ES2862413T3 - Crioconservación de estadios juveniles de percebes - Google Patents

Abstract

Método de crioconservación de huevos, nauplios y/o juveniles de percebes, comprendiendo el método las etapas que se realizan en el siguiente orden: - drenar el agua de los organismos, - añadir una solución crioprotectora de 5 a 8 M que comprende un crioprotector seleccionado del grupo que consiste en etilenglicol, propilenglicol, glicerol y dimetilsulfóxido o una mezcla de los mismos, - congelar la mezcla en un recipiente de acuerdo con las siguientes etapas posteriores: (i) congelar una primera velocidad de congelación lenta de no más de -1ºC min-1 hasta acercarse a la temperatura donde los organismos de la mezcla comienzan a cristalizar; (ii) congelar una segunda velocidad de congelación lenta de no más de -0,1ºC min-1 hasta que los organismos y el crioprotector de la mezcla estén completamente cristalizados; y (iii) una primera velocidad de congelación rápida a una temperatura de almacenamiento criogénico.

Description

DESCRIPCIÓN

Crioconservación de estadios juveniles de percebes

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para la crioconservación de huevos, nauplios y/o juveniles de percebes según la reivindicación 1. La invención también se refiere a un método para la revitalización de los organismos crioconservados. Además, la invención se refiere a un producto o alimento crioconservado y un uso.

Antecedentes de la invención

Las larvas de peces marinos son precoces cuando comienzan a alimentarse y dependen en gran medida de los organismos de alimentos vivos como su primera dieta. Las dietas artificiales, tales como las dietas de alimentos secos, se consideran subóptimas y con frecuencia conducen a altas tasas de mortalidad y a un crecimiento reducido cuando se utilizan en los estadios iniciales como dieta para las larvas de peces marinos. Hay varias razones para este fracaso de las dietas artificiales en la fase de alimentación inicial. Además de otras, las principales razones de este fracaso son generalmente menores tasas de ingestión de presas muertas y una digestibilidad reducida, pero también una pérdida del valor nutricional de los artículos de alimentación y una mayor carga orgánica en el agua. Por lo tanto, la alimentación inicial de las larvas de peces marinos depende en gran medida del suministro de presas vivas, que deben capturarse en la naturaleza o cultivarse para tal fin. Los organismos más comunes utilizados en la alimentación inicial de las larvas de peces marinos son los camarones de salmuera Artemia franciscana y diferentes cepas de rotíferos Brachionus sp. Estos organismos se cultivan típicamente en el sitio de acuicultura y se dan como alimento directamente como presas vivas. Aunque se utilizan ampliamente para este propósito, el valor nutricional de estos organismos es subóptimo para mantener el crecimiento, desarrollo y supervivencia óptimos de las larvas de peces marinos. Aunque se han desarrollado diferentes técnicas de enriquecimiento para mejorar su valor nutricional, tal como con los aceites marinos que tienen un alto contenido de ácidos grasos omega-3, su valor dietético todavía se considera subóptimo, lo que generalmente da como resultado tasas de mortalidad más altas, crecimiento reducido y en muchos casos, se desarrollan mal en comparación con las dietas basadas en presas capturadas en la naturaleza. Además, su cultivo y enriquecimiento son laboriosos y costosos.

La dieta natural de las larvas de peces marinos de agua fría es típicamente nauplios y copepoditos tempranos de copépodos en diferentes estadios, tales como Acartia, Calanus finnmarchicus etc. El uso de copépodos en la alimentación inicial da como resultado altas tasas de crecimiento comparables y una buena supervivencia. Dado que los copépodos se consideran una dieta óptima, se han realizado esfuerzos para mejorar su disponibilidad. Uno de los desafíos con el uso de copépodos para la alimentación inicial es que las capturas silvestres solo son posibles en ciertos períodos limitados del año cuando hay una eclosión de estos organismos en el mar. Además, deben usarse de inmediato, ya que es difícil almacenar presas vivas. Recientemente, se han desarrollado técnicas para cultivar copépodos, pero las técnicas de conservación, en particular para organismos en crecimiento, siguen siendo un desafío.

Por lo tanto, existe una gran necesidad de dietas de presas vivas alternativas en la alimentación inicial de las larvas de peces marinos. En particular, existe la necesidad de dietas de alimento vivo que no dependan del cultivo en el sitio de los organismos de presa o de las capturas silvestres dependientes de la temporada. Además, debido a los recursos pesqueros limitados en el mar y a una creciente demanda mundial de materia prima marina de alta calidad, en particular de lípidos marinos, existe una necesidad general de explotar otros recursos en el mar además de los peces, especialmente de aquellos organismos que se encuentran en un nivel trófico inferior tales como especies planctónicas e invertebrados marinos sin explotar. Para una explotación eficiente de estos recursos es necesario desarrollar nuevos métodos y técnicas.

La crioconservación es el uso de temperaturas muy bajas para conservar células y tejidos vivos estructuralmente intactos, pero también organismos. Utiliza el efecto beneficioso de la disminución de la temperatura para suprimir el movimiento molecular y detener las reacciones metabólicas y bioquímicas. Se necesitan procedimientos específicos con el fin de aprovechar los efectos protectores de la baja temperatura y almacenar con éxito células, tejidos u organismos durante períodos de tiempo prolongados en forma crioconservada.

Los métodos de crioconservación buscan alcanzar bajas temperaturas sin causar daños causados por la formación de hielo durante la congelación. Un tema importante es la efectividad de una posterior revitalización de las células y organismos conservados.

La mayoría de los estudios en este campo se refieren a la crioconservación de células, tejidos, gametos (espermatozoides) y embriones, principalmente de importancia médica y agrícola, incluidas especies de mamíferos, pero también de vertebrados no mamíferos e invertebrados.

Los métodos de crioconservación se basan generalmente en dos técnicas diferentes, que son técnicas de congelación lenta controlada y técnicas de congelación muy rápida (técnicas de vitrificación) tal como en nitrógeno líquido. La aplicación de un crioprotector en el procedimiento de conservación reducirá los efectos negativos que pueden ocurrir durante la crioprotección tales como efectos de solución, formación de hielo extracelular, deshidratación y formación de hielo intracelular.

Los crioprotectores se dividen normalmente en dos clases dependiendo de su aplicación y función en el procedimiento de conservación. Los crioprotectores intracelulares tienen un peso molecular bajo y permean las células. Los crioprotectores intracelulares tales como el glicerol y el dimetilsulfóxido se utilizan típicamente en concentraciones de 0,5 a 3 molar, de modo que minimizan el daño celular en muchos sistemas biológicos cuando se congelan lentamente. La elección del crioprotector y su concentración dependerá de muchos factores, tales como el tiempo de exposición antes y durante la congelación, su toxicidad biológica y la tolerancia individual del material biológico al producto químico. Típicamente, el material que se va a crioconservar usando crioprotectores penetrantes se incuba con el crioprotector durante un periodo suficientemente largo para que se alcance un equilibrio osmótico en concentración entre el crioprotector y el organismo que se va a conservar.

La técnica de congelación rápida normalmente usa crioprotectores extracelulares con un peso molecular relativamente alto que no penetran en las células. Los ejemplos son polivinilpirrolidona e hidroxietil-almidón. Estos son efectivos para proteger sistemas biológicos que se enfrían a velocidades rápidas, tal como en nitrógeno líquido. Algunos de estos crioprotectores extracelulares no penetrantes tienen efectos protectores directos en las membranas celulares, sin embargo, sus principales mecanismos de acción están relacionados con la introducción de la vitrificación, que es el proceso de formación de vidrio extracelular.

Es bien sabido a partir de muchos estudios de crioprotección, que diferentes células tienen diferentes requisitos para aplicar métodos de conservación óptimos. Deben definirse las condiciones óptimas para un número considerable de variables interrelacionadas. Especialmente, la crioconservación de tejidos y organismos multicelulares complejos a menudo va acompañada de problemas interesantes y formidables, p. ej., la formación de hielo extracelular. Además, el tamaño del organismo que se va a conservar influye en el procedimiento de crioconservación. En general, los organismos más pequeños son más fáciles de conservar mediante técnicas de congelación lenta, ya que el equilibrio es más fácil de lograr en comparación con los organismos más grandes.

Uno de los principales desafíos en la crioconservación es la falta de métodos adecuados para conservar lotes más grandes según sea necesario en aplicaciones a escala industrial, tal como para piensos. Normalmente, las técnicas de crioconservación se aplican a escala de microlitros o mililitros, por ejemplo, en viales pequeños o pajitas con un volumen entre 0,5 y 1,5 ml. Por tanto, la aplicación de las técnicas conocidas se limita en general a pequeñas cantidades y no es adecuada para cantidades mayores.

Khin-Maung-Oo et al. 1998 (Khin-Maung-Oo et al. Cryopreservation of Nauplius Larvae of the barnacle, Balanus amphitrite Drawin, Fisheries Science, 64 (6): 857-860) describen un método para la crioprotección de larvas de nauplio de la especie Balanus amphitrite a pequeña escala en pajitas crioprotectoras. Un método preferido incluía drenar el agua de los nauplios en estadio II y equilibrarlos durante 20 min en dimetilsulfóxido 1,5 M como crioprotector en agua de mar al 29%0. Los nauplios se enfriaban de 20°C a -12°C con 5°C/min, se mantenían a -12°C durante 10 min y luego se congelaban a -30°C a una velocidad de 0,5°C/min, se mantenían durante 20 min a -30°C y se congelaban rápidamente a -196°C.

Gakhova et al. 1990 (Gakhova E.N. Freezing of barnacle larvae Balanus improvises to minus 196°C. Biologiya Morya (Valdivstock) (4): 62-65) describen otro método para la crioconservación de nauplios II de Balanus improvisa en un procedimiento de congelación de dos etapas. Se congelaron 200 pl de una suspensión de nauplios/crioprotector en tubos de plástico a una velocidad de 6 a 6,7°C/min a una temperatura entre -38 y -42°C, se mantuvieron durante 10 min a esta temperatura y luego se transfirieron a nitrógeno líquido.

Anil et al. 1997 (Anil A.C., Tulaskar, A.S., Khandeparkar D. C. y Wagh, A.B. Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii. Cryobiology 34, 131-140) describen un método para la crioconservación de nauplios de Balanus amphitrite utilizando tres crioprotectores diferentes (etilenglicol, dimetilsulfóxido y glicerol), en donde las larvas mostraron una susceptibilidad creciente a la concentración de crioprotector aplicado. Una concentración de etilenglicol de 3 a 4 M no causaba daño después de un tiempo de equilibrio de hasta 2 h. Los nauplios se han crioconservado en pequeños volúmenes (pajitas) en un procedimiento de congelación lenta de dos etapas combinado con una siembra inicial a -8°C. La velocidad de congelación era de 5°C/min de 20 a 0°C, 1°C/min de 0 a -8°C. Después de la siembra, la velocidad de enfriamiento era de 0, 3°C/min por congelación lenta hasta alcanzar al menos -20°C, donde la temperatura se mantenía durante 20 min. A continuación, las pajitas se transfirieron a nitrógeno líquido. Las muestras se transfirieron a nitrógeno líquido cuando alcanzaron -40°C después de poco más de 2 horas. Anil et al. describieron una revitalización de 90% una hora después de la descongelación. Sin embargo, la revitalización fue solo de 35% después de 24 horas.

Problema técnico objetivo de la invención

La presente invención tiene como objetivo proporcionar un método para conservar y revivir percebes, en particular con el foco en los estadios tempranos de la vida, es decir, sus huevos, estadios embrionarios, larvales y juveniles. Más en particular, la presente invención tiene como objetivo proporcionar un protocolo de crioconservación para la crioconservación eficaz de estos organismos que habitualmente habitan en la zona litoral marina. Además, la presente invención tiene como objetivo mejorar la explotación de nuevas especies marinas que sean adecuadas como dieta para fines de alimentación inicial, tales como para la alimentación inicial de larvas de peces marinos, y proporcionar métodos que permitan explotarlas con el foco en un aplicación industrial. Otro propósito de la presente invención es proporcionar un método para el almacenamiento a largo plazo de organismos como alimento vivo que puedan usarse para reemplazar de manera eficiente los regímenes actuales de alimento vivo en la producción de acuicultura marina. En particular, la presente invención tiene como objetivo proporcionar un método para la crioprotección a gran escala (cantidades) de organismos que se pueden usar como organismos como alimento vivo en la producción de acuicultura, tal como en la alimentación inicial de larvas de peces marinos precoces.

Otro propósito de la presente invención es proporcionar un método de crioconservación para percebes mediante el cual se logra una alta revitalización durante periodos más largos después de la descongelación. Esto es particularmente importante cuando se usa como alimento inicial, ya que el consumo de los organismos revividos p. ej. por las larvas de peces marinos típicamente no es inmediato, sino que lleva tiempo después de su adición a las unidades de cultivo de larvas de peces. Por tanto, es importante una supervivencia a largo plazo de la presa durante varias horas o días.

Otro propósito de la presente invención es proporcionar un método eficaz para la crioconservación de grandes volúmenes por unidad adecuado para especies de percebes que tienen nauplios grandes.

Otro propósito de la presente invención es proporcionar un método para la producción de alimento crioconservado en partículas que tiene una alta tasa de revitalización.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a protocolos de crioconservación para conservar y revivir varios estadios de vida tempranos (huevos, nauplios y juveniles) de especies de percebes. Un propósito principal de la invención se refiere a la producción de un producto almacenable conservado que comprende estos organismos de alimento vivo que pueden reemplazar o complementar los regímenes actuales de alimento vivo en la producción de acuicultura marina.

Así, según un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la crioconservación de huevos, nauplios y/o juveniles de percebes, comprendiendo el método las etapas llevadas a cabo en el siguiente orden:

- drenar agua de los organismos,

- añadir una solución de crioprotector de 5 a 8 M que comprende un crioprotector seleccionado del grupo que consiste en etilenglicol, propilenglicol, glicerol y dimetilsulfóxido o una mezcla de los mismos,

- congelar la mezcla en un recipiente de acuerdo con las siguientes etapas posteriores:

(i) congelar una primera velocidad de congelación lenta de no más de -1°C min-1 hasta acercarse a la temperatura donde los organismos de la mezcla comienzan a cristalizar;

(ii) congelar una segunda velocidad de congelación lenta de no más de -0,1°C min-1 hasta que los organismos y el crioprotector de la mezcla estén completamente cristalizados; y

(iii) una primera velocidad de congelación rápida a una temperatura de almacenamiento criogénico.

En el contexto de la invención se describe que la relación volumétrica entre la solución crioprotectora y los organismos drenados puede ser de al menos 1:4, entre 1:4 y 2:1, o entre 1:4 y 1:1. Esto significa que en la mezcla al menos aproximadamente 20% del volumen debe ser crioprotector y 80% organismos.

En un método preferido, la primera velocidad de congelación lenta es de -0,5°C min-1 o menos, preferiblemente -0,3°C min-1 o menos, más preferiblemente -0,1°C min-1 o menos.

Opcionalmente, se puede realizar una etapa de equilibrado antes de la primera etapa de congelación, preferiblemente con una duración de 5 a 60 minutos, más preferiblemente entre 15 y 30 minutos, lo más preferiblemente aproximadamente de 15 minutos. La ventaja de esta etapa de equilibrio es que las primeras velocidades de congelación lenta generalmente pueden ser más altas que si se omite esta etapa, sin afectar el producto final. También se describe que la etapa de equilibrio puede combinarse con una primera velocidad de congelación lenta de -0,5 a -1 °C. Los períodos de equilibrio de más de 60 minutos son menos preferidos y típicamente dan como resultado una viabilidad reducida después de la congelación.

El periodo de equilibrio puede acortarse a menos de 15 minutos o incluso omitirse totalmente, en particular si la velocidad de congelación es inferior a -0,5°C min-1. Aunque se podía mostrar que los percebes tienen una alta tolerancia a los crioprotectores, la ventaja de un periodo de equilibrio más corto es una menor exposición de los organismos y un procedimiento de congelación más eficaz en tiempo. Mediante la presente invención fue posible mostrar que los nauplios de percebe no se ven afectados negativamente por un periodo de equilibrio acortado u omitido cuando se usa una primera velocidad de congelación lenta de acuerdo con la presente invención. Sorprendentemente, los organismos no parecen depender de alcanzar el equilibrio antes del inicio de la congelación.

Por ejemplo, cuando se utiliza una velocidad de congelación de menos de -0,52C mim1 es suficiente con un equilibrado durante dicho procedimiento de congelación lenta antes de que se obtenga la cristalización. La ventaja sin una etapa de equilibrio es un procedimiento simplificado que comprende menos etapas individuales que llevar a cabo.

En una realización preferida, la segunda velocidad de congelación lenta está entre -0,015 y -0,1°C min-1 y preferiblemente entre -0,04 y -0,08°C min-1. Se prefiere particularmente una segunda velocidad de congelación lenta de -0,05°C min-1 y lo más preferido de -0,04°C min-1. Esto tiene la ventaja de que la congelación es especialmente suave y que se consigue una distribución de temperatura muy homogénea, lo cual permite volúmenes o masas más grandes tratadas en la misma unidad.

También se describía que la segunda velocidad de congelación lenta puede durar hasta acercarse al menos a -30°C, o alternativamente a al menos -35°C, a al menos -36°C, o de -38 a -46°C.

Preferiblemente, los organismos drenados tienen un contenido en peso seco de 6 a 14% después del drenaje, más preferiblemente entre 8 y 12% y lo más preferido de aproximadamente 10%.

También se describe que la solución crioprotectora puede comprender de 2,0 a 4,5% de NaCl, de 3,0 a 3,8% de NaCl o 3,2 a 3,8% de NaCl.

Se prefiere además que la concentración del crioprotector que se va a añadir a los organismos esté entre 6 y 8 M, más preferido entre 6,5 M y 7,5 M, y lo más preferido 7,2 M. Preferiblemente, el crioprotector es una mezcla de etilenglicol y propilenglicol, preferiblemente en una mezcla de aproximadamente 50% cada uno, más preferiblemente de aproximadamente 75% de etilenglicol y 25% de propilenglicol.

También se describía que la etapa de equilibrado opcional se puede realizar a una temperatura entre 0 y 10°C, entre 3 y 8°C, y aproximadamente a 5°C. Las temperaturas inferiores a 5°C pueden dar como resultado una menor viabilidad.

El método según la presente invención está particularmente desarrollado y es adecuado para grandes cantidades y volúmenes de organismos. Preferiblemente, la cantidad de material para crioconservar en una unidad es de al menos 5 g a 10 g, preferiblemente al menos de 10 a 50 g, más preferiblemente al menos de 50 a 100 g, lo más preferiblemente entre 200 g y 2000 g.

También se describe que la mezcla del crioprotector y los organismos se puede poner en un recipiente adecuado para la crioconservación antes de la etapa de equilibrio o directamente después. Dicha mezcla en el recipiente puede tener un espesor máximo durante el procedimiento de congelación de no más de 100 mm, de no más de 50 mm o de 10 mm o menos.

Preferiblemente, la primera velocidad de congelación lenta finaliza cuando se acerca a una temperatura homogénea en el material de aproximadamente -10 a -13°C, preferiblemente de aproximadamente -12 a -13°C.

Los tiempos de congelación prolongados y las velocidades de congelación lentas son importantes para la calidad del producto final cuando se conserva de acuerdo con la presente invención. Esto es particularmente relevante cuando se conservan grandes cantidades o volúmenes. Preferiblemente, el procedimiento de congelación total dura al menos 5 horas, más preferiblemente entre 6 y 10 horas, incluso más preferiblemente entre 10 y 12 horas y lo más preferiblemente más de 12 horas. De este modo, se consiguen elevadas viabilidades.

En otra realización preferida, los organismos se crioconservan en volúmenes de 5 a 50 ml, preferiblemente en 10 a 25 ml, en moldes de tamaño adecuado. Preferiblemente, dichos moldes están hechos de silicona. Los organismos se pueden crioconservar en placas o bolsas y las placas o bolsas con organismos crioconservados se pueden triturar en partículas más pequeñas en nitrógeno líquido, de modo que las partículas obtenidas se almacenan preferiblemente sin ningún envasado en nitrógeno líquido. La ventaja de la producción de partículas o gránulos más pequeños es, p. ej., en un uso posterior como organismos de alimentación inicial. Esto facilitará su revitalización y dosificación durante la alimentación como alimento vivo.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un método para revitalizar los organismos crioconservados según cualquiera de los párrafos anteriores, aplicando cualquiera de los métodos seleccionados de

- descongelación en un baño de agua tibia a 30-40°C;

- trituración del material congelado y lavado con agua de mar que fluye fría a 10°C o menos, y luego revitalización a <5°C durante un máximo de 36 horas; o

- trituración del material congelado e incubación en agua de mar con aireación a 10°C o menos, y luego revitalización a <5°C durante un máximo de 36 horas. Los organismos descongelados se pueden adaptar opcionalmente después de la descongelación a la temperatura del agua en el cultivo de peces al que se va a alimentar con estos.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un producto o alimento crioconservado caracterizado por que se obtiene por cualquiera de los métodos reivindicados descritos en los párrafos anteriores relacionados con el método de crioconservación.

También se describe un producto o alimento crioconservado que comprende estadios de vida tempranos de percebes por el cual los percebes son crioconservados usando etilenglicol o etilenglicol mezclado con propilenglicol o glicerol como crioprotector, preferiblemente añadido al organismo en una concentración de 6 a 8 M.

Finalmente, la presente invención se refiere a un uso de estadios de vida tempranos crioconservados y revividos de percebes como alimento vivo para larvas de peces marinos e invertebrados.

Las realizaciones preferidas se definen en las reivindicaciones dependientes.

Se apreciará que las características de la invención descritas anteriormente se pueden combinar en cualquier combinación sin apartarse del alcance de la invención.

Descripción detallada de la presente invención, realizaciones preferidas y ejemplos ilustrativos.

La presente invención se refiere a crioprotocolos para conservar y revivir varios estadios de la vida tempranas (huevos, nauplios y juveniles) de especies de percebes. Uno de los objetivos principales de la invención se refiere a la producción de un producto almacenable conservado que comprende estos organismos de alimento vivo que pueden reemplazar o complementar los regímenes actuales de alimentos vivos en la producción de acuicultura marina.

El método de crioconservación de acuerdo con la presente invención incluye la crioconservación mediante técnicas de congelación muy lenta con varias etapas utilizando altas concentraciones de crioprotectores (crioconservantes) identificados a continuación. El método según la presente invención se ha desarrollado para lotes grandes (típicamente adecuados para varios cientos de gramos por unidad a congelar en una unidad), que antes no era posible crioconservar eficazmente. Una gran ventaja de la presente invención es que el método es adecuado para una crioconservación a gran escala/escala industrial de estadios de vida tempranos de percebes y en particular para una producción a gran escala automatizada para obtener un nuevo producto de percebe adecuado como alimento inicial. El método también es adecuado para producir un material en partículas o gránulos adecuados para p. ej. la alimentación inicial de peces (como organismos de alimento vivo).

Las velocidades de congelación para cada uno de las etapas en el protocolo descrito pueden variar dependiendo de la cantidad y/o dimensiones del material (en particular su extensión en ancho) en cada unidad que se va a congelar. Sin embargo, se deben cumplir ciertas condiciones con el fin de obtener resultados óptimos (es decir, organismo viable, no dañado después de la revitalización posterior). Dependiendo de la etapa, se encontró que una distribución sustancialmente homogénea de la temperatura en todo el material durante el procedimiento de congelación es crítica con el fin de lograr buenos resultados. Esto es especialmente crítico desde aproximadamente -10 a -13°C en adelante en el procedimiento de congelación, donde los organismos, cuando se mezclan con el crioprotector, típicamente comienzan a cristalizar y en particular entre -20 y -25°C cuando el crioprotector, p. ej. el etilenglicol que rodea a los organismos, normalmente comienza a cristalizar o cristaliza. El intervalo de temperatura exacto para la temperatura de cristalización puede variar de -20 a -25°C dependiendo de la elección del o de los crioprotectores y la cantidad de sal en la solución. Un punto particularmente crítico identificado para el éxito del método según la presente invención es evitar o limitar un aumento de temperatura en el material debido a la liberación de calor dentro del intervalo de temperatura donde los organismos cristalizan, es decir, alrededor de -10 a -15°C, en particular entre -12 y -13°C. Un crioprotocolo de ejemplo comprende las siguientes características y etapas:

Como primera etapa, se drena el agua de mar de los organismos que se van a conservar. El drenaje se puede lograr, p. ej., usando redes o filtros con una malla o tamaño de poro adecuado para retener a los animales. Típicamente, el contenido de materia seca de percebes tales como Semibalanus balanoides o Balanus crenatus, es aproximadamente 10% después del drenaje. Aunque esto puede variar dependiendo del organismo y sus características para retener agua. Por tanto, el contenido en peso seco puede variar de 6-14% sin afectar significativamente a la calidad del producto final.

A continuación, los organismos drenados se mezclan con una solución madre de un crioprotector. Se describe que se utiliza etilenglicol (solución madre de etilenglicol 7,2 molar en solución salina que comprende entre 3 y 4% de NaCl, en particular aproximadamente 3,5% de NaCl) como crioprotector, en una relación en volumen de crioprotector a organismos de 1:4 a 1:1. La salinidad de la solución madre puede variar. Por razones prácticas, generalmente se usa agua de mar en la solución madre, a la que se añade sal (NaCl) para obtener la mayor salinidad. Es importante utilizar altas concentraciones de crioprotector para obtener resultados óptimos en la crioconservación. En general, la concentración del crioprotector añadido debe estar dentro del intervalo de 5 a 8 M de crioprotector, preferiblemente entre 6 y 8 M, lo más preferiblemente aproximadamente 7,2 M. También se describe que la concentración del crioprotector puede ser de al menos 6 M de crioprotector, o al menos 7 M.

Se mostró que la adición de sal en la solución crioprotectora mejora la revitalización de los nauplios en comparación con la no adición de sal. Especialmente se mejoró la actividad de nadar. Por tanto, se describe que la concentración final de sal de NaCl está entre 2,0 y 4,5%, entre 3,0 y 3,8% o entre 3,2 y 3,8%.

En otra realización preferida, el etilenglicol se reemplaza por una mezcla de etilenglicol y propilenglicol como crioprotector. Los mejores resultados se obtuvieron cuando se utilizó una mezcla de 75% de etilenglicol y 25% de propilenglicol. Es posible una sustitución de 50% del etilenglicol, pero menos óptima en términos de supervivencia después de la revitalización. Una sustitución de 75% del etilenglicol todavía daba como resultado cierta supervivencia. Además, la sustitución de 25% del etilenglicol por glicerol proporcionaba una supervivencia bastante buena, pero no tan buena como cuando se usaba 25% de propilenglicol con 75% de etilenglicol o solo se usaba etilenglicol como crioprotector. La ventaja de sustituir el etilenglicol por propilenglicol o glicerol es una menor toxicidad generalmente reconocida del propilenglicol y glicerol. Esto es beneficioso si el organismo crioconservado se utilizará como alimento para las larvas de peces marinos, ya que se sabe que estos son muy sensibles a los productos químicos, incluido el etilenglicol. En otra realización, se usa dimetilsulfóxido (DMSO) como agente de crioconservación. El DMSO es menos preferido en caso de una aplicación posterior como alimento vivo debido a su mayor toxicidad generalmente reconocida.

La mezcla de crioprotector y organismos puede obtenerse directamente en recipientes adecuados tales como sacos, paquetes y bolsas o transferirse a estos después de mezclar. Se pueden utilizar diferentes tipos de materiales para el envasado siempre que estos sean adecuados para soportar el procedimiento de congelación, almacenamiento y posterior descongelación. Por lo general, se pueden aplicar recipientes, sacos, moldes o bolsas de plástico resistentes al frío. Otro material adecuado es el silicio. Un ejemplo de una bolsa que se utiliza para este propósito tiene las siguientes dimensiones: 500 mm x 190 mm x 10 mm. Esta bolsa es adecuada para contener aproximadamente 600 g de la mezcla. Dependiendo de la proporción elegida entre crioprotectores y organismos, una bolsa de este tamaño puede contener típicamente entre 300 y 450 g de percebes para conservar. Las cantidades (mezcla de organismos y crioprotectores) en cada unidad a congelar de acuerdo con la presente invención están típicamente en el intervalo de 50 g a 1000 g. En algunas aplicaciones, se pueden preferir cantidades más pequeñas por unidad para conservarlas individualmente, tales como 5, 10, 20 o 25 g. Sin embargo, el experto comprenderá que la presente invención no se limita a estas cantidades y dimensiones particulares. Son posibles otras dimensiones y cantidades de material para las bolsas siempre que se pueda lograr una congelación controlada y una distribución de temperatura suficientemente uniforme en cada unidad durante el siguiente procedimiento de congelación. Esto depende en particular del espesor del paquete/saco, que preferiblemente no debe exceder 50 mm, más preferiblemente 10 mm y lo más preferiblemente 5 mm (realizaciones que no forman parte de la invención).

Sorprendentemente, se mostró mediante la presente invención que un periodo de equilibrio antes del inicio del procedimiento de congelación según el protocolo de la presente invención, no es esencial para el éxito del procedimiento. Por tanto, se pudo demostrar que se puede omitir una etapa de equilibrio definido totalmente sin afectar a la velocidad de revitalización de los organismos cuando se crioconservan según la presente invención cuando la primera velocidad de congelación es lenta antes de la cristalización.

Se describe que el crioprotector se debe añadir al organismo a una temperatura de 5 a 10°C. Las temperaturas más bajas son menos preferidas. Temperaturas de aproximadamente 0°C dan como resultado una viabilidad reducida.

Opcionalmente, el método de crioconservación de la presente invención se puede combinar con un periodo de equilibrio. Si se realiza, el periodo de equilibrio puede durar típicamente entre 15 y 60 minutos. Periodos que sean superiores a 60 minutos, p. ej. 120 minutos, pueden afectar negativamente a la viabilidad. La temperatura durante el equilibrio puede estar dentro del intervalo de 5°C a 10°C, y se prefiere aproximadamente 5°C durante esta fase para una absorción eficaz del crioprotector. Se supone que una temperatura por debajo de 20°C y en particular de 5°C es beneficiosa en el procedimiento debido a una actividad metabólica generalmente menor de los organismos en esta fase que puede tener un efecto protector. Puede utilizarse un tiempo de equilibrio de 15-30 minutos a 5°C. Sin embargo, los ensayos realizados en relación con la presente invención han mostrado que incluso un periodo de equilibrio de 24 horas con etilenglicol helado 7,2 M (solución madre) como crioconservante no daña considerablemente los nauplios de percebe de Semibalanus balanoides en un ensayo de toxicidad. Esto indica una tolerancia muy alta a los crioprotectores en altas concentraciones y durante largos periodos. La presente invención aprovecha esta tolerancia sorprendentemente alta a concentraciones altas de crioprotector incluso cuando se expone durante periodos muy largos tal como durante el procedimiento de congelación de la presente invención. Durante el procedimiento de congelación muy lento de acuerdo con la presente invención, los organismos se exponen a esta alta concentración de crioprotector durante largos periodos cuando se congelan dichos lotes más grandes en comparación con el método previamente conocido de la técnica anterior utilizando pajitas. El procedimiento de congelación según la presente invención dura varias horas, preferiblemente al menos 12 horas, desde la temperatura de equilibrio (p. ej., 5°C), respectivamente la temperatura cuando se añade el crioprotector, a la temperatura cuando la mezcla se transfiere al nitrógeno líquido (típicamente de aproximadamente -39 a -43°C, opcionalmente de -30°C o -35°C). Se encuentra que es óptimo que el procedimiento de congelación dure al menos 5 horas, al menos 8 horas, lo más preferiblemente de 12 a 16 horas. El procedimiento de congelación puede durar incluso 24 horas o más. Estos tiempos de congelación muy largos se reconocieron en el contexto de la presente invención como necesarios para lograr una alta tasa de revitalización de los organismos cuando se congelan en dichas unidades de lotes grandes. Así, los periodos de exposición durante el procedimiento de congelación son mucho más largos en comparación con las técnicas comúnmente conocidas aplicadas en pequeños volúmenes tales como pajitas o cuando se utilizan técnicas de congelación rápida basadas en vitrificación.

Después de la etapa de equilibrio, respectivamente después de que se haya añadido el crioprotector, el recipiente que contiene la mezcla se transfiere a un congelador, típicamente un congelador de velocidad controlada que permite controlar las velocidades de congelación. El recipiente (p. ej., saco, molde o bolsa) está provisto de medios adecuados para controlar la temperatura dentro del material. Estos medios para el control de la temperatura son bien conocidos por el experto en la técnica y, por lo tanto, no se explican con más detalle. A continuación, la mezcla se trata mediante dos procedimientos posteriores de congelación lenta. Durante todo el procedimiento de congelación, es fundamental que la velocidad de congelación aplicada dé como resultado una distribución de temperatura homogénea dentro del material. De ese modo, se previene o reduce el daño al organismo. La velocidad de congelación no debe exceder preferiblemente -12C min-1 durante la primera velocidad de congelación lenta. Más preferiblemente, la velocidad de congelación debe ser de -0,5°C min-1 o menos.

Como ejemplo, para una bolsa plana (espesor de aproximadamente 10 mm que comprende aproximadamente 600 g de la mezcla y puesta en un congelador de velocidad controlada) típicamente se aplica una velocidad de congelación en el material de -0,05 a -0,5°C por minuto entre aproximadamente 5°C y aproximadamente -12°C.

A menudo, se observa un subenfriamiento de la mezcla durante el procedimiento de congelación, y cuando la temperatura desciende a p. ej. -15°C, aumenta a aproximadamente -13°C donde los organismos cristalizan. El calor latente de fusión (liberación de energía) provoca este aumento de temperatura. El subenfriamiento es variable y, a menudo, solo se observa un aumento de temperatura de 0,5°C o ningún aumento de temperatura, mientras que otras muestras pueden tener un aumento de temperatura de hasta 3°C. Un aumento de temperatura de p. ej. aproximadamente 3°C debido a la cristalización del crioprotector no parece afectar negativamente a los organismos comprendidos en la mezcla.

Si se usa etilenglicol como crioprotector (es decir, 7,2 molar en NaCl al 3% antes del equilibrio) en la mezcla, típicamente comenzará a cristalizar aproximadamente de -20 a -25°C. La temperatura de cristalización exacta de los organismos y el crioprotector también dependerá del contenido de agua de mar restante en el material drenado antes del equilibrio, así como del contenido de sal en la solución crioprotectora. Por ejemplo, un contenido de agua más bajo da como resultado por lo tanto una temperatura de cristalización más alta de los organismos en la mezcla de crioprotector, p. ej. a aproximadamente -16°C con un 12% en peso seco del material drenado y a aproximadamente -12°C con un 9% en peso seco del material. Dependiendo de la técnica de congelación utilizada, se puede aplicar una velocidad de congelación más alta en esta fase, tal como cuando se usa un congelador con gas circulante o un congelador de líquido que permite una transferencia y distribución de temperatura más eficiente que un congelador lleno de aire y similares.

Sin embargo, es muy importante que se logre una distribución de temperatura homogénea en todo el material cuando se alcance de -12°C a aproximadamente -25°C.

Es muy importante que la disminución de temperatura sea muy baja en la segunda etapa de congelación lenta de -20°C a aproximadamente de -40 a -42°C, cuando la mezcla se transfiere a nitrógeno líquido. Esto es importante para obtener una eficiencia de revitalización óptima del organismo congelado cuando se conserva en dichas grandes cantidades. En particular, debe evitarse o limitarse un potencial aumento de temperatura causado por la cristalización de la mezcla de crioprotector/organismo, ya que se encontró que esto puede afectar críticamente la eficacia de revitalización posterior. La velocidad de congelación debe ser como máximo de -0,3 °C min-1, preferiblemente no más de -0,1°C min-1 y más preferiblemente no más de -0,05°C min-1. Se lograron resultados particularmente buenos (viabilidad) mediante una segunda velocidad de congelación lenta de -0,04°C.

Alternativamente a esta velocidad de congelación muy baja en la segunda etapa de congelación, la temperatura se puede mantener constante alrededor de aproximadamente ■ -12 a -13°C y de -22 a -23°C durante un periodo más largo, típicamente de 0,5 a 3 horas dependiendo del espesor del producto envasado, hasta que se logre una distribución de temperatura homogénea antes del inicio de la cristalización. Después de un periodo de mantenimiento de 0,5-3 horas de -22 a -23°C, la velocidad de congelación no debe superar los -0,15 °C min-1, y preferiblemente no más de -0,08 °C min-1. Utilizando tiempos de mantenimiento, las segundas velocidades de congelación lenta en particular pueden elegirse algo más altas que cuando no se aplican tiempos de mantenimiento.

Es importante que el calor producido durante la etapa de cristalización se libere antes de que la temperatura se reduzca más. En particular, cuando se utiliza un congelador de aire, es importante que la temperatura, es decir, del aire circundante en el congelador, se mantenga lo más constante y estable posible durante la liberación de temperatura mencionada (en particular entre ■ -10 a -13°C y -20 a -25°C) evitando o minimizando de esta manera eficientemente un aumento de temperatura en el producto. De lo contrario, puede ocurrir una cristalización de hielo dañina que puede afectar negativamente la tasa de revitalización de los animales.

Cuando se alcanza de aproximadamente -39 a -43°C, el material congelado, típicamente en forma de placas, se transfiere a nitrógeno líquido para su congelación adicional (primera etapa de congelación rápida) y almacenamiento a una temperatura criogénica. El almacenamiento de las placas se puede hacer de diferentes formas, tal como en nitrógeno líquido o en un congelador adecuado para almacenamiento criogénico.

Las placas incluso se pueden triturar hasta partículas sin ningún envasado exterior antes de añadirlas al recipiente de almacenamiento.

El tiempo que se utilizará en el procedimiento de congelación para cantidades mayores es típicamente de al menos entre 5 y 10 horas, más preferiblemente entre 10 y 12 horas, lo más preferiblemente más de 12 horas dependiendo del recipiente (p. ej., el espesor de las bolsas) y el congelador utilizado.

Para lograr buenos resultados, todo el procedimiento de crioconservación (comenzando desde el equilibrio de 30 min) de acuerdo con la presente invención para estas cantidades mayores mencionadas no debe realizarse más rápido que en el espacio de 6 a 8 horas. Un tiempo de congelación por debajo de 5 horas da como resultado cierta viabilidad, pero no se encontró óptimo para lotes más grandes, donde los tiempos de congelación más largos en general daban como resultado una mejor supervivencia que los tiempos más cortos. Típicamente, el procedimiento dura entre 12 y 24 horas, dependiendo de los volúmenes utilizados en el procedimiento de congelación. En lugar de usar un congelador en el que el aire se enfría dentro del congelador, se puede usar un congelador de líquido. En el último caso, los tiempos de congelación pueden reducirse debido a un control más eficiente del procedimiento de congelación y liberación de calor.

Mediante el método de acuerdo con la presente invención, se pueden crioconservar huevos, nauplios y cipris de percebes a gran escala, p. ej. en entidades de aproximadamente 5 g a más de un kg. El procedimiento normal en el campo de la crioconservación es crioconservar los organismos en una escala de mililitros o microlitros, tales como en viales y pajitas (típicamente 0,5-1,5 ml). Para lograr dicha crioconservación a gran escala, se utilizan agentes de crioprotección (crioprotectores) en concentraciones más altas de lo que se prevé que será tolerado por dichos organismos diana durante periodos más prolongados, tal como en el procedimiento inicial de congelación de 2 etapas muy lento aplicado según la presente invención. Típicamente, con el procedimiento de congelación lenta durante tiempos tan prolongados, se espera que una concentración final más alta de crioprotector superior a aproximadamente 3,2 molar dé como resultado un efecto tóxico durante una exposición a largo plazo que resulte en una mortalidad masiva del organismo que se va a crioconservar.

Por tanto, una de las principales ventajas de este método es la posibilidad de crioconservar grandes volúmenes en la misma unidad. Las técnicas previamente conocidas no funcionan, ya que no son adecuadas para estos volúmenes más grandes, lo que resulta en eficiencias de revitalización bajas o nulas. En el contexto de la presente invención, se consigue una revitalización satisfactoria si los organismos muestran movimientos de nadar normales cuando se revitalizan.

La crioconservación según la presente invención está desarrollada y aprobada para las primeras etapas de vida de percebes que habitan la zona litoral. Típicamente, estos organismos han desarrollado proteínas anticongelantes protectoras endógenas para soportar un ambiente frío.

Cuando se conservan cantidades mayores (número de animales) en el mismo lote para crioconservar juntos, se puede mostrar que un procedimiento de congelación muy lento es de gran importancia con el fin de lograr una distribución de temperatura homogénea en todo el material. Mediante el protocolo de crioconservación según la presente invención que se basa en una congelación muy lenta, tiempos de congelación prolongados, en combinación con una alta concentración de crioprotector tal como el etilenglicol, así como una concentración de salinidad definida, era posible lograr una viabilidad alta y reproducible de los organismos conservados incluso cuando se conservan en estas grandes cantidades de congelación.

Utilizando el protocolo descrito en la presente invención, se pueden crioconservar huevos larvas y juveniles de especies de percebes. Ejemplos de estos son las especies Semibalanus balanoides y Balanus crenatus. Los nauplios de la primera especie son más grandes que los nauplios de percebes crioconservados conocidos de la técnica anterior, tales como Balanus amphithrite y Balananus improvisus. Los organismos más grandes son generalmente más difíciles de conservar por métodos de crioconservación, en particular en métodos en los que debe alcanzarse un equilibrio osmótico. Balanus crenatus (240 gm de longitud, 100 gm de ancho) tiene nauplios sustancialmente más pequeños en comparación con Semibalanus balanoides (320 gm de longitud, 150 gm de ancho).

Más comúnmente, los crioprotectores, en particular los que penetran en las células, se utilizan en volúmenes muy altos. Típicamente, la relación en volumen de crioprotector a material biológico debe ser de 1:1. En la presente invención se encontró que se puede usar un volumen mucho menor de crioprotector sin afectar a la eficacia de revitalización. Por tanto, es posible usar un volumen de 20-25% de crioprotector a 70-75% de material de percebe cuando se usa el método de la presente invención. Esto es claramente una ventaja ya que se reduce el uso de estos productos químicos, que a menudo son bastante tóxicos, y se reduce el volumen total a manipular y almacenar. Además, se reduce la cantidad de residuos químicos cuando se revitalizan los percebes.

Otro aspecto nuevo de la presente invención es que el tiempo habitualmente proporcionado para obtener un equilibrio osmótico con el crioprotector añadido antes de la congelación con el fin de evitar la cristalización intracelular parece ser de menor importancia para los percebes que para otros organismos.

Aparte del etilenglicol, se pueden usar otros crioprotectores conocidos con el método de la presente invención tales como DMSO, así como mezclas de etilenglicol y propilenglicol o glicerol.

En el contexto de la presente invención, se pretende que las primeras etapas de vida de los percebes incluyan huevos, larvas (p. ej., estadios de nauplios) y juveniles de estos organismos. En particular, se incluyen los estadios planctónicos de vida libre de estos organismos marinos, tales como los estadios meroplanctónicos.

La distribución homogénea de la temperatura debe entenderse como que la temperatura no varía o solo varía en un grado muy bajo dentro de la mezcla (producto).

Alcanzar una temperatura debe entenderse de manera que se obtenga una temperatura homogénea definida adicionalmente ± 2°C dentro del material durante la crioconservación.

La temperatura de cristalización de los organismos en la mezcla se puede determinar midiendo el aumento de temperatura (liberación de energía) en la mezcla que ocurre durante su cristalización. Este aumento se produce a menudo a una temperatura más baja, es decir, más tarde en el procedimiento de congelación, que la liberación debido a la cristalización del crioprotector según la presente invención. Para los organismos en la mezcla es típicamente aproximadamente -13°C, mientras que el crioprotector, p. ej. el etilenglicol cristaliza aproximadamente de -20 a -22°C.

La conservación a gran escala debe entenderse como que el método es adecuado para la crioconservación de cantidades en la misma unidad o lote, que son significativamente más altas que las cantidades típicamente crioconservadas en técnicas conocidas tales como en pajitas pequeñas y escala de microlitros o mililitros. Típicamente son cantidades de 5 gramos o mayores (varios cientos de gramos o incluso más de 1 kg), que se conservan simultáneamente al mismo tiempo y en la misma unidad (recipiente). Sin embargo, esto no excluye que el método pueda usarse para volúmenes o cantidades más pequeños si se desea. Por tanto, el experto en la técnica comprenderá que el método no se limita a un uso exclusivo en la crioconservación a gran escala, sino que también se puede utilizar con cantidades y volúmenes más pequeños.

Revivir organismos crioconservados

La revitalización eficaz de los organismos crioconservados se puede lograr utilizando diferentes métodos. Las bolsas que comprenden los organismos congelados se pueden descongelar en un baño de agua de 30 a 40°C, por lo que es importante que las bolsas se amasen de forma más o menos continua para lograr una distribución de temperatura homogénea dentro de las bolsas. Después de descongelar, los organismos se vierten sobre un filtro de malla de 100 pm y se lavan con agua de mar (preferiblemente a menos de 10°C) para eliminar el crioprotector. Después del lavado, los nauplios se revitalizan en agua de mar aireada (a menos de 5°C, preferiblemente de 0 a 3°C) durante más de 3 horas para lograr una buena actividad de nadar. Incluso se logran mejores actividades de nadar en la ventana de tiempo de 10 a 36 horas. La temperatura de los nauplios descongelados se puede adaptar lentamente a la temperatura del estanque para peces en el transcurso de la fase de revitalización.

Dado que da como resultado una actividad de nadar aún mayor del organismo (p. ej., nauplios de percebes) después de la descongelación, es más preferido triturar el contenido congelado de las bolsas sobre un tamiz o filtro que se lava continuamente con agua de mar preferiblemente a una temperatura más fría de 10°C. Después del lavado, los nauplios se revitalizan en agua de mar aireada (menos de 5°C, preferiblemente de 0 a 3°C) durante más de 3 horas para lograr una buena actividad de nadar. Incluso se logran mejores actividades de nadar en la ventana de tiempo de 6 a 36 horas. La temperatura de los nauplios descongelados se puede adaptar lentamente a la temperatura del estanque para peces en el transcurso de la fase de revitalización.

Alternativamente, y dando como resultado una vitalidad incluso mayor de los organismos descongelados, existe un método en el que el contenido triturado de las bolsas se incuba en un tanque con agua de mar y aireación. La desventaja de este método es una concentración remanente potencialmente más alta del crioprotector en los organismos/agua que puede ser tóxica en una aplicación posterior, tal como en la alimentación inicial de las larvas de peces. Cuando se usa etilenglicol como crioprotector, la concentración final no debe exceder 100 ppm por litro en la alimentación inicial.

Incluso más preferido es un método en donde el contenido de las bolsas se tritura en un pequeño volumen de agua de mar aireada que tiene una temperatura por debajo de 5°C y se incuba hasta que se descongela (dependiendo del volumen típicamente después de 15 a 30 minutos). A continuación, el agua que comprende el crioprotector se elimina mediante el uso de un filtro con un tamaño de malla inferior a 120 pm. Posteriormente, los animales son trasladados a un tanque lleno de agua de mar para su revitalización y adaptación de temperatura. Para este fin, típicamente se mantienen allí durante varias horas. La temperatura en este tanque debe ser inferior a 5°C al inicio. Durante la incubación, la temperatura se puede elevar cuidadosamente a la temperatura en el cultivo de peces diana que se va a usar.

Incluso es más preferido un método en donde el contenido de las bolsas se tritura (o se granula o se tritura previamente directamente del recipiente de almacenamiento en nitrógeno líquido) en un volumen de agua de mar aireada que tiene una temperatura inferior a 5°C, y donde el agua de mar se separa por lavado continuamente (tasa de dilución de >5-10 litros por hora) durante >4 horas y se revitaliza durante 8 horas o más. La temperatura se puede aclimatar a la temperatura requerida antes de alimentar con los organismos a las larvas marinas.

Opcionalmente, se pueden aplicar activadores tales como sacarosa durante la descongelación y la revitalización.

La invención se describe a continuación también, a modo de ejemplos de trabajo. Los ejemplos descritos incluyen las siguientes etapas:

1. Recolección o cultivo de huevos y/o nauplios/larvas/estadio temprano de vida de percebes seleccionados de la zona de mareas, p. ej. de Semibalanus balanoides o por debajo de la zona intermareal, Balanus crenatus.

1. Transferencia opcional de los organismos a tanques de retención con agua y aireación para almacenamiento intermedio.

2. Filtrado de organismos en cantidades adecuadas en un filtro para drenar el agua.

3. Adición de una solución 7,2 molar de etilenglicol (mantenido en hielo) al material drenado filtrado en una proporción de 1:4 a 1:1 (en volumen). En teoría, esto da como resultado una concentración final de etilenglicol de 3,6 molar en la mezcla si se equilibra completamente con los organismos. Sin embargo, como se explicó anteriormente y se muestra en los experimentos a continuación, la asimilación del crioprotector por los organismos es mucho menor. Hay indicios de que el equilibrio no es de 100%, sino <15% con estos organismos. El crioprotector contiene 40% de etilenglicol y 60% de agua de mar en volumen:volumen (30 PSU; PSU = Unidad de salinidad práctica = g/kg) en volumen (correspondiente a una solución 7,2 molar). El agua de mar se saliniza aún más hasta una concentración final de 50­ 70 PSU antes de mezclarla con etilenglicol.

4. Típicamente, se transfieren aproximadamente 600 g de los organismos mezclados y el crioprotector a una bolsa de plástico (p. ej., 500 mm x 190 mm x 10 mm; hecha para resistir temperaturas muy bajas) y se incuban durante 30 min a 5°C (equilibrio) u otros recipientes adecuados.

5. Las bolsas/recipientes con los organismos que se van a crioconservar y el crioprotector, se transfieren a un congelador programable o a un ultracongelador normal para su congelación.

6. La mezcla se congela a una temperatura de aproximadamente -12 a -13°C. Se aplica una velocidad de congelación de -0,05 a -0,5°C por minuto entre 5°C y -12°C para dichas bolsas de aproximadamente 600 g. Entre aproximadamente -13°C y aproximadamente -39°C se utiliza una velocidad de congelación de -0,025 a -0,07°C por minuto de modo que la temperatura se distribuya uniformemente en todo el material. Se pueden aplicar velocidades de congelación más altas en esta fase sin dañar los organismos siempre que se logre una distribución de temperatura homogénea en el material. Este es el caso particular si se aplican tiempos de mantenimiento (véase antes).

7. Los organismos en la mezcla típicamente comienzan a cristalizar en el intervalo de -12°C a -16°C. En este intervalo, el aumento de temperatura debido a la liberación de calor debe ser lo más bajo posible. Esto se logra mediante una velocidad de congelación preferida entre -0,02 y -0,1°C por minuto. Alternativamente, la temperatura se puede mantener constante de aproximadamente -12 a -15°C durante varias horas de modo que se logre una distribución de temperatura homogénea en la bolsa antes del inicio de la cristalización.

8. El crioprotector cristaliza a una temperatura de aproximadamente -22°C. En este intervalo, el aumento de temperatura debido a la liberación de calor debe ser lo más bajo posible. Esto se logra mediante una velocidad de congelación entre -0,02 y -0,1°C por minuto, preferiblemente -0,04°C por minuto. Alternativamente, la temperatura se puede mantener constante aproximadamente de -22 a -25°C durante varias horas de modo que se logre una distribución de temperatura homogénea en la bolsa antes del inicio de la cristalización.

9. Se aplica una velocidad de congelación lenta típicamente de -0,01 a -0,1°C por minuto, preferiblemente -0,04°C por minuto, dentro del intervalo de temperatura de aproximadamente -25 a aproximadamente de -38 a -43°C. El tiempo que se utilizará para esta etapa debería estar ventajosamente en el espacio de 5 a 20 horas, o en el espacio de 12 a 20 horas.

10. El material congelado se retira rápidamente del congelador y se transfiere a nitrógeno líquido y se almacena a una temperatura criogénica (p. ej., -196°C) hasta que revive.

Sección experimental

Experimento 1 - Ensayo de toxicidad

Nauplios de percebe en estadios I y II de Semibalanus balanoides se expusieron a una solución 7,2 molar de etilenglicol (solución madre) y se almacenaron en hielo. Se tomaron muestras después de 0, 1,2, 4, 8, 12 y 24 horas y el crioprotector se eliminó por lavado para comprobar la viabilidad de los nauplios. Los niveles de viabilidad se identificaron como 0, 1, 2, 3, 4 y 5. "0" representa que no hay actividad (nauplios muertos), 1-3 son espasmos de los apéndices menores que los nauplios pre-crioconservados, pero 3 están cerca del nado natural. 4 están nadando como nauplios pre-crioconservados y 5 son nauplios sobreestimulados. Sorprendentemente, todos los nauplios se recuperaron (nivel 2-3) y mostraron un comportamiento de nadar relativamente bueno (80-90% de los individuos), incluso después de 24 horas de exposición al crioprotector.

La alta vitalidad incluso después de 24 horas indica que los nauplios de percebe en estadios I y II pueden tolerar concentraciones sorprendentemente altas de etilenglicol durante periodos prolongados. Esto puede indicar que los animales solo absorben etilenglicol en un grado limitado, ya que esta concentración se considera típicamente tóxica durante la exposición a largo plazo. La hipótesis de una absorción limitada de etilenglicol durante el equilibrado está respaldada por el análisis de etilenglicol en nauplios de percebes crioconservados revividos después de la descongelación (véase también más adelante). Inmediatamente después de descongelar, se drenó el agua de los nauplios y se congelaron nuevamente. Se analizó el contenido de etilenglicol de los nauplios. Los resultados indicaron que los organismos absorbieron sólo el 5% del crioprotector. Aunque parte del etilenglicol se puede haber difundido ya fuera de los organismos en el procedimiento de descongelación antes del análisis, la concentración de etilenglicol en los organismos probablemente esté muy por debajo de un equilibrio total con el agente crioprotector.

Experimento 2 - Crioconservación mediante diferentes crioprotectores

La idoneidad de diferentes crioprotectores se ensayó en los ensayos descritos a continuación utilizando el método de crioconservación de la presente invención. Los detalles para el método de crioconservación y el procedimiento de descongelación aplicados en estos experimentos son los siguientes:

Nauplios de percebes (Semibalanus balanoides o Balanus crenatus) se drenaron y se concentraron (10% en peso seco) y se mezclaron 1:1 con un crioprotector (en hielo). La mezcla se cargó, selló y equilibró en una bolsa (600 gramos que consistían en 300 ml de crioprotector y 300 ml de percebes) durante 30 minutos a 5°C antes de transferirla a un congelador controlado. La bolsa se colocó en una rejilla de aluminio y se colocaron registradores de temperatura dentro de la bolsa y en el congelador para medir la temperatura del aire. Alternativamente, se utilizaron cantidades más pequeñas de aproximadamente 60 g o viales en los ensayos.

Después de congelar de 5 a -42°C, con una duración de >12 horas usando el método de la presente invención, las bolsas se remojaron en nitrógeno líquido hasta que se lograron homogéneamente -196°C dentro de las bolsas. Las bolsas se transfirieron a criocontenedores (con nitrógeno líquido) de 175 litros y se almacenaron durante más de 48 horas. Para comprobar la viabilidad, las bolsas se sacaron del criocontenedor, se trituraron para sacar el contenido y se descongelaron en agua de mar fría (menos de 5°C). Después de 15 minutos, los nauplios descongelados se lavaron sobre un filtro de 100 pm para eliminar el crioprotector. La revitalización se realizó durante >8 horas en un tanque aireado con 30 PSU de agua de mar (temperatura de inicio 2,5°C).

A) Etilenglicol:

Los nauplios de percebe en estadio I y II de Semibalanus balanoides o Balanus crenatus se crioconservaron utilizando una solución 7,2 molar de etilenglicol como crioprotector después de mezclar 1:1 entre el crioprotector y los organismos. Se lograron altas viabilidades después de la descongelación, con >50% con actividad de nadar natural (nivel 4) y el resto con la actividad de nadar 1-3 (menos que la natural, pero varias cercanas a la actividad de nadar natural).

B) Dimetilsulfóxido:

Los nauplios de percebe en estadio I y II de Semibalanus balanoides se trataron con una solución 6 molar de dimetilsulfóxido (DMSO) como crioprotector y con mezcla 1:1 entre el crioprotector y los organismos. El equilibrio se realizó durante 30 minutos entre 3 y 5°C.

El DMSO tiene una toxicidad más alta que el etilenglicol y por esa razón es una alternativa menos preferida, aunque la viabilidad después de la descongelación era comparable a los nauplios de percebes expuestos al etilenglicol.

C) Glucosa o propilenglicol:

El etilenglicol se reemplazó por glucosa o propilenglicol (40% de glucosa, metanol o propilenglicol en volumen mezclado con 60% en volumen de agua de mar; etilenglicol 3,4 M, propilenglicol 5,4 M) y se ensayó con nauplios en estadio I y II de Semibalanus balanoides (relación en volumen 1:1) aplicando el método de crioconservación según la presente invención. Aunque se encontró una supervivencia insignificante, el porcentaje de nauplios viables después de la descongelación era mínimo en comparación con el etilenglicol como crioprotector.

D) Etilenglicol y propilenglicol o glicerol:

Se ensayó el efecto de diferentes mezclas de los crioprotectores etilenglicol y propilenglicol o glicerol en la viabilidad de nauplios de percebe en estadio I y II de Semibalanus balanoides después de la crioconservación según la presente invención. En este experimento, se reemplazó el 25, 50 o 75% de etilenglicol por propilenglicol o glicerol (volumen por volumen). El intercambio de 75% del etilenglicol por propilenglicol o glicerol daba como resultado una viabilidad mucho menor que la solución de etilenglicol 7,2 M (relación en volumen 1:1 con organismos). Reemplazar 50% de etilenglicol por propilenglicol o glicerol daba mejores resultados en términos de viabilidad (aunque 50% de propilenglicol daba resultados mucho mejores que 50% de glicerol), mientras que 25% de propilenglicol daba como resultado una viabilidad comparable o mejor que el etilenglicol cuando se usaba como crioprotector. 25% de glicerol daba mejores resultados que 50% de glicerol, pero todavía resultados mucho peores que 25% de propilenglicol.

Dado que el propilenglicol es menos tóxico que el etilenglicol, la mezcla de 25% de propilenglicol y 75% de etilenglicol representa un crioprotector preferido para la crioconservación según la presente invención. En particular, cuando se usa como dieta de reemplazo de alimento para la vida marina.

Experimento 3 - Crioconservación utilizando diferentes relaciones en volumen de crioprotectores

Se ensayó el efecto de diferentes relaciones en volumen de crioprotectores con respecto al volumen de organismos a conservar. Los crioprotectores de penetración intracelular se añaden generalmente en una relación en volumen de 50% de crioprotector a 50% de volumen de organismos a conservar.

Se ensayó el efecto de diferentes relaciones en volumen del crioprotector etilenglicol en la viabilidad de los nauplios de percebe en estadios I y II de Semibalanus balanoides. Las muestras de estos organismos se crioconservaron en una relación en volumen de A) 30% de crioprotector a 70% de organismos (volumen/volumen) y B) 40% de crioprotector a 60% de organismos (volumen/volumen). El control era C) 50% de crioprotector a 50% de organismos (volumen/volumen). Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Los organismos se crioconservaron según el método de la presente invención y posteriormente se revivieron. No hubo diferencias significativas entre los tratamientos en términos de viabilidad.

Los resultados respaldan que muy poca cantidad de los crioprotectores parece ser realmente absorbida por los percebes y es necesaria para la protección intracelular durante el procedimiento de crioconservación. Esto contrasta con otros organismos, donde se sabe que es crucial para revivir que el crioprotector sea absorbido intracelularmente y que la concentración debe ser muy alta para alcanzar un equilibrio antes de la congelación. Sorprendentemente, esto no parece ser válido para los nauplios de percebes. Los nauplios de percebes no parecen depender del establecimiento de equilibrio con el crioprotector antes de que se lleve a cabo la etapa de congelación en la crioconservación cuando se sigue el método descrito en la presente invención. Esto está respaldado además por las observaciones hechas en el contexto de la presente invención, de que los organismos se pueden crioconservar antes de que se alcance un equilibrio (véase también el experimento 4).

Experimento 4 - Efecto del periodo de equilibrio en la viabilidad

Se ensayó el efecto de los tiempos de incubación más cortos antes de alcanzar un equilibrio con el crioprotector con muestras de nauplios I y II de Semibalanus balanoides.

Los organismos se incubaron durante 0, 15, 30, 60 y 90 minutos en etilenglicol 7,2 M a 5°C (relación en volumen 1:1 con organismos). Posteriormente, los organismos se crioconservaron por el método descrito en la invención, se almacenaron en nitrógeno líquido durante 48 horas, se descongelaron y revitalizaron. Se analizó la vitalidad de los nauplios de percebes utilizando un microscopio binocular. No se observaron diferencias significativas en la vitalidad entre los tratamientos a excepción de la muestra almacenada durante 90 minutos, que presentó menos organismos vitales que los otros tratamientos.

Experimento 5 - Absorción intracelular de crioprotector en percebes

Nauplios de percebes de Semibalanus balanoides se crioconservaron en paquetes de 600 g como se describe en la invención usando etilenglicol 7,2 M con una relación en volumen 1:1 respecto a los organismos. Después de descongelar, se analizó el etilenglicol en los nauplios inmediatamente después y se drenó el agua. Se tomó un pequeño trozo de material congelado en un filtro y se enjuagó hasta descongelarlo y, posteriormente, se congeló y se analizó. Esta fue la muestra de tiempo cero, que dio como resultado entre 7400 y 11000 ppm de etilenglicol. Esto indica que los organismos absorben aproximadamente un 5% de etilenglicol. Probablemente más, ya que podría haber tenido lugar un flujo de salida de etilenglicol, pero es difícil imaginar que se pueda encontrar >10% de etilenglicol dentro de los organismos. Se espera que un equilibrio completo diera como resultado etilenglicol 3,6 M dentro de los organismos. La solución madre de etilenglicol 7,2 M tiene una concentración de 400.000 ppm. Luego se transfirieron 600 gramos de muestra a 15 litros de agua de mar y se analizó después de 15 minutos (drenada y congelada), la cual mostraba de 6100 a 7000 ppm de etilenglicol, que es <2% del etilenglicol añadido o aproximadamente etilenglicol 0,1 M. Como una segunda etapa (para imitar el lavado del producto en las piscifactorías), drenado del agua y adición de 15 litros de agua de mar para lavar los nauplios de percebes, la concentración dentro de los organismos era <300 ppm. Cuando se revitalizaron, se drenó de nuevo el agua de mar de los nauplios de percebes y se añadieron 30 litros de agua de mar. Después de una hora, el contenido de etilenglicol en nauplios de percebe drenados era <25 ppm. Después de dos horas, el contenido en nauplios de percebe drenados estaba por debajo del nivel de detección de 10 ppm. El nivel de tolerancia de los animales acuáticos al etilenglicol es muy variable, pero un nivel de 100 ppm o menos se considera no tóxico para los organismos acuáticos en general.

Los resultados indican que aproximadamente el 5% del crioprotector era realmente absorbido por los organismos. Esto contrasta con la absorción descrita de este tipo de crioprotector en otros organismos durante la crioconservación por los crioprotectores de acción intracelular. Los percebes no parecen absorber crioprotectores en tasas elevadas. Sin estar limitados por la teoría, esto puede ser el resultado de agentes anticongelantes endógenos ya presentes en estos organismos que viven en la zona litoral, donde la exposición a bajas temperaturas no es infrecuente.

Experimento 6 - Percebes granulados crioconservados para su uso como alimento

Se describen además métodos para la producción de partículas o gránulos de alimentación crioconservados. Se han llevado a cabo ensayos para producir de manera efectiva partículas de alimento granulado en unidades más pequeñas para su uso posterior como alimento inicial para fines de acuicultura marina.

De acuerdo con la presente invención, se encontró que las partículas de alimento granulado crioconservadas que tienen una alta tasa de revitalización pueden producirse mediante dos métodos diferentes:

A) Grandes lotes de material que se han crioconservado previamente según el método descrito en la presente invención como p. ej. bolsas/placas que comprenden varios cientos de gramos de material y almacenados en nitrógeno líquido, se pueden romper mecánicamente en partículas/gránulos más pequeños en nitrógeno líquido. Los ensayos se llevaron a cabo en paquetes de 600 g como se describe en la invención usando etilenglicol 7,2 M en una relación en volumen 1:1 con los organismos. Las partículas obtenidas pueden almacenarse directamente en nitrógeno líquido sin ser envasadas o selladas de ninguna manera. La trituración no afectaba a la tasa de revitalización posterior incluso cuando se almacenó durante más de 7 meses en nitrógeno líquido después de la trituración.

B) Los gránulos se pueden producir en un congelador de crioconservación controlada congelando organismos en volúmenes más pequeños de típicamente 5 a 50 ml usando el protocolo de la presente invención. Los gránulos se produjeron usando moldes de silicona de tamaño y forma adecuados en el procedimiento de crioconservación según la invención usando etilenglicol 7,2 M en una relación en volumen de 1:1 con los organismos. De este modo se pueden lograr formas y tamaños estandarizados de partículas/gránulos. La congelación en estos moldes no afectó a la tasa de revitalización posterior incluso cuando se almacenaron durante más de 7 meses en nitrógeno líquido.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Método de crioconservación de huevos, nauplios y/o juveniles de percebes, comprendiendo el método las etapas que se realizan en el siguiente orden:

- drenar el agua de los organismos,

- añadir una solución crioprotectora de 5 a 8 M que comprende un crioprotector seleccionado del grupo que consiste en etilenglicol, propilenglicol, glicerol y dimetilsulfóxido o una mezcla de los mismos,

- congelar la mezcla en un recipiente de acuerdo con las siguientes etapas posteriores:

(i) congelar una primera velocidad de congelación lenta de no más de -1°C min-1 hasta acercarse a la temperatura donde los organismos de la mezcla comienzan a cristalizar;

(ii) congelar una segunda velocidad de congelación lenta de no más de -0,1°C min-1 hasta que los organismos y el crioprotector de la mezcla estén completamente cristalizados; y

(iii) una primera velocidad de congelación rápida a una temperatura de almacenamiento criogénico.

2. Método según la reivindicación 1, en donde la primera velocidad de congelación lenta es de -0,5°C min-1 o menos, preferiblemente -0,3°C min-1 o menos, más preferiblemente -0,1°C min-1 o menos.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde se realiza una etapa de equilibrado antes de la primera etapa de congelación, que dura preferiblemente de 5 a 60 minutos, más preferiblemente entre 15 y 30 minutos, lo más preferiblemente aproximadamente 15 minutos.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la segunda velocidad de congelación lenta está entre -0,015 y -0,1°C min-1, preferiblemente entre -0,04 y 0,08°C min-1, más preferiblemente -0,05°C min-1, lo más preferiblemente -0,04°C min-1.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los organismos drenados tienen un contenido en peso seco de 6 a 14% después del drenaje, más preferido entre 8 y 12% y lo más preferido de aproximadamente 10%.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la concentración del crioprotector para añadir a los organismos es entre 6 y 8 M, más preferido entre 6,5 M y 7,5 M, lo más preferido 7,2 M.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el crioprotector es una mezcla de etilenglicol y propilenglicol, preferiblemente en una mezcla de aproximadamente 50% cada uno, más preferiblemente de aproximadamente 75% de etilenglicol y 25% de propilenglicol.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la cantidad de material que se va a crioconservar en una unidad es al menos de 5 g a 10 g, preferiblemente al menos de 10 a 50 g, más preferiblemente al menos 50-100 g, lo más preferido entre 200 g y 2000 g.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la primera velocidad de congelación lenta finaliza cuando se acerca a una temperatura homogénea en el material de aproximadamente -10 a -13°C, preferiblemente de aproximadamente -12 a -13°C.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el procedimiento de congelación total dura al menos 5 horas, preferiblemente entre 6 y 10 horas, más preferiblemente entre 10 y 12 horas, lo más preferiblemente más de 12 horas.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los organismos se crioconservan en volúmenes de 5 a 50 ml, preferiblemente de 10 a 25 ml, en moldes de tamaño adecuado, preferiblemente moldes hechos de silicona.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los organismos se crioconservan en placas o bolsas y las placas o bolsas con organismos crioconservados se trituran en partículas más pequeñas en nitrógeno líquido, por lo que las partículas obtenidas se almacenan preferiblemente sin ningún envasado en nitrógeno líquido.

13. Método de revitalización de los organismos crioconservados según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, aplicando cualquiera de los métodos seleccionados de

- descongelación en un baño de agua tibia a 30-40°C;

- trituración del material congelado y lavado con agua de mar fría que fluye a 10°C o menos, y luego revitalización a <5°C durante hasta 36 horas; o

- trituración del material congelado e incubación en agua de mar con aireación a 102C o menos, y luego revitalización a <5°C durante hasta 36 horas.

14. Método según la reivindicación 13, en donde los organismos descongelados se adaptan después de la descongelación a la temperatura del agua en el cultivo de peces a los que se va a alimentar.

15. Producto o alimento crioconservado caracterizado por que se obtiene por cualquiera de los métodos según las reivindicaciones 1 a 12.

16. Uso de estadios de vida tempranos de percebes como alimento vivo para larvas de peces marinos e invertebrados en donde los estadios de vida tempranos se han crioconservado según un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y posteriormente se han revivido.