ES2860710T3

ES2860710T3 - Inhibidores de IL-26

Info

Publication number: ES2860710T3
Application number: ES16739098T
Authority: ES
Inventors: Michel Gilliet; Domizio Jeremy Di; Stephan Meller
Original assignee: Centre Hospitalier Universitaire Vaudois CHUV; University of Texas System
Current assignee: Centre Hospitalier Universitaire Vaudois CHUV; University of Texas System
Priority date: 2015-07-13
Filing date: 2016-07-13
Publication date: 2021-10-05
Anticipated expiration: 2036-07-13
Also published as: US20180207271A1; PT3322724T; DK3322724T3; US10751416B2; PL3322724T3; EP3322724A1; WO2017009392A1; EP3322724B1

Abstract

Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento biológico activo del mismo que se une a IL-26, que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1, CDR2, CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2, CDR3 en las que: (a) la secuencia de CDR1 de la región variable de cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; (b) la secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (c) la secuencia de CDR3 de la región variable de cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; (d) la secuencia de CDR1 de la región variable de cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 8; (e) la secuencia de CDR2 de la región variable de cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 9; (f) la secuencia de CDR3 de la región variable de cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 10; o dicho anticuerpo monoclonal aislado comprende: i) una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y ii) una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 4.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de IL-26

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el uso terapéutico y diagnóstico en el tratamiento de enfermedades y trastornos que están provocados por o asociados con la interleucina 26 (IL-26), incluyendo enfermedades inflamatorias, tales como psoriasis.

Antecedentes de la invención

La interleucina 26 (IL-26), también conocida como AK155, es una proteína de a-hélice de 19 kDa que pertenece a la familia de citocinas de IL-20. La IL-26 se identificó por primera vez en células T transformadas con herpesvirus saimiri, y posteriormente se encontró que estaba conservada en la mayoría de las especies de vertebrados pero ausente en ratones. Como otras citocinas TH17, IL-26 está altamente expresada en lesiones cutáneas psoriásicas (Wilson NJ et al., Nat Immunol 2007, 8(9): 950-957), lesiones colónicas de pacientes con enfermedad inflamatoria del intestino (Dambacher J, et al., Gut 2009, 58(9): 1207-1217) y sinovios de pacientes con artritis reumatoide (Corvaisier M, et al., PLoS Biol 2012, 10(9): e100139) y está fuertemente asociada con la actividad inflamatoria. Un locus de riesgo que contiene el gen de IL-26 y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) dentro de la región del gen de IL26 estaban asociados con esclerosis múltiple (Goris A, et al., Genes Immun 2001, 2(5): 284-286), artritis reumatoide (Vandenbroeck K, et al., Arthritis Rheum 2003, 48(10): 2773-2778) y enfermedad inflamatoria del intestino (Silverberg MS, et al., Nat Genet 2009, 41(2): 216-220) sugiriendo un papel particularmente importante de IL-26 en la enfermedad inflamatoria mediada por TH17.

Se mostró que IL-26 señaliza a través del receptor heterodimérico IL-10R2-IL-20R1 expresado exclusivamente por células epiteliales (Hor S, et al., J Biol Chem 2004, 279(32): 33343-33351 y Sheikh F, et al., J Immunol 2004, 172(4): 2006-2010). Por medio de este receptor, se encontró que IL-26 inhibe la proliferación de células epiteliales intestinales y, en paralelo, induce la expresión de IL-10 inmunosupresora pero también las citocinas proinflamatorias TNF e IL-8.

Además, IL-26 y otras interleucinas tales como IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22 se producen por células T auxiliares humanas 17 (TH17), un subconjunto de células T que impulsan respuestas inflamatorias produciendo IL-26 (Wilson NJ, et al., Nat Immunol 2007, 8(9): 950-957). Respuestas de TH17 defectuosas en pacientes deficientes en el factor de transcripción STAT3 se han asociado con un aumento de la susceptibilidad a infecciones por Staphylococcus aureus y S. pyogenes (Ma CS, et al., J Exp Med 2008, 205(7): 1551-1557), indicando que este subconjunto de células T desempeña un papel importante en la defensa contra infecciones bacterianas extracelulares particularmente en las superficies cutáneas y mucosas. Por otro lado, respuestas de células TH17 excesivas impulsan la inflamación crónica y el desarrollo de autoinmunidad en individuos predispuestos. Las citocinas asociadas a TH17 estaban de hecho asociadas con la actividad patológica y se encontró que estaban aumentadas en la piel de la psoriasis, en el intestino de la enfermedad de Crohn, en el cerebro de la esclerosis múltiple y el sinovio de pacientes con artritis reumatoide y espondilitis anquilosante pacientes (Gaffen SL et al., Nature reviews Immunology 2014, 14(9): 585-600).

El documento US 2003/0073199 A1 (DNAX RESEARCH, INC.) da a conocer genes purificados que codifican para una citocina de un mamífero, se dan a conocer reactivos relacionados con los mismos incluyendo proteínas purificadas, anticuerpos específicos y ácidos nucleicos que codifica para esta molécula. También se proporcionan métodos de uso de dichos reactivos y kits de diagnóstico. El documento proporciona además un método de tratamiento de un paciente que tiene una respuesta inmunitaria o inflamatoria administrando una dosis eficaz de un anticuerpo o pareja de unión para AK155.

Los documentos WO 03/002717 (Schering Corporation) y US 2003/0108958 (DNAX RESEARCH, INC.) se refieren a células que expresan un receptor de AK155 recombinante, a métodos para el cribado de agentes que modulan los efectos de una AK155 sobre un receptor de AK155 y a métodos de tratamiento de una enfermedad usando agentes que modulan las interacciones entre un AK155 y un receptor de AK155. En estas tecnologías, la nueva función de IL-26 (AK155) es dependiente de receptor y los anticuerpos desarrollados están dirigidos al sitio de unión al receptor de IL-26.

Labome: “Human IL-26/AK155 MAb (Clone 197505): R and D Systems MAB1375 product information”, 1 de enero de 2009 (01-01-2009), XP055304864 da a conocer un anticuerpo monoclonal anti-lL26 comercial que puede usarse en experimentos de inmunotransferencia de tipo Western, bloqueo o activación.

M. Corvaisier et al. “ IL-26 is Overexpressed in Rheumatoid Arthritis and Induces Proinflammatory Cytokine Production and Th17 Cell Generation” PLOS Biology | www.plosbiology.org, septiembre de 2012 | volumen 10 | tema 9 | e1001395, han analizado la expresión y el papel de IL-26 en la artritis reumatoide (AR), un trastorno inflamatorio crónico caracterizado por inflamación sinovial de la articulación. Corvaisier notifica que las concentraciones de IL-26 son superiores en los sueros de pacientes con AR que en sujetos sanos y están drásticamente elevadas en fluidos sinoviales de AR en comparación con sueros de AR. La inmunohistoquímica revela que sinoviocitos similares a fibroblastos positivos para sinoviolina y sinoviocitos similares a macrófagos CD68+ son las principales células productoras de IL-26 en articulaciones con AR. Los sinoviocitos similares a fibroblastos de pacientes con AR producen de manera constitutiva IL-26 y esta producción está regulada por incremento mediante IL-1-beta e IL-17A. Finalmente, investigaron el papel de IL-26 en el proceso inflamatorio. Los resultados muestran que IL-26 induce la producción de las citocinas proinflamatorias IL-1-beta, IL-6 y factor de necrosis tumoral (TNF)-alfa por monocitos humanos y también regula por incremento la expresión de numerosas quimiocinas (principalmente CCL20). De manera interesante, monocitos estimulados por IL-26 promueven selectivamente la generación de células Th17 RORgamma t+, a través de la secreción de IL-1-beta por monocitos. De manera más precisa, monocitos estimulados por IL-26 cambian células T de memoria CD4+ no diferenciadas a Th17 (IL-23R2 o CCR62 CD1612) a células Th17. Finalmente, los líquidos sinoviales de pacientes con AR también inducen la generación de células Th17 y este efecto se reduce tras el agotamiento de IL-26. Estos hallazgos muestran que IL-26 se produce de manera constitutiva por sinoviocitos con AR, induce la secreción de citocinas proinflamatorias por células mieloides y favorece la generación de células Th17. De ese modo, IL-26 aparece como una citocina proinflamatoria novedosa, ubicada aguas arriba de la cascada proinflamatoria, que puede constituir una diana prometedora para tratar la AR y trastornos inflamatorios crónicos.

Por tanto, la modulación (activación o bloqueo) de los efectos de IL-26 podría representar una modalidad atractiva para el tratamiento de enfermedades y/o infecciones bacterianas relacionadas con la inflamación. Además, en la gestión de enfermedades inflamatorias y/o infecciones bacterianas, existe la necesidad de un modulador que sea eficaz sin producir efectos secundarios.

Sumario de la invención

La psoriasis es una enfermedad cutánea inflamatoria crónica-recidivante común que comienza mediante la activación de células dendríticas plasmacitoides (pDC) y mediada por células Th17 que producen IL-17A/F, IL-22 e IL-26. Mientras que las funciones de IL-17 e iL-22 están bien caracterizadas, el papel de IL-26 en el proceso inflamatorio está menos claro. En el presente documento, los solicitantes han encontrado sorprendentemente que IL-26 derivada de TH17 tiene una estructura anfipática catiónica, que permite la destrucción catiónica de bacterias extracelulares por medio de formación de poros en la membrana. Además, la IL-26 derivada de TH17 formaba complejos con el ADN bacteriano y propio liberado por bacterias o células huésped moribundas, respectivamente. Los complejos de IL-26-ADN resultantes desencadenaban una potente producción de IFN de tipo I por pDC por medio de la activación del receptor de tipo Toll 9. En la psoriasis, la IL-26 se expresaba en gran medida en la piel lesionada, alcanzando niveles relevantes para la activación de pDC. Además, la inyección repetitiva en la piel de IL-26 inducía la producción de IFN de tipo I por pDC y el desarrollo de un fenotipo psoriásico en ratones. Estos hallazgos identifican una función antimicrobiana y proinflamatoria de IL-26 derivada de TH17 y demuestran un papel clave en la patogenia de la psoriasis y posiblemente otras enfermedades inflamatorias crónicas.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento biológico activo del mismo que reconoce y se une a IL-26, que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1, CDR2, CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2, CDR3 en las que:

(a) la secuencia de CDR1 de la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o modificaciones conservativas de la misma;

(b) la secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o modificaciones conservativas de la misma;

(c) la secuencia de CDR3 de la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o modificaciones conservativas de la misma;

(d) la secuencia de CDR1 de la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 8 o modificaciones conservativas de la misma;

(e) la secuencia de CDR2 de la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 9 o modificaciones conservativas de la misma;

(f) la secuencia de CDR3 de la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 10 o modificaciones conservativas de la misma,

o dicho anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento biológico activo del mismo capaz de reconocer y unirse a IL-26 comprende:

i) una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y/o secuencias humanizadas de la misma; y

ii) una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 y/o secuencias humanizadas de la misma.

Además, la invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo monoclonal o fragmento biológico activo del mismo.

También se proporciona un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de la invención y una célula que comprende el vector de expresión de la invención.

En otra realización, la invención se refiere a un hibridoma depositado con el número de registro de la ATCC de PTA-122358 presentado el 10 de julio de 2015.

Otro objeto de la invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal que reconoce y se une a IL-26 y que tiene la misma especificidad de epítopo que el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 142-84-B1, número de registro de la ATCC PTA-122358, en el que dicho anticuerpo monoclonal aislado comprende:

una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1, CDR2, CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2, CDR3 en las que:

(a) la secuencia de CDR1 de la región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5;

(b) la secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

(c) la secuencia de CDR3 de la región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7;

(d) la secuencia de CDR1 de la región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;

(e) la secuencia de CDR2 de la región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9;

(f) la secuencia de CDR3 de la región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10;

o dicho anticuerpo monoclonal aislado comprende:

i) una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y/o secuencias humanizadas de la misma, y

ii) una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y/o secuencias humanizadas de la misma.

En una realización adicional de la invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que reconoce y se une a IL-26, y en el que dicho anticuerpo monoclonal aislado se produce mediante la línea celular de hibridoma 142-84-B1, número de registro de la ATCC PTA-122358.

También se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento biológico activo del mismo según la invención, y opcionalmente que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

Preferiblemente, la composición farmacéutica de la invención comprende además uno o más de los siguientes: una sustancia biológicamente activa, un diluyente o un excipiente.

La composición farmacéutica de la invención es adecuada para su uso en un método de prevención, tratamiento o alivio de los efectos de enfermedades inflamatorias seleccionadas entre el grupo que consiste en psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, esclerosis múltiple y colitis ulcerosa.

En particular, la presente invención se refiere al hallazgo de una nueva función inflamatoria de IL-26 (AK155). Esta función es independiente de la función conocida de IL-26 debida a su interacción con el receptor de IL-26 expresado selectivamente en células epiteliales. Esta interacción, que es el punto central de la técnica anterior comentada anteriormente, no ha sido capaz de explicar el potente papel inflamatorio y patogénico de células TH17 productoras de IL-26 en enfermedades inflamatorias crónicas. La identificación de una función independiente de receptor que actúa directamente sobre células inmunitarias e induce de manera potente inflamación y activación inmunitaria, proporciona ahora una explicación del potente papel inflamatorio de células Th17 y tiene las siguientes implicaciones:

1) Proporciona el fundamento del bloqueo de IL-26 en enfermedades inflamatorias crónicas asociadas con una sobreexpresión de IL-26. Los solicitantes fueron capaces de mostrar que, en piel humana con psoriasis, IL-26 alcanza concentraciones relevantes para la inducción de activación inmunitaria y que la inyección de IL-26 en piel de ratón induce un fenotipo psoriasiforme mediado por la ruta descrita de activación inmunitaria.

2) Proporciona la base para el desarrollo de inhibidores/moduladores de IL-26 que bloquean específicamente la función inflamatoria descrita de IL-26. Los solicitantes han generado anticuerpos anti-IL-26 humana e identificado clones que son un fuerte inhibidor de esta función.

Los solicitantes demostraron un papel inflamatorio directo único de células Th17 por medio de la producción de IL-26 proporcionando el fundamento para la selección como diana de esta molécula en enfermedades en las que están implicadas Th17 en la patogenia (por ejemplo psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple).

Breve descripción de las figuras

Figura 1(a). IL-26 tiene propiedades bactericidas directas. Crecimiento de Escherichia coli O1:K1:H7 (E. coli), E. coli O18:K1:H7 y Klebsiella pneumoniae O1:K2 (K. pneumo) en cultivo con una concentración creciente de rhIL-26. Figura 1(b). Actividad antimicrobiana de rhIL-26 (a), crecimiento de las cepas virulentas E. coli J5 O111:B4, E. coli O111:K58:H2 y Pseudomonas aeruginosa (P. aerug.) PA14 en cultivo con concentraciones crecientes de rhIL-26. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes. Figura 1 (c), cinética de crecimiento de P. aerug. cultivada con o sin rhIL-26 10 pM, en presencia de anticuerpos anti-IL-26 bloqueantes o de control de isotipo (IgG de ctl). Figura 1(d), capacidad de IL-26 para unirse a LPS o LTA evaluada mediante un ensayo de unión ELISA. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes, las barras de error representan la desviación estándar de pocillos por triplicado. Figura 1 (e), cargas bacterianas medidas en los pulmones, el bazo y la sangre de ratones recogidos 3 días después de la infección i.n. por K. pneumo (100 UFC) seguido por tratamiento i.n. con 20 pg de rhIL-26 o 50 pg de LL-37. Como control, se pretrató K. pneumo ex vivo con rhIL-26. Cada punto de datos representa un ratón diferenciado, f indicó ratones que murieron por una infección abrumadora en el plazo de los 3 días. Los datos son representativos de 4 experimentos independientes y se obtuvieron con 8 ratones por grupo. Los datos se analizaron estadísticamente usando la prueba de la U de Mann-Whitney no paramétrica desapareada. * P <0,001.

Figura 2(a), las células TH17 ejercen una actividad antimicrobiana directa por medio de la producción de IL-26. Crecimiento de P. aerug. cultivada con sobrenadantes de células primarias TH0 y TH17 y medido mediante un ensayo de dilución en microcaldo. Los ensayos se realizaron con o sin anticuerpos anti-IL-26 bloqueantes o anticuerpos de control (IgG de ctl). Los datos son representativos de 2 experimentos independientes. Las barras de error representan la desviación estándar de pocillos por duplicado. Los datos se analizaron estadísticamente usando la prueba de la t de Student bilateral desapareada * P <0,05, ** P <0,01. Figura 2(b), cinética del potencial de membrana de P. aerug. cultivada como en (d). Los datos son representativos de 3 experimentos independientes, las barras de error representan la desviación estándar de pocillos por duplicado.

Figura 3(a), producción de IL-1 p, IL-6, TNF e IFN-a por PBMC estimuladas durante la noche con IL-26 1 pM sola o en complejo con ADN bacteriano (ADN bact., 3 pg/ml). Cada punto de datos representa un donante diferenciado (n = 4). Figura 3(b), IFN-a producido por PBMC humanas, monocitos, macrófagos, células NK, neutrófilos, pDC y PBMC agotadas en pDC estimulados durante la noche con IL-261 pM solo o en complejo con ADN bact. Los puntos de datos representan 4 donantes independientes. Se muestra la media DE de los datos agrupados. Los datos se analizaron estadísticamente usando la prueba de la t de Student bilateral desapareada * P <0,05, ** P <0,01. IFN-a producido por pDC estimuladas durante la noche con concentraciones crecientes (figura 3c) de P. aerug viva. (P. a.) (titulada según UFC), o (figura 3d) concentración creciente de P. a. lisada (titulada según el contenido de ADN) en presencia o no de IL-26 (10 o 1 pM, respectivamente). (Figura 3e) IFN-a producido por pDC estimuladas durante la noche con lisado de P. a. (ADN 1 pg/ml) o ADN bact. purificado (1 pg/ml) solo o en presencia de IL-26, con o sin pretratamiento con ADNasa. (c-e), las barras de error representan la desviación estándar de pocillos por triplicado. Los datos son representativos de 4 experimentos independientes. Los datos se analizaron estadísticamente usando la prueba de la t de Student bilateral desapareada * P <0,05, ** P <0,01.

Figura 4(a). IL-26 promueve la detección por pDC de ADN humano liberado en el contexto de muerte celular. Viabilidad celular de monocitos, macrófagos, células NK, neutrófilos, pDC y células HEK teñidas determinada por tinción con 7-AAD después de un cultivo durante la noche en medio solo o en presencia de o bien 10 pM de rhIL-26 o bien sobrenadantes sin diluir de células TH17 primarias. Figura 4 (b), IFN-a producido por pDC estimuladas durante la noche con células HEK 293T vivas o irradiadas con UV en presencia o no de rhIL-26 10 pM. Figura 4(c), IFN-a producido por PBMC humanas, monocitos, macrófagos, células NK, neutrófilos, pDC y PBMC agotadas en pDC estimulados durante la noche con IL-26 solo, ADN hu. solo o con complejos de IL-26-ADN hu. Cada punto de datos representa un donante diferenciado (n = 4). Se muestra la media DE de los datos agrupados. Los datos se analizaron estadísticamente usando la prueba de la t de Student bilateral desapareada * P <0,05, ** P <0,0001. Figura 4 (d), IFN-a producido por pDC estimuladas con concentraciones crecientes de ADN humano o bien solo o bien en complejo con IL-26 1 pM. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes. Las barras de error representan la desviación estándar de pocilios por triplicado.

Figura 5. Complejos de IL-26-ADN activan TLR9 endosómico en pDC. IFN-a producido por pDC estimuladas durante la noche con Ad N bact. o ADN hu. solo, o con complejos IL-26-a Dn bact. o IL-26-ADN hu., o con el ligando de STING cGAMP en presencia de cloroquina 100 ng/ml. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes. Las barras de error representan la desviación estándar de pocillos por triplicado.

Figura 6 (a). Las células TH17 activan pDC por medio de la producción de IL-26. IFN-a producido por pDC estimuladas durante la noche con diversas diluciones de sobrenadantes derivados de células TH17 en medio de cultivo (v/v). Figura 6 (b). IFN-a producido por pDC estimuladas durante la noche con sobrenadante derivado de células TH17 reestimuladas en presencia de anticuerpos anti-IL-26 neutralizantes. Las barras de error representan la desviación estándar de pocillos por triplicado. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó usando la prueba de la t de Student bilateral desapareada; ** P <0,001. Figura 6 (c), IFN-a producido por pDC estimuladas durante la noche con sobrenadantes de clones de TH17 (n = 3) transfectados con ARNip contra IL-26 (siIL26) o un ARNip de control (siCtl) suplementado o no con ADN hu. Los datos son representativos de al menos 3 experimentos independientes. Los datos se analizaron estadísticamente usando la prueba de la t de Student bilateral desapareada * P <0,05. Figura 6 (d), concentraciones de IL-26 en piel sana y lesiones cutáneas psoriásicas medidas por ELISA de extractos de piel totales derivados de donantes sanos (n = 15) o pacientes con psoriasis (n = 15). Cada punto de datos representa un donante diferenciado. Los datos se analizaron estadísticamente usando la prueba de la U de Mann-Whitney no paramétrica desapareada * P <0,001.

Figura 7. La inyección intradérmica de IL-26 conduce a la infiltración de células inmunitarias y la producción de IFN de tipo I. Infiltración de neutrófilos, monocitos (a) y pDC (b) en piel de ratón en la que se inyectó por vía intradérmica solución salina o 1 pg de IL-26. Los datos son representativos de tres ratones por grupo. (c), los porcentajes de neutrófilos (Ly6Ghigh Ly6Cint CD11b+), monocitos (Ly6Gint Ly6Chigh CD11b+) y pDC (B220+ CD11c+ PDCA1+) infiltrantes en suspensiones dérmicas unicelulares aisladas de piel en la que se realizó la inyección se midieron mediante citometría de flujo. Los datos son la media DE de tres ratones por grupo *** p <0,001, ** p <0,01, * p <0,05 prueba de la t de Student desapareada. (d), Expresión tisular de ARNm de ifna2 e ifnb1 relativa de piel recogida 24 horas después de la inyección de solución salina o IL-26. Los datos son la media DE de tres ratones por grupo. * p <0,05, prueba de la t de Student para datos desapareados.

Figura 8. La inyección intradérmica repetitiva de IL-26 conduce a una inflamación cutánea psoriasiforme en ratones. (a) Tinción con HE representativa de piel de ratón en la que se inyectó todos los días solución salina o 1 pg de IL-26 durante 5 días. (b) Cuantificación de acantosis (grosor epidérmico) de piel de ratón tratada como en (a). Los datos se obtuvieron con 5 ratones por grupo. ** p <0,01, prueba de la t de Student desapareada.

Figura 9. El clon 84 de anticuerpo anti-IL-26 inhibe la producción de IFN inducida por complejos de IL-26-ADN. IFN-a producido por pDC estimuladas durante la noche con IL-26 (1 pM) ADN (3 pg/ml) con o sin 10, 100 y 1000 pg/ml de los clones de anticuerpo anti-IL-2669, 73 o 84 (142-84-B1), o control de isotipo.

Figura 10. El clon 84 de anticuerpo anti-IL-26 inhibe la capacidad de IL-26 para promover la inmunogenicidad de CpG-ADN y de ADN humano. IFN-a producido por pDC estimuladas durante la noche con IL-26 (1 pM) CpG (1 pM) o ADN (3 pg/ml) con o sin 100 pg/ml de los clones de anticuerpos anti-IL-2669, 73 o 84, o control de isotipo.

Figura 11. El clon 84 de anticuerpo anti-IL-26 inhibe la formación de complejos de IL-26 con ADN. Cuantificación fluorimétrica de la tinción del ADN por el tinte Picogreen tras mezclar ADN hu. con IL-26 en presencia de (panel izquierdo) concentraciones crecientes del polímero aniónico heparina, o (panel derecho) anticuerpos anti-IL-26 (clon 142-84- B1) o anti-IL-17 neutralizantes.

Figura 12. El clon 84 de anticuerpo anti-IL-26 inhibe la expresión de IFN de tipo I inducida por inyección intradérmica de IL-26. Expresión tisular de ARNm de ifna2 e ifnb1 relativa de piel recogida 5 días después de la inyección diaria de solución salina o IL-26 con o sin los clones 69, 73 u 84 de anticuerpo anti-IL-26. Los datos son la media DE de tres ratones por grupo.

Figura 13. El clon 84 de anticuerpo anti-IL-26 inhibe la infiltración cutánea de pDC inducida por inyección intradérmica de IL-26. (a) Infiltración de pDC en piel de ratón en la que se inyectó por vía intradérmica todos los días durante 5 días o bien solución salina o bien 1 pg de IL-26 con o sin 10 pg de los clones de anticuerpos anti-IL-2669, 73 u 84. Los datos son representativos de tres ratones por grupo. (b) Los porcentajes de pDC infiltrantes (CD45+ B220+ CD11c+ PDCA1+) en suspensiones dérmicas unicelulares aisladas de piel en la que se realizó la inyección se midieron mediante citometría de flujo. Los datos son la media DE de tres ratones por grupo **** p <0,0001, *** p <0,001, prueba de la t de Student desapareada. (c) Cuantificación de acantosis (grosor epidérmico) de piel de ratón tratada como en (a). Los datos se obtuvieron con 3 ratones por grupo. * p <0,05, prueba de la t de Student desapareada.

Descripción detallada de la invención

Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o las pruebas de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Las publicaciones y solicitudes comentadas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a tal publicación en virtud de invención anterior. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la materia en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar la comprensión de la presente invención.

El término “comprender” se usa en general en el sentido de incluir, es decir, permitir la presencia de una o más características o componentes.

Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína”, tal como se usan en el presente documento, son intercambiables y se definen como una biomolécula compuesta por aminoácidos unidos por un enlace peptídico.

Los términos “un”, “una” y “el/la” tal como se usan en el presente documento se define que significan “uno o más” e incluyen el plural a menos que el contexto sea inapropiado.

El término “anticuerpo monoclonal” está bien reconocido en la técnica y se refiere a un anticuerpo que es el producto de una única célula productora de anticuerpos clonada. Los anticuerpos monoclonales se fabrican normalmente fusionando una célula B productora de anticuerpos, normalmente de vida corta, con una célula en crecimiento rápido, tal como una célula cancerosa (a veces denominada célula “inmortal”). La célula híbrida resultante, o hibridoma, se multiplica rápidamente, creando un clon que produce el anticuerpo.

Por “aislada” quiere decirse una molécula biológica libre de al menos algunos de los componentes con los que se produce de manera natural. Un anticuerpo “aislado” es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más del 95% en peso de anticuerpo según se determina mediante el método de Lowry, y lo más preferiblemente más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que no estará presente al menos un componente del entorno natural del anticuerpo. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Los términos “anticuerpo” o “anticuerpos” tal como se usan en el presente documento son términos reconocidos en la técnica y se entiende que se refieren a moléculas o fragmentos activos de moléculas que se unen a antígenos conocidos, en particular, a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de la molécula de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión que se une específicamente a un antígeno. Una inmunoglobulina es una proteína que comprende uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por los genes de región constante kappa y lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu de inmunoglobulina, así como innumerables genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como o bien kappa o bien lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. También se conocen subclases de la cadena pesada. Por ejemplo, las cadenas pesadas de IgG en seres humanos pueden ser cualquiera de las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. La inmunoglobulina según la invención puede ser de cualquier clase (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY) o subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) de molécula de inmunoglobulina.

Tal como se usa en el presente documento, “se une específicamente” en referencia a un anticuerpo significa que el anticuerpo se une a su antígeno diana con mayor afinidad que a antígeno(s) estructuralmente diferente(s).

Se sabe que una unidad estructural de inmunoglobulina típica comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ ligera” (aproximadamente 25 kD) y una cadena “pesada” (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligera y pesada respectivamente.

Los anticuerpos existen como anticuerpos intactos de longitud completa o como varios fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas o productos químicos. Por tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de las uniones disulfuro en la región de bisagra produciendo F(ab')2, un dímero de Fab que por sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CH, mediante un enlace disulfuro. El F(ab')2 puede reducirse en condiciones suaves rompiéndose la unión disulfuro en la región de bisagra convirtiendo de ese modo el dímero F(ab')2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un fragmento Fab con parte de la región de bisagra (véase, Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpos). Aunque se definen diversos fragmentos de anticuerpos en cuanto a la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que puede sintetizarse cualquiera de una variedad de fragmentos de anticuerpos de novo o bien químicamente o bien utilizando metodología de ADN recombinante. Por tanto, el término anticuerpo, tal como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de anticuerpos o bien producidos mediante la modificación de anticuerpos completos o sintetizados de novo o bien anticuerpos y fragmentos obtenidos usando metodologías de ADN recombinante.

Dentro del alcance de la presente invención, se pretende que los “anticuerpos” incluyan anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla, biespecíficos, simianizados, humanos y humanizados así como fragmentos biológicos activos de los mismos. Los ejemplos de fragmentos biológicos activos de moléculas que se unen a antígenos conocidos incluyen cadenas ligeras y pesadas separadas, fragmentos Fab, Fab/c, Fv, Fab' y F(ab')2, incluyendo los productos de una biblioteca de expresión de inmunoglobulinas Fab y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anticuerpos y fragmentos mencionados anteriormente.

Estos “fragmentos biológicos activos” pueden derivarse de un anticuerpo de la presente invención mediante varias técnicas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden escindirse con una enzima, tal como pepsina, y someterse a filtración en gel por HPLC. La fracción apropiada que contiene fragmentos Fab puede entonces recogerse y concentrarse mediante filtración por membrana y similar. Para una descripción adicional de técnicas generales para el aislamiento de fragmentos de anticuerpos activos, véase, por ejemplo, Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986.

Los anticuerpos recombinantes pueden ser anticuerpos de longitud completa convencionales, fragmentos de anticuerpos activos conocidos de la digestión proteolítica, fragmentos de anticuerpos activos únicos tales como Fv o Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de dominio delecionado, y similares. Un anticuerpo Fv tiene aproximadamente 50 Kd de tamaño y comprende las regiones variables de la cadena pesada y ligera. Un polipéptido de Fv de cadena sencilla (“scFv”) es un heterodímero de VH::VL unido covalentemente que puede expresarse a partir de un ácido nucleico que incluye secuencias que codifican VH y VL o bien unidas directamente o bien unidas mediante un ligador que codifica un péptido. Véase Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883. Varias estructuras para convertir las cadenas polipeptídicas ligera y pesada agregadas de manera natural, pero separadas químicamente, de una región V de anticuerpo V en una molécula de scFv que se plegará para dar una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión a antígeno. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.091.513, 5.132.405 y 4.956.778.

El sitio de combinación se refiere a la parte de una molécula de anticuerpo que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión a antígeno está formado por residuos de aminoácido de las regiones variables N-terminales (“V”) de las cadenas pesada (“H”) y ligera (“L”). Las regiones variables del anticuerpo comprenden tres tramos altamente divergentes denominados “regiones hipervariables” o “regiones determinantes de complementariedad” (CDR) que se interponen entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como “regiones marco” (FR). En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) se disponen en relación entre sí en el espacio tridimensional formando un bolsillo o superficie de unión a antígeno. El sitio de combinación del anticuerpo representa, por tanto, los aminoácidos que constituyen las CDR de un anticuerpo y cualquier residuo marco que constituya el bolsillo del sitio de unión.

La identidad de los residuos de aminoácido en un anticuerpo particular que constituyen el sitio de combinación puede determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden identificarse las CDR de un anticuerpo como las regiones hipervariables originalmente definidas por Kabat et al. (véase, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services; Johnson, G y Wu, TT (2001) Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Research, 29: 205-206; http://immuno.bme.nwa.edu). Las posiciones de las CDR pueden identificarse también como las estructuras de bucles estructurales originalmente descritas por Chothia y otros (véanse Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987), Chothia et al., Nature 342, 877 (1989), y Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215, 175 (1990)). Otros métodos incluyen la “definición de AbM” que es un compromiso entre Kabat y Chothia y se deriva usando el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (ahora Accelrys) o la “definición de contacto” de CDR de Macallum et al., (“Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site topography”, J Mol Biol. 11 de octubre de 1996; 262(5):732-45). El siguiente gráfico identifica CDR basándose en diversas definiciones conocidas.

Bucle AbM de Kabat Chothia Contacto

L1 L24L34 L24L34 L24 -- L34 L30 -- L36

L2 L50L56 L50L56 L50 -- L56 L46 -- L55

L3 L89L97 L89L97 L89 -- L97 L89 -- L96

H1 H31-H35B H26-H35B H26 -- H32..34 H30 -- H35B

(Numeración de Kabat)

H1 H31 -- H35 H26H35 H26H32 H30H35

(Numeración de Chothia)

H2 H50 -- H65 H5 -- H58 H52 -- H56 H47 -- H58

Las directrices generales mediante las que pueden identificarse las CDR en un anticuerpo a partir de la secuencia solo son las siguientes:

LCDR1:

Inicio - Aproximadamente residuo 24.

El residuo anterior es siempre una Cys.

El residuo posterior es siempre un Trp. Normalmente TRP va seguido por TYR-GLN, pero también puede ir seguido por LEU-GLN, PHE-GLN o TYR-LEU.

La longitud es de 10 a 17 residuos.

LCDR2:

Inicio - 16 residuos después del final de L1.

La secuencia anterior es generalmente ILE-TYR, pero también puede ser VAL-TYR, ILE-LYS o ILE-PHE. La longitud es generalmente de 7 residuos.

LCDR3:

Inicio - generalmente 33 residuos después del final de L2.

El residuo anterior es una Cys.

La secuencia posterior es PHE-GLY-X-GLY.

La longitud es de 7 a 11 residuos.

HCDR1:

Inicio - en aproximadamente el residuo 26 (cuatro residuos después de una CYS) [definición de Chothia/AbM]. La definición de Kabat comienza 5 residuos después.

La secuencia anterior es CYS-X-X-X.

El residuo posterior es un TRP, normalmente seguido por VAL, pero también seguido por ILE o ALA.

La longitud es de 10 a 12 residuos según la definición de AbM mientras que la definición de Chothia excluye los últimos 4 residuos.

HCDR2:

Inicio - 15 residuos después del final de la definición de Kabat/AbM de CDR-H1.

La secuencia anterior es normalmente LEU-GLU-TRP-ILE-GLY. (SEQ ID NO. 1), pero son posibles varias variaciones. La secuencia posterior es LYS/ARG-LEU/ILE/VAL/PHE/THR/ALA-THR/SER/ILE/ALA

La longitud es de 16 a 19 residuos según la definición de Kabat (la definición de AbM termina 7 residuos antes). HCDR3:

Inicio - 33 residuos después del final de CDR-H2 (dos residuos después de una CYS).

La secuencia anterior es CYS-X-X (normalmente CYS-ALA-ARG).

Secuencia posterior es TRP-GLY-X-GLY.

La longitud es de 3 a 25 residuos.

La identidad de los residuos de aminoácido en un anticuerpo particular que están fuera de las CDR, pero no obstante constituyen parte del sitio de combinación al tener una cadena lateral que es parte del revestimiento del sitio de combinación (es decir, está disponible para la unión a través del sitio de combinación), puede determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica tales como modelado molecular y cristalografía de rayos X. Véase, por ejemplo, Riechmann et al., (1988) Nature, 332: 323-327.

Una “sustitución de aminoácidos conservativa” o “modificación conservativa” es una en la que un residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o el grado de similitud se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste los conocen bien los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307 - 31 (1994).

Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifático: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: ácido aspártico y ácido glutámico; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones de aminoácidos conservativas preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisinaarginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina.

Alternativamente, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 dada a conocer en Gonnet et al., Science 256: 1443-45 (1992), incorporado en el presente documento como referencia. Un reemplazo “moderadamente conservativo” es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

“Anticuerpos quiméricos” son aquellos en los que una o más regiones del anticuerpo son de una especie de animal y una o más regiones del anticuerpo son de una especie de animal diferente. Un anticuerpo quimérico preferido es uno que incluye regiones de una inmunoglobulina de primate. Se entiende normalmente que un anticuerpo quimérico para uso clínico humano tiene regiones variables de un animal no humano, por ejemplo un roedor, con las regiones constantes de un ser humano. Por el contrario, un anticuerpo humanizado usa CDR del anticuerpo no humano con la mayor parte o todas las regiones marco variables de y todas las regiones constantes de una inmunoglobulina humana. Se entiende típicamente que un anticuerpo quimérico humano tiene las regiones variables de un roedor. Un anticuerpo quimérico humano típico tiene regiones constantes pesadas humanas y regiones constantes de cadena ligera humana con las regiones variables tanto pesadas como ligeras procedentes de un anticuerpo de roedor. Un anticuerpo quimérico puede incluir algunos cambios en una secuencia de aminoácidos nativa de las regiones constantes humanas y la secuencia de región variable nativa de roedor. Pueden prepararse anticuerpos quiméricos y humanizados mediante métodos bien conocidos en la técnica que incluyen enfoques de injerto de CDR (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.843.708; 6.180.370; 5.693.762; 5.585.089; 5.530.101), estrategias de intercambio de cadenas (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.565.332; Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95: 8910-8915), estrategias de modelado molecular (patente estadounidense n.° 5.639.641), y similares.

Un “anticuerpo humanizado” tal como se usa en el presente documento en el caso de un anticuerpo de dos cadenas es uno en el que al menos una cadena está humanizada. Una cadena de anticuerpo humanizada tiene una región variable en la que una o más de las regiones marco son humanas. Un anticuerpo humanizado que es de una sola cadena es uno en el que la cadena tiene una región variable en la que una o más de las regiones marco son humanas. Las porciones no humanas de la región variable de la cadena de anticuerpo humanizada o fragmento de la misma se derivan de una fuente no humana, particularmente un anticuerpo no humano, normalmente de origen de roedor. La contribución no humana al anticuerpo humanizado se proporciona normalmente en forma de al menos una región CDR que está intercalada entre regiones marco derivadas de una (o más) inmunoglobulinas humanas. Además, los residuos de soporte de marco pueden alterarse para conservar la afinidad de unión.

El anticuerpo humanizado puede comprender además regiones constantes (por ejemplo, al menos una región constante o porción de la misma, en el caso de una cadena ligera, y preferiblemente tres regiones constantes en el caso de una cadena pesada). Las regiones constantes de un anticuerpo humanizado, si están presentes, son generalmente humanas.

Los expertos en la técnica conocen bien métodos para obtener “anticuerpos humanizados” (véanse, por ejemplo, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9: 421 (1991)).

También puede obtenerse un “anticuerpo humanizado” mediante un enfoque de ingeniería genética novedoso que permite la producción de anticuerpos policlonales de tipo humano madurados por afinidad en animales grandes tales como, por ejemplo, conejos y ratones. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.632.976.

El término región constante (CR) tal como se usa en el presente documento se refiere a genes de regiones constantes de la inmunoglobulina. Los genes de regiones constantes codifican para la porción de la molécula de anticuerpo que confiere funciones efectoras. Para anticuerpos humanos quiméricos y anticuerpos humanizados, normalmente no humanos (por ejemplo, murinos), las regiones constantes se sustituyen por regiones constantes humanas. Las regiones constantes de los anticuerpos quiméricos o humanizados en cuestión se derivan normalmente de inmunoglobulinas humanas. La región constante de cadena pesada puede seleccionarse de cualquiera de los cinco isotipos: alfa, delta, épsilon, gamma o mu. Además, cadenas pesadas de diversas subclases (tales como las subclases de IgG de cadenas pesadas) son responsables de diferentes funciones efectoras y, por tanto, al elegir la región constante de cadena pesada deseada, pueden producirse anticuerpos con la función efectora deseada. Las regiones constantes que pueden usarse dentro del alcance de esta invención son gamma 1 (IgG1), particularmente una región Fc del isotipo gamma 1 (IgG1), gamma 3 (IgG3) y especialmente gamma 4 (IgG4). La región constante de cadena ligera puede ser de tipo kappa o lambda, preferiblemente de tipo kappa. En una realización, la región constante de cadena ligera es la cadena constante kappa humana (Heiter et al. (1980) Celda 22: 197-207) y la cadena constante pesada es la cadena constante de IgG4 humana.

La “homología” entre dos secuencias se determina mediante la identidad de secuencia. Si dos secuencias que van a compararse entre sí difieren en la longitud, la identidad de secuencia se refiere preferiblemente al porcentaje de residuos de nucleótidos de la secuencia más corta que son idénticos a los residuos de nucleótidos de la secuencia más larga. La identidad de secuencia puede determinarse convencionalmente con el uso de programas informáticos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711). Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, con el fin de encontrar el segmento que tiene la mayor identidad de secuencia entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit u otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia particular tiene, por ejemplo, un 95% de identidad con una secuencia de referencia de la presente invención, los parámetros se ajustan preferiblemente de modo que el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de la longitud total de la secuencia de referencia y que se permiten huecos de homología de hasta el 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia. Cuando se utiliza Bestfit, los denominados parámetros opcionales se dejan preferiblemente en sus valores predeterminados (“por defecto”). Las desviaciones que aparecen en la comparación entre una secuencia dada y las secuencias de la invención descritas anteriormente pueden estar provocadas, por ejemplo, por adición, deleción, sustitución, inserción o recombinación. Preferiblemente, una comparación de secuencias de este tipo también puede realizarse con el programa “fasta20u66” (versión 2.0u66, septiembre de 1998 por William R. Pearson y la Universidad de Virginia; véase también W.R. Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98, ejemplos adjuntos y http://workbench.sdsc.edu/). Para este fin, pueden usarse los ajustes de parámetros “por defecto”.

El término “fragmento” se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos residuos de aminoácidos que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos pueden obtenerse mediante tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos también pueden obtenerse por medios recombinantes. Los fragmentos a modo de ejemplo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fabc y/o Fv. El término “fragmento de unión a antígeno” se refiere a un fragmento de polipéptido de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une al antígeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que se derivaron) por la unión al antígeno (es decir, unión específica).

Los fragmentos de unión se producen mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, cadenas sencillas y anticuerpos de cadena sencilla.

El término “antígeno” se refiere a una entidad o fragmento de la misma que puede unirse a un anticuerpo. Un inmunógeno se refiere a un antígeno que puede provocar una respuesta inmunitaria en un organismo, particularmente un animal, más particularmente un mamífero, incluyendo un ser humano. El término antígeno incluye regiones conocidas como determinantes antigénicos o epítopos que se refieren a una porción del antígeno (que está en contacto o que desempeña un papel significativo en el apoyo de un residuo de contacto en el antígeno responsable de la antigenicidad o determinantes antigénicos).

Tal como se usa en el presente documento, el término “epítopo” se refiere a una porción de una molécula antigénica para la que se produce un anticuerpo y a la que se unirá el anticuerpo. Los epítopos pueden comprender residuos de aminoácidos lineales (es decir, los residuos dentro del epítopo están dispuestos secuencialmente uno tras otro de forma lineal), residuos de aminoácidos no lineales o residuos de aminoácidos tanto lineales como no lineales. Normalmente, los epítopos son generalmente secuencias de aminoácidos cortas (por ejemplo, aproximadamente cinco aminoácidos de longitud).

También tal como se usa en el presente documento, el término “inmunogénico” se refiere a sustancias que provocan la producción de anticuerpos, el reclutamiento de células T y otras células inmunitarias reactivas dirigidas contra un antígeno del inmunógeno.

Se produce una respuesta inmunitaria cuando un individuo produce suficientes anticuerpos, células T y otras células inmunitarias reactivas contra las composiciones inmunogénicas administradas de la presente invención para moderar o aliviar el trastorno que va a tratarse.

El término inmunogenicidad tal como se usa en el presente documento se refiere a una medida de la capacidad de un antígeno para provocar una respuesta inmunitaria (humoral o celular) cuando se administra a un receptor. La presente invención se refiere a enfoques que reducen la inmunogenicidad de los anticuerpos humanizados o quiméricos humanos en cuestión.

La expresión “enfermedades y trastornos que están provocados por o asociados con IL-26” incluye, pero no se limita a enfermedades o trastornos inflamatorios seleccionados entre el grupo que comprende psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “sujeto” o “paciente” o “beneficiario” se conocen bien en la técnica y se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un mamífero, incluyendo perro, gato, rata, ratón, mono, vaca, caballo, cabra, oveja, cerdo, camello y, más preferiblemente, un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto que necesita tratamiento o un sujeto con una enfermedad o trastorno. Sin embargo, en otras realizaciones, el sujeto puede ser un sujeto normal. El término no indica una edad o sexo en particular. Por tanto, se pretende cubrir a sujetos jóvenes, adultos y recién nacidos, ya sean hombres o mujeres.

El término “una cantidad eficaz” se refiere a una cantidad necesaria para obtener un efecto fisiológico. El efecto fisiológico puede lograrse mediante una dosis de aplicación o mediante aplicaciones repetidas. La dosificación administrada, por supuesto, puede variar dependiendo de factores conocidos, tales como las características fisiológicas de la composición particular; la edad, la salud y el peso del sujeto; la naturaleza y la extensión de los síntomas; el tipo de tratamiento concurrente; la frecuencia del tratamiento; y el efecto deseado y puede ajustarse eficazmente por un experto en la técnica.

La “inflamación” es parte de la compleja respuesta biológica de los tejidos vasculares a estímulos dañinos, tales como patógenos, células dañadas o irritantes. La respuesta inflamatoria permite a un sujeto detectar y destruir inmediatamente la infección o el material tóxico en el tejido dañado antes de que pueda extenderse a otras áreas del cuerpo. La inflamación se desarrolla como una respuesta protectora normal del sistema inmunitario cuando se irrita el tejido corporal. Cuando el tejido se irrita, el sistema inmunitario aumenta el flujo sanguíneo al área, lo que provoca hinchazón, calor y enrojecimiento localizados. La inflamación puede producirse en cualquier parte del cuerpo y puede producirse con el uso excesivo de un área corporal o con lesiones menores.

La inflamación es un intento protector del organismo para eliminar los estímulos nocivos e iniciar el proceso de curación. Inflamación no es sinónimo de infección, incluso en los casos en que la inflamación está provocada por una infección.

Aunque la infección está provocada por un microorganismo, la inflamación es una de las respuestas del organismo al patógeno. Sin embargo, la inflamación puede considerarse como un mecanismo de inmunidad innata en comparación con la inmunidad adaptativa, que es específica para cada patógeno.

El término “enfermedades inflamatorias” se refiere a un grupo de enfermedades y trastornos asociados con la expresión de IL-26 incluyendo, pero sin limitarse a psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple.

También se refiere a otras enfermedades asociadas con inflamación incluyendo, pero sin limitarse a diabetes mellitus insulinodependiente (DMID), diabetes mellitus, esclerosis múltiple, encefalomielitis diseminada aguda, miastenia grave, tiroiditis, uveorretinitis, enfermedad de Hashimoto, mixedema primario, tirotoxicosis, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmunitaria, enfermedad de Addison, menopausia prematura, infertilidad masculina, diabetes juvenil, síndrome de Goodpasture, pénfigo vulgar, penfigoide, oftalmia simpática, uveítis facogénica, anemia hemolítica autoinmunitaria, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa Hbs-ve, cirrosis criptogénica, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, poli/dermatomiositis, LE discoide, lupus eritematoso sistémico, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, anemia aplásica, hepatitis autoinmunitaria, enfermedad celíaca, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré (GBS), púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome opsoclono-mioclono (OMS), neuritis óptica, tiroiditis de Ord, pénfigo, poliartritis, cirrosis biliar primaria, artritis reumatoide, síndrome de Reiter, Takayasu, arteritis temporal, anemia hemolítica autoinmunitaria caliente, granulomatosis de Wegener, alopecia universal, enfermedad de Behcet, enfermedad de Chagas, síndrome de fatiga crónica, disautonomía, endometriosis, hidradenitis supurativa, cistitis intersticial, neuromiotonía, sarcoidosis, esclerodermia, colitis ulcerosa, vitíligo y vulvodinia.

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma pueden someterse a ensayo entonces para detectar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-26 o un fragmento de la misma. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma puede determinarse mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA). Tales técnicas y ensayos se conocen bien en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard (1980) Anal. Biochem. 107:220.

Después de que se identifiquen las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y hacerse crecer por métodos convencionales (Goding, citado anteriormente). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, Medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden hacerse crecer in vivo como ascitis en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse de los medio de cultivo o fluido de ascitis mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales pueden producirse también por métodos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente estadounidense n.° 4.816.567. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el a Dn puede colocarse en vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped tales como células COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen por lo demás proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN puede modificarse también, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para dominios constantes de cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias murinas homólogas (patente estadounidense n.° 4,816,567; Morrison et al., citado anteriormente) o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido distinto de inmunoglobulina. Este tipo de polipéptido distinto de inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Un aspecto de la invención es un anticuerpo monoclonal purificado y aislado (también denominado en el presente documento anticuerpo frente a IL-26) o un fragmento biológico activo del mismo que reconoce y se une específicamente a IL-26, en el que dicho anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo comprende:

i) una región variable de cadena pesada (HCVR), y

ii) una región variable de cadena ligera (LCVR).

Dicho anticuerpo monoclonal aislado o fragmento biológico activo del mismo comprende: una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1, CDR2, CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2, CDR3 y modificaciones conservativas de las mismas.

Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento biológico activo del mismo que reconoce y se une a IL-26, que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1, CDR2, CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2, CDR3 en las que:

(f) la secuencia de CDR3 de la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 10 o modificaciones conservativas de la misma;

o dicho anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento biológico activo del mismo capaz de reconocer y unirse específicamente a IL-26 comprende:

Más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento biológico activo del mismo capaz de reconocer y unirse a IL-26 consiste en:

una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

También se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el anticuerpo monoclonal o un fragmento biológico activo del mismo.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 que codifica para la cadena pesada del anticuerpo monoclonal y/o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 que codifica para la cadena ligera del anticuerpo monoclonal de la invención.

Otro objeto de la invención es proporcionar un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención.

Un objeto adicional de la invención es una célula que comprende el vector de expresión de la invención.

Aún un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un hibridoma y un anticuerpo monoclonal aislado secretado por dicho hibridoma.

En consecuencia, la presente invención se refiere a una línea celular de hibridoma de ratón depositada con el número de registro de la ATCC PTA-122358 y presentada el 10 de julio de 2015 en la ATCC.

(f) la secuencia de CDR3 de la región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o

dicho anticuerpo monoclonal aislado comprende:

En una realización de la invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que reconoce y se une a IL-26, y en el que dicho anticuerpo monoclonal aislado se produce por la línea celular de hibridoma 142-84-B1, número de registro de la ATCC PTA-122358.

En otra realización de la invención, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento biológico activo del mismo y/o la composición farmacéutica que contiene el mismo es adecuado para su uso en el tratamiento o alivio de los efectos de enfermedades inflamatorias seleccionadas entre grupo que comprende psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, esclerosis múltiple y colitis ulcerosa.

Preferiblemente, las enfermedades inflamatorias se seleccionan entre el grupo que comprende psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple.

Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende además uno o más de los siguientes: una sustancia biológicamente activa, un diluyente o un excipiente.

Más preferiblemente, la sustancia activa es un compuesto usado en el tratamiento de enfermedades inflamatorias tales como psoriasis.

Incluso más preferiblemente, el compuesto se selecciona entre la lista que comprende: metotrexato, ciclosporina, ácido fumárico, Neotigason; bloqueantes de TNF seleccionados entre etanarcept, adalimumab, infliximab; bloqueantes de IL-12/23p40 tales como ustekinumab; anticuerpos anti-IL-17 seleccionados entre secukinumab, ixekinumab; Apremilast, tofacitinib.

El anticuerpo monoclonal o el fragmento biológico activo del mismo y/o la composición farmacéutica de la invención se usa en el tratamiento o alivio de los efectos de enfermedades inflamatorias seleccionadas entre el grupo que comprende psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple.

En particular, el tratamiento del paciente con el anticuerpo monoclonal de la invención conduce a una disminución en:

a- La producción de IFN de tipo I en la lesión (IFN-a o IFN-b) y una disminución de la expresión génica inducida por IFN de tipo I;

b- la infiltración celular y la expresión de los genes inflamatorios IL-6, TNF, IL-12, IL-23, IL-8, IL-17, IL-22, IFN-g. Más preferiblemente, el tratamiento de la psoriasis en un paciente, con el anticuerpo monoclonal de la invención, conduce además a una disminución en:

i- el engrosamiento epidérmico en la histología (acantosis y papilomatosis) y la resolución clínica de la placa ii- la puntuación PASI.

También se proporciona una composición farmacéutica que comprende el inhibidor de la invención en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

En otras realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que incluye el anticuerpo monoclonal o fragmento biológico activo del mismo tal como se describió anteriormente junto con un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente o excipiente.

En la preparación de las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos descritos en las enseñanzas en el presente documento, pueden usarse una variedad de vehículos y excipientes y vías de administración, tal como resultará evidente para el experto en la técnica. Se enseña la tecnología de formulación representativa en, entre otros, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1995) y Handbook of Pharmaceutical Excipientes, 3a ed., Kibbe, A. H. ed., Washington D.C., American Pharmaceutical Association (2000); incorporados por la presente por referencia en su totalidad.

Las composiciones farmacéuticas comprenderán generalmente un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad farmacológicamente eficaz de los anticuerpos, o mezcla de anticuerpos.

La composición farmacéutica puede formularse como polvos, gránulos, disoluciones, suspensiones, aerosoles, sólidos, píldoras, comprimidos, cápsulas, geles, cremas tópicas, supositorios, parches transdérmicos y otras formulaciones conocidas en la técnica.

Para los fines descritos en el presente documento, se pretende que las sales farmacéuticamente aceptables de los anticuerpos incluyan cualquier sal farmacéuticamente aceptable reconocida en la técnica, incluyendo ácidos y/o bases orgánicos e inorgánicos. Los ejemplos de sales incluyen sodio, potasio, litio, amonio, calcio, así como aminas primarias, secundarias y terciarias, ésteres de hidrocarburos inferiores, tales como metilo, etilo y propilo. Otras sales incluyen ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido pirúvico, ácido maleico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido salicílico, etc.

Tal como se usa en el presente documento, “portador farmacéuticamente aceptable” comprende cualquier portador convencional farmacéuticamente aceptado conocido por los expertos en la técnica en la formulación de composiciones farmacéuticas. Por tanto, los anticuerpos o péptidos, por sí mismos, tales como los que están presentes como sales farmacéuticamente aceptables, o como conjugados, pueden prepararse como formulaciones en diluyentes farmacéuticamente aceptables; por ejemplo, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), etanol acuoso o disoluciones de glucosa, manitol, dextrano, propilenglicol, aceites (por ejemplo, aceites vegetales, aceites animales, aceites sintéticos, etc.), celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa, hidroxilpropilmetilcelulosa, estearato de magnesio, fosfato de calcio, gelatina, polisorbato 80 o como formulaciones sólidas en excipientes apropiados.

Las composiciones farmacéuticas a menudo comprenderán además uno o más tampones (por ejemplo, solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, etc.), bacteriostáticos, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio), solutos que hacen que la formulación sea isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservantes. Alternativamente, las composiciones de la presente invención pueden formularse como un liofilizado.

Aunque en las composiciones de esta invención puede emplearse cualquier portador adecuado conocido por los expertos en la técnica, el tipo de portador variará típicamente dependiendo del modo de administración. Las composiciones de anticuerpos pueden formularse para cualquier forma apropiada de administración, incluyendo, por ejemplo, administración oral, nasal, mucosa, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea e intramuscular.

Para la administración parenteral, las composiciones pueden administrarse como dosis inyectables de una disolución o suspensión de la sustancia en un diluyente fisiológicamente aceptable con un portador farmacéutico que puede ser un líquido estéril tal como agua estéril libre de pirógenos, aceites, solución salina, glicerol, polietilenglicol o etanol. Además, en las composiciones pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponantes del pH y similares.

Otros componentes de las composiciones farmacéuticas son los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, por ejemplo, disoluciones no acuosas de aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los anticuerpos pueden administrarse en forma de una inyección de depósito o preparación de implante, que puede formularse de tal manera que permita una liberación sostenida del principio activo. Una composición a modo de ejemplo comprende anticuerpo a 5 mg/ml, formulado en tampón acuoso que consiste en L-histidina 50 mM, NaCl 150 mM, ajustado a pH 6,0 con HCl.

Normalmente, las composiciones se preparan como inyectables, como o bien disoluciones o bien suspensiones líquidas; formas sólidas o en polvo adecuadas para su reconstitución con vehículos adecuados, incluyendo a modo de ejemplo y no de limitación, agua estéril libre de pirógenos, solución salina, disoluciones tamponadas, disolución de dextrosa, etc., antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas o micropartículas tales como polilactida, poliglicolida o copolímeros.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o múltiples dosis, como ampollas o viales sellados. Normalmente, tales recipientes se sellan de tal manera que se conserva la esterilidad y estabilidad de la formulación hasta su uso. En general, las formulaciones pueden almacenarse como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, tal como se indicó anteriormente.

Alternativamente, una composición farmacéutica puede almacenarse en un estado secado por congelación requiriendo solo la adición de un portador líquido estéril inmediatamente antes de su uso.

Más preferiblemente, la sustancia biológicamente activa es un compuesto usado en el tratamiento de enfermedades inflamatorias tales como psoriasis.

Para el tratamiento de la psoriasis, dicho compuesto se selecciona entre la lista que comprende: metotrexato, ciclosporina, ácido fumárico, Neotigason; bloqueantes de TNF seleccionados entre etanarcept, adalimumab, infliximab; bloqueantes de IL-12/23p40 tales como ustekinumab; anticuerpos anti-IL-17 seleccionados entre secukinumab, ixekinumab; Apremilast, tofacitinib.

Por tanto, el producto farmacéutico de la invención es adecuado para su uso en un método de prevención, tratamiento o alivio de los efectos de enfermedades inflamatorias seleccionadas entre el grupo que comprende psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple.

La composición farmacéutica de la invención es adecuada para su uso en un método de prevención, tratamiento o alivio de los efectos de enfermedades inflamatorias seleccionadas entre el grupo que comprende psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple.

La descripción anterior se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, tales ejemplos son a modo de ejemplo de métodos para poner en práctica la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplos

Material y métodos

Muestras humanas

Los estudios fueron aprobados por la Junta de revisión institucional del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas, la Universidad Heinrich-Heine de Düsseldorf y la Universidad de Lausana, y se realizaron según las directrices de la Declaración de Helsinki. Se tomaron biopsias cutáneas con sacabocados, tras la obtención del consentimiento informado, de pacientes que padecían psoriasis en placas definida según los criterios histopatológicos y clínicos convencionales, así como de donantes sanos. Las muestras se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80°C. Se obtuvieron capas leucocíticas sanguíneas de donantes sanos del Gulf Coast Regional Blood Center, Houston, Texas o del Service Vaudois de Transfusion, Epalinges, Suiza.

Reactivos

La IL-26 humana recombinante (rhIL-26), rhIL-17 y rhIL-22 eran de R&D Systems. El ADN genómico humano (ADN hu.) aislado de piel fetal, pulmón o leucocitos se adquirió de BioChain. Se adquirieron LL-37 y hBD3 sintéticos de Innovagen. Se generaron anticuerpos contra IL-26 inmunizando ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad con proteína rhIL-26. Se establecieron hibridomas que secretaban anticuerpos específicos para IL-26. Se usaron dos clones en estos estudios: el clon 142-84-B1 con la capacidad de inhibir la unión de IL-26 al ADN y el clon 142-69-1 con la capacidad de teñir IL-26 para microscopía confocal. Ambos clones se usaron a 10 pg/ml. Se usaron como controles anticuerpos de ratón de isotipo IgG1 coincidente. El agonista de TLR9 de fosfotioato sintético CpG-2006 (1 pM) (5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3') se adquirió de Trilink. El agonista de TLR1/2 Pam3CSK4, el agonista de TLR2 LTA y el agonista de TLR4 LPS se adquirieron de Invivogen. Los anticuerpos de cabra anti-IL-10R2 humana bloqueantes eran de R&D Systems. La cloroquina se adquirió de Sigma.

Modelado de proteínas

Los modelos de IL-26 humana (secuencia de Uniprotkp Q9NPH9) se generaron usando el software i-Tasser. El modelado adicional de IL-26 se basó en las estructuras atómicas publicadas de IL-19 (entrada de PDB 1N1F) e IL-22 (1M4R), mientras que un modelo de IL-26 con intercambio de brazos supuesto se basó en la estructura atómica de IL-10 (2ILK). Las secuencias de IL-19, IL-22 e IL-10 son aproximadamente un 25% idénticas y aproximadamente un 55% similares a IL-26. El mejor modelo de i-Tasser (un monómero compacto) tenía una puntuación C de alta significación de 0,36, con una rmsd esperada de 4,0 2,7 A.

Dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS)

Se suspendió IL-26 en tampón fosfato de sodio 16 mM, pH 6,5, NaCl 560 mM, glicerol al 8%, p-mercaptoetanol 2 mM y se concentró hasta 1,1 mg/ml. Los datos se registraron en el ALS, Berkeley, CA, línea de haz 12.3.1. (SIBYLS) a 10°C usando una longitud de onda de 1 A, para valores del vector de transferencia de momento q = (4rcsin9)A, entre 0,01 y 0,32 A-1. La misma muestra se expuso secuencialmente a rayos X durante 0,5 s, 1 s y 5 s. Las muestras que solo contenían tampón se midieron antes y después de las muestras de proteínas. Las contribuciones del tampón se restaron de los datos de dispersión de proteínas usando el nuevo programa de software Ogre disponible en SIBYLS. Los datos no se vieron afectados por el daño por radiación tal como se indica mediante un Rg constante de la región de Guinier para exposiciones de muestras posteriores. Se obtuvo un patrón de SAXS combinado a través de aumento a escala y fusión de regiones seleccionadas de patrón de dispersión con resta del tampón para las exposiciones de 0,5 s, 1s y 5s. Los datos entre q = 0,01 y 0,13 Á-1 se analizaron usando PRIMUS, SASREF y DAMMIF del paquete de software ATSAS.

Ensayos antimicrobianos

Se usaron las siguientes cepas de bacterias, Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853 y PA14), Escherichia coli (O1:K1:H7, O18:K1:H7, O111:K58:H2 y J5 O111:B4), Staphylococcus aureus (ATCC6538), Klebsiella pneumoniae O1:K2, Enterococcus faecalis (ATCC29212). Las bacterias se cultivaron durante la noche en caldo de tripticasa de soja (TB) NaCl 10 mM a 37°C seguido de subcultivo durante 3 h adicionales para obtener un crecimiento en fase logarítmica media. Las concentraciones bacterianas se midieron mediante espectrofotometría a 620 nm y se diluyeron para proporcionar una concentración final de 105 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml, seguido por una incubación de 24 horas a 37°C en condiciones de baja fuerza iónica (NaCl 10 mM). Se añadieron los efectos de IL-26, LL-37 o hBD3 a estos cultivos para someter a prueba su actividad antimicrobiana. Después de 24 h, se sembraron en placa diluciones en serie de cultivos bacterianos sobre placas de agar LB (caldo de lisogenia). Dos investigadores independientes contaron el número de colonias formadas después de la incubación durante la noche. La concentración inhibitoria mínima 50 (MIC50) de IL-26 se definió como la concentración más baja que inhibía > 50% del crecimiento de bacterias después de la incubación durante la noche. En algunos experimentos, las bacterias se incubaron en medio RPMI sin antibióticos o sobrenadantes de TH17 suplementados o sin el clon 142-84-1 anti-IL-26 bloqueante a 10 pg/ml. Para el análisis de la pérdida de potencial de membrana, las bacterias se incubaron con IL-26 10 pM y se recogieron en diferentes puntos de tiempo para teñirlas con el colorante indicador de potencial de membrana fluorescente DiOC2 (3) (kit de potencial de membrana bacteriana BacLight, Molecular Probes) según el protocolo del fabricante. Como control positivo, se usó CCCP 5 pM, un ionóforo de protones. Para un análisis adicional de la muerte bacteriana, los ácidos nucleicos bacterianos se tiñeron mediante 5 pM del tinte SYTO® 13 Green que permea las células y 5 pM del tinte SYTOX® Orange que no permea las células (Life Technologies). Todas las bacterias viables se teñirán con SYTO® 13 Green pero no con SYTOX® Orange, mientras que las bacterias muertas se teñirán con ambos tintes.

Microscopía electrónica de barrido de Pseudomonas aeruginosa

Se incubaron 5 x 105 UFC de Pseudomonas aeruginosa con IL-26 o vehículo (fosfato de sodio, NaCl 1,0 M, glicerol al 10%, pH 6,5) durante de 30 a 180 min en TB. Las muestras se colocaron en cubreobjetos de vidrio tratados con poli-1-lisina y se dejaron secar durante la noche. Las muestras en cubreobjetos se montaron en lengüetas de carbono de doble barra (Ted Pella. Inc.), que se habían montado previamente sobre soportes de aluminio para muestras (Electron Microscopy Sciences). Las muestras se recubrieron entonces a vacío usando un evaporador Balzer MED 010 (Technotrade International) con aleación de platino para un grosor de 25 nm, luego se recubrieron inmediatamente con carbono instantáneo al vacío. Las muestras se transfirieron a un desecador para su examen en una fecha posterior. Las muestras se examinaron en un microscopio electrónico de barrido JSM-5910 (JEOL, EE.UU., Inc.) a un voltaje de aceleración de 5 kV.

Ensayo de unión ELISA

Se recubrieron placas de 96 pocillos Nunc MaxiSorp® con PBS BSA al 1%, LPS 1 pg/ml o LTA 1 pg/ml durante 24 horas a 4°C. Entonces, se lavaron las placas y se añadieron concentraciones crecientes de IL-26, LL-37 o IL-22 diluidas en PBS BSA al 1% durante 1 hora a TA. Entonces, se lavaron las placas y se añadieron 0,5 pg/ml de anticuerpos de ratón anti-IL-26 (clon 142-69-1), anti-LL-37 (Santa Cruz) o anti-IL-22 (RnD Systems) diluidos en PBS BSA al 1% durante 1 hora a TA. Entonces, se lavaron las placas y se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-HRP (Thermo Scientific) diluido 1/5000 en PBS BSA al 1% a todos los pocillos durante 30 min a TA. Entonces se lavaron las placas y se añadió sustrato TMB. A continuación, se leyeron las placas a 450 nm usando un espectrómetro.

Modelo de infección pulmonar in vivo

Los procedimientos con animales fueron aprobados por la “Office Vétérinaire du Canton de Vaud”, Lausana, Suiza y se realizaron según las directrices federales para la experimentación con animales. La cepa de Klebsiella pneumoniae Caroli (O1:K2) 22 se cultivó durante la noche a 37°C en 10 ml de medio de infusión de cerebro-corazón (BHI) y se subcultivó durante 2 horas y se diluyó adicionalmente para obtener 104 UFC/ml. Se usaron ratones hembra BALB/c de ocho semanas de edad (Harlan Lab). Se realizó la instilación intranasal de 102 UFC de K. pneumoniae en un volumen de 10 pl manteniendo a los ratones en posición vertical bajo anestesia. Después de la infección, se inyectaron 20 pl del siguiente tratamiento por medio de la vía i.n. (intranasal): 20 pg de IL-26; 50 pg de LL-37 (control positivo) o PBS (control negativo). Otro control fue la infección intranasal de ratones con bacterias pretratadas con IL-26 (102 UFC 20 pg de IL-26 mezclados durante 1 hora antes de la inyección). Setenta y dos horas después de la exposición, se sacrificó a los ratones y se recogieron la sangre, los pulmones y los bazos. Los pulmones y los bazos se pesaron y homogeneizaron con un mortero Potter-Elvehjem. Se cultivaron homogeneizados de bazo, pulmones y sangre diluida en NaCl durante la noche en placas de agar sangre antes de que dos investigadores independientes contaran las colonias bacterianas.

Aislamiento de células de sangre periférica

Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación en Ficoll de capas leucocíticas sanguíneas. Entonces, se aislaron monocitos, células NK y pDC mediante separación magnética usando los siguientes kits comerciales disponibles: kit de aislamiento de monocitos II (Miltenyi), kit de enriquecimiento de células NK humanas EasySep™ (StemCell) y kit de aislamiento de pDC Diamond II (Miltenyi). Se diferenciaron macrófagos cultivando monocitos con GM-CSF 50 ng/nl durante 5 días. Después de la centrifugación en Ficoll, se usó la fracción de granulocitos de alta densidad para aislar neutrófilos usando microperlas de CD15 (Miltenyi). La pureza fue habitualmente > 95%, evaluada por citometría de flujo de: monocitos CD14+, células NK c D56+, pDC BDCA2+ CD123+, macrófagos CD14+ CD68+ FSCalto y neutrófilos CD15+ SSCalto.

Análisis de microalineamientos

El ARN total de las células clasificadas se aisló inmediatamente con el kit RNeasy de QIAGEN y se usó para generar ADNc según el Manual técnico de análisis de expresión (Affymetrix). Se generaron muestras de ARNc con el kit de marcaje de transcritos de ARN Bioarray High-Yield (ENZO) y la matriz Human Genome U133 plus 2.0 según el protocolo del fabricante (Affymetrix). Las imágenes escaneadas se alinearon y analizaron usando el software GeneChip Microarray Suite 5.0 (Affymetrix) según las instrucciones del fabricante. Las intensidades de la señal se normalizaron a la intensidad media de todos los genes representados en la matriz, y se aplicó el aumento a escala global (aumento a escala a todos los conjuntos de sondas) antes de realizar el análisis de comparación. Se seleccionaron genes con niveles de expresión variables según los siguientes criterios: los genes deben expresarse (tener identificaciones de presencia) en al menos una de las tres muestras y la razón ci/pi debe ser > 0,65, donde ci y pi son la desviación estándar y la media de los valores de intensidad de hibridación de cada gen particular en todas las muestras, respectivamente.

Generación y caracterización in vitro de complejos de IL-26-ADN

Se generaron complejos de IL-26-ADN mezclando 600 ng de ADN bact. (Life Technologies) o ADN hu. (BioChain) con diferentes concentraciones de IL-26 recombinante en 40 pl de agua libre de nucleasas (Ambion) y luego se diluyeron en 200 pl de medio completo para estimulación celular (concentraciones finales: ADN 3 pg/ml e IL-26 de 0,1 a 1 pM). Los complejos de IL-26-ADN se visualizaron mediante migración en gel de agarosa al 1,5% o mediante microscopía confocal después de teñir el ADN con DAPI (0,1 ng/ml; Sigma-Aldrich) o usando ADN marcado con Alexa488. El marcaje del ADN con Alexa 488 se realizó usando el kit de marcaje de ácido nucleico Ulysis (Molecular Probes), que usa un complejo de colorante de platino para formar un aducto estable con la posición N7 de una guanina, así como con menor eficiencia con bases de adenina en el ADN. Para detectar IL-26, se tiñeron suspensiones que contenían complejos precipitantes durante la noche con un anticuerpo anti-IL-26 de ratón (clon 142-69-1), seguido por lavados cuidadosos e incubación con anticuerpo secundario anti-ratón marcado con Alexa 546 durante 1 hora.

Generación de células TH17 y clones de TH17

Se enriquecieron células T CD4 no tratadas previamente a partir de capas leucocíticas de voluntarios sanos con el kit II de aislamiento de células T CD4+ no tratadas previamente (Miltenyi Biotec). Después de eso, las células se clasificaron en un instrumento FACSAria (Becton Dickinson) como CD45RA+, CD4+, Cd8-, CD14-, CD16-, CD20-, CD56-, y8TCR-, BDCA2-, CD11c-, CD25-, CD45RO- para alcanzar una pureza de > 95% de células T CD4+CD45RA+ no tratadas previamente. Entonces, se sembraron estas células en placas de fondo plano a 5 x 104 células/pocillo y se cultivaron durante 5 días en presencia de anticuerpos anti-CD3 unido a la placa (10 pg ml-1) y anti-CD28 soluble (1 pg ml-1) más IL-1 p (10 ng/ml) IL-6 (20 ng/ml) TGF-p (1 ng/ml) TNF-a (10 ng/ml) IL-23 (100 ng/ml) en medio de Yssel (Geminis) 23. Como control, también se estimularon células T no tratadas previamente (i) sin citocinas, (ii) IL-12 (5 ng/ml) IFN-y (20 ng/ml) anti-IL-4 (10 pg/ml) e (iii) IL-4 (25 ng/ml) anti-IFN-y (10 pg/ml) para generar células Th0, Th1 y Th2 respectivamente. Todas las citocinas usadas para la polarización se adquirieron de R&D Systems. Para los clones de TH17, se generaron células 1G3, 7H1 y 72G6 tal como se describió anteriormente y se cultivaron en RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con L-glutamina 2 mmol/l, p-mercaptoetanol 0,05 mmol/l, suero humano AB masculino al 10% (GemCell), 300 UI/ml de IL-2, IL-1 p 5 ng/ml e IL-23 10 ng/ml en presencia de la línea de células B de EBV alimentadoras irradiadas LCL111 a 0,3*106/ml Para generar sobrenadantes, se reestimularon células TH17 primarias o clones de TH17 con anticuerpo anti-CD3/anti-CD28 en medio sin antibióticos y se recogieron los sobrenadantes libres de células 24 horas después. Se midieron los niveles de proteína IL-26 en los sobrenadantes de células TH17 mediante ELISA (USCN Life Science). En algunos experimentos, los clones de TH17 se transfectaron con 80 pmoles de ARNip-A de control (secuencia intercambiada) o ARNip que selecciona como diana IL-26 complejada con 6 pl de reactivo de transfección de ARNip según el protocolo del fabricante (Santa Cruz Biotechnology) durante 6 horas a 37°C. Entonces, se lavaron las células y se reestimularon con anticuerpo anti-CD3/anti-CD28 en medio sin antibióticos y se recogieron los sobrenadantes libres de células 24 horas después. Se midió la concentración de IL-26 en los diferentes sobrenadantes mediante ELISA (Cusabio Biotech).

Análisis de PCR en tiempo real

Se recogieron células TH0, TH1, TH2 y TH17 polarizadas, se lisaron con el reactivo TRI (Ambion) y se almacenaron a -20°C. Se extrajo el ARN total usando el kit RiboPure (Ambion) y se limpió con el kit RNAqueous (Ambion). A continuación, se transcribió de forma inversa un pg de ARN en ADNc (ADNc de alta capacidad, Applied Biosystems). Para cada gen individual, se amplificaron 20 ng de ADNc para el análisis de expresión usando Taqman en un sistema ABI 7500 Fast. Se cuantificaron los niveles de ARNm de GAPDH humano y se usaron para la normalización como se describió anteriormente 30. Las sondas de Taqman humanas usadas fueron: IL26 (Hs00218189_m1), IL17A (Hs00174383_m1), IL17F (Hs00369400_m1), IL22 (Hs01574154_m1), IFNG (Hs00989291_m1), IL13 (Hs00174379_m1) y se adquirieron todas de Life Technologies.

Obtención de imágenes de complejos de IL-26-ADN en sobrenadantes de TH17

Se visualizaron complejos de ADN-IL-26 en sobrenadantes de células TH17 se visualizaron mediante tinción de complejos precipitantes con anticuerpo anti-IL-26 de ratón 10 pg/ml (clon 142-69-1) durante 2 h, seguido por incubación con anticuerpo secundario anti-ratón marcado con Alexa 546 durante 1 h. Después de lavados adicionales, se añadió DAPI (0,1 ng/ml) para teñir el ADN y se visualizó mediante microscopía confocal.

Estimulación de células inmunitarias mediante complejos de IL-26-ADN o sobrenadantes de TH17

Se cultivaron células inmunitarias purificadas en placas de fondo redondo de 96 pocillos a 5 x 104/pocillo en 200 pl de RPMI 1640 (GIBCO) suplementado con FCS al 10% (Atlanta biologicals) y pen./estrep. en presencia de IL-26 1 pM, ADN bact. o ADN hu., o complejos de IL-26-ADN. La viabilidad de las células después del cultivo se evaluó mediante citometría de flujo usando tinción con 7-AAD según el protocolo del fabricante (BioLegend). En algunos experimentos, se estimularon pDC con diferentes cantidades de bacterias vivas (P. aerug), diferentes concentraciones de contenido de ADN de bacterias lisadas químicamente (Tris 50 mM pH 8,0, Triton X-100 al 0,1%) o diferentes cantidades de 1.106 células/ml de células 293T vivas o moribundas tratadas con UV en presencia de IL-26 10 pM. Las PDC también se estimularon con diversas cantidades de sobrenadantes derivados de células TH0 o TH17 solas o suplementadas con ADN hu. 3 pg/ml. En algunos experimentos, se pretrataron los sobrenadantes o complejos generados in vitro con ADNasa I (1.000 U/ml) o heparina (hasta 10 U/ml). Los diferentes sobrenadantes de células inmunitarias se recogieron después del cultivo durante la noche y se midieron los niveles de producción de citocinas mediante ELISA: IL-1 p, IL-6, TNF-a (R&D Systems) e IFN-a (PBL Biomedical Laboratories).

Captación e internalización de complejos de IL-26-ADN por pDC

Se incubaron pDC purificadas con ADN marcado con Alexa488 3 pg/ml mezclado con IL-261 pM a 5 x 104/pocillo en 200 pl de Rp M i 1640 (GIBCO) suplementado con FCS al 10% (Atlanta biologicals) durante 3 horas a 37°C. Entonces, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron para el marcador específico de pDC CD123 (anticuerpo anti-CD123-APC, BD Biosciences) y se analizaron mediante citometría de flujo (FACS Calibur, BD). Alternativamente, se dejó que las células se unieran a cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina durante 3 horas, se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron para el marcador específico de pDC CD123 (anticuerpo anti-CD123-PE, clon 7G3, BD Biosciences) o el marcador de endosomas tempranos CD71 (anticuerpo anti-CD71-biotina, clon M-A712, BD Biosciences estreptavidina-PE), y se montaron en ProLong® DAPI (Life Technologies).

Ensayo de gen indicador de TLR9

Se adquirieron de Invivogen células 293 de riñón embrionario humano (HEK) que coexpresan de manera estable un gen de TLR4 o TLR9 humano y un gen indicador SEAP (fosfatasa alcalina embrionaria secretada) inducible por NF-kB. Después de la activación de TLR4 o TLR9, se detectaron los niveles de SEAP secretados en el sobrenadante libre de células usando medio QUANTI-Blue (InvivoGen) y se cuantificaron leyendo la DO a 620 nm.

Homogeneización de tejidos para ELISA de IL-26

Las biopsias de piel se transfirieron a tubos de polipropileno que contenían 1 ml de tampón que consistía en PBS suplementado con NaCl 1 M e inhibidor de proteasas (cóctel inhibidor de proteasas, kit III; Merck Millipore) antes de realizar la homogeneización usando un instrumento Polytron PT 2500 E (Kinematica, Suiza). Entonces, se transfirieron los homogeneizados a tubos de baja unión a proteínas (Eppendorf) y se centrifugaron a 5000 X g durante 5 min a 4°C. El sobrenadante resultante se almacenó a -20°C. Con el fin de determinar la concentración de proteína total, se usó el kit de ensayo de proteínas Pierce® BCA (Thermo Scientific) según el protocolo del fabricante. La concentración de proteína total de las muestras se ajustó posteriormente a 100 pg/ml antes de medir la concentración de IL-26 mediante ELISA (Cusabio Biotech). La concentración de IL-26 en la muestra de biopsia de piel original se estimó entonces dividiendo la cantidad total de IL-26 medida en cada muestra entre el volumen de la biopsia de piel. Se estimó que el volumen de la biopsia de piel en una muestra cilíndrica de biopsia por sacabocados de 3 mm era: h x (n x r2) = 3 x (n x 1,52) = 21,2 mm3 = 21,2 pl.

Análisis estadístico

Se realizaron análisis estadísticos con la prueba de la t de Student desapareada bilateral para experimentos in vitro y con la prueba de la U de Mann-Whitney desapareada no paramétrica para experimentos in vivo y análisis de muestras de pacientes. P <0,05 se consideró significativo. Los tamaños de los grupos, la reproducibilidad y los valores de p para cada experimento se facilitan en la leyenda de la figura correspondiente.

Ejemplo 1: IL-26 es una proteína multimérica catiónica y anfipática

El análisis de secuencia de IL-26 reveló un carácter catiónico poco común de esta citocina: carga calculada de 18,1 a pH 7 y punto isoeléctrico de 10,4.

Se encontró que la mayoría de las cargas catiónicas estaban contenidas dentro de o adyacentes a 2 de las 6 hélices predichas de la proteína: las hélices B y E contienen tres argininas y siete lisinas. El modelado tridimensional de la proteína reveló una proximidad estrecha de las hélices B y E, conduciendo a la formación de agrupaciones y a la exposición en superficie de los residuos catiónicos. En el lado opuesto de esta agrupación, reside un parche hidrófobo (hélice A) compuesto por varias cadenas laterales hidrófobas (alanina 23, isoleucina 26, alanina 29, triptófano 30, alanina 33). La predominancia de residuos polares (catiónicos) en un lado de la molécula y aminoácidos hidrófobos en el lado opuesto indicó que IL-26 es una proteína anfipática catiónica.

La estructura de IL-26 se analizó además mediante análisis de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) de IL-26 humana recombinante (rhIL-26). IL-26 no solo formó dímeros, sino que también fue capaz de formar multímeros de mayor grado. Esto representa una estructura atípica en comparación con los homólogos próximos IL-10 e IL-22, que solo pueden dimerizarse. De manera interesante, se encontró que los multímeros de IL-26 adoptan una forma cuentas en un hilo, dando lugar a estructuras alargadas. Por tanto, IL-26 es una proteína altamente catiónica y anfipática que forma multímeros alargados, representando una estructura altamente atípica en comparación con otras citocinas tales como IL-10 e IL-22 de la misma familia.

Ejemplo 2: Anticuerpos monoclonales de ratón

El anticuerpo de ratón se ha generado contra un constructo antigénico que comprende un péptido antigénico correspondiente a la secuencia de aminoácidos de IL-26 humana recombinante rhIL-26 de R&D Systems. Para provocar y preparar anticuerpos, se inmunizó a ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad con el péptido de IL-26 humana recombinante antigénico. La inmunogenicidad del constructo antigénico se determina explorando muestras de sueros en intervalos de tiempo adecuados tras la inmunización usando un inmunoensayo tal como, por ejemplo, un ensayo ELISA. El inmunógeno puede administrarse solo, o mezclado con adyuvante, o expresado a partir de un vector (vector de replicón de VEE, vaccinia), o como ADN, o como una proteína de fusión para inducir una respuesta inmunitaria.

Después del refuerzo del animal, por ejemplo, dos o más veces, se recogen células de bazo de los animales inmunizados y se generan hibridomas fusionando células de bazo sensibilizadas con una línea celular de mieloma, tal como células de mieloma SP2/O murino (ATCC, Manassas, VA) usando los procesos bien conocidos de Kohler y Milstein (Nature 256: 495-497 (1975)) y Harlow y Lane (Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York 1988)).

El constructo antigénico según la invención, particularmente una composición de vacuna que comprende dicho constructo antigénico en una forma farmacéuticamente aceptable, se administra en dosis repetidas, en particular, en de 1 a 15 dosis, más particularmente en de 2 a 10 dosis, incluso más particularmente en 3 a 7 dosis, pero especialmente en de 4 a 6 dosis, en intervalos de tiempo de entre 1 y 10 semanas, particularmente en intervalos de tiempo de entre 1 y 6 semanas, más particularmente en intervalos de tiempo de entre 1 y 4 semanas e incluso más particularmente en intervalos de tiempo de entre 2 y 3 semanas. La respuesta inmunitaria se monitoriza tomando muestras de suero en un momento adecuado tras el refuerzo, particularmente de 3 a 10 días tras el refuerzo, más particularmente de 4 a 8 días tras el refuerzo y más particularmente de 5 a 6 días tras el refuerzo y determinando la inmunogenicidad del constructo antigénico usando metodología conocida, particularmente uno de los inmunoensayos comúnmente usados tales como, por ejemplo, un ensayo ELISA.

La inmunización con el constructo antigénico según la invención, pero, en particular, con una composición de vacuna que comprende el constructo antigénico según la invención en una forma farmacéuticamente aceptable, conduce a una respuesta inmunitaria significativa en el animal tratado. Los animales, pero especialmente ratones con títulos terapéuticos, se seleccionan para una fusión de células productoras de anticuerpos, particularmente linfocitos B, con una línea celular inmortal o de crecimiento continuo, tal como una línea celular de mieloma. Se induce la fusión de las células mediante la adición de polietilenglicol. Los títulos terapéuticos son aquellos que dan un resultado positivo en un ensayo ELISA en una dilución de entre 1:4000 y 1:6000, particularmente de entre 1:4500 y 1:5500, más particularmente de 1:5000.

Las células híbridas resultantes se clonan entonces de la manera convencional, por ejemplo, usando dilución limitante, y los clones resultantes, que producen los anticuerpos monoclonales deseados, se cultivan.

Los hibridomas así obtenidos se seleccionan químicamente sembrando en placa las células en un medio de selección que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT).

Los hibridomas se examinan posteriormente para determinar su capacidad para producir anticuerpos monoclonales contra IL-26. Los hibridomas que producen anticuerpos de interés se clonan, se expanden y se almacenan congelados para su futura producción. El hibridoma preferido produce un anticuerpo monoclonal tal como el clon 142-84-B1 que tiene el isotipo IgG, más preferiblemente el isotipo IgG1.

Ejemplo 3: Lista de secuencias del clon de anticuerpo monoclonal de ratón 142-84-B1 aislado y purificado que reconoce y se une a IL-26 así como anticuerpos quiméricos y humanizados del mismo

Secuencias del clon de anticuerpo monoclonal 142-84-B1.

Cadena pesada (HC)

ADN de HC de 84: correspondiente a SEQ ID No 1

CAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAC GCTGTCCTGCAAGGCCTCGGGCTT CACATTTCCTGACTATGAAATACACTGGGTGAGGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGA AT GGATT GGAGGT ATT GAT C C TG AAACTGGTGATACTGCCAACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCA GACACATCCTCCAGCACAGCCTAC ATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCAGCCGTCTATTACTGTACAAGATTC T ACGGT AGTTTTGACT ACTGGGA CCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA AA de HC de 84: correspondiente a SEQ ID No 3

QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGFTFPDYEIHWVRQTPVHGLEWIGGIDPETGDTA NN QKFKGK ATLT ADT S S S T AY MELRSLTSED S AVYYCTRF Y GSFD YWDQGTTLT V S S

Cadena ligera (LC)

ADN de LC de 84: correspondiente a SEQ ID No 2

AACATTATGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAAGGTC ACTCTGAGCTGTAAGTCCAGTCA AAGTGTTTTATACAGTTCAAATCAGAAAAATTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACC AGGGCAGTCTCCTAAACTACTGA TCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGAT CTGGGACAGATTTTACTCTTACC ATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTCC TCGT AC AC GTTC GGAGGGGGGAC C AAGCTGGAAAT AAAA AA de LC de 84: correspondiente a SEQ ID No 4

NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTLSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWAST RESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSSYTFGGGTKLEIK

Determinación de las CDR:

Cadena pesada

QYQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGFTFPDYEIHWVRQTPVHGLEWIGGIDPETGDT ANNQKFKGKATLTADTSS STAYMELRSLTSEDS AVYYCTRFY GSFDYWDQGTTLTV S S CDR-H1: GFTFPDYEIH correspondiente a SEQ ID No 5

CDR-H2: GIDPETGDTANNQKFKG correspondiente a SEQ ID No 6

CDR-H3: FYGSFDY correspondiente a SEQ ID No 7

Cadena ligera NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTLSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWAS TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSSYTFGGGTKLEIK CDR-L1: KSSQSVLYSSNQKNILA correspondiente a SEQ ID No 8

CDR-L2: WASTRES correspondiente a SEQ ID No 9

CDR-L3: HQILSSYT correspondiente a SEQ ID No 10

En un aspecto, puede proporcionarse un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo, o un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo que comprende en la región variable al menos una CDR de origen no humano incrustada en una o más regiones marco derivadas de ser humano o primate y combinada con una región constante derivada de un anticuerpo fuente de ser humano o primate, anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo, o un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo que es capaz de reconocer y unirse específicamente al péptido de IL-26. En otro aspecto, puede proporcionarse un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo, en el que la Lys C-terminal de la región constante de cadena pesada se ha eliminado.

En un aspecto adicional, puede proporcionarse un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo, anticuerpo humanizado o fragmento del mismo que es del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

Ejemplo 4: Bloqueo de IL-26 con el Ac anti-IL26 para el tratamiento de la psoriasis

La psoriasis es una enfermedad inflamatoria mediada por células T común de la piel que, en su forma más prevalente, se caracteriza por la aparición de placas eritematosas escamosas que pueden cubrir áreas grandes del cuerpo del paciente. Una característica clave de la psoriasis es la activación anómala de subconjuntos de células dendríticas (DC) en el compartimento dérmico que conduce a la cascada autoinmunitaria mediada por células T aguas abajo. El papel de las DC plasmacitoides (pDC) que producen IFN de tipo I parece ser central en este proceso. Los IFN derivados de pDC activan DC convencionales que estimulan la migración de células T a la epidermis. Allí, estas células T producen las citocinas de Thl7 IL-17 e IL-22 [6, 7], que inician directamente la proliferación de queratinocitos y un patrón de diferenciación epidérmica anómalo.

Los solicitantes encontraron que IL-26 tiene la capacidad de romper la tolerancia innata al ADN extracelular y desencadenar la activación de pDC junto con el hallazgo de que IL-26 se sobreexpresa en piel con psoriasis a concentraciones que son relevantes para la activación de pDC, lo que sugiere que IL-26 podría representar un desencadenante clave de la activación de pDC y el desarrollo de la psoriasis. Para someter a prueba este enfoque, los solicitantes inyectaron repetidamente IL-26 en piel murina. Es de destacar que en el sistema de ratón no hay IL-26R y, por tanto, cualquier posible efecto de IL-26 puede estar impulsado por efectos independientes de receptor que los solicitantes han descrito.

Una única inyección intradérmica de IL-26 indujo el reclutamiento y la activación de pDC (figura 7), lo que sugiere que este modelo es válido para someter a prueba su función inflamatoria. Los solicitantes han encontrado que la inyección intradérmica repetitiva de IL-26 a lo largo de 5 días indujo una inflamación sostenida de la piel y acantosis epidérmicas (figura 8) proporcionando pruebas de que IL-26 puede inducir una lesión cutánea psoriasiforme.

El objetivo de este estudio consiste en la generación de anticuerpos anti-IL26 y la identificación de clones que son capaces de inhibir la capacidad de IL-26 para activar pDC in vitro e in vivo, y para inhibir la inducción de psoriasis mediada por IL-26.

En resumen, se inmunizó a un ratón BALB/c de menos de 6 meses de edad con proteína IL26 purificada. Se identificaron mediante ELISA hibridomas que secretaban anticuerpos monoclonales que reconocían IL26. Se identificaron tres clones específicos de IL-26 con alta afinidad por IL-26: el clon 69 (IgG1), el clon 73 (IgG1) y el clon 84 (IgG1).

Los solicitantes sometieron a prueba entonces los clones para determinar su capacidad para bloquear la inmunogenicidad de complejos de IL-26-ADN in vitro. En resumen, los solicitantes generaron complejos de IL-26-ADN mezclando 600 ng de ADN humano (BioChain) con IL-26 recombinante en 40 pl de agua libre de nucleasas (Ambion) y luego los diluyeron en 200 pl de medio completo para la estimulación de pDC (concentraciones finales: ADN 3 pg/ml e IL-26 1 pM). Se añadieron concentraciones crecientes del clon 69, el clon 73 y el clon 84 (10 pg/ml, v) a los cultivos finales. Se midió IFN-a en los sobrenadantes de pDC después del cultivo durante la noche. El clon 84 (concretamente 142-84-B1), pero no los clones 69 o 73, inhibieron eficazmente la producción de IFN-a por pDC a concentraciones de 100 pg/ml, 1000 pg/ml (figura 9).

Estos hallazgos se confirmaron además usando oligonucleótidos de CpG fosfodiestéricos, que son un potente inductor de IFN cuando se complejan con IL-26 pero no cuando se administran solos (figura 10). De nuevo, solo el clon 84, pero no los clones 69 o 73, fue capaz de bloquear la capacidad de IL-26 para promover la inmunogenicidad de CpG-ADN (figura 10).

La capacidad del clon 84 para neutralizar la unión de IL-26 al ADN se mostró en el experimento de tinción con Picogreen. La figura 11 muestra la incapacidad del colorante Picogreen para teñir el ADN debido a que su unión a IL-26 se restaura mediante anticuerpo anti-IL-26 clon 84 (figura 11), lo que indica que inhibe la unión de IL-26 al ADN.

Para determinar si los anticuerpos anti-IL-26 bloquearían la producción de IFN por pDC in vivo, los solicitantes aprovecharon el modelo de inyección de IL-26 cutánea. Tal como se describió anteriormente, la inyección de IL-26 repetitiva produjo una fuerte infiltración de pDC y producción de IFN de tipo I. Los solicitantes han mostrado previamente que la infiltración cutánea de pDC es en gran medida dependiente de su producción de IFN de tipo I, en un bucle que se amplifica a sí mismo. La inyección intradérmica de 10 pg del anticuerpo anti-IL-26 clon 84 cada día durante 5 días condujo a una inhibición completa de la expresión de IFN de tipo I y la infiltración de pDC (figuras 12 y 13a-b). En cambio, el tratamiento con el clon 69 y el clon 73 mostró solo efectos parciales, confirmando los datos in vitro (figuras 12 y 13a-b).

Por tanto, el anticuerpo anti-IL-26 clon 84 bloquea la inducción de IFN de tipo I y la infiltración de pDC en piel en la que se inyectó IL-26. La expresión de IFN de tipo I por pDC en la piel es un acontecimiento clave que inicia la inflamación y la inducción del fenotipo psoriásico epidérmico. De hecho, el clon 84 inhibió significativamente la infiltración de células T (no mostrado) y el desarrollo del fenotipo psoriásico (figura 13c).

Ejemplo 5: IL-26 recombinante destruye bacterias extracelulares mediante formación de poros

Usando ensayos de dilución de microcaldo (MBDA), rhIL-26 5-10 microM inhibió el crecimiento de varias cepas bacterianas Gram-negativas, incluyendo Pseudomonas aeruginosa (PA14), Escherichia coli (O1:K1:H7, O18:K1:H7, O111:B4, O111:K58:H2), Klebsiella pneumonia (O1:K2) (figura 1a y figura 1b). No se observó inhibición de la formación de colonias con Enterococcus faecalis o Candida albicans a concentraciones de IL-26 de hasta 50 pM (tabla 1).

Tabla 1:

Determinación de la concentración inhibidora mínima (CIM) de la actividad antimicrobiana de IL-26 contra varios microorganismos. CIM de IL26 contra P. aeruginosa, E. coli, S. aureus, E. faecalis y C. albicans determinada mediante ensayos de dilución de microcaldo.____________________________________________________________ ____________________________ Organismo____________________________________ CIM50 de IL-26 (pM) Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853) 8,6 Escherichia coli (ATCC11775) 18,6 Staphylococcus aureus (ATCC6538) 8,8 Enterococcus faecalis (ATCC29212) > 50

Candida albicans (ATCC24433) > 50

rhIL-26, pero no rhIL-17 ni rhIL-22, inhibió eficazmente la formación de colonias de Pseudomonas aeruginosa a concentraciones de 10 pM. La inhibición observada de la formación de colonias se debía a destrucción bacteriana ya que el número de colonias disminuyó a lo largo del tiempo (> log 2 a lo largo de 24 h) (figura 1c). Se confirmó la pérdida de la integridad de la membrana por la disminución de la tinción bacteriana usando un colorante indicador del potencial de membrana fluorescente y el aumento de la tinción bacteriana con un colorante de ADN por lo demás impermeable.

Para determinar si IL-26 destruye bacterias mediante formación de poros y rotura de la membrana, se analizó la ultraestructura de bacterias tratadas con IL-26 usando microscopía electrónica de barrido. Tan pronto como 30 min después del tratamiento con IL-26 10 pM, se observó la formación de ampollas de membrana en la superficie de las bacterias. En algunos casos, se observó la rotura de las ampollas con fuga del citosol al entorno extracelular. Estos datos indican que IL-26 rompe las membranas bacterianas por medio de la formación de poros.

Además, IL-26 tiene la capacidad de unirse a lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram-negativas y ácido lipoteicoico (LTA) de bacterias Gram-positivas (figura 1d y tabla 2).

Tabla 2: IL-26 se une a los componentes de la pared celular bacteriana LPS y LTA. Constantes de disociación (KD) de la unión de IL-26, IL-22 o LL-37 a LPS o LTA, medidas mediante ELISA. (NI) indica sin interacción.

KD (media DE) 40,5 nM 4,95 20,91 nM 2,84 3,45 nM 0,8 NI NI

Ejemplo 6: Modelo de ratón de septicemia por K. pneumonía y actividad antimicrobiana de rhIL-26

La actividad antimicrobiana de rhIL-26 se sometió a prueba in vivo usando a modelo de ratón de septicemia por K. pneumonia. Este modelo se basa en la administración intranasal de K. pneumonia (O1:K2), que da como resultado infección del pulmón seguida por una propagación rápida de las bacterias en la circulación y el bazo. El tratamiento de los ratones con IL-26 dio como resultado títulos bacterianos significativamente reducidos en los pulmones, el bazo y la sangre en comparación con los ratones de control (figura 1e). La actividad antibacteriana in vivo de IL-26 fue comparable a la observada con el péptido antimicrobiano LL-37. También se observó una fuerte reducción de los títulos bacterianos cuando las bacterias se pretrataron in vitro con IL-26, antes de la administración intranasal. Por tanto, IL-26 es una proteína antimicrobiana que destruye eficazmente bacterias extracelulares in vitro e in vivo.

Ejemplo 7: Las células TH17 tienen actividad antimicrobiana por medio de la producción de IL-26

La capacidad de los sobrenadantes de células TH17 para destruir bacterias extracelulares se sometió a prueba en un ensayo de dilución de microcaldo. Los sobrenadantes de TH17 pero no los sobrenadantes de TH0 destruyeron eficazmente P. aeruginosa (figura 2a). El crecimiento bacteriano se restauró completamente mediante la adición del anticuerpo anti-IL-26 bloqueante (clon 84), que se mostró que inhibía la destrucción de bacterias por IL-26 recombinante (figura 2b).

Conjuntamente, esos datos revelan una capacidad antimicrobiana directa de células TH17 células por medio de su producción de IL-26.

Ejemplo 8: IL-26 promueve la detección de ADN liberado durante la destrucción bacteriana

El análisis mediante microscopía confocal de P. aeruginosa tratada con rhIL-26 reveló que las bacterias moribundas liberaban estructuras de ADN que forman complejos con IL-26. La capacidad de IL-26 para unirse a ADN bacteriano se confirmó mezclando fragmentos de ADN bacteriano con concentraciones crecientes de la IL-26. IL-26, pero no IL-17 ni IL-22, se unía eficazmente al ADN ya que disminuía la capacidad de tinción del ADN y retardaba la migración del ADN en un ensayo de gel de agarosa. Además, ADN bacteriano mezclado con IL-26, pero no ADN mezclado con IL-17 o IL-22, formaba partículas insolubles, lo que muestra su capacidad para empaquetar y condensar el ADN.

Se sometió a prueba la capacidad de los complejos de IL-26-ADN para desencadenar la producción de citocinas inflamatorias por células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas. Los complejos de IL-26-ADN indujeron la producción de IL-1p, IL-6 e IFN-a por PBMC, pero solo la producción de IFN-a estaba significativamente potenciada en comparación con la estimulación con ADN bacteriano solo o IL-26 sola (figura 3a).

Para determinar qué tipo de célula era responsable de la producción de IFN-a, se estimularon monocitos, células NK, neutrófilos, células dendríticas plasmacitoides (pDC) y macrófagos con complejos de IL-26-ADN. Solo las pDC produjeron altas cantidades de IFN-a tras la estimulación con los complejos (figura 3b) y el agotamiento de pDC de las PBMC suprimió completamente su capacidad para producir produce IFN-a, lo que indica que las pDC son una diana clave de los complejos de ADN bacteriano-IL-26. El ADN bacteriano purificado solo indujo una producción débil o nula de IFN-a por pDC (figura 3b), mientras que IL-26 fue incapaz de inducir ninguna producción de IFN-a en pDC en ausencia del ADN. Estos datos demuestran que IL-26 puede formar complejos con a Dn bacteriano y promover de ese modo la inmunogenicidad del ADN conduciendo a la producción de IFN-a por pDC.

Se sometió a prueba la capacidad de los complejos de IL-26-ADN generados en el contexto de la destrucción bacteriana para promover la activación de pDC. Mientras que P. aeruginosa viva fue incapaz de activar pDC, P. aeruginosa destruida por IL-26 indujo una fuerte producción de IFN-a (figura 3c). El sobrenadante de P. aeruginosa destruida por ciclos de congelación-descongelación tampoco fue capaz de activar pDC, pero adquirió esta capacidad cuando se mezcló con IL-26 (figura 3d). En estos cultivos, la producción de IFN-a iba paralela al contenido de ADN y se suprimió completamente si el ADN se agotaba mediante tratamiento con ADNasa (figura 3e). Estos datos indican que IL-26 tiene la capacidad de destruir bacterias, unirse a ADN bacteriano y promover su inmunogenicidad desencadenando la activación de pDC.

Ejemplo 9: IL-26 promueve la detección de ADN humano liberado por células moribundas

Se sometió a prueba la capacidad de rhIL-26 para destruir una gama de células humanas incluyendo células HEK y células inmunitarias primarias. No hubo actividad citotóxica a 10 pM, la concentración requerida para una destrucción microbiana eficaz (figura 4a). De manera similar, rhIL-26 mezclada con estas células humanas vivas no indujo activación de pDC (figura 4b). Sin embargo, cuando se mezcló rhIL-26 con células humanas irradiadas para desencadenar la apoptosis y necrosis secundaria, se observó activación de pDC (figura 4b).

De manera importante, el ADN humano indujo producción de IFN-a de una manera dependiente de la dosis y solo en presencia de IL-26 (figuras 4c y 4d), lo que confirma que IL-26 convierte el ADN humano por lo demás no estimulador

Claims

REIVINDICACIONES

i. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento biológico activo del mismo que se une a IL-26, que comprende:

una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1, CDR2, CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2, CDR3 en las que:

(a) la secuencia de CDR1 de la región variable de cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5;

(b) la secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

(c) la secuencia de CDR3 de la región variable de cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7;

(d) la secuencia de CDR1 de la región variable de cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 8;

(e) la secuencia de CDR2 de la región variable de cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 9;

(f) la secuencia de CDR3 de la región variable de cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 10;

o dicho anticuerpo monoclonal aislado comprende:

i) una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y

ii) una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 4.
2. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento biológico activo del mismo capaz de reconocer y unirse a IL-26 según la reivindicación 1, que consiste en:

una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
3. Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo monoclonal o fragmento biológico activo del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
4. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.
5. Vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 3-4.
6. Célula que comprende el vector de expresión según la reivindicación 5.
7. Hibridoma depositado con un número de registro de la ATCC PTA-122358.
8. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento biológico activo del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, y opcionalmente que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
9. Composición farmacéutica según la reivindicación 8, que comprende además uno o más de los siguientes:

una sustancia biológicamente activa, un diluyente o un excipiente.
10. Composición farmacéutica según la reivindicación 9, que comprende además una sustancia biológicamente activa que es un compuesto usado en el tratamiento de enfermedades inflamatorias.
11. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento biológico activo del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y/o composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para su uso en el tratamiento o alivio de los efectos de enfermedades inflamatorias seleccionadas del grupo que consiste en psoriasis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.