KR102172791B1 - 미성숙기 따개비류의 냉동보존 - Google Patents

Abstract

본 발명은 따개비류의 알, 노플리우스 및/또는 치어의 냉동보존 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 전형적으로 로티퍼, 알테미아 및 기타 생사료 유기체를 대체하는, 해양 양식업에서 생사료 유기체로서 냉동보존된 사료 및 보존된 유기체의 용도에 관한 것이다.

Description

미성숙기 따개비류의 냉동보존

본 발명은 청구항 1항의 전문에 따른 따개비류의 알, 노플리우스 (nauplius)및/또는 치어 (juvenile)의 대량 냉동보존 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 냉동보존된 유기체의 소생 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 냉동보존된 제품 또는 사료 및 그 용도에 관한 것이다.

해양 어류 유충 (marine fish larvae)이 먹이를 먹기 시작하면 성숙기이며, 첫 먹이로서는 주로 살아있는 먹이 유기체에 의존한다. 건식 사료와 같은 인공 사료는 차선책이며, 이것이 초기 성장 단계에서 해양 어류 유충에 대한 사료로서 사용될 경우 높은 사망률과 성장률 저하를 흔히 일으킨다. 사료 개시기 (start-feeding phase)에 인공 사료로 인한 이러한 실패에는 몇가지 이유가 있다. 특히, 실패의 주된 이유는 일반적으로 살아있지 않은 먹이 제품의 낮은 섭취율과 낮은 소화율, 그리고 수중에서의 사료 제품의 영양가 감소 및 높은 유기물 부하이다. 따라서, 해양 어류 유충의 사료 개시는, 주로 야생에서 포획하거나 또는 사료 용도로 양식하여야 하는, 살아있는 먹이의 공급에 달려 있다. 해양 어류 유충의 사료 개시시 사용되는 가장 일반적인 유기체는 브라인 슈림프 (brine shrimp)인 아르테미아 프란시스카나 (Artemia franciscana)와 여러가지 계통의 윤충류 (rotifer) 브라키오누스 (Brachionus sp)이다. 이들 유기체는 전형적으로 양식장에서 양식되며, 살아있는 먹이로 바로 공급된다. 이들 유기체는, 이런 목적으로 널리 사용됨에도 불구하고, 영양가는 해양 어류 유충의 최적 성장, 발달 및 생존을 뒷받침하는데는 차선책에 불과하다. 오메가-3 지방산 함량이 높은 해양성 오일 (marine oil)을 이용하는 등, 상기 유기체들의 영양가를 높이기 위한 여러가지 농화 기법 (enrichment technique)들이 개발되었지만, 이들의 음식물가 (dietary value)는 여전히 최적 상태에는 미치지 못하며, 전형적으로 더 높은 사망율, 낮은 성장율을 초래하며, 대개의 경우 야생 포획 먹이를 이용한 사료와 비교해 발달 부진을 유발한다. 또한, 이들 유기체의 양식 및 농화는 노동 및 비용 집약적인 과정이다.

차가운 해역대의 어류 유충의 자연 먹이는 전형적으로 아카르티아 (Acartia), 칼라누스 핀마르치쿠스 (Calanus finnmarchicus) 등과 같이 여러 생장 단계의 노플리우스 (nauplius)와 초기 코페포디드 (early copepodite)이다. 사료 개시시 요각류를 사용하게 되면, 비슷한 높은 생장율과 양호한 생존률이 달성된다. 요각류가 최적 사료인 것으로 여겨져, 이의 이용성을 개선하기 위한 시도들이 행해져왔다. 사료 개시 목적으로 요각류를 사용하는 경우에 한가지 해결해야 할 과제는 야생 포획이 이들 유기체가 바다에 풍족하게 존재하는 연중 한정된 특정 기간에만 가능하다는 것이다. 또한, 요각류는 살아있는 먹이로 보관하기 어려워 즉시 사용하여야 한다. 최근, 요각류를 양식하기 위한 기술들이 개발되었지만, 보존 기술, 특히 생장 중인 유기체에 대한 보존 기술은 여전히 해결해야 할 과제로 남아있다.

따라서, 해양 어류 유생의 사료 개시시 대안적인 살아있는 먹이 사료가 절실히 요구된다. 특히, 먹이 유기체의 증식 지역 또는 계절성 야생 포획에 의존하지 않는 살아있는 사료에 대한 수요도 존재한다. 아울러, 바다의 어류 자원이 제한적이고 전세계적으로 고 품질의 해양 원료, 특히 해양성 지질 (marine lipid)에 대한 수요가 증가하고 있어, 어류 이외의 다른 해양 자원, 특히 플랑크톤 종 및 미개발된 해양 무척추동물과 같이 영양단계가 낮은 유기체를 활용하여야 하는 전반적인 요구가 존재한다. 이러한 자원을 효율적으로 개발하기 위해서는 새로운 방법 및 기술의 개발이 요구된다.

냉동보존은 구조적으로 온전한 살아있는 세포 및 조직 뿐만 아니라 유기체를 보존하기 위해 매우 낮은 온도를 이용한다. 이 기술은, 분자 운동을 억제하고 대사적 및 생화학적 반응을 중지시키는 낮은 온도의 유익한 효과를 활용한다. 저온의 보호 효과를 이용하여 성공적으로 세포, 조직 또는 유기체를 냉동보존된 형태로 장기간 저장하기 위해서는 특수 공정이 요구된다.

냉동보존 방법은 동결시 얼음 형성으로 인한 손상을 유발하지 않으면서 낮은 온도에 도달하고자 한다. 중요한 한가지 이슈는 보존된 세포 및 유기체의 향후 소생 효율이다.

본 기술 분야에서 대부분의 연구는 포유류 종 뿐만 아니라 비-포유류 척추동물 및 무척추동물 등의 의학적 및 농업적으로 대부분 중요한 세포, 조직, 생식 세포 (정자) 및 배아의 냉동보존에 대한 것이다.

냉동보존 방법은 일반적으로 2가지 기술, 즉 제어된 저속 동결 기술 (controlled slow freezing technique) 및 액체 질소와 같은 급속 동결 기술 (유리화 기술 (vitrification technique))을 기반으로 한다. 보존 공정에 동결보호제의 사용은 용액 효과, 세포외 얼음 형성, 탈수 및 세포내 얼음 형성과 같이 냉동보호 중에 생길 수 있는 좋지 않은 효과를 줄여줄 것이다.

동결보호제는 통상적으로 보존 공정에의 적용 및 역할에 따라 2가지 타입으로 분류된다. 세포내 동결보호제는 저분자량이어서, 세포에 침투한다. 글리세롤 및 다이메틸 설폭사이드와 같은 세포내 동결보호제는, 전형적으로, 서서히 냉동될 때 여러 생물학적 시스템에서 세포 손상을 최소화하는 0.5 - 3몰 농도로 사용된다. 동결보호제 및 이의 농도 선택은 냉동 전 및 냉동 중의 노출 시간, 이의 생물학적 독성 및 생물학적 물질의 화학제에 대한 개별 관용성에 따라 결정될 것이다. 전형적으로, 침투성 동결보호제를 사용하여 냉동보존되는 물질은, 동결보호제와 보존처리되는 유기체 간에 농도 삼투 평형이 이루어지도록 충분히 장시간 동안 동결보호제와 인큐베이션된다.

급속 동결 기술은 일반적으로 세포에 침투하지 못하는 비교적 고 분자량을 가진 세포외 동결보호제를 사용한다. 그 예로는 폴리비닐 피롤리돈과 하이드록시에틸 스타치가 있다. 이들 물질은 액체 질소와 같이 급속 냉각되는 생물학적 시스템을 보호하는데 효과적이다. 이러한 세포외 비-침투성 동결보호제들 중 일부는 세포 막에 직접적인 보호 효과를 나타내지만, 이들의 일차적인 작용 기전은 세포외 유리 형성 공정인 유리화의 유도와 관련있다.

세포가 상이하면 세포마다 적용되는 최적 보존 방법에 따라 서로 다른 요건을 필요로 한다는 것이 많은 냉동보호 실험들을 통해 잘 알려져 있다. 상당수의 상호관련된 변수들에 대한 최상의 조건이 정의되어야 한다. 특히, 복합적인 다세포성 조직 및 유기체의 냉동보존은 종종 예를 들어 세포외 얼음 형성으로 인해 흥미롭고 엄청난 문제를 동반한다. 특히, 보존할 유기체의 크기가 냉동보존 공정에 영향을 준다. 작은 유기체는 일반적으로 큰 유기체와 비교해 평형이 더 쉽게 달성되기 때문에 저속 동결 기술에 의해 보존하기 더 용이하다.

냉동보존에서 주요 과제 중 한가지는 사료 등의 공업적인 대규모 활용시 요구되는 바와 같이 큰 규모의 배치를 보존하기 위한 적합한 방법이 부족하다는 것이다. 전형적으로, 냉동보존 기술은 예를 들어 0.5 - 1.5 ml 부피를 가진 소형 바이얼 또는 스트로 (straw)에서 ㎕ 또는 ㎖ 규모로 적용된다. 따라서, 공지 기술의 적용은 일반적으로 소량에 한정되어 있으며, 대규모 용량에는 적합하지 않다.

Khin-Maung-Oo et al. 1998 (Khin-Maung-Oo et al. Cryopreservation of Nauplius Larvae of the barnacle, Balanus amphitrite Drawin, Fisheries Science, 64(6):857-860)에는 동결방지용 스트로에서 소규모로 발라누스 암피트리트 (Balanus amphitrite)의 노플리우스 유생을 냉동보호하는 방법이 개시되어 있다. 바람직한 방법은 II기 노플리우스에서 물을 빼내고, 29‰ 바닷물에 동결보호제로서 1.5 M 다이메틸 설폭사이드를 포함하는 용액에서 20분간 평형시키는 것을 포함한다. 노플리우스를 5℃/분 속도로 20℃에서 -12℃까지 냉각시킨 다음 -12℃에서 10분간 두고, 이후 0.5℃/분의 속도로 -30℃까지 냉각시켜 -30℃에 20분간 둔 다음 다시 -196℃까지 급속 냉동시킨다.

Gakhova et al. 1990 (Gakhova E.N. Freezing of barnacle larvae Balanus improvises to minus 196℃. Biologiya Morya (Valdivstock) (4): 62-65)에는 발라누스 임프로비시스 (Balanus improvises)의 II기 노플리우스를 2단계 동결 공정으로 냉동보존하는 또 다른 방법이 개시되어 있다. 플라스틱 튜브에서 노플리우스/동결보호제 현탁물 200 ㎕를 -38℃ 내지 -42℃의 온도까지 6℃/분 내지 6.7℃/분의 속도로 냉각시켜 이 온도에서 10분간 둔 후 이를 액체 질소로 이동시킨다.

Anil et al. 1997 (Anil A.C., Tulaskar, A.S., Khandeparkar D. C., and Wagh, A.B. Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii. Cryobiology 34, 131-140)에는 3가지 동결보호제 (에틸렌 글리콜, 다이메틸 설폭사이드 및 글리세롤)를 사용해 발라누스 암피트리트 (Balanus amphitrite) 노플리우스를 냉동보존하는 방법이 개시되어 있는데, 여기서 유생은 적용된 동결보호제 농도에 대해 증가된 감수성을 나타내었다. 에틸렌 글리콜 3-4 M 농도는 최대 2시간의 평형 시간 경과 후 손상을 유발하지 않았다. 노플리우스는 -8℃에서의 일차 시딩 (seeding)이 조합된 2-단계의 저속 동결 공정으로 작은 규모 (스트로)로 냉동보존된다. 냉동 속도는 20℃에서 0℃까지 5℃/분, 그리고 0℃에서 -8℃까지 1℃/분이다. 시딩 후, 냉각 속도는 적어도 -20℃에 도달할 때까지 천천히 냉동시키는 0.3℃/분이며, 그 후 그 온도에서 20분간 유지한다. 그런 후, 스트로를 액체 질소로 옮긴다. 샘플을 2시간 조금 넘게 두어 -40℃에 도달하였을 때 액체 질소로 옮긴다. Anil 등은 해동 후 1시간 경과시 소생율이 90%라고 발표하였다. 그러나, 24시간 후에 소생율은 35%에 불과하였다.

본 발명은 따개비류의, 특히 생명 초기 단계, 즉 이의 알, 배아, 유생 및/또는 치어 단계에 중점을 둔, 보존 및 소생 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 전형적으로 해양 연안 지역에 서식하는 이들 유기체를 효율적으로 냉동보존하기 위한 냉동보존 프로토콜을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, 해양 어류 유생의 사료 개시 등의 사료 개시 목적을 위한 먹이로서 적합한, 새로운 해양 종의 개발을 개선하고, 산업적인 이용에 초점을 맞추어 이를 이용할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 다른 목적은 해양 양식업에서 지금의 살아있는 먹이 사용을 효율적으로 대체하기 위해 사용될 수 있는 살아있는 사료 유기체를 장기간 보관하는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명은 성체 전 단계의 해양 어류 유생의 사료 개시시와 같이 양식업에서 살아있는 사료 유기체로서 사용될 수 있는 유기체의 대규모 (대량) 냉동보호 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 해동 후 장기간 높은 소생율이 달성되는 따개비류의 냉동보존법을 제공하는 것이다. 이는, 예를 들어 소생된 유기체의 해양 어류 유생에 의한 섭취가 전형적으로 즉각적으로 이루어지지 않고 어류 유생의 양식 시설에 투입된 후 시간이 걸리기 때문에, 특히, 사료 개시로서 사용될 때 중요하다. 먹이가 수시간 또는 수일 동안 장기간 생존하는 것이 따라서 중요하다.

본 발명의 또 다른 목적은 노플리우스가 큰 따개비 종에 적합한 유닛 당 대규모로 냉동보존하는 효율적인 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 소생율이 높은 냉동보존된 입자 사료를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 따개비류 종들의 다양한 생명 초기 단계의 어류 (알, 노플리우스 및 치어)를 보존 및 소생하기 위한 냉동보존 프로토콜에 관한 것이다. 본 발명의 한가지 주 목적은 해양 양식업에서 현행 생사료 방식을 대체 또는 보충할 수 있는, 상기한 생사료 유기체를 포함하는 보존된 저장가능한 제품을 제조하는 방법에 관한 것이다.

이에, 제1 측면에서, 본 발명은, 하기 단계로 수행되는 방법을 포함하는, 따개비류의 알, 노플리우스 및/또는 치어의 대량 냉동보존 방법에 관한 것이다:

- 유기체에서 물을 배액하는 단계,

- 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 다이메틸 설폭사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 동결보호제 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 5 - 10 M 동결보호제 용액을 투입하는 단계,

- 결과 생성된 혼합물의 하기의 단계에 따라 용기에서 동결시키는 단계:

(i) 혼합물에서 유기체의 결정화 (crystallizing)가 개시되는 온도에 도달할 때까지, -1℃/분 이하의 제1 저속 동결 속도로 동결하는 단계;

(ii) 혼합물 중 유기체 및 동결보호제가 완전히 결정화될 때까지, -0.1℃/분 이하의 제2 저속 동결 속도로 동결하는 단계; 및

(iii) 극저온 저장 온도 (cryogenic storage temperature)까지 제1 급속 동결 속도로 동결하는 단계.

바람직하게는, 동결보호제 용액과 배액된 상기 유기체 간의 부피 비는 적어도 1:4, 바람직하게는 1:4 - 2:1, 더 바람직하게는 1:4 - 1:1이다. 이는, 혼합물에서 부피의 약 20% 이상이 동결보호제이고, 80%가 유기체이어야 한다는 것을 의미한다.

바람직한 방법에서, 제1 저속 동결 속도는 -0.5℃/분 이하, 바람직하게는 -0.3℃/분 이하, 더 바람직하게는 -0.1℃/분 이하이다.

선택적으로, 제1 동결 단계 이전에, 평형 단계 (equilibration step)가 바람직하게는 5 - 60분간, 더 바람직하게는 15분 - 30분간, 가장 바람직하게는 약 15분간 수행될 수 있다. 평형 단계의 이점은, 이 단계를 생략한 경우 보다 제1 저속 동결 속도가 일반적으로 더 빠를 수 있지만 최종 생산물에는 영향을 미치지 않는다는 것이다. 평형 단계는 -0.5℃ 내지 -1℃의 제1 저속 동결 속도와 조합될 수 있다. 60분을 초과하는 평형화 기간은 바람직하지 않으며, 전형적으로 동결 후 생존성 저하를 야기한다.

평형 기간은 15분 미만으로 단축될 수도 있으며, 또는 심지어 동결 속도가 -0.5℃/분 미만일 경우에 완전히 생략될 수 있다. 따개비류가 동결보호제에 높은 허용성을 가진 것으로 확인될 수도 있지만, 유기체의 노출을 줄이고, 보다 시간 효율적인 동결 공정이 된다는 점에서 평형 기간을 단축하는 것이 유익하다. 본 발명의 예로서, 따개비류 노플리우스에서, 본 발명에 따른 제1 저속 동결 속도를 이용할 경우, 평형 기간의 단축 또는 생략이 부정적으로 작용하지 않다는 것을, 확인할 수 있었다. 놀랍게도, 이들 유기체는 동결 개시 전 평형 도달에 의존하지 않는 것으로 보인다.

예를 들어, 동결 속도를 -0.5℃/분 미만으로 사용할 경우, 결정화가 달성되기 전 전술한 저속 동결 공정 중의 평형화로도 충분하다. 평형 단계가 생략될 경우의 이점은 수행하여야 하는 각각의 단계 수가 더 적은 단순화된 공정이라는 것이다.

바람직한 구현예에서, 제2 저속 동결 속도는 -0.015 내지 -0.1℃/분, 바람직하게는 -0.04 내지 -0.08℃/분이다. 특히 바람직하게는, 제2 저속 동결 속도는 -0.05℃/분, 가장 바람직하게는 -0.04℃/분이다. 이는, 동결이 특히 서서히 이루어지고, 매우 균일한 온도 분포가 달성되어, 동일 유닛에서 대량의 부피 또는 중량을 처리할 수 있다는, 이점을 가진다.

제2 저속 동결 속도는, 바람직하게는 -30℃, 바람직하게는 적어도 -35℃, 더 바람직하게는 적어도 -36℃, 가장 바람직하게는 -38 내지 -46℃에 도달할 때까지, 지속된다.

바람직하게는, 배액된 유기체는 배액 후 건조 중량 함량이 6 - 14%, 더 바람직하게는 8 - 12% 가장 바람직하게는 약 10%이다.

바람직하게는, 동결보호제 용액은 2.0 - 4.5 % NaCl, 더 바람직하게는 3.0 - 3.8 % NaCl, 가장 바람직하게는 3.2 - 3.8 % NaCl을 포함한다.

더 바람직하게는, 유기체에 첨가되는 동결보호제의 농도는 6 - 8 M, 더 바람직하게는 6.5 M - 7.5 M이다. 특히 바람직하게는, 동결보호제의 농도는 적어도 6 M, 더 바람직하게는 적어도 7 M, 가장 바람직하게는 7.2 M이다. 바람직하게는, 동결보호제는 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 혼합물이며, 바람직하게는 각각 50%의 혼합물이며, 더 바람직하게는 약 75 % 에틸렌 글리콜과 약 25 % 프로필렌 글리콜의 혼합물이다.

선택적인 평형 단계는 바람직하게는 0 - 10℃, 더 바람직하게는 3 - 8℃, 가장 바람직하게는 약 5℃의 온도에서 수행된다. 5℃ 보다 낮은 온도는 생존성 저하를 유발할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 특히 유기체의 보다 큰 중량 및 부피에 맞게 개발되며, 이에 적합하다. 바람직하게는, 하나의 유닛에서 냉동보존할 물질의 양은 5 g 내지 10 g, 바람직하게는 10 내지 50 g, 더 바람직하게는 50 내지 100 g, 가장 바람직하게는 200 g 내지 2000 g이다.

동결보호제와 유기체의 혼합물은 평형 단계 전 또는 그 직후에 동결보존에 적합한 용기에 배치될 수 있다. 용기 내 이들 혼합물은 동결 공정 중에 100 mm 이하, 더 바람직하게는 50 mm 이하, 가장 바람직하게는 10 mm 이하의 최대 두께를 가질 수 있다.

바람직하게는, 제1 저속 동결 속도는, 물질의 균일 온도 약 -10 내지 -13℃, 바람직하게는 약 -12 내지 -13℃에 도달되었을 때, 종료된다.

긴 동결 시간과 저속 동결 속도는 본 발명에 따라 보존할 경우 최종 생성물의 품질에 중요하다. 특히, 대규모의 양 또는 부피를 보존할 경우가, 이에 해당된다. 바람직하게는, 전체 동결 공정은 적어도 5시간, 더 바람직하게는 6 내지 10시간, 보다 더 바람직하게는 10시간 내지 12시간, 가장 바람직하게는 12시간 넘게 지속된다. 이로써, 높은 생존성이 달성된다.

다른 바람직한 구현예에서, 유기체는 적정 크기의 몰드 안에서 5 - 50 ml, 바람직하게는 10 - 25 ml의 부피로 냉동보존된다. 바람직하게는, 몰드는 실리콘으로 제작된다. 냉동보존된 유기체를 포함하는 큰 플레이트 또는 파우치를 액체 질소에서 더 작은 입자로 분쇄할 수 있으며, 이로써 수득되는 입자는 바람직하게는 임의의 포장없이 액체 질소에서 보관된다. 더 작은 입자 또는 펠릿으로 만드는 것이, 예를 들어, 향후 유기체의 개시 사료로서 사용하기 좋다. 이는 생사료로서 공급시 소생 및 투입 (dosing)을 용이하게 할 것이다.

본 발명의 제2 측면은 하기 방법들로부터 선택되는 임의 방법을 이용하여, 전술한 임의 단락에 따라 냉동보존된 유기체를 소생시키는 방법에 관한 것이다:

- 30-40℃의 온수 수조 안에서 해동시키는 방법;

- 냉동된 물질을 분쇄하여 이를 10℃ 이하의 차가운 해수가 흐르는 조건 하에 세척한 후 <5℃에서 36시간 이하의 시간 동안 소생시키는 방법; 또는

- 냉동된 물질을 분쇄하여, 이를 10℃ 이하의 공기 공급되는 해수 중에 인큐베이션한 후 <5℃에서 36시간 이하의 시간 동안 소생시키는 방법으로부터 선택되는 방법. 해동된 유기체는 선택적으로 해동된 유기체가 공급될 양식장의 수온까지 해동된 후 이용할 수 있다.

본 발명의 제3 측면은, 냉동보존 방법과 관련된 전술한 단락들에 기술된 임의의 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는, 냉동보존물 또는 냉동보존 사료에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은, 따개비류의 유기체를 동결보호제로서 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤의 혼합물을 사용해 냉동보존하는, 바람직하게는 6 - 8 M 농도로 따개비류의 유기체에 첨가하여 냉동보존하는 것을 특징으로 하는, 생명 초기 단계 (early life stage)의 따개비류를 포함하는 냉동보존물 또는 냉동보존 사료에 관한 것이다.

마지막으로, 본 발명은 해양 어류 유생 (marine fish larvae) 및 무척추동물의 생사료로서 냉동보존 및 소생된 생명 초기 단계의 따개비류의 용도에 관한 것이다.

바람직한 구현예들은 또한 종속항에서 정의된다.

전술한 본 발명의 특징들은 본 발명의 범위내에서 임의 조합으로 조합될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

본 발명은 따개비류 종들의 다양한 생명 초기 단계의 어류 (알, 노플리우스 및 치어)를 보존 및 소생하기 위한 저온 프로토콜에 관한 것이다. 본 발명의 한가지 주 목적은, 해양 양식업에서 현행 생사료 방식을 대체 또는 보충할 수 있는, 상기한 생사료 유기체를 포함하는 보존된 저장가능한 제품을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 냉동보존 방법은 후술한 동결보호제 (동결보존제)를 고 농도로 이용하는 몇가지 단계로 매우 느리게 냉동시키는 기법에 의해 냉동보존하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 방법은, 기존에는 효과적으로 냉동보존할 수 없었던, 대량의 배치 (전형적으로, 하나의 유닛에서 수백 g/유닛으로 동결시키기에 적합한)용으로 개발되었다. 본 발명의 중요한 이점은, 본 방법이 생명 초기 단계의 따개비류를 대량/산업적인 규모로 냉동보존하기 적합하며, 특히 개시 사료로서 적합한 새로운 따개비류 제품을 수득하기 위한 자동화된 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 또한, 본 방법은 예를 들어 어류 개시 사료 공급 (생사료 유기체)에 적합한 미립자 물질 또는 펠릿을 제조하기에 적합하다.

본원의 프로토콜에서 각 단계의 동결 속도는 각 유닛에서 동결시킬 물질의 양 및/또는 크기 (특히, 폭 연장)에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 최상의 결과 (즉, 향후 소생 후 살아있는 비-손상 유기체)를 수득하기 위해 특정 조건이 충족되어야 한다. 단계에 따라, 동결 공정 중에 전체 물질의 실질적으로 균일한 온도 분포가 양호한 결과를 달성하기 위해 중요하다는 것을, 확인하였다. 이는, 동결 공정에서, 동결보호제와 혼합하였을 때 유기체가 전형적으로 결정화를 개시하는 약 -10℃ 내지 -13℃로 진행될 특히 중요하며, 특히 유기체를 둘러싸고 있는 동결보호제, 예를 들어 에틸렌 글리콜이 전형적으로 결정화를 개시하거나 또는 결정화되는 경우에는, -20℃ 내지 -25℃에서 특히 중요하다. 결정화 온도의 정확한 온도 범위는, 동결보호제(들)의 선택 및 용액내 염 함량에 따라, -20℃ 내지 -25℃에서 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 성공을 위해 특히 중요한 사항은 유기체가 결정화하는 온도 범위, 즉 약 -10℃ 내지 약 -15℃, 특히 -12℃ 내지 -13℃ 범위에서 열 방출로 인한 물질의 온도 상승을 방지 또는 제한하는 것이다. 본 발명에 따른 냉동 프로토콜은 하기 특징 및 단계를 포함한다:

제1 단계로서, 보존 처리할 유기체에서 해수를 배액 (draining)한다. 배액은 예를 들어, 동물을 걸러내기에 적합한 메쉬 또는 구멍 크기를 가진 네트 또는 필터를 사용함으로써 달성할 수 있다. 전형적으로, 해수 배액 후, 세미발라누스 발라노이데스 (Semibalanus balanoides) 또는 발라누스 크레나투스 (Balanus crenatus) 등의 따개비류의 건조 중량 함량은 약 10%이다. 그러나, 이는 유기체 또는 이의 수분 보유 특징에 따라 달라질 수도 있다. 따라서, 건조 중량 함량은 최종 산물의 품질에 유의한 영향을 미치지 않으면서 6 내지 14%에서 다양할 수 있다.

배액시킨 유기체는, 이후, 동결보호제의 스톡 용액과 혼합한다. 바람직하게는, 에틸렌 글리콜 (스톡 용액: 3 - 4% NaCl, 바람직하게는 약 3.5 % NaCl을 포함하는 염 용액 중의 7.2 몰 에틸렌 글리콜)이 동결보호제로 사용되며, 바람직하게는 동결보호제 : 유기체의 부피비는 1:4 내지 1:1이다. 스톡 용액의 염도는 다양할 수 있다. 실무적인 이유로, 일반적인 해수가 스톡 용액으로 사용되며, 여기에 염 (NaCl)을 첨가하여 염도 증가를 달성한다. 냉동보존에 최상의 결과를 달성하기 위해 동결보호제를 고 농도로 이용하는 것이 중요하다. 일반적으로, 첨가되는 동결보호제의 농도는 동결보호제 5 - 10 M, 바람직하게는 6 - 8 M 범위이어야 한다. 따라서, 바람직하게는, 동결보호제의 농도는 적어도 6 M, 더 바람직하게는 적어도 7 M, 가장 바람직하게는 약 7.2 M이다.

동결보호제 용액에 염 첨가가 염 무첨가한 경우와 비교해 노플리우스의 소생을 향상시키는 것으로 입증되었다. 특히, 수영 능력 (swimming activity)이 개선되었다. NaCl의 최종 염 농도는 바람직하게는 2.0 - 4.5 %, 더 바람직하게는 3.0 - 3.8 %, 가장 바람직하게는 3.2 - 3.8%이다.

다른 바람직한 구현예에서, 에틸렌 글리콜은 동결보호제로서 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 혼합물로 대체된다. 최상의 결과는, 75% 에틸렌 글리콜과 25% 프로필렌 글리콜의 혼합물을 이용하는 경우 달성되었다. 50% 에틸렌 글리콜로 대체하는 것도 가능하지만, 소생 후 생존율 측면에서 최상은 아니다. 75% 에틸렌 글리콜로 대체하면 여전히 일부 생존성이 달성되었다. 또한, 25% 에틸렌 글리콜을 글리세롤로 치환하면, 생존율이 상당히 양호해지지만, 동결보호제로 25% 프로필렌 글리콜을 75% 에틸렌 글리콜과 함께 사용하거나 또는 에틸렌 글리콜만 사용하는 경우 만큼 양호하지 않았다. 에틸렌 글리콜을 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤로 치환할 경우의 이점은 일반적으로 알려진 프로필렌 글리콜과 글리세롤의 낮은 독성이다. 이는, 냉동보존된 유기체를 해양 어류 유생의 사료로서 사용되어야 하는 경우, 이는 에틸렌 글리콜과 같은 화학제에 매우 민감한 것으로 알려져 있기 때문에, 유익하다. 다른 구현예에서, 다이메틸 설폭사이드 (DMSO)가 동결보존제로서 사용된다. DMSO는 널리 공인된 더 높은 독성으로 인해 생사료로서 향후 사용할 경우 덜 바람직하다.

동결보호제와 유기체의 혼합물은 백, 패키지 및 파우치와 같은 적절한 용기에서 바로 수득할 수 있거나 또는 혼합 후 여기로 옮길 수 있다. 동결, 보관 및 향후 해동 공정을 지속하기에 적합한 한, 여러가지 타입의 물질들이 패킹에 사용될 수 있다. 전형적으로, 내한성 (cold-resistant) 플라스틱으로 제작된 용기, 백, 몰드 또는 파우치가 사용될 수 있다. 또 다른 적절한 재료는 실리콘이다. 이러한 목적으로 사용되는 파우치의 예는 다음과 같은 크기를 가진다: 500 mm x 190 mm x 10 mm. 이 파우치는 혼합물 약 600 g을 수용하는데 적합하다. 동결보호제와 유기체의 선택 비율에 따라, 이 크기의 파우치는 전형적으로 보존 처리할 따개비류 300 g 내지 450 g을 수용할 수 있다. 각 유닛에서 본 발명에 따라 동결시킬 (혼합된 유기체 및 동결보호제) 양은 전형적으로 50 g 내지 1000 g 범위이다. 일부 경우에는, 바람직하게는, 각각 유닛 당 5, 10, 20 또는 25 g과 같이 보존 처리할 양이 더 소량일 수도 있다. 그러나, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명이 이러한 구체적인 양 및 크기로 한정되지 않음을, 이해할 것이다. 후술한 동결 공정 중에 각 유닛에서 제어된 동결과 충분히 균등한 온도 분포가 달성될 수 있는 한, 파우치에 대한 또 다른 크기 및 물질의 양이 가능하다. 이는 특히 패키지/백의 두께에 따라 결정되며, 두께는 바람직하게는, 50 mm 이하, 더 바람직하게는 10 mm 이하, 가장 바람직하게는 5 mm를 초과하지 않아야 한다.

놀랍게도, 본 발명의 방법에 따라, 본 발명의 프로토콜에 따른 동결 공정 개시 전에, 평형화 기간이 공정의 성공을 위해 필수적이진 않은 것으로, 확인되었다. 따라서, 입증된 바와 같이, 제1 동결 속도가 결정화 이전에 느릴 경우, 본 발명에 따른 냉동보존된 유기체의 소생율에 영향을 미치지 않으면서, 규정된 평형 단계를 완전히 생략할 수 있다.

바람직하게는, 동결보호제는 5 - 10℃의 온도에서 유기체에 첨가되어야 한다. 이 보다 낮은 온도는 바람직하지 않다. 약 0℃의 온도는 생존성을 떨어뜨린다.

선택적으로, 본 발명의 냉동보존 방법은 평형화 기간과 조합될 수 있다. 수행하는 경우, 평형화 기간은 전형적으로 15-60분간 지속될 수 있다. 60분 보다 긴, 예를 들어 120분의 평형화 기간은 생존성에 좋지 않게 작용할 수 있다. 바람직하게는, 평형화 온도는 5℃ 내지 10℃ 범위이며, 가장 바람직하게는, 동결보호제의 효과적인 흡수를 위해 이 단계 동안에는 약 5℃이다. 20℃ 미만의 온도, 특히 5℃는, 보호 효과가 있을 수 있는 이 단계 동안, 유기체의 전체적으로 낮은 대사 활성으로 인해, 공정에 유익한 것으로 추정된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 5℃에서 15-30분의 평형화 시간이 적용된다. 그러나, 본 발명과 연계하여 수행된 검사들에서, 심지어 동결보존제로서 7.2 M (스톡 용액) 빙랭한 에틸렌 글리콜을 이용한 24시간의 평형화 기간이, 세미발라누스 발라노이데스의 따개비 노플리우스에 대한 독성 검사에서 상당히 유해한 것은 아닌 것으로, 확인되었다. 이는 고 농도의 동결보호제에 장기간 동안 매우 높은 허용성을 가진다는 것을 의미한다. 본 발명은, 심지어 본 발명의 동결 공정에서와 같이 매우 장기간 노출되는 경우에도, 고 농도의 동결보호제에 대한 놀라운 높은 허용성을 이용한다. 본 발명에 따른 매우 느린 동결 공정 중에, 유기체는, 스트로를 이용한 선행 기술 분야에서 이미 공지된 방법과 비교해 대규모의 배치를 동결시키는 경우, 장기간 이러한 고 농도의 동결보호제에 노출된다. 본 발명에 따른 동결 공정은 평형 온도 (예, 5℃), 즉 동결보호제가 첨가되는 온도에서부터 혼합물을 액체 질소로 옮길 때의 온도 (전형적으로 약 -39℃에서 -43℃, 선택적으로 -30℃ 또는 -35℃)까지 수시간, 바람직하게는 적어도 12시간 동안 지속된다. 동결 공정은 적어도 5시간, 더 바람직하게는 적어도 8시간, 가장 바람직하게는 12 - 16시간 지속하는 것이 최적인 것으로 확인된다. 동결 공정은 심지어 24시간 이상 지속될 수 있다. 이러한 매우 긴 동결 시간은, 큰 배치 유닛에서 동결시키는 경우, 유기체의 높은 소생율을 달성하는데 필수적인 것으로, 본 발명에서 확인되었다. 즉, 동결 공정의 노출 기간은, 유리화에 기반한 급속 동결 기술을 이용하거나 또는 스트로와 같이 작은 체적에 적용되는 통상적으로 공지된 기술과 비교해, 매우 길다.

평형 단계 후, 동결보호제 첨가 후, 혼합물이 수용된 용기를 냉동기, 전형적으로 동결 속도를 조절할 수 있는 속도 제어형 냉동기로 이동시킨다. 용기 (예, 백, 몰드 또는 파우치)에는 물질의 내부 온도를 모니터링하는데 적합한 수단이 구비된다. 온도 제어 수단은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 따라서 상세하게 설명하지 않는다. 그 후, 혼합물을 후속적인 2단계 저속 동결 공정에 따라 처리한다. 전체 동결 공정 중에, 적용되는 동결 속도로 물질 내부에서 균일한 온도 분포를 달성하는 것이 중요하다. 이로써, 유기체의 손상이 방지 또는 저하된다. 동결 속도는 바람직하게는 제1 저속 동결 속도 공정 동안 -1℃/분을 초과해서는 안된다. 더 바람직하게는, 동결 속도는 -0.5℃/분 이하이어야 한다.

예를 들어, 납작한 파우치 (혼합물 약 600 g을 포함하는 두께 약 10 mm, 이는 속도 제어형 냉동기에 배치됨)의 경우, 전형적으로 물질의 동결 속도인 분 당 -0.05 내지 0.5℃는 약 +5℃에서 약 -12℃까지 적용된다.

대개, 동결 공정 중에 혼합물의 과냉각 (undercooling)이 관찰되며, 온도가 예를 들어 -15℃까지 떨어지면, 유기체가 결정화되면서 약 -13℃로 상승한다. 융해 잠열 (에너지 방출)이 이러한 온도 상승을 유발한다. 과냉각은 가변적이며, 종종 0.5℃의 온도 증가가 관찰되거나 또는 온도 증가가 관찰되지 않지만, 다른 샘플의 경우 최대 3℃ 증가할 수 있다. 동결보호제의 결정화로 인한 예를 들어 약 3℃의 온도 증가는 혼합물에 포함된 유기체에 부정적으로 작용하지 않는 것으로 보인다.

에틸렌 글리콜을 혼합물에 동결보호제 (예, 평형화 전 3% NaCl 중의 7.2 M)로 사용할 경우, 전형적으로 약 -20℃ 내지 -25℃에서 결정화가 시작될 것이다. 전형적으로, 유기체와 동결보호제의 정확한 결정화 온도는 또한 평형 전에 배액시킨 물질에 남아있는 해수 함량과 동결보호제 용액내 염 함량에 따라 결정될 것이다. 예를 들어, 수분 함량이 낮을수록 동결보호제 혼합물내 유기체의 결정화 온도는 더 높아지며, 예를 들어 배액된 물질의 건조 중량이 12%일 경우 약 -16℃에서, 그리고 건조 중량이 9%일 경우 약 -12℃에서 결정화가 이루어진다. 사용되는 동결 기술에 따라, 순환 가스를 이용한 냉동기 또는 공기 등이 충진된 냉동기 보다 온도 전달 및 분산을 보다 효율적으로 할 수 있는 액체 냉동기를 사용하는 경우와 같이, 더 빠른 동결 속도를 이 단계에 적용할 수 있다.

그러나, -12℃ 내지 -약 25℃에 도달할 때까지 전체 물질의 균일한 온도 분포를 달성하는 것이 매우 중요하다.

혼합물을 액체 질소로 이동시킬 때, -20℃에서 약 -40℃ 내지 -42℃까지, 제2 저속 동결 단계 동안에 매우 느리게 온도를 떨어뜨리는 것이, 매우 중요하다. 이는, 대량 보존시 동결처리된 유기체에서 최상의 소생 효율을 달성하기 위해 중요하다. 특히, 동결보호제/유기체 혼합물의 결정화로 인한 잠재적인 온도 상승은, 향후 소생 효율에 중대한 영향을 미칠 수 있는 것으로 확인된 바, 피하거나 또는 제한되어야 한다. 동결 속도는 최대 -0.3℃/분이어야 하며, 바람직하게는 -0.1℃/분 이하, 더 바람직하게는 -0.05℃/분 이하이어야 한다. 특히 양호한 결과 (생존성)는 -0.04℃의 제2 저속 동결 속도에서 달성되었다.

제2 동결 단계에서 이러한 매우 느린 동결 속도에 대한 또 다른 구현예로, 온도는, 결정화 개시 전에 균일한 온도 분포가 달성될 때까지, 장기간, 패킹된 산물의 두께에 따라 전형적으로 0.5 내지 3시간 동안 약 -12℃ 내지 -13℃에서 -22℃ 내지 -23℃로 유지될 수 있다. -22℃ 내지 -23℃에서 0.5 - 3시간 홀딩한 후, 동결 속도는 -0.15℃/분을 넘어서는 안되며, 바람직하게는 -0.08℃/분 이하이어야 한다. 홀딩 시간을 이용함으로써, 특히, 제2 저속 동결 속도는 홀딩 시간이 적용되지 않았을 경우 보다 다소 더 빠른 속도를 채택할 수 있다.

결정화 단계 중에 발생되는 열은 온도가 더 떨어지기 전에 방출하는 것이 중요하다. 특히, 공기를 이용한 냉동기를 사용할 경우, 온도, 즉 냉동기내 순환 공기의 온도는 언급한 열 방출 기간 동안 가능한 일정하고 안정적으로 유지하여 (-10℃ 내지 -13℃에서 -20℃ 내지 -25℃의 범위), 산물의 온도 증가를 효과적으로 방지 또는 최소화하는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 동물의 소생율에 좋지 않게 작용할 수 있는 유해한 얼음 결정화가 발생할 수 있다.

약 -39℃ 내지 -43℃에 도달하면, 동결된 물질, 전형적으로 플레이트 형태의 동결된 물질을 추가적인 동결 (제1 급속 동결 단계) 및 극저온 보관을 위해 액체 질소로 이동시킨다. 플레이트의 보관은 액체 질소 중에 또는 극저온 보관에 적합한 냉동기 등의 여러가지 방식으로 행해질 수 있다.

플레이트는 보관 용기에 넣기 전에 어떠한 외부 패킹없이 심지어 입자로 분쇄될 수 있다.

대규모의 양을 동결하는 공정에 사용되는 시간은 전형적으로 사용 용기 (예, 파우치의 두께)와 사용 냉동기에 따라 적어도 5시간 내지 10시간, 더 바람직하게는 10시간 내지 12시간, 가장 바람직하게는 12시간 이하이다.

양호한 결과를 수득하기 위해, 전술한 대량에 대한 본 발명에 따른 전체 냉동보존 공정 (30분 평형 단계 이후부터 시작)이 6시간 내지 8시간 보다 짧으면 안된다. 5시간 미만의 동결 시간으로도 일부 생존성이 달성되지만, 대규모 배치에서 최적이 아닌 것으로 확인되었으며, 이 경우 긴 동결 시간이 일반적으로 짧은 동결 시간 보다 생존성이 양호하였다. 전형적으로, 동결보존 공정은 공정에 이용되는 부피에 따라 12시간 내지 24시간 소요된다. 냉동기의 내부 냉각 매질이 공기인 냉동기를 사용하는 대신, 액체 냉동기를 사용할 수 있다. 이 경우, 동결 공정 및 열 방출을 보다 효율적으로 조절할 수 있어, 동결 시간을 단축할 수 있다.

본 발명에 따른 방법으로, 따개비류의 알, 노플리우스 및 사이프리드 (cyprid)를 대규모로, 예를 들어, 전체 약 5 g 내지 1 kg 이상을 냉동보존할 수 있다. 냉동보존 분야에서 일반적인 공정은 바이얼 및 스트로 (전형적으로 0.5 - 1.5 ml)에서와 같이 ㎖ 또는 ㎕ 규모로 유기체를 냉동보존하는 것이다. 이러한 대량의 냉동보존을 달성하기 위해, 동결방지제 (동결보호제)는, 본 발명에 따라 적용되는 초기 매우 느린 2단계 동결 공정에서와 같이, 장기간, 이러한 타겟 유기체에 허용되는 것으로 생각되는 것 보다, 고 농도로 사용된다. 전형적으로, 이러한 장기간의 저속 동결 공정을 이용하여, 동결보호제를 약 3.2몰 보다 더 높은 고 농도로 사용하는 경우, 장기간의 노출시 독성 효과를 나타내어, 냉동보존 처리되는 유기체에 상당한 사망을 유발할 것으로 예상된다.

따라서, 본 방법의 주요 이점은 동일한 유닛에서 많은 양을 냉동보존할 수 있다는 것이다. 기존에 공지된 기술들은 이렇듯 대량의 부피에는 적합하지 않아 실패하므로, 소생율이 떨어지거나 또는 소생하지 못한다. 본 발명의 맥락에서, 유기체가 소생되었을 때 정상적으로 헤엄치는 움직임을 보인다면 성공적으로 소생된 것이다.

본 발명에 따른 냉동보존은 연안 지역에 서식하는 생명 초기 단계의 따개비류용으로 개발 및 허가된다. 전형적으로, 이들 유기체에는 차가운 환경을 견디기 위한 내인성의 보호용 부동 단백질 (endogenous protective anti-freeze protein)이 발달되어 있다.

본 발명에 수행되는 바와 같이, 함께 냉동보존할 많은 양 (동물의 많은 수)을 동일 배치에서 보존하는 경우, 물질 전체적으로 균일한 온도 분포를 달성하기 위해 매우 느린 동결 공정이 매우 중요하다. 에틸렌 글리콜과 같은 고 농도의 동결보호제와 규정된 염 농도와 조합하여, 매우 느린 동결, 긴 동결 시간에 기초한 본 발명에 따른 냉동보존 프로토콜을 이용함으로써, 심지어 대규모 동결로 보존처리하는 경우에도 보존된 유기체의 우수하고 재현가능한 생존성을 달성할 수 있었다.

본원에 개시된 프로토콜을 이용함으로써, 따개비류 종의 알, 유생 및 치어를 냉동보존할 수 있다. 이에 대한 예로는 세미발라누스 발라노이데스 (Semibalanus balanoides) 및 발라누스 크레나투스 (Balanus crenatus) 종이 있다. 세미발라누스 발라노이데스 종의 노플리우스는 발라누스 암피트리트 (Balanus amphithrite) 및 발라나누스 임프로비시스 (Balananus improvises) 등의 선행 기술 분야에 공지된 냉동보존된 따개비 노플리우스 보다 더 크다. 유기체의 크기가 클수록, 일반적으로 냉동보존 방법에 의해, 특히 삼투 평형 (osmotic equilibrium)이 달성되어야 하는 방법으로 보존하기 더 어렵다. 발라누스 크레나투스 (길이 240 ㎛, 폭 100 ㎛)는 세미발라누스 발라노이데스 (길이 320 ㎛, 폭 150 ㎛)에 비해 노플리우스의 크기가 실질적으로 더 작다.

대부분의 일반적인 동결보호제, 특히 세포 침투성 동결보호제는 상당히 대량 부피로 사용된다. 전형적으로 동결보호제 : 생물학적 물질의 부피 비는 1:1이어야 한다. 본 발명에서는, 소생 효율에 영향 없이 동결보호제를 훨씬 적은 부피로 사용할 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용할 경우, 동결보호제 20-25% : 따개비류 물질 70-75% 부피 비로 사용할 수 있다. 이는 종종 유해한 화합물의 사용을 줄이고, 취급 및 보관해야 하는 전체 부피를 줄일 수 있어, 확실히 유익하다. 또한, 따개비류를 소생시킬 때 화합물 폐기량이 적다.

본 발명과 관련된 또 다른 새로운 측면은, 세포내 결정화를 방지하기 위해 동결 전 첨가한 동결보호제와 삼투 평형을 달성하기 위해 통상적으로 주어지는 시간이 다른 유기체들에 비해 따개비류에서는 덜 중요한 것으로 보인다는 것이다.

에틸렌 글리콜 이외에, DMSO 등의 다른 공지된 동결보호제 뿐만 아니라 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤의 혼합물도 본 발명의 방법으로 사용할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 생명 초기 단계의 따개비류는 이러한 유기체의 알, 유생 (예, 노플리우스 단계) 및 치어를 포함하는 것을 의미한다. 특히, 메로플랑크톤 단계 (meroplanktonic stage) 등의 이들 해양 유기체의 자유 부유 생장 단계 (planktonic free-living stage)를 포함한다.

균일한 온도 분포는 혼합물 (산물) 내부 온도에 차이가 없거나 또는 그 차이가 매우 낮은 것으로 이해된다.

온도 도달은, 동결보존 중에 물질내 규정된 균일한 온도 ±2℃가 달성되는 것으로 이해된다.

혼합물내 유기체의 결정화 온도는 결정화 중에 발생하는 혼합물의 온도 상승 (에너지 방출)을 측정함으로써 정할 수 있다. 이러한 온도 상승은 대개 본 발명에 따른 동결보호제의 결정화로 인한 방출 보다 더 낮은 온도에서, 즉 동결 공정의 후기에서 발생한다. 혼합물내에서 유기체는 전형적으로 약 -13℃이지만, 동결보호제, 예를 들어 에틸렌 글리콜은 약 -20℃ 내지 -22℃에서 결정화된다.

대규모의 냉동보존은 이 방법이 전형적으로 소형 스트로 및 마이크로리터 또는 밀리리터 규모와 같이 기존의 기술로 냉동보존되는 양 보다 현저하게 많은 양을동일한 유닛 또는 배치에서 냉동보존하는데 적합하다는 것으로 이해된다. 동일 유닛 (용기)에서 동시간대에 동시에 보존 처리되는 양은 전형적으로 5 g 이상 (수백 g 또는 1 kg 이상)이다. 그러나, 필요에 따라 이 보다 적은 부피 또는 양에도 본 방법을 사용할 수 있음을 배제하는 것은 아니다. 따라서, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 방법이 대규모 냉동보존에만 유일하게 사용하는 것으로 제한되지 않으며, 더 소규모의 양 및 부피에서 사용될 수 있음을 알 것이다.

냉동보존된 유기체의 소생

냉동보존된 유기체의 효율적인 소생은 여러가지 방법으로 달성할 수 있다. 동결된 유기체를 포함하는 파우치를 30 - 40℃의 수조에서 해동시킬 수 있으며, 이때 파우치는 파우치 내부에서 균일한 온도 분포를 달성하기 위해 거의 연속적으로 니딩 (kneading)된 것이 중요하다. 해동 후, 유기체를 100 ㎛ 필터 메쉬 위에 부어, 바닷물 (바람직하게는 10℃ 미만)로 세척하여 동결보호제를 제거한다. 세척 후, 노플리우스를 통기성 바닷물 (aerated seawater) (5℃ 미만, 바람직하게는 0℃ 내지 3℃)에서 3시간 이상 소생시켜, 양호한 수영 활동을 회복시킨다. 심지어 10시간 내지 36시간 범위에서 보다 우수한 수영 활동을 보인다. 소생 단계 동안에 해동된 노플리우스의 온도를 어류 탱크의 온도까지 천천히 적응시킬 수 있다.

더 바람직하게는, 해동 후 유기체에서 심지어 더 우수한 수영 활동이 나타나므로, 체 또는 필터 위에서 파우치의 냉동된 내용물을 뭉개고, 바람직하게는 10℃ 보다 낮은 바닷물로 계속 세척한다. 세척 후, 노플리우스를 통기성 바닷물 (5℃ 미만, 바람직하게는 0℃ 내지 3℃)에서 3시간 이상 소생시켜, 양호한 수영 활동을 회복시킨다. 심지어 6시간 내지 36시간 범위에서 보다 우수한 수영 활동이 나타난다. 해동된 노플리우스의 온도는 소생 단계 동안에 어류 탱크 온도까지 천천히 적응시킬 수 있다.

다른 예로, 해동된 유기체의 심지어 보다 우수한 활력 달성 (vitality)은, 파우치의 분쇄된 내용물을 공기가 공급되는 해수 탱크에서 인큐베이션하는 방법이다. 이 방법의 단점은 어류 유생의 사료 개시와 같이 향후 이용시 유해할 수 있는 동결보호제가 유기체/물에 많이 잔류할 수 있다는 것이다. 동결보호제로서 에틸렌 글리콜을 이용하는 경우, 개시 사료 1 L 당 최종 농도가 100 ppm을 초과해서는 안된다.

파우치의 내용물을 5℃ 미만의 통기성 바닷물 소량으로 부수고, 해동될 때까지 (부피에 따라, 전형적으로 15분 내지 30분 후) 인큐베이션하는 방법이 보다 더 바람직하다. 그 후, 동결보호제를 포함하는 물은 120 ㎛ 미만의 메쉬 크기의 필터를 사용해 제거한다. 그 후, 동물은 소생 및 온도 적응을 위해 바닷물이 채워진 탱크로 이동시킨다. 이를 위해, 동물은 전형적으로 수 시간 동안 그곳에 둔다. 탱크내 온도는 개시 시점에 5℃ 미만이어야 한다. 인큐베이션하는 동안, 온도는 사용할 타겟 어류 양식장의 온도까지 조심스럽게 높일 수 있다.

파우치의 내용물을 5℃ 미만의 다량의 공기가 공급되는 해수 중에서 부수고 (또는 펠릿 또는 액체 질소 보관 용기에서 직접 사전-분쇄), 바닷물로 계속적으로 >4시간 동안 세척하고 (희석 속도 시간 당 >5-10L), 8시간 이상 소생시킨다. 이 유기체를 해양 유생에 사료로 공급하기 전에, 필요한 온도까지 온도 적응시킬 수 있다.

선택적으로, 슈크로스와 같은 활성제를 해동 및 소생시 이용할 수 있다.

본 발명의 구현예들은 이하 실시예들을 들어 추가로 설명된다. 본 발명에 따른 바람직한 구현예에 해당되는 기술한 실시예들은 하기 단계를 포함한다:

1. 연안 지역에서 선택 따개비류, 예를 들어 세미발라누스 발라노이데스 (Semibalanus balanoides) 또는 조간대에서 발라누스 크레나투스 (Balanus crenatus)의 알 및/또는 노플리우스/유생/발생 초기 단계의 회수 또는 증식 (cultivating).

1. 선택적으로, 중간 보관을 위해 유기체를 통기된 물 홀딩 탱크로 이동시킴.

2. 물 배액을 위해 필터 상에서 적량의 유기체를 여과함.

3. (얼음 위에 둔) 7.2M 에틸렌 글리콜 용액을 필터에서 배액시킨 물질에 1:4 내지 1:1 (부피) 비율로 첨가한다. 이론적으로, 유기체와 충분히 평형화된다면, 혼합물내 에틸렌 글리콜의 최종 농도는 3.6 M이 된다. 그러나, 상기에서 설명되고 아래 실험들에서 확인된 바와 같이, 유기체의 동결보호제 흡수는 매우 낮다. 이는 평형이 100%가 아니며, 이들 유기체의 경우 <15%이라는 것을 의미한다. 동결보호제는 40% 에틸렌 글리콜 및 60% 해수를 부피:부피 (30 PSU; PSU 실용 염분 단위 (Practical salinity unit) = g/kg) 비율로 포함한다 (이는 7.2M 용액에 해당됨). 바닷물은 에틸렌 글리콜과 혼합하기 전에 최종 50-70 PSU로 염 첨가된다.

4. 혼합된 유기체 및 동결보호제 혼합물 전형적으로 약 600 g을 플라스틱 파우치 (예, 500 mm x190 mm x 10mm; 극저온 내성 재료로 제조됨)에 넣고, 5℃에서 30분간 (평형) 인큐베이션하거나 또는 다른 적절한 용기에 넣는다.

5. 냉동보존 처리할 유기체와 동결보호제가 수용된 파우치/용기를 프로그림 설정가능한 냉동기 또는 일반적인 울트라-냉동기에 이동시켜 동결시킨다.

6. 혼합물을 약 -12℃ 내지 -13℃의 온도에서 냉동한다. 파우치 약 600 g의 경우, +5℃에서 -12℃까지, -0.05 내지 0.5℃/분의 동결 속도를 적용한다. 약 -13℃에서부터 약 -39℃까지는, -0.025 내지 -0.07℃/분의 동결 속도를 적용하여, 물질 전체에 온도가 균일하게 분포되게 한다. 이 단계에서는, 물질에 균일한 온도 분포가 달성된다면, 더 빠른 동결 속도를 유기체를 손상시키지 않으면서 적용할 수 있다. 홀딩 시간을 이용하는 경우가 이에 해당된다 (상기 참조).

7. 혼합물내 유기체는 전형적으로 -12℃ 내지 -16℃ 범위에서 결정화가 시작된다. 이 범위에서, 열 방출로 인한 온도 상승은 가능한 낮아야 한다. 이는 분당 약 -0.02℃ 내지 -0.1℃의 바람직한 동결 속도에 의해 달성된다. 다른 예로, 결정화 개시 전에 파우치에서 균일한 온도 분포가 달성되도록 온도를 수시간 동안 약 -12℃ 내지 -15℃에서 일정하게 유지시킬 수 있다.

8. 동결보호제는 약 -22℃의 온도에서 결정화된다. 이 범위에서, 열 방출로 인한 온도 상승은 가능한 적어야 한다. 이는 분당 -0.02 내지 -0.1℃, 바람직하게는 분당 -0.04℃의 바람직한 동결 범위에 의해 달성된다. 다른 예로, 결정화 개시 전에 파우치에서 균일한 온도 분포가 달성되도록 온도를 수시간 동안 약 -22℃ 내지 -25℃에서 일정하게 유지시킬 수 있다.

9. 전형적으로 -0.01 내지 -0.1℃/분, 바람직하게는 -0.04/분의 저속 동결 속도를, 약 -25℃에서부터 약 -38℃ 내지 -43℃까지의 온도 범위에서, 적용한다. 이 단계에 소요되는 시간은 바람직하게는 5시간 내지 20시간, 바람직하게는 12시간 내지 20시간이어야 한다.

10. 냉동된 물질은 냉동기에서 신속하게 꺼내, 액체 질소로 옮겨 극저온 온도 (예, -196℃)에서 소생시까지 보관한다.

실험 섹션

실험 1 - 독성 검사

세미발라누스 발라노이데스의 따개비 노플리우스 단계 I 및 II를 7.2 M 에틸렌 글리콜 용액 (스톡 용액)에 노출시키고, 얼음 위에 두었다. 0, 1, 2, 4, 8, 12, 및 24시간 후, 샘플을 취하고, 동결보호제를 세척하여 노플리우스의 생존력을 체크하였다. 생존력 수준을 0, 1, 2, 3, 4 및 5로 식별하였다. "0"은 활동이 없는 것이고 (죽은 노플리우스), 1-3은 냉동보존 전 노플리우스에 비해 부속 기관의 트위칭 (twitching) 저하, 그러나 3은 정상 수영 활동에 가깝다. 4는 냉동보존되기 전 노플리우처럼 수영하는 상태이고, 5는 과-자극된 노플리우스이다. 놀랍게도, 노플리우스가 모두 회복되었으며 (레벨 2-3), 비교적 양호한 수영 행태를 심지어 동결보호제에 24시간 노출시킨 이후에도 나타내었다 (개체의 80-90%).

심지어 24시간 후 높은 생존력은, 따개비 노플리우스 단계 I 및 II가 놀랍게도 장기간 에틸렌 글리콜 고 농도를 허용할 수 있다는 것을 의미한다. 이는, 그 농도가 전형적으로 장기가 노출시 유해한 것으로 간주되므로, 에틸렌 글리콜이 동물에 제한적인 수준으로만 흡수된다는 것을, 의미하는 것일 수 있다. 평형화가 이루어지는 동안 에틸렌 글리콜이 제한적으로 흡수된다는 가설은, 해동 후 소생시킨 냉동보존된 따개비 노플리우스에 대한 에틸렌 글리콜 분석을 통해 뒷받침된다 (또한, 하기 참조). 해동 직후, 노플리우스에서 물을 배액시키고, 다시 냉동시켰다. 노플리우스에서 에틸렌 글리콜 함량을 분석하였다. 그 결과, 유기체에 동결보호제는 단 5% 흡수된 것으로 나타났다. 에틸렌 글리콜 중 일부가 이미 분석 전 해동 과정에서 유기체 밖으로 방출된 것일 수도 있지만, 유기체내 에틸렌 글리콜의 농도는 아마 동결보호제와의 완전한 평형 상태 보다 훨씬 적다.

실험 2 - 여러가지 동결보호제를 이용한 냉동보존

여러가지 동결보호제의 적합성을 본 발명의 냉동보존법을 이용하여 후술한 검사로 테스트하였다. 본 실험에 사용된 냉동보존법과 해동 공정에 대한 상세 설명은 다음과 같다:

따개비 노플리우스 (세미발라누스 발라노이데스 또는 발라누스 크레나투스)에서 배액시키고, 농화 (건조 중량 10%) 후 (얼음 위) 동결보호제와 1:1로 혼합하였다. 이 혼합물을 파우치에 넣고 (동결보호제 300 ml 및 따개비류 300 ml로 구성된 600 g), 밀봉 후 5℃에서 30분간 평형화한 후, 조절된 냉동기로 이동시켰다. 파우치를 알루미늄 랙에 넣고, 온도 이력 기록 장치를 파우치와 냉동기 안에 넣어 공기 온도를 측정하였다. 다른 예로, 더 적은 양 약 60 g 또는 바이얼도 검사에 이용하였다.

본 발명의 방법을 이용해 >12시간 동안 5℃에서부터 -42℃까지 냉각시킨 후, 파우치의 내부 온도가 균일하게 -196℃에 도달할 때까지 파우치를 액체 질소에 넣었다. 파우치는 175 L의 극저온 용기 (액체 질소 충진된)로 이동시켜, 48시간 이상 보관하였다. 생존력을 체크하기 위해, 파우치를 극저온 용기에서 꺼내, 분쇄하여 내용물을 취하고, 차가운 (5℃ 미만의) 해수에서 해동시켰다. 15분 후, 해동된 노플리우스를 100 ㎛ 필터 상에서 세척하여 동결보호제를 제거하였다. 30 PSU 바닷물이 수용된 공기 공급 탱크 (aerated tank)에서 >8시간 동안 소생을 수행하였다 (2.5℃에서 시작).

A) 에틸렌 글리콜:

세미발라누스 발라노이데스 또는 발라누스 크레나투스의 따개비 노플리우스 단계 I 및 II를, 동결보호제로서 7.2 M 에틸렌 글리콜 용액을 이용해, 동결보호제와 유기체를 1:1로 혼합한 후, 냉동보존 처리하였다. 해동 후 높은 생존력이 달성되었으며, 정상적인 수영 활동 (레벨 4)이 >50% 관찰되었으며, 나머지는 수영 활동이 1-3 (정상 보다는 낮지만, 각각 정상적인 수영 활동에 가까움)이었다.

B) 다이메틸 설폭사이드:

세미발라누스 발라노이데스의 따개비 노플리우스 단계 I 및 II를, 동결보호제로서 6 M 다이메틸 설폭사이드 (DMSO) 용액을 이용해, 동결보호제와 유기체를 1:1로 혼합한 후, 냉동보존 처리하였다. 3-5℃에서 30분간 평형화를 수행하였다.

DMSO는 에틸렌 글리콜 보다 독성이 높으므로, 그로 인해 해동 후 생존성이 에틸렌 글리콜에 노출된 따개비 노플리우스와 비슷함에도 불구하고, 바람직하지 않은 대안이다.

C) 글루코스 또는 프로필렌 글리콜:

에틸렌 글리콜을 글루코스 또는 프로필렌 글리콜로 교체하고 (40% 글루코스, 메탄올 또는 프로필렌 글리콜, 바닷물 60%와 혼합; 에틸렌 글리콜 3.4 M, 프로필렌 글리콜 5.4 M), 본 발명에 따른 냉동보존 방법을 적용하여 (부피비 1:1) 세미발라누스 발라노이데스의 따개비 노플리우스 단계 I 및 II로 테스트하였다. 일부 낮은 생존성이 관찰되었지만, 해동 후 노플리우스의 생존율은 동결보호제로서 에틸렌 글리콜과 비교해 매우 낮았다.

D) 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤:

동결보호제로서 여러가지 혼합물, 즉 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤 혼합물의 효과를, 본 발명에 따라 냉동보존 처리 후, 세미발라누스 발라노이데스의 따개비 노플리우스 단계 I 및 II의 생존성으로 테스트하였다. 본 실험에서, 25, 50 또는 75% 에틸렌 글리콜을 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤 (부피/부피)로 대체하였다. 에틸렌 글리콜의 75%를 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤로 교체한 결과, 7.2 M 에틸렌 글리콜 용액 (유기체와 1:1 부피비)과 비교해 생존성이 훨씬 낮게 관찰되었다. 에틸렌 글리콜의 50%를 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤로 교체하면 보다 우수한 생존성이 관찰되었으며 (50% 프로필렌 글리콜이 50% 글리세롤 보다 훨씬 우수한 결과를 발생시킴), 25% 프로필렌 글리콜을 동결보호제로서 사용한 경우 에틸렌 글리콜과 비슷하거나 또는 보다 우수한 생존성이 달성되었다. 25% 글리세롤이 50% 글리세롤 보다 결과가 우수하였지만, 여전히 25% 프로필렌 글리콜 보다는 결과가 훨씬 좋지 않았다.

프로필렌 글리콜이 에틸렌 글리콜 보다 독성이 적기 때문에, 25% 프로필렌 글리콜과 75% 에틸렌 글리콜 혼합물이 본 발명에 따른 냉동보존에, 특히, 해양 생사료 대체 먹이로서 사용할 경우에, 바람직한 동결보호제이다.

실험 3 - 동결보호제를 여러가지 부피비로 사용하여 냉동보존처리

보존 처리할 유기체의 부피에 대한 동결보호제의 여러가지 부피비 효과를 테스트하였다. 세포내 침투성 동결보호제는 일반적으로 보존처리할 유기체 : 동결보호제 50% : 50% 부피비로 첨가된다.

세미발라누스 발라노이데스의 따개비 노플리우스 단계 I 및 II의 생존성에 대해, 동결보호제 에틸렌 글리콜의 여러가지 부피비 효과를 테스트하였다. 이 유기체 샘플을, A) 30% 동결보호제 : 70% 유기체 (부피/부피) 및 B) 40% 동결보호제 : 60% 유기체 (부피/부피)의 부피비로 냉동보존 처리하였다. 대조군은 C) 50% 동결보호제 : 50% 유기체 (부피/부피)이었다. 모든 검사는 3세트로 수행하였다.

유기체를 본 발명의 방법에 따라 냉동보존처리한 후 소생시켰다. 처리군 간에 생존성에 유의한 차이는 없었다.

이들 결과는, 동결보호제의 극소량이 따개비류에 실제 흡수되는 것으로 보이며, 냉동보존 처리 중에 세포내 보호가 필요하다는 것을 뒷받침해준다. 이는, 동결보호제가 세포내 흡수되고, 그 농도가 동결 전 평형에 도달하기 위해 매우 높아야 한다는 것이, 소생에 중요한 것으로 알려진 다른 유기체들과는 대조적이다. 놀랍게도, 이는 따개비류 노플리우스에 유효한 것으로 보이지 않는다. 따개비 노플리우스는 본 발명에 개시된 방법에 따라 수행하는 경우, 냉동보존시 동결 단계 이행 전에 동결보호제와의 평형 확립에 의존하는 것으로 보이지 않는다. 이는 본 발명의 맥락에서 행해진 관찰 결과에 의해 추가로 뒷받침되는데, 유기체는 평형에 도달하기 전에 냉동보존처리될 수 있다 (실험 4 참조).

실험 4 - 생존성에 대한 평형 기간의 효과

동결보호제와 평형에 도달되기 전의 시간으로 단축한 인큐베이션 시간의 효과를 세미발라누스 발라노이데스의 I 및 II기 노플리우스 샘플로 테스트하였다.

유기체를 7.2 M 에틸렌 글리콜 중에 5℃에서 0, 15, 30, 60 및 90분간 (유기체와 1:1 부피비로) 인큐베이션하였다. 그 후, 유기체를 본원에 기술된 방법으로 냉동보존처리하여 액체 질소에서 48시간 둔 다음 해동 및 소생시켰다. 따개비 노플리우스의 생명력을 양안 현미경으로 분석하였다. 처리군들 간에 생명력에 유의한 차이는 관찰되지 않았지만, 단 90분간 둔 샘플의 경우에는 다른 처리군과 비교해 유기체의 생명력이 낮게 관찰되었다

실험 5 - 따개비류의 세포내 동결보호제 흡수

세미발라누스 발라노이데스의 I 및 II기 노플리우스를, 7.2M 에틸렌 글리콜 용액을 유기체와 1:1 부피비로 사용해 본원에 기술된 바와 같이 600 g 팩에서 동결보존처리하였다. 이를 해동시킨 후, 노플리우스에서 물 배액 직후 에틸렌 글리콜을 분석하였다. 작은 냉동 물질 조각을 필터 상에서 취하여, 해동될 때까지 헹군 다음 냉동 및 분석하였다. 이것은 0시간대 샘플로서, 7400 - 11000 ppm 에틸렌 글리콜이 검출되었다. 이는, 에틸렌 글리콜의 약 5%가 유기체에 흡수되었다는 것을 의미한다. 아마 가능하게는, 에틸렌 글리콜의 유출이 발생할 수 있지만, 에틸렌 글리콜의 >10%가 유기체 내부에서 검출될 수 있다고 보긴 어렵다. 완전한 평형시 유기체 체내에서 3.6 M 에틸렌 글리콜이 검출될 것으로 예상된다. 7.2 M 에틸렌 글리콜 스톡 용액은 농도가 400　000 ppm이다. 샘플 600 g을 바닷물 15 L로 이동시켜, 15분 후 (배액 및 냉동) 분석한 결과, 첨가한 에틸렌 글리콜의 <2% 또는 약 0.1 M 에틸렌 글리콜에 해당하는 6100 내지 7000 ppm의 에틸렌 글리콜이 검출되었다. (양식장에서 제품의 세척을 따라하기 위해) 2차 단계로, 물 배액과, 따개비 노플리우스를 세척하기 위한 바닷물 15 L의 첨가를 실시한 경우, 유기체 체내 농도는 <300 ppm이었다. 따개비 노플리우스에는, 소생시키기 위해, 다시 바닷물 배액 후 바닷물 30 L를 투입하였다. 1시간 후, 배액시킨 따개비 노플리우스의 체내 에틸렌 글리콜 함량은 <25 ppm이었다. 2시간 후, 배액시킨 따개비 노플리우스의 체내 함량은 검출 수준 10 ppm 미만이었다. 수생 동물의 에틸렌 글리콜 허용 수준은 매우 가변적이지만, 100 ppm 이하의 농도는 일반적으로 수생 유기체에 무독성으로 간주된다.

이들 결과는, 동결보호제 대략 5%가 실제 유기체에 흡수된다는 것을, 보여준다. 이는, 세포내 작용하는 동결보호제에 의한 동결보존 처리시 다른 유기체에서 이런 타입의 동결보호제에 대해 보고된 흡수성과는 대조적이다. 따개비류는 동결보호제를 높은 비율로 흡수하지 않는 것으로 보인다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이는 저온 노출이 드물지 않은 연안 지역에서 서식하는 이들 유기체에 이미 존재하는 내인성 부동성 물질의 결과일 수 있다.

실험 6 - 사료로 사용하기 위해 펠릿화된 냉동보존처리된 따개비류

본 발명은 냉동보존된 사료 입자 또는 펠릿의 제조 방법을 추가로 기술한다. 향후 해양 양식 목적으로 개시 사료로서 사용하기 위해 작은 유닛에서 펠릿화된 사료 입자를 효율적으로 제조하기 위한 검사를 수행하였다.

본 발명에서, 소생율이 높은 냉동보존처리된 펠릿화된 사료 입자를 2가지 방법으로 제조할 수 있는 것으로, 확인되었다.

A) 본원에 기술된 방법에 따라 이미 냉동보존처리한 대규모 물질 배치, 예를 들어 수백 g의 물질을 포함하여 액체 질소 중에 보관된 파우치/플레이트를, 액체 질소에서 더 작은 입자/펠릿으로 기계적으로 분쇄할 수 있다. 테스트는 7.2 M 에틸렌 글리콜을 유기체와 1:1 부피비로 사용하여 본원에 기술된 바와 같이 600 g 파우치에서 수행하였다. 수득한 입자는 어떠한 방식으로의 패킹 또는 밀봉없이 액체 질소에 바로 보관할 수 있다. 분쇄는, 분쇄시 액체 질소에서 7달 이상 보관한 경우에도, 향후 소생율에 어떠한 영향도 미치지 않았다.

B) 본원의 프로토콜을 이용해 전형적으로 5 - 50 ml의 작은 부피로 유기체를 냉동시켜, 제어된 냉동보존 냉동기에서 펠릿을 제조할 수 있다. 이 펠릿은 7.2 M 에틸렌 글리콜을 유기체와 1:1 부피비로 사용하고 본원에 따른 냉동보존 공정에서 적정 크기와 형태의 실리콘 몰드를 사용해 제조하였다. 이로써 표준화된 입자/펠릿 형태 및 크기를 달성할 수 있다. 이 몰드에서 냉동 처리는, 심지어 액체 질소에서 7달 이상 보관한 경우에도, 이후 소생에 영향을 미치지 않았다.

Claims (24)

1. 따개비류 (barnacle)의 알, 노플리우스 (nauplius) 및/또는 치어 (juvenile)의 냉동보존 방법으로서,
   상기 방법은 하기 순서로 수행되는 단계:
   - 유기체로부터 물을 배액하는 단계,
   - 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 다이메틸 설폭사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 동결보호제 (cryoprotectant) 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 5 - 8 M 동결보호제 용액을 투입하는 단계,
   - 결과 생성된 혼합물의 하기의 단계에 따라 용기에서 동결시키는 단계:
   (i) 상기 혼합물에서 유기체의 결정화 (crystallizing)가 개시되는 온도에 도달할 때까지, -1℃/분 이하의 제1 저속 동결 속도로 동결하는 단계;
   (ii) 상기 혼합물 중 유기체 및 동결보호제가 완전히 결정화될 때까지, -0.1℃/분 이하의 제2 저속 동결 속도로 동결하는 단계; 및
   (iii) 극저온 저장 온도까지 제1 급속 동결 속도로 동결하는 단계
   를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 제1 저속 동결 속도가 -0.5℃/분 이하, 또는 -0.3℃/분 이하, 또는 -0.1℃/분 이하인, 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 제1 동결 단계 이전에, 평형 단계가 5 - 60분간, 또는 15분 - 30분간, 또는 15분간 수행되는, 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 제2 저속 동결 속도가 -0.015 내지 -0.1℃/분, 또는 -0.04 내지 0.08℃/분, 또는 -0.05℃/분, 또는 -0.04℃/분인, 방법.
5. 제1항에 있어서,
   배액된 상기 유기체는 배액 후의 건조 중량 함량 (dry weight content)이 6 - 14%, 또는 8 - 12%, 또는 10%인, 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 유기체에 첨가되는 상기 동결보호제의 농도가 6 - 8 M, 또는 6.5 M - 7.5 M, 또는 7.2 M인, 방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 동결보호제가 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 혼합물, 또는 50% 에틸렌 글리콜과 50% 프로필렌 글리콜의 혼합물, 또는 75%의 에틸렌 글리콜과 25%의 프로필렌 글리콜의 혼합물인, 방법.
8. 제1항에 있어서,
   하나의 유닛에서 냉동보존되는 물질의 양이 5 g 내지 10 g, 또는 10 내지 50 g, 또는 50 내지 100 g, 또는 200 g 내지 2000 g인, 방법.
9. 제1항에 있어서,
   상기 제1 저속 동결 속도로 동결하는 단계는, 물질의 균질 온도 (homogenous temperature)가 -10℃ 내지 -13℃, 또는 -12℃ 내지 -13℃에 도달되면, 종료되는, 방법.
10. 제1항에 있어서,
    전체 동결 과정이 적어도 5시간, 또는 6 - 10시간, 또는 10 - 12시간, 또는 12시간 보다 길게 지속되는, 방법.
11. 제1항에 있어서,
    상기 유기체는 적절한 크기의 몰드, 또는 실리콘으로 제작된 몰드에서 5 - 50 ml, 또는 10 - 25 ml의 부피로 냉동보존되는, 방법.
12. 제1항에 있어서,
    유기체는 플레이트 또는 파우치에 냉동보존되고,
    냉동보존된 유기체를 포함하는 플레이트 또는 파우치를 액체 질소내에서 더 작은 입자로 분쇄하고, 수득되는 입자는 패킹 (packing)없이 액체 질소에 저장되는, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따라 냉동보존된 유기체의 소생 방법으로서, 상기 방법은,
    - 30-40℃의 온수 수조 안에서 해동시키는 방법;
    - 냉동된 물질을 분쇄하고 10℃ 이하의 차가운 해수가 흐르는 조건 하에 세척한 후 <5℃에서 36시간 이하의 시간 동안 소생시키는 방법; 또는
    - 냉동된 물질을 분쇄하여, 이를 10℃ 이하의 공기 공급되는 해수 (sea water with aeration) 중에 인큐베이션한 후 <5℃에서 36시간 이하의 시간 동안 소생시키는 방법으로부터 선택되는 방법을 이용하는, 소생 방법.
14. 제13항에 있어서,
    해동된 유기체는 해동된 유기체가 공급될 양식장의 수온까지 해동된 후 이용되는, 소생 방법.
15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는, 냉동보존물 또는 냉동보존 사료.
16. 해양 어류 유생 (marine fish larvae) 및 무척추동물에 대한 생사료 (live feed)로서 생명 초기 단계 (early life stage)의 따개비류를 사용하는 방법으로서,
    상기 생명 초기 단계의 따개비류가 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 냉동보존된 후 소생된 것인, 방법.
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