JP2020182473A

JP2020182473A - 核酸構築物

Info

Publication number: JP2020182473A
Application number: JP2020117041A
Authority: JP
Inventors: プーレマーティン; Pule Martin; コルドバショーン; Cordoba Shaun
Original assignee: UCL Business Ltd
Current assignee: UCL Business Ltd
Priority date: 2015-04-27
Filing date: 2020-07-07
Publication date: 2020-11-12
Also published as: JP2018514209A; EP3288582B1; AU2016254499A1; US20180099994A1; CA2983687A1; CN107532175A; JP6836516B2; WO2016174409A1; ES2869971T3; US11613559B2; GB201507108D0; HK1243958A1; EP3288582A1

Abstract

【課題】単一のベクターから共発現されるポリペプチドの相対発現を調節するための構築物および手法を提供する。【解決手段】次の構造：Ａ−Ｘ−Ｂを含む核酸構築物であって、式中、Ａは、第１のシグナルペプチドを含む第１のポリペプチドをコードする核酸配列であり；Ｂは、第２のシグナルペプチドを含む第２のポリペプチドをコードする核酸配列であり、Ｘは切断部位をコードする核酸配列であり、第１のシグナルペプチドまたは第２のシグナルペプチドが、より少ない疎水性アミノ酸を有するように１つまたは複数の変異（複数可）を含む、核酸構築物。【選択図】なし

Description

本発明は、単一のベクターから共発現されるポリペプチドの相対発現を調節するための構築物および手法に関する。具体的には本発明は、第２のポリペプチドを伴って単一のベクターから共発現される膜貫通タンパク質の発現を調節することに関する。

同じ細胞の複数回の形質導入が困難で費用がかかり予測不可能であることから、異なるタンパク質を同じベクターから発現することがしばしば望ましい。したがってさまざまな方法が単一のベクターからの２つのタンパク質の共発現を可能にするために開発された（図１を参照されたい）。

最初の試みは、同じカセット内の２つの異なるプロモーターを使用した。これは、別々のタンパク質をそれぞれコードする２つの別々の転写物をもたらす。これは、多くの原因により困難な手法である。重要な課題は、一方のプロモーターが優位になり、第２のプロモーターのサイレンシングを生じる「プロモーター干渉」である。加えて異なるプロモーターは、異なる細胞コンテキストにおいて異なって作動し、これは各導入遺伝子の相対的発現の調和のとれた「調整」を達成することを困難にする。

代替的手法は、配列内リボソーム侵入配列（ＩｎｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍｅＥｎｔｒｙｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＩＲＥＳ）を使用することである。ここで単一の転写物が生成される。転写物中のＩＲＥＳ配列は、２つの導入遺伝子のオープンリーディングフレームの間に置かれ、ｍＲＮＡキャップ構造を模倣する。それによりリボソームは、５’キャップまたはＩＲＥＳのいずれかで翻訳を開始し、２つの別々のタンパク質の発現をもたらす。この手法の重要な制限は、相対的発現を制御できないことである。３’転写物は、典型的には５’のものより少なく発現されるが、発現の比を予測および調整することは困難である。

さらなる手法は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）（および関連ウイルス）が単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から複数のタンパク質を発現できるようにする口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチドの役割の特徴付けに続いて提供された（Donnellyら；J. Gen. Virol.；８２巻、１０２７〜１０４１頁（２００１年））。２Ａペプチド（およびホモログ）は、ＯＲＦの翻訳直後に非常に高い効率で切断され、単一のＯＲＦからの複数のペプチドの発現を可能にする。同じＯＲＦ中の異なるペプチド間で切断する２Ａペプチドの使用に伴う課題は、発現が１：１の比に限定されることである。

Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（２００１年）；８２巻、１０２７〜１０４１頁

したがって、上に記載の不利益を伴わずに単一のベクターから１つより多いタンパク質を発現するための代替方法が必要である。

本発明は、２つのシグナルペプチド含有タンパク質が翻訳後に切断されるポリタンパク質として共発現される場合に、シグナルペプチドの相対「強度」を改変することが可能であり、それにより２つのタンパク質の相対発現を制御できるという測定に基づいている。これは導入遺伝子の対に限定される必要はなく、ポリタンパク質として最初に翻訳される複数のタンパク質の相対発現の制御を可能にするために使用されてよい。

本明細書において使用される「ポリタンパク質」は、単一の核酸構築物から単一の実体として翻訳されるが、次いで分離され、別々の実体（例えば別々のタンパク質）として機能するポリペプチド配列を含むポリペプチド配列を指す。

したがって第一態様では本発明は、次の構造：
Ａ−Ｘ−Ｂ
を含む核酸構築物であって、
式中
Ａは、第１のシグナルペプチドを含む第１のポリペプチドをコードする核酸配列であり；Ｂは、第２のシグナルペプチドを含む第２のポリペプチドをコードする核酸配列であり、Ｘは切断部位をコードする核酸配列であり、
第１のシグナルペプチドまたは第２のシグナルペプチドが、より少ない疎水性アミノ酸を有するように１つまたは複数の変異（複数可）を含む、
核酸構築物を提供する。

変異されたシグナルペプチドは、それが由来する「野生型」シグナルペプチド配列よりも少ない疎水性アミノ酸を有してよい。

変異されたシグナルペプチドは、他のポリペプチドのシグナルペプチドよりも少ない疎水性アミノ酸を有してよい。

疎水性アミノ酸（複数可）は、群：アラニン（Ａ）；バリン（Ｖ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；メチオニン（Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐ）；チロシン（Ｙ）；トリプトファン（Ｗ）から選択されてよい。

第１のシグナルペプチドおよび第２のシグナルペプチドは同じ配列に由来してよいが、一方のシグナルペプチドは他方のシグナルペプチドと比較して１つまたは複数の疎水性アミノ酸を除去または置き換えるように１つまたは複数のアミノ酸欠失または置換を含んでよい。

下により詳細に説明のとおり、シグナル配列は、ｎおよびｃ領域が隣接した疎水性コア領域（ｈ領域）からなる三要素構造（tripartite structure）を有する。第１のシグナルペプチドおよび第２のシグナルペプチドは、同一のｎおよびｃ領域を有してよいが、ｈ領域において異なっていてよく：一方のシグナルペプチドのｈ領域は、他方のシグナルペプチドよりも多い疎水性アミノ酸を有する。

シグナルペプチドから欠失または置き換えられる疎水性アミノ酸（複数可）は、群：アラニン（Ａ）；バリン（Ｖ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；メチオニン（Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐ）；チロシン（Ｙ）；トリプトファン（Ｗ）から選択されてよい。

シグナルペプチドから欠失または置き換えられる疎水性アミノ酸（複数可）は、群：バリン（Ｖ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；およびトリプトファン（Ｗ）から選択されてよい。

一方のポリペプチドのシグナルペプチドは、他方のシグナルペプチドよりも最大で５つ多い疎水性アミノ酸を含んでよい。変更されたシグナルペプチドは、その疎水性アミノ酸の１０％まで、２０％まで、３０％まで、４０％までまたは５０％までが置き換えられてよい、または除去されてよい。

第１のおよび第２のポリペプチドは、分泌性タンパク質、膜貫通タンパク質または小器官タンパク質などのシグナルペプチド含有ポリペプチドであってよい。本発明は、タンパク質の相対発現、すなわち関連コンパートメントでのタンパク質の相対量を制御できるようにする。分泌性タンパク質について本発明は、細胞によって産生されるタンパク質の相対量を制御できるようにする。膜貫通タンパク質について、本発明は、２つ（またはそれより多い）タンパク質の相対的な細胞表面発現を制御できるようにする。小器官タンパク質について、本発明は、問題の小器官の内、またはその膜上のタンパク質の相対発現を制御できるようにする。

第１のおよび第２のポリペプチドは、両方ともＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの膜貫通タンパク質であってよい。

第１のおよび第２のタンパク質が膜貫通タンパク質である場合、第１のおよび第２のシグナルペプチドの間の差異は、核酸構築物が細胞内で発現される場合に細胞表面での第１のおよび第２のポリペプチドの相対発現に差異が生じるようなものであってよい。

Ｘは、自己切断ペプチド、フューリン切断部位またはタバコエッチウイルス切断部位をコードする核酸配列であってよい。

Ｘは、例えば，アフトもしくはカルジオウイルス由来２Ａ自己切断ペプチドまたは２Ａ様ペプチドをコードしてよい。

第二の態様では本発明は、前記請求項のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクターを提供する。

ベクターは、例えばレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであってよい。

第三の態様では、本発明の第一の態様による核酸構築物または本発明の第二の態様によるベクター含む細胞が提供される。

この第三の態様では、異なるシグナルペプチドを有する２つのキメラ抗原受容体を含む細胞も提供される。

２つのシグナルペプチドは、異なる数の疎水性アミノ酸を有してよい。

この態様では、より多い数の疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドを有するキメラ抗原受容体は、より少ない数の疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドを有するキメラ抗原受容体よりも細胞表面で高度に発現されてよい。

異なるシグナルペプチドを有する２つのキメラ抗原受容体を含む細胞も提供され、一方のキメラ抗原のシグナルペプチドはより少ない疎水性アミノ酸を有するように１つまたは複数の変異を含む。

変異されたシグナルペプチドを有するキメラ抗原受容体は、変異されていないシグナルペプチドを有するキメラ抗原受容体よりも細胞表面で低いレベルで発現されてよい。

細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの細胞溶解性免疫細胞であってよい。

第四の態様では、本発明の第一の態様による核酸構築物または本発明の第二の態様によるベクターを細胞に導入するステップを含む、本発明の第四の態様による細胞を作製するための方法が提供される。

第五の態様では、一方のタンパク質のシグナルペプチドをコードする核酸配列を、他方のタンパク質のシグナルペプチドと比較して１つまたは複数の疎水性アミノ酸を除去または置き換えるために、変異させるステップを含む、単一の核酸構築物から第２のシグナルペプチド含有タンパク質を伴って発現される第１のシグナルペプチド含有タンパク質の相対的な細胞表面発現を調節するための方法が提供される。

膜貫通タンパク質のシグナルペプチドからの疎水性アミノ酸の除去または置き換えは、未改変シグナルペプチドを有する膜貫通タンパク質と比較して、細胞表面上に発現される膜貫通タンパク質の量を低減する。そのように第２のポリペプチドを含むポリタンパク質由来の膜貫通タンパク質の相対発現レベルは、調節され得る。膜貫通タンパク質が細胞表面でだけ活性（または細胞表面で主に活性）である場合、タンパク質の相対的な細胞表面発現を低減すると、その相対活性も低減される。

本発明は、連結されたポリペプチドとして発現され、切断部位によって分離される３つまたはそれを超えるタンパク質の相対発現およびさまざまな活性のシグナルシグナルによって決定される相対表面発現を調節するために拡張されてよい。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
次の構造：
Ａ−Ｘ−Ｂ
を含む核酸構築物であって、
式中
Ａは、第１のシグナルペプチドを含む第１のポリペプチドをコードする核酸配列であり；Ｂは、第２のシグナルペプチドを含む第２のポリペプチドをコードする核酸配列であり、Ｘは切断部位をコードする核酸配列であり、
前記第１のシグナルペプチドまたは前記第２のシグナルペプチドは、より少ない疎水性アミノ酸を有するように１つまたは複数の変異（複数可）を含む、
核酸構築物。
（項目２）
前記第１のシグナルペプチドおよび前記第２のシグナルペプチドが同じ配列に由来するが、一方のシグナルペプチドが他方のシグナルペプチドと比較して１つまたは複数の疎水性アミノ酸を除去／置き換えるように１つまたは複数のアミノ酸欠失／置換を含む、項目１に記載の核酸構築物。
（項目３）
前記疎水性アミノ酸（複数可）が、群：アラニン（Ａ）；バリン（Ｖ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；メチオニン（Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐ）；チロシン（Ｙ）；トリプトファン（Ｗ）から選択される、項目２に記載の核酸構築物。
（項目４）
前記疎水性アミノ酸（複数可）が、群：バリン（Ｖ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；およびトリプトファン（Ｗ）から選択される、項目３に記載の核酸構築物。
（項目５）
一方のシグナルペプチドが、他方のシグナルペプチドよりも最大で５つ多い疎水性アミノ酸を含む、前記項目のいずれかに記載の核酸構築物。
（項目６）
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、両方とも膜貫通タンパク質である、前記項目のいずれかに記載の核酸構築物。
（項目７）
前記第１の膜貫通タンパク質および前記第２の膜貫通タンパク質が、両方ともキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、項目６に記載の核酸構築物。
（項目８）
前記第１のシグナルペプチドと前記第２のシグナルペプチドとの間の差異が、前記核酸構築物が細胞中で発現される場合に細胞表面での前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの相対発現に差異が生じるような差異である、項目６または７に記載の核酸構築物。
（項目９）
Ｘが、自己切断ペプチド、フューリン切断部位またはタバコエッチウイルス切断部位をコードする核酸配列である、前記項目のいずれかに記載の核酸構築物。
（項目１０）
Ｘが、アフトもしくはカルジオウイルス由来２Ａ自己切断ペプチドまたは２Ａ様ペプチドをコードする、項目９に記載の核酸構築物。
（項目１１）
前記項目のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
（項目１２）
項目１１に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
（項目１３）
項目１から１０のいずれか一項に記載の核酸構築物または項目１１または１２に記載のベクターを含む細胞。
（項目１４）
異なる数の疎水性アミノ酸を有する異なるシグナルペプチドを有する２つのキメラ抗原受容体を含む細胞であって、より多い数の疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドを有するキメラ抗原受容体が、より少ない数の疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドを有するキメラ抗原受容体よりも細胞表面で高度に発現される、細胞。
（項目１５）
異なるシグナルペプチドを有する２つのキメラ抗原受容体を含む細胞であって、一方のキメラ抗原の前記シグナルペプチドが、より少ない疎水性アミノ酸を有するように１つまたは複数の変異を含む、細胞。
（項目１６）
変異されたシグナルペプチドを有する前記キメラ抗原受容体が、変異されていないシグナルペプチドを有する前記キメラ抗原受容体よりも細胞表面で低いレベルで発現される、項目１５に記載の細胞。
（項目１７）
Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、項目１３から１６のいずれかに記載の細胞。
（項目１８）
項目１から１０のいずれかに記載の核酸構築物または項目１１もしくは１２に記載のベクターを細胞に導入するステップを含む、項目１３から１７のいずれかに記載の細胞を作製するための方法。
（項目１９）
一方のタンパク質のシグナルペプチドをコードする核酸配列を、他方のタンパク質のシグナルペプチドと比較して１つまたは複数の疎水性アミノ酸を除去または置き換えるために変異させるステップを含む、第２のタンパク質を伴って単一の核酸構築物から発現される第１のタンパク質の相対的な細胞表面発現を調節するための方法。

図１は、同じベクターから異なるタンパク質を発現するために利用される方法を示す図であり、（ａ）同じカセット内の２つの異なるプロモーターは、それぞれ別々のタンパク質をもたらす２つの異なる転写物を生じる。（ｂ）配列内リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）の使用は、２つの別々のタンパク質に翻訳される単一の転写物をもたらす。（ｃ）ＦＭＤＶ２Ａペプチドの使用は、迅速に２つの別々のタンパク質に切断される単一の転写物および単一のポリタンパク質を生じる。

図２は、タンパク質標的化におけるシグナル配列の機能を例示する模式図である。

図３は、２つのＣＡＲをコードする核酸構築物の模式図である。

図４は、置換されたシグナル配列の機能を検証する図である。ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５３４５２は、２つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（１つはＣＤ１９に対するおよびもう１つはＣＤ３３に対する）をコードするベクター系を記載している。本研究においてＣＡＲのために使用されたシグナルペプチドは、ヒトＣＤ８ａシグナル配列由来のシグナルペプチドであった。本研究の目的のために、これは、配列：（疎水性残基は太字で強調されている）を有するマウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域由来のシグナルペプチドで置換された。マウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩシグナル配列がヒトＣＤ８ａ由来のシグナル配列と同様に機能することを確立するために比較研究が実施された。両シグナル配列について、抗ＣＤ３３ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ＣＡＲの機能的発現が観察された。

図５は、マウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ中の１アミノ酸欠失の効果の検査を示す図である。変異体１カッパ鎖は、次の欠失（灰色で示す）をｈ領域中に有して作製され、抗ＣＤ３３ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ＣＡＲでの相対発現が観察された。

図６は、マウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ中の２アミノ酸欠失の効果の検査を示す図である。変異体２カッパ鎖は、次の欠失（灰色で示す）をｈ領域中に有して作製され、抗ＣＤ３３ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ＣＡＲでの相対発現が観察された。

図７は、マウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ中の３アミノ酸欠失の効果の検査を示す図である。変異体２カッパ鎖は、次の欠失（灰色で示す）をｈ領域中に有して作製され、抗ＣＤ３３ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ＣＡＲでの相対発現が観察された。

図８は、マウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ中の５アミノ酸欠失の効果の検査を示す図である。変異体２カッパ鎖は、次の欠失（灰色で示す）をｈ領域中に有して作製され、抗ＣＤ３３ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ＣＡＲでの相対発現が観察された。

本発明は、次の構造：
Ａ−Ｘ−Ｂ
を含む核酸構築物であって、
式中
Ａは、第１のシグナルペプチドを含む第１のポリペプチドをコードする核酸配列であり；Ｂは、第２のシグナルペプチドを含む第２のポリペプチドをコードする核酸配列であり、Ｘは切断部位をコードする核酸配列であり、
第１のシグナルペプチドまたは第２のシグナルペプチドが、より少ない疎水性アミノ酸を有するように１つまたは複数の変異（複数可）を含む、
核酸構築物を提供する。

核酸構築物
ポリペプチド
本発明の核酸構築物により作製されるポリペプチドは、分泌性タンパク質、膜貫通タンパク質または小器官タンパク質などのシグナルペプチド含有ポリペプチドである。

シグナルペプチド
本発明の核酸構築物によってコードされるポリペプチドＡおよびＢ（ならびに任意選択で他にＣ、Ｄなど）は、ポリペプチドが細胞内で発現される場合に新生タンパク質が小胞体（ＥＲ）へと方向付けられるように、それぞれシグナル配列を含んでよい（図２ａを参照されたい）。

用語「シグナルペプチド」は、「シグナル配列」と同義である。

シグナルペプチドは、短いペプチド、通常５〜３０アミノ酸長であり、分泌経路に向かうことになる大部分の新たに合成されたタンパク質のＮ末端に存在する。これらのタンパク質は、ある特定の小器官（例えば小胞体、ゴルジまたはエンドソーム）のいずれかの内側に存在するもの、細胞から分泌されるものおよび膜貫通タンパク質を含む。

シグナルペプチドは、単一のアルファヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチであるコア配列を通常含有する。シグナルペプチドは、トランスロケーションの際にポリペプチドの適切なトポロジーを強化することに役立つ正に荷電したアミノ酸の短いストレッチで始まる場合がある。シグナルペプチドの末端にシグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸のストレッチが典型的にはある。シグナルペプチダーゼは、トランスロケーションの際またはその完了後のいずれかで切断し、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成することができる。次いで遊離シグナルペプチドは、特異的プロテアーゼによって消化される。

シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に通常位置するが、一部のカルボキシ末端シグナルペプチドが公知である。

上述のとおり、シグナル配列は、ｎおよびｃ領域が隣接する疎水性コア領域（ｈ領域）からなる三要素構造を有する。後者は、シグナルペプチダーゼ（ＳＰａｓｅ）コンセンサス切断部位を含有する。通常、シグナル配列は翻訳と同時に切断され、生じた切断型シグナル配列はシグナルペプチドと称される。

配列：
を有するマウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域由来のシグナルペプチドでは、ｎ領域は配列
を有し；ｈ領域（太字で示されている）は配列
を有し；ｃ領域は配列
を有する。

本発明の核酸構築物では、２つ（またはそれを超える）ポリペプチドのシグナル配列はそれらのｈ領域において異なっている。一方の（より高い相対発現を有する）ポリペプチドは、他方の（より低い相対発現を有する）ポリペプチドよりもｈ領域中により多い数の疎水性アミノ酸を有する。より低い相対発現を有するポリペプチドのシグナルペプチドは、より低い相対発現を有するポリペプチドのシグナルペプチドよりも、ｈ領域中の疎水性アミノ酸の置換または欠失などの１つまたは複数のアミノ酸変異を含んでよい。

第１のシグナルペプチドおよび第２のシグナルペプチドは、実質的に同じｎおよびｃ領域を含んでよいが、上に説明のとおりｈ領域において異なり得る。「実質的に同じ」は、ｎおよびｃ領域が第１のシグナルペプチドと第２のシグナルペプチドとの間で同一であってよい、またはシグナルペプチドの機能に影響を与えることなくｎもしくはｃ鎖において１、２もしくは３アミノ酸だけ異なっていてよいことを示している。

コア中の疎水性アミノ酸は、例えば：アラニン（Ａ）；バリン（Ｖ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；メチオニン（Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐ）；チロシン（Ｙ）；またはトリプトファン（Ｗ）であってよい。

シグナルペプチド効率を変更するために変異される疎水性アミノ酸は、上記リスト、具体的には：バリン（Ｖ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；およびトリプトファン（Ｗ）のいずれであってもよい。

ｈ領域中の残基の内、一方のシグナルペプチド（例えば変更されたシグナルペプチド）は、他方のシグナルペプチド（例えば変更されていないシグナルペプチド）より少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％少ない疎水性アミノ酸を含んでよい。

ｈ領域が５〜１５アミノ酸を含む場合、一方のシグナルペプチドは、他方のシグナルペプチドより１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ多い疎水性アミノ酸を含んでよい。

変更されたシグナルペプチドは、疎水性アミノ酸の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸欠失または置換を含んでよい。疎水性アミノ酸は、親水性アミノ酸または中性アミノ酸などの非疎水性アミノ酸で置き換えられてよい。

シグナル配列は、ソフトウェア技術（例えば、http://www.predisi.de/を参照されたい）を使用して検出または予測され得る。

非常に多くのシグナル配列が公知であり、データベースで利用可能である。例えば、http://www.signalpeptide.deは、２１０９個の確認された哺乳動物のシグナルペプチドをそのデータベースに列挙している。

表１は、単に例示的目的のためにシグナル配列のリストを提供する。疎水性コアは太字で強調されている。これは、本発明の目的のために置換または除去されてよいアミノ酸の例を含んでいる。

変異されたシグナルペプチドは、それが由来する野生型シグナルペプチドよりも少ない疎水性アミノ酸を有するように、１つまたは複数の変異（複数可）を含む。用語「野生型」は、シグナルペプチドが由来する天然タンパク質に存在するシグナルペプチドの配列を意味する。例えば、実施例に記載のシグナルペプチドは、野生型配列：
を有するマウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域由来のシグナルペプチドである。

用語「野生型」は、ｎまたはｃ領域に１つまたは複数のアミノ酸変異を含む天然に存在するタンパク質に由来するシグナルペプチドも含む。例えば天然シグナルペプチドを、制限部位を導入するためにＮ末端を保存的アミノ酸置換で改変することは一般的である。そのような改変シグナルペプチド配列（ｈ領域にいかなる変異も含まない）は、本発明の目的のための「野生型」と考えられる。

本発明は、野生型配列を参照して規定できない合成シグナルペプチド配列にも関する。本実施形態では、一方のポリペプチドのシグナルペプチドは、他方のポリペプチドのシグナル配列よりも少ない疎水性アミノ酸を含む。２つのシグナル配列は、同じ合成シグナルペプチド配列に由来してよいが、コア領域中の疎水性アミノ酸の数は異なり得る。

膜貫通タンパク質
本発明は、膜貫通表面タンパク質の相対発現の調節を可能にする。膜貫通表面タンパク質は、細胞表面で発現されるタンパク質である。細胞表面で発現される場合、膜貫通タンパク質の少なくとも１つのドメインは外細胞質（exoplasmic）（すなわち細胞の外部）にある。

膜貫通タンパク質は、１回貫通型膜貫通タンパク質であってよい、すなわち単一の膜貫通ドメインを含んでよい、または複数の膜貫通ドメインを含んでよい。

膜貫通タンパク質は、トポロジーによって、すなわちＮおよびＣ末端ドメインの位置に関して分類できる。Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型膜貫通タンパク質が１回貫通型分子である一方で、ＩＶ型膜貫通タンパク質は複数回貫通型分子である。Ｉ型膜貫通タンパク質は輸送停止アンカー(stop-transfer anchor)配列で脂質膜に係留され、それらのＮ末端ドメインを合成の際にＥＲ内腔（および細胞外空間、成熟形態が細胞膜に位置する場合）へと標的化する。ＩＩおよびＩＩＩ型はシグナルアンカー配列で係留され、ＩＩ型はＣ末端ドメインでＥＲ内腔へと標的化され、一方ＩＩＩ型はそれらのＮ末端ドメインがＥＲ内腔へと標的化されている。ＩＶ型はＩＶ−Ａにさらに分類され、それらのＮ末端ドメインはサイトゾルへと標的化され、ＩＶ−Ｂは内腔へと標的化されたＮ末端ドメインを有する。

本発明の核酸構築物によって作製された本発明の膜貫通タンパク質（複数可）は、Ｉ〜ＩＶ型のいずれかであってよい。

膜貫通ドメインは、膜で熱力学的に安定である任意のタンパク質構造であってよい。これは、典型的にはいくつかの疎水性残基からなるアルファヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインは、膜貫通部分を供給するために使用されてよい。タンパク質の膜貫通ドメインの存在および長さはＴＭＨＭＭアルゴリズム（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）を使用して当業者によって決定され得る。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的単純な構造、すなわち膜に及ぶ十分な長さの疎水性アルファヘリックスを形成すると予測されるポリペプチド配列であることを考慮すると、人工的に設計されたＴＭドメインも使用されてよい（ＵＳ７０５２９０６Ｂ１は合成膜貫通構成成分を記載している）。

膜貫通ドメインは、ＣＤ２８由来であってよく、良好な安定性をもたらす。

Ｉ型膜貫通タンパク質の構造およびプロセシングは、当技術分野において周知である。そのようなタンパク質は、典型的には細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内エンドドメインを含み、細胞膜を通る単一のα−ヘリックスを有する１回貫通型分子である。

Ｉ型膜貫通タンパク質は小胞体（ＥＲ）によって迅速に認識されるシグナルペプチドを典型的には有し、したがって翻訳中のタンパク質は迅速にＥＲへと再方向付けされる。疎水性ヘリックスは、タンパク質をＥＲの膜にロックし、次いで係留する。

上述のとおりＩ型膜貫通タンパク質は、脂質膜に輸送停止アンカー配列で係留されている。輸送停止配列は、ポリペプチドのさらなるトランスロケーションを停止し、膜貫通アンカーとして作用する。

本明細書において使用される用語Ｉ型膜貫通タンパク質は、Ｉ型膜貫通ドメインおよび輸送停止アンカー配列を含み、外因性細胞内保持シグナルの非存在下で細胞表面で発現されるように標的化されている任意のタンパク質を包含する。

本発明における使用のために好適である種々の１型膜貫通タンパク質は、当技術分野において公知である。そのようなタンパク質として、これだけに限らないが抑制受容体、刺激受容体、サイトカイン受容体およびＧタンパク質が挙げられる。

膜貫通タンパク質（複数可）は、Ｔ細胞受容体αまたはβ鎖であってよい。

膜貫通タンパク質（複数可）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってよい。

ＣＡＲは、抗原結合ドメインをＴ細胞のエフェクター機能に移植するタンパク質である。それらの通常形態は、Ｔ細胞生存および活性化シグナルを伝達する複合エンドドメインにすべて接続されている抗原認識アミノ末端、スペーサー、膜貫通ドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質のものである。

抗原結合ドメインは、抗体もしくは抗体模倣物から誘導されてよく、またはリガンドなど抗原に特異的に結合する別の実体であってよい。

これらの分子の最も一般的な形態は、標的抗原を認識するモノクローナル抗体から誘導され、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインに融合されている１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体である。そのような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞の活性化を生じる。Ｔ細胞がそのようなＣＡＲを発現する場合、それらは標的抗原を発現している標的細胞を認識し、死滅させる。いくつかのＣＡＲが腫瘍関連抗原に対して開発されており、そのようなＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用する養子移入手法が種々のがんの処置のために現在臨床試験中である。

シグナル伝達エンドドメインが別の分子上に存在することも可能である。本発明と関連して用語「ＣＡＲ」は、膜貫通ドメインに接続された抗原結合ドメインを含む分子も包含する。そのようなＣＡＲは、Ｔ細胞活性化を刺激するように別個の細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用できる。

本発明では核酸配列ＡまたはＢのいずれかは、シグナルぺプチドを含む膜貫通タンパク質をコードする核酸配列であってよい。

目的の大部分の膜貫通タンパク質は、細胞膜においてのみ活性である、または細胞膜で主に活性である。したがって非効率的なシグナルペプチドの使用は、細胞表面でのタンパク質の相対発現を低減し、それによりタンパク質の相対活性を低減する。

ポリタンパク質
本発明の核酸構築物は、第１のおよび第２のポリペプチドを含むポリタンパク質をコードしてよい。

第１のおよび第２のポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってよい。

実施例に記載される核酸構築物は、種々の構成要素をそれらが列挙されている順に含む次のポリタンパク質をコードしている：
マウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域由来シグナルペプチド：
（下を参照されたい）
ｓｃＦｖａＣＤ１９：
リンカー：
ヒトＣＤ８ａＳＴＫ：
ヒトＣＤ２８ＴＭ：
ヒトＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン：
２Ａペプチド：
マウスＩｇカッパ由来シグナルペプチド：
ｓｃＦｖａＣＤ３３：
リンカー：
ＦｃＲｇ会合を妨げる変異を有するヒトＩｇＧ１由来のヒンジおよびＦｃ（ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ）：
リンカー：
ヒトＣＤ１４８ＴＭ：
ヒトＣＤ１４８細胞内ドメイン：

配列：
（疎水性残基は太字で強調されている）を有するマウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域由来のシグナル配列は、実施例に記載のとおり変更される。疎水性残基は、抗ＣＤ１９ＣＡＲの発現レベルを低減するために疎水性コアから逐次的に欠失された。

切断部位
本発明の第１の態様の核酸構築物は、第１のおよび第２のポリペプチドが別々の実体として発現され得るように、第１のおよび第２のポリペプチドをコードする核酸配列の間に位置する切断部位をコードする配列を含む。

切断部位は、第１のおよび第２のポリペプチドを含むポリペプチドが分離され得るようにする任意の配列であってよい。

用語「切断」は本明細書において便宜的に使用されるが、切断部位は古典的切断以外の機序によって第１のおよび第２のポリペプチドを個々の実体に分離させることができる。例えば口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（下記を参照されたい）について、種々のモデルが、「切断」活性：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解（autoproteolysis）または翻訳効果の原因を説明するために提案されている（Donnellyら（２００１年）J. Gen. Virol. ８２巻：１０２７〜１０４１頁）。そのような「切断」の正確な機序は、切断部位が第１のおよび第２のポリペプチドをコードする核酸配列間に位置する場合に、第１のおよび第２のポリペプチドが別々の実体として発現されるようにする限り、本発明の目的のために重要ではない。

切断部位はフューリン切断部位であってよい。

フューリンは、サブチリシン様プロプロテインコンバターゼファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在型前駆体タンパク質をそれらの生物学的に活性な産生物にプロセシングするプロプロテインコンバターゼである。フューリンは、対合した塩基性アミノ酸プロセシング部位で前駆体タンパク質を効率的に切断できるカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。フューリン基質の例として、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング増殖因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロベータセクレターゼ、膜１型マトリクスメタロプロテイナーゼ、プロ神経増殖因子のベータサブユニットおよびフォン・ビルブランド因子が挙げられる。フューリンは、塩基性アミノ酸標的配列のすぐ下流（標準的には、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ’）でタンパク質を切断し、ゴルジ装置で豊富である。

切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であってよい。

ＴＥＶプロテアーゼは、キモトリプシン様プロテアーゼである高度に配列特異的なシステインプロテアーゼである。その標的切断部位に非常に特異的であり、したがって融合タンパク質の制御された切断のためにｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの両方で頻繁に使用される。コンセンサスＴＥＶ切断部位は、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓ（式中「＼」は切断されるペプチド結合を示す）である。ヒト細胞などの哺乳動物細胞は、ＴＥＶプロテアーゼを発現しない。したがって本核酸構築物がＴＥＶ切断部位を含み、哺乳動物細胞において発現される実施形態では、外因性ＴＥＶプロテアーゼも哺乳動物細胞において発現されなければならない。

切断部位は、自己切断ペプチドをコードしてよい。

「自己切断ペプチド」は、第１のおよび第２のポリペプチドを含むポリペプチドおよび自己切断ペプチドが産生されると、それがいかなる外部の切断活性も必要とすることなく別個の分離した第１のおよび第２のポリペプチドに直ちに「切断される」または分離されるように機能するペプチドを指す。

自己切断ペプチドは、アフトまたはカルジオウイルス由来２Ａ自己切断ペプチドであってよい。アフト（aptho）およびカルジオウイルスの主な２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端での２Ａ「切断」によって媒介される。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなどのアフトウイルスでは、２Ａ領域は、約１８アミノ酸の短いセクションであり、これは、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存プロリン残基）と共にそれ自体のＣ末端での「切断」を媒介できる自律的エレメントを表す。

長いカルジオウイルスタンパク質のＣ末端１９アミノ酸は、２ＢのＮ末端プロリンと共に、アフトウイルスＦＭＤＶ２ａ配列とほぼ等しい効率で「切断」を媒介する。カルジオウイルスは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）およびタイラーマウス脳炎ウイルス（ＴＭＥＶ）を含む。

ＥＭＣＶおよびＦＭＤＶ２Ａの変異解析は、モチーフＤｘＥｘＮＰＧＰが「切断」活性に本質的に関与していることを明らかにした（Donellyら（２００１年）上記）。

本発明の切断部位は、アミノ酸配列：
Ｄｘ_１Ｅｘ_２ＮＰＧＰ、を含んでよく、式中ｘ_１およびｘ_２は任意のアミノ酸である。Ｘ_１は次の群：Ｉ、Ｖ、ＭおよびＳから選択されてよい。Ｘ_２は次の群：Ｔ、Ｍ、Ｓ、Ｌ、Ｅ、ＱおよびＦから選択されてよい。

例えば切断部位は、表２に示すアミノ酸配列の１つを含んでよい。

２Ａ配列に基づく切断部位は、例えば長さ１５〜２２アミノ酸であってよい。配列は、２Ａタンパク質のＣ末端を含んでよく、プロリン残基（２ＢのＮ末端プロリンに相当する）が続く。

変異研究は、天然に存在する２Ａ配列に加えて一部の改変体も活性であることを示した。切断部位は、１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を有し、２つまたはそれを超える別々のタンパク質へのポリタンパク質配列の「切断」を誘導する能力を保持している、天然に存在する２Ａポリペプチド由来の改変体配列に相当する場合がある。

切断配列は、全てある程度活性であることが示されている次のものから選択されてよい（Donnellyら（２００１年）上記）：

ＤｘＥｘＮＰＧＰの配列に基づいて「モチーフ、「２Ａ様」配列は、アフトまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルスならびにトリパノソーマ種および細菌性配列内の反復配列において見出された（Donnellyら（２００１年）上記）。切断部位は：
などのこれらの２Ａ様配列の１つを含んでよい。

切断部位は、
として示す２Ａ様配列を含んでよい。

５から３９アミノ酸の間のＮ末端「伸長」を含むことが活性を増加させることができることが示された（Donnellyら（２００１年）上記）。具体的には切断配列は、次の配列の１つ、または例えば切断部位活性を保持して５つまでのアミノ酸変更を有するその改変体を含んでよい：

調整能力（ｔｕｎａｂｉｌｉｔｙ）
１つまたは複数のタンパク質（複数可）の相対発現は、異なる量または割合の疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドを使用することによる本発明の方法を使用して微細に調整され得る。

異なるシグナルペプチドを使用する調整能力は、それぞれそれら自体の相対発現を有する複数のタンパク質の発現を、検討する場合に特に有用である。例えば、次の構造：
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
を有する核酸構築物であって、
式中
Ａ、ＢおよびＣはポリペプチドをコードする核酸配列であり、ならびに
ＸおよびＹは切断部位をコードする核酸配列である
核酸構築物を検討されたい。

核酸構築物は、３つのタンパク質Ａ、ＢおよびＣをコードし、そのいずれかまたはすべては膜貫通タンパク質であってよい。Ａ、ＢおよびＣについて相対レベルがＡ＞Ｂ＞Ｃであるように発現されることが望ましい場合、核酸配列Ａは最も多く疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドを有してよく、核酸配列Ｂは中程度の量の疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドを有してよく、核酸配列Ｃは最も少なく疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドを有してよい。

ベクター
本発明は、本発明の第一の態様による核酸構築物を含むベクターも提供する。

そのようなベクターは、第１のおよび第２のポリペプチドを発現するように宿主細胞に核酸構築物を導入するために使用されてよい。

ベクターは、例えばプラスミド、またはレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、またはトランスポゾンに基づくベクター、または合成ｍＲＮＡであってよい。

ベクターは、哺乳動物細胞、例えばＴ細胞をトランスフェクトまたは形質導入することが可能であり得る。

細胞
本発明は、本発明の核酸構築物またはベクターを含む細胞であって、核酸配列によってコードされている第１のおよび第２のポリペプチドを発現する細胞をさらに提供する。

細胞は、免疫細胞などの、細胞表面に膜貫通タンパク質を発現できる任意の真核細胞であってよい。

細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞などの細胞溶解性免疫細胞であってよい。

方法
さらなる態様では、本発明は、本発明の核酸構築物またはベクターを細胞に導入するステップを含む本発明による細胞を作製するための方法を提供する。

核酸構築物は、形質導入またはトランスフェクションによって導入されてよい。

細胞は、被験体から単離された細胞、例えば被験体から単離されたＴ細胞またはＮＫ細胞であってよい。

本発明は、一方のタンパク質のシグナルペプチドをコードする核酸配列を、他方のタンパク質のシグナルペプチドと比較して１つまたは複数の疎水性アミノ酸を除去または置き換えるために変異させるステップを含む、第２のタンパク質を伴って単一の核酸構築物から発現される第１のタンパク質の相対的な細胞表面発現を調節するための方法も提供する。

シグナルペプチドは、部位特異的変異誘発および組換え技術などの当技術分野において公知の技術によって変更されてよい。

本発明は、本発明を実施する当業者を支援するように役立つことが目的とされ、本発明の範囲を限定することをいかなる方法でも意図しない実施例の方法によってここにさらに記載される。

（実施例１−マウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩシグナル配列の使用）
ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５３４５２は、１つはＣＤ１９に対するおよびもう１つはＣＤ３３に対する２つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするベクター系を記載している。研究においてＣＡＲに対して使用されたシグナルペプチドは、ヒトＣＤ８ａシグナル配列由来シグナルペプチドであった。本研究の目的のために、これを、配列：
（疎水性残基は太字で強調されている）を有するマウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域由来のシグナルペプチドで置換した。マウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩシグナル配列がヒトＣＤ８ａ由来のシグナル配列と同様に機能したことを確立するために、比較研究を実施した。両シグナル配列について、抗ＣＤ３３ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ＣＡＲの機能性発現が観察された。この置換されたシグナル配列およびそのすべての続く変異を２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクション３日後、２９３Ｔ細胞をウサギＦｃ鎖に融合した可溶性キメラＣＤ１９およびマウスＦｃ鎖に融合した可溶性キメラＣＤ３３の両方で染色した。次いですべての細胞を抗ウサギＦｃ−ＦＩＴＣおよび抗マウスＦｃ−ＡＰＣで染色した。フローサイトメトリープロットは、置換されたシグナル配列を非トランスフェクト（ＮＴ）およびＣｄ８シグナル配列を含む構築物と比較して示している（図４）。マウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩシグナル配列は、ヒトＣＤ８ａ由来シグナル配列と同様に機能することが見出された。

（実施例２−シグナルペプチド中の疎水性残基を欠失させることによる相対発現の変更）
疎水性残基は段階的様式で欠失され、抗ＣＤ３３ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ＣＡＲの相対発現への効果を観察した。１つ、２つ、３つおよび４つのアミノ酸欠失の影響を調査し、結果を図５から８にそれぞれ示す。

すべての変異体構築物は、抗ＣＤ３３ＣＡＲと比較して抗ＣＤ１９ＣＡＲの相対発現において減少を示した。抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現の相対的減少は、アミノ酸欠失の数が１個から３個と大きくなるほど大きかったが、その後プラトーになった（欠失４個は発現において欠失３個と同様の減少であった）。

したがって、２つのポリペプチドをコードする核酸構築物中のシグナル配列の改変は、２つのポリペプチドの相対発現を制御するために使用できる。

上記明細書に述べるすべての刊行物は、本明細書に参照により組み込まれる。本発明の記載の方法および系の種々の改変および変法は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は具体的な好ましい実施形態と関連して記載されているが、特許請求される本発明がそのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことは理解されるべきである。実際に、本発明を実行するために記載された様式の種々の改変は、分子生物学、細胞生物学または関連する分野の当業者に明らかであり、続く特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。

Claims

本願明細書に記載の発明。