ES2788741T3

ES2788741T3 - Uso de savia de árbol para conservar líneas celulares espermáticas

Info

Publication number: ES2788741T3
Application number: ES16786993T
Authority: ES
Inventors: Meg Robinson
Original assignee: Cryosaps LLC
Current assignee: Cryosaps LLC
Priority date: 2015-04-27
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2020-10-22
Anticipated expiration: 2036-04-26
Also published as: EP3288378B1; WO2016176200A1; EP3288378A1; CA2984241A1; EP3288378A4; US10681907B2; US20200267969A1; CA2984241C; US20180146659A1

Abstract

Un método de crioconservación de esperma que comprende: a. combinar el esperma que se va a crioconservar y una composición que comprende (1) un crioprotector, que comprende una o más savias de árbol; y (2) un medio extensor para producir una combinación esperma/medio; y b. someter la combinación a condiciones que lleven a la crioconservación del esperma, produciendo así una combinación crioconservada que comprende esperma crioconservado.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de savia de árbol para conservar líneas celulares espermáticas

Antecedentes

En general, la presente invención se refiere al uso de savia de árbol para crioconservar celulares espermáticas de aves y mamíferos, preferentemente para su uso en la industria avícola, en la conservación de aves de presa y en la conservación de especies aviares amenazadas o en peligro. La presente invención se puede usar también en la industria bovina, la industria porcina, la industria equina y en medicina veterinaria de mamíferos.

Los espermatozoides de las aves tienen una forma que hace que sean difíciles de congelar. Los espermatozoides son largos y delgados y tienen forma de látigo. Esto hace que las células sean muy susceptibles a las lesiones criogénicas ya que tienen un área superficial muy grande que puede ser dañada con facilidad durante la congelación o el procesamiento. El esperma de mamíferos también se beneficiará de la presente invención, ya que, incluso aunque estas células son más fáciles de congelar, siguen siendo susceptibles a lesiones debidas a los procesos criogénicos. (Referencia; "Avian Semen Cryopreservation: What Are the Biological Challenges?", J.A. Long, 2006 Laboratorio de biotecnología y germoplasma, Instituto de Recursos Naturales y Animales, Centro de investigación agrícola de Beltsville, Servicio de investigación agrícola, DAEU, Beltsville, MD 20705, 2006 Asociación de ciencias avícolas, Inc., aceptado el 10 de septiembre de 2005).

Actualmente, se congelan espermatozoides de ave utilizando diversas técnicas. Una técnica emplea la adición de un crioprotector a un medio fluido que suspende y sustenta a las células. La primera etapa del procedimiento es recoger el semen y añadirle después un extensor líquido. Un extensor de semen es un diluyente líquido que se añade al semen para mantener su capacidad de fertilización. El extensor permite transportar el semen hasta la hembra, en lugar de tener que aproximar el macho y la hembra entre sí. Un extensor de congelación especial permite también la crioconservación del esperma ("semen congelado"), que se puede transportar para su uso, o para usar in situ en una fecha posterior.

La mezcla extensor/células se coloca después en un refrigerador para enfriar la mezcla hasta una temperatura deseada que permita a las células alinear los componentes lipídicos en su membrana celular externa antes de la congelación. Esto es una forma de "aclimatación al frío" y ayuda a las células a sobrevivir al proceso criogénico. El método reduce también la disminución del gradiente térmico, por el que han de pasar las células antes de alcanzar el punto de congelación, y reduce el daño celular cuando son congeladas.

Una vez que las células se han enfriado/aclimatado, se añade el crioprotector a la mezcla extensor/células, la mezcla se envasa rápidamente y, o bien se somete a congelación ultrarrápida mediante inmersión rápida en el nitrógeno líquido, se granula y se congela de forma ultrarrápida y después se envasa en crioviales, o bien se suspende sobre el nitrógeno líquido y se expone a los vapores para una congelación más lenta antes de su inmersión en el nitrógeno líquido. Se puede efectuar la congelación rápida y la congelación lenta en función de los requerimientos de la especie. Los diferentes crioprotectores que se añaden a la mezcla incluyen habitualmente DMSO (dimetilsulfóxido), MA (metilacetamida) y DMA (dimetilacetamida). Estos compuestos químicos actúan como crioprotectores intracelulares mientras que los compuestos químicos a los que no es permeable la pared celular actúan como crioprotectores extracelulares. Estos son conocidos también por dañar la pared celular durante la crioconservación y perjudicar la fertilidad.

En la técnica sigue siendo necesario un modo mejor y más eficaz para conservar el semen de aves y mamíferos. Los siguientes documentos también hacen referencia a:

• Blanco et al. (2012) Animal Reproduction Science, 131 (1-2): páginas 1-8 relativas a los efectos de las velocidades de congelado y descongelado sobre la criosupervivencia de esperma de pavo y de grulla canadiense; y

• KR-A-2012/0123213 relativo a una composición para la conservación de esperma aviar y a un método de conservación que emplea la misma.

Sumario de la invención

En una realización, la presente invención es un método de crioconservación de semen que comprende (a) combinar el esperma que se va a crioconservar y una composición que comprende (1) un crioprotector, que comprende una o más savias de árbol; y (2) un medio extensor para producir una combinación esperma/medio y (b) someter la combinación a condiciones que lleven a la crioconservación del esperma, produciendo así una combinación crioconservada que comprende esperma crioconservado. En una versión de la invención, el esperma es esperma aviar. En una versión, el esperma procede del azor del norte (Accipiter gentilis).

En otra versión de la invención, el esperma procede de una especie mamífera no humana, seleccionada preferentemente entre el grupo que consiste en vacas, cerdos y caballos.

En una versión de la invención, la savia es savia de arce o savia de abedul, preferentemente savias de primer flujo. En una versión, la presente invención es la combinación crioconservada resultante del método descrito anteriormente.

En otra versión, la presente invención es un método de fertilización de un óvulo que comprende las etapas de descongelar una combinación crioconservada producida mediante el método de la invención e introducir la combinación en un óvulo no fertilizado, en el que el óvulo llega a ser fertilizado. En una versión adicional, la invención es una composición que comprende una mezcla de un medio de conservación y esperma, en la que el medio de conservación comprende: (1) un crioprotector, que comprende una o más savias de árbol; y (2) un medio extensor.

Descripción de la invención

En general, la presente invención es un método y un medio que son útiles para la crioconservación de esperma que emplean savias de árbol. En otra realización, la presente invención es una composición que comprende la mezcla del medio de conservación y el esperma, que emplea savias de árbol.

Aunque la presente invención es útil para todos los espermas animales, la invención se usa más preferentemente con esperma aviar debido a las especiales necesidades fisiológicas de las muestras aviares. Especies aviares preferentes incluyen aves de presa (tales como falconiformes y estirigiformes) y especies comerciales tales como pavos, pollos (galliformes) y patos (anseriformes). Otras especies aviares preferentes incluyen, si bien no se limitan a las mismas, paseriformes y psitaciformes.

En otra versión de la invención, puede ser deseable conservar el esperma de otras especies mamíferas que incluyen vacas (familia de los bóvidos), cerdos (familia de los suidos), caballos (familia de los equinos) y aplicaciones en medicina veterinaria, incluyendo especies caninas (cánidos) y felinas (félidos).

Un método de crioconservación de esperma que comprende: (a) combinar el esperma que se va a crioconservar y una composición que comprende (1) un crioprotector, que comprende una o más savias de árbol; y (2) un medio extensor para producir una combinación esperma/medio; y (b) someter la combinación a condiciones que lleven a la crioconservación del esperma, produciendo así una combinación crioconservada que comprende esperma crioconservado.

El extensor de esperma habitual contiene normalmente compuestos químicos para estabilizar y proteger las membranas celulares. Los ejemplos que siguen emplean la fórmula del extensor de pavo de Beltsville (Beltsville Turkey Extender o BTE) con la excepción de que se elimina la fructosa como ingrediente. La fructosa se sustituyó por sacarosa y constituye una fórmula de extensor aparte, también una realización preferente de la presente invención. Se encontró que al semen de azor no le iba bien con la fructosa como fuente de energía cuando se sometía a crioconservación. Esta observación es cierta también para otras líneas celulares animales.

La fórmula del extensor preferente para el semen de azor, y otras muestras de semen aviar normales, consiste en

Esto constituye una fórmula completa del extensor preferente para semen de azor para crioconservación. La sacarosa se excluye a menudo de esta fórmula y se suministra simplemente mediante la adición de savias de árbol que contienen sacarosa de forma natural. Otras fórmulas de base pueden ser preferentes para otras líneas celulares en otras especies de modo que cumplan los requerimientos específicos de la especie. El azúcar suministrado a la fórmula puede proceder de la savia como en la lista de ejemplos de la hoja de cálculo Excel.

La presente invención implica el uso de savia de árbol como crioprotector. La savia de árbol es un fluido transportado en células del xilema (traqueidas o elementos de los vasos) o en elementos de tubos cribosos del floema de una planta. Se definen dos tipos de savia: la savia del xilema y la savia del floema. En la presente definición se incluyen ambos tipos de savia.

La savia de árbol se produce en un momento del año en el que los árboles están sometidos a estrés por frío y a congelación en intervalos de temperatura que son muy dañinos para las células que los inventores están intentando congelar. Los árboles sobreviven a temperaturas desde el punto de congelación hasta -51 °C (-60 °F). Los árboles sobreviven también a los cambios diarios de las temperaturas en los que el árbol puede sobrevivir a temperaturas por encima del punto de congelación o por debajo del mismo. La savia de árbol tiene propiedades que le permiten sustentar la vida celular incluso cuando está congelada y cuando pasa por rigurosos ciclos de congelación y descongelación y temperaturas extremas diariamente. Contiene varios azúcares, proteínas anticongelantes, carbohidratos, minerales, compuestos fenólicos y otros compuestos que proporcionan propiedades crioprotectoras. Algunos de estos compuestos ya han sido descritos.

Las especies de árboles que son más útiles en la presente invención incluyen especies de arce resistentes al frío, especies de abedul, especies de chopo, especies de álamo temblón y otros árboles que pueden ser sangrados o de los que se pueden extraer compuestos químicos o fluidos. Se incluyen las especies de árboles de los bosques caducifolios de mayor latitud aunque no se mencionen de forma directa en el presente documento.

Un factor común de estos árboles es la cantidad de azúcar en la savia. Los azúcares tienen propiedades crioprotectoras. Algunas fórmulas de extensor aviar requieren a menudo un 0,5 % de sacarosa o de fructosa. La mayoría de las especies de árboles cumplen o superan este requerimiento de porcentaje de azúcar. El arce presenta un intervalo desde aproximadamente un 0,5 % a un 4,0 % de sacarosa. Otro factor común que tienen estos árboles es que tienen compuestos crioprotectores distintos al azúcar en su savia. Estos compuestos químicos pueden proporcionar mayores propiedades crioprotectoras que los azúcares simples que se miden fácilmente.

Hay más de 128 especies de arce en todo el mundo. El arce azucarero (Acer saccharum) y el arce negro (Acer nicirum) producen la mayor parte del azúcar en sus savias. El arce rojo (Acer rubrum) y el arce plateado (Acer saccharinum) producen menos azúcar pero están en latitudes en las que probablemente posean propiedades crioproctectoras similares en su savia. Estas dos últimas especies son una de las versiones preferentes de la presente invención debido a su menor contenido de azúcar y a sus potencialmente superiores propiedades crioproctectoras en la savia que no proceden de los azúcares.

Las especies de abedul (Familia Betulaceae, Género Betula), chopo (Familia Salicaceae, Género Populus) y álamo temblón (Familia Salicaceae, Género Populus) proceden de latitudes mayores de los Estados Unidos y Canadá y tienen un menor contenido de azúcar en su savia que las especies de arce (especies de Acer). Los compuestos químicos crioprotectores distintos al azúcar presentes en su savia probablemente estarán en mayor cantidad ya que estas especies sobreviven en un medio más extremo con intervalos de temperatura que varían ampliamente por debajo del punto de congelación, y los árboles tienen un menor contenido en su savia de azúcares conocidos por ser crioprotectores.

Veintitrés especies de árboles que pueden ser sangrados en Estados Unidos y que son útiles en la presente invención incluyen, si bien no se limitan a los mismos, el arce azucarero (Acer saccharum), arce negro (Acer nigrum), arce rojo (Acer rubrum), arce plateado (Acer saccharinum), arce de Noruega (Acer platanoides), arce negundo (Acer negundo), arce de hoja grande (Acer macrophyllum), arce cañón o arce de dientes grandes (Acer grandidentatum), arce de las Montañas Rocosas (Acer glabrum), gorosoe (Acer mono), nogal gris americano o nogal blanco americano (Juglans cinerea), nogal negro americano (Juglans nigra), nogal japonés (Juglans ailantifolia), nogal inglés (Juglans regia), abedul papirífero (Betula papyrifera), abedul amarillo (Betula alleghaniensis), abedul negro (Betula lenta), abedul de río (Betula nigra), abedul gris (Betula populifolia), abedul blanco europeo (Betula pendula), sicomoro (Platanus occidentalis), arce de Manchuria, y carpe negro o falso carpe (Ostrya virginiana). Preferentemente, se empezaría con fórmulas de extensor diseñadas para la conservación o almacenamiento de esperma animal. Normalmente, la cantidad inicial de savia añadida a la fórmula de extensor modificada constituirá la solución inicial fisiológicamente próxima a la osmolaridad del semen crudo y proporcionará crioprotección a las células. El intervalo de osmolaridad inicial requerido se determina mediante la medición de la osmolaridad del semen crudo.

El semen de azor tiene una osmolaridad de aproximadamente 341 miliosmoles. Adiciones posteriores de combinaciones extensor/savia aumentan la osmolaridad de la mezcla para deshidratar las células inmediatamente antes de congelar. La deshidratación de las células justo antes de su congelación, aumenta su supervivencia.

Se determina un nivel ideal de osmolaridad mediante los resultados finales de la supervivencia de las células en cuestión y la capacidad de la muestra almacenada para crear gametocitos femeninos fértiles. Es conocido que diferentes especies de aves tienen células espermáticas que toleran extremos de osmolaridad diferentes. Algunos espermatozoides aviares sobreviven a una osmolaridad muy elevada y otros no. [Véase "Species Variation in Osmotic, Cryoprotectant, and Cooling Rate Tolerance in Poultry, Eagle, and Peregrine Falcon Spermatozoa"; Juan M. Blanco, George Gee, David E. Wildt, y Ann M. Donoghue; Biology of Reproduction, 1 Oct de 2000, Vol. 63 n.° 4 1164-1171]. El uso de la savia permite eliminar otros crioprotectores tóxicos de la mezcla y/o reducir la cantidad de crioprotectores tóxicos usados. Además, puede ser deseable añadir crioprotectores adicionales a la mezcla.

Una combinación esperma/savia-extensor normal de la presente invención es la siguiente: El volumen final de la combinación esperma/savia-extensor no debe ser superior a diluciones 1:3 constituyendo el semen un cuarto del volumen final. Diluciones del semen mayores que esta pueden afectar a la fertilidad por simple dilución.

En una versión preferente de la invención, la savia comprende al menos un 30 % de la combinación final esperma/savia-extensor. En otra versión de la invención, la savia comprende al menos un 10-80 % de la combinación final esperma/savia-extensor, preferentemente aproximadamente un 50 %.

La dilución en exceso reduce la fertilidad espermática de la muestra. La cantidad de savia necesaria para proporcionar crioprotección a la mezcla varía considerablemente debido a la variación entre las especies de árboles en cuanto a tipos y propiedades de los crioprotectores.

El presente inventor ha estado modificando la fórmula del extensor lo suficiente como para permitir que la savia se combine en la mezcla de modo que esta mezcla sustente las células cuando son congeladas en nitrógeno líquido (N2L) con o sin el uso de un crioprotector adicional. Un ejemplo normal de extensor incluye los ingredientes secos del extensor de pavo de Beltsville sin la fructosa (BTE menos fructosa) como fórmula de base con la que trabajar. La savia del arce y del abedul se añadieron después al BTE menos fructosa y se usó en diferentes proporciones a fin de conservar las células espermáticas. Una fórmula que conservó bien las células en N2L incluía 1 parte de semen crudo, 1 parte de BTE menos fructosa con un 0,5 % de sacarosa añadida de nuevo, 2 partes de BTE menos fructosa con savia añadida, a fin de suministrar su volumen líquido. El esperma y el BTE menos fructosa con un 0,5 % de sacarosa añadida de nuevo; se mezclaron en un vial Eppendorf de 0,5 ml en el refrigerador. El volumen correspondiente de BTE menos fructosa con savia como su diluyente líquido se colocó también en el refrigerador aunque en un tubo separado. Se dejaron equilibrar ambos tubos a una temperatura igual durante 10 minutos antes de mezclarlos, envasarlos y someterlos a congelación ultrarrápida. La operación se efectuó en el refrigerador a 6 °C (42 °F) de modo que no hubiera fluctuaciones de temperatura que estresaran al semen. Esta forma de "aclimatación" al frío permite a los componentes lipídicos de la pared celular alinearse antes de su congelación para ayudar a prevenir daños de la estructura celular.

Por tanto, una versión preferente de la presente invención comprende una composición, en la que 1 parte del volumen es semen crudo; 1 parte del volumen es extensor, tal como BTE sin fructosa, más un 0,5 % de sacarosa añadida de nuevo; y 2 partes del volumen total era BTE sin fructosa con savia de arce o de abedul. Preferentemente se debe usar en esta mezcla un mínimo de un 50 % de savia en volumen. Las muestras con un 50 % de savia en volumen tenía una supervivencia mucho mejor tras descongelar que las muestras con un porcentaje menor.

El envasado consistió en la colocación del semen en un tubo capilar de 75 |jl recubierto con Mylar con uno de los extremos sellado. El extremo opuesto se mantuvo abierto. Este tubo capilar se colocó después dentro de una pajuela para aves de plástico convencional y el extremo opuesto del algodón se dobló para cerrarlo. A continuación, la pajuela para aves se colocó dentro de una pajita de plástico que tenía orificios practicados en los laterales. Estos orificios permitían que el L2N entrara y rodeara rápidamente la pajuela para aves a medida que se sumergía esta. Los orificios en la pajita permitían también al envase drenar y respirar a medida que se descongelaba para no explotar.

La crioconservación se puede llevar a cabo en cualquier momento después de la producción de la combinación medio/esperma siempre que el almacenamiento no afecte negativamente a la viabilidad del esperma. Por ejemplo, la crioconservación se puede llevar a cabo a menudo en un periodo de hasta 180 minutos tras la producción de la combinación esperma/medio sin pérdida de fertilidad. Las muestras deben enfriarse para extender la vida útil antes de congelar. Una temperatura normal para almacenar semen aviar de es 5 °C. El enfriamiento del semen ayuda a que se alineen los componentes lipídicos de la pared celular antes de su congelación. Esto aumenta la supervivencia de las células.

La conservación se efectúa normalmente a una temperatura de -198 °C. En realizaciones específicas, la crioconservación se efectúa a una temperatura entre aproximadamente -80 °C y aproximadamente -198 °C. En una realización preferente, la crioconservación tiene lugar en un baño/cartucho de nitrógeno líquido y los viales se almacenan a -198 °C. El almacenamiento a largo plazo se puede conseguir colocando los viales o pajuelas de almacenamiento en un cartucho de nitrógeno líquido. Sería deseable usar el esperma conservado para fertilizar un gametocito femenino, célula germinal femenina u óvulo.

Antes de usar el esperma para inseminación artificial o de incubarlo con un gameto femenino, normalmente el esperma se descongela y también se puede lavar. Las muestras de esperma se descongelan a menudo en baños de agua fría o de agua templada, estando determinados los requerimientos de temperatura por los requerimientos de las células de la especie y por el tipo de crioprotector usado en la mezcla. Los espermatozoides aviares se descongelan normalmente en baños de agua helada o en baños de agua fría y los espermatozoides bovinos se descongelan normalmente en baños de agua templada que es la temperatura corporal. La inseminación se efectúa inmediatamente después de la descongelación. El esperma se concentra a veces en gránulos con los contenidos de diferentes pajuelas combinados y se centrifuga para formar un gránulo de semen.

En todas las realizaciones descritas en el presente documento, el esperma crioconservado resultante se puede almacenar indefinidamente.

La capacidad de fertilización o la capacidad del esperma se pueden evaluar empleando métodos conocidos por los expertos en la materia, tales como métodos in vitro, que incluyen evaluar la capacidad para fertilizar los oocitos/gametos femeninos con los que se combinan/incuban (su capacidad para formar embriones, por ejemplo) y/o métodos in vivo, que incluyen evaluar la producción de crías por las hembras en las que se han implantado los oocitos/gametos femeninos fertilizados (mamíferos). La capacidad de fertilización o la capacidad se pueden evaluar empleando métodos disponibles tales como un ensayo funcional que incluye, si bien no se limita a los mismos, un ensayo de motilidad, un ensayo de viabilidad, un ensayo de hemizona (unión del esperma a la zona pelúcida), o penetración del semen en oocitos de aves o mamíferos sin zona.

La comercialización de la crioconservación de semen aviar ha evitado a los científicos durante décadas. El proceso de congelación no ha tenido el suficiente éxito. Artículos recientes citan aproximadamente de un 35 a un 40 % de motilidad del semen después de descongelar. Véase; "Comparative cryopreservation of avian spermatozoa; Benefits of non-permeating osmoprotectants and ATP on turkey and crane sperm cryosurvival". de Juan M. Blanco, Julie Long, George Gee, David E. Wildt, Ann M. Donoghue. Recibido el 24 de mayo de 2010. Aceptado el 10 de diciembre de 2010. Elsevier B.V.

La presente invención, que comprende la mejora del empleo de savia como único crioprotector, demostró a menudo más de un 50 % de supervivencia basada en las tinciones vivos/muertos efectuadas después de descongelar las muestras. Algunos ejemplos mostraban hasta un 73 % de supervivencia tras descongelar sin el uso de un crioprotector adicional. Tras combinar esta exitosa idea con las otras exitosas ideas de la ciencia en la actualidad, la supervivencia del semen probablemente será lo suficientemente elevada como para constituir una empresa de crioconservación de semen comercialmente viable.

Otras especies animales se beneficiarán probablemente de esta invención también. Existen numerosos artículos de científicos intentando congelar el semen de otras especies animales con éxito limitado. El empleo de savia de árbol recolectada en el primer deshielo del invierno y usada en crioconservación de líneas celulares es un éxito excitante y ahora documentado. El éxito de este proceso se debe evaluar también basado en la mejora de la fertilidad y la capacidad de eclosión de los huevos producidos por hembras inseminadas con semen congelado.

Ejemplos

En general, la presente invención se refiere al uso de savia de árbol para crioconservar líneas de esperma aviar, preferentemente para su uso en la industria avícola, en la conservación de aves de presa y en la conservación de especies aviares amenazadas o en peligro y otras especies aviares. También es útil en cerdos (familia de los suidos), vacas (familia de los bóvidos), caballos (familia de los equinos) perros (familia de los cánidos) y gatos (familia de los félidos).

La tabla 1 contiene los resultados de muchas pruebas experimentales. En general, se obtuvo savia de arce de árboles nativos del suroeste de Wisconsin. La osmolaridad del arce # 3 es de 100 miliosmoles.

Los ingredientes secos crudos para el medio preferente fueron los siguientes: La fórmula del extensor de pavo de Beltsville sin la fructosa; tenía savia de arce o savia de abedul añadida para un volumen final de 100 ml. (el inventor añadió 90 ml de savia para conseguir un volumen final de los ingredientes secos y húmedos totales de 100 ml). El inventor comenzó con un conjunto de ingredientes secos que era para 1/10 de la fórmula convencional enumerada anteriormente. Añadió 90 ml de savia de arce a un frasco y 90 ml de savia de abedul a otro frasco para tener un volumen final de 100 ml en cada frasco. No se añadió ningún otro crioprotector a la mezcla. La fructosa se había eliminado de modo que la fuente de energía para el semen provenía de la sacarosa que ya había en la savia. Las células que se están intentando conservar no parecen metabolizar bien la fructosa y necesitan sacarosa en la fórmula para sobrevivir a la congelación.

La savia se usó con su concentración máxima en los frascos de reserva, aunque se usó en diferentes proporciones cuando se añadió al semen crudo. A veces se usó una dilución 1:1:2 (1 parte de semen: 1 parte de BTE sin fructosa, más un 1/ % de sacarosa: 2 partes de BTE más savia); a veces se usó una dilución 1:1:1. A veces se usó una dilución 1:1:1 en donde la mezcla final era de un 33 % de semen y un 66 % de savia, añadiendo la savia a la mezcla de base y a la mezcla final antes de la congelación. En todos los casos, no se añadió otro crioprotector a la muestra y se usó solamente la savia para conservar las células en el nitrógeno líquido. Las células sobrevivieron en gran porcentaje incluso cuando no se añadió a la mezcla un crioprotector (penetrante o no penetrante) adicional.

Los experimentos se efectuaron también usando savia del abedul de Alaska. Igualmente, a los ingredientes secos crudos para el extensor de pavo de Beltsville sin fructosa (1/10 del volumen de la fórmula convencional) se añadió savia de abedul para un volumen final de 100 ml. [La fórmula para un volumen convencional de un litro de BTE se ha enumerado anteriormente]. No se añadió ningún otro crioprotector a la mezcla.

La savia de arce se almacenó en botellas de plástico de 100 ml, con aproximadamente 16 botellas por caja de cartón, con la parte superior abierta. La parte superior de la botella expulsó los minerales y otros compuestos químicos dejando cristales de hielo arriba. El centro de la botella no se congeló y permaneció en un estado casi vítreo sin congelarse completamente después de 24 horas. Este tipo de congelación es crítico para tener éxito cuando se efectúa la crioconservación. Evita la formación de cristales de hielo que dañan las células. [Referencia; "Investigation of Chemical and Physical Properties of Southwestern Wisconsin Maple Syrup"; de Hiroyuki Takano, tesis presentada en cumplimiento parcial de los requisitos para el Master del Grado de ciencias con especialización en Ciencias alimentarias y nutricionales. Martin G. Ondrus, director de tesis; Escuela de Posgrado de la Universidad de Wisconsin-Stout, diciembre de 2005]

La savia del abedul se obtuvo en Alaska a través de una empresa de sirope llamada Alaska Wild Harvest LLC, dba Kahiltna Birchworks, PO Box 2267, Palmer, Alaska 99645. El inventor obtuvo savias de primer y segundo flujo para experimentación. Esta savia contiene tres veces menos azúcar en promedio que la savia de arce. Este árbol procede de latitudes mayores que están sometidas a temperaturas y cambios de temperatura más severos que los de los bosques de Wisconsin. La savia de abedul se congela muy lentamente en el arcón congelador y de forma similar a la savia de arce mencionada en el párrafo anterior.

La primera muestra de semen que se congeló procedía de un azor del norte (Accipiter gentilis) macho usando una fórmula de extensor que se modificó para incluir la savia de arce. Esta fórmula consistía en todos los ingredientes secos del extensor de pavo de Beltsville con los porcentajes habituales, pero sin fructosa. Se añadieron 90 ml de savia de arce para un volumen final de 100 ml. (Esto es, 1/10 de la fórmula convencional del BTE). Un cien por cien del líquido añadido a la fórmula era savia de arce. El contenido de sacarosa de la savia de arce se da en la bibliografía como una cantidad del 2-2,6 %. No se midió el nivel exacto de sacarosa de esta savia aunque se estimó que era de aproximadamente un 2 % ya que era una savia de primer flujo. El nivel mínimo de azúcar necesario para el extensor de pavo de Beltsville es del 0,5 %. Por tanto, esta fórmula acabó conteniendo más azúcar (que el extensor comercial) ya que la savia tenía 4-5 veces el nivel de azúcar necesario, de forma natural.

Esta primera fórmula contenía 4-5 veces el azúcar necesario, haciéndolo hiperosmolar de modo que el esperma perdía gradualmente motilidad a temperatura ambiente. Sin embargo, una muestra de semen congelado (muestra # 69, tabla 1) del azor del norte (Accipiter gentilis) se sometió inmediatamente a congelación ultrarrápida después de mezclarlo con la combinación extensor-savia 1:2 (1 parte de semen y 2 partes de combinación extensor-savia) y un 58 % de las células sobrevivieron al proceso de congelación y descongelación basándose en la tinción vivos/muertos (eosina/nigrosina) y observaciones visuales. Esta muestra se descongeló en un baño de agua fría a aproximadamente 12,8°C (55 °F) después de estar en el cartucho de nitrógeno líquido durante un día. Estas células siguieron perdiendo motilidad a aproximadamente o exactamente la misma velocidad que una muestra que se había mezclado y mantenido a temperatura ambiente debido a la constitución química de la muestra. Sin embargo, las células sobrevivieron al proceso de congelación permaneciendo esencialmente inalteradas. La motilidad y el movimiento linear de las células permanecieron prácticamente intactos, al no ser modificados por el proceso de congelación. Este fue el primer éxito documentado del inventor y superó sus expectativas. La supervivencia de las células tras la congelación demostró un gran éxito.

No se introdujeron otros crioprotectores en la muestra. Esta fórmula es claramente hiperosmolar (y perjudicial para las células) ya que contenía al menos un 2 % de sacarosa y el esperma solo necesitaba un 0,5 % de sacarosa. El inventor halló un 58 % de supervivencia después de descongelar basándose en la tinción vivos/muertos (eosina/nigrosina) de esta primera muestra. Se contaron un centenar de células usando un contador de células de laboratorio convencional y se estableció este simple porcentaje. Este superaba a las referencias de la bibliografía del 25 % con crioprotectores convencionales tales como DMA y MA. Una tasa de supervivencia superior al 25 %, preferentemente superior al 40 % o al 50 %, indica el éxito del experimento.

Se congeló después una segunda muestra de 22 |jl de semen (muestra #81, tabla 1). Se añadieron 22 |jl de extensor de pavo de Beltsville, sin fructosa, más un 0,5 % de sacarosa, al semen en un tubo Eppendorf de 0,5 ml y se colocó en el refrigerador. Se colocaron 44 j l de BTE con savia de arce en un tubo separado, también en el refrigerador a 5,6 °C (42 °F). Los dos líquidos se combinaron tras su aclimatación en el refrigerador durante 10 minutos. El volumen total fue de 88 jl. La muestra se envasó en 2 tubos capilares de 75 j l recubiertos con Mylar, colocados en pajuelas para aves, estas se colocaron después en pajitas ventiladas y se sometieron a congelación ultrarrápida. Ambas pajuelas se descongelaron en un baño de agua a 12,8°C (55 °F). Se produjeron 2 pajuelas a partir de una muestra de semen. La muestra 1 tenía un 25-30 % de esperma vivo con motilidad progresiva y con una velocidad de desplazamiento normal y una tinción vivos/muertos de 50 vivos/50 muertos. La segunda pajuela tenía un 55 % de motilidad progresiva con motilidad normal y una tinción vivos/muertos de 57 vivos/43 muertos. La supervivencia del semen aumentó cuando el porcentaje de savia de arce se redujo al 50 %.

Se congelaron muestras adicionales de semen de este azor macho. Los resultados se enumeran en la tabla 1, tabla que expone muestras de semen en las que se usó savia de arce o savia de abedul exclusivamente para la crioconservación. El semen del azor del norte (Accipiter gentilis) se usó en todos los experimentos.

En la tabla 1 el inventor enumera las muestras que han tenido éxito y las que no en la columna titulada "¿Esta muestra es factible?" Las muestras se registraron como Sí, No, y Quizás. Hay una columna que registra el éxito o la falta de éxito; de modo que es sencillo revisar rápidamente la tabla buscando a lo largo de esta única columna. Se tuvo éxito al congelar muestras en N2L en cuanto se comenzó a añadir la savia de arce natural a la fórmula. Las células de semen sobrevivieron a la crioconservación cuando se usó solamente savia de árbol como crioprotector, incluso cuando no se usaron otros crioprotectores químicos. Las muestras del inventor sobrevivieron al trauma de la congelación casi como si no hubieran sido nunca congeladas; y continuaron nadando a su velocidad normal en línea recta. Finalmente las células perdieron motilidad debido a problemas con la solución en la que se encontraban. Cabe señalar particularmente que algunas de las muestras sobrevivieron con porcentajes de supervivencia y motilidad incluso mayores sin la adición de otros crioprotectores y en las que solamente se usó la savia. La muestra 84 sobrevivió la que mejor y está próxima a los porcentajes máximos de supervivencia y motilidad registrados, conocidos por los científicos que trabajan en este campo de la crioconservación, con una tinción vivos/muertos en % de 73V/27M y una segunda muestra con una tinción vivos/muertos en % de 64V/36M. Las muestras 67, 69, 70, 71, 72, 80, 81, 84, 93, 97, 118, 120, 126 y 128 muestran resultados muy prometedores con una motilidad progresiva hacia adelante y unos porcentajes de la tinción vivos/muertos enumerada en la lista anterior. En la tabla siguiente se enumeran igualmente otras muestras que muestran también esta tendencia.

Algunas de las muestras mostraban características de inactividad y, de acuerdo con la tinción vivos/muertos, sobrevivieron a la congelación aunque no eran móviles. Las células vivas no absorben la tinción vivos/muertos y aparecen blancas sobre el portaobjetos del microscopio, incluso cuando ya no son móviles. Estas muestras probablemente no están muertas y se pueden "resucitar" y hacerlas móviles con técnicas conocidas. Muchas de las muestras tenían células con características celulares gruesas normales tras la congelación y no parecían estar distorsionadas o dañadas por el proceso de congelación; en las tinciones vivos/muertos. Estas tinciones se han conservado para futuras referencias.

La savia es el ingrediente clave para la crioconservación ya que no es tóxica, no tiene agentes contagiosos que transmitir al esperma, es abundante, tiene propiedades crioconservantes claves, está en estado líquido de forma natural, se puede recolectar sin contaminación bacteriana, y no es viscosa (espesa) de modo que no afecta a la motilidad espermática a través del medio fluido. Es un producto natural que es muy improbable que contenga compuestos químicos adulterantes.

Se prevén optimizaciones normales de la presente invención. En primer lugar, será necesario desarrollar la base líquida optimizada que sustenta las líneas celulares que han de ser conservadas y modificarla después para permitir la adición de la savia a la mezcla en varios porcentajes, de modo que la savia no añada compuestos químicos en concentraciones que podrían matar a las células, sino que sigan permitiendo la crioconservación. (Por ejemplo, la osmolaridad de la savia de arce que obtuvo el inventor era de 100 miliosmoles). Esta osmolaridad parece ser demasiado elevada cuando se añadía directamente a los ingredientes secos de la fórmula de pavo de Beltsville que no tenía fructosa añadida a la misma. Las células sobrevivieron a la congelación en un estado excelente, aunque perdieron motilidad posiblemente debido a la hiperosmolaridad del aproximadamente 2 % de sacarosa de la savia de arce).

En segundo lugar, el ingrediente de savia se puede optimizar simplemente seleccionando diferentes especies de árboles para usar. El contenido de azúcares en las savias varía según la especie de árbol y lo mismo para los otros compuestos químicos que actúan como crioprotectores naturales distintos a los azúcares. Los productores de sirope usan arces que producen la mayor parte del azúcar y algunos productores de sirope usan abedules para este proceso. Ellos saben que si la savia de arce se reduce por ebullición, se requieren 20-50 unidades por unidad de sirope. Si la savia de abedul se reduce por ebullición, se requieren 150 unidades por unidad de sirope. Los productores de sirope tienden a no usar especies de arce que producen un contenido bajo de azúcar en la savia. Además, estos árboles sobreviven también a las temperaturas rigurosas y a los extremos de temperatura, y se deben adaptar bien para sobrevivir sin azúcar como crioprotector principal, lo que implica que otros compuestos químicos de la savia distintos a los azúcares, están actuando como tal.

Adicionalmente, puede ser deseable usar una combinación de savias. Se usaron combinaciones de las fórmulas de savia de arce y abedul en la experimentación registrada en la tabla 1. Se consiguieron altas tasas de éxito con esta combinación.

Adicionalmente, la savia recogida en diferentes momentos durante el proceso de sangrado puede dar algunos resultados beneficiosos. Las savias de flujo posterior son más bajas en los azúcares observados en el primer flujo, mientras los árboles todavía están sufriendo y sobreviviendo al estrés por temperaturas extremas. La osmolaridad de las savias recogidas en diferentes momentos puede ser ventajosa.

Adicionalmente, los extractos de las savias pueden proporcionar beneficios mediante el descubrimiento de proteínas o compuestos anticongelantes recientemente descubiertos que se podrían usar con este proceso. [Referencia; "When plant cells can survive ultra-low temperatures"; Pawl M. Pukacki, Laboratorio de fisiología de estrés abiótico, Instituto de dendrología, Academia polaca de ciencias, Kornik, Polonia].

Fórmulas adecuadas del extensor para 2015 y estudio de supervivencia de semen

Fórmula número 1; Extensor de pavo de Beltsville, sin fructosa, más 90 ml de savia de arce, procedente del sangrado de primer flujo, c.s. hasta 100 ml. Fechado en botella el 11/3/2015 y mezclado el 27/3/2015. El pH inicial se registró como 7,5 y después, tras haberlo mezclado, el pH era de 6,73 con el dispositivo del inventor.

La savia de arce tiene un 2-2,6 % de sacarosa que es 4-5 veces más elevado e hiperosmolar. El BTE contiene normalmente un 0,5 % de fructosa. Sin embargo, a los huevos de azor no les va bien la fructosa y deben tener sacarosa para sobrevivir.

Fórmula número 2; Extensor de pavo de Beltsville, sin fructosa, más 90 ml de savia de abedul de Alaska, savia de primer flujo, c.s. hasta 100 ml, fechado en botella el 11/3/2015 y mezclado el 11/4/2015. El pH inicial se registró como 7,5 y después, tras la mezcla, el dispositivo del inventor dio una lectura de 7,62.

Fórmula número 3; Extensor de pavo de Beltsville, sin fructosa, más un 0,5 % de sacarosa, más un 16 % de metilacetamida en peso. El pH era de 7,78. Más 0,2 mg de inositol (deberían haber sido 0,02 mg de inositol). Tenía un volumen total de aproximadamente 10 ml

Fórmula número 4; Extensor de pavo de Beltsville, sin fructosa, más un 0,5 % de sacarosa. El pH era de 7,36. El agua se hirvió y probablemente tenga una baja presión de oxígeno.

Las fórmulas de Purdy eran una simple adición de savia de arce, en volumen, al BTE. Las osmolaridades eran las enumeradas.

BTE, Control, sin savia añadida, 352 mOsm

BTE, 5 % de savia de arce, 339 mOsm

BTE, 10 % de savia de arce, 326 mOsm

BTE, 20 % de savia de arce, 308 mOsm

La osmolaridad del 20 % de savia de arce era demasiada baja para sustentar las células debido al hinchamiento de las mismas.

<

o

uaujos |ap eiauaM Ajadns el A o |ua iu ieuaaeui|B

lo aiqos soueiueuioo

IP/Buj ua e$oon|6 ap io a in sa BJisan ¿ueiiquoej ^bj* 3 ? Josua)xa:uauias upiojodojd

U3UI3S |3p c jo id a a a j e u i||e o

eianfed ap o d ij, ua anbu eB7)!|B pD pO a| j aus a a idn nb a | ya

o)ua;ujeudoeiu|e ua epnfed e\ ap ojuajiuipuay

epnfed ap od;i

ez(|eDO| as anb |a ua anbuej |ap aiuajdjoay

e j j s a n u j B| ap uopepBuoo ap opo^

uaiuas |ap epudAiAjadns B| A o)ua!UJBuaoeui|e

la ajqos soueiuaiuoQ

josua)xa:uauias uopjodojd

uaujas pp Bjojdaoaj

e u n iB Q

ajuBuop oqoB^

uauias pp ep|6ooaj ap eqoaj

o J d iu n N

ojuaiujBuaD0Uj|e ua epnfed e\ ap o)ua;uJ!pua^

epnfed ap od;x

ezipaoi as anb |a ua anbuei |ap ajuajdpay

ejjsaniu e| ap uopep6uoa ap opo|/\j

uaujas |ap epuaAjAjadns e| A o)ua;uieua3euj|e |a ajqos souejuauioQ

IP/6uj ua esoan|6 ep pajn ¿aiq;pej sa ejjsanw ejsg?

josuajxa:uaujas uopjodojd

UOUJOS

pp ejojdaoaj eujiieo

ajueuop oipe^

uauias pp ep;6oaaj ap eqoaj

uauias pp osn ap eqaâ !

o j a u j i i N

o)uajujeu3oeuj|e ua eianfed e\ ap ojuaiimpuay

ejanfed ap odjj.

ezüBDoi as anb |a ua anbuB) ^|ap ajuajdpay

ejjsaniu e\ ap uopB|a6uoo ap opo^

uaiuas pp epuaAjAjadns e| A o)ua;iueua3euj|e

|a ajqos souBjuaiuoQ

ip/6iu ua esoon|6 ap |aA|N

¿eiqipej sa ejjsaniu Bjsg?

josuajxa:uaujos uopjodojd

uaiuas |ap ejojdaoaj

e u n iB Q

ajueuop oqoe^j

uauias p p Bp;6ooaj ap Bqoaj

uauias pp osn ap Bqoaj

o ja u jn N

ojuajiuBuaoBiuiB ua epníed e\ ap ojuajiuipuay

eianfed ap od;i

ez;ieoo| as anb |a ua anbuB) |ap ajuaidioay

aiuaXniip ap odjj.

ajuaAnüp |ap nd

ejjsaniu ^b| ap uope|a6uoD ap opô

uauias |ap e p u a A jA ja d n s B| A o)ua¡uieuaaeui|e |a ajqos soue^ uauioo

^{IP /B uj} ua esoan|6 ap p a in ¿aiqipaj sa BJjsanui ejs3?

josua)xa:uauias uopjodojd

uauias |ap ejojdaoaj BU!||B9

ajueuop oqoB^

uaujas |ap ep(6ooaj ap Bqaaj

uauias pp osn ap e ip a j

o ja u jn N

ojuajiuBuaoBuiie ua BianfBd b| ap ojuaiunpuay

ejanfed ap odjj.

^{b z ; | b d o |} as anb |a ua anbuej |ap ajuaidpay

ajueAnnp ap od|i

a)uaAn|;p |ap nd

BJisaniu B| ap uope|a6uoo ap opow

uauias ^pp BpuaAfAjadns B| A 0)ua;iuBua3Biu|B

|a ajqos s o u B ^ u a u iO Q

josua)xa:uaiuas uppjodojd

uauias |ap ^{B jo jd a o a j} BUj||B9

ajueuop oqDB^

uaujas pp Bp;6ooaj ap ^{e ip a j}

uaujas pp osn ap eqoaj

o j a u ip N

o|uaiuieua3eui|e

ua ppnfpd

P| ap ojuaiuJipuBH

ppnfpd ap odij.

pziipaoi as anb ia ua

anbuei iap a iua idpag

aiuaAnpp ap ody.

aiuaAnpp |ap Hd

e jissn u i B| ap

upppjaOuoa ap opo ft

uauias

iap piauaAi/uadns

P1 A O)uaiuipuaopui|p

|9 a iqos soupiuau ioo

IP/6IU

ua psoanib ap ibain

¿ a p ip e *

sa p jisanu i e isg?

josua}xa:uawas

U<?IDJOdOJd

uauias

|ap e jo idaaaj euineo

ojupuop o ip e f t

ti auias

iap epiCoaaj ap e ip a j

uaiuas

iap osn ap t ip a ^

ojouinrg

oiu3!weu0Dew|e ua eianfed ei ap ojuaiiujpuay

eianfed ap odjj.

ezüEoog as anb |a ua anbuej iap ejuaidjoey

ajuaAnnp ap odü

¿ a iq p o e j s a BJisaniu EJS3?

josuajxa:uawas uojojodoid

uaiuas iap Ejoidaoaj eujueo

ajueuop oi|OE|fl

uauias |ap ep;6oaaj ap eqoa j

ua Lúas | a p o s n ap E ip a j

ojauinivi

oiuaiLueuaaeiuie

ua eianfed e|

ap oiuajiuipuay

epnfed ap odij.

ez!|Boo| as

anb |a ua anbuej

|ep aiuajdpay

ajuaAnnp

ap od|i

eiuaAnnp |ap nd

ejisaniu e|

ap uopEiaBuoD

ap opoifl

uawas pp

epuaAjAjadns

El A

oiua|iueuaoEUJ|E

la aaqos

soueiuauioo

IP /B lu ua

esoD n iB ap |aAi[\j

¿aiqjpej sa

EJisanm ejs3?

jo su apta: uawas

uopjodojd

uawas

iap Ejo)daoaj

eui|[Eo

aiuEuop ogaê i

uaiuas

|ap epjboaaj

BP BLJ30J

uaiuas |dp

osn ap eipaj

ojoujniM

oiuBjuieuaoeuiie ua eianfed a| ap oiuajiuipuay

cianfed ap odji

ez¡|eao| as anb | a ua anbue;

|ap ajuajdpay

aiuaAriüp ap odü

e j;s a n u j b | ap uo;ae|a6uo3 ap opoftj

uauias iap a p u a A i A j a d n s B| A ojuaiuieuaDeuiie

la ajqos soue;uaiuoo

IP/6iu ua esoan|6 ap |9a;n

josua;xe:uawas uopjodojd

Llamas I ap ejoidaaaj B U ü i e o

ajueuop oyoei/M

uaiuas iap BpfBooaJ ap Bipaj

uauias iap osn ap Bipaj

ojaiunN

ouauuao e ua Bianfed e| ap ojuaiiuipuay

eianfed ap odfj.

ezj|B30| as anb |a ua anbuei iap ajuaidpay

aiuaÁnnp ap odü

ajuaÁnpp |ap Hd

ejjsaruu e| ap uoiaeiaSuoa ap opoyv

uauias |ap BjouaAjAiadns B| A o i u a j i u B u a o B L u i e

la ajqos

S 0 M e )U 9 L U 03

josuaixa:uaiuas UOIDJOdOJd ----------------- UñlUéS |ap BJoidaoaJ eunieo

a i u B U o p o m d bi a i

uaiuas iap BpiBoaaj ap tnp aj

uaiuas [ap osn ap BLpaj

ojaiun|M

o i u 3 j i u e u 33 e i u | e

ua eianfed ei

ap o íu a iu iip u a y

Bianfed apodij.

ezüeaoi as

anb |a ua enbuej

|ap atuajdpau

ensan tu e\

ap up!3e|a6uoD

ap opow

uauias |ap

eiouaAiAjadns

e| A

OHiaiiueuaaeiuie

|á a jq o s

soueiuaujoo

IP/Buj ua

esoanjG ap |9A|n

¿aiqiP^I sa

ensarno ejsg?

jo s u a ix a iu a iu a s

uopjodojd

--------------uaiuas

|ap e jo jd a n a j

eu¡ ||BO

a ju euop o ipe |/\j

uauias

¡ap epiBoaaj

ap eqaaj

uauias |ap

osn ap BLpaj

ojaiun|M

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de crioconservación de esperma que comprende:

a. combinar el esperma que se va a crioconservar y una composición que comprende (1) un crioprotector, que comprende una o más savias de árbol; y (2) un medio extensor para producir una combinación esperma/medio; y b. someter la combinación a condiciones que lleven a la crioconservación del esperma, produciendo así una combinación crioconservada que comprende esperma crioconservado.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el esperma crioconservado de la etapa (b) demuestra una supervivencia superior al 50 % después de descongelar, tal como se demuestra mediante tinción vivos/muertos con eosina/nigrosina.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la una o más savias de árbol es el único crioprotector.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se añade un crioprotector adicional.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

(i) el esperma es esperma aviar; o

(ii) el esperma procede del azor del norte (Accipiter gentilis).

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el esperma procede de una especie seleccionada entre el grupo que consiste en especies caninas, aviares, bovinas, porcinas y equinas.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

(i) la savia es savia de arce o savia de abedul; o

(ii) la savia es savia de arce o savia de abedul y la savia es savia de primer flujo.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio extensor no contiene fructosa.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo el método la etapa adicional de someter la combinación a una temperatura entre -80 °C y -198 °C durante un periodo de al menos un día.

10. La combinación crioconservada resultante del método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

11. Un método de fertilización de un óvulo que comprende las etapas de descongelar una combinación crioconservada producida mediante un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores e introducir la combinación en un óvulo no fertilizado, en el que el óvulo llega a ser fertilizado.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el huevo es un huevo de ave o un huevo de mamífero.

13. Una composición que comprende una mezcla de un medio de conservación y esperma, en la que el medio de conservación comprende: (1) un crioprotector, que comprende una o más savias de árbol; y (2) un medio extensor.

14. La composición de acuerdo con la reivindicación 13, en la que la savia es al menos el 50 % en volumen de la composición.

15. La composición de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en la que la savia de árbol se selecciona entre savia de abedul o savia de arce.