CN110237075A - 一种达氟沙星在治疗副猪嗜血杆菌药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种达氟沙星在治疗副猪嗜血杆菌药物中的用途，优化公式为该公式根据达氟沙星对副猪嗜血杆菌的临床折点获取。本发明公开了临床折点的获取流程，该折点由界定野生型和非野生型细菌的野生型临界值、代表药物对细菌体内抗菌效应的药效学临界值、代表临床治疗有效性的临床临界值共同决定。本发明还公开了达氟沙星对副猪嗜血杆菌的野生型临界值、药效学临界值和临床临界值的获取流程。本发明获取的给药方案基于达氟沙星对副猪嗜血杆菌的体内外的抗菌效应以及临床的抗菌效果，能较好的代表达氟沙星对国内大部分副猪嗜血杆菌的临床效应，具有适用范围广、适用于临床等优点。

Description

一种达氟沙星在治疗副猪嗜血杆菌药物中的用途

技术领域

本发明涉及兽医药理学领域，特别是涉及一种达氟沙星在治疗副猪嗜血杆菌药物中的用途。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是定殖于猪上呼吸道的一种常见的条件性致病菌，一般多继发于其它呼吸道病毒和细菌病原体，引起猪群严重的呼吸道疾病综合征，各种应激因素也可诱发该病。副猪嗜血杆菌在临床上可感染各年龄阶段的猪，以2周龄至4月龄最易感，临床上以浆液性纤维素性胸膜炎、关节炎、脑膜炎和肺炎为特征，有时会引起肺炎和败血症，又称为Glasser’s disease。多数病呈亚急性或慢性，患畜出现精神沉郁、食欲不振、体温升高(39.6℃～41℃)，关节跛行等，常发病后2～3天死亡，给畜牧业的发展造成了巨大的经济损失。

临床上用于治疗副猪嗜血杆菌病的药物有很多，包括β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类、氟喹诺酮类等。达氟沙星(Danofloxacin)是第3代动物专用氟喹诺酮类药物，能抑制细菌DNA旋转酶的合成而呈现杀菌作用，具有抗菌谱广、杀菌活性强、体内分布广泛、与其他抗菌药无交叉耐药等特点。以甲磺酸盐的形式给药后，吸收迅速、生物利用度高、组织中浓度高。目前达氟沙星在亚洲、欧洲、北美洲和拉丁美洲等很多国家已被批准应用于治疗牛、猪和鸡等兽禽类动物因细菌和支原体感染引起的呼吸道疾病。但由于抗生素在临床上的不合理或不正当使用以及副猪嗜血杆菌的适应性突变，很多地区的副猪嗜血杆菌均出现了不同程度的耐药性。副猪嗜血杆菌耐药菌株在德国，英国，西班牙，中国等许多国家都逐步被检测出来，现有的给药方案已经难以达到最初的治疗效果。

发明内容

本发明结合目前达氟沙星对副猪嗜血杆菌的体内外抗菌效应以及临床治疗的有效性，建立了相应的给药剂量公式。

本发明所述副猪嗜血杆菌菌株购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.11146。

WindoW为本领域在期刊中发表过的一种计算折点值的通用方法，本发明涉及的软件的操作过程均为本领域技术人员的常规技术手段，且并非发明要点，在此不做赘述。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种达氟沙星在治疗副猪嗜血杆菌药物中的用途，用量优化方法为：

(1)获取副猪嗜血杆菌对达氟沙星的野生型临界值；

(2)获取副猪嗜血杆菌对达氟沙星的药效学临界值；

(3)获取副猪嗜血杆菌对达氟沙星的临床临界值；

(4)利用上述三种临界值，综合分析建立副猪嗜血杆菌对达氟沙星的耐药判定耐药判定折点值；

(5)运用折点值优化达氟沙星治疗副猪嗜血杆菌的给药剂量，具体公式为其中，Dose表示给药剂量；(AUC_24/MIC)_ex表示半体内药动学参数；CL/F表示生物利用度校正过的体清除率；fu表示蛋白结合率，BP为耐药判定折点值。

进一步的，所述野生型临界值的获取包括：对副猪嗜血杆菌进行鉴定，测定达氟沙星对副猪嗜血杆菌的MIC，整理分析得到的MIC数据，用Ecoffinder软件模拟，得到副猪嗜血杆菌对达氟沙星的野生型临界值。

进一步的，达氟沙星对副猪嗜血杆菌的体外药效学实验：用ERIC-PCR分型方法和小鼠毒力实验，筛选毒力较强的血清5型的菌株。测定达氟沙星对副猪嗜血杆菌H80菌株的体外MIC,MBC,MPC和PAE，绘制杀菌曲线，选择合适的PK-PD参数。

进一步的，所述药效学临界值的获取包括：给猪肌肉注射2.5mg/kg b.w.的甲磺酸达氟沙星注射液，测定不同时间点血浆和肺泡液中的药物浓度，用Winnonlin软件模拟出相关的PK-PD参数，用蒙特卡洛软件模拟得到达标率为90％以上所对应的最大MIC值为最终的药效学临界值。

进一步的，所述临床临界值的获取：选取血清5型的5个不同MIC的副猪嗜血杆菌进行临床治疗实验，以PK-PD推荐的治疗剂量为给药剂量，统计实验对副猪嗜血杆菌的抑制率。分析MIC与抑制率之间的关系，取抑制率大于等于90％的最大MIC为最终的临床临界值。

进一步的，耐药判定折点值的判定包括：将得到的3个临界值按照CLSI的折点获取流程图来分析，得到达氟沙星对副猪嗜血杆菌的耐药判定标准。

进一步的，运用耐药判定折点值优化达氟沙星治疗副猪嗜血杆菌的给药剂量，将得到的敏感性折点带入推荐的浓度依赖性药物的给药剂量公式，替换其MIC值，获取出推荐的给药剂量，具体公式为其中，Dose表示给药剂量；(AUC_24/MIC)_ex表示半体内药动学参数；CL/F表示生物利用度校正过的体清除率；fu表示蛋白结合率，BP为耐药判定折点值。

本发明还提供所述的优化达氟沙星治疗副猪嗜血杆菌的给药剂量的技术在指导临床用药中的应用。

本发明的有益效果是：

1、本发明获取了达氟沙星对副猪嗜血杆菌的野生型临界值，基本代表了我国副猪嗜血杆菌的分布以及耐药现状，所获取的野生型临界值代表了我国达氟沙星对副猪嗜血杆菌的体外抗菌效应；

2、本发明测定了达氟沙星在健康动物体内的药物代谢情况，获得了更稳定、可靠的达氟沙星在猪体内的药动学数据，并根据半体内的杀菌效应，获取了相应的药效学临界值；

3、本发明采用不同MIC副猪嗜血杆菌攻毒，得到了MIC与临床治疗效应之间的关系，进一步分析得到了其临床临界值；

4、本发明综合其野生型临界值、药效学临界值和临床临界值，建立了相应的给药剂量公式；

5、经过本发明中的用量优化方法优化得到的给药剂量对于治疗副猪嗜血杆菌时具有良好的效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为达氟沙星对副猪嗜血杆菌的MIC分布；

图2为副猪嗜血杆菌在TSB肉汤和猪肺泡灌洗液中的生长曲线；

图3为达氟沙星对副猪嗜血杆菌的体外杀菌曲线；

图4为达氟沙星对副猪嗜血杆菌的半体内杀菌曲线；

图5为CART回归树分析临床治疗的结果；

图6为敏感性折点获取流程图；

图7为本发明的技术路线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

本发明涉及的软件的操作过程均为本领域技术人员的常规技术手段，且并非发明要点，在此不做赘述。

实施例1副猪嗜血杆菌对达氟沙星的野生型临界值的获取

(1)达氟沙星对副猪嗜血杆菌的最小抑菌浓度(MIC)的测定

采用美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的琼脂稀释法测定达氟沙星对副猪嗜血杆菌的MIC，参考标准为M31-A3。质控菌为粪肠球菌ATCC 29212，质控药物为达氟沙星，质控范围为0.25μg/mL～1μg/mL，参考标准为M31-A3。每次测定MIC时均须同时测定质控菌株对质控药物的MIC，只有测定MIC在质控范围内，结果才可信。同时设定阳性对照和阴性对照，阳性对照为未添加药物的TSA平板，阴性对照为未加滴菌液的平板。

含药平板的制备：准确称取TSA培养基0.4g至25mL血清瓶中，添加8.65mL去离子水，加上灭菌膜后121℃高压灭菌15min。将1280μg/mL达氟沙星标准储液用TSB肉汤依次倍比稀释为640μg/mL,320μg/mL,160μg/mL,80μg/mL,40μg/mL,20μg/mL,10μg/mL,5μg/mL,2.5μg/mL,1.25μg/mL,0.6μg/mL,0.3μg/mL,0.15μg/mL,0.075μg/mL。将稀释后的药物按照1:9的比例添加到灭菌的加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSA培养基中，同时添加0.25mL无菌胎牛血清和0.1mL 1％NAD，涡旋混匀后，倾入培养皿，吹干后放置于-4℃备用。

菌悬液的制备：将细菌复苏后，在加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSA培养基中传代培养2次，挑取单菌落至加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSB肉汤中振荡培养12h～16h至对数生长期。采用麦氏比浊法将菌液用TSB肉汤稀释至0.5麦氏浊度，此时的菌液浓度约为1×10⁸CFU/mL，然后用TSB肉汤进行10倍稀释，使细菌浓度达到1×10⁷CFU/mL。

使用细菌多位点接种仪将稀释后的菌液接种于事先制备的含药平板上，将平板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养36h。

结果的判读：当质控菌株的MIC结果在质控范围内，并且在阳性对照平板中菌株均生长，在阴性对照平板中无细菌生长，则证明实验结果可信。以无细菌生长的含药平板所对应的最低药物浓度为MIC，参考标准为M31-A3。

(2)数据处理及野生型临界值的获取

非线性回归分析：将测得的达氟沙星对副猪嗜血杆菌的MIC数据整理分析，分别得到其MIC₅₀和MIC₉₀，见图1。再将所得MIC数据采用EUCAST提出的Ecoffinder软件进行模拟。Ecoffinder软件是利用非线性回归的原理编写的程序软件，将所得MIC数据输入Ecoffinder软件，设置初始数量为140，Log₂MIC_mean为2，Log₂MIC_SD为1，取置信区间为95％或97.5％的ECOFFs值为最终的野生型临界值。即达氟沙星对副猪嗜血杆菌的野生型临界值为16μg/mL，见表1。

表1达氟沙星对副猪嗜血杆菌的Ecoffinder拟合结果

实施例2副猪嗜血杆菌对达氟沙星药效学临界值的判定

(1)达氟沙星对副猪嗜血杆菌的体外药效学研究

①副猪嗜血杆菌生长曲线的绘制

将副猪嗜血杆菌菌株复壮后，接种于加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSB肉汤，37℃，220r/min振荡培养12h作为种子液。取种子液按1％的体积添加到预热至37℃的加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSB肉汤中，37℃，220r/min振荡培养。从0h至48h，每隔2h取0.1mL菌液用紫外分光光度计测定OD₆₀₀值，将测定结果以时间为横坐标，OD₆₀₀为纵坐标，绘制成曲线。副猪嗜血杆菌H80在猪肺泡灌洗液中生长曲线的测定方法与在加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSB肉汤中的试验方法相同，试验过程中将肺泡灌洗液用0.22μm滤膜过滤，然后代替TSB肉汤即可。

副猪嗜血杆菌在TSB肉汤和猪肺泡液中生长情况相似，见图2，在4h-12h副猪嗜血杆菌的生长速度最快，在12h以后，生长缓慢，在30h时菌液量达到最高。副猪嗜血杆菌在肺泡液中的生长趋势与在TSB肉汤一致，在4h-12h的生长速度最快，但生长速度明显较TSB肉汤中慢，在24h时，副猪嗜血杆菌在猪肺泡灌洗液中的浓度与在TSB肉汤中的浓度基本一致。

②最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

参考CLSI推荐的微量肉汤稀释法测定达氟沙星对副猪嗜血杆菌H80的MIC，参考标准为M31-A3。质控菌为粪肠球菌ATCC 29212，质控药物为达氟沙星，质控范围为0.25μg/mL～1μg/mL。每次测定MIC时均须同时测定质控菌株对质控药物的MIC，只有测定MIC在质控范围内，结果才可信。

菌悬液的制备：将副猪嗜血杆菌H80复苏后，在加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSA培养基中传代培养2次，挑取单菌落至加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSB肉汤中振荡培养12h～16h。采用麦氏比浊法将菌液用TSB肉汤稀释至0.5麦氏浊度，此时的菌液浓度约为1×10⁸CFU/mL，然后用TSB肉汤进行100倍稀释，使细菌浓度达到1×10⁶CFU/mL。

MIC的测定：将1280μg/mL达氟沙星标储液用TSB肉汤依次倍比稀释为128μg/mL,64μg/mL,32μg/mL,16μg/mL,8μg/mL,4μg/mL,2μg/mL,1μg/mL,0.5μg/mL,0.25μg/mL。取无菌的96孔板，向第1孔至第10孔各添加100μL菌悬液和100μL稀释后的药物，第11孔只添加TSB肉汤作为阴性对照，第12孔只添加菌悬液作为阳性对照。将添加完毕的96孔板标记完毕后转移至37℃，5％CO₂培养箱中培养24h后观察结果。

MBC的测定：吸取高于MIC药物浓度的3个梯度各100μL在加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSA平板上进行涂板计数，转移至37℃，5％CO₂培养箱中培养36h后观察结果。

MIC和MBC结果的判读：以96孔板中细菌不能生长的最低药物浓度作为MIC；以TSA平板上细菌不能生长的最低药物浓度作为MBC。

达氟沙星在猪肺泡灌洗液中对副猪嗜血杆菌H80的MIC和MBC测定方法与在加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSB肉汤中的试验方法相同，试验过程中将肺泡灌洗液用0.22μm无菌滤膜过滤，然后代替TSB肉汤即可。其测定结果见表2。

③达氟沙星对副猪嗜血杆菌耐药防突变浓度(MPC)的测定

以副猪嗜血杆菌H80作为研究对象，将菌株复苏后放入加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSB肉汤震荡培养12h，将菌液与0.5麦氏比浊管进行比对，当浓度达到10⁸CFU/mL时,以4000r/min的转速离心1min，将其浓缩为10¹⁰CFU/mL，备用。按已测定的MIC值配制含达氟沙星浓度分别为1MIC,2MIC,4MIC,8MIC,16MIC,32MIC的加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSA琼脂，在含药琼脂板上各接种备用10¹⁰CFU/mL菌液100mL，涂布均匀，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，以72h时没有菌落生长的最低药物浓度成为初测MPC即MPC_pr。再以MPC_pr为基准，线性递减20％的抗菌药物浓度，配制含相应药物浓度的含药平板，重复3次，以不出现菌落生长的最低药物浓度即为最终的MPC。其测定结果见表2。

表2副猪嗜血杆菌对达氟沙星的药敏试验结果

④达氟沙星对副猪嗜血杆菌杀菌曲线的绘制

菌悬液的制备：将副猪嗜血杆菌复苏后，在加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSA培养基中传代培养2次，挑取单菌落至加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSB肉汤中振荡培养12h～16h至对数生长期。采用麦氏比浊法将菌液用TSB肉汤稀释至0.5麦氏浊度，此时的菌液浓度约为1×10⁸CFU/mL，然后用TSB肉汤进行100倍稀释，使细菌浓度达到1×10⁶CFU/mL。

达氟沙星药液的准备：根据MIC实验结果，将1280μg/mL达氟沙星储备液用TSB肉汤依次稀释成0MIC,1MIC,2MIC,4MIC,8MIC,16MIC,32MIC,64MIC共8个系列浓度。

操作步骤：将稀释后的药液1.5mL和菌悬液1.5mL加入到细菌瓶中，混合后药物的终浓度为0MIC,1/2MIC,MIC,2MIC,4MIC,8MIC,16MIC,32MIC。将细菌瓶放置在37℃，5％CO₂培养箱中培养，分别在0h,1h,2h,4h,8h,12h,24h各取0.1mL涂板计数时，设置3个平行取平均值。以时间点为横坐标，以细菌的对数值为纵坐标绘制达氟沙星对副猪嗜血杆菌的杀菌曲线。根据杀菌曲线所呈现的杀菌特点决定所选择的PK-PD参数。

达氟沙星在猪肺泡灌洗液中对副猪嗜血杆菌H80的杀菌曲线的绘制与在加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSB肉汤中的试验方法相同，试验过程中将肺泡灌洗液用0.22μm无菌滤膜过滤，然后代替TSB肉汤；试验中达氟沙星的药物浓度与达氟沙星在猪肺泡灌洗液中不同时间点的药物浓度一致。

达氟沙星在TSB肉汤和猪肺泡灌洗液中的杀菌曲线(见图3、图4)可以看出，达氟沙星在血浆和肺泡液中的杀菌作用比较一致。体外杀菌曲线和半体内杀菌曲线均随着药物浓度的增加，杀菌曲线的斜率明显增加，达氟沙星对副猪嗜血杆菌的杀菌作用明显增强，呈现出明显的浓度依赖性，最终的药动学参数选择AUC/MIC。

⑤达氟沙星对副猪嗜血杆菌抗菌后效应(PAE)的测定

PAE的诱导：将达氟沙星标准储备液稀释至40MIC,20MIC,10MIC备用，对照管用无菌生理盐水代替。取不同浓度的达氟沙星溶液0.2mL分别与1.8mL的l0⁷CFU/mL的副猪嗜血杆菌H80混合，对照管做相同处理。将混匀的菌液置于37℃，5％CO₂培养箱中分别1h和2h。

药物的去除及重建：采用1000倍稀释法除去药物。以微量加样器分别取10μL上述试管中的药物与细菌的混合培养物，加入10mL肉汤培养液中，作1：1000倍稀释，即除去药物。此时为重建后的零时。

细菌生长动力学曲线的建立：重建后0h,1h,2h,4h,6h,8h和12h分别取菌液0.1mL，作10倍系列稀释，选取适宜浓度的0.1mL菌液于琼脂板上以无菌涂布棒将其涂布均匀，于37℃，5％CO₂培养箱中培养36h后计数，计数时设置3个平行取平均值。

根据公式计算PAE持续时间：PAE＝T-C。其中，T表示经PAE诱导的细菌在去除药物后细菌数量所增加10倍所需的时间；C表示未接触药物的对照组细菌数量增加10倍所需的时间。见表3。

表3达氟沙星对副猪嗜血杆菌H80的抗菌后效应

(2)达氟沙星在猪体内的药动学研究

①达氟沙星在猪体内的药动学实验

正式实验前12h给6头猪禁食，称重和编号。按体重准确吸取达氟沙星注射液，2.5mg/kg b.w.的剂量一次性肌肉注射。给药前通过前腔静脉采血一次，给药后分别在0.08h,0.16h,0.25h,0.5h,0.75h,1h,1.5h,2h,3h,4h,6h,8h,10h,12h,24h,36h和48h采集血液4mL。将采集后的血液加入到装有肝素钠的离心管中，3500r/min离心10min，取上清。利用之前建立的样品前处理方法对采集的血浆样品进行处理，然后用建立的高效液相色谱检测方法，检测样品中达氟沙星的含量。

给药后分别在0.5h,1h,1.5h,2h,3h,4h,6h,8h,10h,12h,24h,36h和48h采集肺泡灌洗液。将采集的肺泡灌洗液800r/min离心10min，分为2份，一份利用之前建立的样品前处理方法对采集的肺泡液样品进行处理，然后用建立的高效液相色谱检测方法，检测样品中达氟沙星的含量。一份用来测定尿素氮含量，样品标记后于-20℃冰箱中保存备用。

麻醉方案：实验猪只麻醉前6h禁食，自由饮水，并在水中添加食盐和葡萄糖，维持电解质和能量平衡，以防出现应激。以0.05mg/kg b.w.的剂量肌注阿托品，0.5h后对猪进行保定，于耳缘静脉静注10mg/kg b.w.的丙泊酚注射液，麻醉确实后可进行支气管插管，麻醉维持时间约为10min。

气管插管：将麻醉后的猪抬至手术台，手术台垫一层棉絮保暖，猪采取平卧姿势。用干净纱布条勒住猪的上下颚打开口腔，使猪口腔和喉部成一直线。打开猪口腔，找到会厌处，用喉镜压下会厌软骨，将电子支气管镜插入管插入气管，并通过显示器同步监测，直至插到第4级支气管。

肺泡灌洗：待插入管插至第4级支气管后，观察动物有无不良反应或是苏醒症状，然后注入50mL准备好的37℃温热生理盐水，停留20s后使用气泵回抽肺泡灌洗液，注意观察动物反应以控制回抽气压的大小。

按体重准确吸取达氟沙星注射液，2.5mg/kg b.w.的剂量一次性肌肉注射。通过高效液相色谱检测，得出血浆和肺泡液中达氟沙星的药动学参数，见表4。

表4猪单次肌注2.5mg/kg达氟沙星后猪肺泡灌洗液中的药动学参数

注：α表示分布速率常数；β表示消除速率常数；T_1/2α表示分布半衰期；T_1/2β表示消除半衰期；T_max表示达峰时间；AUC表示药时曲线下面积；C_max表示达峰浓度；CL_F表示生物利用度校正过的体清除率

②达氟沙星在肺泡液中蛋白结合率的测定

透析袋预处理方法可分为六步，将透析管剪成适当长度，10cm～20cm的小段，即形成透析袋；在大体积2％碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(pH＝8.0)中将透析袋煮沸10min；将透析袋用蒸馏水彻底漂洗；将透析袋置1mmol/L EDTA(pH＝8.0)中煮沸10min；将透析袋冷却，存放于4℃，应确保透析袋始终浸没在液体中；在使用前用蒸馏水将透析袋里外加以清洗。

取实验前预处理过的透析袋，剪成长度约8cm的小段，将其一端用棉绳扎紧，除去袋内外多余水份，用移液器精密吸取1mL空白肺泡液至透析袋中，扎紧袋口，使透析袋悬浮于盛有20mL含药浓度分别为0.1μg/mL,0.5μg/mL和4.0μg/mL透析液的100mL聚丙烯塑料离心管中，并调整透析袋位置，让透析袋内外液面保持在同一水平面，尽量避免使透析袋紧贴管壁，密封管口，放置于4℃冰箱中透析直至达到平衡，每个浓度设3个重复。

透析结束后，分别取透析袋内外的样品0.5mL，加入0.5mL乙睛，混匀。分别用10000r/min离心10min取水层过膜，转入进样瓶，检测。蛋白结合率计算公式如下：Fb＝(Dt-Df)/Dt×100％，其中Dt:透析袋内血浆药物浓度(总浓度)；Df:透析袋外缓冲液中药物浓度(游离药物浓度)。

(3)数据处理与PK-PD临界值的建立

①药动学数据处理

运用高效液相色谱法对获得的血浆和肺泡灌洗液样品进行药物浓度检测，得到采集的血浆和肺泡灌洗液中达氟沙星的浓度。通过尿素氮的检测，将每头猪血浆中的尿素氮含量除以对应的不同时间点肺泡液中的尿素氮含量，则为肺泡液中达氟沙星被稀释的倍数，从而求得药物在稀释前的初始浓度。根据达氟沙星在血浆和肺泡液中的半对数药时曲线，选择合适的药动学模型，用Winnonlin软件对血浆和肺泡液的药动学数据进行拟合，从而获得达氟沙星在血浆和肺泡液中的药动参数，如AUC,C_max,T_max等。

根据达氟沙星给药后不同时间点的药物浓度，向空白肺泡液中添加药物与细菌孵育，分别测定加药前细菌的数量和24h后细菌对数减少量，并计算各个浓度下的细菌孵育24h的半体内AUC₂₄。以(AUC₂₄/MIC)_ex为横坐标，不同药物浓度下24h后细菌的对数减少量为纵坐标作图，通过Winnonlin软件中的Hill方程模拟,分别求出E＝0,-3和-4时(AUC₂₄/MIC)_ex的数值，得到不同杀菌作用下对应的(AUC₂₄/MIC)_ex为药效学目标，见表5。

表5达氟沙星对副猪嗜血杆菌的半体内药效学参数

②药效学临界值的建立

使用Winnonlin软件模拟获得6头猪肺泡液和血浆中药动学参数AUC，计算平均值和标准差。药动学参数符合对数正态分布，根据计算结果使用Crystal ball软件进行蒙特卡洛模拟10000头猪的AUC₂₄。通过半体内杀菌曲线给出的不同杀菌作用下的药效学目标，分别计算不同药效学目标下，不同MIC时，AUC₂₄/MIC达到药效学目标的概率，得出不同杀菌作用下达标率大于等于90％的最大MIC即为药效学临界值。见表6。

表6肺泡液中达氟沙星对副猪嗜血杆菌在不同MIC下的达标率(PTA)

③初步给药方案的获取

将达氟沙星达到不同抗菌效果时所需要的PK-PD参数值，代入剂量计算方程，即可计算出达氟沙星达到不同抗菌效果时所需要的给药剂量。剂量计算方程如下：(Toutain et al 2002)，公式中Dose表示给药剂量；(AUC_24/MIC)_ex表示半体内药动学参数；CL/F表示生物利用度校正过的体清除率；MIC为临床病原菌的MIC值，可以是MIC₅₀或MIC₉₀；fu表示蛋白结合率。

应用Mlxplore软件模拟不同给药剂量和给药间隔下副猪嗜血杆菌的生长情况，获取出合理的给药方案，在有效治疗副猪嗜血杆菌病的同时，减少耐药菌株的产生。鉴于达氟沙星在肺组织中的浓度和AUC远远高于血浆中的浓度，其获取的临界值也高于血浆中的临界值，且副猪嗜血杆菌定殖于猪的上呼吸道，感染的靶位点就在肺部，故本试验最终选择了达氟沙星在肺部的药动学数据来进行给药方案的获取。计算得到预防剂量为4.58mg/kg，治疗剂量10.32mg/kg，根除剂量为15.97mg/kg，选择的给药方案为一天2次，给药间隔12h。

实施例3达氟沙星对副猪嗜血杆菌的临床临界值的获取

(1)临床治疗试验

攻毒菌株：根据致病性副猪嗜血杆菌的筛选结果，选择5个不同MIC的副猪嗜血杆菌，包括MIC₅₀、MIC₉₀、野生型临界值、药效学临界值以及最敏感菌株或其MIC附近的5株致病性副猪嗜血杆菌来进行攻毒。

给药方案：由于最终我们所需要得到的是治疗剂量下，MIC与POC之间的关系。故统一选用根据PK-PD实验所得到的达氟沙星对副猪嗜血杆菌的给药方案，来进行实验。

攻毒方案：将试验仔猪(20kg左右)分为11组，其中5组为实验组，5组为，1组为空白对照组，每组6头，共计66头。5个实验组分别攻毒5株不同的致病性副猪嗜血杆菌，以1×10¹⁰CFU的剂量，鼻内注射的方式攻毒，一天2次，攻毒一天；阴性对照组与实验组做相同的处理；空白对照组鼻内注射空白的TSB肉汤。

攻毒后密切观察猪只有无出现咳嗽、流鼻涕、体温升高、食欲减退及跛行等症状，对出现的症状进行评分，当出现明显副猪嗜血杆菌疾病症状，即任意一个症状达到2分时，开始给药，实验组给药，阴性对照组不给药，连续观察2周，当所有症状均转归，且降为0分，则为治疗成功，统计实验的临床治疗结果。剖检实验过程中死亡及濒死的猪，采用无菌操作从死亡动物血液、腹腔液、心包液、关节液、肺、气管等取样划线接种加有10μg/mL NAD与5％胎牛血清的TSA固体培养基，培养36h，PCR鉴定。此外，在攻毒前，攻毒后，给药前，给药后，采取每头猪的鼻腔拭子，进行副猪嗜血杆菌的分离培养，统计副猪嗜血杆菌临床治疗的细菌学预后的结果。

(2)临床数据与临床临界值的获取

统计临床治疗实验的临床治疗结果和细菌学预后。临床治疗结果包括成功和失败。每一个MIC都应该有一个对应的临床治疗结果。由于副猪嗜血杆菌在临床上主要引起精神不振、食欲下降、体温升高、关节跛行等，在实验组给药后观察发病猪的症状，当所有症状均恢复到0分，即为临床治疗成功。细菌学预后主要考察攻毒给药后，细菌在猪体内的生长状况，当从猪的鼻腔拭子中无法分离到副猪嗜血时，即为细菌根除。当临床治疗成功且细菌根除时，则为抑制。统计实验组各细菌的抑制率，整理MIC与抑制率之间的关系。结果见表7。

表7达氟沙星对不同MIC的副猪嗜血杆菌的抑制率(POC)

将所得数据先用“WindoW”方法对临床治疗的结果进行的分析，测定其参数值MaxDiff和CAR。得到MaxDiff和CAR所形成达氟沙星对副猪嗜血杆菌的的临床临界值的选择窗为0.125μg/mL～4μg/mL。见表8。

表8 MaxDiff and CAR模拟结果

再根据EUCAST提议的POC与MIC之间的公式，利用Spss软件中的非线性回归对所得数据进行拟合，以Log2MIC为自变量，POC为因变量，选择与实验数据相关系数最高的模型来模拟，其相关系数为0.996，模型表达式为y＝80.989-7.271x+0.271x²+0.16x³。所推荐的临床临界值即为0.428μg/mL。

最后，再将临床试验的数据带入Salford Predictive Modeler软件，进行CART分析，以MIC为预测变量，临床治疗结果为目标变量。CART用Gini系数最小化准则自动选择节点对MIC进行分割，生成回归树，得到不同MIC区间的抑制率。CART回归树分析临床治疗的结果见图5。综合分析以上3种方法，以抑制率大于等于90％所对应的MIC值为最终临床临界值。CART分析选择的节点为MIC＝0.56μg/mL，从回归树可知，当MIC≤0.56μg/mL时，抑制率为100％，当MIC>0.56μg/mL时，抑制率为72.2％。当POC等于90％时，MIC应该小于0.56μg/mL，因此得到临床临界值应当小于0.56μg/mL。

综合上述分析方法，对本试验所得的POC分布进行眼观分析，POC等于90％时的MIC应位于0.125μg/mL～1μg/mL；“WindoW”方法推荐的临床临界值的选择窗为0.125μg/mL～4μg/mL，范围较大；非线性回归分析表明，当抑制率大于等于90％时，MIC≤0.428μg/mL，所推荐的临床临界值即为0.428μg/mL；CART回归树分析所得的临床临界值小于等于0.56μg/mL，结合本实验的MIC分布，从测得的MIC中选择符合范围的最大的MIC即0.25μg/mL作为本实验的临床临界值，即达氟沙星对副猪嗜血杆菌的临床临界值为0.25μg/mL。

实施例4达氟沙星对副猪嗜血杆菌耐药性判定标准的获取

已有的研究均没有报道有关耐药判定标准建立的方法，本试验主要参考CLSI建立人用药物的耐药判定标准建立的流程。综合上述实验，已知达氟沙星对副猪嗜血杆菌的野生型临界值为16μg/mL，药效学临界值为0.5μg/mL，临床临界值为0.25μg/mL。将这3个临界值带入CLSI公布的折点获取的流程图(图6)，符合CO_WT>CO_PD>CO_CL，对应的耐药判定折点值(BP)等于野生型临界值，可得到达氟沙星对副猪嗜血杆菌的耐药判定标准为16μg/mL。

实施例5达氟沙星对副猪嗜血杆菌给药剂量公式的优化

达氟沙星是第3代动物专用氟喹诺酮类药物，对大部分的猪呼吸道细菌包括猪传染性胸膜肺炎、猪支原体的MIC都比较低，且治疗效果好，而目前还没有用达氟沙星来治疗副猪嗜血杆菌的文献，因此达氟沙星的推荐用药剂量没有考虑到副猪嗜血杆菌的治疗效果，相对比较低，对于获取的药效学临界值有所影响。在获取临床临界值时，样本数量非常有限，对结果也造成了一定的影响。根据已有的给药剂量公式(Toutain et al 2002)，本发明将临床病原菌的MIC值替换为敏感性折点，采用获取的耐药判定折点值来代表临床病原菌的MIC值，更具有临床意义。可得到达氟沙星对副猪嗜血杆菌的优化给药方案为计算得到不同杀菌作用(抑菌、杀菌和根除)下优化的给药剂量分别为18.33mg/kg,41.29mg/kg和63.90mg/kg。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种达氟沙星在治疗副猪嗜血杆菌药物中的用途，其特征在于：其用量优化方法为：

(1)获取副猪嗜血杆菌对达氟沙星的野生型临界值；

(2)获取副猪嗜血杆菌对达氟沙星的药效学临界值；

(3)获取副猪嗜血杆菌对达氟沙星的临床临界值；

(4)利用上述三种临界值，建立副猪嗜血杆菌对达氟沙星的耐药判定折点值；

(5)运用耐药判定折点值优化达氟沙星治疗副猪嗜血杆菌的给药剂量，具体公式为公式(1)中，Dose表示给药剂量；(AUC_24/MIC)_ex表示半体内药动学参数；CL/F表示生物利用度校正过的体清除率；fu表示蛋白结合率，BP为耐药判定折点值。

2.根据权利要求1所述的一种达氟沙星在治疗副猪嗜血杆菌药物中的用途，其特征在于：步骤(1)所述获取副猪嗜血杆菌对达氟沙星的野生型临界值的过程包括：对副猪嗜血杆菌进行鉴定，测定达氟沙星对副猪嗜血杆菌的MIC，整理分析得到的MIC数据，用Ecoffinder软件模拟，得到副猪嗜血杆菌对达氟沙星的野生型临界值。

3.根据权利要求1所述的一种达氟沙星在治疗副猪嗜血杆菌药物中的用途，其特征在于：步骤(2)所述药效学临界值的获取包括：给猪肌肉注射2.5mg/kg b.w.的甲磺酸达氟沙星注射液，测定不同时间点血浆和肺泡液中的药物浓度，用Winnonlin软件模拟出相关的PK-PD参数，用蒙特卡洛软件模拟得到达标率为90％以上所对应的最大MIC值为最终的药效学临界值。

4.根据权利要求1所述的一种达氟沙星在治疗副猪嗜血杆菌药物中的用途，其特征在于：步骤(3)所述临床临界值是根据达氟沙星对副猪嗜血杆菌的临床有效性建立的，通过CART软件、“WindoW”和非线性回归模拟得到。

5.根据权利要求1所述的一种达氟沙星在治疗副猪嗜血杆菌药物中的用途，其特征在于：步骤(4)耐药判定折点值的判定包括：将得到的3个临界值按照CLSI的折点获取流程图来分析，得到达氟沙星对副猪嗜血杆菌的耐药判定标准。

6.根据权利要求1所述的一种达氟沙星在治疗副猪嗜血杆菌药物中的用途，其特征在于：步骤(5)中运用耐药判定折点值优化达氟沙星治疗副猪嗜血杆菌的给药剂量，将得到的敏感性折点带入给药剂量公式(2)，替换其MIC值，得到优化给药剂量公式(1)，

其中，给药剂量公式为

公式(2)中，Dose表示给药剂量；(AUC_24/MIC)_ex表示半体内药动学参数；CL/F表示生物利用度校正过的体清除率；MIC为临床病原菌的MIC值，可以是MIC₅₀或MIC₉₀；fu表示蛋白结合率。

7.根据权利要求2所述的一种达氟沙星在治疗副猪嗜血杆菌药物中的用途，其特征在于：所述野生型临界值的获取以达氟沙星对至少100株临床副猪嗜血杆菌的MIC为基础，采用Ecoffinder软件模拟得到。

8.根据权利要求4所述的一种达氟沙星在治疗副猪嗜血杆菌药物中的用途，其特征在于：所述临床临界值的获取包括：选取血清5型的5个不同MIC的副猪嗜血杆菌进行临床实验，以PK-PD推荐的治疗剂量为给药剂量，统计实验对副猪嗜血杆菌的抑制率，分析MIC与抑制率之间的关系，取抑制率大于等于90％的最大MIC为最终的临床临界值。

9.根据权利要求5所述的一种达氟沙星在治疗副猪嗜血杆菌药物中的用途，其特征在于：所述敏感性折点由野生型临界值、药效学临界值和临床临界值，采用Susceptibilitybreakpoints tree获取。