ES2877094T3 - Diagnóstico del cáncer de próstata usando ghrelina-O-acil transferasa (GOAT) - Google Patents

Diagnóstico del cáncer de próstata usando ghrelina-O-acil transferasa (GOAT) Download PDF

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María Del Mar Moreno
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Abstract

La presente invención se refiere al uso de los niveles obtenidos ex vivo a partir de una muestra biológica aislada de un sujeto de la cantidad o concentración de la enzima ghrelina-O-acil transferasa (GOAT) o del ARNm que codifica para esta proteína, como una herramienta eficaz para la obtención de datos útiles en el diagnóstico clínico del cáncer de próstata.

Description

DESCRIPCIÓN
Diagnóstico del cáncer de próstata usando ghrelina-O-acil transferasa (GOAT)
Campo de la técnica
La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular y la medicina, y se refiere a una enzima denominada ghrelina-O-acil transferasa (GOAT) y a los usos de la misma. En concreto, se refiere al uso de esta enzima para la obtención de datos que pueden usarse en el diagnóstico y/o la detección de pacientes con cáncer de próstata.
Estado de la técnica anterior
La ghrelina es una hormona que se sintetiza fundamentalmente en el estómago [1], aunque también se expresa en una amplia gama de tejidos donde actúa como un factor paracrino o autocrino [2-5]. La ghrelina es el principal ligando endógeno del receptor de secretagogos de la hormona del crecimiento (GHS-R) de tipo 1a (GHS-R1a). Actualmente se sabe que el sistema ghrelina/GHS-R1a ejerce acciones en diversos tejidos, muchos de ellos relacionados con la regulación de las funciones metabólicas [6-8]. Para que la ghrelina se una al receptor GHS-R1a y, por lo tanto, actúe, en primer lugar debe acilarse (a través de una n-octanoacilación) su residuo de serina 3 (Ser3). La enzima responsable de esta modificación postraduccional es la ghrelina-O-acil transferasa o GOAT [9, 10]. Esta enzima pertenece a la superfamilia de O-acil transferasas ancladas a membrana (MBOAT) [11] y, por ello, se denomina también MBOAT4 [12].
El gen de la GOAT humana (MBOAT4) se localiza en el cromosoma 12 y su secuencia presenta un alto grado de conservación entre los vertebrados [13]. La GOAT es una proteína integral de membrana que octanoila el residuo Ser3 de la ghrelina en el retículo endoplasmático tras la eliminación del péptido señal [14]. La enzima GOAT se expresa, a nivel de ARNm, en un amplio número de tejidos tales como el estómago, el páncreas, el músculo esquelético, el corazón, el intestino o los huesos [15]; un patrón de expresión que parcialmente solapa con el patrón exhibido por la ghrelina [15]. De hecho, se ha observado la presencia de GOAT (a nivel de ARNm y de proteína) en células individuales productoras de ghrelina [16]. Sin embargo, algunos estudios han demostrado que los niveles de expresión de la GOAT no se correlacionan completamente con los niveles de expresión de la ghrelina, sino que son más similares a los mostrados por una variante de corte y empalme del gen de la ghrelina, denominada In1-ghrelina [17], sugiriendo la posible existencia de dianas adicionales para la GOAT.
Es importante señalar que el sistema compuesto por la ghrelina, su variante de corte y empalme In1-ghrelina, los receptores asociados (GHS-R1a y un receptor truncado denominado GHS-R1b) y la enzima GOAT podrían ejercer un papel regulador relevante en varios tipos de patologías tumorales. De hecho, todos los componentes de este sistema regulador se han encontrado expresados en tumores gástricos [18-20] y/o tumores intestinales [21] y/o tumores carcinoides del páncreas [20, 22], así como en cáncer de mama [23] y cáncer de próstata [24], aunque sus niveles de expresión dependen del método de detección usado [18-21].
Sin embargo, los autores de la presente invención son los primeros en sugerir y aportar datos experimentales que respalden la determinación de uno de los componentes específicos del sistema, en particular la enzima GOAT, como una herramienta que puede usarse clínicamente en el diagnóstico clínico del cáncer de próstata. El documento WO02/090387 describe otros biomarcadores del cáncer de próstata.
Breve descripción de la invención
Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico del cáncer de próstata en un sujeto humano, en el que el método comprende:
a. detectar y cuantificar, in vitro, la expresión del ARNm de la enzima ghrelina-O-acil transferasa (GOAT) en una biopsia de tejido prostático o una muestra aislada de dicho sujeto o la cantidad de la proteína GOAT en una muestra de sangre, plasma o suero aislada de dicho sujeto;
b. comparar los niveles obtenidos en la etapa (a) con un nivel de referencia o con los niveles obtenidos en una muestra de control obtenida de un sujeto humano sano; y
c. asignar los sujetos que tienen niveles aumentados con respecto a un nivel de referencia al grupo de individuos que padecen cáncer de próstata.
En una realización particular de la presente invención, la etapa c) comprende:
c. asignar los sujetos que tienen niveles aumentados en al menos 2 veces, con respecto a los niveles obtenidos en una muestra de control obtenida de un sujeto humano sano, al grupo de individuos que padecen cáncer de próstata.
Otra realización particular de la presente invención se refiere al uso in vitro de un kit o dispositivo en el método del primer aspecto de la invención, en el que el kit o dispositivo comprende cebadores específicos para la determinación de los niveles de expresión del ARNm de GOAT mediante PCR, en el que preferiblemente el kit o dispositivo comprende cebadores que consisten esencialmente en las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2. Más preferiblemente, el kit o dispositivo comprende además al menos uno o cualquier combinación de los siguientes reactivos: ADN polimerasa, dNTP, MgCh, marcadores, estabilizadores, ADNasas y la enzima transcriptasa inversa (RT).
Otra realización particular de la presente invención se refiere al uso in vitro de un kit o dispositivo en el método anterior, en el que el kit o dispositivo comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos que son específicos frente a la proteína GOAT.
Sumario de otros aspectos de la divulgación
Los autores de la presente invención abordan el problema que se refiere a proporcionar herramientas diagnósticas del cáncer de próstata. En particular, abordan el problema que se refiere a proporcionar una herramienta diagnóstica que sirva como una alternativa clínicamente eficaz al uso del antígeno prostático específico (PSA).
Al abordar este problema, los autores han hallado que el uso de los niveles obtenidos ex vivo o in vitro a partir de una muestra biológica humana aislada de la cantidad o concentración de la enzima ghrelina-O-acil transferasa (GOAT) o del ARNm que codifica para dicha proteína, constituye una herramienta eficaz como biomarcador o indicador para obtener datos que pueden usarse en el diagnóstico clínico del cáncer de próstata. En particular, los autores de la presente invención han observado cómo los niveles plasmáticos de GOAT pueden discernir entre pacientes con cáncer de próstata y controles (individuos sanos) con una alta especificidad y sensibilidad del 66% y el 81%, respectivamente; niveles que demuestran que son una herramienta diagnóstica que puede usarse clínicamente.
Breve descripción de la figuras
Figura 1. Niveles de expresión de la GOAT en muestras de biopsias de pacientes con cáncer de próstata y controles (individuos sanos). Se representa el número de copias ajustado por un factor de normalización de n=37 casos tumorales y n=10 controles. La curva ROC muestra que los niveles de expresión de la GOAT en muestras de biopsias pueden discernir entre pacientes con cáncer de próstata y controles (individuos sanos).
Figura 2. Niveles de GOAT en muestras de plasma de pacientes con cáncer de próstata y controles (individuos sanos). Se representa la concentración de GOAT (ng/ml) de n=85 casos tumorales y n=29 controles. La curva ROC muestra que los niveles plasmáticos de GOAT pueden discernir entre pacientes con cáncer de próstata y controles (individuos sanos) con una alta especificidad y sensibilidad.
Figura 3. Correlaciones de los niveles plasmáticos de GOAT con los niveles de otros marcadores tumorales tales como PSA total (TPSA), PSA libre (FPSA), ca153 y cyfra_211 en pacientes con cáncer de próstata.
Figura 4. Correlación de los niveles plasmáticos de GOAT con los niveles plasmáticos de hemoglobina glicosilada en pacientes con cáncer de próstata.
Figura 5. Correlaciones de los niveles plasmáticos de GOAT con los niveles de glucosa y el índice HOMA-IR en pacientes con cáncer de próstata que tienen síndrome metabólico.
Descripción detallada de la invención
Los resultados mostrados en la presente invención demuestran que los niveles de expresión de la GOAT, medidos por PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR), están significativamente aumentados en muestras procedentes de biopsias (muestras aisladas de tejido prostático) de pacientes con cáncer de próstata en comparación con muestras procedentes de biopsias de pacientes sanos (en los que la biopsia resultó negativa para la presencia de cáncer de próstata) (figura 1, panel izquierdo). Es más, tal y como se muestra en la curva ROC mostrada en la figura 1 (panel derecho), los niveles de expresión de la GOAT en dichas muestras biopsiadas pueden discernir de forma significativa entre pacientes con cáncer de próstata e individuos sanos con una alta sensibilidad y especificidad.
Por otro lado, los resultados mostrados en el presente documento también indican que aunque los niveles de la proteína GOAT en orina no parecen ser suficientemente elevados como para su uso para el diagnóstico del cáncer de próstata, la medición de niveles plasmáticos de la proteína GOAT permite discernir entre pacientes con cáncer de próstata y controles (individuos sanos) con una alta especificidad y sensibilidad (figura 2, panel izquierdo). Es más, los datos mostrados demuestran que la medición de este marcador en muestras de sangre, en particular en plasma, da como resultado una herramienta diagnóstica especialmente eficaz en clínica. Así, tal y como se muestra en la curva ROC de la figura 2 (panel derecho), un valor de GOAT en plasma de 1,212 ng/ml muestra una sensibilidad del 81% y una especificidad del 67% para discernir entre pacientes con y sin cáncer de próstata.
Además, los niveles plasmáticos de GOAT detectados en pacientes con cáncer de próstata se correlacionaron positivamente con los niveles de PSA total (TPSA) y negativamente con los niveles de PSA libre (FPSA) (figura 3). De la misma forma, los niveles plasmáticos de GOAt detectados en pacientes con cáncer de próstata también se correlacionaron positivamente con otros dos marcadores tumorales, tales como ca1 5.3 y cyfra_211 (figura 3).
Por último, debe indicarse que los niveles plasmáticos de GOAT detectados en pacientes con cáncer de próstata se correlacionan con varios marcadores relacionados con la homeostasis de la glucosa, la diabetes y el síndrome metabólico. En concreto, los niveles de GOAT se correlacionan positivamente con los niveles de hemoglobina glicosilada en pacientes con cáncer de próstata (figura 4). Además, se correlacionaron con los niveles de glucosa y con el índice HOMA-IR en pacientes con cáncer de próstata que tienen síndrome metabólico (figura 5).
Por tanto, un primer aspecto de la presente divulgación se refiere al uso de los niveles obtenidos in vitro (fuera del cuerpo humano o animal) a partir de una muestra biológica aislada de un sujeto, preferiblemente de un humano, de los productos de expresión del gen que codifica para la enzima ghrelina-O-acil transferasa (GOAT), como biomarcador o indicador para obtener datos que pueden usarse en el diagnóstico o la detección del cáncer de próstata.
Preferiblemente, la presente divulgación, se refiere al uso in vitro de los niveles (expresados en términos de cantidad o concentración) obtenidos a partir de una muestra biológica aislada de un sujeto, preferiblemente de un humano, de la enzima ghrelina-O-acil transferasa (GOAT) o del ARNm que codifica para dicha enzima, como biomarcador o indicador para obtener datos que pueden usarse en el diagnóstico o la detección del cáncer de próstata.
Además, preferiblemente, en la presente divulgación los niveles de la enzima ghrelina-O-acil transferasa (GOAT) se determinan a partir de una muestra aislada de sangre, suero, de una muestra aislada de tejido prostático o de plasma, y la determinación de los niveles del ARNm se determina a partir de la muestra aislada de tejido prostático.
Tal y como se usa en el presente documento, el término “productos de expresión del gen...”, se refiere a los productos de transcripción y/o de traducción (ARN y/o proteína) de dicho gen, o a cualquier forma resultante del procesamiento de dichos productos de transcripción o traducción.
Una “muestra biológica aislada” incluye, sin limitación, células, tejidos y/o líquidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica. La muestra biológica puede ser un tejido, por ejemplo, una biopsia o un aspirado por aguja fina, o puede ser una muestra de líquido, como sangre, plasma o suero. Preferiblemente, las muestras biológicas aisladas se seleccionan de la lista que consiste en sangre, plasma, suero o una biopsia o muestra de tejido prostático.
Tal y como se usa en el presente documento, el término “cáncer” o “canceroso” se refiere a cualquier tumor maligno, en concreto, a un tumor maligno de próstata.
La determinación de los niveles de la cantidad o concentración, preferiblemente de manera semicuantitativa o cuantitativa, puede llevarse a cabo de manera directa o indirecta. La medición directa se refiere a la medición de la cantidad o concentración de los productos de expresión, basada en una señal que se obtiene directamente de los productos de expresión, y que está correlacionada con el número de moléculas de dichos productos de expresión. Dicha señal, que también puede denominarse señal de intensidad, puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos de expresión. La medición indirecta incluye la medición obtenida de un componente secundario o un sistema de medición biológica (por ejemplo la medición de respuestas celulares, ligandos, “etiquetas” o productos de reacción enzimática).
Tal y como se usa en el presente documento, el término “cantidad” se refiere, pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión, así como a cualquier otro valor o parámetro que se relaciona con los productos de expresión o que pueda derivarse de los mismos. Dichos valores o parámetros comprenden los valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de los productos de expresión obtenidos mediante medición directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos valores o parámetros obtenidos mediante medición indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medición descritos en otra parte del presente documento. Así pues, la “determinación del nivel de expresión” de los genes puede llevarse a cabo por cualquier método de determinación de la cantidad del producto de expresión de los genes conocido en el estado de la técnica.
Además, preferiblemente, en la presente divulgación la detección del producto de expresión de los genes se realiza determinando el nivel de ARNm derivado de la transcripción de dichos genes, donde el análisis del nivel de ARNm de GOAT puede analizarse, a modo de ilustración y sin que limite el alcance de la invención, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), transcripción inversa en combinación con reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), transcripción inversa en combinación con reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR) o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; chips de ADN preparados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microalineamientos de ADN preparados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o cualquier otro mecanismo; hibridación in situ usando sondas específicas marcadas con cualquier método de marcaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen usando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio.
El ARNm puede analizarse, por ejemplo, pero sin limitación, en muestras de tejido recién obtenido, muestras de tejido congelado, muestras de tejido fijado o muestras de tejido fijado y embebido en parafina. El uso de muestras de tejido fijado y embebido en parafina tiene ventajas significativas con respecto a las muestras de tejido recién obtenido o congelado, ya que son estables a temperatura ambiente, fáciles de almacenar y existe un amplio archivo de muestras clínicas disponibles junto con su información clínica y el seguimiento de la enfermedad. Por tanto, en una realización preferida, el analito se extrae de muestras de tejido fijado y embebido en parafina.
Sin embargo, el ARN obtenido a partir de muestras de tejido fijado y embebido en parafina suele experimentar una extensa degradación. Mientras que los estudios mediante microalineamientos son muy sensibles a la degradación del ARN, el uso de RT-PCR, y en particular, de RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) ha demostrado ser una técnica que ofrece los mejores resultados ante la degradación del ARN. Además, el análisis de expresión mediante microalineamientos es una técnica compleja que requiere equipos sofisticados que no están disponibles en muchos laboratorios. Por tanto, en otra realización preferida, la detección del ARNm de los genes se realiza mediante la técnica de RT-PCR; y en una realización más preferida, la detección se realiza mediante la técnica de qRT-PCR.
Además, preferiblemente, en la presente divulgación la detección del producto de expresión de los genes se realiza determinando el nivel de proteína derivada de la transcripción y traducción de dichos genes, donde puede analizarse el nivel de los productos peptídicos de la GOAT, a modo de ilustración y sin que limite el alcance de la presente divulgación, mediante la incubación con un anticuerpo específico en un inmunoensayo. Tal y como se usa en el presente documento, el término “ inmunoensayo” se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de conjugación de un anticuerpo con la muestra obtenida. Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitación: inmunotransferencia, ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunohistoquímica o microalineamientos de proteína.
Un segundo aspecto de la divulgación se refiere a un método para obtener datos que pueden usarse para el diagnóstico y/o la detección del cáncer de próstata en un sujeto, preferiblemente un humano, en el que el método comprende:
a. detectar y cuantificar, in vitro, en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, la cantidad o concentración de la enzima ghrelina-O-acil transferasa (GOAT) o del ARNm que codifica para dichas proteínas.
Preferiblemente, en el segundo aspecto de la divulgación la muestra biológica aislada se selecciona de la lista que consiste en sangre, plasma, suero o una biopsia o muestra de tejido prostático.
Además, preferiblemente, en el segundo aspecto de la divulgación, el método comprende además:
b. comparar los niveles obtenidos en la etapa (a) con un nivel de referencia o con los niveles obtenidos en una muestra de control obtenida de un sujeto humano sano.
Un primer aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico y/o detección del cáncer de próstata, en el que el método comprende las etapas (a) - (b) del segundo aspecto de la divulgación y comprende además:
c. asignar los sujetos que tienen niveles aumentados con respecto a un nivel de referencia al grupo de individuos que padecen cáncer de próstata.
Tal y como se usa en el presente documento, el término “diagnóstico” se refiere a la capacidad de discriminar entre individuos que padecen o no cáncer de próstata. También se refiere, sin limitación, a la capacidad de discriminar entre muestras procedentes de pacientes y una muestra procedente de individuos sanos. Esta discriminación tal y como entiende un experto en la técnica, no pretende ser correcta en todas las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad significativamente estadística puede establecerla un experto en la técnica mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitación, mediante la determinación de intervalos de confianza, la determinación del valor de p, la prueba de la t de Student o funciones discriminantes de Fisher. Preferiblemente, los intervalos de confianza son de al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1, 0,05, 0,01,0,005 ó 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80% o en al menos el 90% de los sujetos de un grupo específico o población analizada.
La detección de la GOAT (tanto del ARNm como la propia proteína) en una muestra biológica aislada de un sujeto en una proporción mayor que la cantidad de referencia es indicativa de que dicho individuo padece cáncer de próstata. En particular, los niveles obtenidos en una muestra de control obtenida de un sujeto humano sano que están aumentados en al menos 1,5 veces, preferiblemente en 2 veces, son indicativos de que dicho individuo padece cáncer de próstata.
Por tanto, un primer aspecto alternativo de la invención se refiere a un método de diagnóstico y/o detección del cáncer de próstata que comprende las etapas (a) - (b) del segundo aspecto de la invención, y comprende además:
c. asignar los sujetos que tienen niveles aumentados en al menos 1,5 veces, preferiblemente en 2 veces, con respecto a los niveles obtenidos en una muestra de control obtenida de un sujeto humano sano, al grupo de individuos que padecen cáncer de próstata.
El término “sujeto” no pretende ser limitativo en ningún aspecto, donde dicho sujeto puede ser de cualquier edad y tener cualquier condición física.
Otro aspecto de la divulgación, es decir, el tercer aspecto, se refiere a un kit que comprende los medios adecuados para llevar a cabo los métodos de la invención. Preferiblemente, en el tercer aspecto de la invención, dicho kit comprende los medios para detectar los productos de expresión (en particular ARNm y proteína) derivados del gen que genera la GOAT.
Un aspecto particular de la divulgación se refiere a un kit o dispositivo adecuado para llevar a cabo una reacción PCR, preferiblemente RT-PCR, qRT-PCR o qPCR, en el que el kit comprende cebadores que consisten esencialmente en las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID No 2. Dicho kit puede comprender además todos aquellos reactivos necesarios para llevar a cabo dichas reacciones PCR. En este sentido, el kit puede incluir además, sin ningún tipo de limitación, el uso de tampones, enzimas, enzimas polimerasas, cofactores para obtener una actividad enzimática óptima, agentes para prevenir la contaminación, etc. Por otro lado, el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para ponerlo en uso y para la optimización del mismo. El kit puede contener además otras moléculas, genes, proteínas o sondas de interés, que sirvan como controles positivos y negativos. Preferiblemente, el kit comprende además instrucciones para llevar a cabo el cuarto aspecto de la invención. Preferiblemente, el kit comprende, además de los cebadores indicados, al menos uno o cualquier combinación de los siguiente reactivos: ADN polimerasa, dNTP, MgCh, marcadores, estabilizadores, ADNasas y transcriptasa inversa (RT).
Un segundo aspecto de la invención se refiere al uso in vitro de un kit o dispositivo en los métodos de los primeros aspectos de la invención, que comprende cebadores específicos para la determinación de los niveles de expresión de la GOAT mediante PCR, para obtener datos que pueden usarse para el diagnóstico y/o la detección del cáncer de próstata en un sujeto humano basándose en una muestra biológica aislada de dicho sujeto. Preferiblemente, dicho kit se define según el tercer aspecto de la divulgación. Preferiblemente, dicha muestra biológica se selecciona de la lista que consiste en sangre, plasma, suero y muestras aisladas de tejido prostático.
Un tercer aspecto de la invención se refiere al uso in vitro de un kit o dispositivo en los métodos de los primeros aspectos de la invención, que comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos, que son específicos frente a la proteína GOAT, para obtener datos que pueden usarse para el diagnóstico y/o la detección del cáncer de próstata en un sujeto humano basándose en una muestra biológica aislada de dicho sujeto. Preferiblemente, dicha muestra biológica es una biopsia de tejido prostático. Preferiblemente, el uso del tercer aspecto de la invención se lleva a cabo mediante un inmunoensayo, preferiblemente mediante un ELISA, más preferiblemente mediante el uso in vitro de un ELISA comercial (Human Ghrelin-O-Acyltransferase (GOAT) ELISA Kit; MBS2019923, MyBioSource, San Diego, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. En otra realización preferida, el inmunoensayo es una inmunotransferencia o inmunotransferencia de tipo Western. Para llevar a cabo una inmunotransferencia o inmunotransferencia de tipo Western, se obtiene un extracto de proteínas a partir de una muestra biológica aislada de un sujeto y se separan las proteínas en un medio de soporte capaz de retener dichas proteínas mediante electroforesis. Una vez separadas, las proteínas se transfieren a un soporte diferente donde pueden detectarse mediante el uso de anticuerpos específicos que reconocen a los productos peptídicos de la GOAT, la ln1-ghrelina y/o el receptor truncado de ghrelina (GHS-R1b).
En otra realización preferida, el inmunoensayo es una inmunohistoquímica (IHQ). Las técnicas de inmunohistoquímica permiten la identificación de determinantes antigénicos característicos en muestras tisulares o citológicas. El análisis mediante inmunohistoquímica se realiza sobre cortes de tejido, ya sea congelado o incluido en parafina, procedente de una muestra biológica aislada de un sujeto. Estos cortes se hibridan con un anticuerpo monoclonal o policlonal que reconoce a los productos peptídicos de la GOAT, la ln1-ghrelina y/o el receptor truncado de ghrelina (GHS-R1b).
Entre las técnicas inmunohistoquímicas que pueden usarse para obtener los perfiles de expresión se encuentra el microalineamiento tisular. El microalineamiento tisular (TMA) es considerado hoy en día una potente herramienta para el análisis masivo simultáneo del perfil molecular del cáncer de diversas muestras de tejido, proporcionando la posibilidad de estudiar nuevos marcadores, o marcadores ya existentes, a gran escala. A su vez, el TMA conserva las muestras originales de tejido que con los métodos convencionales disminuyen en cantidad y se deterioran como resultado del uso frecuente.
Tal y como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con cualquiera de los productos peptídicos de GOAT. Los ejemplos de fragmentos de moléculas de inmunoglobulinas inmunológicamente activas incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2 que pueden generarse tratando el anticuerpo con una enzima tal como la pepsina. Los anticuerpos pueden ser policlonales (incluyen normalmente anticuerpos diferentes que seleccionan como diana determinantes o epítopos distintos) o anticuerpos monoclonales (que seleccionan como diana un único determinante en el antígeno). El anticuerpo monoclonal puede alterarse bioquímicamente por manipulación genética o puede ser sintético, posiblemente careciendo el anticuerpo, en su totalidad o en partes, de porciones que no son necesarias para el reconocimiento de los productos peptídicos de la GOAT y sustituyéndose por otras que confieren al anticuerpo propiedades ventajosas adicionales. El anticuerpo también puede ser recombinante, quimérico, humanizado, sintético o una combinación de cualquiera de los anteriores. Un “anticuerpo o polipéptido recombinante” (rAC) es un anticuerpo que se ha producido en una célula huésped que ha sido transformada o transfectada con el ácido nucleico que codifica para el polipéptido, o produce el polipéptido como resultado de la recombinación homóloga.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra “comprende”" y variantes de la misma no pretenden excluir otras características técnicas, adiciones, componentes o etapas. Para los expertos en la técnica, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de poner en práctica la invención.
Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que limiten la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1. Mariales y métodos
1.1. Pacientes y muestras
Las muestras de biopsias prostáticas [tanto muestras tumorales (n=37) como muestras normales (n=10)] se obtuvieron en el Hospital Universitario Reina Sofía (Córdoba), tras la apropiada evaluación de un experto anatomopatólogo y bajo la aprobación de los Comités de Ética de la Universidad de Córdoba y del Hospital Reina Sofía (Córdoba). Se trata de una cohorte de pacientes con sospecha de tener cáncer de próstata a los que se les realizaron biopsias entre 2012 y 2014 para confirmar dicha sospecha. Durante la biopsia también se recogieron muestras de sangre y de orina de dichos pacientes. Antes de participar en el estudio, cada paciente firmó un consentimiento informado.
1.2. Aislamiento de ARN y transcripción inversa (RT)
Los ácidos nucleicos se aislaron de los tejidos biopsiados mediante el uso de un kit comercial (AllPrep DNA/RNA Mini Kit, Qiagen; Barcelona, España) según las instrucciones del fabricante y se trataron con ADNasa. La cantidad de ARN total recuperado se determinó mediante el uso del espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, NC, EE.UU.). La transcripción inversa se llevó a cabo con 1 |ig de ARN total, usando el kit de ADNc First-Strand Synthesis (Fermentas, Hanover, MD, EE.UU.).
1.3. Determinación de la expresión génica mediante PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR)
La determinación de los niveles de expresión de la GOAT se realizó mediante qPCR usando cebadores específicos para este transcrito (Sn (SEQ ID NO 1): TTGCTCTTTTTCCCTGCTCTC y As (SEQ ID NO 2): ACTGCCACGTTTAGGCATTCT). Se seleccionaron los cebadores, se verificó la especificidad y se confirmó la eficiencia de manera similar a lo descrito previamente para otros genes [17, 25]. El volumen final de la reacción PCR fue de 20 |il incluyendo 100 ng de muestra y 10 |il de IQ™ SYBR Green Supermix (Biorad). El programa de la PCR consistió en 40 ciclos a 95°C durante 20 s, 60°C durante 20 s y 55°C durante 30 s. Además, en cada placa se desarrolló un control sin ADN para monitorizar posibles contaminaciones exógenas. En todos los casos, la amplificación se llevó a cabo con el sistema de qPCR Mx3000 (Agilent, Madrid). Para confirmar que sólo se amplificó una única banda del tamaño esperado, los productos se desarrollaron en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. Esta banda se purificó y secuenció posteriormente para confirmar que correspondía con la secuencia esperada.
1.4. Determinación de los niveles de la proteína GOAT
La concentración plasmática o en orina de GOAT se determinó mediante el uso de un ELISA comercial (Human Ghrelin-O-Acyltransferase (GOAT) ELISA Kit; MBS2019923, MyBioSource, San Diego, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La información relativa a la especificidad, la detectabilidad y la reproducibilidad del ensayo están disponibles en la página web de la empresa.
Ejemplo 2. RESULTADOS
2.1. Expresión del ARNm de GOAT en muestras de biopsias prostáticas
Los niveles de expresión de la GOAT, medidos por PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR), están significativamente aumentados en muestras procedentes de biopsias de pacientes con cáncer de próstata en comparación con muestras procedentes de biopsias de pacientes sanos (en los que la biopsia resultó negativa para la presencia de cáncer de próstata) (figura 1, panel izquierdo). De hecho, los niveles de expresión de la GOAT en las biopsias pueden discernir significativamente entre pacientes con cáncer de próstata e individuos sanos con una alta sensibilidad y especificidad (curva ROC; figura 1, panel derecho).
2.2. Niveles de GOAT en líquidos corporales de pacientes con sospecha de cáncer de próstata
Además, se determinaron los niveles de la proteína GOAT en líquidos corporales (plasma y orina) de dichos pacientes. Estos análisis revelaron que la GOAT no se encuentra en orina a niveles detectables; mientras que se encuentra a niveles considerables (detectables) en muestras de plasma. En concreto, la enzima GOAT también se encuentra en mayores niveles en el plasma de pacientes con cáncer de próstata en comparación con el plasma de pacientes de control sanos (figura 2, panel izquierdo). De la misma forma, los niveles plasmáticos de GOAT pueden discernir entre pacientes con cáncer de próstata e individuos sanos con una alta sensibilidad y especificidad (curva ROC; figura 2, panel derecho). Así, un valor de GOAT en suero de 1,212 ng/ml muestra una sensibilidad del 81% y una especificidad del 66% para discernir entre pacientes con y sin cáncer de próstata.
Además, los niveles plasmáticos de GOAT detectados en pacientes con cáncer de próstata se correlacionaron positivamente con los niveles de PSA total (TPSA) y negativamente con los niveles de PSA libre (FPSA) (figura 3). De la misma forma, los niveles plasmáticos de GOAt detectados en pacientes con cáncer de próstata también se correlacionaron positivamente con otros dos marcadores tumorales, tales como ca153 y cyfra_211 (figura 3).
Por último, debe indicarse que los niveles plasmáticos de GOAT detectados en pacientes con cáncer de próstata se correlacionan con varios marcadores relacionados con la desregulación de la homeostasis de la glucosa, la diabetes y el síndrome metabólico. En concreto, los niveles de GOAT se correlacionaron positivamente con los niveles de hemoglobina glicosilada en pacientes con cáncer de próstata (figura 4). Además, se correlacionaron con los niveles de glucosa y con el índice HOMA-IR en pacientes con cáncer de próstata que tienen síndrome metabólico (figura 5).
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Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Método para el diagnóstico del cáncer de próstata en un sujeto humano, en el que el método comprende:
    a. detectar y cuantificar, in vitro, la expresión del ARNm de la enzima ghrelina-O-acil transferasa (GOAT) en una biopsia de tejido prostático o una muestra aislada de dicho sujeto o la cantidad de la proteína GOAT en una muestra de sangre, plasma o suero aislada de dicho sujeto;
    b. comparar los niveles obtenidos en la etapa (a) con un nivel de referencia o con los niveles obtenidos en una muestra de control obtenida de un sujeto humano sano; y
    c. asignar los sujetos que tienen niveles aumentados con respecto a un nivel de referencia al grupo de individuos que padecen cáncer de próstata.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa c) comprende:
    c. asignar los sujetos que tienen niveles aumentados en al menos 2 veces, con respecto a los niveles obtenidos en una muestra de control obtenida de un sujeto humano sano, al grupo de individuos que padecen cáncer de próstata.
  3. 3. Uso in vitro de un kit o dispositivo en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el kit o dispositivo comprende cebadores específicos para la determinación de los niveles de expresión del ARNm de GOAT mediante PCR.
  4. 4. Uso según la reivindicación 3, en el que el kit o dispositivo comprende cebadores que consisten esencialmente en las secuencias SEQ ID No 1 y SEQ ID NO 2.
  5. 5. Uso según la reivindicación 4, en el que el kit o dispositivo comprende además al menos uno o cualquier combinación de los siguientes reactivos: ADN polimerasa, dNTP, MgCh, marcadores, estabilizadores, ADNasas y la enzima transcriptasa inversa (RT).
  6. 6. Uso in vitro de un kit o dispositivo en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el kit o dispositivo comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos que son específicos frente a la proteína GOAT.
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