizó en medio sin suero OptiCHO usando un biorreactor de fibra hueca. La expansión de este clon permitió la producción a granel y la purificación de IgG1 h2A2 en el sistema de fibra hueca. La purificación de IgG recombinante de la cosecha concentrada se realizó usando cromatografía de afinidad de proteína A/G convencional. Se eluyó el anticuerpo, se realizó el intercambio de tampón y el anticuerpo en solución salina tamponada con fosfato se congeló en alícuotas a una concentración de 3 mg/ml para análisis adicional. Hasta la fecha, los presentes inventores han purificado más de 50 miligramos de h2A2 recombinante para su evaluación in vitro e in vivo.

Para confirmar la afinidad de unión de h2A2 a ceramida, se realizó una serie de ensayos ELISA se realizaron usando ceramida Ci6 unida covalentemente a seroalbúmina bovina (BSA) u ovoalbúmina (OVA) a través de un enlace en el extremo terminal de la subunidad de ácido graso de ceramida. Brevemente, h2A2 se biotiniló y el anticuerpo se unió a las microplacas recubiertas con ceramida Ci6 conjugada a BSA u OVA usando estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante. Los experimentos revelaron que h2A2 se unió a ceramida Ci6 de una manera dependiente de la dosis.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-ceramida, o un fragmento biológicamente activo del mismo, y un antibiótico que sea eficaz contra bacterias gramnegativas, para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad en un animal, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad por radiación y síndrome GI por radiación.

2. El anticuerpo anti-ceramida, o el fragmento biológicamente activo del mismo, y el antibiótico, para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

3. El anticuerpo anti-ceramida, o el fragmento biológicamente activo del mismo, y el antibiótico, para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el antibiótico es un antibiótico de quinolona seleccionado del grupo que consiste en Enrofloxacina, Ciprofloxacina, Enoxacina, Gatifloxacina, Gemifloxacina, Levofloxacina, Lomefloxacina, Moxifloxacina, Norfloxacina, Ofloxacina, Prulifloxacina, Esparfloxacina, Trovafloxacina, Alatrofloxacina, Danofloxacina, Difloxacina, Marbofloxacina, Orbifloxacina, Ácido nalidíxico, Cinoxacina, Flumequina, Ácido oxolínico, Ácido pipemídico, Ácido piromídico, Rosoxacina, Fleroxacina, Pefloxacina, Rufloxacina, Balofloxacina, Grepafloxacina, Pazufloxacina, Temafloxacina, Tosufloxacina, Besifloxacina, Clinafloxacina, Garenoxacina, Sitafloxacina, Ibafloxacina, Pradofloxacina y Sarafloxacina.

4. El anticuerpo anti-ceramida, o el fragmento biológicamente activo del mismo, y el antibiótico, para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en 2A2, 1H4, 15D9 y 5H9.

5. El anticuerpo anti-ceramida, o el fragmento biológicamente activo del mismo, y el antibiótico, para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de ratón humanizado h2A2, tales como anticuerpo monoclonal de ratón humanizado IgG 2A2 o IgM 2A2.

6. El anticuerpo anti-ceramida, o el fragmento biológicamente activo del mismo, y el antibiótico, para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, para prevenir o tratar la enfermedad por radiación o el síndrome GI, en donde el anticuerpo y el antibiótico se administran antes o después de la irradiación del animal.

7. El anticuerpo anti-ceramida, o el fragmento biológicamente activo del mismo, y el antibiótico, para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el anticuerpo monoclonal reacciona de forma cruzada con ceramida y es secretado por un hibridoma derivado de células del bazo de un animal inmunizado con sarcoma de Kaposi (KS) completo.

8. El anticuerpo anti-ceramida, o el fragmento biológicamente activo del mismo, y el antibiótico, para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-ceramida es de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg y una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz del antibiótico es de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg.

9. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-ceramida, o un fragmento biológicamente activo del mismo, y un antibiótico que es eficaz contra bacterias gramnegativas, formulada en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en donde el antibiótico es un antibiótico de quinolona seleccionado del grupo que consiste en Enrofloxacina, Ciprofloxacina, Enoxacina, Gatifloxacina, Gemifloxacina, Levofloxacina, Lomefloxacina, Moxifloxacina, Norfloxacina, Ofloxacina, Prulifloxacina, Esparfloxacina, Trovafloxacina, Alatrofloxacina, Danofloxacina, Difloxacina, Marbofloxacina, Orbifloxacina, Ácido nalidíxico, Cinoxacina, Flumequina, Ácido oxolínico, Ácido pipemídico, Ácido piromídico, Rosoxacina, Fleroxacina, Pefloxacina, Rufloxacina, Balofloxacina, Grepafloxacina, Pazufloxacina, Temafloxacina, Tosufloxacina, Besifloxacina, Clinafloxacina, Garenoxacina, Sitafloxacina, Ibafloxacina, Pradofloxacina y Sarafloxacina.

11. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 9 o 10, que comprende además una estatina.

12. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 9 o 10, que comprende además imipramina.