ES2869971T3 - Construcción de ácido nucleico - Google Patents

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Abstract

Una construcción de ácido nucleico que comprende la siguiente estructura: A-X-B en la cual A es una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que comprende un primer péptido de señal que tiene una estructura tripartita que contiene una región central hidrófoba (región h) flanqueada por una región n y una región c; B es la secuencia de ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que comprende un segundo péptido de señal que tiene una estructura tripartita que contiene una región central hidrófoba (región h) flanqueada por una región n y una región c, y X es una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión, en donde el primer péptido de señal y el segundo péptido de señal se pueden derivar de la misma secuencia, pero un péptido de señal comprende una o más deleciones/sustituciones de aminoácidos en la región h para eliminar/sustituir uno o más aminoácidos hidrófobos en comparación con el otro péptido de señal, en donde el primer péptido de señal y el segundo péptido de señal tienen las mismas regiones n y c, y en donde la diferencia entre el primer y el segundo péptidos de señal es tal que, cuando la construcción de ácido nucleico se expresa en una célula, existe expresión relativa diferencial del primer y segundo polipéptidos en la superficie celular.

Description

DESCRIPCIÓN
Construcción de ácido nucleico
Campo de la invención
La presente invención se refiere a construcciones y enfoques para modular la expresión relativa de polipéptidos coexpresados a partir de un solo vector. En particular, la invención se refiere a modular la expresión de una proteína transmembrana coexpresada a partir de un único vector con un segundo polipéptido.
Antecedentes de la invención
A menudo es deseable expresar diferentes proteínas a partir del mismo vector ya que la transducción múltiple de la misma célula es difícil, costosa e impredecible. Por lo tanto, se han desarrollado diferentes métodos para permitir la coexpresión de dos proteínas a partir de un solo vector (ver Figura 1).
Los intentos iniciales utilizaron dos promotores diferentes dentro del mismo casete. Esto da como resultado dos transcritos diferentes, cada uno de los cuales codifica una proteína diferente. Este es un enfoque difícil por varias razones. Un problema clave es la "interferencia del promotor" por la que un promotor domina y provoca el silenciamiento del segundo promotor. Además, diferentes promotores funcionan de manera diferente en diferentes contextos celulares y esto hace que el "ajuste" uniforme de la expresión relativa de cada transgén sea difícil de lograr. Un enfoque alternativo es utilizar una secuencia de sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). En este caso, se genera un único transcrito. La secuencia IRES en el transcrito está situada entre los marcos de lectura abierta para los dos transgenes e imita una estructura de caperuza del ARNm. Por lo tanto, el ribosoma inicia la traducción en la caperuza 5' o en IRES, lo que da como resultado la expresión de dos proteínas diferentes. Una limitación clave de este enfoque es la incapacidad de controlar la expresión relativa. El transcrito 3' se expresa normalmente menos que el 5', pero la proporción de expresión es difícil de predecir y ajustar.
Se ha proporcionado un enfoque adicional después de la caracterización del papel del péptido 2A del virus de la fiebre aftosa (VFA) para permitir que el VFA (y virus relacionados) expresen múltiples proteínas a partir de un solo marco de lectura abierta (o Rf ) (Donnelly et al; J. Gen. Virol.; 82, 1027-1041 (2001)). El péptido 2A (y homólogos) se escinden con una eficacia muy alta inmediatamente después de la traducción del ORF, lo que permite la expresión de múltiples péptidos a partir de un único ORF. Un problema con el uso del péptido 2A para escindir entre diferentes péptidos en el mismo ORF es que la expresión se limita a una proporción de 1:1.
Por tanto, existe la necesidad de métodos alternativos para expresar más de una proteína a partir de un único vector que no estén asociados con las desventajas descritas anteriormente.
Sumario de aspectos de la invención
La presente invención se basa en la determinación de que, cuando dos proteínas que contienen péptido de señal se coexpresan como una poliproteína que se escinde después de la traducción, es posible modificar la "fuerza" relativa de los péptidos de señal y así controlar la expresión relativa de las dos proteínas. Esta necesidad no se limita a un par de transgenes, pero puede usarse para permitir el control de la expresión relativa de múltiples proteínas traducidas inicialmente.
Como se utiliza en el presente documento, 'poliproteína' se refiere a una secuencia polipeptídica traducida de una construcción de ácido nucleico como una entidad individual, pero que comprende secuencias polipeptídicas que se separan posteriormente y que funcionan como entidades discretas (por ejemplo, proteínas diferentes).
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende la siguiente estructura:
A-X-B
en la cual
A es una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que comprende un primer péptido de señal que tiene una estructura tripartita que contiene una región central hidrófoba (región h) flanqueada por una región n y una región c;
B es la secuencia de ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que comprende un segundo péptido de señal que tiene una estructura tripartita que contiene una región central hidrófoba (región h) flanqueada por una región n y una región c, y X es una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión,
en donde el primer péptido de señal y el segundo péptido de señal se pueden derivar de la misma secuencia, pero un péptido de señal comprende una o más deleciones/sustituciones de aminoácidos en la región h para eliminar/sustituir uno o más aminoácidos hidrófobos en comparación con el otro péptido de señal, en donde el primer péptido de señal y el segundo péptido de señal tienen las mismas regiones n y c, y en donde la diferencia entre el primer y el segundo péptidos de señal es tal que, cuando la construcción de ácido nucleico se expresa en una célula, existe expresión relativa diferencial del primer y segundo polipéptidos en la superficie celular.
El o los aminoácidos hidrófobos pueden seleccionarse del grupo: Alanina (A); Valina (V); Isoleucina (I); Leucina (L); Metionina (M); Fenilalanina (P); Tirosina (Y); Triptófano (W).
Como se explica a continuación más detalladamente, las secuencias de señal tienen una estructura tripartita, que consiste en una región central hidrófoba (región h) flanqueada por una región n y c. El primer péptido de señal y el segundo péptido de señal tienen regiones n y c idénticas, pero pueden diferir en la región h: la región h de un péptido de señal tiene más aminoácidos hidrófobos que el otro péptido de señal.
El o los aminoácidos hidrófobos eliminados o reemplazados del péptido de señal pueden seleccionarse del grupo: Alanina (A); Valina (V); Isoleucina (I); Leucina (L); Metionina (M); Fenilalanina (P); Tirosina (Y); Triptófano (W). El o los aminoácidos hidrófobos eliminados o reemplazados del péptido de señal pueden seleccionarse del grupo: Valina (V); Isoleucina (I); Leucina (L); y triptófano (W).
El péptido de señal de un polipéptido puede comprender hasta cinco aminoácidos hidrófobos más que el otro péptido de señal. El péptido de señal alterado puede tener hasta 10 %, hasta 20 %, hasta 30 %, hasta 40 % o hasta 50 % de sus aminoácidos hidrófobos reemplazados o eliminados.
El primer y segundo polipéptidos son polipéptidos que contienen péptidos de señal, tales como proteínas secretadas, transmembrana o de orgánulos. La presente invención permite controlar la expresión relativa de las proteínas, es decir, las cantidades relativas de proteínas en el compartimento relevante. Para las proteínas secretadas, la presente invención permite controlar las cantidades relativas de las proteínas producidas por una célula. Para las proteínas transmembrana, la presente invención permite controlar la expresión relativa en la superficie celular de las dos (o más) proteínas. Para las proteínas de orgánulos, la presente invención permite la expresión relativa de las proteínas a controlar dentro, o sobre la membrana de, el orgánulo en cuestión.
El primer y segundo polipéptidos pueden ser ambos proteínas transmembrana, tales como los receptores de linfocitos T o receptores de antígenos quiméricos (CAR).
Cuando la primera y segunda proteínas son proteínas transmembrana, la diferencia entre el primer y el segundo péptido de señal puede ser tal que, cuando la construcción de ácido nucleico se expresa en una célula, existe expresión relativa diferencial del primer y segundo polipéptidos en la superficie celular.
X puede ser un ácido nucleico que codifica un péptido autoescindible, un sitio de escisión de furina o un sitio de escisión del virus del grabado del tabaco.
X puede, por ejemplo, codificar un péptido autoescindible 2A de un aftovirus o cardiovirus o un péptido similar a 2A. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
El vector puede, por ejemplo, ser un vector retroviral o un vector lentiviral.
En un tercer aspecto, se proporciona una célula que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto de la invención o un vector de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.
En este tercer aspecto, también se proporciona una célula que comprende dos receptores de antígeno quiméricos que tienen diferentes péptidos de señal que se pueden derivar de la misma secuencia, en donde los péptidos de señal tienen una estructura tripartita que contiene una región central hidrófoba (región h) flanqueada por una región n y una región c, en donde los péptidos de señal tienen las mismas regiones n y c, pero un péptido de señal comprende una o más deleciones/sustituciones de aminoácidos para eliminar/sustituir uno o más aminoácidos hidrófobos en la región h en comparación con el otro péptido de señal, en donde el receptor de antígeno quimérico que tiene un péptido de señal con el mayor número de aminoácidos hidrófobos se expresa más en la superficie celular que el receptor de antígeno quimérico que tiene un péptido de señal con el menor número de aminoácidos hidrófobos.
La célula puede ser una célula inmunitaria citolítica, tal como un linfocito T o un linfocito citolítico natural (NK).
En un cuarto aspecto, se proporciona un método para fabricar una célula de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención que comprende la etapa de introducir una construcción de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto de la invención o un vector de acuerdo con el segundo aspecto de la invención en una célula.
En un quinto aspecto, se proporciona un método para modular la expresión relativa en la superficie celular de una primera proteína que contiene péptido de señal expresada a partir de una única construcción de ácido nucleico con una segunda proteína que contiene péptido de señal que comprende la etapa de mutar la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de señal de una proteína para eliminar o reemplazar uno o más aminoácidos hidrófobos en comparación con el péptido de señal de la otra proteína.
La eliminación o sustitución de aminoácidos hidrófobos del péptido de señal de una proteína transmembrana reduce la cantidad de proteína transmembrana expresada en la superficie celular, en comparación con una proteína transmembrana que tiene un péptido de señal no modificado. Como tal, se puede modular el nivel de expresión relativa de una proteína transmembrana derivada de una poliproteína que incluye un segundo polipéptido. Cuando la proteína transmembrana solo es activa en la superficie celular (o predominantemente activa en la superficie celular), la reducción de la expresión relativa en la superficie celular de la proteína también reduce su actividad relativa.
Esta invención puede ampliarse para modular la expresión relativa de tres o más proteínas expresadas como un polipéptido concatenado, separadas por sitios de escisión y expresión relativa en la superficie dictada por péptidos de señal de actividad diferente.
Descripción de las figuras
Figura 1: Métodos utilizados para expresar diferentes proteínas del mismo vector
(a) Dos promotores diferentes dentro del mismo casete dan como resultado dos transcritos diferentes, cada uno de los cuales da lugar a proteínas diferentes. (b) Uso de una secuencia del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) que conduce a un transcrito único que se traduce en dos proteínas diferentes. (c) Uso de los resultados del péptido FMDV 2A que da como resultado un único transcrito, y una única poliproteína que se escinde rápidamente en dos proteínas diferentes.
Figura 2: Diagrama esquemático que ilustra la función de las secuencias de señal en el direccionamiento de proteínas
Figura 3: Diagrama esquemático de la construcción de ácido nucleico que codifica dos CAR
Figura 4: Verificación de la función de una secuencia de señal sustituida.
PCT/GB2014/053452 describe el sistema de vector que codifica dos receptores de antígeno quiméricos (CAR), uno contra CD19 y uno contra CD33. El péptido de señal utilizado para los CAR en ese estudio fue el péptido de señal de la secuencia de señal de CD8a humana. Para los fines del estudio, esta se sustituyó con el péptido de señal de la región V-III de la cadena kappa de la Ig murina, que tiene la secuencia: METDTLILWVLLLLVPGSTG (los restos hidrófobos están destacados en negrita). Con el fin de establecer que la secuencia de señal de la región V-III de la cadena kappa de la Ig murina funcionaba también como la secuencia de señal de la CD8a humana, se llevó a cabo un estudio comparativo. Para ambas secuencias de señal, se observó la expresión funcional del CAR anti-CD33 y del CAR anti-CD19.
Figura 5: Ensayo del efecto de una deleción de un aminoácido en la región V-III de la cadena kappa de la Ig murina. Se creó una cadena kappa mutante 1 con la siguiente deleción (mostrada en gris) en la región h METDTLILWVLLLLVPGSTG y se observó la expresión relativa en el CAR anti-CD33 y en el c Ar anti-CD19. Figura 6: Ensayo del efecto de dos deleciones de aminoácidos en la región V-III de la cadena kappa de la Ig murina. Se creó una cadena kappa mutante 2 con las siguientes deleciones (mostradas en gris) en la región h METDTLILWVLLLLVPGSTG y se observó la expresión relativa en el CAR anti-CD33 y en el CAR anti-CD19. Figura 7: Ensayo del efecto de tres deleciones de aminoácidos en la región V-III de la cadena kappa de la Ig murina. Se creó una cadena kappa mutante 2 con las siguientes deleciones (mostradas en gris) en la región h METDTLILWVLLLLVPGSTG y se observó la expresión relativa en el CAR anti-CD33 y en el CAR anti-CD19. Figura 8: Ensayo del efecto de cinco deleciones de aminoácidos en la región V-III de la cadena kappa de la Ig murina. Se creó una cadena kappa mutante 2 con las siguientes deleciones (mostradas en gris) en la región h METDTLILWVLLLLVPGSTG y se observó la expresión relativa en el CAR anti-CD33 y en el CAR anti-CD19. Descripción detallada
La presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende la siguiente estructura:
A-X-B
en la cual
A es una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que comprende un primer péptido de señal que tiene una estructura tripartita que contiene una región central hidrófoba (región h) flanqueada por una región n y una región c;
B es una secuencia de ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que comprende un segundo péptido de señal que tiene una estructura tripartita que contiene una región central hidrófoba (región h) flanqueada por una región n y una región c, y
X es una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión,
en donde el primer péptido de señal y el segundo péptido de señal se pueden derivar de la misma secuencia, pero un péptido de señal comprende una o más deleciones/sustituciones de aminoácidos en la región h para eliminar/sustituir uno o más aminoácidos hidrófobos en comparación con el otro péptido de señal, en donde el primer péptido de señal y el segundo péptido de señal tienen las mismas regiones n y c, y en donde la diferencia entre el primer y el segundo péptidos de señal es tal que, cuando la construcción de ácido nucleico se expresa en una célula, existe expresión relativa diferencial del primer y segundo polipéptidos en la superficie celular.
CONSTRUCCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO POLIPÉPTIDO
Los polipéptidos producidos con la construcción de ácido nucleico de la invención son polipéptidos que contienen péptidos de señal, tales como proteínas secretadas, transmembrana o de orgánulos.
PÉPTIDO SEÑAL
Los polipéptidos A y B (y opcionalmente otros, C, D, etc.) codificados por la construcción de ácido nucleico de la invención comprenden cada uno una secuencia de señal de modo que cuando el polipéptido se expresa dentro de una célula, la proteína naciente se dirige al retículo endoplásmico (RE) (véase la Figura 2a).
La expresión "péptido de señal" es sinónima de "secuencia de señal".
Un péptido de señal es un péptido corto, frecuentemente de 5-30 aminoácidos de longitud, presente en el extremo N de la mayoría de las proteínas recién sintetizadas que están destinadas a la vía secretora. Estas proteínas incluyen aquellas que residen dentro de ciertos orgánulos (por ejemplo, el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi o los endosomas), se secretan de la célula y las proteínas transmembrana.
Los péptidos de señal comúnmente contienen una secuencia central que es un tramo largo de aminoácidos hidrófobos que tiende a formar una única hélice alfa. El péptido de señal puede empezar con un tramo corto de aminoácidos cargados positivamente, que ayuda a reforzar la topología adecuada del polipéptido durante la translocación. Al final del péptido de señal normalmente hay un tramo de aminoácidos que reconoce y escinde la peptidasa señal. La peptidasa señal puede escindir durante o después de completarse la translocación, para generar un péptido de señal libre y una proteína madura. Después, los péptidos de señal libres se digieren por proteasas específicas.
El péptido de señal está normalmente situado en el extremo amino de la molécula, aunque se conocen algunos péptidos de señal en el extremo carboxilo.
Como se ha mencionado anteriormente, las secuencias de señal tienen una estructura tripartita, que consiste en una región central hidrófoba (región h) flanqueada por una región n y c. Esta última contiene el sitio de escisión consenso de peptidasa señal (SPasa). Normalmente, las secuencias de señal se escinden co-traduccionalmente, y las secuencias de señal escindidas resultantes se denominan péptidos de señal.
En el péptido de señal de la región V-III de la cadena kappa de la Ig murina, que tiene la secuencia: METDTLILWVLLLLVPGSTG: la región n tiene la secuencia METD; la región h (mostrada en negrita) tiene la secuencia TLILWVLLLLV; y la región c tiene la secuencia PGSTG.
En la construcción de ácido nucleico de la presente invención la secuencia de señal de los dos (o más) polipéptidos difiere en sus regiones h. Un polipéptido (que tiene una expresión relativa más alta) tiene un mayor número de aminoácidos hidrófobos en la región h que el otro polipéptido (que tiene una expresión relativa más baja). El péptido de señal del polipéptido con una expresión relativa más baja puede comprender una o más mutaciones de aminoácidos, tales como sustituciones o deleciones, de aminoácidos hidrófobos en la región h que el péptido de señal del polipéptido con una expresión relativa más baja.
El primer péptido de señal y el segundo péptido de señal tienen las mismas regiones n y c, pero diferir en la región h como se explicó anteriormente. "Sustancialmente igual" indica que las regiones n y c pueden ser idénticas entre el primer y el segundo péptido de señal o pueden diferir en uno, dos o tres aminoácidos en la cadena n o c, sin afectar a la función del péptido de señal.
Los aminoácidos hidrófobos en el núcleo pueden, por ejemplo, ser: Alanina (A); Valina (V); Isoleucina (I); Leucina (L); Metionina (M); Fenilalanina (P); Tirosina (Y); o Triptófano (W).
Los aminoácidos hidrófobos mutados para alterar la eficiencia del péptido de señal pueden ser cualquiera de la lista anterior, en particular: Valina (V); Isoleucina (I); Leucina (L); y triptófano (W).
De los restos de la región h, un péptido de señal (por ejemplo, el péptido de señal alterado) puede comprender al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % menos aminoácidos hidrófobos que el otro péptido de señal (por ejemplo, el péptido de señal inalterado).
Cuando la región h comprende 5-15 aminoácidos, un péptido de señal puede comprender 1, 2, 3, 4 o 5 más aminoácidos hidrófobos que el otro péptido de señal.
El péptido de señal puede comprender 1, 2, 3, 4 o 5 deleciones o sustituciones de aminoácidos hidrófobos. Los aminoácidos hidrófobos pueden estar sustituidos con aminoácidos no hidrófobos, tales como aminoácidos hidrófilos o neutros.
Las secuencias de señal se pueden detectar o predecir utilizando técnicas de software (véase por ejemplo, http://www.predisi.de/).
Se conoce una gran cantidad de secuencias de señal, y están disponibles en bases de datos. Por ejemplo, http://www.signalpeptide.de incluye 2109 péptidos de señal de mamíferos confirmados en su base de datos.
La Tabla 1 proporciona una lista de secuencias de señal exclusivamente con fines ilustrativos. El núcleo hidrófobo se resalta en negrita. Esto incluye ejemplos de aminoácidos que pueden sustituirse o eliminarse para los fines de la presente invención.
T l 1
Figure imgf000006_0001
continuación
Figure imgf000007_0001
El péptido de señal mutado comprende una o más mutaciones de tal manera que tiene menos aminoácidos hidrófobos que el péptido de señal de tipo silvestre del que se deriva. La expresión "tipo silvestre" significa la secuencia del péptido de señal que se produce en la proteína natural de la que deriva. Por ejemplo, el péptido de señal descrito en los ejemplos es el péptido de señal de la región V-III de la cadena kappa de la Ig murina, que tiene la secuencia de tipo: METDTLILWVLLLLVPGSTG.
La expresión "tipo silvestre" también incluye péptidos de señal derivados de una proteína natural que comprende una o más mutaciones de aminoácidos en la región n o c. Por ejemplo, es frecuente modificar un péptido de señal natural con una sustitución de aminoácidos conservada en el extremo N para introducir un sitio de restricción. Dichas secuencias de péptidos de señal modificadas (que no comprenden ninguna mutación en la región h) se consideran "de tipo silvestre" para los fines de la presente invención.
La presente invención también se refiere a secuencias de péptidos de señal sintéticos, que no se pueden definir con respecto a una secuencia de tipo silvestre. En esta realización, el péptido de señal de un polipéptido comprende menos aminoácidos hidrófobos que la secuencia de señal del otro polipéptido. Las dos secuencias de señal pueden derivarse de la misma secuencia de péptido de señal sintético, pero difieren en el número de aminoácidos hidrófobos en la región central.
PROTEÍNA TRANSMEMBRANA
La presente invención permite la modulación de la expresión relativa de una proteína de superficie transmembrana. La proteína de superficie transmembrana es una proteína que se expresa en la superficie celular. Cuando se expresa en la superficie celular, al menos un dominio de la proteína transmembrana es exoplasmático (es decir, en el exterior de la célula).
La proteína transmembrana puede ser una proteína transmembrana de un solo paso, es decir, puede comprender un solo dominio transmembrana o puede comprender múltiples dominios transmembrana.
Las proteínas transmembrana se pueden clasificar por topología, es decir, con referencia a la posición de los dominios N- y C-terminales. Las proteínas transmembrana de tipo I, II y III son moléculas de un solo paso, mientras que las proteínas transmembrana de tipo IV son moléculas de paso múltiple. Las proteínas transmembrana de tipo I están ancladas a la membrana lipídica con una secuencia de anclaje de parada-transferencia y tienen sus dominios N-terminales dirigidos a la luz del RE durante la síntesis (y al espacio extracelular, cuando la forma madura se encuentra en la membrana plasmática). Los tipos II y III están anclados con una secuencia de anclaje de señal, estando el tipo II dirigido al lumen del RE con su dominio C-terminal, mientras que el tipo III tiene sus dominios N-terminales dirigidos al lumen del RE. El tipo IV se subdivide en IV-A, con sus dominios N-terminales dirigidos al citosol y IV-B, con un dominio N-terminal dirigido al lumen.
La proteína o proteínas transmembrana preparadas mediante la construcción de ácido nucleico de la presente invención pueden ser de cualquiera de los tipos I-IV.
El dominio transmembrana puede ser cualquier estructura de proteína que sea termodinámicamente estable en una membrana. Esto es típicamente una hélice alfa que comprende varios restos hidrófobos. El dominio transmembrana de cualquier proteína transmembrana se puede usar para suministrar la porción transmembrana. Los expertos en la materia pueden determinar la presencia y la extensión de un dominio transmembrana de una proteína utilizando el algoritmo TMHMM http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/). Adicionalmente, dado que el dominio transmembrana de una proteína es una estructura relativamente simple, es decir, una secuencia de polipéptidos prevista para formar una hélice alfa hidrófoba de longitud suficiente para abarcar la membrana, también se puede usar un dominio TM diseñado artificialmente (el documento US7052906 B1 describe componentes transmembrana sintéticos).
El dominio transmembrana puede obtenerse de CD28, lo que le proporciona una buena estabilidad.
La estructura y el procesamiento de las proteínas transmembrana de Tipo I son bien conocidos en la técnica. Tales proteínas comprenden normalmente un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un endodominio intracelular y son moléculas de un solo paso con una única hélice a que atraviesa la membrana celular.
Las proteínas transmembrana de tipo I normalmente tienen un péptido de señal que es rápidamente reconocido por el retículo endoplásmico (RE) y, por lo tanto, la proteína en traducción se redirige rápidamente al RE. Una hélice hidrófoba bloquea y a continuación ancla la proteína en la membrana del RE.
Como se ha mencionado anteriormente, las proteínas transmembrana de Tipo I están ancladas a la membrana lipídica con una secuencia de anclaje de parada-transferencia. La secuencia de parada-transferencia detiene la translocación adicional del polipéptido y actúa como un ancla transmembrana.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión proteína transmembrana de Tipo I abarca cualquier proteína que comprende un dominio transmembrana de Tipo I y una secuencia de anclaje de parada-transferencia y, en ausencia de una señal de retención intracelular exógena, está dirigida para expresión en la superficie celular.
Se conocen en la técnica diversas proteínas transmembrana de tipo 1 que son adecuadas para su uso en la presente invención. Dichas proteínas incluyen, pero no se limitan a, receptores inhibidores, receptores estimuladores, receptores de citocinas y Proteínas G.
La proteína o proteínas transmembrana pueden ser una cadena a o p del receptor de linfocitos T.
La proteína o proteínas transmembrana pueden ser un receptor de antígeno quimérico (CAR).
Los CAR son proteínas que injertan un dominio de unión a antígeno en la función efectora de un linfocito T. Su forma habitual es la de una proteína de dominio transmembrana de tipo I con un extremo amino terminal que reconoce el antígeno, un espaciador, un dominio transmembrana, todos conectados a un endodominio compuesto que transmite señales de activación y supervivencia de linfocitos T.
El dominio de unión al antígeno puede derivar de un anticuerpo o mimético de anticuerpo, o puede ser otra entidad que se une específicamente al antígeno, tal como un ligando.
La forma más habitual de estas moléculas son fusiones de fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) derivados de anticuerpos monoclonales que reconocen un antígeno diana, fusionados mediante un espaciador y un dominio transmembrana a un endodominio de señalización. Dichas moléculas dan como resultado la activación de los linfocitos T en respuesta al reconocimiento por el scFv de su diana. Cuando los linfocitos T expresan dicho CAR, reconocen y eliminan células diana que expresan el antígeno diana. Se han desarrollado varios CAR contra antígenos asociados al tumor, y las estrategias de transferencia adoptiva usando dichos linfocitos T que expresan CAR están actualmente en ensayo clínico para el tratamiento de diversos cánceres.
También es posible que el endodominio de señalización esté presente en una molécula diferente. El término "CAR" en relación con la presente invención también abarca una molécula que comprende un dominio de unión a antígeno conectado a un dominio transmembrana. Tal CAR puede ser capaz de interactuar con un dominio de señalización intracelular diferente para estimular la activación de los linfocitos T.
En la presente invención, cualquiera de las secuencias de ácido nucleico A o B puede ser una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína transmembrana que comprende un péptido de señal.
La mayoría de las proteínas transmembrana de interés solo son activas, o son predominantemente activas cuando están en la membrana celular. Por tanto, el uso de un péptido de señal ineficaz reduce la expresión relativa de la proteína en la superficie celular y, por tanto, reduce la actividad relativa de la proteína.
POLIPROTEÍNA
La construcción de ácido nucleico de la presente invención puede codificar una poliproteína, que comprende el primer y segundo polipéptidos.
El primer y segundo polipéptidos pueden ser receptores de antígenos quiméricos (CAR).
La construcción de ácido nucleico descrita en los Ejemplos codifica la siguiente poliproteína que comprende los diversos componentes en el orden en que se enumeran:
Péptido de señal derivado de la región V-III de la cadena kappa de la Ig de ratón:
METDTLILWVLLLLVPGSTG (véase a continuación)
scFv aCD19:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRF SGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIW GSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQG TSVTVS
Enlazador:
SD CD8aSTK humana:
PTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI CD28TM humana:
FWVLWVGGVLACYSLLVTVAFMFWV
Dominio intracelular de CD3zeta humana:
RRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEG LYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Péptido 2A:
RAEGRGSLLTCGDVEENPGP
Péptido de señal derivado de la cadena kappa de la Ig de ratón:
MAVPTQVLGLLLLWLTDA
scFv aCD33:
RCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYFNLVWYQQKPGKAPKLLIYDTNRLADGVPS RFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHYKNYPLTFGQGTKLEIKRSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSRSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYGMHWIRQAPGKGLEW VSSISLNGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQDAYTGGYFD YWGQGTLVTVSSM
Enlazador:
DPA
Bisagra y Fc derivados de la IgG1 humana con mutaciones para prevenir la asociación de FcRg (HCH2CH3pvaa):
EPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Enlazador:
KDPK CD148TM humana:
AVFGCIFGALVIVTVGGFIFW
Dominio intracelular de CD148 humana:
RKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKY AAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTL KDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRD FTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGV GRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSK VDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA
La secuencia de señal de la región V-III de la cadena kappa de la Ig murina, que tiene la secuencia: METDTLILWVLLLLVPGSTG (los restos hidrófobos están destacados en negrita) está alterada como se describe en los Ejemplos. Los restos hidrófobos se eliminaron secuencialmente del núcleo hidrófobo para reducir el nivel de expresión del CAR anti-CD19.
SITIO DE ESCISIÓN
La construcción de ácido nucleico del primer aspecto de la invención comprende una secuencia que codifica un sitio de escisión posicionado entre las secuencias de ácido nucleico que codifican el primer y segundo polipéptidos, de manera que el primer y segundo polipéptidos se pueden expresar como entidades diferentes.
El sitio de escisión puede ser cualquier secuencia que permita que el polipéptido que comprende el primer y segundo polipéptidos se separe.
El término "escisión" se usa en el presente documento por conveniencia, pero el sitio de escisión puede provocar que el primero y segundo polipéptidos se separen en entidades individuales por un mecanismo que no sea la escisión clásica. Por ejemplo, para el péptido 2A autoescindible del virus de la fiebre aftosa (VFA) (véase más abajo), se han propuesto diversos modelos para dar cuenta de la actividad de "escisión": proteólisis por una proteinasa de la célula hospedadora, autoproteólisis o un efecto traduccional (Donnelly et al (2001) J. Gen. Virol. 82:1027-1041). El mecanismo exacto de tal "escisión" no es importante para los fines de la presente invención, siempre y cuando el sitio de escisión, cuando está posicionado entre secuencias de ácido nucleico que codifican el primer y segundo polipéptidos, haga que el primer y segundo polipéptidos se expresen como entidades diferentes.
El sitio de escisión puede ser un sitio de escisión de furina.
La furina es una enzima que pertenece a la familia de la proproteína convertasa de tipo subtilisina. Los miembros de esta familia son proproteína convertasas que procesan proteínas precursoras latentes en sus productos biológicamente activos. La furina es una serina endoproteasa dependiente de calcio que puede escindir de forma eficaz proteínas precursoras en sus sitios de procesamiento de aminoácidos básicos emparejados. Los ejemplos de sustratos de furina incluyen la hormona proparatiroidea, el precursor del factor de crecimiento transformante beta 1, la proalbúmina, la pro-beta-secretasa, la metaloproteinasa de matriz de membrana de tipo 1, la subunidad beta del profactor de crecimiento nervioso y el factor von Willebrand. La furina escinde proteínas justo cadena abajo de una secuencia diana de aminoácidos básicos (canónicamente, Arg-X-(Arg/lys)-Arg') y es enriquecida en el aparato de Golgi.
El sitio de escisión puede ser un sitio de escisión del virus del grabado del tabaco (VGT).
La proteasa de VGT es una cisteína proteasa altamente específica de secuencia que es una proteasa de tipo quimotripsina. Es muy específica para su sitio de escisión diana y, por lo tanto, se usa con frecuencia para la escisión controlada de proteínas de fusión tanto in vitro como in vivo. El sitio de escisión del VGT consenso es ENLYFQ\S (donde '\' denota el enlace peptídico escindido). Las células de mamífero, tales como las células humanas, no expresan la proteasa de VGT. Por lo tanto, en realizaciones en las que la presente construcción de ácido nucleico comprende un sitio de escisión de VGT y se expresa en una célula de mamífero, la proteasa de VGT exógena también debe expresarse en la célula de mamífero.
El sitio de escisión puede codificar un péptido autoescindible.
Un 'péptido autoescindible' se refiere a un péptido que funciona de tal modo que cuando se produce el polipéptido que comprende el primer y segundo polipéptidos y el péptido autoescindible, se "escinde" inmediatamente o se separa en un primer y segundo polipéptidos distintos y discretos sin la necesidad de ninguna actividad de escisión externa. El péptido autoescindible puede ser un péptido autoescindible 2A de un aftovirus o un cardiovirus. La escisión primaria 2A/2B de los aftovirus y cardiovirus está mediada por la "escisión" de 2A en su propio extremo C. En los aftovirus, tal como los virus de la fiebre aftosa (FMDV) y el virus de la rinitis equina A, la región 2A es una sección corta de aproximadamente 18 aminoácidos, que, junto con el residuo N-terminal de la proteína 2B (un resto de prolina conservado) representa un elemento autónomo capaz de mediar la "escisión" en su propio C-terminal.
Los 19 aminoácidos C-terminales de la proteína de cardiovirus más larga, junto con la prolina N-terminal de 2B median la "escisión" con una eficacia aproximadamente igual a la secuencia del aftovirus FMDV 2a. Los cardiovirus incluyen el virus de la encefalomiocarditis (EMCV) y el virus de la encefalitis murina de Theiler (TMEV).
El análisis mutacional de EMCV y FMDV 2A ha revelado que el motivo DxExNPGP está íntimamente implicado en la actividad de "escisión" (Donelly et al (2001) como anteriormente).
El sitio de escisión de la presente invención puede comprender la secuencia de aminoácidos: Dx-iEx2 NPGP, donde x 1 y x2 son cualquier aminoácido. x 1 puede seleccionarse del siguiente grupo: I, V, M y S. x2 puede seleccionarse del siguiente grupo: T, M, S, L, E, Q y F. Por ejemplo, el sitio de escisión puede comprender una de las secuencias de aminoácidos mostradas en la Tabla 2.
T l 2
Figure imgf000011_0001
El sitio de escisión, basado en una secuencia 2A puede tener, por ejemplo 15-22 aminoácidos de longitud. La secuencia puede comprender el extremo C-terminal de una proteína 2A, seguido de un resto de prolina (que corresponde a la prolina N-terminal de 2B).
Los estudios de mutaciones también han demostrado que, además de las secuencias 2A naturales, algunas variantes también son activas. El sitio de escisión puede corresponder a una secuencia variante de un polipéptido 2A de origen natural, que tiene una, dos o tres sustituciones de aminoácidos, que retiene la capacidad de inducir la "escisión" de una secuencia de poliproteína en dos o más proteínas diferentes.
La secuencia de escisión puede seleccionarse de las siguientes que todas han demostrado en cierta medida ser activas (Donnelly et al (2001) como anteriormente):
LLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID No. 11)
LLNFDLLKLAGDVQSNPGP (SEQ ID No. 12)
LLNFDLLKLAGDVEINPGP (SEQ ID No. 13)
LLNFDLLKLAGDVEFNPGP (SEQ ID No. 14)
LLNFDLLKLAGDVESHPGP (SEQ ID No. 15)
LLNFDLLKLAGDVESEPGP (SEQ ID No. 16)
LLNFDLLKLAGDVESQPGP (SEQ ID No. 17)
LLNFDLLKLAGDVESNPGG (SEQ ID No. 18)
Basándose en la secuencia del motivo DxExNPGP, se han descubierto secuencias "similares a 2A" en picornavirus que no son aftovirus o cardiovirus, virus de insectos 'tipo picornavirus', rotavirus de tipo C y secuencias repetidas dentro de Trypanosoma spp, y una secuencia bacteriana (Donnelly et al (2001), como anteriormente). El sitio de escisión puede comprender una de estas secuencias similar a 2A, tales como:
YHADYYKQRLIHDVEMNPGP (SEQ ID NO: 19)
HYAGYFADLLIHDIETNPGP (SEQ ID NO: 20)
QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 21)
ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 22)
AARQMLLLLSGDVETNPGP (SEQ ID NO: 23)
RAEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 24)
TRAEIEDELIRAGIESNPGP (SEQ ID NO: 25)
TRAEIEDELIRADIESNPGP (SEQ ID NO: 26)
AKFQIDKILISGDVELNPGP (SEQ ID NO: 27)
SSIIRTKMLVSGDVEENPGP (SEQ ID NO: 28)
CDAQRQKLLLSGDIEQNPGP (SEQ ID NO: 29)
YPIDFGGFLVKADSEFNPGP (SEQ ID NO: 30)
El sitio de escisión puede comprender la secuencia de tipo 2A mostrada como la SEQ ID NO: 24 (RAEGRGSLLTCGDVEENPGP).
Se ha demostrado que incluir una "extensión" N-terminal de entre 5 y 39 aminoácidos puede aumentar la actividad (Donnelly et al (2001) como anteriormente). En particular, la secuencia de escisión puede comprender una de las siguientes secuencias o una variante de la misma que tiene, por ejemplo, hasta 5 cambios de aminoácidos que retienen la actividad del sitio de escisión:
VTELLYRMKRAETYCPRPLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID No. 31) LLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID No. 32) EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID No. 33)
APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID No. 34)
AJUSTABILIDAD
La expresión relativa de una o más proteínas puede ajustarse con precisión usando el método de la invención usando péptidos de señal con diferentes cantidades o proporciones de aminoácidos hidrófobos.
La ajustabilidad usando diferentes péptidos de señal es especialmente útil cuando se considera la expresión de múltiples proteínas, cada una con su propia expresión relativa. Por ejemplo, si se considera una construcción de ácido nucleico que tiene la siguiente estructura:
A-X-B-Y-C
en la cual
A, B y C son secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos; y
X e Y son secuencias de ácido nucleico que codifican sitios de escisión.
La construcción de ácido nucleico codificará tres proteínas A, B y C, cualquiera de las cuales pueden ser proteínas transmembrana. Si se desea que A, B y C se expresen de tal manera que los niveles relativos sean A>B>C, entonces la secuencia de ácido nucleico A puede tener un péptido de señal con los aminoácidos más hidrófobos, la secuencia de ácido nucleico B puede tener un péptido de señal con una cantidad media de aminoácidos hidrófobos, y la secuencia de ácido nucleico C puede tener un péptido de señal con los aminoácidos menos hidrófobos.
VECTOR
La presente invención también proporciona un vector que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
Tal vector se puede usar para introducir la construcción de ácido nucleico en una célula hospedadora para que exprese el primer y el segundo polipéptido.
El vector puede, por ejemplo, ser un plásmido o un vector viral, tal como un vector retroviral o un vector lentiviral, o un vector basado en transposón o ARNm sintético.
El vector puede tener la capacidad de transfectar o transducir una célula de mamífero, por ejemplo un linfocito T. CÉLULA
La presente invención además proporciona una célula que comprende una construcción o vector de ácido nucleico de la presente invención que expresa el primer y segundo polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico. La célula puede ser cualquier célula eucariota capaz de expresar una proteína transmembrana en la superficie celular, tal como una célula inmunitaria.
La célula puede ser una célula inmunitaria citolítica, tal como un linfocito T o un linfocito citolítico natural.
MÉTODO

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una construcción de ácido nucleico que comprende la siguiente estructura:
A-X-B
en la cual
A es una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que comprende un primer péptido de señal que tiene una estructura tripartita que contiene una región central hidrófoba (región h) flanqueada por una región n y una región c;
B es la secuencia de ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que comprende un segundo péptido de señal que tiene una estructura tripartita que contiene una región central hidrófoba (región h) flanqueada por una región n y una región c, y X es una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión,
en donde el primer péptido de señal y el segundo péptido de señal se pueden derivar de la misma secuencia, pero un péptido de señal comprende una o más deleciones/sustituciones de aminoácidos en la región h para eliminar/sustituir uno o más aminoácidos hidrófobos en comparación con el otro péptido de señal, en donde el primer péptido de señal y el segundo péptido de señal tienen las mismas regiones n y c, y en donde la diferencia entre el primer y el segundo péptidos de señal es tal que, cuando la construcción de ácido nucleico se expresa en una célula, existe expresión relativa diferencial del primer y segundo polipéptidos en la superficie celular.
2. Una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde el o los aminoácidos hidrófobos se seleccionan del grupo: Alanina (A); Valina (V); Isoleucina (I); Leucina (L); Metionina (M); Fenilalanina (P); Tirosina (Y); Triptófano (W).
3. Una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde el o los aminoácidos hidrófobos se seleccionan del grupo: Valina (V); Isoleucina (I); Leucina (L); y triptófano (W).
4. Una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde un péptido de señal comprende hasta cinco aminoácidos hidrófobos más que el otro péptido de señal.
5. Una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el primer y segundo polipéptidos son ambos proteínas transmembrana.
6. Una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 5, en donde la primera y la segunda proteínas transmembrana son ambas receptores de antígenos quiméricos (CAR).
7. Un vector que comprende una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
8. Una célula que comprende una construcción de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un vector según la reivindicación 7.
9. Una célula que comprende dos receptores de antígeno quiméricos que tienen diferentes péptidos de señal que se pueden derivar de la misma secuencia, en donde los péptidos de señal tienen una estructura tripartita que contiene una región central hidrófoba (región h) flanqueada por una región n y una región c, en donde los péptidos de señal tienen las mismas regiones n y c, pero un péptido de señal comprende una o más deleciones/sustituciones de aminoácidos para eliminar/sustituir uno o más aminoácidos hidrófobos en la región h en comparación con el otro péptido de señal, en donde el receptor de antígeno quimérico que tiene un péptido de señal con el mayor número de aminoácidos hidrófobos se expresa más en la superficie celular que el receptor de antígeno quimérico que tiene un péptido de señal con el menor número de aminoácidos hidrófobos.
10. Un método para fabricar una célula según la reivindicación 8 o 9, que comprende la etapa de introducir una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un vector según la reivindicación 7 en una célula.
11. Un método para modular la expresión relativa en la superficie celular de una primera proteína expresada a partir de una única construcción de ácido nucleico con una segunda proteína que comprende la etapa de mutar la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de señal de una proteína para eliminar o reemplazar uno o más aminoácidos hidrófobos en comparación con el péptido de señal de la otra proteína.
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