CN110232955A - 一种头孢喹肟药动-药效同步模型的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种头孢喹肟药动‑药效同步模型的构建方法及其应用，具体内容包括：检测抗菌药物对相应细菌微生物的药物敏感性，获得MIC分布范围；利用液相色谱检测法测定健康和疾病模型动物给药后不同时间点所得血浆样本中的游离药物浓度，获得药时曲线；用药代动力学软件对药物的药代动力学参数进行拟合，获得PK参数；研究体外和半体内条件下抗菌药物对致病性细菌的抗菌作用，进行拟合后获得PD参数；根据Sigmoid E_max方程建立半体内PK‑PD模型；基于此模型，利用剂量计算方法和Mlxplore软件，制定不同给药目的下的给药方案；本发明对于头孢喹肟在临床医学上的应用具有指导性意义。

Description

一种头孢喹肟药动-药效同步模型的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于临床医学领域，具体涉及一种头孢喹肟药动-药效同步模型的构建方法及其应用。

背景技术

近年来，由于抗菌药物的不规范使用以及滥用，导致细菌耐药性的快速产生及传播，很多细菌的耐受药物逐渐增多，且耐药比率亦是日益增高，有些对抗菌药物的耐药率甚至高达100％，目前临床上关于抗菌药物的用药亟需得到科学合理的规范，以减缓细菌耐药性产生和传播的速度。

药代动力学-药效动力学(Pharmacokinetic-pharmacodynamic,PK/PD)结合模型反映了药物的体内过程、药物对机体的效果以及随时间产生的变化之间的关系。将PK/PD结合模型用于临床抗菌药物给药方案制定优化，可以为抗菌药物用药方案的制定提供科学依据。

迄今为止，关于抗菌药物PK/PD结合模型的研究已有很多报道，但是很多研究内容存在如下问题：(1)仅是停留在体内抗菌药物的吸收分布代谢消除上，忽略了PK/PD结合模型与抗菌药物给药方案及治疗效果之间的因果关系；(2) 未针对病灶组织或器官，研究方式存在一定的错误。有报道称通过定点宰杀实验动物，取肺组织经研磨前处理方法得到抗菌药物在猪肺泡液中的药动学参数，该方法不仅浪费大量的实验动物，而且通过研磨等前处理得到的肺部药物浓度并不能代表肺部真实的药物浓度，与真实结果存在较大误差。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种头孢喹肟药动-药效同步模型的构建方法；目的之二在于提供一种头孢喹肟药动-药效同步模型的构建方法在临床医学上的应用；本发明通过细菌对抗菌药物的体外药物敏感性检测、抗菌药物在实验动物体内的药代动力学研究，以及在半体内条件下的药效动力学研究，建立半体内 PK/PD结合模型，为抗菌药物防耐药给药方案的制定提供参考标准，维持和保护抗菌药物临床治疗有效性。

为达到上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

技术方案一：

一种头孢喹肟药动-药效同步模型的构建方法，其特征在于：它包括如下步骤：

a.测定头孢喹肟对致病菌猪链球菌的体外药物敏感性：将猪链球菌的冻干菌种复苏传代，获得工作菌液，将头孢喹肟灭菌后制备琼脂平板，将工作菌液接种至琼脂平板上，恒温培养后观察记录头孢喹肟对猪链球菌的MIC 分布范围；

b.筛选具有致病性的菌株；

c.获得头孢喹肟在健康和疾病模型动物体内的药代动力学参数：对健康和患病动物进行肌内注射头孢喹肟，于给药前以及给药后不同时间点用支气管镜肺泡采样仪采取肺泡灌洗液，采用液相色谱法检测不同时间点所得肺泡灌洗液中的药物浓度，利用尿素氮检测法确定肺液中药物原始浓度，采用药代动力学软件计算相关的药代动力学参数，即PK参数，以及绘制半对数药时曲线；

d.研究体外和半体内条件下头孢喹肟对细菌的药效动力学：用不同时间点所得肺泡灌洗液测定半体内杀菌曲线，拟合体内中的药物浓度与杀菌效应之间的关系，获得PD参数；通过半体内杀菌曲线类型选择相应的PK-PD 参数，使用药代动力学软件模拟SigmoidE_max PK-PD模型方程模拟患病组和健康组肺液药效学数据，得到抗菌效果为E＝0，E＝-3，E＝-4条件下的 PK-PD靶值，分别获得预防、治疗和彻底根除猪链球菌感染的药物剂量；其中E＝0为抑菌作用；E＝-3为杀菌作用；E＝-4为清除作用；利用E＝0， E＝-3，E＝-4条件下的PK-PD靶值，通过公式(1)计算得到E＝0、-3、-4 条件下的药用剂量；其中E＝0为抑菌作用；E＝-3为杀菌作用；E＝-4为清除作用；

公式(1)如下：

其中：Dose为给药剂量；(AUC_24h/MIC)_ex为半体内PK-PD参数值； MIC为头孢喹肟对猪链球菌的最低抑菌浓度，CL/F为生物利用度校正过的体清除率，fu为游离药物浓度；

e.利用Mlxplore软件模拟这三个剂量下猪链球菌随着体内药物浓度变化的生长趋势变化，确定给药间隔，由此得到抑菌、杀菌和除菌三个目的的三种给药剂量。

作为本发明的进一步改进，b步骤中所述具有致病性的菌株为由步骤a中得到的范围为MIC₉₀的猪链球菌菌株。

作为本发明的进一步改进，c步骤与d步骤中所述药代动力学软件为 WinNonlin软件。

作为本发明的进一步改进，所述Sigmoid E_max PK-PD模型方程为Hill方程，用于表示半体内PK-PD参数与抗菌效果之间的对应关系，公式如下：

其中：E表示细菌在各时间点肺泡灌洗液中培养24h后菌落减少的对数值； E_max表示空白肺泡灌洗液接种培养细菌24h后与初始接种菌落对数值的差值； E₀表示肺泡灌洗液中接种细菌培养24h后与初始接种菌落对数值的最大差值；C 表示半体内参数值；EC₅₀表示肺泡灌洗液样品中达到最大杀菌数一半时的半体内参数值；N代表Hill系数；其中E_max和E₀可由半体内杀菌数据得到，EC₅₀和 N值由WinNonlin软件模拟而来。

作为本发明的进一步改进，所述步骤c中尿素氮检测法为采用尿素氮试剂盒进行检测。

作为本发明的进一步改进，所述半体内杀菌曲线是在采集的肺泡灌洗液基础之上，采用琼脂平板计数方法进行检测得到的。

技术方案二：

一种头孢喹肟药动-药效同步模型的构建方法在临床医学上的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

以疾病模型为研究对象，使用WinNonlin药代动力学软件工具，拟合抗菌药物在病灶组织的药代动力学和半体内药效动力学特征，建立半体内PK/PD结合模型，最终得到预防疾病、治疗疾病、彻底根除目的下的三种给药方案，以期为临床抗菌药物的使用方案进行优化，缓解细菌耐药性的产生。

本发明构建的PK/PD结合模型为半体内模型，即使用实验动物肺泡液为生物基质研究药效动力学。

利用Mlxplore软件模拟这三个剂量下猪链球菌随着体内药物浓度变化的生长趋势变化，确定给药间隔。其原理是预测不同给药剂量和给药间隔下细菌的生长情况，从而判断不同给药方案和给药间隔对细菌生长变化的影响，由此得到抑菌、杀菌和除菌三个目的的三种给药方案。

附图说明

图1为猪肌内注射头孢喹肟(2mg/kg b.w)肺泡液半对数药时曲线；

图2为头孢喹肟在肺泡灌洗液中的色谱图(左：空白BALF；右：肺泡灌洗液样品0.1ppm)；

图3为头孢喹肟在肺泡灌洗液中的标准曲线和工作曲线；

图4为TSB肉汤中头孢喹肟对猪链球菌0061菌株的体外杀菌曲线；

图5为肺泡灌洗液中头孢喹肟对SS0061菌株的半体内杀菌曲线；

图6为半体内PK-PD参数值和细菌对数变化模型拟合图；

图7为Mlxpolre软件模拟不同给药方案下的细菌生长情况；

注：上图为间隔12h连续给药三天；下图为间隔24h连续给药三天。

具体实施方式

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限值和下限值之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述的范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限值和下限值可独立地包括或排除在范围内。

另外，为了更好地说明本发明的内容，在下文的具体实施例中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。关于本发明的技术指标的测定方法均为本领域内使用标准方法，具体可参见最新的国家标准，除非另外说明。

以下实施例中所用到的猪链球菌冻干菌种购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1316，保藏地址为：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期：2005年2月21日。

其他来源的商购的猪链球菌冻干菌种同样能够实现本发明的以下方案。

实施例1

1.1猪链球菌对头孢喹肟体外药物敏感性的测定

将冻干的菌种复苏传代，取单个菌落混悬于加血TSB肉汤培养基中增菌培养，待细菌达到生长对数期后方可进行药敏试验。试验前需将原菌液用0.5的麦氏标准比浊管(McFarland)目测比浊制成1～2×10⁸CFU/mL的细菌悬液，再用无菌TSB肉汤按1:100稀释以获得10⁶CFU/mL接种量的工作菌液。

将1280μg/mL的头孢喹肟标准储备液用灭菌的超纯水进行1:4、1:8、1:16 等系列稀释，得到320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.6、0.3、0.15、 0.075μg/mL的工作药液，向已灭菌好的17mL TSA琼脂中加入1mL的小牛血清，然后分别加入2mL各浓度的工作药液，每个浓度共20mL，轻柔翻转数次混匀，注意不可产生气泡，然后倾倒9cm的平板，冷却凝固后即可得到含头孢喹肟浓度32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015、0.0075μg/mL的琼脂平板。

用多位点接种仪接种1-2μL制备好的菌液至每个平板表面，菌落数在10⁴ CFU/点左右，仔细操作，避免喷溅，另外需要准备两个不含药物的空白板作为对照，点种结束后，需要等到平板完全吸收接种物后，再放入37℃恒温培养箱中培养，24h后观察并记录MIC值。根据敏感性检测结果可知(表1)，头孢喹肟对猪链球菌的MIC范围在0.015～8μg/mL之间，MIC₉₀为0.25μg/mL。

表1 342株猪链球菌对头孢喹肟的敏感性菌株分布

1.2头孢喹肟在健康和疾病模型猪体内的药代动力学研究

试验猪分为健康组和致病菌攻毒模型组，每组8头。正常饲养一周以适应环境，减少环境对猪产生的应激反应。正式试验前12h禁食，称重编号。按照临床推荐剂量2mg/kgb.w单次颈部肌内注射硫酸头孢喹肟注射液(沃克炎)。

健康组和患病组猪只给药前采集空白肺泡液，给药后分别在0.25h、0.5h、 1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h时间点用支气管镜肺泡采样仪采取肺泡灌洗液，进行肺泡采样前需对猪只进行麻醉，麻醉前 6h禁食禁水，以0.05mg/kg b.w的剂量肌内注射阿托品注射液，后于耳缘静脉处按照5-9.5mg/kg b.w剂量静脉注射丙泊酚注射液，观察到猪只眼睑反射不敏感即为麻醉成功。用干净纱布条勒住猪的上下颚打开口腔，使猪口腔和喉部呈一直线，将喉镜伸至会厌软骨处，压下会厌软骨，找到气管口，将电子纤维支气管插入气管，观察计算机显示屏，待插到第四级支气管后，注入50mL温热生理盐水，停留20s后按住气泵回抽肺泡灌洗液，在此过程应随时观察动物状态，若有不良反应随时准备抢救。采集的肺泡灌洗液在4℃800r/min条件下离心 10min，除去其中的细胞，取上清置于-20℃保存备用。

采集的肺泡灌洗液为生理盐水稀释的样品，因此需要检测肺泡灌洗液的稀释倍数，采用尿素氮(BUN)试剂盒检测血浆和肺泡液中尿素氮浓度，确定肺泡灌洗液中药物的稀释倍数，从而得到稀释前肺泡液中的药物初始浓度(下表2)，半对数药时曲线见图1。利用WinNonlin数据处理软件中的房室模型对药时数据进行拟合，得到相应的药动学参数，见下表3。

表2猪肌内注射头孢喹肟(2mg/kg b.w)肺泡液中药物浓度(n＝8)

注：ND表示低于LOD。

表3猪肌内注射(2mg/kg b.w)头孢喹肟肺泡液药动学参数(n＝8)

注：AUC：药时曲线下面积；C_max：药物峰浓度；T_max：达峰时间；T_1/2α：吸收半衰期；T_1/2β：消除半衰期；α：分布相速率常数；β：消除相速率常数；CL/F：生物利用度校正的体清除率。

使用高效液相色谱法测定肺泡液中头孢喹肟的浓度水平：

色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq(250mm×4.6mm,5μm)，流动相：0.05％磷酸溶液：乙腈，梯度洗脱条件(0min，90:10；5min，90:10；8min， 85:15；8.1min，90:10；15min，90:10)，检测波长为265nm，流速为1mL/min，进样量为30μL，柱温30℃。

样品前处理方法取0.5mL肺泡灌洗液样品，加入1mL乙腈沉淀蛋白，涡旋2min，10000g离心力下离心10min，取上清液加入到另一离心管中，加入 1.5mL的二氯甲烷，涡旋15s，10000g离心力下离心10min，取上清液过0.22μm 滤膜后上样检测。

特异性和专一性取空白肺泡灌洗液样品、头孢喹肟标准工作液和添加0.1 μg/mL药物浓度的血浆或肺泡灌洗液样品，按照样品前处理方法处理，进行HPLC 检测，重复测定5次。经前处理方法处理后，头孢喹肟出峰附近无杂峰干扰，峰形尖锐，峰宽良好，符合高效液相方法学的要求，测定结果见图2。

检测限(LOD)和定量限(LOQ)在空白肺泡灌洗液中加入一系列较低浓度的头孢喹肟，使肺泡液中的头孢喹肟浓度分别为1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、 0.08μg/mL、0.05μg/mL、0.04μg/mL、0.03μg/mL，按照样品前处理方法处理后进行HPLC检测。每个浓度样品5个平行，重复测定5d，取25次测定结果均值，以达到信噪比S/N大于等于3时样品的最低浓度为该方法的LOD，以达到信噪比S/N大于等于10时样品的最低浓度确定为该方法的LOQ。头孢喹肟在肺泡液中的检测限和定量限分别为0.03μg/mL和0.08μg/mL。

标准曲线和工作曲线取一定量头孢喹肟标准储备液，用流动相稀释成0.08 μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，进行HPLC检测。在肺泡灌洗液中加入一系列浓度的头孢喹肟，使肺泡液中的药物终浓度分别为 0.08μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，经过样品前处理方法处理后进行HPLC检测。每种浓度每天重复测定5次，重复检测5d，将峰面积均值作纵坐标，对应浓度为横坐标，绘制计算标准曲线及肺泡灌洗液工作曲线和相关系数，见图3。

准确度和精密度准确度和精密度分别用回收率和变异系数进行表示。取空白肺泡灌洗液样品，添加一定浓度头孢喹肟，使得样品终浓度分别为0.1μg/mL、 1μg/mL、5μg/mL，按照样品前处理方法处理，进行HPLC检测。同一天内每个浓度重复5次，取平均值，计算日内变异系数；每个浓度重复5d，计算日间变异系数；将测得的峰面积带入头孢喹肟标准曲线线性方程，求出对应的浓度真值，比较求得的真实值和理论值之间的差异，计算回收率，见下表4。

表4猪血浆和肺泡灌洗液中头孢喹肟的准确度和精密度

1.3头孢喹肟对致病性猪链球菌的药效学研究

利用多重PCR方法鉴定猪链球菌毒力血清型，选择出一株具有致病性的 MIC₉₀菌株。参照CLSI推荐的微量肉汤稀释法测定头孢喹肟对致病性猪链球菌的MIC，参考标准为CLSI-M07A8-2010，质控菌株选择大肠杆菌ATCC25922。

体外MIC的测定取200μL的药物浓度稀释为16μg/mL的头孢喹肟标准储备液，加入96孔板的第1列，吸取100μL的TSB肉汤分别加入96孔板的第2-10 列。从第1列加有储备液的孔中吸取100μL到第2列对应孔，混匀，从第2列吸取100μL混合液到第3孔，依次一直到第10孔，然后从第10孔中吸取100μL 到第12孔，如此经二倍稀释为16.00μg/mL、8.00μg/mL、4.00μg/mL、2.00μg/mL、 1.00μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.06μg/mL、0.03μg/mL，将96孔板的第1-11列孔中分别加入100μL 1×10⁶CFU/mL有活力的工作菌液，其中第11孔为只含菌液不含药物的阳性对照孔，第12孔为只含培养基药物不含菌的阴性对照孔，放入37℃恒温培养箱中培养24小时后记录结果。每次设三个重复，重复三次试验，保证试验结果真实可靠。

体外MBC的测定根据CLSI的M26-AE号文件中推荐的方法进行测定，可与最小抑菌浓度实验同时进行。在测定MIC的步骤中，将工作菌液10倍梯度稀释至适当浓度，取100μL接种与TSA琼脂平板上，放入37℃恒温培养箱中培养 24小时后进行菌落计数，得到初始接种菌落数。然后将培养24h测定MIC值的 96孔板从培养箱中取出，移入无菌操作台中，从最低抑菌浓度以上无细菌生长的清亮孔中各取10μL直接转入或做10倍稀释后转入TSA琼脂平板上，放入37℃恒温培养箱中培养24小时后进行菌落计数。以刚好杀死99.9％的初始接种量的头孢喹肟药物浓度为最小杀菌浓度。实验重复三次，保证实验结果可靠性。

半体内MIC和MBC的测定方法步骤同体外检测方法相同，只需将TSB肉汤替换成肺泡灌洗液即可。

检测结果见下表5。头孢喹肟对猪链球菌的MIC在体外TSB肉汤中和肺泡灌洗液中都为0.125μg/mL，在TSB肉汤和肺泡灌洗液中的MBC分别为 0.125μg/mL和0.25μg/mL。

表5头孢喹肟对SS0061菌株体外和半体内MIC和MBC

体外杀菌曲线体外杀菌曲线是在MIC测定的基础之上采用琼脂平板计数方法进行检测。根据最低抑菌浓度的测定结果，取少量头孢喹肟标准储备液，先用TSB肉汤稀释至64MIC，后进行倍比稀释，依次稀释为32MIC、16MIC、8MIC、 4MIC、2MIC、1MIC、0MIC系列浓度。后取不同浓度的头孢喹肟工作液3mL，加入到含有3mL 1.5×10⁸CFU/mL浓度备好的试验工作菌液细菌瓶中，混合均匀，此时药物浓度变为初始1/2倍，即依次为16MIC、8MIC、4MIC、2MIC、1MIC、1/2MIC、0MIC。然后将细菌瓶置37℃恒温培养箱中培养，分别在0、1、2、4、 6、8、12、24h各取0.1mL混合悬液经过适当稀释后进行涂板计数。然后将平板放于37℃恒温培养箱中培养24h后进行计数，最低检测限为10CFU，以所有时间点为横坐标，得到的细菌总数对数值为纵坐标，绘制不同浓度头孢喹肟对猪链球菌SS0061菌株的体外杀菌曲线(见图4)。

半体内杀菌曲线考虑到肺泡灌洗液已经过生理盐水稀释，可能其中的各种肺泡液成分也经稀释，因此为保持和动物体内的肺泡液一致，将肺泡灌洗液冷冻干燥浓缩。按照尿素氮检测稀释倍数结果，将空白肺泡灌洗液进行浓缩，然后添加一定比例的头孢喹肟药液，配置成不同时间点的含头孢喹肟药物浓度的肺泡液。半体内杀菌曲线是在采集的肺泡液基础之上，采用琼脂平板计数方法进行检测。具体步骤为：取少量头孢喹肟标准储备液，先用TSB肉汤稀释至10μg/mL，取空白肺泡灌洗液，经过滤除菌后按照比例配制0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、3 h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h时的含药肺泡液。后取各时间点的肺泡灌洗液0.5mL，添加10μL 1.5×10⁶CFU/mL浓度有活力的菌液，混合均匀后，将细菌瓶放于37℃恒温培养箱中培养，分别在0、1、2、4、8、12、24h 后取0.1mL混合悬液经过适当稀释后进行涂板计数。

将平板置于37℃恒温培养箱中培养24h后进行计数，最低检测限为10CFU。由结果(图5)可知肺泡灌洗液中头孢喹肟对猪链球菌SS0061的杀菌效果随着时间的延长，药物浓度的增加，表现出的杀菌能力也随之增强。因此在半体内条件下，头孢喹肟对猪链球菌的杀菌效应呈现出时间依赖型，同时也伴有一定程度的浓度依赖型。

1.4 Sigmoid Emax PK-PD结合模型的构建

由半体内杀菌数据可知，头孢喹肟在肺泡液中表现出来的杀菌效应具有时间依赖型和一定程度的浓度依赖型特点，因此对于半体内PK-PD参数的选择可通过参数值和细菌对数减少量之间模型拟合的相关系数R²来确定，结果见下图6。分析结果可知，(AUC_24h/MIC)_ex的相关性为0.9987。最终选择(AUC_24h/MIC)_ex参数值进行半体内PK-PD模型的拟合。

半体内PK-PD模型的拟合是模拟健康组和患病组半体内杀菌曲线数据和对应的PK-PD参数值之间的关系，具体见下表6和7。其中，(AUC_24h/MIC)_ex是通过HPLC检测得到的健康组和患病组肺泡灌洗液中不同时间点头孢喹肟药物浓度的平均值，然后乘以半体内培养时间24h再除以最低抑菌浓度。细菌对数减少值为健康组和患病组肺泡液中细菌培养24h后与0h之间的细菌对数变化量。

表6健康组肺泡液半体内PK-PD参数值和抗菌效应值

注：(AUC_24h/MIC)_ex为半体内PK-PD参数值；E为各时间点肺泡灌洗液接种培养 24h后菌落对数值的差值。

表7患病组肺泡液半体内PK-PD参数值和抗菌效应值

注：(AUC_24h/MIC)_ex为半体内PK-PD参数值；E为各时间点肺泡灌洗液接种培养 24h后菌落对数值的差值。

然后通过Sigmoid E_max模型，即Hill方程来表明半体内PK-PD参数与抗菌效果之间的对应关系。公式如下：

公式(2)中E表示细菌在各时间点肺泡灌洗液中培养24h后菌落减少的对数值；E_max表示空白肺泡灌洗液接种培养细菌24h后与初始接种菌落对数值的差值；E₀表示肺泡灌洗液中接种细菌培养24h后与初始接种菌落对数值的最大差值；C表示半体内参数值；EC₅₀表示肺泡灌洗液样品中达到最大杀菌数一半时的半体内参数值；N代表Hill系数。描述了半体内PK-PD参数值与效应E直线化后的斜率，决定S型曲线关系的陡度。其中E_max和E₀可由半体内杀菌数据得到，EC₅₀和N值由WinNonlin软件模拟而来。

利用不同E值所对应的不同治疗效应来计算得到所对应的的PK-PD参数值。当E＝0时，表示培养前后细菌对数变化量无差异，可抑制细菌生长，起到预防作用；当E＝-3时，表示培养适当时间后可杀灭99.9％的细菌，起到治疗作用；当E＝-4时，表示培养适当时间后可杀灭99.99％的细菌，可根除病原菌，防止耐药菌的产生，起到根除作用。

表8猪肌内注射(2mg/kg b.w)头孢喹肟肺泡液Sigmoid E_max模型拟合结果

注：(AUC_24h/MIC)_ex E为各时间点肺泡灌洗液接种培养24h后菌落对数值的差值；E_max为空白肺泡灌洗液接种培养24h后与初始接种菌落对数值的差值；E₀为肺泡灌洗液样品接种培养24h前后与初始接种菌落对数值的最大差值；C为半体内 PK-PD参数值；EC₅₀为肺泡灌洗液样品中产生50％最大杀菌作用时半体内PK-PD 参数值；N为Hill系数，描述半体内PK-PD参数值与效应E直线化后的斜率，决定S型曲线关系的陡度。

通过Sigmoid E_max模型方程可以计算出抗菌药物达到不同抗菌效果时所需的 PK-PD模型参数值(见上表8)，带入剂量计算公式即可算出抗菌药物浓度达到不同抗菌效果(预防、治疗、根除)所需要的给药剂量。得到不同给药目的下的剂量，具体见下表9。最终得到预防、治疗、清除给药剂量分别为1.37、2.61、3.64 mg/kg b.w。剂量计算公式如下：

公式(1)中AUC₂₄/MIC值为当E＝0(抑菌)时所对应的PK-PD参数值；MIC 为测定的最低抑菌浓度；CL/F为生物利用度校正过的体清除率；fu为药物游离度。

表9不同给药目的下头孢喹肟给药剂量

通过Mlxplore软件模拟预测三个给药剂量(预防、治疗、清除)和不同给药间隔下细菌的生长情况，从而得到最佳的给药方案和给药间隔。由图7可知，给药间隔为24h情况下，1.37mg/kg b.w给药剂量不能达到抑菌作用，2.61mg/kg b.w 给药剂量，杀菌效果并不理想，3.64mg/kg b.w给药剂量下，可达到较好的杀菌效果，但药物浓度变化趋势表明药物有效浓度维持较短；在给药间隔为12h情况下，1.37mg/kg b.w给药剂量可起到抑菌作用，2.61mg/kg b.w给药剂量，可取得较为理想的杀菌效果，且药物有效浓度在动物体内可维持较长时间；3.64mg/kg b.w给药剂量下，可达到非常理想的杀菌效果。综上所述，三种给药剂量下，按照2.61mg/kg b.w给药剂量一天给药两次的给药方案为最理想的选择。

本发明中，Mlxplore软件、WinNonlin软件的使用方法和工作原理均为本领域的公知常识，本发明应用的也是两个软件的常规的功能模块，实现的也是常规技术效果，且这两款软件并非发明要点，其工作过程在此不做赘述。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种头孢喹肟药动-药效同步模型的构建方法，其特征在于：它包括如下步骤：

a.测定头孢喹肟对致病菌猪链球菌的体外药物敏感性：将猪链球菌的冻干菌种复苏传代，获得工作菌液，将头孢喹肟灭菌后制备琼脂平板，将工作菌液接种至琼脂平板上，恒温培养后观察记录头孢喹肟对猪链球菌的MIC分布范围；

b.筛选具有致病性的菌株；

c.获得头孢喹肟在健康和疾病模型动物体内的药代动力学参数：对健康和患病动物进行肌内注射头孢喹肟，于给药前以及给药后不同时间点用支气管镜肺泡采样仪采取肺泡灌洗液，采用液相色谱法检测不同时间点所得肺泡灌洗液中的药物浓度，利用尿素氮检测法确定肺液中药物原始浓度，采用药代动力学软件计算相关的药代动力学参数以及绘制半对数药时曲线；

d.研究体外和半体内条件下头孢喹肟对细菌的药效动力学：用不同时间点所得肺泡灌洗液测定半体内杀菌曲线，拟合体内中的药物浓度与杀菌效应之间的关系；通过半体内杀菌曲线类型选择相应的PK-PD参数，使用药代动力学软件模拟Sigmoid E_max PK-PD模型方程模拟患病组和健康组肺液药效学数据，得到抗菌效果为E＝0，E＝-3，E＝-4条件下的PK-PD靶值，分别获得预防、治疗和彻底根除猪链球菌感染的药物剂量；其中E＝0为抑菌作用；E＝-3为杀菌作用；E＝-4为清除作用；利用E＝0，E＝-3，E＝-4条件下的PK-PD靶值，通过公式(1)计算得到E＝0、-3、-4条件下的药用剂量；其中E＝0为抑菌作用；E＝-3为杀菌作用；E＝-4为清除作用；

公式(1)如下：

其中：Dose为给药剂量；(AUC_24h/MIC)_ex为半体内PK-PD参数值；MIC为头孢喹肟对猪链球菌的最低抑菌浓度，CL/F为生物利用度校正过的体清除率，fu为游离药物浓度；

e.利用Mlxplore软件模拟这三个剂量下猪链球菌随着体内药物浓度变化的生长趋势变化，确定给药间隔，由此得到抑菌、杀菌和除菌三个目的的三种给药剂量。

2.根据权利要求1所述的一种头孢喹肟药动-药效同步模型的构建方法，其特征在于：b步骤中所述具有致病性的菌株为由步骤a中得到的范围为MIC₉₀的猪链球菌菌株。

3.根据权利要求1所述的一种头孢喹肟药动-药效同步模型的构建方法，其特征在于：c步骤与d步骤中所述药代动力学软件为WinNonlin软件。

4.根据权利要求4所述的一种头孢喹肟药动-药效同步模型的构建方法，其特征在于：所述Sigmoid E_max PK-PD模型方程为Hill方程，用于表示半体内PK-PD参数与抗菌效果之间的对应关系，公式如下：

其中：E表示细菌在各时间点肺泡灌洗液中培养24h后菌落减少的对数值；E_max表示空白肺泡灌洗液接种培养细菌24h后与初始接种菌落对数值的差值；E₀表示肺泡灌洗液中接种细菌培养24h后与初始接种菌落对数值的最大差值；C表示半体内参数值；EC₅₀表示肺泡灌洗液样品中达到最大杀菌数一半时的半体内参数值；N代表Hill系数；其中E_max和E₀可由半体内杀菌数据得到，EC₅₀和N值由WinNonlin软件模拟而来。

5.根据权利要求1所述的一种头孢喹肟药动-药效同步模型的构建方法，其特征在于：所述步骤c中尿素氮检测法为采用尿素氮试剂盒进行检测。

6.根据权利要求1所述的一种头孢喹肟药动-药效同步模型的构建方法，其特征在于：所述半体内杀菌曲线是在采集的肺泡灌洗液基础之上，采用琼脂平板计数方法进行检测得到的。

7.如权利要求1-7任一项所述的一种头孢喹肟药动-药效同步模型的构建方法在临床上的应用。