ES2879304T3 - Método de producción de alérgenos recombinantes de alta calidad en una planta - Google Patents

Abstract

Procedimiento de producción de un alérgeno recombinante en una planta de tabaco Nicotiana benthamiana, que comprende las siguientes etapas: a) el cultivo de la planta en aeroponia o en hidroponía y con luz LED, y después b) la agroinfiltración de la planta obtenida en la etapa a), al vacío, por agrobacterias que comprenden un vector de expresión que comprende un fragmento de ADN que codifica el alérgeno recombinante, y después c) volver a cultivar las plantas después de la etapa b), en las mismas condiciones que las de la etapa a), y después d) la extracción y la purificación del alérgeno recombinante a partir de las partes aéreas de las plantas producidas en la etapa c).

Description

DESCRIPCIÓN

Método de producción de alérgenos recombinantes de alta calidad en una planta

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un método de producción de alérgenos recombinantes de alta calidad.

Estado de la técnica

La utilización de alérgenos recombinantes permite una mayor especificidad y una mejor eficacia de los ensayos de diagnóstico y del tratamiento de las alergias.

Numerosos alérgenos ya se han producido en forma recombinante. Se utilizan actualmente para el diagnóstico in vitro de alergias. Sin embargo, el sistema de expresión utilizado, generalmente E. coli, solo permite, a menudo, obtener copias muy aproximativas de alérgenos naturales, debido a la incapacidad de esta bacteria para realizar las modificaciones postraduccionales necesarias para un replegamiento correcto de las proteínas de eucariotas. Con frecuencia esto perjudica a la fiabilidad y a la sensibilidad de los ensayos diagnósticos realizados utilizando esas moléculas, porque determinados epítopos susceptibles de reaccionar con las inmunoglobulinas E (IgE) de los pacientes, no están presentes en los alérgenos recombinantes producidos en E. coli.

También se han utilizado sistemas de expresión de eucariotas para la producción de alérgenos recombinantes. Los más habituales son las levaduras, y en este caso, la hiperglucosilación, específica de estos organismos, tampoco permite la producción de alérgenos recombinantes conformes a sus homólogos naturales.

Las plantas son los únicos hospedadores eucariotas que permiten la producción de alérgenos complejos en forma recombinante, debido a costes de producción y a una calidad compatible con su utilización para un tratamiento personalizado de las alergias, que integran los ensayos de diagnóstico y la terapia.

En cambio, los sistemas de expresión vegetales utilizados hasta ahora para la producción de alérgenos recombinantes recurren generalmente a la transgénesis vegetal con sus bien conocidas limitaciones principales, es decir:

- tiempos prolongados de transferencia del gen a la proteína; lo que significa un esfuerzo de desarrollo de varios años, y

- escasos rendimientos, del orden del 0,1 % al 1 % de las proteínas solubles, lo que significa el tratamiento de una gran biomasa de materia vegetal para una producción a gran escala.

Los recientes avances realizados gracias a la expresión transitoria, han permitido superar estas limitaciones, por un lado reduciendo considerablemente los periodos de tiempo de transferencia del gen a la proteína, lo que permite un esfuerzo de desarrollo mucho más rápido, y por otro lado, aumentar los rendimientos de producción como mínimo a un factor de 10, lo que minimiza las inversiones de la extracción y purificación de la proteína de interés.

Hoy en día, en los vegetales, determinadas empresas, utilizan una técnica de expresión transitoria de este tipo a gran escala para la producción de vacunas, desarrollando actualmente inmensas unidades de producción en los Estados Unidos.

Por lo tanto, a pesar de estos esfuerzos, siempre existe una necesidad de disponer de un método de producción eficaz y reproducible de alérgenos recombinantes, que permita la obtención de alérgenos recombinantes que tengan una composición y una conformación similares a las de sus homólogos naturales. Asimismo, existe una necesidad de un método que tenga un buen rendimiento de producción.

Objeto de la invención

La presente invención permite obtener proteínas recombinantes complejas, en particular, alérgenos recombinantes complejos, que jamás se han obtenido anteriormente en forma recombinante. Estos alérgenos son además copias conformes a sus homólogos naturales.

La presente invención se refiere por tanto a un procedimiento de producción de una proteína recombinante en una planta de tabaco de la especie Nicotiana benthamiana, que comprende las siguientes etapas:

a) el cultivo de plantas en aeroponia o en hidroponia, preferentemente sobre flotadores móviles, y con luz LED (del inglés, Light Emitting Diode, diodo emisor de luz),

b) la agroinfiltración de las plantas obtenidas en la etapa a), al vacío, por agrobacterias que comprenden un vector de expresión que comprende un fragmento de ADN que codifica la proteína recombinante, y después

c) volver a cultivar las plantas después de la etapa b), en las mismas condiciones que las de la etapa a), y después d) la extracción y la purificación de la proteína recombinante a partir de las partes aéreas de las plantas producidas en la etapa c).

La presente solicitud también describe una proteína recombinante que es posible obtener mediante el procedimiento según la invención.

La planta utilizable en el procedimiento descrito en el presente documento, es particularmente una planta de tabaco seleccionada entre Nicotiana benthamiana y Nicotiana tabacum, o incluso cualquier otra planta utilizable para la expresión transitoria, como una planta de lechuga (género Lactuca) o una planta de espinaca (Spinacia oleracea). Entre las lechugas, pueden citarse las variedades de lechuga Appia, Grosse Blonde Paresseuse, Lollo Rossa, Merveille de cuatro estaciones, hoja de roble o Red sails. La planta también puede ser del género Arabidopsis, o uno de sus mutantes, en particular mutantes de glucosilación de Arabidopsis; finalmente, pueden utilizarse plantas de tabaco de tabaco genosuprimidas (en particular mutantes de glucosilación). La planta utilizada según la invención es N. benthamiana.

La proteína recombinante producida mediante el procedimiento según la invención, es un alérgeno recombinante, preferentemente un alérgeno recombinante de acárido.

Por “alérgeno” se entiende cualquier proteína o cualquier péptido capaz de provocar una reacción alérgica en un sujeto, previamente sensibilizado, cuando se pone en contacto, lo más a menudo por contacto con la piel, por inhalación o ingestión. Un alérgeno se denomina “principal” cuando un alérgeno purificado desencadena una alergia en el 50 % o más de los pacientes sometidos a pruebas, y que presenta IgE específicas, con pruebas cutáneas inmediatamente positivas, a una concentración muy débil, teniendo al menos el 70 % de los sujetos la enfermedad alérgica en relación con este alérgeno.

Por “proteína”, se entiende una secuencia que comprende al menos 50 aminoácidos.

Por “péptido”, se entiende una secuencia que comprende entre 1 y 49 aminoácidos, preferentemente entre 2 y 40 aminoácidos.

Preferentemente, la proteína recombinante producida por el procedimiento según la invención, es un alérgeno, un fragmento de alérgeno o una proteína de fusión que comprende un alérgeno o un fragmento de alérgeno

Preferentemente, la proteína recombinante se selecciona de entre los alérgenos responsables de alergias respiratorias procedentes de ácaros domésticos, tales como Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus o Euroglyphus manei, los alérgenos de ácaros de almacenamiento tal como Blomia tropicalis, los alérgenos de ácaros de tipo Acarus siro (anteriormente denominado Tyroglyphus farinae), los alérgenos de cucarachas, los alérgenos de pólenes de árboles o de gramíneas, los alérgenos de animales (gato, perro, caballo), los alérgenos de hongos, los alérgenos responsables de alergias de contacto como los del látex de Hevea (árboles del género Hevea) o incluso los alérgenos responsables de alergias alimentarias (leche, huevo, pescado, frutas).

Entre los alérgenos de Dermatophagoides farinae, se pueden citar Der f 10, Der f 11, Der f 13, Der f 14, Der f 15, Der f 16, Der f 17, Der f 18, Der f 2, Der f 2.0101, Der f 2.0102, Der f 2.0103, Der f 2.0104, Der f 2.0105, Der f 2.0106, Der f 2.0107, Der f 2.0108, Der f 2.0109, Der f 2.0110, Der f 2.0111, Der f 2.0112, Der f 2.0113, Der f 2.0114, Der f 2.0115, Der f 2.0116, Der f 2.0117, Der f 20, Der f 3, Der f 4, Der f 5, Der f 6, Der f 7, Der f 8, Der f 9 y Der f HSP70.

Entre los alérgenos de Dermatophagoides pteronyssinus, se pueden citar Der p 10, Der p 11, Der p 14, Der p 15, Der p 18, Der p 2, Der p 2.0101, Der p 2.0102, Der p 2.0103, Der p 2.0104, Der p 2.0105, Der p 2.0106, Der p 2.0107, Der p 2.0108, Der p 2.0109, Der p 2.0110, Der p 2.0111, Der p 2.0112, Der p 2.0113, Der p 20, Der p 21, Derp 3, Der p 4, Der p 5, Der p 6, Der p 7, Der p 8, Der p 9.

Entre los alérgenos de Blomia tropicalis, se pueden citar Blo t 1, Blo t 5 (que presenta una homología de secuencia de 40 % con Der p 5), Blo t 9, Blo t 10, Blo t 12 o Blo t 21.

T odos estos alérgenos son muy conocidos, y su secuencia puede encontrarse principalmente en bases de datos tales como Allergome (allergome.org), o simplemente en UniProt.

El procedimiento de producción de alérgenos recombinantes por expresión transitoria según la invención, en N. benthamiana, es muy eficaz, reproducible, y presenta un buen rendimiento.

El procedimiento de producción de proteínas recombinantes según la invención comprende una primera etapa de cultivo de la planta (etapa a), en aeroponia o en hidroponia, preferentemente en cultivo sobre flotadores móviles libres, y con luz LED, para producir una proteína recombinante.

La aeroponia corresponde al cultivo de la planta sobre un soporte, generalmente de plástico, asociado a vaporizaciones permanentes de soluciones nutritivas a base de sales minerales.

La hidroponia corresponde al cultivo de la planta sin suelo, cultivándose dicha planta sobre un sustrato neutro e inerte, tal como arena, bolitas de arcilla, placas de poliestireno o lana de roca. El sustrato está regularmente irrigado por una corriente de solución que lleva sales minerales y nutrientes esenciales a la planta. En el procedimiento utilizado según la invención, las plantas de tabaco, principalmente N. benthamiana, se cultivan preferentemente en hidroponia sobre flotadores libres, por ejemplo, en una placa de poliestireno perforada. Estos flotadores se disponen en cubas que contienen un medio de cultivo aéreo permanente gracias a difusores de aire. Esta técnica permite una estandarización de las condiciones de producción de las proteínas recombinantes, junto con la ausencia total de riesgo de contaminación de los medios de agroinfiltración durante la etapa b), por impurezas o residuos procedentes de los sustratos contenidos en las macetas (en el caso de cultivos clásicos). Además, como se muestra en los ejemplos, la utilización de este sistema de cultivo permite obtener rendimientos muy superiores.

Finalmente, durante la mejora, la manipulación para la agroinfiltración o la recogida de lotes de plantas establecidas sobre una placa de poliestireno, es evidentemente más fácil que la de las plantas cultivadas en maceta y sustrato.

El procedimiento de producción de proteínas recombinantes según la invención comprende, después de la etapa a), una etapa b) de agroinfiltración de la planta, particularmente de la planta de tabaco, al vacío, por agrobacterias que comprenden un fragmento de ADN que codifica la proteína recombinante.

Particularmente, después de cinco semanas de cultivo, preferentemente en hidroponia sobre flotadores móviles libres, la agroinfiltración de las plantas de tabaco se realiza al vacío, por agrobacterias que comprenden un vector de expresión que comprende un fragmento de ADN que codifica la proteína recombinante.

Esta etapa b) de agroinfiltración, puede realizarse mediante cualquier medio que permita hacer el vacío. Preferentemente, el procedimiento utilizado según la invención, se realiza al vacío por efecto Venturi.

El fragmento de ADN que codifica la proteína recombinante, utilizado en la etapa a) e introducido en las agrobacterias, puede prepararse por clonación. Este fragmento de ADN puede comprender la secuencia que codifica la proteína recombinante, por ejemplo, un alérgeno heterólogo, estando dicha secuencia fusionada a una secuencia que codifica un péptido que facilita su purificación, como por ejemplo una secuencia de “etiqueta de histidina “o una secuencia que codifica un péptido o un polipéptido de direccionamiento intracelular. Dicho péptido o polipéptido de direccionamiento intracelular puede seleccionarse particularmente entre los péptidos cuyas secuencias se presentan en la tabla 1, es decir, entre los péptidos de SEQ ID NO :1 a 20. Después, el fragmento de ADN puede integrarse en el vector de expresión pAG01 desarrollado en el ámbito de la invención (figura 1 y secuencia SEQ ID NO : 21), seguidamente, las agrobacterias se transforman utilizando este vector de expresión. La presente solicitud también describe un vector de expresión que comprende la secuencia SEQ ID NO :21 y un inserto, particularmente localizado entre los bordes derecho e izquierdo del ADN de transferencia (ADNT) (esto se ilustra en la figura 1, en la que el borde izquierdo es “LB, Left Borde?’ y el borde derecho es “RB, Right Borde?’), comprendiendo dicho inserto al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido seleccionado entre SEQ ID NO: 1 a 20, estando dicha secuencia de ácido nucleico directamente fusionada a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés. Este vector corresponde al vector pAG01 que comprende un inserto, comprendiendo dicho inserto una secuencia de ácido nucleico de péptido (seleccionada entre SEQ ID NO: 1 a 20) directamente fusionada a la secuencia de ácido nucleico del alérgeno de interés. Preferentemente, la proteína de interés es un alérgeno, tal y como se describe anteriormente en el presente documento.

La agroinfiltración de partes aéreas de las plantas de tabaco N. benthamiana, se realiza al vacío. Preferentemente, se utiliza una campana hermética, que posee un sistema de vacío por efecto Venturi. Típicamente, la campana contiene el cultivo de agrobacterias y después del cambio de las placas flotantes sobre las cuales se cultivan las plantas en hidroponia, estas últimas se sumergen, boca abajo, en la suspensión bacteriana. Este procedimiento se ilustra en la figura 2 y permite infiltrar simultáneamente todas las plantas cultivadas sobre una misma placa flotante.

Según un primer modelo de realización, la agroinfiltración se realiza mediante una etapa de poner al vacío las plantas durante 2 minutos.

Preferentemente, según un segundo modelo de realización, la agroinfiltración se realiza en tres etapas (proceso secuencial):

1) poner al vacío, preferentemente a -0,8 bar durante 2 minutos,

2) quitar el vacío, y regresar a la presión atmosférica preferentemente durante 30 segundos, y después, 3) poner al vacío, preferentemente a -0,8 bar durante 2 minutos, y después regresar a la presión atmosférica.

Esta técnica de agroinfiltración es rápida (duración total inferior a 5 minutos), eficaz y fácil de automatizar.

Entre las agrobacterias utilizables según la invención, se pueden citar preferentemente, las cepas LBA4404, GV3101, EHA 101/105 o C58.

Preferentemente, para la infiltración, las agrobacterias se utilizan a una concentración definida por una DO600 comprendida entre 0,7 y 1,0, en una solución que comprende 10 mM de Mes (ácido 2-morfolino etanosulfónico), que eventualmente puede sustituirse por MOPS (ácido 3-(N-morfolino propanosulfónico), 10 mM de MgCl2 y 100 pM de acetosiringona.

Al final de la etapa b) de agroinfiltración, el procedimiento comprende una etapa c) de volver a poner en cultivo las plantas, en las mismas condiciones que las de la etapa a).

Normalmente, el drenaje de las plantas se realiza poniendo las plantas boca abajo durante 15 minutos, y después se vuelven a poner en cultivo en las condiciones descritas en la etapa a), garantizando idealmente una vaporización frecuente de estas últimas durante las 6 primeras horas de cultivo que siguen a la agroinfiltración. De manera alternativa, las plantas se vuelven a poner directamente en cultivo en las condiciones descritas para la etapa a).

Finalmente, el procedimiento según la invención comprende una etapa d) de extracción y de purificación de la proteína recombinante producida después de la agroinfiltración en la etapa c).

La recogida de la biomasa vegetal se efectúa de 4 a 5 días después de la puesta en cultivo de las plantas que sigue a la agroinfiltración. Después de la trituración y la extracción de las proteínas a partir de partes aéreas de las plantas, la proteína recombinante se purifica. En esta etapa pueden realizarse técnicas extracción y de purificación conocidas en la materia. Preferentemente, si la proteína recombinante comprende una secuencia de “etiqueta de histidina”, esta se purifica por cromatografía en columna de níquel inmovilizado (IMAC, del inglés Inmobilized Metal Affinity Chromatography, cromatografía de afinidad sobre metales inmovilizados), seguido de una etapa de tamizado molecular. Después, la secuencia de etiqueta utilizada para la purificación puede escindirse del producto final.

Descripción de las figuras

La invención va a ilustrarse ahora utilizando los siguientes ejemplos no limitativos.

Las leyendas de las figuras son las siguientes:

Tabla 1 (Figura 8): Secuencias de Reozyme™ utilizadas para la expresión dirigida de alérgenos recombinantes y compartimento subcelular de almacenamiento de alérgenos cuando se producen en fusión con péptidos de direccionamiento. ER: retículo endoplasmático; AG: Aparato de Golgi.

Figura 1: El ADN-T del vector pAG01 está constituido por dos secuencias de borde (RB y LB) de ADN-T de agrobacterias, y tres casetes de expresión que permiten la expresión del inhibidor de silenciamiento (casete 1), de una proteína recombinante preferentemente un alérgeno (casete 2) y de una enzima que confiere una resistencia a un antibiótico de selección o de una enzima de maduración de proteínas (casete 3).

Figura 2: La plataforma desarrollada según la invención asocia etapas y herramientas originales que permiten la producción en masa y a bajo coste de alérgenos recombinantes de una muy alta calidad inigualable. La adaptabilidad y la rapidez de producción, dado que bastan de 4 a 5 días para transferir el gen a la proteína, son también características de esta plataforma de producción.

Figura 3: Producción de alérgenos complejos principales del ácaro Dermatophagoides pteronyssinus: Der p 4 (carril 1); Der p 7 (carril 2); Der p 21 (carril 4); Der p 5 (carril 6) et Der p 2 (carril 7); de uno de los alérgenos principales del látex: Hev b 13 (carril 3) y un alérgeno de hongo: CP120 (carril 5).

Figura 4: Ilustración esquemática de casetes de expresión utilizados (panel A). En el panel B, los análisis por transferencia Western ilustran las diferencias de calidad del alérgeno Der p 2 producido en fusión con diferentes señales de Reozyme™. El alérgeno se produce en forma heterogénea y presenta una masa molecular no conforme cuando se utilizan las señales R1, R2 y R3 de Reozyme™ .En cambio, cuando se utiliza la señal R4, el alérgeno recombinante es homogéneo y presenta una masa molecular idéntica a la del alérgeno natural.

Figura 5: El panel A presenta el análisis por SDS-PAGE de proteínas totales extraídas de cada planta. El análisis de estos extractos por transferencia Western (paneles B y C) ilustran los rendimientos de producción para una misma proteína de interés, cuando las plantas se cultivan en condiciones estándar (cultivo en maceta luz por lámpara incandescente) (carriles 1-6, correspondiendo los diferentes carriles a diferentes sucesos de transformación) o bien se cultivan en aeroponia luz LED (carriles 7-9). Panel B: revelado cromogénico; panel C: revelado por quimioluminiscencia.

Figura 6: Comparación de la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés, green fluorescent protein): 1) cuando la agroinfiltración se efectúa según el protocolo descrito en la invención (panel B), o 2) cuando la infiltración se efectúa según un método de infiltración clásico (panel A).

Figura 7: Análisis por SDS-PAGE y transferencia Western de etapas de purificación del alérgeno Der p 4.

Carril 1: Extracto proteico total.

Carril 2: Der p 4 purificado sobre la columna de níquel inmovilizado (IMAC) y eluído en presencia de imidazol 50 mM

Carril 3: Der p 4 purificado por tamizado molecular después de la etapa IMAC.

Carril 4: Der p 4 purificado y por tanto la etiqueta se ha escindido in vitro.

Panel superior: Análisis de Der p 4 por SDS-PAGE seguido de tinción de proteínas con azul de Coomassie en el gel.

Panel inferior: Análisis de Der p 4 por SDS-PAGE seguido de transferencia Western e inmunodetección sobre el molde con un suero inmunoespecífico de etiqueta de purificación.

Descripción detallada de la invención

Ejemplo 1: Producción estandarizada de antígenos complejos

Para validar el procedimiento descrito en el presente documento, los ADNc que codifican alérgenos complejos de ácaros, de árboles o de hongos, se clonaron en el vector pAG01. A continuación, estos vectores se introdujeron en las agrobacterias (cepa LBA4404) a fin de efectuar la expresión transitoria en N. benthamiana.

Las plantas de N. benthamiana se cultivaron según el procedimiento descrito a continuación: las semillas se sembraron en tierra y se cultivaron durante al menos 45 días en este substrato. Preferentemente, las plántulas obtenidas de estas semillas se desarrollaron durante 15 días en este sustrato (y con luz LED), antes de transferirse en cubetas para el cultivo hidropónico sobre flotadores libres. Después, las plantas se cultivaron durante 25 días en esas condiciones en presencia de nutrientes y oligoelementos y con luz LED. En una alternativa a este protocolo, la utilización de semillas recubiertas permite la siembra directa de plantas de N. benthamiana sobre las placas flotantes. En estas condiciones, la germinación y el cultivo de las plantas se producen en condiciones de hidroponia.

Después de 40 días de cultivo, las plantas mantenidas sobre los flotadores, se transfirieron a una campana hermética para su transfección. Para introducir las agrobacterias portadoras del vector binario, la parte aérea de las plantas se sumergió (el flotador se volteó) en la solución de agrobacterias, cuya concentración correspondía a una DO 600: 0,7. La transfección se realizó al vacío en la campana hermética por efecto Venturi según el siguiente protocolo: 2 minutos al vacío (-0,8 bar), regreso a la normalidad, después de nuevo 2 minutos al vacío (-0,8 bar). A continuación, los flotadores se colocaron sobre soportes (con las plantas boca abajo) durante 10 a 15 minutos, para drenar las plantas. Después, las plantas, siempre mantenidas en las placas flotantes sobre las que se han cultivado, se reemplazaron en las cubetas de cultivo durante 4 días, idealmente garantizando una vaporización frecuente de estas últimas durante las 6 primeras horas de cultivo que siguen a la agroinfiltración.

Al final de estos 4 días, se recogieron las partes aéreas de las plantas que expresaban los diferentes alérgenos. Las proteínas se extrajeron en un tampón desnaturalizante y después se analizaron en SDS-PAGE y/o por transferencia Western utilizando un anticuerpo dirigido contra el epítopo FLAG.

La figura 3 ilustra los resultados obtenidos. El método según la invención permite la producción de alérgenos complejos principales.

Ejemplo 2: el procedimiento según la invención permite controlar la calidad de los alérgenos

Para controlar la maduración y la homogeneidad de los alérgenos recombinantes, diferentes señales (R1, R2, R3 y R4) se fusionaron al alérgeno de interés, y después la proteína de fusión se clonó en el vector pAG01. A continuación, estos vectores se introdujeron en las agrobacterias (cepa LBA4404), con el fin de efectuar la expresión transitoria en N. benthamiana.

Las plantas de N. benthamiana se cultivaron según el procedimiento descrito anteriormente: las semillas se sembraron en tierra y las plántulas obtenidas de estas semillas se desarrollaron durante 15 días en este sustrato (luz LED) antes de transferirse a los flotadores libres. Las plantas se cultivaron después durante 25 días en hidroponia sobre flotadores libres.

Después de 40 días de cultivo en estas condiciones, las plantas mantenidas en las placas flotantes de cultivo se transfirieron a una campana hermética para su transfección. Para introducir las agrobacterias portadoras del vector binario, la parte aérea de las plantas se sumergió (el flotador se volteó) en la solución de agrobacterias. La transfección se realizó al vacío en campana hermética por efecto Venturi según el siguiente protocolo: 2 minutos al vacío a (­ 0,8 bar), regreso a la normalidad, y después de nuevo 2 minutos al vacío (-0,8 bar). A continuación, los flotadores se colocaron sobre soportes (con las plantas boca abajo) durante 10 a 15 minutos para drenar las plantas. Después, las plantas, siempre mantenidas en los flotadores, se reemplazaron en las cubetas de cultivo durante 4 días.

Al final de estos 4 días, se recogieron las plantas que expresaban los diferentes alérgenos. Las proteínas se extrajeron triturando las partes aéreas en un tampón desnaturalizante y después se analizaron en SDS-PAGE y/o por transferencia Western utilizando un anticuerpo dirigido contra el epítopo FLAG.

La figura 4 presenta una ilustración esquemática de los casetes de expresión utilizados (panel A). Dicha figura también muestra, a través del ejemplo del alérgeno de ácaro Der p 2, las ventajas cualitativas ligadas a la utilización de señales de Reozyme™. En efecto, en el panel B, análisis por transferencia Western ilustran las diferencias de calidad del alérgeno Der p 2 producido en fusión con las diferentes señales de Reozyme™. El alérgeno se produce en forma heterogénea y presenta una masa molecular no conforme cuando se utilizan las señales R1, R2 y R3 de Reozyme™. En cambio, cuando se utiliza la señal R4 el alérgeno recombinante es homogéneo y presenta una masa molecular idéntica a la del alérgeno natural.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de producción de un alérgeno recombinante en una planta de tabaco Nicotiana benthamiana, que comprende las siguientes etapas:

a) el cultivo de la planta en aeroponia o en hidroponía y con luz LED, y después

b) la agroinfiltración de la planta obtenida en la etapa a), al vacío, por agrobacterias que comprenden un vector de expresión que comprende un fragmento de ADN que codifica el alérgeno recombinante, y después c) volver a cultivar las plantas después de la etapa b), en las mismas condiciones que las de la etapa a), y después

d) la extracción y la purificación del alérgeno recombinante a partir de las partes aéreas de las plantas producidas en la etapa c).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que el alérgeno recombinante es un alérgeno recombinante de acárido.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que el alérgeno recombinante se selecciona entre los alérgenos de Dermatophagoides farinae, los alérgenos de Dermatophagoides pteronyssinus, los alérgenos de Euroglyphus manei, los alérgenos de Acarus siro, los alérgenos de Blomia tropicalis, los alérgenos de cucarachas, los alérgenos de pólenes de árboles o de gramíneas, los alérgenos de animales, los alérgenos de hongos, los alérgenos del látex de Hevea y los alérgenos responsables de alergias alimentarias.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el alérgeno recombinante se selecciona entre Der f 10, Der f 11, Der f 13, Der f 14, Der f 15, Der f 16, Der f 17, Der f 18, Der f 2, Der f 2.0101, Der f 2.0102, Der f 2.0103, Der f 2.0104, Der f 2.0105, Der f 2.0106, Der f 2.0107, Der f 2.0108, Der f 2.0109, Der f 2.0110, Der f 2.0111, Der f 2.0112, Der f 2.0113, Der f 2.0114, Der f 2.0115, Der f 2.0116, Der f 2.0117, Der f 20, Der f 3, Der f 4, Der f 5, Der f 6, Der f 7, Der f 8, Der f 9 y Der f HSP70.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el alérgeno recombinante se selecciona entre Der p 10, Der p 11, Der p 14, Der p 15, Der p 18, Der p 2, Der p 2.0101, Der p 2.0102, Der p 2.0103, Der p 2.0104, Der p 2.0105, Der p 2.0106, Der p 2.0107, Der p 2.0108, Der p 2.0109, Der p 2.0110, Der p 2.0111, Der p 2.0112, Der p 2.0113, Der p 20, Der p 21, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 6, Der p 7, Der p 8 y Der p 9.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el alérgeno recombinante se selecciona entre Blo t 1, Blo t 5, Blo t 9, Blo t 10, Blo t 12 y Blo t 21.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la agroinfiltración se realiza al vacío por efecto Venturi.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por que la agroinfiltración se realiza mediante una etapa de poner al vacío la planta durante 2 minutos, o de poner al vacío, preferentemente a -0,8 bar durante 2 minutos, a continuación quitar el vacío y regresar a la presión atmosférica, preferentemente durante 30 segundos, y después poner al vacío, preferentemente a -0,8 bar durante 2 minutos, seguido finalmente del regreso a la presión atmosférica.