ES2869302T3 - Herramienta de diagnóstico para determinar el borramiento del proceso del pie de los podocitos - Google Patents
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Abstract
Un procedimientode diagnóstico o prediagnóstico de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de a) determinar la longitud del diafragma de hendidura (ISD) formada por los procesos del pie de los podocitos en un área específica A en una muestra de tejido renal de dicho individuo mediante microscopía óptica de superresolución, en el que el área específica A es un área en el cual los glomérulos son visibles con un vista de planta el proceso del pie de los podocitos; b) comparar la longitud del diafragma de hendidura (ISD) formado por los procesos del pie de los podocitos en un área específica A como se determina en la etapa (a) con la longitud del diafragma de hendidura (ISD) formada por los procesos del pie de los podocitos en un área específica comparable A'en una muestra de tejido renal de un individuo que en el momento de la toma de muestras no mostraba síntomas clínicos de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos, en el que una desviación indica una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos.
Description
DESCRIPCIÓN
Herramienta de diagnóstico para determinar el borramiento del proceso del pie de los podocitos La presente invención se refiere a un procedimientode diagnóstico o prediagnósticode una enfermedad asociada con el procesamiento de borramiento del pie de los podocitos en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de (a) determinar la longitud del diafragma de hendidura (ISD) formada por procesos del pie de los podocitos en un área específica A en una muestra de tejido renal de dicho individuo mediante microscopía de luz de superresolución; (b) comparar la longitud del diafragma de hendidura (ISD) formada por los procesos del pie de los podocitos en un área específica A como se determina en la etapa (a) con la longitud del diafragma de hendidura (Isd) formada por los procesos del pie de los podocitos en un área específica comparable A' en una muestra de tejido renal de un individuo que en el momento del muestreo no mostraba síntomas clínicos de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos, en el que una desviación indica una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos. El alcance de la invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
Durante décadas, el estándar de oro para la evaluación patológica de la enfermedad renal ha sido la evaluación con microscopio óptico y electrónico de biopsias renales teñidas. La investigación histopatológica rápida y el diagnóstico de estas biopsias seccionadas es unaetapa crucial parael siguiente tratamiento, especialmente de enfermedades nefróticas tal como enfermedad de cambios mínimos (MCD), nefropatía diabética y glomeruloesclerosis focal y segmentaria (FSGS). En el caso de la MCD, la evaluación histopatológica de rutina clásica (H&E, PAS, Silverstain, Trichrome) y la inmunohistología (IgG, IgM, IgA, C3) no conducen al diagnóstico, dado que la única característica patológica importante que se puede encontrar es el borramiento de los procesos del pie de los podocitos1.Por lo tanto, se requiere una preparación y evaluación con microscopio electrónico de transmisión (TEM) que requiere mucho tiempo. El borramiento del proceso del pie de los podocitos es característico de las glomerulopatías, por ejemplo, de las enfermedades renales proteinúricas. Las glomerulopatías son un conjunto de enfermedades que afectanlos glomérulos de la nefrona, que es la unidad estructural y funcional básica del riñón.
Según lo descrito porErnst Abbe, el límite de resolución determinado físicamente de la microscopía óptica es de aproximadamente 200 nm en la dirección xy- e incluso mayor en la dirección z. Últimamente, se ha desarrollado con éxito una variedad creciente de técnicas de microscopía de superresolución (SR) como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), la microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED) y la microscopía de iluminación estructurada (SIM) para superar este límite de resolución2.
En 2013, Suleiman y sus colegas presentaron por primera vez la microscopía SR a la comunidad de investigación renal con un estudio STORM sobre la distribución de proteínas dentro de la membrana basal glomerular humana y murina3. En 2016, Unnersjo-Jess y sus colegas mostraron un enfoque STED para visualizar el diafragma de hendidura (SD) en tejido renal depurado ópticamente4 Indudablemente, STORM y STED ofrecen oportunidades interesantes y una alta resolución, pero desafortunadamente, el inconveniente de estas técnicas es su exigente preparación de muestras (limpieza de tejidos, fluoróforos especiales y tampones de imágenes especiales) y adquisición de imágenes. Por tanto, es difícil imaginar que estas técnicas se conviertan en parte de los diagnósticos de rutina.
Los microscopios actualmente disponibles comercialmente con SIM superan el límite de resolución óptica de Abbe al menos en dos veces en las tres direcciones, lo que da como resultado un aumento de aproximadamente 10 veces en la resolución de vóxeles5,6. SIM funciona mediante la iluminación secuencial de una muestra a través de una rejilla definida. En las diferentes etapas de iluminación, la rejilla se desplaza y gira, de modo que el patrón de iluminación de la rejilla interfiere con el patrón original de la muestra creando los llamados patrones de Moire. En una segundaetapa, estos patrones mixtos de frecuencia se demodulan mediante la reconstrucción digital del conjunto de datos que conduce a una resolución espacial mejorada. A diferencia de otras técnicas de SR como STED y STORM, SIM funciona con fluoróforos y procedimientos de etiquetado estándar, lo que la vuelve una excitante nueva herramienta sin necesidad de establecimiento de nuevos protocolos, y es por lo tanto un sistema listo para uso. Para los científicos que se centran en la biología glomerular, SIM es una herramienta muy tentadora dado que los procesos del pie de los podocitos (FP) tienen un ancho de aproximadamente 200 nm subdividido por un diafragma de hendidura (SD) de aproximadamente 30 nm. Por lo tanto, estas estructuras no pueden obtenerse mediante microscopía óptica convencional y solo se utiliza la evaluación ultraestructural mediante microscopía electrónica para cuantificar los cambios en el nivel de los procesos del pie.7,8
Los podocitos son células en la cápsula de Bowman de la nefrona. Los procesos del pie de los podocitos (también denominados proyecciones del pie de los podocitos, o pedicelos de los podocitos) envuelven los capilares del glomérulo y dejan hendiduras entre estos. La sangre se filtra a través de estas hendiduras, cada una conocida como hendidura de filtración rodeada por el diafragma de hendidura. Una proteína similar a una cremallera que forma el diafragma de hendidura es la nefrina, en la que hay espacios entre los dientes de la cremallera, lo suficientemente grandes para permitir el paso del azúcar y el agua, pero demasiado pequeños para permitir el paso de las proteínas. Los podocitos responden al estrés y las lesiones sufriendo enormes cambios de forma. El borramiento del proceso del pie es el más prominente y, sin embargo, de alguna manera, el más enigmático de esos cambios. Se sabe desde
hace mucho tiempo que el ancho de los procesos del pie del podocito borrado (dpp) se correlaciona inversamente con la función renal en glomerulopatías, por ejemplo, enfermedades renales proteinúricas.
Desde el descubrimiento de las diferentes proteínas que componen el diafragma de hendidura (p. Ej., Nefrina, NEpH1, podocina) y el posterior desarrollo de anticuerpos específicos, se ha intentado utilizarlas como marcadores diagnósticos de enfermedades glomerulares9-12 Se ha descubierto que el marcador diagnostica o subdivide enfermedades nefróticas. Últimamente, se ha demostrado que SIM puede resolver la SD utilizando un etiquetado específico de podocina13. Sin embargo, el diagnóstico convencional de borramiento de Fp de podocitos todavía se realiza mediante TEM, que es un procedimiento que requiere mucho tiempo.
por tanto, el problema técnico subyacente a la presente invención fue la provisión de un nuevo procedimientode diagnóstico o prediagnóstico de glomerulopatías, es decir, enfermedades asociadas con el borramiento del proceso del pie de los podocitos, lo que permite un diagnóstico más rápido, es decir, que requiere menos tiempo que el procedimiento TEM convencional.
Inesperadamente, se ha descubierto que la longitud del diafragma de hendidura (ISD) formada por los procesos del pie de los podocitos se puede utilizar para el diagnóstico borramiento de procesos delpie de los podocitos.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a un procedimientode diagnóstico o prediagnóstico de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de
a) determinar la longitud del diafragma de hendidura (ISD) formada por los procesos del pie de los podocitos en un área específica A en una muestra de tejido renal de dicho individuo mediante microscopía óptica de superresolución;
b) comparar la longitud del diafragma de hendidura (Isd) formada por los procesos del pie de los podocitos en un área específica A como se determina en la etapa (a) con la longitud del diafragma de hendidura (Isd) formada por los procesos del pie de los podocitos en un área específica comparable A' en una muestra de tejido renal de un individuo que en el momento del muestreo no mostraba síntomas clínicos de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos (individuo sano), en el que una desviación indica una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos. Inesperadamente se ha descubierto que la longitud del diafragma de hendidura (Isd) se cambia, especialmente se reduce, en individuos que tienen borramiento del proceso del pie de los podocitos. En el borramiento del proceso del pie del podocito, la interdigitación de los procesos del pie del podocito disminuye ya que los procesos del pie del podocito se retraen, lo que, además de un cambio en el ancho del proceso del pie del podocito, también da como resultado un cambio en la forma de la SD, que es menos serpenteante y, por lo tanto, más corta. Por lo tanto, la longitud del diafragma de hendidura (Isd) es un indicador de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos.
La expresión "diafragma de hendidura" comprende áreas en las que los procesos del pie del podocito tienen el contacto normal de célula a célula de un diafragma de hendidura. Sin embargo, la expresión, especialmente en el caso de enfermedades asociadas con el borramiento del pie de los podocitos, también abarca áreas en las que elcontacto de célula a célula de los procesos del pie delos podocitos se altera y están en contacto a través de otras conexiones, por ejemplo, uniones estrechas, uniones de adherencia o uniones gap.
De acuerdo con (b), la longitud del diafragma de hendidura(IsD) en un área específica A determinada en (a) se puede comparar con la longitud del diafragma de hendidura (Isd) formada por los procesos del pie de los podocitos en un área específica comparable A' en una muestra de tejido renal de un individuo sano. La longitud del diafragma de hendidura (Isd) de un individuo sano utilizada en (b) también puede ser un valor de referencia de la literatura (si se conoce).
Una muestra de tejido renal se usa preferentemente en forma de sección histopatológica, más preferentemente en forma de sección histopatológica seleccionada del grupo que consiste en sección de parafina, sección congelada, sección incrustada de polímero, por ejemplo, LR blanco, y sección semifina, más preferentemente se utilizan secciones de parafina histopatológicas. Directamente después de las biopsias o antes o directamente después de la extracción del riñón, la muestra de tejido renal se fija preferentemente en un medio de fijación adecuado que comprende un agente de fijación, más preferentemente una solución de fijación que comprende un agente de fijación, para obtener una muestra de tejido renal fijado y mantener el tejido lo menos afectado posible. La fijación se realiza mediante fijación por perfusión o fijación por inmersión. El agente de fijación se selecciona preferentemente del grupo que consiste en alcohol, acetona, formaldehído y combinaciones de dos o más de los mismos. Más preferentemente, el agente de fijación comprende formaldehído. La solución de fijación comprende preferentemente el agente de fijación y un disolvente adecuado, preferentemente agua. A continuación, la muestra de tejido renal, preferentemente fijada, se incrusta, por ejemplo, en parafina y se corta en secciones adecuadas. Opcionalmente, la muestra de tejido renal, preferentemente fijada, se vuelve transparente mediante la limpieza del tejido, preferentemente mediante el uso de hidrogeles a base de acrilamida (CLARITY) o disolventes orgánicos, por ejemplo, tetrahidrofurano, diclorometano, dibencil éter (3DISCO, iDISCO). La limpieza del tejido se puede realizar
antes o después de la inmunotinción.
"Área específica A" significa preferentemente un área en la que los glomérulos son visibles con una vista en planta en FP. En otras palabras, dentro del área específica, el capilar del glomérulo debe cortarse dentro del plano de las apófisis podocitos del pie, de modo que la trayectoria de la hendidura de filtración sea visible (sección horizontal). "Área comparable A' " significa un área que tiene el mismo tamaño y la misma orientación que la descrita anteriormente para el área específica A, es decir, dentro del área comparable A', el capilar del glomérulo también debe cortarse dentro del plano de las apófisis podocitos del pie, de modo que la trayectoria de la hendidura de filtración sea visible (sección horizontal).
De acuerdo con una realización preferente, se calculó la densidad SD, que se define como la longitud de la SD por área capilar (ISD/A). Inesperadamente, se ha descubierto que el cálculo de la densidad de SD puede mejorar y simplificar el procedimiento de diagnóstico del borramiento de FP de los podocitos. Por tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se describe anteriormente, en el que (a) comprende
a.1) determinar la longitud del diafragma de hendidura (ISD) formado por los procesos del pie de los podocitos en un área específica A en una muestra de tejido renal de dicho individuo mediante microscopía óptica de superresolución;
a.2) formar la densidad del diafragma de hendidura ISD/A mediante la división de la longitud del diafragma de hendidura (Isd) determinada en (a.1) por el área específica (A); y
b) comparar la densidad del diafragma de hendidura Isd/A determinada en la etapa (a.2) con la densidad del diafragma de hendidura Isd/A obtenida en una muestra de tejido renal de un individuo que en el momento del muestreo no presentaba síntomas clínicos de una enfermedad asociada con borramiento del proceso del pie del podocito (individuo sano), en el que una desviación indica una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie del podocito.
La densidad del diafragma de hendidura Isd/A de un individuo sano utilizada en (b) comprende también un valor de referencia dedensidad del diafragma de hendidura Isd/A obtenida de más de una muestra de tejido renal y/o de más de un individuo que en el momento del muestreo no mostraba síntomas clínicos de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos. El valor de referencia representa el valor de media de estos datos. La densidad del diafragma de hendidura Isd/A de un individuo sano usada en (b) también puede ser un valor de referencia de la literatura (si se conoce).
De acuerdo con una realización preferente, la muestra de tejido renal está inmunoteñida, preferentemente con un sistema de tinción inmune que comprende
i) al menos una molécula de unión dirigida contra una proteína seleccionada del grupo que consiste en proteínas de diafragma de hendidura, proteínas que interactúan con el diafragma de hendidura y proteínas de contacto con células de podocitos, preferentemente seleccionado del grupo formado por nefrina, NEPH1, podocina, ZO-1, FAT-1, Claudin-5, CD2AP, FYN, Nck1, Nck2, CRIM1, IQGAP1, MAGI-2, MYO1C, MYO1E, TRPC6, ApoL1, NOTCH, Par3, Par6, Dinamina, Clatrina, B-arrestina, PKC, Grb2, canales activados por Ca2+ (BK) y P-Cadherina, más preferentemente seleccionas del grupo que consiste en nefrina, NEPH1, podocina, ZO-1, FAT-1, Claudin-5, más preferentemente nefrina.
ii) al menos un tinte de fluorescencia, preferentemente al menos un tinte de fluorescencia excitable por luz en el intervalo de 400 a 800 nm, más preferentemente un tinte de cianina, más preferentemente un tinte de cianina seleccionado del grupo que consiste en Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 y Cy7.5, más preferentemente Cy3.
La molécula de unión de acuerdo con i) se selecciona del grupo que consiste en proteínas y ácidos nucleicos, preferentemente del grupo que consiste en anticuerpo, aptámero, peptímero y nanocuerpo (anticuerpo de dominio único), más preferentemente anticuerpo.
Como se mencionó anteriormente, una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos es una enfermedad del grupo de glomerulopatías, preferentemente seleccionadas del grupo que consiste en nefropatía diabética, glomeruloesclerosis focal segmentaria, glomerulonefritis membranosa/nefropatía membranosa y enfermedad de cambios mínimos.
De acuerdo con las etapas (a), (b) y (a.1), (a.2), (b) respectivamente, la longitud del diafragma de hendidura (Isd) formada por procesos del pie de los podocitos se determina mediante microscopía óptica de superresolución, en la que "superresolución" significa un límite de resolución por debajo de 200 nm en la dirección xy. Preferentemente, la microscopía de luz de superresolución se selecciona de todas las técnicas de microscopía de súper resolución, y es más preferentemente microscopía de iluminación estructurada.
De acuerdo con (b), una desviación en la comparación de los resultados de (a) y (b) indica una enfermedad asociadacon el borramiento del proceso del pie de los podocitos. Preferentemente, la desviación de acuerdo con (b)
es una disminución de la longitud del diafragma de hendidura (Isd) como se determina en (a) en comparación con la longitud del diafragma de hendidura (Isd) de un individuo que en el momento del muestreo mostró ningún síntoma clínico de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos o de la densidad del diafragma de hendidura Isd/A formada en (a.2) en comparación con la densidad del diafragma de hendidura Isd/A de un individuo que en el momento de la toma de muestras no mostrabasíntomas clínicos de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos.
Como se describió anteriormente, la determinación del ancho de los procesos del pie de los podocitos es un indicador del borramiento de los podocitos. Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferente, el procedimiento descrito anteriormente comprende además
c) determinar la anchura de los procesos del pie de los podocitos en un área específica A en una muestra de tejido renal de dicho individuo mediante microscopía óptica de superresolución;
d) comparar el ancho de los procesos del pie de los podocitos en un área específica A como se determinó en la etapa c) con el ancho de los procesos del pie de los podocitos en un área específica comparable A' en una muestra de tejido renal de un individuo que en el momento de la toma de muestras no mostrabasíntomas clínicos de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos,
en el que una desviación determinada en (b) y/o (d), preferentemente una desviación en (b) y (d), indica una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos.
Como se mencionó anteriormente, una "desviación" determinada en (b) significa preferentemente una disminución. Por el contrario, una "desviación" con respecto alaetapa (d) significa un aumento, es decir, un aumento de la anchura de los procesos del pie de los podocitos.
El ancho de los procesos del pie de los podocitos se determina mediante un procedimiento estandarizado en el que se midió la distancia de pico a pico de la SD en ambos lados del FP en la mitad de la longitud de cada FP.
El individuo, cuya muestra de tejido renal se analiza, es un mamífero, preferentemente seleccionado del grupo de ser humano, ratón, conejo y rata, más preferentemente ser humano y ratón, más preferentemente ser humano. El procedimiento es un procedimientoin vitro, es decir, la muestra de tejido renal se analiza in vitro y la longitud del diafragma de hendidura (Isd) formada por los procesos del pie de los podocitos en un área específica A en la muestra de tejido renal y la densidad del diafragma de hendidura Isd/A, respectivamente, se determinan in vitro. La invención representa un nuevo procedimientode diagnóstico o prediagnóstico de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos en un individuo que usa muestras rutinarias de tejido renal de un individuo, por ejemplo, cortes histopatológicos de parafina, tinción por inmunofluorescencia, evaluación rápida por microscopía de luz de superresolución, preferentemente por SIM, y preferentemente automatizado, análisis de los resultados y determinación del borramiento de FP.
La invención se describe a continuación con más detalle, en la que la MCD se ha utilizado como una glomerulopatía ejemplar, es decir, una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos.
En primer lugar, las muestras de tejido renal, en este caso cortes histopatológicos de parafina, que eran excedentes de la histología patológica de rutina, se procesaron mediante tinción con PAS para la investigación histológica clásica o mediante tinción con un anticuerpo específico contra la proteína nefrina SD, detectada por un anticuerpo secundario conjugado con Cy3.
Tabla 1: valores de dFPde pacientes con MCD eindividuos sanos (control)
_ ____________________________
Las secciones teñidas con PAS no revelaron mayores diferencias entre las biopsias provenientes de pacientes sanos en comparación con las biopsias de individuos diagnosticados con MCD (Figura 1). Algunas biopsias de MCD mostraron una ligera dilatación de los túbulos proximales (Figura 1a-b) y disminución de la tinción del borde cepillado
de las células del túbulo proximal compatible con daño tubular de bajo grado. Todas estas características, bastante inespecíficas, se encuentran comúnmente en biopsias que se diagnostican para MCD1.
Las micrografías de barrido láser confocal de las secciones de riñón sanas teñidas con nefrina mostraron un patrón de tinción lineal clásico para la nefrina (Figura 1 g-h), mientras que en las de los pacientes diagnosticados con MCD, la tinción fue ligeramente más débil, menos lineal y más granulada (Figura 1e-f). Como se muestra en el recuadro de la Figura 1f, algunas áreas en los glomérulos de pacientes con MCD incluso permitieron la discriminación de la SD teñida con nefrina.
Las pilas z de SIM se registraron con 3 ángulos y 5 desplazamientos de la rejilla en aproximadamente 4 pm por glomérulo con una distancia de corte a corte de 0,3 pm. El volumen completo se reconstruyó tanto en SIM como en pilas z de campo amplio. Como se muestra en la Figura 2c, las imágenes de campo amplio mostraron un patrón de tinción lineal similar al de las imágenes confocales. Las reconstrucciones de SIM en la Figura 2b yd mostraron la morfología de la SD ubicada entre FP simple, revelando su morfología interdigitante en el capilar. Mientras que las imágenes de SIM de los individuos de control sanos mostraron una morfología normal con FP ordenado como lo indica la estructura serpenteante de la SD, los pacientes con MCD mostraron un aspecto significativamente rectilíneo de la SD que indica un borramiento masivo del podocito FP.
Como se sabe desde hace mucho tiempo, el ancho del borramiento de losprocesos del pie de los podocitos (dFp) se correlacionan inversamente con la función renal en enfermedades glomerulares como la MCD14 y la nefropatía membranosa15, eldFP de los riñones de control sanos se comparó en primer lugar con la de los pacientes diagnosticados para MCD. Como un procedimiento estandarizado, se midió la distancia pico a pico de las SD en ambos lados del FP en la mitad de la longitud de cada FP (Figura 3b, barra roja y gráfico). En el grupo de control, se encontró una media de dFP de 0,249 pm (Desv. Est. = 0,068 pm, nFP = 1,220, npacientes = 8) en comparación con una media de dFP significativamente mayor de 0,675 pm (Desv. Est. = 0,256 pm, nFP = 1,880, npacientes= 10) en los pacientes con MCD. Los resultados se resumen en la Tabla 1.
Como es evidente, la media de dFP (Mall FP) aumentó notablemente en los individuos con MCD. En comparación con los riñones de control, se encontró una diferencia estadísticamente significativa (P <0,001) de dFP medido para cada paciente diagnosticado con MCD. Los resultados para los 10 pacientes con MCD (MCD1 a MCD10) y para el control se muestran en la Fig.4.
De acuerdo con una realización de la invención, se midió la longitud del diafragma de hendidura (Isd) y, de acuerdo con una realización adicional, con el fin de optimizar la interpretación de la imagen y automatizar la medición, se calculó la densidad SD, que se define como la longitud de SD por área capilar (Isd/A). Inesperadamente, se encontró que la determinación de la longitud del diafragma de hendidura (Isd), así como el cálculo de la densidad de SD, podrían mejorar y simplificar el procedimiento de diagnóstico del borramiento de FP de podocitos.
Por lo tanto, se estableció un flujo de trabajo basado en ImageJ en la popular plataforma FIJI16. Se utilizó el complemento Ridge Detection17, que reconoce y segmenta automáticamente las estructuras lineales dentro de las micrografías digitales. Para automatizar el procedimiento, se escribió un complemento específico, que luego de la selección manual de un área con una vista en planta en FP indicada por una SD nefrina positiva, midió automáticamente la longitud total de la SD y el área capilar total seleccionada. Luego, el complemento guardó automáticamente los resultados y una imagen de la SD segmentada.
Se determinó que la Isd del control sano era de 52,54 pm para un área de 16.955 pm2, la media de IsDde los pacientes con MCD se determinó en 30,94 pm paraun área de idéntico tamaño. Como es evidente, la longitud del diafragma de hendidura (Isd) en el control fue notablemente mayor que la longitud del diafragma de hendidura (Isd) en los pacientes con MCD, es decir, la longitud del diafragma de hendidura (Isd) disminuyó en los pacientes con MCD.
Como valor de referencia de riñones de control sanos se midió una Isd/A de 3,099 pm/pm2 (Desv.Est. = 0,268 pm / pm2, npacientes = 8, Atotal= 16.955 pm2). En comparación con eso, los pacientes con m Cd mostraron una media de Isd/A más pequeña estadísticamente significativa de 1,825 pm/pm2 (Desv.Est. = 0,493, npacientes = 13, Atotal = 26.475 pm2).
Como indicador de la severidad del borramiento de podocitos, se calculó cuántas desviaciones estándar (del grupo de control) cada biopsia de MCD estaba por debajo de la media del grupo de control. Sobre todas las biopsias de MCD, se calculó un valor de 4,757 desviaciones estándar con un valor mínimo de 2,045 y un valor máximo de 7,120 desviaciones estándar, lo que indica una gran variabilidad en la severidad del borramiento de podocitos con respecto a los diagnosticados con pacientes con MCD. Como se muestra en la Figura 5, la media de Isd/A de cada biopsia evaluada fue significativamente menor (P <0,001, Isd/A de todos los glomérulos del grupo MCD frente al grupo de control) en comparación con el grupo de control. Los resultados se enumeran en la Tabla 2.
Tabla 2: Isd/A de individuos sanos (control) versus pacientes con MCD.
Para verificar la aplicabilidad de Isd/A como marcador de diagnóstico para el borramiento de podocitos, se calculó una regresión lineal simple de los valores de dFP e Isd/A tanto de pacientes con MCD y biopsias de pacientes y control, los cuales se midieron con ambas estrategias. Como se muestra en el gráfico de la Figura 6, ambos valores se correlacionaron linealmente (R2 = 0,91) por lo que se concluyó con que ambas estrategias son equivalentes para diagnosticar el borramiento de FP de podocitos.
En resumen, la presente invención presenta un enfoque patohistológico novedoso, fácil y rápido para diagnosticar y cuantificar el borramiento de FP en biopsias renales. El protocolo utiliza procedimientos estándar, que se pueden implementar fácilmente en el flujo de trabajo de los diagnósticos de rutina con dos ventajas sobre los procedimientos del estado de la técnica: En primer lugar, el enfoque novedoso es mucho más rápido en comparación con el diagnóstico convencional de borramiento de FP de podocitos por TEM. En segundo lugar, los técnicos capacitados pueden realizar el análisis de las biopsias, lo que reduce los costos y el tiempo en el flujo de trabajo de diagnóstico de las biopsias renales.
Hasta el momento, otro error de la evaluación convencional a través de TEM ha sido que para la medición correcta de dFP, se requieren secciones ortogonales correctas a través del FP. Este no es siempre el caso y dará lugar a falsosvalores altos paradFP. La nueva técnica supera esta limitación ya que utiliza vistas planas de los capilares glomerulares.
Descripción de figuras
La Fig. 1 muestra las características histopatológicas de las secciones de riñón teñidas con PAS procedentes de pacientes diagnosticados con MCD (a-b) o de individuos de control sanos (c d). No se observaron diferencias morfológicas importantes entre los grupos. Las micrografías de barrido láser confocal de secciones teñidas con nefrina de pacientes con MCD (e-f) o riñones de control (g-h) muestran una tinción ligeramente más débil para nefrina en las biopsias de pacientes con diagnóstico de MCD (e-f). Se puede distinguir la aparición de SD únicos positivos a nefrina (f, recuadro). Las barras de escala indican en c 100 pm, en d 40 pm, en g 50 pm y en h 20 pm.
La Fig. 2 muestra micrografías de glomérulos teñidos con nefrina antes y después de la reconstrucción de SIM. Las micrografías en a y c muestran un solo fotograma del conjunto de datos de campo amplio original (WF) antes de la reconstrucción de SIM. El patrón de tinción es lineal y similar al de la microscopía confocal. Después de la reconstrucción de SIM (b, d, proyección de intensidad máxima de 3 fotogramas posteriores), se pueden distinguir más detalles sobre los bucles capilares. Como se muestra por el aumento en d, los riñones de control muestran un patrón de tinción regular con un solo FP puenteado por un meandro SD en el medio. En los pacientes diagnosticados con MCD (b), la SD aparece menos serpenteante y el FP borrado. Las imágenes de los volúmenes SIM reconstruidos en 3D en la imagen e y f muestran el aspecto espacial de la SD serpenteante en los bucles capilares. Claramente, un solo FP se puede distinguir en GBM. La barra de escala en a-d indica 10 pm, la barra de escala en e-f indica 2 pm.
La Fig. 3 muestra de forma ejemplar el proceso de detección automática de SD. El panel a muestra un segmento de una imagen de campo amplio que se reconstruyó con SIM (b). Como se muestra en el gráfico del panel b, el dFPse midió como la distancia pico a pico de la SD vecina. Para un enfoque automatizado, se seleccionaron áreas de secciones capilares planas y se realizó la detección automática de SD. Las líneas negras dentro del contorno blanco en el panel c
muestran la SD segmentada (indicada por una flecha blanca), la longitud que fue medida por el complemento FIJI. La barra de escala indica 2 pm.
La Fig. 4 muestra el dFppara los 10 pacientes MCD (MCD1 a MCD10) y para el control.
La Fig. 5 muestra la media de Isd/A para los 10 pacientes con MCD (MCD1 a MCD10) y para el control. La Fig. 6 muestra los valores de media de dFpe Isd/A, que se midieron en biopsias de MCD oindividuos de control, y que se grafican entre sí para cada individuo. Ambos valores muestran una relación lineal con un R2 de 0,91. Como ya se ha mostrado en la Tabla 1 y 2, hay una diferencia significativa entre el MCD y el grupo de control tanto para dFP como para Isd/A. ***P <0,001.
Procedimientos
1.1 Tinción histológica
Para este estudio se utilizaron biopsias anónimas de riñón humano fijadas con formalina e incluidas en parafina que fueron diagnosticadas para MCD por patólogos experimentados del Instituto de Patología de la Universidad de Medicina de Greifswald o de la Universidad de Erlangen-Nürnberg. Como controles sanos, se utilizó exceso anonimizado de tejido renal de nefrectomías parciales del Departamento de Urología dela Universidad de Medicina Greifswald. El uso de las biopsias de Erlangen ha sido aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Friedrich Alexander de Erlangen-Nürnberg, renunciando a la necesidad de consentimiento retrospectivo para el uso de material de reposo archivado (Núm. Ref. 4415). El comité de ética local de la Universidad de Medicina Greifswald aprobó el uso de las biopsias de Greifswald. Después de la desparafinización en xileno y una serie ascendente de etanol, se realizó la recuperación del antígeno en tampón de citrato por 5 minutos hirviendo en una olla a presión.Los portaobjetos se lavaron en PBS y se bloquearon durante 1 hora con FBS al 2%, BSA al 2% y gelatina de pescado al 0,2% en PBS. El anticuerpo primario (1:75 en solución de bloqueo, IgG anti-nefrinapoliclonal de cobaya, PG-N2, Progen, Heidelberg, Germany) se incubó en los portaobjetos durante 4 horas a 4°C. Después de tres lavados en PBS, el anticuerpo secundario (anti-conejillo de indias de cabra conjugado con Cy3, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA) se incubó durante 1 hora a 4 ° C seguido de incubación en dAp I (1: 100) y triple lavado en PBS. Los portaobjetos se montaron en Mowiol para microscopía (Carl Roth, Karlsruhe, Germany). Para la tinción de PAS, se utilizó un protocolo estándar que se puede encontrar en la Información Complementaria.
1.2 Microscopía
Se tomaron micrografías de secciones teñidas con PAS con un microscopio Olympus BX50 equipado con una Cámara Olympus UC30. Se utilizaron objetivos de 10x y 40x.
Para la microscopía de barrido láser confocal se utilizó un Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) equipado con un objetivo 63x (NA 1.4). Se adquirieron micrografías únicas de cada glomérulo con zoom 1x y 3x. Para SIM, se utilizó un sistema ZeissElyra SP.1 (ZeissMicroscopy, Jena, Germany) equipado con un objetivo de inmersión en aceite 63x (1.4 NA). Se adquirieron pilas Z con un tamaño de 2.430 x 2.430 píxeles (78,35 x 78,35 pm) con una distancia de corte a corte de 0,3 pm en aproximadamente 4 pm utilizando el láser de 561 nm, con una potencia de láser del 2,4% y un tiempo de exposición de 100 ms. La rejilla de período de 34 pm se movió 5 veces y se giró 3 veces en cada marco. La reconstrucción de SIM 3D se realizó con el software Zeiss ZEN utilizando los siguientes parámetros: Corte de valor de referencia, Ponderación de frecuencia SR: 1,3; Filtro de ruido: -5,6; Seccionamiento: 96, 84, 83.
1.3 Evaluación de dFP y mediciónautomatizada de Isd/A
El ancho del dFPen imágenes SIM se midió de forma estandarizada con FIJI: la distancia pico a pico de dos SD vecinas se midió en la mitad de la longitud de un solo FP. EldFP se evaluó para 20 FP por glomérulo, con 8-12 glomérulos incluidos por paciente que conducen a -200 mediciones por paciente.
Para la evaluación automática de la longitud de SD, se programó una macro personalizada para la plataforma FIJI basada en ImageJ y el complemento ImageJ "Ridge Detection" 16,17 La macro solo requiere la selección manual de un área capilar con una vista de planta en la SD y FP. El código fuente se puede encontrar en la Información Complementaria y los autores pueden proporcionar la macro FIJI lista para usar a pedido.
La macro mide la longitud SD total (Isd) y el área capilar (A) y guarda los resultados en unArchivo de Excel junto con un archivo JPEG del resultado de la detección de SD. Para tener en cuenta la densidad SD, Isd se dividió por A. Para comprobar la diferencia estadística, el resultado de cada biopsia se comparó con el grupo de control mediante la prueba t de Student para datos no apareados. Para comprobar la diferencia estadística de la media de MCD frente a los pacientes de control (Tablas 1, 2), se aplicó una prueba de U de Mann-Whitney utilizando SPSS (22.0 IBM SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Para cuantificar la gravedad del fenotipo, los resultados se expresaron como
"desviaciones estándar por debajo del control".
Referencias
1. Fogo AB, Lusco MA, Najafian B, Alpers CE: AJKD Atlas of Renal Pathology: Minimal Change Disease. American journal of kidney diseases the official journal of the National Kidney Foundation 66(2): 376 7, 2015
2. Huang B, Babcock H, Zhuang X: Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell 143(7): 1047-58, 2010
3. Suleiman H, Zhang L, Roth R, Heuser JE, Miner JH, Shaw AS, Dani A: Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane. eLife 2: e01149, 2013
4. Unnersjo-Jess D, Scott L, Blom H, Brismar H: Super-resolution stimulated emission depletion imaging of slit diaphragm proteins in optically cleared kidney tissue. KidneyInt 89(1): 243-7, 2016
5. Gustafsson MG: Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc 198(Pt 2): 82-7, 2000
6. Gustafsson MGL, Shao L, Carlton PM, Wang CJR, Golubovskaya IN, Cande WZ, Agard DA, Sedat JW: Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysicaljournal 94(12): 4957-70, 2008
7. Deegens JKJ, Dijkman HBPM, Borm GF, Steenbergen EJ, van den Berg JG, Weening JJ, Wetzels JFM: Podocyte foot process effacement as a diagnostic tool in focal segmental glomerulosclerosis. KidneyInt 74(12): 1568-76, 2008
8. van den Berg JG, van den Bergh Weerman MA, Assmann KJM, Weening JJ, Florquin S: Podocyte foot process effacement is not correlated with the level of proteinuria in human glomerulopathies. KidneyInt 66(5): 1901-6, 2004
9. Patrakka J, Ruotsalainen V, Ketola I, Holmberg C, Heikinheimo M, Tryggvason K, Jalanko H: Expression of nephrin in pediatric kidney diseases. Journal of the American Society of Nephrology JASN 12(2): 289-96, 2001
10. Furness PN, Hall LL, Shaw JA, Pringle JH: Glomerular expression of nephrin is decreased in acquired human nephrotic syndrome. Nephrology, dialysis, transplantation official publication of the European Dialysis and Transplant Association European Renal Association 14(5): 1234-7, 1999
11. Agrawal V, Prasad N, Jain M, Pandey R: Reduced podocin expression in minimal change disease and focal segmental glomerulosclerosis is related to the level of proteinuria. Clinical and experimental nephrology 17(6): 811-8, 2013
12. Suvanto M, Jahnukainen T, Kestila M, Jalanko H: Podocyte proteins in congenital and minimal change nephrotic syndrome. Clinical and experimentalnephrology 19(3): 481-8, 2015
13. Pullman JM, Nylk J, Campbell EC, Gunn-Moore FJ, Prystowsky MB, Dholakia K: Visualization of podocyte substructure with structured illumination microscopy (SIM): A new approach to nephrotic disease. BiomedOptExpress 7(2): 302-11, 2016
14. Bohman SO, Jaremko G, Bohlin AB, Berg U: Foot process fusion and glomerular filtration rate in minimal change nephrotic syndrome. KidneyInt 25(4): 696-700, 1984
15. Hladunewich MA, Lemley KV, Blouch KL, Myers BD: Determinants of GFR depression in early membranous nephropathy. American journal of physiology. Renal physiology 284(5): F1014-22, 2003 16. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T, Preibisch S, Rueden C, Saalfeld S, Schmid B, Tinevez J-Y, White DJ, Hartenstein V, Eliceiri K, Tomancak P, Cardona A: Fiji: An open-source platform for biologicalimage analysis. Naturemethods 9(7): 676-82, 2012
17. Steger C: An unbiased detector of curvilinear structures. IEEE Trans. Pattern Anal. Machine Intell.
20(2): 113-25, 1998
Claims (10)
1. Un procedimientode diagnóstico o prediagnóstico de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de
a) determinar la longitud del diafragma de hendidura (Isd) formada por los procesos del pie de los podocitos en un área específica A en una muestra de tejido renal de dicho individuo mediante microscopía óptica de superresolución, en el que el área específica A es un área en el cual los glomérulos son visibles con un vista de planta el proceso del pie de los podocitos;
b) comparar la longitud del diafragma de hendidura (Isd) formado por los procesos del pie de los podocitos en un área específica A como se determina en la etapa (a) con la longitud del diafragma de hendidura (Isd) formada por los procesos del pie de los podocitos en un área específica comparable A'en una muestra de tejido renal de un individuo que en el momento de la toma de muestras no mostraba síntomas clínicos de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos, en el que una desviación indica una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que (a) comprende
a.1) determinar la longitud del diafragma de hendidura (Isd) formado por los procesos del pie de los podocitos en un área específica A en una muestra de tejido renal de dicho individuo mediante microscopía óptica de superresolución;
a.2) formar la densidad del diafragma de hendidura Isd/A mediante la división de la longitud del diafragma de hendidura (Isd) determinada en (a.1) por el área específica (A); y
b) comparar la densidad del diafragma de hendidura Isd/A determinada en la etapa (a.2) con la densidad del diafragma de hendidura Isd/A en una muestra de tejido renal de un individuo que en el momento de la toma de muestras no mostraba síntomas clínicos de una enfermedad asociada con borramiento del proceso del pie de los podocitos,en el que una desviación indica una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos.
3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la muestra de tejido renal está inmunoteñida, preferentemente con un sistema de tinción inmunitaria que comprende
i) al menos una molécula de unión dirigida contra una proteína seleccionada del grupo que consiste en proteínas de diafragma de hendidura, proteínas que interactúan con el diafragma de hendidura y proteínas de contacto con células de podocitos, preferentemente seleccionadas del grupo que consiste ennefrina, NEPH1, podocina, ZO-1, FAT-1 Claudin-5, CD2AP, FYN, Nck1, Nck2, CRIM1, IQGAP1, MAGI-2, MYO1C, MYO1E, TRPC6, ApoL1, NOTCH, Par3, Par6, Dynamin, Clatrina, b-arrestina, PKC, Grb2, Canales activados Ca2+ (BK) y P-Cadherina.
ii) al menos un tinte de fluorescencia, preferentemente al menos un tinte de fluorescencia excitable por luz en el intervalo de 400 a 800 nm, más preferentemente un tinte de cianina, más preferentemente un tinte de cianina seleccionado del grupo que consiste en Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 y Cy7.5, más preferentemente Cy3.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la molécula de unión de acuerdo con i) se selecciona del grupo que consiste en proteínas y ácidos nucleicos, preferentemente del grupo que consiste en anticuerpo, aptámero, peptímero y nanocuerpo, más preferentemente anticuerpo.
5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos se selecciona del grupo de glomerulopatías, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en nefropatía diabética, glomeruloesclerosis focal y segmentaria, glomerulonefritis membranosa / nefropatía membranosa y enfermedad de cambios mínimos.
6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la microscopía óptica de superresolución es microscopía de iluminación estructurada.
7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la desviación de acuerdo con (b) es una disminución de la longitud del diafragma de hendidura (Isd) como se determina en (a) en comparación con la longitud del diafragma de hendidura (Isd) de un individuo que en el momento de la toma de muestras no mostraba síntomas clínicos de una enfermedad asociada con borramiento del proceso del pie de los podocitos o de la densidad del diafragma de hendidura Isd/A formado en (a.2) en comparación con la densidad del diafragma de hendidura Isd/A de un individuo en el momento de la toma de muestras no mostraba síntomas clínicos de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos.
8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además
c) determinar el ancho delos procesos del pie delos podocitos en un área específica A en una muestra de tejido renal de dicho individuo mediante microscopía de luz de superresolución;
d) comparar el ancho de los procesos del pie de los podocitos en un área específica A como se determinó en la etapa c) con el ancho de los procesos del pie de los podocitos en un área específica comparable A' en una muestra de tejido renal de un individuo que en el momento de la toma de muestras no mostrabasíntomas clínicos de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos,
en el que una desviación determinada en (b) y/o (d), preferentemente una desviación en (b) y (d), indica una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la desviación de acuerdo con (d) es un aumento del ancho de los procesos del pie de los podocitos como se determina en (c) en comparación con el ancho de los procesos del pie de los podocitos en un área específica comparable A' en una muestra de tejido renal de un individuo que en el momento de la toma de muestras no mostraba síntomas clínicos de una enfermedad asociada con el borramiento del proceso del pie de los podocitos.
10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el individuo es un mamífero, preferentemente seleccionado del grupo de ser humano, ratón, conejo y rata, más preferentemente ser humano y ratón, más preferentemente ser humano.
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