JP2014502840A - 植物のバキュームインフィルトレーション方法およびシステム - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図1
Description
本出願の範囲内で使用される専門的な用語および表現は、概して植物生物学の関連技術において一般に適用される意味が与えられるべきである。
インフィルトレーションイノキュラムの調製。
対象となる遺伝子または複数の遺伝子および遺伝子サイレンシングの抑制因子の発現のためのバイナリーベクターを、植物細胞において機能的な調節エレメントの制御下に置き、Agrobacterium tumefaciens系統Agl1中に導入する。それぞれのアグロバクテリウム株およびバイナリーベクター(複数可)の選択のために、2g/L牛肉エキス、0.4g/L酵母エキス、2g/L Bacto−Peptone、2g/Lショ糖、0.1g/L MgSO4および適切な抗生物質を含むYEB培地中で、細菌を増殖させる。細菌は、28℃および250rpmでOD600が1.6を超えるまで、ロータリーシェーカー上の三角フラスコ中でまたはバイオリアクター(使い捨ての滅菌済みビニールバッグを使用するWaveバイオリアクター等)中で増殖させることができる。次いで、細菌培養物を10mM 2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)および適切な抗生物質を含有する新鮮なLBブロスMiller培地中で1:100に希釈し、OD600が2を超えるまでロータリーシェーカー上で28℃および250rpmでさらに増殖させた。増殖はバイオリアクターを使用する使い捨ての滅菌済みビニールバッグ中であり得る。滅菌済みバッグは、1L、5L、10L、25L、50L、100L、250Lまたは500L以上である。増殖後に、細菌を8000gおよび4℃で15分間の遠心分離によって回収することができる。ペレットにした細菌を、10mM MgCl2および5mM MESを含むインフィルトレーション溶液中に、最終的にpH5.6およびOD600=2で再懸濁する。
4週齢のNicotiana benthamiana植物は、トマトブッシースタントウイルス(TBSV)p19遺伝子サイレンシングサプレッサー(Swiss−Prot P50625)を含有するAgrobacterium tumefaciens系統Agl1および植物細胞において機能的な調節エレメントの制御下に対象となる遺伝子を含有するバイナリーベクターにより共インフィルトレーションすることができる。細菌のイノキュラムは1:1の比率および最終OD600nm=0.3で混合することができる。バキュームインフィルトレーションは本発明中で記述された通りである。
2 インフィルトレーションチャンバー制御V1 バルブ
V2 放出バルブ
M1 圧力センサー
Tf 温度センサー
Claims (15)
- マクロ分子または微生物により植物組織に浸潤するためのシステムであって、
植物組織を収容するための少なくとも1つのシール可能なハッチを有するインフィルトレーションチャンバーと;
インフィルトレーションチャンバー内の圧力を低下させるための手段と;
インフィルトレーションチャンバーと流体連通させる第1の放出バルブと;
第1の放出バルブおよび圧力低下手段を協調的に操作するための制御装置とを含み、
その結果、インフィルトレーションチャンバー中の圧力が、(i)第1の時間の期間中に開始圧力から300ミリバール以下の標的圧力まで減少され、(ii)第2の時間の期間の間標的圧力で維持され、(iii)5秒以下の第3の時間の期間内に標的圧力から少なくともおよそ1バールの最終的な圧力まで増加される、システム。 - 圧力低下手段とインフィルトレーションチャンバーとの間に提供される第2のバルブを圧力の調節のためにさらに含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記制御装置が、インフィルトレーションチャンバー内で圧力を調節する第2のバルブを操作するのに好適である、請求項2に記載のシステム。
- 前記システムが、属、Agrobacterium、Rhizobium、Sinorhizobium、Mesorhizobium、Pseudomonas、Azospirillum、Rhodococcus、Phyllobaterium、Xanthomonas、BurkholderiaおよびErwiniaのメンバーから選択される細菌細胞、ならびに好ましくはAgrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenesによる植物組織の浸潤に適合する、請求項1、2または3のいずれか一項に記載されるシステム。
- 前記圧力低下手段が、少なくとも1つのバッファーチャンバー、真空ポンプまたは両方を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のシステム。
- 制御バルブを介して互いに連結されたインフィルトレーションチャンバーおよびバッファーチャンバーを含み;真空ポンプを操作してバッファーチャンバー中の圧力を標的圧力以下まで低下させ、制御バルブを開いてインフィルトレーションチャンバーおよびバッファーチャンバーを互いと流体連通させるように、制御装置がプログラムされる、請求項5に記載のシステム。
- 前記少なくとも1つのハッチが、インフィルトレーションチャンバーの側面において、またはインフィルトレーションチャンバーの上部において形成され;前記インフィルトレーションチャンバーが、50リットル、100リットル、200リットル、500リットル、750リットル、1000リットル、1500リットルまたは2000リットル以上の内部体積を有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記システムが、およそ300ミリバール、200ミリバール、150ミリバール、100ミリバール、50ミリバールまたは25ミリバール以下の標的圧力をインフィルトレーションチャンバー内で確立するように操作可能であり;前記制御装置が、4分、3分、2分または1分以下の第2の時間の期間の維持に適合する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記インフィルトレーションチャンバーが5秒、4秒、3秒、2秒または1秒未満の第3の時間の期間内に1バールの圧力に少なくとも実質的に戻ることができるように、前記第1の放出バルブが構成される、請求項1〜8のいずれか一項に記載のシステム。
- インフィルトレーションチャンバーから取り出されたマクロ分子および微生物の回収のためのフィルターをさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1の放出バルブが、1バールを超える圧力を有する流体源、不活性ガス、または両方と選択的に連通される、請求項1〜7のいずれか一項に記載のシステム。
- マクロ分子または微生物により植物組織に浸潤する方法であって、
(a)インフィルトレーションチャンバーの中へ植物組織を導入する工程と;
(b)インフィルトレーションチャンバー内の圧力を第1の時間の期間中に300ミリバール以下の標的圧力まで低下させる工程と;
(c)インフィルトレーションチャンバー内の前記標的圧力を5分以下の第2の時間の期間の間維持する工程と;
(d)インフィルトレーションチャンバー内の圧力を5秒以下の第3の時間の期間内に部分的にまたは少なくとも実質的に1バールに戻す工程と
を含む方法。 - 前記標的圧力が、およそ300ミリバール、200ミリバール、150ミリバール、100ミリバール、75ミリバール、50ミリバールまたは25ミリバール以下であり;前記第3の時間の期間が、5秒、4秒、3秒、2秒または1秒以下である、請求項12に記載の方法。
- インフィルトレーションチャンバー内で圧力を低下させる前記工程が、(i)バッファーチャンバー内の圧力をインフィルトレーションチャンバーの標的圧力よりも低く低下させる工程と、(ii)バッファーチャンバーをインフィルトレーションチャンバーと流体連通させる工程とを含む、請求項12または13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記植物組織が、Nicotiana属、好ましくはNicotiana tabacumのメンバーである植物全体または植物の部分を含み、前記微生物がAgrobacterium種である、請求項12、13または14のいずれか一項に記載の方法。
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