ES2865950T3

ES2865950T3 - Biorreactor de meandro y procedimiento para el aislamiento y la multiplicación de células de partes de tejido de tumores, metástasis y otros tejidos

Info

Publication number: ES2865950T3
Application number: ES18000410T
Authority: ES
Inventors: Hans Hoffmeister
Original assignee: ZELLWERK GmbH
Current assignee: ZELLWERK GmbH
Priority date: 2018-01-24
Filing date: 2018-04-30
Publication date: 2021-10-18
Anticipated expiration: 2038-04-30
Also published as: DK3517600T3; DE102018000561A1; DE102018000561B4; EP3517600A1; EP3517600B1

Abstract

Biorreactor de meandro constituido por un recipiente de biorreactor rectangular (1) de material polimérico preferentemente transparente, que es estéril cerrado con una cubierta (2), caracterizado por que el recipiente de biorreactor (1) está dividido en tres cámaras (3, 4, 5) dispuestas una encima de la otra y la cámara más baja (3) está formada como cámara de subcapa, la cámara (4) dispuesta encima de la cámara de subcapa (3) está formada como cámara de perfusión de meandro y la cámara (5) dispuesta encima de la cámara de perfusión de meandro (4) está formada como cámara de capa superpuesta y la cámara de capa superpuesta (3) y la cámara de perfusión de meandro (4) están separadas entre sí por una placa de fondo perforada (6) con una lámina semipermeable (7) dispuesta en la parte inferior de la placa de fondo perforada (6), en el que el oxígeno se difunde a través de la lámina preferentemente en comparación con otros gases.

Description

DESCRIPCIÓN

Biorreactor de meandro y procedimiento para el aislamiento y la multiplicación de células de partes de tejido de tumores, metástasis y otros tejidos

[0001] Biorreactor de meandro y procedimiento para el aislamiento y la multiplicación de células de partes de tejido de tumores, metástasis y otros tejidos La invención se refiere a un nuevo tipo de biorreactor, con el cual es posible en una sola etapa de procedimiento cerrada permitir que ciertas células crezcan en el medio en el biorreactor a partir de trozos de tejido cortados y activar las células al mismo tiempo, para que se multipliquen y luego para separarlas de los residuos de tejido. En particular, los linfocitos T autólogos infiltrantes de tumores (TIL) pueden obtenerse de esta manera a partir de tejido tumoral, tejido metastásico, su tejido circundante y de los ganglios linfáticos afectados por células tumorales.

[0002] El documento DE 69534 132 T2 describe un dispositivo de cultivo celular que comprende un depósito con un compartimento de cultivo celular, en el que el depósito para la multiplicación celular está delimitado por una capa inferior, permeable a los gases, preferentemente permeable al oxígeno y una lámina superior, que son selectivamente permeables a sustancias de un tamaño predeterminado e impermeables a las célula. El depósito está diseñado para contener un medio de cultivo entre la lámina superior y la capa inferior permeable a los gases. El depósito consta de

• un compartimento de medio basal, al menos una parte del cual se encuentra sobre la lámina superior, en el que un medio basal puede estar encima de la lámina superior;

• una sola abertura de acceso al compartimento de cultivo celular;

• una abertura de acceso al compartimento de medio basal; y

• un soporte de capa permeable a los gases que está dispuesto debajo de la capa permeable a los gases y está parcialmente en contacto con ella, con lo que la mayor parte de la capa permeable a los gases se mantiene en una posición sustancialmente horizontal para que las células de una suspensión se puedan distribuir a lo largo de la porción horizontal de la capa permeable a los gases y el intercambio de gases con el compartimento de cultivo celular no se vea obstaculizado significativamente. El suministro de medio a las células no está regulado, el flujo sobre las células no está dirigido.

[0003] En el documento DE 693 32 374 T2 se describe un biorreactor para el cultivo de células y/o tejidos humanos, que incluyen células madre humanas o células hematopoyéticas humanas, que se pueden introducir desde una carcasa que define una cámara de cultivo celular en las células y/o tejidos humanos, incluidas las células madre humanas o las células hematopoyéticas humanas, y en las que se pueden cultivar, en el que esta cámara de cultivo celular está diseñada de tal manera que contiene una pluralidad de aberturas de entrada sustancialmente equidistantes de una pluralidad de aberturas de salida para que pueda fluir a su través el medio de cultivo celular. El biorreactor describe además medios para perfundir un medio de cultivo celular líquido a través de la cámara de cultivo celular; medios para poner en contacto el medio de cultivo celular líquido perfundido a través de la cámara de cultivo celular con una fuente de oxígeno de manera que el medio de cultivo celular líquido perfundido a través de la cámara de cultivo celular esté enriquecido con oxígeno, en el que dichos medios de contacto incluyen una membrana permeable a los gases e impermeable a los líquidos; y medios para la recogida continua, periódica o discontinua de células no adherentes de la cámara de cultivo celular mediante el flujo del medio de cultivo. La membrana permeable a los gases e impermeable a los líquidos está integrada en la carcasa de tal manera que la carcasa está dividida en la cámara de cultivo celular en un lado de la membrana y en una cámara de gas en el otro lado de la membrana. El biorreactor comprende medios para perfundir gases respiratorios a través de este cultivo celular, medios para suministrar los gases respiratorios a la cámara de gas, con lo que los gases respiratorios fluyen a través de la membrana y así pasan a través de la cámara de cultivo celular y medios para extraer los gases respiratorios usados de la cámara de gas.

[0004] La invención de acuerdo con el documento DE 69614535 T2 se refiere en general a un dispositivo para el almacenamiento ex vivo y para el cultivo ex vivo de células biológicas y, en particular, a un dispositivo de este tipo que almacena y cultiva las células en un cartucho portátil mientras se mantiene un sistema estéril que está aislado del ambiente externo. El dispositivo para el almacenamiento y cultivo ex vivo de células biológicas comprende un cartucho de crecimiento celular portátil que incluye una carcasa, una cámara de crecimiento celular dentro de la carcasa configurada para transportar una cantidad de células biológicas y un medio de crecimiento, en el que la cámara de crecimiento celular tiene un abertura de entrada de medio y un abertura de salida de medio, un depósito de medio conectado a la abertura de entrada de medio de la cámara de crecimiento celular y configurado para contener un medio de crecimiento, un depósito de residuos que está conectado a la abertura de salida de medio de la cámara de crecimiento celular y está configurado para recibir el medio drenado de la cámara de crecimiento, en el que la cámara de crecimiento celular, el depósito de medio y el depósito de residuos forman un sistema estéril cerrado al ambiente externo. La cámara de crecimiento celular contiene una membrana que es, preferentemente, permeable al oxígeno e impermeable a los líquidos y que define una parte de la cámara de crecimiento celular y una cámara de gas que se encuentra en el lado de la membrana opuesto a la cámara de crecimiento celular. El cartucho de crecimiento celular portátil incluye además un puerto de suministro de gas portado por una pared trasera de la carcasa y una línea de suministro de gas que conecta el puerto de suministro de gas a la cámara de gas para suministrar gas a la cámara de gas para que permee a través de la membrana a la cámara de crecimiento celular.

[0005] La invención de acuerdo con el documento CN 1699558 (A) se refiere a una tecnología de cultivo a gran escala de células asesinas para inducir factores celulares para células madre hematopoyéticas utilizando un biorreactor capaz de obtener células madre hematopoyéticas de sangre de cordón umbilical, induciendo las células madre hematopoyéticas a células DC con citocina, completando para presentar la función del antígeno tumoral para completar la activación seleccionada de los linfocitos T asesinos con efectos específicos de muerte en los tumores. Se vincula la producción del microportador de gelosa para el anticuerpo monoclonal (CD3McAb), la activación de las células CIK y el cultivo continuo de células CIK en el biorreactor.

[0006] El documento DE 102011 106914 B4 / EP2543719 A1 describe un biorreactor de meandro para la expansión, diferenciación y recogida dinámica y libre de estrés de la fracción total de células hematopoyéticas, células madre, células progenitoras, pero también de fracciones aisladas, estimuladas y activadas de estas células, excluidas las embrionarias, con lo que el biorreactor funciona en modo de perfusión. El biorreactor consta de un recipiente de biorreactor, cuya superficie inferior está provista de paredes separadoras dispuestas de manera descentrada, que hacen que el medio sea guiado de manera serpenteante con un flujo laminar. El biorreactor de meandro se puede conectar en serie con otros biorreactores de meandro mediante válvulas de cierre. Después de introducirse en el recipiente de biorreactor, las células forman una capa de células cohesivas que casi cubre la superficie inferior del biorreactor de meandro, en el que las células están a menudo en estrecho contacto entre sí. Los grupos de células formados durante la expansión se rompen agitando y se recogen o se alimentan a un biorreactor modular posterior con una superficie inferior más grande del recipiente de biorreactor correspondiente a la velocidad de expansión del biorreactor anterior para una expansión adicional.

[0007] Una tecnología que integra varios etapas de procedimiento para aislar y multiplicar células de partes de tejido de tumores, metástasis y otros tejidos no se conoce en los antecedentes de la técnica. Tampoco hay descripción de un biorreactor con el que se puedan producir células y en particular TIL de manera estéril y en cantidades terapéuticamente significativas debido a su alta citotoxicidad, en ninguno de los biorreactores de los antecedentes de la técnica para el crecimiento de tejidos o células se han utilizado células ex vivo de tejidos aislados, cultivados, activados, expandidos y recogidos al mismo tiempo.

Además, no se conoce de los antecedentes de la técnica ningún biorreactor para llevar a cabo este procedimiento.

El objetivo de la invención es crear un biorreactor de meandro y un procedimiento que permita que las células crezcan inicialmente a partir de pequeños trozos de tejido (que se originan a partir de tejido quirúrgico o biopsias) en un procedimiento de perfusión cerrado y, por lo tanto, se activan de forma continua y se pueden recoger después de alcanzar una cierta densidad celular. En particular, de acuerdo con el procedimiento se pueden producir linfocitos T autólogos infiltrantes de tumores, los denominados TIL, pero también otras células inmunitarias, por ejemplo, células NK infiltrantes de tumores (TINK)

[0008] El objetivo de la invención se logra mediante un biorreactor de meandro y un procedimiento de dos fases para la extracción ex vivo de células que, en la primera fase del procedimiento, crecen a partir de tejido triturado crecen en el medio en el recipiente del biorreactor (1 ), se activan y multiplican al mismo tiempo y se separan de las partes de tejido después de que se haya alcanzado una cierta densidad de células completamente desarrolladas y expandidas. Los tejidos de partida que se ven afectados por las células tumorales provienen, preferentemente, con motivo de operaciones de metástasis o tumores de órganos o la extirpación de sus tejidos circundantes inmediatos o también de los ganglios linfáticos. El procedimiento en la primera fase tiene lugar en un

[0009] recipiente de biorreactor de meandro cerrado (1) que se perfunde de manera dirigida con un medio convencional y cuyo medio se suplementa temporalmente con una mezcla de suero humano AB, citocinas, anticuerpos y células nutrientes humanas irradiadas. Los trozos de tejido cortados en pedazos pequeños son especialmente adecuados para la recuperación de linfocitos T infiltrantes de tumores (TIL), pero también para células asesinas naturales infiltrantes de tumores (TINK). Después de un período de expansión de 7 a 14 días, los TIL completamente desarrollados y multiplicados se filtran de los residuos de tejido a través de la boquilla de salida (15) del recipiente de biorreactor (1) provisto de malla (16) y se recogen en forma pura. Los TIL separados de esta manera se centrifugan y se resuspenden en medio de congelación en viales, se dividen en alícuotas y se crioconservan. Con medios debidamente suplementados, las células NK infiltrantes de tumores (TINK) y otros tipos de células también pueden cultivarse en el biorreactor de meandro.

[0010] Para aplicaciones clínicas, los viales crioconservados se descongelan en la segunda fase de tal manera que se producen cantidades terapéuticamente significativas de TIL según lo programado en una segunda fase de expansión. Para ello, después de lavarse del medio de congelación, los TIL se resuspenden en un medio adecuado. La suspensión de TIL (50 a 100 millones de células vitales) se transfiere a otro biorreactor de meandro listo para usar. Esta segunda fase de procedimiento para la expansión adicional de TIL se lleva a cabo en un biorreactor que es similar al biorreactor de meandro descrito de la primera fase, pero que tiene un área de colonización más grande en la proporción de 3:1 a 20:1. Se utiliza medio recién suplementado para una mayor propagación. Después de 12 a 20 días de expansión, más de 500 millones de TIL crecen regularmente en el biorreactor de meandro de la segunda etapa. Los TIL se recogen, se lavan y se resuspenden en una solución de NaCl con albúmina humana. La suspensión de TIL se carga en una bolsa de infusión. La viabilidad y el recuento celular se analizan el día de la recogida celular de acuerdo con la farmacopea, la esterilidad, el perfil del marcador y la producción paracrina de las células. Para 500 millones de TIL, se utiliza un máximo de 100 ml de solución de NaCl con albúmina humana. La suspensión de TIL se mantiene a temperatura ambiente y se transporta inmediatamente al socio clínico. Los TIL deben aplicarse después de 12 a 24 horas como máximo. Se crioconservan cantidades excesivas de TIL. Estas están disponibles TIL para la producción de más dosis que serán necesarias más adelante

[0011] En una versión del procedimiento inventivo, el aumento de TIL se filtra de los residuos de tejido a través de la boquilla de salida (15) del recipiente de biorreactor (1) provisto de malla (16) y la suspensión de células con los TIL se transfiere directamente a la segunda fase en un biorreactor de meandro de diseño como en la primera fase, pero transferido con un área de colonización más grande, cultivado durante 12 a 20 días, las células se recogen después del cultivo, se lavan y se resuspenden en solución de NaCl con albúmina humana y la suspensión celular se carga en bolsas de infusión.

[0012] El biorreactor de meandro según la invención consta de un recipiente de biorreactor rectangular (1) hecho de material polimérico preferentemente transparente, que se cierra de manera estéril con una cubierta (2). El recipiente del biorreactor (1) está dividido en tres cámaras (3, 4, 5) dispuestas una encima de la otra, la cámara inferior (3) está diseñada como cámara de subcapa, la cámara (4) dispuesta encima de la cámara de subcapa (3) está diseñada como cámara de perfusión de meandro (4) y la cámara (5) dispuesta sobre la cámara de perfusión de meandro (4) está diseñada como una cámara de capa superpuesta. La cámara de subcapa (3) y la cámara de perfusión de meandro (4) están separadas entre sí por una placa de fondo perforada (6) con una lámina permeable al oxígeno (7) firmemente adherida. En la cámara de subcapa (3) hay entradas y salidas (13, 14) que permiten el paso de gases, en particular con mezclas de aire y oxígeno o con nitrógeno y oxígeno, en las que se regula la proporción de oxígeno. El oxígeno se difunde preferentemente respecto al nitrógeno a través de la lámina permeable a los gases (7) que está firmemente adherida a la placa de fondo perforada (6) de la cámara de perfusión de meandro (4). Cuando fluye a través de la cámara de perfusión de meandro (4), cantidades reguladas de oxígeno entran en el medio de cultivo durante la expansión de las células tanto desde la capa superpuesta como desde la subcapa (por difusión). La cámara de perfusión de meandro (4) está provista de entradas y salidas para los medios de cultivo (11, 12), y en la cámara de capa superpuesta (5) hay una entrada y una salida (13, 14) para la atmósfera de capa superpuesta y una boquilla de salida (15) disponible. Una malla (16) está dispuesta en la boquilla de salida (15) en el interior de la cámara de capa superpuesta (5) delante de la salida. En la salida (12) de la cámara de perfusión de meandro (4) también hay un rebosadero (17) para descargar el caldo celular usado. La altura del rebosadero es regulable.

[0013] La cámara de perfusión de meandro (4) consta de la placa de fondo (6) con forma de tira, dispuesta en la cara superior (8), la placa de fondo (6) se divide y se fuerza un flujo serpenteante a través de la cámara de perfusión de meandro (4) con paredes separadoras (8) de gases y medio, en la que la distancia (A) de las paredes separadoras (8) entre sí y de las paredes laterales y finales de la cámara de perfusión de meandro (4) se selecciona de modo que en el filamento de flujo, en el canal formado por las paredes separadoras (8), se forma un flujo superior laminar promedio con un número de Froude < 0,005. A medida que aumenta el número de células en el transcurso del aumento en el número de células (TIL u otras células), el suministro de medio fresco aumenta continuamente, en el que el suministro aumentado de medio nuevo está controlado automáticamente mediante un algoritmo correspondiente. El flujo de fondo permanece cerca de un número de Froude 0, lo que evita que las células se arremolinen. Las condiciones de flujo descritas previenen el estrés celular y aseguran un suministro homogéneo de nutrientes sobre toda la capa celular que crece en el fondo del canal. Al igual que la cámara de subcapa, la cámara de capa superpuesta (5) tiene entradas y salidas (13, 14) para el desbordamiento de gases. La misma mezcla de gas/gas que en la cámara de capa superpuesta (5) fluye a través de la cámara de subcapa. En una serie de cultivo, las células suelen crecer a partir de los trozos de tejido durante de 7 a 14 días y las células adultas se multiplican al mismo tiempo. De esta manera, se pueden producir TIL en grandes cantidades a partir de tejido tumoral. Pero también se pueden obtener TINK y otras células a partir de los tejidos de esta manera. Cuando el consumo de glucosa en el biorreactor alcanza de 100 a 300 mg por día, los TIL se separan de los residuos de tejido como filtrado a través de la boquilla de salida (15) del recipiente de biorreactor (1) provista de una malla (16).

[0014] El biorreactor de meandro y el procedimiento de dos fases para la extracción ex vivo y la multiplicación de células a partir de partes de tejido se explican con más detalle a continuación, en el que la figura 1 es una vista esquemática en sección del biorreactor de meandro y la figura 2 una vista esquemática en planta del biorreactor de meandro, en el que los números de referencia del 1 al 17 marcan las partes de construcción del biorreactor enumeradas en la siguiente lista:

1 Recipiente de biorreactor

2 Cubierta

3 Cámara de subcapa

4 Cámara de perfusión de meandro

5 Cámara de capa superpuesta

6 Placa de fondo

7 Lámina

8 Pared separadora

9 Entrada de atmósfera de subcapa

10 Salida de atmósfera de subcapa

11 Entrada de medio de cultivo

12 Salida de medio de cultivo

13 Entrada de atmósfera de capa superpuesta

14 1 Salida de atmósfera de capa superpuesta

15 Boquilla de salida

16 Malla

17 Rebosadero para caldo celular

[0015] El material de partida para la producción de TIL o TINK y otras células son partes de tejido que surgen, por ejemplo, durante la extirpación quirúrgica de tumores de órganos sólidos, sus metástasis o su tejido circundante inmediato o se extirpan para este fin. Una cantidad de tejido con un volumen de aproximadamente 1 ml por lo general es suficiente como material de partida. Las muestras de tejido se colocan en un recipiente de transporte con medio. El recipiente se mantiene cerrado a temperatura ambiente y se transporta desde el sitio de extracción de tejido al área de la sala limpia para la producción de las preparaciones de células inmunitarias. Los trozos de tejido quirúrgico se trituran en trozos de 1 a 2 mm3 de tamaño bajo un LFB en una sala limpia y se transfieren a un biorreactor de meandro en la primera fase. Los trozos de tejido triturados se distribuyen uniformemente en el biorreactor de meandro y se cultivan en el modo de perfusión. El biorreactor de meandro está conectado listo para funcionar en un reactor reproductor GMP y es supervisado continuamente, en gran parte controlado automáticamente y documentado por la unidad de control.

[0016] El biorreactor de meandro consta de un recipiente de biorreactor rectangular (1) hecho de material polimérico preferentemente transparente, que se cierra de manera estéril con una cubierta (2). El recipiente del biorreactor (1) está dividido en tres cámaras (3, 4, 5) dispuestas una encima de la otra, la cámara inferior (3) está diseñada como cámara de subcapa, la cámara (4) dispuesta encima de la cámara de subcapa (3) está diseñada como cámara de perfusión de meandro y la cámara (5) dispuesta sobre la cámara de perfusión de meandro (4) está diseñada como una cámara de capa superpuesta. La cámara de subcapa (3) y la cámara de perfusión de meandro (4) están separadas entre sí por una placa de fondo perforada (6) con una lámina permeable al oxígeno (7) firmemente adherida. En la cámara de subcapa (3) hay entradas y salidas (9, 10) que permiten el paso de gases, en particular con mezclas de aire y oxígeno o con nitrógeno y oxígeno, en las que se regula la proporción de oxígeno. El oxígeno se difunde preferentemente respecto al nitrógeno a través de la lámina permeable a los gases (7) que está firmemente adherida a la placa de fondo perforada (6) de la cámara de perfusión de meandro (4). Cuando fluye a través de la cámara de perfusión de meandro (4), cantidades reguladas de oxígeno entran en el medio de cultivo durante la expansión de las células tanto desde la cámara de capa superpuesta como desde la de subcapa (por difusión). La cámara de perfusión de meandro (4) está provista de entradas y salidas para los medios de cultivo (11, 12), y en la cámara de capa superpuesta (5) hay una entrada y una salida (13, 14) para la atmósfera de capa superpuesta y una boquilla de salida (15) disponible. Una malla (16) está dispuesta en la boquilla de salida (15) en el interior de la cámara de capa superpuesta (5) delante de la salida. En la salida (12) de la cámara de perfusión de meandro (4) también hay un rebosadero (17) para descargar el caldo celular usado. La altura del rebosadero es regulable. La cámara de perfusión de meandro (4) consta de la placa de fondo (6) con forma de tira, dispuesta en la cara superior (8), la placa de fondo (6) se divide y se fuerza un flujo serpenteante a través de la cámara de perfusión de meandro (4) con paredes separadoras (8) de gases y medio, en la que la distancia (A) de las paredes separadoras (8) entre sí y de las paredes laterales y finales de la cámara de perfusión de meandro (4) se selecciona de modo que en el filamento de flujo, en el canal formado por las paredes separadoras (8), se forma un flujo superior laminar promedio con un número de Froude < 0,005. A medida que aumenta el número de células en el transcurso del aumento en el número de células (TIL u otras células), el suministro de medio fresco aumenta continuamente, lo que está controlado automáticamente mediante un algoritmo correspondiente. El flujo de fondo permanece cerca de un número de Froude 0, lo que evita que las células se arremolinen. Las condiciones de flujo descritas previenen el estrés celular y aseguran un suministro homogéneo de nutrientes sobre toda la capa celular que crece en el fondo del canal. La cámara de capa superpuesta (5) tiene entradas y salidas (13,14) para el desbordamiento de gases. La misma mezcla de gas/gas fluye a través de la cámara de subcapa que en la cámara de capa superpuesta (5).

[0017] En una serie de cultivo, las células suelen crecer a partir de los trozos de tejido durante de 7 a 14 días y las células adultas se multiplican al mismo tiempo. De esta manera, se pueden producir TIL en grandes cantidades a partir de tejido tumoral. Pero también se pueden obtener TINK y otras células a partir de los tejidos de esta manera. Cuando el consumo de glucosa en el biorreactor alcanza de 100 a 300 mg por día, los TIL se separan de los residuos de tejido como filtrado a través de la boquilla de salida (15) del recipiente de biorreactor (1 ) provista de una malla (16).

[0018] Desde la transferencia de los trozos de tejido al recipiente de biorreactor (1) en la primera fase, todo el proceso hasta el llenado de las células activadas y expandidas tiene lugar en un sistema vascular completamente cerrado. El cultivo se lleva a cabo en un medio adecuado que se complementa temporalmente con una mezcla específica de suero humano con AB, citocinas, anticuerpos y células nutrientes humanas irradiadas. Se puede lograr una multiplicación y activación más rápida con suplementos que se fijan en las superficies del canal de biorreactor. En el caso de TIL y otras células inmunitarias, los TIL multiplicados y separados en esta primera fase se centrifugan, se resuspenden en medio de congelación y se dividen en alícuotas (alrededor de 50 millones de TIL por vial). Las muestras se almacenan en fase gaseosa sobre nitrógeno líquido.

[0019] Para aplicaciones clínicas, los viales crioconservados se descongelan de tal manera que se producen cantidades terapéuticamente significativas de TIL según lo programado en una segunda fase de expansión. Para ello, después de lavarse del medio de congelación, los TIL se resuspenden en un medio adecuado. La suspensión de TIL (50 a 100 millones de células vitales) se transfiere a otro biorreactor de meandro listo para usar. Esta segunda etapa del proceso para la expansión adicional de TIL se lleva a cabo en un biorreactor de meandro, que es similar al biorreactor de meandro descrito anteriormente, pero que tiene un área de colonización más grande. Se utiliza un medio recién suplementado para una mayor propagación. Después de 12 a 20 días de expansión, más de 500 millones de TIL crecen regularmente en el biorreactor de meandro. Los TIL se recogen, se lavan y se resuspenden en una solución de NaCl con albúmina humana. La suspensión de TIL se carga en una bolsa de infusión. La viabilidad y el número de células se determinan el día de la recogida celular y se analizan adicionalmente de acuerdo con la farmacopea, la esterilidad, el perfil del marcador y la producción paracrina de las células. La suspensión de TIL se mantiene a temperatura ambiente y se transporta inmediatamente al socio clínico. Los TIL deben aplicarse después de 12 a 24 horas como máximo. Se crioconservan cantidades excesivas de TIL. Estas están disponibles TIL para la producción de más dosis que serán necesarias más adelante, para 500 millones de TIL, se utiliza un máximo de 100 ml de solución de NaCl con albúmina humana.

[0020] Con el biorreactor de meandro de acuerdo con la invención y el procedimiento de acuerdo con la invención para el aislamiento y la multiplicación de células de partes de tejido de tumores, metástasis y otros tejidos, es posible en una sola etapa de procedimiento cerrada permitir que ciertas células crezcan en el medio en el biorreactor a partir de trozos de tejido cortados y activar las células al mismo tiempo, para que se multipliquen y luego para separarlas de los residuos de tejido. En particular, los linfocitos T autólogos infiltrantes de tumores (TIL) pueden obtenerse de esta manera a partir de tejido tumoral, tejido metastásico, su tejido circundante y de los ganglios linfáticos afectados por células tumorales. El flujo laminar dirigido sobre las células con medio en el biorreactor de meandro conduce a un rápido crecimiento de las células. En el caso de TIL, las células que tienen citotoxicidad específica hacia las células tumorales de las cuales o de cuyo entorno se obtienen, son particularmente preferentes para expandirse

[0021] En una segunda etapa de procedimiento, se producen cantidades terapéuticamente significativas de TIL para aplicaciones clínicas en un biorreactor, que es similar al biorreactor de meandro de la primera etapa de procedimiento, pero que tiene un área de colonización más grande.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Biorreactor de meandro constituido por un recipiente de biorreactor rectangular (1) de material polimérico preferentemente transparente, que es estéril cerrado con una cubierta (2 ), caracterizado por que el recipiente de biorreactor (1) está dividido en tres cámaras (3, 4, 5) dispuestas una encima de la otra y la cámara más baja (3) está formada como cámara de subcapa, la cámara (4) dispuesta encima de la cámara de subcapa (3) está formada como cámara de perfusión de meandro y la cámara (5) dispuesta encima de la cámara de perfusión de meandro (4) está formada como cámara de capa superpuesta y la cámara de capa superpuesta (3) y la cámara de perfusión de meandro (4) están separadas entre sí por una placa de fondo perforada (6) con una lámina semipermeable (7) dispuesta en la parte inferior de la placa de fondo perforada (6), en el que el oxígeno se difunde a través de la lámina preferentemente en comparación con otros gases.

2. Biorreactor de meandro de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que porta la cámara de subcapa (3) con entradas y salidas (9, 10) unidas a diferentes alturas para el flujo de gases, la cámara de perfusión de meandro (4) con entradas y salidas para medios de cultivo (11, 12) y la cámara de capa superpuesta (5) con entradas y salidas (13,14) para gases de capa superpuesta y con una boquilla de salida (15), en la que en el interior de la cámara de capa superpuesta (5) antes de la salida está dispuesta una malla (16), en el que un rebosadero (17) para el caldo celular usado es regulable en altura en la entrada (11) de la cámara de biorreactor de meandro (4).

3. Biorreactor de meandro de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, caracterizado por que la cámara de perfusión de meandro (4) consta de la placa de fondo (6) con forma de tira, dispuesta en la cara superior (8), que divide la placa de fondo (6) y un flujo en forma de meandro a través de la cámara de perfusión de meandro (4) con paredes separadoras de refuerzo medio (8), la distancia (A) de las paredes separadoras (8) entre sí y de las paredes laterales y finales de la cámara de perfusión de meandro (4) se selecciona de manera que en el filamento de la corriente, en el canal formado por las paredes separadoras (8), se forme un flujo superior laminar promedio con un número de Froude no mayor de 0,005 y un flujo de fondo con un número de Froude cercano a 0, lo cual, con un número creciente de células, asegura tanto una concentración homogénea de nutrientes como ningún flujo que cause turbulencias en el medio que fluye sobre las células sedimentadas.

4. Biorreactor de meandro de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, caracterizado por que varios biorreactores de meandro pueden conectarse entre sí de forma modular a través del rebosadero (17) para el caldo celular (con dispositivos de cierre no representados en detalle).

5. Procedimiento para la extracción ex vivo de células en el biorreactor de meandro de acuerdo con la reivindicación 2 , en el que las células en una primera fase del procedimiento superan las partes de tejido trituradas al medio ubicado en el biorreactor, simultáneamente activadas y aumentadas y después de alcanzar cierta densidad de células completamente desarrolladas y expandidas se separan de las partes de tejido, caracterizado por que las partes de tejido que se ven afectadas por las células tumorales se extirpan con motivo de operaciones de tumor de órgano o metástasis o extirpación de los tejidos circundantes inmediatos o de los ganglios linfáticos y en la primera fase del procedimiento en un recipiente de biorreactor cerrado (1 ), en el que el medio se perfunde de manera dirigida en el recipiente de biorreactor (1), el medio se suplementa temporalmente con una mezcla de suero humano AB, citocinas, anticuerpos y células nutrientes humanas irradiadas, y después de 7 a 14 días de expansión, los TIL completamente desarrollados y multiplicados se filtran de los residuos de tejido a través de la boquilla de salida (15) del recipiente de biorreactor (1) provisto de malla (16) y se recogen en forma pura, los TIL así separados se centrifugan y se resuspenden en medio de congelación en viales, se dividen en alícuotas y se crioconservan.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por que en el biorreactor de meandro de acuerdo con la reivindicación 1 se cultivan linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) o células NK infiltrantes de tumores (TINK) y otros tipos de células en un medio debidamente suplementado.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por que mediante la adición de suplementos adecuados (anticuerpos) se evita específicamente la reproducción de TIL y de esta manera se multiplican las TINK de las partes de tejido triturado y se recogen en forma pura, en el que los TINK se filtran a través de la malla (16) y se recogen en forma pura, los TINK así separados se centrifugan y se resuspenden en medio de congelación en viales, se dividen en alícuotas y se crioconservan.

8. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 6 y 7, caracterizado por que los viales crioconservados se descongelan para una expansión adicional y el medio de congelación se lava, en el que las células se resuspenden en un medio recién suplementado correspondiente y la suspensión celular en una segunda fase en un biorreactor de meandro del mismo diseño, como se transfirió en la primera fase pero con un área de colonización más grande, se puede cultivar durante 12 a 20 días, las células se recolectan después del cultivo, se lavan y se resuspenden en solución de NaCI con albúmina humana y la suspensión celular se carga en bolsas de infusión.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la relación del área de colonización en este biorreactor de meandro más grande de la segunda fase en comparación con el biorreactor de perfusión de meandro más pequeño descrito en la reivindicación 1 puede ser de 3:1 a 20:1.

10. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 6-9, caracterizado por que el aumento de TIL se filtra de los residuos de tejido a través de la boquilla de salida (15) del recipiente de biorreactor provisto de malla (16) y la suspensión de células con los TIL se transfiere directamente a la segunda fase en un biorreactor de meandro de diseño como en la primera fase, pero transferido con un área de colonización más grande, cultivado durante 12 a 20 días, las células se recogen después del cultivo, se lavan y se resuspenden en solución de NaCl con albúmina humana y la suspensión celular se carga en bolsas de infusión.