ES2859559T3

ES2859559T3 - Péptidos miméticos

Info

Publication number: ES2859559T3
Application number: ES13792995T
Authority: ES
Inventors: Nicolas Vuilleumier; Sabrina Pagano; Oliver Hartley; Hubert Gaertner; Teixeira Priscila Camillo; Paul Cutler; Philippe Ferber
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Universite de Geneve; Hopitaux Universitaires De Geneve
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Universite de Geneve; Hopitaux Universitaires De Geneve
Priority date: 2012-11-06
Filing date: 2013-11-06
Publication date: 2021-10-04
Anticipated expiration: 2033-11-06
Also published as: US20150291682A1; BR112015010276A2; RU2015121688A; KR20150082350A; JP6499967B2; CA2888657C; EP2917234A1; JP2016505514A; RU2662973C2; CN104768970B; EP2917234B1; CN104768970A; KR102215175B1; MX2015005761A; WO2014072916A1; US10087234B2; MX364626B; CA2888657A1

Abstract

Un procedimiento para detectar anticuerpos anti-ApoA-I endógenos en una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero que comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero; (b) poner dicha muestra de fluido biológico en contacto con una matriz sólida donde se acopla al menos un péptido mimético de un epítopo de apolipoproteína A-I (ApoA-I), donde dicho péptido mimético consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 15 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 16 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 17 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 19 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 20 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 25, donde dicha variante de péptido mimético es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético excepto que 1, 2, 3 , 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia son sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I, donde el contacto es bajo condiciones suficientes para unir un anticuerpo anti-ApoA-I presente en dicha muestra de fluido biológico a dicho al menos un péptido mimético a través de interacciones antígeno- anticuerpo, donde la secuencia de dicho al menos un péptido mimético tiene una reticulación interna entre al menos dos aminoácidos no contiguos; (c) eliminar cualquier anticuerpo no unido de la superficie de dicha matriz sólida; (d) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo unido a dicha matriz sólida; donde la presencia de dicho complejo es indicativa de que la muestra de fluido biológico contiene anticuerpos anti- ApoA-I endógeno.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos miméticos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a péptidos útiles para el pronóstico, diagnóstico o tratamiento de una enfermedad cardiovascular.

Antecedentes de la invención

La Apolipoproteína A-I (ApoA-I) es la proteína más abundante (70 %) de la lipoproteína de alta densidad (HDL), cuya concentración se sabe está correlacionada con el riesgo cardiovascular. La ApoA-I asociada con HDL juega un papel crucial en la hemostasis del colesterol al regular el transporte de colesterol inverso y suministrar el mismo al hígado (Yancey y col.; 2003, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23:712-719). La ApoA-I asociada con HDL tiene también propiedades antiinflamatorias y tiene propiedades antioxidantes.

Se han descrito altos niveles de auto-anticuerpos respecto a la ApoA-I de subclase IgG (IgG anti-ApoA-I) en pacientes que padecen lupus eritematoso sistémico (SLE), una condición autoinmune asociada con un alto riesgo de enfermedad cardiovascular (CV) (Dinu y col., 1998, Lupus 7:355-360). Los auto-anticuerpos de IgG anti-ApoA-I también se han descrito en otras poblaciones con alto riesgo de CV que incluyen pacientes con infarto de miocardio (MI) (Vuilleumier y col., 2010a, Eur.Heart J. 31:815-823), pacientes con artritis reumatoide (RA) (Vuilleumier y col., 2010b, Arthritis Rheum. 62:2640-2650), pacientes con dolor de pecho agudo (Keller y col., 2012, J. Intern. Med. 271:451-462), y pacientes con estenosis carotídea severa (Montecucco y col., 2011, Eur. Heart J. 32:412-421). En pacientes con MI y RA, los auto-anticuerpos de IgG anti-ApoA-I mostraron estar independientemente asociados con mayor riesgo de enfermedad CV en poblaciones con alto riesgo de CV (Vuilleumier y col., 2010a y b, supra; Keller y col., 2012, supra), y en pacientes con estenosis carotídea severa los mismos estaban asociados con mayor vulnerabilidad a la placa aterosclerótica (Montecucco y col., 2011, Eur. Heart J. 32:412-421). Finalmente, en un reciente estudio de comparación cara a cara, se mostró que los auto-anticuerpos de IgG anti-ApoA-I son el mejor marcador autoinmune humoral para el pronóstico de CV después de un MI (Vuilleumier, 2011, J. Clinic. Experiment. Cardiology. 2:69), y el único biomarcador que proporciona información del pronóstico incremental para factores tradicionales de riesgos cardiovasculares para la estratificación de riesgo de CV en pacientes con RA (Finckh y col., 2012, Arthritis Care Res (Hoboken) 64:817-825).

Desde un punto de vista patofisiológico, se ha mostrado que los auto-anticuerpos de IgG anti-ApoA-I son mediadores potenciales de la aterogénesis y complicaciones relacionadas al incrementar el tamaño de las lesiones ateroscleróticas y la vulnerabilidad cuando se administran a ratones carentes de ApoE (Montecucco y col., 2011, supra). Aunque estos efectos pro-aterogénicos no se entienden por completo, existe evidencia de que los mismos actúan sinérgicamente a varios niveles diferentes. Se ha mostrado que auto-anticuerpos de IgG anti-ApoA-I (i) suprimen los efectos ateroprotectores de la Lipoproteína de Alta Densidad (Batuca y col., 2009, Rheumatology (Oxford) 48:26-31), (ii) propician la inflamación estéril a través del complejo del receptor 2 tipo Toll/CD14 (Pagano y col., 2012, J Intern Med.

1365-2796), (iii) actúan como un factor pro-arritmogénico a través de la activación descendente del receptor mineralocorticoide de canales de calcio tipo L (Rossier y col., 2012, Endocrinology 153:1269- 1278), y (iv) propician la quimiotaxis de neutrófilos (Montecucco y col., 2011, supra). Se han desarrollado procedimientos para el pronóstico/diagnóstico de enfermedades cardiovasculares, los cuales se basan en evaluar la presencia de autoanticuerpos anti-ApoA-I en un sujeto. Sin embargo, estos procedimientos se basan generalmente en la reacción inmunológica entre dichos anticuerpos y la ApoA-I de longitud completa (Dinu y col., 1998, supra; Vuilleumier y col., 2010a, supra; Keller y col., 2012, supra, Montecucco y col., 2011, supra; Batuca y col., 2009, supra). Las principales limitaciones del uso de ApoA-I de longitud completa en tales inmunoensayos para diagnóstico conciernen a los costes para producir grandes cantidades y la inestabilidad de la proteína que hace peligrar la eficacia del ensayo. Se ha demostrado que el encadenamiento de hidrocarburos de péptidos miméticos de apolipoproteínas aumenta su helicidad, resistencia a la proteólisis y mejora su capacidad para promover la salida de colesterol por el transportador ABCA1 (Sviridov y col., 2011, Biochemical and Biophysical Research Communications, 410(3), 446-451; WO 2012/149563). Para resolver el problema de los procedimientos de pronóstico/diagnóstico de la técnica anterior, la presente invención proporciona un nuevo inmunoensayo de diagnóstico a base de péptidos los cuales son menos costosos de producir, más estables, y los cuales se unen específicamente a los auto-anticuerpos anti-ApoA-I de pacientes que padecen enfermedades cardiovasculares. Los procedimientos de la invención son particularmente útiles para elegir la terapia apropiada para las necesidades específicas del paciente, así como para tomar medidas para prevenir el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, evitando los primeros eventos cardiovasculares o eventos cardiovasculares recurrentes en sub-poblaciones de pacientes con alto riesgo cardiovascular.

Breve descripción de la Invención

En un primer aspecto, la presente invención está dirigida a un péptido mimético que consiste en.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit para detectar anticuerpos anti-ApoA-I como biomarcadores para una enfermedad cardiovascular en una muestra de fluido biológico, que comprende al menos un péptido mimético según la invención, o una combinación de los mismos.

En otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para detectar anticuerpos anti-ApoA-I endógenos en una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero;

(b) poner dicha muestra de fluido biológico en contacto con una matriz sólida donde se acopla al menos un péptido mimético de un epítopo de ApoA-1 según la invención, donde dicho péptido mimético consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 15 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 16 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 17 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 19 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 20 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 25, donde dicha variante de péptido mimético es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético excepto que 1,2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia son sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I, donde el contacto es bajo condiciones suficientes para unir un anticuerpo anti-ApoA-I presente en dicha muestra de fluido biológico a dicho al menos un péptido mimético a través de interacciones antígeno-anticuerpo; donde la secuencia de dicho al menos un péptido mimético tiene una reticulación interna entre al menos dos aminoácidos no contiguos; (c) eliminar cualquier anticuerpo no unido de la superficie de dicha matriz sólida;

(d) detectar la presencia de un complejo de antígeno-anticuerpo unido a dicha matriz sólida;

donde la presencia de dicho complejo es indicativa de que la muestra de fluido biológico contiene anticuerpos anti-ApoA- I endógenos.

Otros aspectos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: reacción química para hacer un enlace de bisulfuro dentro de un péptido según la invención en la solución (A), un encadenamiento de hidrocarburos dentro de un péptido según la invención utilizando la síntesis (B) de péptidos en fase sólida a base de Fmoc, o un enlace de lactama dentro de un péptido según la invención en fase sólida (C). “DMSO” es dimetil-sulfóxido, “PyBOP” es hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxotripirrolidinofosfonio, “DIEA” es N,N-Diisopropiletilamina, el “grupo de alloc” es el grupo de aliloxicarbonilo, el “grupo de alilo” tiene la fórmula estructural H²C=CH-CH²-. Junto a los paréntesis, m, k, y l se refieren a las posiciones de los aminoácidos en la secuencia de péptidos.

Figura 2: la fórmula química desarrollada de los ejemplos de reticulación interna dentro de un péptido según la invención: enlace de bisulfuro (A), encadenamiento de hidrocarburos (B), enlace de lactama (C). En (A): k es 3 o 6, R es cualquier cadena lateral de aminoácido; en (B): para una reticulación entre los residuos en las posiciones n y n+4, k es 3, n es 1, * es (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina; para una reticulación entre los residuos en las posiciones n y n+7, k es 6, n es 4, * es (R)-2-(7'-octenil)-Alanina; R es cualquier cadena lateral de aminoácido; en (C): cuando X es -CO-NH-, n es 2, p es 4, k es 3; cuando X es -NH-CO-, n es 4, p es 2, k es 3; R es cualquier cadena lateral de aminoácidos. Junto a los paréntesis, m, k, y l se refieren a las posiciones de los aminoácidos en la secuencia de péptidos.

Figura 3. La espectroscopia CD de los péptidos miméticos F3L1 y F3S2A (F3S2A=F3S2) (A), F3S1B y F4S2B (B), F3L1 y F4L1 (C) muestra el contenido alfa-helicoidal incrementado en comparación con el péptido F3 de control no encadenado.

Figura 4. El ELISA de competencia muestra que el péptido mimético F3L1 compite efectivamente con la ApoA-I intacta para unirse a los anticuerpos anti-ApoA-I. El suero de un paciente que se sabe que da positivo a los anticuerpos anti-ApoA-I se pre-incubó con el péptido mimético F3L1 a las concentraciones indicadas y, a continuación, se agregó a las placas ELISA revestidas con ApoA-I intacta, con las subsecuentes etapas de ensayo llevadas a cabo según el protocolo (A) estándar. Los resultados comparativos de ensayos ELISA de competencia se llevaron a cabo con la ApoA-I como el competidor (B).

Figura 5. El ELISA de competencia muestra que el péptido mimético F3L1 compite eficazmente con la ApoA-I intacta para unirse a anticuerpos anti-ApoA-I. El suero de 3 pacientes que se sabe que dan positivo (+) a anticuerpos anti-ApoA-I, se pre- incubó con el péptido mimético F3L1 (A), F3 (B), o F3 desorganizado (C), a las concentraciones indicadas y, a continuación, se agregó a las placas con ELISA revestidas con ApoA-I intacta, con las subsecuentes etapas de ensayo llevadas a cabo según el protocolo estándar. Los controles con el suero de 3 pacientes que se sabe que dan negativo (-) a los anticuerpos anti-ApoA-I.

Figura 6. El péptido mimético F3L1 inhibe la respuesta pro-inflamatoria relacionada con IgG anti-ApoA-I. Efecto en la producción de TNF-alfa por los macrófagos inducidos por IgG anti-ApoA-I (A) o por un depósito de IgG de pacientes positivos a los anticuerpos anti-ApoA-I (B).

Figura 7. El péptido mimético F3L1 inhibe la respuesta cronotrópica relacionada con IgG anti-ApoA-I.

Figura 8. Identificación del epítopo ApoA-I utilizando digestión en los residuos de lisina (K). Inmuno-reactividad de auto-anticuerpos del suero de pacientes positivos (A) y negativos (B) contra péptidos presentes en cada fracción recolectada.

Figura 9. Identificación del epítopo ApoA-I utilizando digestión en residuos de arginina (R). Inmuno-reactividad de autoanticuerpos del suero de pacientes positivos (A) y negativos (B) contra péptidos presentes en cada fracción recolectada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La “apolipoproteína A-1”, también referida en la presente como “ApoA-I” y “ApoA-1”, es una proteína que se codifica, en humanos, por el gen APOA1. En humanos, la ApoA-I es una proteína de 28 kDa (número de acceso Uniprot P02647). La APO-A1 humana madura comprende 243 aminoácidos (SEQ ID NO: 1). La proteína ApoA-I tiene un rol específico en metabolismo de lípidos. La apolipoproteína A-I es el principal componente de la proteína de lipoproteína de alta densidad (HDL) en plasma. La proteína promueve el eflujo de colesterol de tejidos al hígado para su excreción. Es un cofactor para colesterolaciltransferasa de lecitina (LCAT) que es responsable de la formación de la mayoría de colesteril-ésteres en plasma. La ApoA-I también se aisló como un factor estabilizante de prostaciclina (PGI2), y por consiguiente puede tener un efecto anticoagulante. Los defectos en el gen que codifica la misma están asociados con las deficiencias de HDL, incluyendo la enfermedad de Tangier, y con amiloidosis no neuropática sistémica. La ApoA-I es una proteína adaptativamente flexible y dinámica, capaz de intercambiarse entre al menos dos conformaciones sorprendentemente diferentes: conformaciones asociadas con lípidos y libres de lípidos. Los estudios estructurales de la forma intacta libre de lípidos de la Apolipoproteína A-1 indican la presencia de seis hélices alfa como sigue: Hélice A de Arginina en la posición 10 a Glicina en la posición 39 de la SEQ ID NO: 1, Hélice B de Asparagina en la posición 48 a Glutamina en la posición 84 de la SEQ ID NO: 1; Hélice C de Lisina en la posición 94 a Ácido glutámico en la posición 136 de la SEQ ID NO: 1, Hélice D del Ácido glutámico en la posición 146 a Alanina en la posición 187 de la SEQ ID NO: 1; Hélice E de Alanina en la posición 196 a Ácido glutámico en la posición 212 de la SEQ ID NO: 1; Hélice F de Prolina en la posición 220 a Glutamina en la posición 243 de la SEQ ID NO: 1.

Los términos “péptido mimético de un epítopo” denominado también “mimotopo”, que se utiliza en esta invención se refiere a un péptido que imita a un epítopo de una proteína diana. Dicho péptido mimético es suficientemente similar a un epítopo natural de la proteína objetivo en la que la misma se puede reconocer por un anticuerpo específico para el epítopo natural (y, por consiguiente, posee propiedades antigénicas) y, posiblemente, también inducen una respuesta inmunológica específica para el epítopo natural (y, por consiguiente posee propiedades inmunogenizadoras). Más específicamente, los términos “péptido mimético de un epítopo de ApoA-I” se refiere a un péptido que imita a una determinante antígena de la Apolipoproteína Apo A-I y que, por lo tanto, es reconocida por un anticuerpo que se une específicamente a la Apolipoproteína A-I, también denominada un anticuerpo de ApoA-I.

El término “epítopo”, también denominado en esta invención “epítopo” o “determinante antigénica”, es la parte d e un Antígeno que es reconocido por el sistema inmune, específicamente por anticuerpos, células B, o células T.

“Antigenicidad” se refiere a las propiedades antígenas de un epítopo y corresponde a la capacidad del epítopo para combinar con los productos finales de la respuesta inmune tal como los anticuerpos secretados y/o receptores superficiales en las células T. La “ inmunogenicidad” se refiere a las propiedades inmunogénicas de un epítopo y corresponde a la capacidad del epítopo para inducir una respuesta inmune humoral y/o mediada con células. Aunque todos los epítopos que tienen la propiedad de inmunogenicidad también tienen la propiedad de antigenicidad, lo contrario no es verdad.

La expresión “dos aminoácidos no contiguos”, aplicada a una secuencia de aminoácidos, en la presente designa dos aminoácidos que no son contiguos, es decir no adyacentes entre sí, en la estructura primaria del péptido que tiene dicha secuencia de aminoácidos.

El término “anticuerpo ApoA-I” o “anticuerpo anti-ApoA-I” que se utiliza en esta invención se refiere a cualquier anticuerpo o forma variante del mismo, que incluye pero no está limitado a, fragmento de anticuerpo, anticuerpo de dominio o anticuerpo de una sola cadena capaz de unirse selectivamente a una proteína de ApoA-I, por ejemplo la forma libre de lípidos de ApoA-I, o fragmento del mismo. En particular, los anticuerpos ApoA-I incluyen un anticuerpo ApoA-I capaz de unirse a los epítopos de ApoA-I mamífera notablemente humana, en particular la ApoA-I de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, o en particular cualquier epítopo localizado dentro de una región que consiste en cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 23. Un anticuerpo ApoA-I incluye anticuerpos murinos, quiméricos, humanizados o completamente humanos, genéticamente diseñados o anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos así como fragmentos de los mismos tales como anticuerpos de cadena sencilla (scFv) o anticuerpos de dominio contra la proteína de ApoA-I o fragmento de la misma y similares. Los anticuerpos anti-ApoA-I pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales, o fragmentos o derivados de los mismos que tienen sustancialmente la misma especificidad de antígeno. En particular, los anticuerpos anti-ApoA-I pueden ser auto-anticuerpos (también denominados anticuerpos endógenos) producidos en pacientes con alto riesgo cardiovascular, en particular en poblaciones de pacientes tales como los que padecen dolor de pecho agudo, síndrome coronario agudo, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, estenosis carotídea severa, enfermedad renal terminal y periodontitis. El término “selectivamente” indica que los anticuerpos preferencialmente reconocen y/o se unen al polipéptido o epítopo diana, es decir con una afinidad mayor a la de cualquier otro antígeno o epítopo, es decir la unión al polipéptido diana se puede diferenciar de una unión no específica a otros antígenos. La afinidad de unión de un anticuerpo se puede determinar fácilmente por alguien de experiencia ordinaria en la técnica, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard (Scatchard y col., 1949, Ann. N.Y. Acad.1949. 51, 660-672).

El término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a un portador comprendido de un material que no es biológicamente deseable ni de ningún otro modo deseable.

El término “portador” se refiere a cualquier componente presente en una formulación farmacéutica distinta al agente activo y que, por consiguiente, incluye diluyentes, aglutinantes, lubricantes, desintegradores, agentes de relleno, agentes de coloración, agentes de humectación o emulsión, agentes amortiguadores de pH, conservadores y similares.

Como se utiliza en esta invención, “tratamiento” y “tratar” y similares generalmente significan que se obtiene un efecto farmacológico y fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir o prevenir parcialmente una enfermedad, síntoma o condición del mismo y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de una enfermedad, condición, síntoma o efecto adverso atribuido a la enfermedad. El término “tratamiento” que se utiliza en esta invención cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un humano, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad se presente en un sujeto que pueda tener predisposición a la enfermedad aunque aún no haya sido diagnosticada que tiene la misma por ejemplo debido a su historial familiar; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o aliviar la enfermedad, es decir, causando la regresión de la enfermedad y/o sus síntomas o condiciones tales como la mejora o alivio del daño.

En particular, el tratamiento de enfermedades cardiovasculares comprende prevenir, disminuir o incluso erradicar los síntomas de las enfermedades por ejemplo disminuyendo la prevalencia e incidencia de accidente por infarto de miocardio o enfermedad de las arterias periféricas en la población general (prevención primaria) o en pacientes que ya han padecido tales eventos (prevención secundaria).

Los términos “enfermedades cardiovasculares” en la presente se definen como enfermedades o padecimientos que afectan al corazón o a los vasos sanguíneos. Los ejemplos no limitativos de enfermedades o padecimientos cardiovasculares incluyen en su mayoría la manifestación aguda y crónica de arteriosclerosis tales como síndromes coronarios agudos, accidente cerebrovascular, ataques isquémicos transitorios, arritmia, insuficiencia cardiaca, y enfermedad de las arterias periféricas.

Los términos “riesgo de enfermedad cardiovascular” o “riesgo cardiovascular” se definen en la presente como la probabilidad de desarrollar una enfermedad cardiovascular en sujetos que aún no han desarrollado una enfermedad aterosclerótica mayor. Esta probabilidad se evalúa típicamente en base a la observación de diferentes factores tradicionales de riesgo cardiovascular, tales como el género, edad, historial familiar, uso de tabaco, diabetes, presión sanguínea elevada (hipertensión), colesterol elevado (dislipidemia), obesidad, inactividad física, y dietas poco saludables, también conocidos como tablas de puntuación de riesgo tales como la puntuación de riesgo Framingham (D'Agostino y col., 2008, Circulation 117:743-53). Un sujeto es elegible cuando tiene un “alto riesgo cardiovascular” cuando el riesgo en 10 años de desarrollar una enfermedad cardiovascular es mayor del 10 % en base a la puntuación de riesgo Framingham global de 10 años (D'Agostino y col., 2008, Circulation 117:743-53).

El término “sujeto” que se utiliza en esta invención se refiere a mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos contemplados por la presente invención incluyen humanos, primates, animales domesticados tales como ganado, ovejas, cerdos, caballos, roedores de laboratorio y similares.

La expresión “muestra de fluido biológico” se refiere a una muestra de fluido clínica para analizar cuál se toma de un fluido corporal de un mamífero tal como saliva, sangre y orina. Por ejemplo, una muestra de fluido biológico es una muestra de suero de un sujeto humano.

La expresión “muestra de control” se refiere a una muestra de control positivo o de control negativo. Una muestra de control negativo incluye una muestra de fluido corporal tomada de un sujeto que es de la misma especie o especie homóloga a la del sujeto que se va a evaluar para los auto-anticuerpos anti-ApoA-I y se sabe que tiene un estado biológico normal, por ejemplo sin auto-anticuerpos detectables contra ApoA-I o una solución que no contiene anticuerpos que son inmuno-reactivos con ApoA-I. Una muestra de control positiva incluye una muestra de fluido corporal tomada de un sujeto que es de la misma especie homóloga o especie homóloga cuando se examinan los auto-anticuerpos del sujeto y se sabe que tiene auto-anticuerpos detectables contra ApoA-I o una solución que no contiene anticuerpos que son inmuno-reactivos con ApoA-I.

El término “variante”, aplicado a un péptido o polipéptido, como se menciona en esta invención significa un péptido o polipéptido sustancialmente homólogo a la secuencia de péptidos de referencia, aunque tiene una secuencia de aminoácidos diferente a la de la secuencia de referencia debido a una o más de una eliminación, inserción y/o sustitución de aminoácidos. Sustancialmente homólogo significa una secuencia de aminoácidos variante que es idéntica a la secuencia de péptidos de referencia excepto por la eliminación, inserción y/o sustitución de 1, 2, 3, 4, 5, o 6 residuos de aminoácidos. La identidad de dos secuencias de aminoácidos se puede determinar mediante inspección visual y/o cálculo matemático, o más fácilmente comparando la información de secuencia utilizando un programa informático conocido utilizado para la comparación de secuencias tales como el paquete Clustal versión 1.83. Una variante puede comprender una secuencia que tiene al menos un aminoácido conservativamente sustituido, lo que significa que un residuo de aminoácido dado es remplazado por un residuo que tiene características fisicoquímicas similares. Generalmente, deberán hacerse sustituciones para uno o más aminoácidos presentes en el polipéptido original de manera conservativa. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu, o Ala por otro, o sustituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Otras de tales sustituciones conservativas, por ejemplo, las sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares, son bien conocidas (Kyte, y col., 1982, J. Mol. Biol., 157: 105-131). Por ejemplo, una “sustitución de aminoácido conservativa” puede involucrar una sustitución de un residuo de aminoácido natural con un residuo no natural de tal modo que tenga poco o ningún efecto en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Se pueden determinar sustituciones de aminoácidos deseadas (ya sea conservativas o no conservativas) por aquellos expertos en la técnica en el momento que se deseen tales sustituciones. Las sustituciones de aminoácidos ejemplares se presentan

En la Tabla 1 más adelante. El término “variante” incluye también un péptido o polipéptido sustancialmente homólogo a la secuencia de péptidos de referencia, aunque tenga una secuencia de aminoácidos diferente a la de la secuencia de referencia debido a que uno o más aminoácidos se han modificado químicamente o sustituido por análogos de aminoácidos. Por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, o 6 aminoácidos se han modificado químicamente. La modificación química de uno o más residuos de aminoácidos incluye modificaciones para establecer un encadenamiento de hidrocarburos tal como modificando químicamente cualquier residuo de la secuencia en (S)-2-(4'-pentenil)-alanina o (R)-2-(7'-octenil)-alanina. Por consiguiente, una variante que se define en la presente incluye también la secuencia de péptidos de referencia donde uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia se han sustituido con (S)-2-(4'-pentenil)-alanina o (R)-2-(7'-octenil)-alanina para establecer un encadenamiento de hidrocarburos.

Tabla 1

Las variantes cubren también péptidos miméticos según la invención que contienen residuos a,a-dialquilados tales como ácido 2-aminoisobutírico para estabilizar estructuras alfa-helicoidales. Las posiciones preferidas para agregar residuos a,a-dialquilados que tienen que ver con posiciones de residuos que no tienen tendencia distinta e intrínseca a la formación de hélices, tales como Prolina, Glicina o Valina, esta última tiene tendencia intrínseca a estabilizar la estructura de la hoja. (R)-2-(7'-octenil)-Alanina y (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina que se pueden utilizar para generar el encadenamiento de hidrocarburos descritos en la presente pertenecen también a esta familia de compuestos. Tales residuos se pueden incorporar también en las posiciones que son propensas a la escisión proteolítica del péptido si hay alguna aplicación terapéutica para dicho péptido. Los ejemplos de posiciones donde se pueden agregar residuos a,a-dialquilados en la secuencia de aminoácidos de ApoA-I incluyen aquéllos en la región de la hélice F tal como la Prolina en la posición 229, Valina en la posición 220, enilalanina en la posición 221, Lisina en la posición 225,Valina en la posición 226 o Fenilalanina en la posición 228, las posiciones que se refieren a la secuencia de aminoácidos de ApoA-I madura SEQ ID NO: 1.

El término “matriz sólida” incluye cualquier soporte de fase sólida para llevar a cabo un inmunoensayo o un procedimiento según la invención. La misma incluye perlas, micropartículas, nanopartículas, tubos, telas o placas, películas, láminas, cavidades, formadas de o revestidas con vidrio, poliestireno, polipropileno, nitrocelulosa, cuarzo, cerámica, dextrano u otros materiales. Por ejemplo, la matriz sólida está en una forma de cavidades para microtitulación, tal como una placa para microtitulación de 96 cavidades.

El término “kit” comprende al menos un péptido mimético según la invención, o una variante del mismo, o una combinación del mismo, como se describe en esta invención que se acopla o ya está acoplado a una matriz sólida y opcionalmente material de instrucciones.

El término “eficacia” de un tratamiento o procedimiento según la invención se puede medir en base a los cambios en el transcurso de la enfermedad o condición en respuesta al uso o a un procedimiento según la invención. Por ejemplo, la eficacia de un tratamiento o procedimiento según la invención se puede medir por su impacto en i) diferentes puntos finales clínicos relevantes (por ejemplo: mortalidad en total, mortalidad relacionada con enfermedades cardiovasculares, síndrome coronario agudo o recaída por apoplejía, hospitalización...), y/o en ii) criterios indirectos de valoración tales como el impacto de los compuestos terapéuticos en diferentes animales o en sistemas in vitro. El término “cantidad efectiva” que se utiliza en esta invención se refiere a una cantidad de al menos un péptido mimético según la invención, o una formulación farmacéutica del mismo, que suscita una reducción detectable de los síntomas de la enfermedad cardiovascular en un sujeto al que se está administrando dicho péptido mimético, estos síntomas pueden incluir, por ejemplo, mortalidad en total, mortalidad relacionada con enfermedades cardiovasculares, síndrome coronario agudo o recaída por apoplejía, hospitalización relacionada con CV.

Péptidos miméticos de los epítopos de ApoA-I

Según un aspecto de la invención se refiere a péptidos de la invención que imitan al(los) epítopo(s) de la confirmación de Apolipoproteína A-I libre de lípidos y que son capaces de unirse específicamente a los auto-anticuerpos anti-ApoA-I de pacientes que padecen enfermedades o padecimientos cardiovasculares.

En un primer aspecto, el péptido mimético tiene una reticulación interna.

En otra realización particular, la secuencia de aminoácidos del péptido mimético según la invención consiste en la SEQ ID NO: 19

En otra realización, el péptido útil en un procedimiento según la invención tiene una secuencia de aminoácidos que se menciona anteriormente excepto que 1,2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia son sustituidos, eliminados, y/o insertados sin anular la capacidad de dicho péptido mimético de unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I.

En una realización particular de la invención, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia son sustituidos por residuos de aminoácidos adecuados para establecer la reticulación interna, tal como el residuo de Ácido glutámico (E) y/o un residuo de Lisina (K) para establecer un enlace de lactama o tal como el(los) residuo(s) de Cisteína (C) para establecer un enlace de disulfuro.

Opcionalmente, 2, 4, o 6 aminoácidos contenidos en la secuencia de aminoácidos del péptido mimético de la invención se modifican químicamente para establecer la reticulación interna, sin anular la capacidad de dicho péptido mimético de unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I. Por ejemplo, en una realización particular, al menos dos, por ejemplo 2 o 4, residuos de aminoácidos tales como Fenilalanina (F), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V), Lisina (K), y Tirosina (Y), contenidos dentro de la secuencia de aminoácidos del péptido según la invención son sustituidos en residuos de alanina y dichos residuos de alanina son modificados químicamente en (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina o (R)-2-(7'-octenil)-Alanina para establecer un encadenamiento de hidrocarburos entre dos de los residuos de Alanina modificados químicamente.

En otra realización, los extremos N-terminal y/o C-terminal del péptido mimético de la invención se modifican además para eliminar la posible carga eléctrica del amino libre y/o carboxi terminal, respectivamente. En una realización particular, el grupo de amino libre en el extremo N-terminal de dicho péptido se anexa covalentemente a un grupo de acilo (tal como acetilo, propionilo, palmitoilo, etc.). En otra realización, se amida el grupo de carboxi libre en el extremo C- terminal de dicho péptido. En una realización adicional, se modifican los extremos tanto N-terminal como C-terminal del péptido mimético, en particular el grupo de amino libre en el extremo N-terminal de dicho péptido se une covalentemente a un grupo de acilo (tal como acetilo, propionilo, palmitoilo, etc.) y se amida el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal de dicho péptido.

En una realización adicional de la invención, la reticulación interna entre 2 aminoácidos no contiguos contenidos en la secuencia de aminoácidos del péptido mimético mencionado anteriormente se lleva a cabo a través de un enlace covalente tal como un enlace de lactama, encadenamiento de hidrocarburos, enlace de disulfuro, o cualquier otro enlace rígido entre dichos 2 residuos de aminoácidos no contiguos tales como los producidos por la estabilización de la sustitución del enlace de hidrógeno de cadena principal (Chapman y col., J Am Chem Soc, 2004, 126: 12252-12253) o los representados en las figuras 1 y 2.

En una realización de la invención, los residuos de aminoácidos del péptido que son reticulados están ubicados en la posición n y n+3, n+4, n+5, n+6, n+7, n+8, n+9, n+10, n+11, respectivamente. Se entiende que las posiciones se refieren a la secuencia de aminoácidos primaria del péptido, es decir las respectivas posiciones de los residuos de aminoácidos en la estructura primaria del péptido, y que “n” indica la posición de uno del residuo de aminoácido, “n+3” indica que el otro residuo de aminoácido está ubicado 3 aminoácidos delante de la posición n en la secuencia de aminoácidos del péptido, “n+4” indica que el otro residuo de aminoácido está ubicado 4 aminoácidos delante de la posición n en la secuencia de aminoácidos del péptido, “n+5” indica que el otro residuo de aminoácido está ubicado 5 aminoácidos delante de la posición n en la secuencia de aminoácidos del péptido, etc.

En una realización particular de la invención, se establece un enlace de disulfuro entre un residuo de Cisteína (C) en la posición n dentro de la secuencia de péptidos y otro residuo de Cisteína (C) en la posición n+3 de dicha secuencia de péptidos. La reacción química para hacer un enlace de disulfuro dentro de un péptido en la solución se representa en la figura 1A. El puente de disulfuro dentro de un péptido se representa en la figura 2A.

En otra realización particular de la invención, se establece un encadenamiento de hidrocarburos entre la Alanina (A) modificada químicamente en la posición n dentro de la secuencia de péptidos y otra Alanina (A) modificada químicamente en la posición n+4, o n+7, de dicha secuencia de péptidos. En particular, el encadenamiento de hidrocarburos se establece entre los residuos de Alanina modificados que incluyen aminoácidos a-disustituidos tales como el ácido 2-aminoisobutírico, (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina y (R)-2-(7'-octenil)-Alanina. En una realización adicional, la reticulación interna es un encadenamiento de hidrocarburos entre una (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina y una (R)-2-(7'-octenil)-Alanina. En otra realización, la reticulación interna es un encadenamiento de hidrocarburos entre dos (S)-2-(4'-pentenil)-Alaninas. En una realización alternativa, se establece un encadenamiento de hidrocarburos entre la Alanina (A) químicamente modificada en la posición n dentro de la secuencia de péptidos y otra Alanina (A) químicamente modificada en la posición n+3, de dicha secuencia de péptidos.

La reacción química para hacer un encadenamiento de hidrocarburos dentro de un péptido utilizando síntesis de péptidos de fase sólida a base de Fmoc se representa en la figura 1B. El encadenamiento de hidrocarburos dentro de un péptido se representa en la figura 2B.

Los ejemplos de encadenamientos de hidrocarburos útiles en la invención incluyen los representados en la figura 2B. Por ejemplo un encadenamiento de hidrocarburos puede unir dos aminoácidos Xaa en las posiciones n y n+7, donde Xaa en la posición n es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH- C(CH3)(R)-C(O)- donde R es un encadenamiento de hidrocarburos -(CH2)6-CH=CH-(CH2)3- unido a una subsecuente Xaa en la posición n+7, y donde Xaa en la posición n+7 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R')-C(O)- donde R' es un enlace simple unido al encadenamiento de hidrocarburos de Xaa en la posición n que se define anteriormente. Como otro ejemplo, un encadenamiento de hidrocarburos se puede unir a dos aminoácidos Xaa en las posiciones n y n+4, donde Xaa en la posición n es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R)-C(O)- donde R es un encadenamiento de hidrocarburos -(CH2)6-CH=CH-(CH2)3- unido a una subsecuente Xaa en la posición n+4, y donde Xaa en la posición n+4 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R')-C(O)- donde R' es un enlace simple unido al encadenamiento de hidrocarburos de Xaa en la posición n que se define anteriormente.

En una realización particular de la invención, se establece un enlace de lactama entre un residuo de Ácido glutámico (E) en la posición n dentro de la secuencia de péptidos y un residuo de Lisina (K) en la posición n+4 o n+7, preferiblemente en la posición n+4, de dicha secuencia de péptidos.

En otra realización, se establece un enlace de lactama entre un residuo de Lisina (K) en la posición n dentro de la secuencia de péptidos y un residuo de Ácido glutámico (E) en la posición n+4 o n+7, preferiblemente en la posición n+4, de dicha secuencia de péptidos.

La reacción química para hacer un enlace de lactama dentro de un péptido en fase sólida se representa en la figura 1C. El enlace de lactama dentro de un péptido se representa en la figura 2C.

Los ejemplos de enlaces de lactama útiles en la invención incluyen los representados en la figura 2C. Por ejemplo, un enlace de Lactama formado entre dos aminoácidos Xaa en las posiciones n y n+4 en la secuencia de péptidos, donde Xaa en la posición n es un aminoácido modificado de la fórmula (I): -NH-C(H)(R)-C(O)- donde R es un enlace de lactama -(CH2)2-CO-NH-(CH2)4- unido a un subsecuente residuo en la posición n+4, y donde Xaa en la posición n+4 es un aminoácido modificado de la fórmula (I):-NH-C(H)(R')-C(O)- donde R' es un enlace simple unido al enlace de lactama de Xaa en la posición n que se define anteriormente. Otro ejemplo es un enlace de lactama formado entre dos aminoácidos Xaa en las posiciones en n y n+4 en la secuencia de péptidos, donde Xaa en la posición n es un aminoácido modificado de la fórmula (I): -NH-C(H)(R)-C(O)- donde R es un enlace de lactama -(CH2)4-NH-CO-(CH2)2- unido a una subsecuente Xaa en la posición n+4, y donde Xaa en la posición n+4 es un aminoácido modificado de la fórmula (I): -NH-C(CH)(R')-C(O)- donde R' es un enlace simple unido al enlace de lactama de Xaa en la posición n que se define anteriormente.

Ejemplos de péptidos miméticos útiles en un procedimiento según la invención se representan en la Tabla 2 más adelante, donde se realiza una reticulación interna ya sea a través de un enlace de lactama entre los residuos de Ácido glutámico (E) y Lisina (K) subrayados o a través de un encadenamiento de hidrocarburos entre R8 y S⁵donde R8 corresponde (R)-2-(7'-octenil)-Alanina y S⁵corresponde a (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina.

Tabla 2. Ejemplos de péptidos miméticos útiles en un procedimiento según la invención y su secuencia de aminoácidos. R8 corresponde a (R)-2-(7'-octenil)-Alanina y S⁵corresponde a (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina que se conectan en un encadenamiento de hidrocarburos según la figura 2B. Los E y K subrayados son los aminoácidos conectados en un enlace de lactama según la figura 2C. Opcionalmente, los péptidos según la invención tienen el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado.

En una realización particular, la secuencia de aminoácidos del péptido mimético útil en un procedimiento según la invención que consiste en la SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9; o una variante de las mismas donde dicha variante es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético, excepto que 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia son sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I .

En una realización particular, la secuencia de aminoácidos del péptido mimético útil en un procedimiento según la invención que consiste en la SEQ ID NO: 25; o una variante de la misma donde dicha variante es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético, excepto que 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia son sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I útil en un procedimiento.

En otra realización particular la secuencia de aminoácidos del péptido mimético útil en un procedimiento según la invención que consiste en la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, o SEQ ID NO: 20; o una variante de las mismas donde dicha variante es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético, excepto que 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia son sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I.

En otra realización, el péptido mimético útil en un procedimiento según la invención que consiste en la SEQ ID NO: 15 con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y/o el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado, más particularmente con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado.

En otra realización, el péptido mimético útil en un procedimiento según la invención que consiste en la SEQ ID NO: 16 con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y/o el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado, más particularmente con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado.

En otra realización, el péptido mimético útil en un procedimiento según la invención que consiste en la SEQ ID NO: 17 con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y/o el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado, más particularmente con el grupo de amino libre en el extremo N- terminal acetilado y el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado.

En otra realización, el péptido mimético útil en un procedimiento según la invención que consiste en la SEQ ID NO: 19 con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y/o el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado, más particularmente con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado.

En otra realización, el péptido mimético útil en un procedimiento según la invención que consiste en la SEQ ID NO: 20 con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y/o el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado, más particularmente con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado.

En una realización particular adicional, la secuencia de aminoácidos del péptido mimético útil en un procedimiento según la invención tiene:

(i) una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 19 con un enlace de lactama de la Fig. 2C que se une a E en la posición 19 y K en la posición 23;

(ii) una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 15 con un encadenamiento de hidrocarburos de la Fig. 2B que se une a (R)-2-(7'-octenil)-Alanina en la posición 16 y (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 23; (iii) una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 16 con un encadenamiento de hidrocarburos de la Fig. 2B que se une a (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 13 y (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 17;

(iv) una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 17 con un encadenamiento de hidrocarburos de la Fig. 2B que se une a (R)-2-(7'-octenil)-Alanina en la posición 9 y (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 16.

En aún otra realización particular, la secuencia de aminoácidos del péptido mimético según la invención consiste en cualquiera de:

(i) SEQ ID NO: 19 con un enlace de lactama de la Fig. 2C que se une a E en la posición 19 y K en la posición 23; (ii) SEQ ID NO: 15 con un encadenamiento de hidrocarburos de la Fig. 2B que se une a (R)-2-(7'-octenil)-Alanina en la posición 16 y (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 23;

(iii) s Eq ID NO: 16 con un encadenamiento de hidrocarburos de la Fig. 2B que se une a (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 13 y (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 17;

(iv) SEQ ID NO: 17 con un encadenamiento de hidrocarburos de la Fig. 2B que se une a (R)-2-(7'-octenil)-Alanina en la posición 9 y (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 16.

En una realización particular adicional, la secuencia de aminoácidos del péptido mimético útil en un procedimiento según la invención que consiste en cualquiera de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; o una variante de las mismas, donde dicha variante es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético, excepto que 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia están sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I.

En otra realización, los extremos N-terminal y/o C-terminal del péptido mimético de la invención se modifican además para eliminar la posible carga eléctrica del amino libre y/o carboxi terminal, respectivamente. En una realización particular, el grupo de amino libre en el extremo N-terminal de dicho péptido se anexa covalentemente a un grupo de acilo (tal como acetilo, propionilo, palmitoilo, etc.). En otra realización, se amida el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal de dicho péptido. En una realización adicional, se modifican los extremos tanto N-terminal como C-terminal, en particular el grupo de amino libre en el extremo N-terminal de dicho péptido se une covalentemente a un grupo de acilo (tal como acetilo, propionilo, palmitoilo, etc.) y se amida el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal de dicho péptido.

En una realización particular, un péptido mimético útil en un procedimiento según la invención consiste en la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 25.

En otra realización particular, el péptido mimético según la invención que consiste en la SEQ ID NO: 8, o una variante de la misma, con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y/o el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado, más particularmente con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado, donde dicha variante de péptido mimético es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético excepto que 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia están sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I.

En otra realización particular, el péptido mimético útil en un procedimiento según la invención que consiste en la SEQ ID NO: 9, o una variante de la misma, con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y/o el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado, más particularmente con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado, donde dicha variante de péptido mimético es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético excepto que 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia están sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I.

En otra realización particular, el péptido mimético útil en un procedimiento según la invención consiste en la SEQ ID NO: 25, o una variante de la misma, con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y/o el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado, más particularmente, con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado, donde dicha variante de péptido mimético es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético excepto que 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia están sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I.

Polinucleótidos que codifican los péptidos miméticos según la invención

Otro aspecto descrito en esta invención se refiere a polinucleótidos aislados que codifican los péptidos miméticos.

En una realización particular, los polinucleótidos aislados codifican los péptidos miméticos donde la reticulación interna es un enlace de disulfuro entre dos residuos de Cisteína no contiguos de la secuencia de aminoácidos de dichos péptidos miméticos.

Producción y purificación de los péptidos según la invención

Otro aspecto descrito en esta invención se refiere a un vector recombinante que comprende un polinucleótido.

Se pueden utilizar numerosos sistemas de expresión, incluyendo sin limitación cromosomas, episomas, y virus derivados. Más particularmente, los vectores recombinantes utilizados se pueden derivar de plásmidos bacterianos, transposones, episomas de levaduras, elementos de inserción, elementos de cromosomas de levaduras, virus tales como baculovirus, virus de papiloma tales como SV40, virus de vaccinia, adenovirus, virus de viruela, virus de pseudorabias, retrovirus. Estos vectores recombinantes pueden ser igualmente cósmidos o derivados de fagémidos. La secuencia de nucleótidos se puede insertar en el vector de expresión recombinante mediante procedimientos bien conocidos para una persona experta en la técnica tales como, por ejemplo, los que se describen en MOLECULAR CLONING: A LABORATORY m An UAL, Sambrook y col., 4a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001.

El vector recombinante puede incluir secuencias de nucleótidos que controlan la regulación de la expresión de polinucleótidos así como secuencias de nucleótidos que permiten la expresión y la transcripción de un polinucleótido de la invención y la traducción de un polipéptido de la invención, estas secuencias se seleccionan según las células huésped que se utilizan.

Por consiguiente, por ejemplo, una señal de secreción apropiada se puede integrar en el vector recombinante de modo que el polipéptido, codificado por el polinucleótido de la invención, se dirija al lumen del retículo endoplásmico, al espacio periplásmico, en la membrana o al ambiente extracelular. La elección de una señal de secreción apropiada puede facilitar la subsecuente purificación de proteína.

En una realización adicional, se proporciona una célula huésped que comprende un vector recombinante según la invención.

La introducción del vector recombinante en una célula huésped se puede llevar a cabo según los procedimientos que son bien conocidos para una persona experta en la técnica, tal como los descritos en BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis y col., 2a ed., McGraw-Hill Professional Publishing,1995, y MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, supra, tal como la transfección mediante fosfato de calcio, transfección mediante dextrano de DEAE, transfección mediante microinyección, transfección mediante lípidos catiónicos, electroporación, transducción o infección.

La célula huésped puede ser, por ejemplo, células bacterianas tales como E. coli, células de hongos tales como células de levaduras y células de Aspergillus, Streptomyces, células de insectos, células de Ovario de Hámster Chino (CHO), línea de células de ratón C127, línea de células BHK de células de hámster sirio, células de Riñón Embrionario Humano 293 (HEK 293).

Las células huésped pueden usarse, por ejemplo, para expresar un péptido mimético de la invención. Después de la purificación por procedimientos estándar, el péptido de la invención se puede usar en un procedimiento descrito a continuación.

Cuando la reticulación interna de dos residuos de aminoácidos no contiguos del péptido según la invención se lleva a cabo a través de la incorporación del enlace de lactama o a través de la formación del encadenamiento de hidrocarburos, y el péptido se produce a través de tecnología recombinante como en el procedimiento descrito anteriormente, la preparación del péptido mimético según la invención puede requerir una etapa adicional mediante la cual dicha reticulación interna del péptido se lleva a cabo como se describe en la presente.

Alternativamente, el péptido mimético según la invención se puede preparar mediante procedimientos de química sintética, tal como la síntesis del péptido de fase sólida. La purificación de esos péptidos puede llevarse a cabo por medio de cualquier técnica conocida en la técnica para la purificación de proteínas/péptidos. Las técnicas ejemplares incluyen cromatografía de intercambio iónico de interacción hidrófoba, y procedimientos de inmunoafinidad.

La reticulación interna del péptido según la invención se puede llevar a cabo a través de la formación del enlace de lactama entre residuos de Ácido glutámico y Lisina del péptido utilizando protecciones ortogonales (O-Fm y Fmoc) cuando se trabaja en química Boc y la formación del enlace de lactama en la resina después de la escisión mediada con base de piperidina al 20 % de los grupos protectores de éster de fluorenilmetilo/carbamato durante 1 h. Cuando se trabaja en química Fmoc, las protecciones ortogonales son por ejemplo O-alilo y Aloc y se escinden en la resina un exceso triple de tetrakis(trifenilfosfin)paladio(O) en CHCl3/AcOH/NMM durante 2 h. La ciclización de lactama peptídica se puede llevar a cabo con 3 eq. de Pyclock y 9 eq. de DIEA durante 2 días y monitorearse por medio del análisis de ninhidrina Kaiser (Kaiser y col., 1970, Anal Biochem 34:595-598).

En otra realización, la reticulación interna del péptido según la invención se lleva a cabo a través de la formación del encadenamiento de hidrocarburos utilizando la metátesis de cierre del círculo (RCM) de los péptidos, en la cual se han incorporado dos aminoácidos de a-metilo, a-alquenilo durante la extensión de cadena en la síntesis del péptido de fase sólida. La RCM se realiza en péptidos protegidos con Fmoc en resina de amida MBHA-Rink con Rutenio (II) (oisopropoxifenilmetileno) (triciclohexilfosfina) de dicloro como el catalizador, como se describe en Kim y col., 2011 (Nat Protoc 6: 761-771). La desprotección final (y acetilación) y subsecuente escisión del péptido mimético según la invención de la resina se puede realizar utilizando el protocolo descrito en la sección de ejemplo.

Composiciones y kits según la invención

Según un aspecto adicional, la invención se refiere a un kit útil para llevar a cabo un procedimiento según la invención.

El kit según la invención comprende el péptido mimético para acoplar, o ya acoplado a una matriz sólida como un soporte de fase sólida que se menciona en esta invención.

Se pueden utilizar varias matrices sólidas, incluidas pero no limitadas a vidrio, poliestireno, polipropileno, nitrocelulosa, cuarzo, cerámica, dextrano u otros materiales. Las formas adecuadas de la matriz sólida incluyen perlas, micropartículas, nanopartículas, tubos, telas o placas, películas, láminas, cavidades, formadas de o revestidas con estos materiales. Típicamente, la matriz sólida comprende cavidades de microtitulación, tal como una placa de microtitulación de 96 cavidades.

El acoplamiento, o fijación, de los péptidos miméticos según la invención a la matriz sólida en un kit según la invención puede llevarse a cabo mediante adsorción o acoplamiento químico a un soporte de fase sólida. Se puede utilizar cualquier medio conocido en la técnica para inmovilizar una proteína o péptido a un soporte sólido. Los péptidos según la invención se pueden unir de manera ya sea covalente o no covalente a la matriz sólida mediante técnicas tales como unión covalente a través de un enlace de amida o éster o adsorción. Los péptidos se pueden unir utilizando pares de enlace tales como biotina y avidina o anticuerpo y antígeno. Después de que los péptidos se fijan a la matriz sólida, la matriz sólida se puede incubar con una solución bloqueadora (que contiene una proteína bloqueadora tal como albúmina de suero bovino) para reducir la adsorción no específica de anticuerpos en una muestra de prueba a la superficie del soporte. Según un aspecto, los péptidos miméticos según la invención se pueden sintetizar directamente en la matriz sólida del kit de la invención.

Según una realización, cuando el kit comprende un péptido mimético para acoplar a una matriz sólida como soporte de fase sólida, el kit comprende además opcionalmente reactivos de acoplamiento y/o una matriz sólida y/o una matriz sólida para realizar un inmunoensayo.

Según otra realización adicional, el kit según la invención comprende además al menos un reactivo de enjuague para lavar el material suelto antes de la detección a fin de evitar la detección de ruido de fondo. Típicamente los reactivos de enjuague comprenden amortiguadores estándar conocidos en la técnica.

Según otra realización adicional, el kit según la invención comprende además al menos una muestra de control opcionalmente junto con la información de calibración para la cuantificación de anticuerpos anti-ApoA-I detectados.

Según otra realización, la invención proporciona una placa de inmunoensayo que comprende al menos un péptido mimético según la invención, una variante del mismo, o una combinación del mismo, que se acoplan a una matriz sólida como soporte de fase sólida.

Usos y procedimientos según la invención

Según un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para detectar anticuerpos anti-ApoA-I endógenos en una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero;

(b) poner dicha muestra de fluido biológico en contacto con una matriz sólida donde se acopla al menos un péptido mimético de un epítopo de ApoA-I, donde dicho péptido mimético consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 15 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 16 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 17 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 19 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 20 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 25, donde dicha variante de péptido mimético es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético excepto que 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia son sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I, donde el contacto es bajo condiciones suficientes para unir un anticuerpo anti-ApoA- I presente en dicha muestra de fluido biológico contra dicho al menos un péptido mimético a través de la interacción antígeno-anticuerpo donde la secuencia de dicho al menos un péptido mimético tiene una reticulación interna entre al menos dos aminoácidos no contiguos;

(c) eliminar cualquier anticuerpo no unido de la superficie de dicha matriz sólida;

Según una realización adicional, se proporciona un procedimiento según la invención, donde la secuencia de aminoácidos de dicho al menos un péptido mimético consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionados de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y SEQ ID NO: 20 y cualquier variante de las mismas, donde dicha variante es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético, excepto que 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia son sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I.

En una realización particular, se proporciona un procedimiento según la invención, donde la secuencia de aminoácidos de dicho al menos un péptido mimético consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionados de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, y cualquier variante de las mismas, donde dicha variante es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético, excepto que 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia son sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I.

En una realización particular, se proporciona un procedimiento según la invención, donde la secuencia de aminoácidos de dicho al menos un péptido mimético consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionados de la SEQ ID NO: 25.

Según otra realización particular, se proporciona un procedimiento según la invención, donde la secuencia de aminoácidos de dicho al menos un péptido mimético consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y SEQ ID NO: 20, y cualquier variante de las mismas, donde dicha variante es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético, excepto que 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia son sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I.

Según una realización adicional, se proporciona un procedimiento según la invención, donde la secuencia de aminoácidos de dicho al menos un péptido mimético consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, y cualquier variante de las mismas, donde dicha variante es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético, excepto que 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia son sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I.

Según una realización adicional, se proporciona un procedimiento según la invención, donde la secuencia de péptidos miméticos consiste en SEQ ID NO: 19.

Según otra realización adicional, se proporciona un procedimiento según la invención, donde dicho al menos un péptido mimético consiste en cualquiera de:

(i) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 con un enlace de lactama de la Fig. 2C que se une a E en la posición 19 y K en la posición 23 en dicha secuencia;

(ii) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15 con un encadenamiento de hidrocarburos de la Fig. 2B que se une a (R)-2-(7'-octenil)-Alanina en la posición 16 y (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 23 en dicha secuencia; (iii) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16 y la reticulación interna en c) es un encadenamiento de hidrocarburos de la Fig. 2B que se une a (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 13 y (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 17 en dicha secuencia;

(iv) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17 y la reticulación interna en c) es un encadenamiento de hidrocarburos de la Fig. 2B que se une a (R)-2-(7'-octenil)-Alanina en la posición 9 y (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 16 en dicha secuencia.

Según otra realización adicional se proporciona un procedimiento según la invención, donde dicho al menos un péptido mimético consiste en cualquiera de:

(i) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.

Según otra realización se proporciona un procedimiento según la invención, donde dicho al menos un péptido mimético consiste en cualquiera de:

(ii) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15 con un encadenamiento de hidrocarburos de la Fig. 2B que se une a (R)-2-(7'-octenil)-Alanina en la posición 16 y (S)-2-(4'- pentenil)-Alanina en la posición 23 en dicha secuencia; (iii) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16 y la reticulación interna en c) es un encadenamiento de hidrocarburos de la Fig. 2B que se une a (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 13 y (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 17 en dicha secuencia;

Según aún otra realización se proporciona un procedimiento según la invención, donde dicho al menos un péptido mimético consiste en cualquiera de:

(i) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20; o una variante de las mismas, donde dicha variante es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético, excepto que 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia son sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I.

Según otra realización adicional, se proporciona un procedimiento según la invención, donde dicha muestra de fluido biológico se pone en contacto con dicha matriz sólida en la etapa (b), donde al menos un péptido mimético, o variante del mismo, se acopla a dicha matriz sólida.

Según otra realización adicional, se proporciona un procedimiento, donde el procedimiento comprende además una etapa de comparar la señal obtenida en la etapa (d) de detección con la misma señal obtenida para al menos una muestra de control, donde la señal obtenida para dicha al menos una muestra de control se recolecta previamente, simultánea o posteriormente a la etapa (d) de detección para dicha muestra de fluido biológico.

La detección de los anticuerpos capturados/unidos en la etapa (d) se pueden llevar a cabo mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica para detectar anticuerpos capturados o proteínas sobre superficies tales como técnicas de detección óptica (por ejemplo, ELISA), detección de variación de masa (por ejemplo, resonancia de plasmón superficial, espectrometría de masas), detección eléctrica (por ejemplo, espectroscopia dieléctrica, electroquímica).

Los resultados del ensayo pueden ser cualitativos o cuantitativos. La cantidad de los anticuerpos capturados/unidos asociados con la matriz sólida se pueden comparar con controles positivos y negativos. Los controles de manera típica se ejecutan concomitantemente con la muestra a analizar. Un control positivo puede ser un suero o una solución que contiene anticuerpos que son inmuno-reactivos con la ApoA-I. Un control negativo puede ser un suero o solución que no contenga anticuerpos que sean inmuno-reactivos con ApoA-I. Para la cuantificación, se puede generar y/o utilizar una curva de calibración utilizando cantidades conocidas de anticuerpos anti-ApoA-I. Los anticuerpos para su uso como controles positivos pueden producirse utilizando la totalidad, o fragmentos de, la secuencia de aminoácidos de ApoA-I.

La comparación con muestras de fluido biológico saludable puede lograrse con diferentes procedimientos. Según una realización, puede llevarse a cabo incluyendo una reacción de control con una muestra de sangre no enferma. Según otra realización, puede llevarse a cabo empleando un valor para la concentración del anticuerpo anti-ApoA-I para una muestra de fluido biológico típica de un sujeto sano. Típicamente, la comparación del nivel de anticuerpo anti-ApoA-I endógeno presente en una muestra bajo investigación puede realizarse con respecto a un valor determinado en cada procedimiento de prueba individual o a un valor predeterminado. El valor predeterminado puede determinarse para el procedimiento de análisis en general, o alternativamente, el valor puede ser válido solamente para un cierto lote de reactivos de prueba. Por ejemplo, el valor de referencia puede ser válido durante un periodo de calibración definido solamente y puede redefinirse tras la calibración del procedimiento de prueba.

Los procedimientos, los kits y usos según la invención pueden adecuarse para propósitos de selección así como para propósitos de diagnóstico y pueden aplicarse en el diagnóstico primario, así como en el monitoreo del transcurso de la enfermedad durante o después del tratamiento.

En particular, los procedimientos, los kits y usos según la invención pueden ser adecuados para:

i) propósitos de diagnóstico en pacientes con dolor de pecho agudo para descartar o determinar una isquemia del miocardio y, por consiguiente, para el diagnóstico de síndrome coronario agudo,

ii) pronóstico y, posiblemente, propósitos terapéuticos en pacientes con dolor de pecho agudo, síndrome coronario agudo, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, estenosis carotídea severa, enfermedad renal terminal o periodontitis, puesto que la invención permite la identificación de los sub-conjuntos de pacientes que tienen un alto riesgo cardiovascular y, por consiguiente, permite la identificación de los sub-conjuntos de pacientes que podrían beneficiarse de una terapia específica (como se describe en la misma) dirigida a revertir los efectos nocivos de los anticuerpos anti-ApoA-I.

Los propósitos de diagnóstico, pronóstico y terapéuticos antes mencionados pueden aplicarse en prevención primaria así como secundaria.

Los procedimientos, los kits y usos según la invención, en particular, pueden ser adecuados también para determinar si un paciente adolece de dolor agudo de pecho, síndrome coronario agudo, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, estenosis de arterias carótidas severa, enfermedad renal en etapa terminal o periodontitis, en los cuales no se observan factores de riesgo cardiovasculares usuales (incluyendo el uso de tabaco, uso de alcohol, presión sanguínea elevada, colesterol elevado, obesidad, inactividad física, dietas poco saludables), no obstante podrían beneficiarse de una terapia para prevenir o tratar una enfermedad cardiovascular tal como un procedimiento que comprende administrar al menos un péptido mimético según la invención.

Los análisis de pronóstico y/o diagnóstico descritos en esta invención se pueden utilizar para determinar si un sujeto podría beneficiarse de la administración de un agente (por ejemplo, un fármaco) para prevenir y/o tratar una enfermedad cardiovascular. Por ejemplo, tales análisis se pueden utilizar para determinar si la administración de un agente terapéutico adecuado para tratar una enfermedad cardiovascular tal como ApoA-I, un péptido mimético según la invención, inmunoglobulinas intravenosas (IVIG) o eplerenona, podría beneficiar a un sujeto. La inmunoglobulina intravenosa (IVIG) es un producto sanguíneo administrado intravenosamente. La misma contiene la inmunoglobulina IgG polivalente, mezclada, extraída del plasma de más de un ciento de donadores de sangre. Típicamente, la dosificación de IVIG depende de las indicaciones. Para una disfunción inmune primaria se implementan 100 a 400 mg/kg de peso corporal cada 3 a 4 semanas. Para enfermedades neurológicas y autoinmunes se implementan 2 gramos por kilogramo de peso corporal por tres a seis meses durante el transcurso de cinco días una vez al mes. A continuación, sigue la terapia de mantenimiento de 100 a 400 mg/kg de peso corporal cada 3 a 4 semanas.

La eplerenona (nombre IUPAC sistemático: ácido pregn-4-ene-7,21-dicarboxílico, 9,11-epoxi-17-hidroxi-3-oxo, ylactona, éster de metilo (7a, 11a, 17a) es un antagonista de la aldesterona utilizado como un adjunto en el manejo de la insuficiencia cardiaca crónica. La misma se comercializa específicamente para reducir el riesgo cardiovascular en pacientes después de un infarto de miocardio. Por lo tanto, otro aspecto de la invención es un procedimiento para determinar si un sujeto, en particular un sujeto que padece un dolor de pecho agudo, síndrome coronario agudo, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, estenosis carotídea severa, enfermedad renal terminal o periodontitis podrían beneficiarse de la administración de un agente terapéutico para prevenir y/o tratar una enfermedad cardiovascular.

Otro aspecto es un procedimiento para monitorear el transcurso de una enfermedad cardiovascular en un sujeto durante o después del tratamiento. Para este propósito, la detección de anticuerpos anti-ApoA-I en una muestra biológica de un sujeto se puede determinar en muestras biológicas de un sujeto antes, durante, o después de someterse a un tratamiento. Una disminución en la cantidad de anticuerpos anti-ApoA-I detectados después del tratamiento indica que el sujeto se puede tratar además con el mismo tratamiento. La ausencia de anticuerpos anti-ApoA-I después del tratamiento indica que el tratamiento se puede interrumpir o continuar a una frecuencia más baja y/o dosificación más baja.

La información obtenida de la práctica de los análisis anteriores es útil en el pronóstico, identificación de avance, y manejo clínico de enfermedades y otras condiciones dañinas que afectan al estado de salud de un individuo. La información ayuda más específicamente al médico a diseñar la terapia u otros regímenes y tratamiento para tratar la enfermedad cardiovascular, en particular en sub-poblaciones de pacientes que sufren de dolor agudo de pecho, síndrome coronario agudo, artritis reumatoide, lupus eritematosos sistémico, estenosis carotídea severa, enfermedad renal terminal o periodontitis.

Pacientes

En una realización, los pacientes según la invención son pacientes que padecen una enfermedad cardiovascular o que se sospecha padecen tal enfermedad.

En una realización particular, los pacientes según la invención han sido admitidos en el departamento de urgencias con dolor agudo de pecho.

En otra realización, los pacientes según la invención son pacientes que han sido admitidos en el departamento de urgencias con dolor agudo de pecho y que se ha diagnosticado que padecen una enfermedad cardiovascular después de los análisis de pronóstico y/o diagnóstico según la invención.

En aún otra realización, los pacientes según la invención son pacientes que padecen dolor agudo de pecho, síndrome coronario agudo, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, estenosis carotídea severa, enfermedad renal terminal o periodontitis.

En aún otra realización, los pacientes según la invención no presentan los factores cardiovasculares de riesgo usualmente observados tales como el uso de tabaco, uso de alcohol, presión sanguínea elevada, colesterol elevado, obesidad, inactividad física, dietas poco saludables.

En una realización adicional, los pacientes según la invención son pacientes que padecen dolor agudo de pecho, síndrome coronario agudo, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, estenosis carotídea severa, enfermedad renal terminal o periodontitis, que se ha diagnosticado que padecen una enfermedad cardiovascular siguiendo los análisis de pronóstico y/o diagnóstico según la invención.

Habiéndose descrito la invención, los siguientes ejemplos se presentan a modo de ilustración, y no como limitación.

Ejemplos

Las siguientes abreviaturas se refieren respectivamente a las definiciones de abajo:

aa (aminoácido); AUC (área bajo la curva), h (hora), pl (microlitro), pM (micromolar), mM (milimolar), mg (miligramo), min (minuto), nm (nanómetro), BSA (albúmina de suero bovino), CI (intervalo de confianza), CH²Cl²(diclorometano), DIPEA (diisopropiletilamina), DMF (Dimetilformamida), EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), HCTU (2-(6-Cloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-aminiohexafluoro-fosfato), HoBt (N-hidroxi-benzotriazol), OR (razón de probabilidades), PBS (solución salina amortiguada con fosfato), PyBOP (Hexafluoro-fosfato de benzotriazol-1-il-oxitris-pirrolidino-fosfonio), PyClock (hexafluorofosfato de 6-Cloro-benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio), TFA (Ácido trifluoroacético), TIS (triisopropilsilano).

Materiales y procedimientos

Síntesis del péptido

Los péptidos lineales, derivados de tioéster C-terminal para ligadura química natural (Dawson y col., 1994, Science 266:776-779) y ciertos análogos enlazados con lactama (F3L1) se sintetizaron utilizando la síntesis del péptido de fase sólida Merrifield a base de Boc en un sintetizador de péptidos ABI 433A adaptado a la química con Boc (Wilken y Kent, 1998,Curr Opin Biotechnol 9:412-426). La escisión de la resina se realizó con fluoruro de hidrógeno. Para la incorporación del enlace de lactama, se utilizaron respectivamente protecciones ortogonales (O-Fm y Fmoc) para Glu y Lys, y el enlace de lactama se formó en la resina después de la escisión mediada a base de piperidina al 20 % de los grupos protectores de éster/carbamato de fluorenilmetilo durante 1 h. La ciclización de lactama peptídica se llevó a cabo con 3 eq. de Pyclock y 9 eq. de DIEA durante 2 días y se monitoreó mediante la prueba de ninhidrina Kaiser (Kaiser y col., 1970, Anal Biochem 34:595-598).

La longitud de los péptidos EF (Ala190-Thr242 ApoA-I es decir 53 residuos) necesitaron la síntesis a través de dos fragmentos (Ala190-Arg215 y Gln216-Thr242) los cuales se ensamblaron mediante ligadura química natural (Dawson y col., 1994, Science 266:776-779). Debido a que esta metodología requiere Cys N-terminal en el fragmento C-terminal, fue necesario remplazar Gln216 en la secuencia de ApoA-I por un residuo de Cys. Este residuo se alquiló con yodoacetamida después de la etapa de ligadura para obtener un análogo de Gln (cadena lateral CH²-S-CH²-CONH²en vez de CH²-CH²-CONH²). Además, puesto que los extremos terminales del péptido se sometieron a ciclización a través del enlace de bisulfuro, se agregaron residuos de Cys(Acm) al N-terminal de Ala190-Arg215 y C-terminal de Gln216-Thr242. Estos se desprotegieron con HgOAc después de la alquilación del producto de ligadura y se oxidaron con H²O². Los mejores resultados para la ciclización se obtuvieron cuando se utilizaron 20 eq. de H²O²durante 30 min a pH 7.0, seguido inmediatamente por purificación mediante RP-HPLC.

También se utilizó la síntesis de fase sólida a base de Fmoc para generar algunos de los péptidos lineales con un enlace de lactama. En este caso se utilizó un par de grupos protectores ortogonales (alilo/alloc) para los residuos de ácido glutámico y lisina. Estos grupos protectores se eliminaron con 3 eq. de Pd(PPha)4 en CHCb-AcOH-N metilmorfolina (37:2:1) durante 2 h, según el procedimiento de Kates y col. (30), antes de la ciclización del péptido.

Todos los péptidos de hidrocarburo encadenados se sintetizaron utilizando química con Fmoc en resina de amida MBHA-Rink (carga de 0,56 mmol/g) a escala de 100 pm con un sintetizador Prelude (Protein Technologies Inc., Tucson, E.U.A.). Un ciclo de alargamiento de péptidos consistió en las siguientes etapas: (i) la resina cargada primero se lavó con DMF (3 x 30 s) y el grupo protector de Fmoc terminal se eliminó con piperidina al 20 %/DMF (2 x 10 min); (ii) la resina desprotegida se lavó, a continuación, con DMF (6 x 30 s) y se trató durante 30 min con una solución que contiene 5 eq. del aminoácido con Fmoc apropiado, 5 eq. de HCTu , y 10 eq. de DIPEA; (iii) la resina se lavó, a continuación, tres veces con NMP (3 x 30 s), con grupos de amino sin reaccionar acetilados después de su tratamiento con anhídrido acético al 10 % v/v en DMF (1 x 10 min), y la resina sellada se lavó con DMF (6 x 30 s). Estas etapas se repitieron hasta que se completó la secuencia de péptidos.

El acoplamiento de una glicina de a-metilo, a-alquenilo se realizó manualmente como se describió previamente (Kim y col., 2011, Nat Protoc 6:761-771) con ligeras modificaciones. La resina desprotegida se trató durante 2 h con una solución que contiene 2 eq. del aminoácido, 2 eq. de Pyclock y 4 eq. De DIPEA. Esta etapa se repitió si era necesario un acoplamiento doble. El siguiente aminoácido en la secuencia se incorporó también manualmente en una etapa de acoplamiento doble durante 1 h con una solución que contiene 5 eq. de aminoácido, 5 eq. de PyClock y 15 eq. de DIEA.

Una vez que se eliminó el grupo protector de Fmoc final, la resina se trató con anhídrido acético al 10 % (v/v) y DIPEA al 1 % (v/v) en DMF (1 x 10 min) para obtener un N-terminal sellado con acetilo. La resina se lavó subsecuentemente con DMF (5 x 30 s) y CH2Cl2 (5 x 30 s), se secó durante 2 min bajo vacío y, a continuación, se trató durante 90 min con una solución de escisión que contiene agua al 2,5 % (v/v), triisopropilsilano al 2,5 % (v/v) y fenol al 5 % en TFA.

Metátesis de cierre del círculo

La metátesis de cierre del círculo (RCM) de todos los péptidos que contienen derivados de aminoácido olefínico se realizó en péptidos protegidos con Fmoc en resina de amida MBHA-Rink con rutenio (II) de (o-opropoxifenilmetileno) (triciclohexilfosfina) como el catalizador, como se describe (Kim y col., 2011, Nat Protoc 6:761-771). La resina se lavó sucesivamente con DCM y DCE y se trató con una solución 6 mM del catalizador de primera generación de Grubbs en DCE (4,9 mg/ml, 0,2 eq. con respecto a la sustitución de resina) durante 2 h, acompañada por un burbujeo de N2 lento pero continuo a través de la solución. La RCM se repitió dos veces. El avance de la reacción de la metátesis se monitoreó mediante HPLC y ESI-MS tras escindir una muestra pequeña de resina. La desprotección final (y acetilación) y subsecuente escisión del péptido de la resina se realizó utilizando el protocolo descrito anteriormente.

Purificación de péptidos y análisis

Los espectros de masas se adquirieron en un espectrómetro de masas Micromass-Platform LCZ. Se realizó una cromatografía de líquidos a alta presión de fase reversa analítica en un módulo HPLC Waters 2795 acoplado con detección UV de 214 nm, utilizando una columna Phenomenex-Aeris widepore, 3,6 pm XB C8, de 4,6 mm x 150 mm. La HPLC preparativa se realizó en un módulo Delta 600 acoplado con un detector UV 2487 utilizando una columna Vydac C88250 x 22 mm de d.i., tamaño de partícula 10 pm). Los eluyentes fueron TFA acuoso al 0,1 % y TFA al 0,1 % en acetonitrilo: agua (9:1, v:v).

La producción de cada síntesis se evaluó primero mediante análisis con HPLC y ESI-MS de la mezcla de reacción cruda. Los péptidos se purificaron a continuación hasta homogeneidad mediante HPLC de fase reversa. Las identidades y purezas de péptidos purificados se evaluaron mediante HPLC analítica y espectrometría de masas.

Suero de detección de pacientes con dolor de pecho agudo con o sin auto-anticuerpos anti-ApoA-I

Las muestras de suero utilizadas eran iguales a las descritas en un estudio previamente publicado que involucra 138 pacientes admitidos en el departamento de urgencias (ED) con dolor agudo de pecho (Keller y col., 2012, J Intern Med 271:451-462). El objetivo de este estudio era determinar la exactitud del diagnóstico de la inmuno-reactividad de IgG contra ApoA-I en la misma primera muestra de plasma recolectada en el ED del (i) infarto de miocardio sin elevación en el segmento ST (NSTEMI) y (ii) subsecuente elevación de troponina I. Los detalles de la recolección y procesamiento de muestras, definiciones de puntos finales y criterios de inclusión/exclusión se describen en Keller y col. (2012, J Intern Med 271:451-462. Debido a la falta de material de seis de los pacientes, los análisis en los péptidos se realizaron en muestras de los 132 pacientes restantes.

Ensayo por inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA) en el suero de los pacientes

La inmuno-reactividad con el suero del paciente se midió mediante ELISA como se describe previamente (Vuilleumier y col., 2010, Eur Heart J 31:815-823). En pocas palabras, se revistieron placas Maxisorp (Nunc™, Roskilde, Dinamarca) con ya sea ApoA-I sin lípidos derivada de humano, purificada (20 pg/mL; 50 pl, cavidad) o péptidos derivados de ApoA -I sintética (20 pg/mL; 50 pl, cavidad) durante 1 h a 37 °C. Después de lavarse, las cavidades se bloquearon durante 1 h con PBS con BSA al 2 % a 37 °C. A continuación, se agregaron muestras de suero duplicadas diluidas 1/50 a las cavidades y se incubaron durante 1 h. Las muestras de suero se agregaron también a una cavidad no revestida para evaluar el enlace no específico individual. Después de lavarse seis veces, se agregó IgG anti-humana conjugada con fosfatasa alcalina (50 pl, cavidad) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) diluida 1/1000 en solución de BSA con PBS a las cavidades y se incubaron durante 1 h a 37 °C. Después de lavarse de nuevo seis veces, las cavidades se revelaron 0 proyectaron agregando p-nitrofenilfosfato disódico con substrato de fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich), disuelto en amortiguador de dietanolamina (pH 9.8). Después de 20 min de incubación a 37 °C, se determinaron señales ELISA (absorbancia OD405 nm) utilizando un lector de placas (Molecular Devices Versa Max™; Molecular Device, Sunnyvale, CA, EUA). La correspondiente unión no específica se sustrajo de la absorbancia media de cada muestra.

También se llevaron a cabo experimentos con ELISA de competencia utilizando péptidos sintéticos seleccionados. Se co-incubaron péptidos sintéticos (disueltos en PBS con albúmina de suero bovino (BSA) al 2 % a diferentes concentraciones con el suero de pacientes que contiene altos niveles de IgG anti-ApoA-I durante 2 a temperatura ambiente, antes de agregarse a las cavidades revestidas con ApoA-I sin lípidos, derivada de humanos, purificada, como se describe anteriormente, antes del desarrollo del ensayo que se describe anteriormente.

Análisis estadísticos

Se realizaron análisis utilizando el programa informático Statistica™ (StatSoft, Tulsa, OK, EUA). Se utilizó la prueba exacta bilateral de Fisher y la prueba U de Mann Whitney cuando era pertinente. Se presentan asociaciones entre la inmuno-reactividad a diferentes péptidos, y términos de estudio como la razón de posibilidades (OR) y el correspondiente intervalo de confianza del 95 % (CI 95 %). Se utilizaron análisis de multivariables con regresión logística para evaluar las asociaciones entre variables. En este modelo se establecieron puntos finales como variables dependientes, y calificación NSTEMI-TIMI (Antman y col., 2000, JAMA 284:835-842) (permitiendo el ajuste de mayores determinantes CV de los resultados de los pacientes a los 14 días dentro de una sola variable continua) se estableció como la única variable de confusión debido al tamaño limitado de la muestra. Se realizaron análisis ROC utilizando el programa informático analyse-it™ para Excel (Microsoft, Redmond, WA, EUA). Se realizaron comparaciones de áreas bajo la curva (AUC) según la metodología no paramétrica de DeLong y col. (1988, Biometrics 44:837-845).

Experimentos a base de células: respuesta pro-inflamatoria relacionada con IgG Anti-ApoA-I

Se obtuvieron macrófagos derivados de monocitos humanos (HMDMs) tratando los monocitos humanos con interferón (IFN)-y durante 24 horas como se describió previamente (Pagano y col., 2012, J Intern Med). Los HMDMs se estimularon entonces en bandejas de 96 cavidades durante 24 h con concentraciones cada vez mayores (5-40 pg/mL) de ya sea ApoA-I anti-humana policlonal (Academy Bio-Medical Company, Houston, TX, EUA) o anticuerpo de control (Meridian Life Science, Saco, ME, EUA), con IgG de la mezcla+ o mezcla- (500 pg/mL). En este modelo, se ha mostrado que la IgG anti-ApoA-I libre de LPS promueve la producción de TNF-a e IL-6 de una manera dependiente a la dosis, con una estimulación óptima a 40 pg/ml (Pagano y col., 2012, J Intern Med).

Para experimentos de inhibición de competencia, se co-incubaron péptidos sintéticos con 40 pg/ml de IgG anti-ApoA-1 policlonal durante 2 h a temperatura ambiente antes de su adición a HMDMs en placas de 96 cavidades, y seguido por la evaluación de niveles de IL-6 y TNF-a en sobrenadantes de células utilizando la Tecnología Luminex MAP™. Se realizaron experimentos con la sangre de tres donantes diferentes.

Experimentos a base de células: respuesta cronotrópica relacionada con la IgG anti-ApoA-I

Se aislaron cardiomiocitos ventriculares de ratas neonatales (NRVC) de los ventrículos de ratas Wistar de 1 -2 días de edad mediante digestión con EDTA baja en tripsina y colagenasa tipo 2. Los animales fueron eliminados mediante decapitación sin anestesia, analgesia, o administración de agentes de bloqueo neuromuscular, de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por el NIH (publicación 85-23) y con la autorización (1012/3134/0- R) de la oficina veterinaria del condado local. Se sembraron células recién aisladas en matraces de plástico que permiten la adhesión selectiva de fibroblastos cardiacos. Después de esto los cardiomiocitos se decantaron de los matraces y se distribuyeron en platos de Petri de 90 mm revestidos con laminina.

Después del cultivo de 1-2 días, las células se incubaron a intervalos de tiempo con la concentración apropiada de IgG anti-ApoA-I (Abeam, Nottingham, Reino Unido) o vehículo en DMEM libre de suero. La frecuencia de latido de las unicapas de microcitos espontáneamente contraídos se determinó de manera inmediata al final del período de pre incubación (t=0) y a diferentes tiempos después de la adición de varias sustancias. Se realizaron determinaciones de frecuencia por un técnico (que desconocía las condiciones experimentales) utilizando un microscopio óptico para cuantificar el número de contracciones por unidad de tiempo en diferentes locaciones del plato. La regularidad de las contracciones de células se ha evaluado previamente monitoreando las fluctuaciones de calcio citosólicas libres con sondas de calcio fluorescentes {Maturana y col., 2009, Endocrinology 150:3726-3734). Debido a que previamente demostró que el efecto cronotrópico máximo de IgG anti-ApoA-I se alcanza a 10 pg/ml (Vuilleumier y col., 2010, Eur Heart J 31:815-823), esta concentración de anticuerpo se mantuvo en todos los experimentos. Se realizaron experimentos de inhibición de competición con péptidos sintéticos utilizando las mismas condiciones experimentales. Se co-incubaron péptidos sintéticos con 10 pg/ml de anti-ApoA-I monoclonal (Abeam, Nottingham, Reino Unido) durante 2 h a temperatura ambiente, antes de agregarse a NRVC en los platos, con la frecuencia de latido determinada como se describió anteriormente.

Espectroscopia CD para determinar el contenido helicoidal

Se recolectaron espectros de dicroísmo circular (CD) de 185 a 240 nm en un espectropolarímetro Jasco J-815 a 20 °C. Una muestra típica se preparó disolviendo el péptido liofilizado en trifluoroetanol al 25 % en agua para obtener una concentración de 2 mM, diluyendo a continuación esta solución 20 veces en agua y cargándola en un tubo de cuarzo (trayectoria de recorrido de 0,2 cm). Los espectros CD básicos para TFE al 1,25 % en agua se sustrajeron de los espectros experimentales. Los datos se normalizaron calculando la elipticidad media del residuo a una longitud de onda de 222 nm, (0 )mrw, e .

Ejemplo 1: ejemplos de péptidos miméticos según la invención

Los péptidos miméticos descritos en la Tabla 3 más abajo se sintetizaron como se describe en la sección anterior Materiales y procedimientos y se caracterizaron además mediante espectrometría de masas.

Tabla 3. Ejemplos de péptidos miméticos según la invención y su secuencia de aminoácidos.

Además de un enlace de lactama como se describe anteriormente, el péptido mimético EFL1 contenía también un enlace de disulfuro para enlazar las dos regiones derivadas de hélices E y F de Apo-AI en una proximidad cercana. La ciclización de péptidos a través de un enlace de disulfuro en el caso de EFL1 se confirmó mediante una pérdida de 2 Da así como mediante un cambio de picos en HPLC analítica. Este fue el caso también para la formación del enlace de lactama y metátesis de cierre del círculo, con pérdidas de masa de 18 Da (eliminación de H²O) y 28 Da (eliminación de etileno), respectivamente. Durante la metátesis de cierre del círculo del fragmento C1S2, se obtuvieron dos isómeros con la masa esperada pero con diferentes movilidades de RP-HPLC. Estos se purificaron por separado y se analizaron independientemente.

El péptido F3, derivado de la hélice F de ApoA-I, se eligió como el control en la sección experimental. El péptido F3 tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado, y no contiene ninguna reticulación interna.

SEQ ID NO: 9: GLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNT

Ejemplo 2: Contenido alfa-helicoidal de los péptidos miméticos de la invención

El contenido alfa-helicoidal de los péptidos miméticos F3L1, F3S2A, F3S1B, F4S2B y F4L1 (véase la Tabla 3) se evaluó mediante espectroscopia CD como se describe en la sección Materiales y procedimientos anteriores. Los resultados presentados en la figura 3 muestran que el F3S2A encadenado y F3L1 y F4L1 enlazados así como el F3S1B y F4S2B encadenados exhibieron un contenido alfa-helicoidal incrementado (concentraciones mínimas características a 208 y 222 nm) en comparación con el péptido F3 de control no encadenado.

Ejemplo 3: Antigenicidad y potencial de diagnóstico de los péptidos miméticos de la invención

Se evaluó la reactividad de los péptidos miméticos F3L1, F3S2A, F3S1B, y F4S2B (véase la Tabla 3) con suero desde el grupo de 132 pacientes con dolor agudo de pecho utilizando el ensayo ELISA en el suero de los pacientes, con resultados sometidos a análisis estadísticos. Los resultados, mostrados en la Tabla 4, indican claramente el incremento en la precisión del diagnóstico ofrecida por los F3S2A, F3S1B, F4S2B con hidrocarburos encadenados, y péptidos miméticos F3L1 enlazados con lactama con respecto al péptido de control (F3) no encadenado. De hecho, los parámetros estadísticos para esos péptidos miméticos, en particular para F3L1, se compara favorablemente con los de Copeptina, y se acerca a los que se pueden obtener con Apo-A-1 intacta. La copeptina es un control interno que valida el hecho de que el grupo de pacientes utilizado es de hecho representativo de pacientes con dolor de pecho agudo (Reichelin, y col., 2009, J Am Coll Cardiol. 54(l):60-8). La copeptina también conocida como provasopresina cter, es el precursor de la vasopresina que es una hormona clave en la homeostasis de agua, cuyos niveles circulantes han demostrado obtener un valor de pronóstico fuerte en síndromes coronarios agudos (Lippi y col., 2012, Clin Chem Lab Med. 50(2):243-5).

Tabla 4. Propiedades de diagnóstico de los péptidos para el diagnóstico NSTEMI y subsecuente elevación cTnl en 132 pacientes con ACP derivado del ensayo ELISA del suero de los pacientes. Los resultados de ApoA-I intacta y copeptina se incluyen para su comparación y se obtuvieron de experimentos llevados a cabo en el mismo período. Los resultados estadísticamente significativos (p<0,05) se indican con en negrita. *Ajustados para puntuación NSTEMI-TIMI; Para análisis de riesgo: Separación de copeptina: <9 pmol/L (Reichlin y col., 2009, JACC); separación adaptada y colocada en el 80° percentil de la distribución de población de estudio.

En los ensayos ELISA de competencia, el suero de un paciente que se sabe que es positivo a los anticuerpos ApoA-I se pre-incubó con el péptido F3L1 a diferentes concentraciones como se indica en la figura 3 y, a continuación, se agrega a las placas de ELISA revestidas con ApoA-I intacta, con las subsecuentes etapas de ensayo llevadas a cabo según el protocolo estándar. Los resultados demostraron que el péptido F3L1 mimético fue capaz de inhibir competitivamente el enlace a la ApoA-I intacta de IgG del suero de un paciente que se sabe que da positivo a los anticuerpos anti-ApoA-I, de manera dependiente de la dosis (figura 4).

Los resultados de los ensayos ELISA de competencia, llevados a cabo con F3, F3 desorganizado, y F3L1 (figura 5) mostraron la ausencia de la inhibición dependiente de la dosis del péptido desorganizado, que refuerza la especificidad del efecto observado con F3L1 y el correspondiente péptido sin el enlace de lactama. Más generalmente, enfatiza la importancia de una estructura secundaria apropiada de la correspondiente región derivada de la Hélice F. F3 desorganizado: Ac-KELYLLKFTVESKVGSTe Lp LNFSLA-NH2 corresponde a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26 con el grupo de amino libre en el extremo N-terminal acetilado y el grupo de carboxi libre en el extremo C-terminal amidado.

Ejemplo 4: Péptido mimético F3L1 de la invención que inhibe la respuesta pro-inflamatoria relacionada con la IgG anti-ApoA-I

La IgG anti-ApoA-I policlonal (Academy Bio-Medical Company; Houston, TX, EUA) aplicada a la concentración óptima de 40 pg/ml suscitó un incremento significativo en la producción de TNF-a mediante macrófagos humanos derivados de monocitos (figura 6A). Esta producción se anuló cuando la IgG anti-ApoA-I se pre-incubó con el péptido F3L1 durante 2 h a temperatura ambiente antes de la adición al medio de cultivo de células. El mismo efecto se observó en un segundo experimento utilizando un depósito de IgG obtenido de pacientes que se sabe que dan positivo a los anticuerpos anti- ApoA-I (figura 6B), aunque el nivel de producción de TNF-a suscitado por la IgG acumulada fue significativamente más bajo que el suscitado por la IgG anti-ApoA-I policlonal.

Estos resultados muestran que el péptido mimético F3L1 inhibe la respuesta proinflamatoria relacionada con IgG anti-ApoA-I.

Ejemplo 5: Péptido mimético F3L1 inhibe la respuesta cronotrópica relacionada con IgG anti-ApoA-I

La adición de anticuerpos anti-ApoA-I suscitó una fuerte respuesta cronotrópica en cardiomiocitos de rata cultivados (primer grupo de barras a la izquierda de la figura 7). Esta respuesta fue completamente anulada cuando el anticuerpo se pre-incubó con el péptido mimético F3L1 (75 pg/ml) durante 2 h a temperatura ambiente antes de su adicción a las células cultivadas (segundo grupo de barras de la izquierda en la figura 7. Finalmente, cuando se agregó solo, el péptido F3L1 no alteró la relación de contracción de la frecuencia basal o la relación de contracción en la presencia de 10 nM de aldosterona (último grupo de barras a la derecha de la figura 7, sugiriendo que su capacidad de anular la respuesta cronotrópica relacionada con IgG anti-apoA-I está directamente relacionada con su capacidad de interactuar con los anticuerpos anti-ApoA-I.

Estos resultados muestran que el péptido mimético F3L1 inhibe la respuesta cronotrópica relacionada con la IgG anti-ApoA-I.

Los resultados descritos en los Ejemplos 3 y 4 indican que F3L1 podría tener un efecto beneficioso para el tratamiento de una enfermedad cardiovascular.

Ejemplo 6. Identificación mediante espectrometría de masas de los epítopos de ApoA-I que son inmunoreactivos a los anticuerpos anti-ApoA-I

Para identificar los epítopos endógenos específicos de ApoA-I, la ApoA-I purificada se sometió a digestión enzimática, hidrolizando la proteína específicamente en el lado del carboxilo de la lisina o en el lado carboxílico de la arginina, seguido por la separación de péptidos y purificación mediante cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa e identificación de péptidos mediante espectrometría de masas. La inmuno-reactividad a la proteína digerida y cada fracción se analizaron mediante ELISA utilizando muestras de suero de 3 pacientes con titulaciones elevadas y muestras de suero de 3 pacientes con bajas titulaciones de auto-anticuerpos.

Para la ApoA-I digerida en residuos de lisina, se utilizó la enzima Endoproteinasa Lys-C (Roche Applied Science) (cantidad de enzima 1:50 fue 1/50 de proteína en peso, incubación por 18 h a 37 °C, pH 8.5). La digestión de ApoA-I con Lys-C permitió la identificación de las fracciones 70 y 71 (figura 8) que contenían un epítopo de péptido inmunoreactivo previamente no notificado de la secuencia de aminoácidos de ApoA-I de la SEQ ID NO: 1, que comprende la región derivada de la hélice D de la SEQ ID NO: 5 con una eliminación de los últimos 2 aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoácidos de este epítopo es la SEQ ID NO: 21.

A fin de generar fragmentos de péptido escindidos en residuos de arginina la manera convencional podría utilizar la enzima ArgC. Sin embargo, la enzima ArgC tiene una falta reconocida de especificidad, que genera péptidos trípticos, que anulan la inmuno-reactividad. Para superar esto, la ApoA1 fue reversiblemente bloqueada en los residuos de lisina con anhídrido maleico antes de su digestión y obtuvo la escisión específica de arginina (Butler y col., 1967, Biochemical Journal, 103(3): 78P-79P; Butler y col., Biochemical Journal, 112(5): 679-689). Esta metodología permitió la identificación de las fracciones 74 y 80 (figura 9) que contenían otro epítopo de péptido inmuno-reactivo de la secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 216-243 en relación con la secuencia de aminoácidos madura de ApoA-I de la SEQ ID NO: 1, que comprende la región 1 derivada de la hélice F de la SEQ ID NO: 8. La secuencia de aminoácidos de este epítopo es la SEQ ID NO: 25.

Los resultados descritos en el Ejemplo 6 indican que los epítopos específicos identificados en este ejemplo y, más generalmente, la región derivada de la Hélice D de la SEQ ID NO: 5 así como la región 1 y región 2 derivadas de la Hélice F de la SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, respectivamente, son más inmuno-reactivos a los anticuerpos anti-ApoA-I que otros fragmentos de ApoA-I que contienen otras hélices, en particular la hélice E contenida en el péptido que corresponde a los residuos de aminoácidos 189-215 de la ApoA-I madura de la SEQ ID NO: 1 que era menos inmuno-reactiva. Por consiguiente, los péptidos en los cuales la secuencia de aminoácido comprende al menos una de estas regiones puede utilizarse ventajosamente para detectar los auto-anticuerpos anti-ApoA-I.

Se han repetido experimentos similares a los descritos en los Ejemplos 4 y 5 con un mayor número de muestras (n=9), que confirman los resultados presentados en dichos ejemplos.

Listado de secuencias

ApoA-I humana: SEQ ID NO: 1 DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLRE QLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRA ELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGG ARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ

Región derivada de la hélice A: SEQ ID NO: 2:

VKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSAL

Región derivada de la hélice B: SEQ ID NO: 3:

DSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGL

Región derivada de la hélice C: SEQ ID NO: 4:

YLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHE

Región derivada de la hélice D: SEQ ID NO: 5:

EEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKEN

Región 2 derivada de la hélice E: SEQ ID NO: 6:

ATEHLSTLSEKAKPALE

Región 2 derivada de la hélice E: SEQ ID NO: 7:

LAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLR

Región 1 derivada de la hélice F: SEQ ID NO: 8:

VLESFKVSFLSALEEYTKKLNT

Región 2 derivada de la hélice F: SEQ ID NO: 9:

GLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNT

A1S2 sin acetilación y amidación:

VKDLR8TVYVDVS5KDSGRDYVSQFEGSAL

con un encadenamiento de hidrocarburos que se une a R8 en la posición 5 y S5 en la posición 12 en dicha secuencia, que es representada por:

VKDLXaaTVYVDVXaaKDSGRDYVSQFEGSAL (SEQ ID NO: 10 donde Xaa en la posición 5 es sustituida en una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R)-C(O)- donde R es un encadenamiento de hidrocarburos -(CH²)⁶-CH=CH-(CH2)3- unido a una subsecuente Xaa en la posición 12, y donde Xaa en la posición 12 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH- C(CH3)(R')-C(O)- donde R' es un enlace simple unido al encadenamiento de hidrocarburos de Xaa en la posición 5 como se define anteriormente)

B1S2 sin acetilación y amidación:

DSVTSTR8SKLREQS5GPVTQEFWDNLEKETEGL

con un encadenamiento de hidrocarburos que se une a R8 en la posición 7 y S5 en la posición 14 en dicha secuencia, que es representada por:

DSVTSTXaaSKLREQXaaGPVTQEFWDNLEKETEGL (SEQ ID NO: 11 donde Xaa en la posición 7 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R)-C(O)- donde R es un encadenamiento de hidrocarburos -(CH²)⁶-CH=CH-(CH2)3- unido a una subsecuente Xaa en la posición 14, y donde Xaa en la posición 14 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R')- C(O)- donde R' es un enlace simple unido al encadenamiento de hidrocarburos de Xaa en la posición 7 como se define anteriormente)

C1S2 sin acetilación y amidación:

YLDDFQKKWQEER8ELYRQKS5EPLRAELQEGARQKLHEL

con un encadenamiento de hidrocarburos que se une a R8 en la posición 13 y S5 en la posición 20 en dicha secuencia, que es representada por:

YLDDFQKKWQEEXaaELYRQKXaaEPLRAELQEGARQKLHEL (SEQ ID NO: 12 donde Xaa en la posición 13 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R)-C(O)- donde R es un encadenamiento de hidrocarburos -(CH²)⁶-CH=CH-(CH2)3- unido a una subsecuente Xaa en la posición 20, y donde Xaa en la posición 20 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH- C(CH3)(R')-C(O)- donde R' es un enlace simple unido al encadenamiento de hidrocarburos de Xaa en la posición 13 como se define anteriormente)

D1S2A sin acetilación y amidación:

EEMRDRARAHR8DALRTHS5APYSDELRQRLAARLEALKEN

con un encadenamiento de hidrocarburos que se une a R8 en la posición 11 y S5 en la posición 18 en dicha secuencia, que es representada por:

EEMRDRARAHXaaDALRTHXaaAPYSDELRQRLAARLEALKEN (SEQ ID NO: 13 donde Xaa en la posición 11 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R)-C(O)- donde R es encadenamiento de hidrocarburos -(CH²)⁶-CH=CH-(CH2)3- unido a una subsecuente Xaa en la posición 18, y donde Xaa en la posición 18 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH³)(R')-C(O)- donde R' es un enlace simple unido al encadenamiento de hidrocarburos de Xaa en la posición 11 como se define anteriormente)

E1S2 sin acetilación y amidación:

ATEHR8STLSEKS5KPALED

ATEHXaaSTLSEKXaaKPALED (SEQ ID NO: 14 donde Xaa en la posición 5 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R)-C(O)- donde R es encadenamiento de hidrocarburos -(CH2)6-CH=CH-(CH2)3- unido a una subsecuente Xaa en la posición 12, y en donde Xaa en la posición 12 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R')-C(O)- donde R' es un enlace simple unido al encadenamiento de hidrocarburos de Xaa en la posición 5 como se define anteriormente)

F3L1 sin acetilación y amidación:

GLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNT

con un enlace de lactama que se une a E en la posición 19 y K en la posición 23 en dicha secuencia, que es representada por:

GLLPVLESFKVSFLSALEXaaYTKXaaLNT (SEQ ID NO: 19 donde Xaa en la posición 19 es un aminoácido modificado de la fórmula (I): -NH-C(H)(R)-C(O)- donde R es un enlace de lactama -(CH²)²- CO-NH-(CH2)4- unido a una subsecuente Xaa en la posición 23, y donde Xaa en la posición 23 es un aminoácido modificado de la fórmula (I): -NH-C(H)(R')-C(O)- donde R' es un enlace simple unido al enlace de lactama de Xaa en la posición 19 como se define anteriormente)

F3S2A sin acetilación y amidación:

GLLPVLESFKVSFLSR8LEEYTKS5LNT

con un encadenamiento de hidrocarburos que se une a R8 en la posición 16 y S5 en la posición 23 en dicha secuencia, que es representada por:

GLLPVLESFKVSFLSXaaLEEYTKXaaLNT (SEQ ID NO: 15 donde Xaa en la posición 16 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R)-C(O)- donde R es encadenamiento de hidrocarburos -(CH2)6-CH=CH-(CH2)3- unido a una subsecuente Xaa en la posición 23, y donde Xaa en la posición 23 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R')- C(O)- donde R' es un enlace simple unido al encadenamiento de hidrocarburos de Xaa en la posición 16 como se define anteriormente)

F3S1B sin acetilación y amidación:

GLLPVLESFKVSS5LSAS5EEYTKKLNT

con un encadenamiento de hidrocarburos que se une a S5 en la posición 13 y S5 en la posición 17 en dicha secuencia, que es representada por:

GLLPVLESFKVSXaaLSAXaaEEYTKKLNT (SEQ ID NO: 16 donde Xaa en la posición 13 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R)-C(O)- donde R es encadenamiento de hidrocarburos -(CH2)3-CH=CH-(CH2)3- unido a una subsecuente Xaa en la posición 17, y donde Xaa en la posición 17 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R')-C(O)- donde R' es un enlace simple unido al encadenamiento de hidrocarburos de Xaa en la posición 13 como se define anteriormente)

F4S2B sin acetilación y amidación:

VLESFKVSR8LSALEES5TKKLNT

con un encadenamiento de hidrocarburos que se une a R8 en la posición 9 y S5 en la posición 16 en dicha secuencia, que es representada por:

VLESFKVSXaaLSALEEXaaTKKLNT (SEQ ID NO: 17 donde Xaa en la posición 9 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R)-C(O)- donde R es encadenamiento de hidrocarburos -(CH2)6-CH=CH-(CH2)3- unido a una subsecuente Xaa en la posición 16, y donde Xaa en la posición 16 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R')-C(O)- donde R' es un enlace simple unido al encadenamiento de hidrocarburos de Xaa en la posición 9 como se define anteriormente)

EFL1 lineal sin amidación:

CAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRXGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTC con X= análogo de Gln en la posición 28 (cadena lateral CH²-S-CH²- CONH²en vez de CH²-CH²-CONH²) y un enlace de lactama que se une a E en la posición 47 y K en la posición 51 en dicha secuencia, que es representada por:

CAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRXaaGLLPVLESFKVSFLSALEXaaYTKXaaLNTC (SEQ ID NO: 18 donde Xaa en la posición 28 es un análogo de Gln que tiene CH²-S-CH²-CONH²como cadena lateral, donde Xaa en la posición 47 es un aminoácido modificado de la fórmula (I): -NH-C(H)(R)-C(O)- donde R es un enlace de lactama -(CH2)2-CO-NH-(CH2)4- unido a una subsecuente Xaa en la posición 51, y donde Xaa en la posición 51 es un aminoácido modificado de la fórmula (I): -NH-C(H)(R')-C(O)- donde R' es un enlace simple unido al enlace de lactama de Xaa en la posición 47 como se define anteriormente)

F4L1 sin acetilación y amidación: SEQ ID NO: 20:

VLESFKVSFLSALEXaaYTKXaaLNT

donde Xaa en la posición 15 es un aminoácido modificado de la fórmula (I): -NH-C(H)(R)-C(O)- donde R es un enlace de lactama -(CH2)2-CO-NH-(CH2)4- unido a una subsecuente Xaa en la posición 19, y donde Xaa en la posición 19 es un aminoácido modificado de la fórmula (I): -NH-C(H)(R')-C(O)- donde R' es un enlace simple unido al enlace de lactama de Xaa en la posición 15 como se define anteriormente)

D2 (aa 141-182): SEQ ID NO: 21:

LSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALK

D2S2A: SEQ ID NO: 22:

LSPLGEEMRDRARAHXaaDALRTHXaaAPYSDELRQRLAARLEALK

donde Xaa en la posición 16 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R)-C(O)- donde R es encadenamiento de hidrocarburos -(CH2)6-CH=CH-(CH2)3- unido a una subsecuente Xaa en la posición 23, y donde Xaa en la posición 23 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R')-C(O)- donde R' es un enlace simple unido al encadenamiento de hidrocarburos de Xaa en la posición 16 como se define anteriormente)

D3: SEQ ID NO: 23:

EEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALK

D3S2A: SEQ ID NO: 24:

EEMRDRARAHXaaDALRTHXaaAPYSDELRQRLAARLEAL

donde Xaa en la posición 11 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R)-C(O)- donde R es encadenamiento de hidrocarburos -(CH2)6-CH=CH-(CH2)3- unido a una subsecuente Xaa en la posición 18, y donde Xaa en la posición 18 es una alanina modificada de la fórmula (I): -NH-C(CH3)(R')-C(O)- donde R' es un enlace simple unido al encadenamiento de hidrocarburos de Xaa en la posición 11 como se define anteriormente

F5: SEQ ID NO: 25:

QGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ

F3 desorganizado sin acetilación y amidación: SEQ ID NO: 26:

KELYLLKFTVESKVGSTELPLNFSLA

En el presente listado de secuencias Rs corresponde a (R)-2-(7'-octenil)-Alanina y S5 corresponde a (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para detectar anticuerpos anti-ApoA-I endógenos en una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero;

(b) poner dicha muestra de fluido biológico en contacto con una matriz sólida donde se acopla al menos un péptido mimético de un epítopo de apolipoproteína A-I (ApoA-I), donde dicho péptido mimético consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 15 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 16 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 17 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 19 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 20 o una variante de la misma, o SEQ ID NO: 25, donde dicha variante de péptido mimético es de una secuencia de aminoácidos idéntica a dicho péptido mimético excepto que 1, 2, 3 , 4, 5 o 6 aminoácidos de dicha secuencia son sustituidos, eliminados y/o modificados químicamente, sin abortar la capacidad de dicho péptido mimético para unirse específicamente a un anticuerpo anti-ApoA-I, donde el contacto es bajo condiciones suficientes para unir un anticuerpo anti-ApoA-I presente en dicha muestra de fluido biológico a dicho al menos un péptido mimético a través de interacciones antígenoanticuerpo, donde la secuencia de dicho al menos un péptido mimético tiene una reticulación interna entre al menos dos aminoácidos no contiguos;

(d) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo unido a dicha matriz sólida;

donde la presencia de dicho complejo es indicativa de que la muestra de fluido biológico contiene anticuerpos anti-ApoA-I endógeno.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, donde la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo es indicativa de que la muestra de fluido biológico contiene uno o más auto-anticuerpos anti-ApoA-1 asociados a enfermedades cardiovasculares.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, donde dicho sujeto padece al menos un trastorno seleccionado entre dolor de pecho agudo, síndrome coronario agudo, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, estenosis carotídea grave, enfermedad renal terminal o periodontitis.

4. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el péptido mimético en (b) se selecciona entre SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9.

5. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la reticulación interna es un puente de lactama formado entre dos aminoácidos Xaa en las posiciones ny n 4 en dicha secuencia peptídica, donde Xaa en la posición n es un aminoácido modificado de fórmula (I): -NH-C (H) (R)-C(O)- donde R es un puente de lactama -(CH2)2-CO-NH-(CH2)4- unido a un residuo posterior en la posición n 4, y donde Xaa en la posición n 4 es un aminoácido modificado de fórmula (I): -NHC(H)(R')-C(O)- donde R' es un enlace sencillo unido al puente de lactama de dicha Xaa en la posición n.

6. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la reticulación interna es un encadenamiento de hidrocarburos que une dos aminoácidos Xaa en las posiciones n y n+7 de dicha secuencia peptídica, donde Xaa en la posición n es una alanina modificada de fórmula. (I): -NH-C(CH3)(R)-C(O)- donde R es un encadenamiento de hidrocarburos -(CH2)6-CH=CH-(CH2)3- unido a una Xaa posterior en la posición n+7, y donde Xaa en la posición n+7 es una alanina modificada de fórmula (I): -NH-C(CH3)(R')- C(O)- donde R' es un enlace sencillo unido al encadenamiento de hidrocarburos de dicha Xaa en la posición n.

7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la reticulación interna es un encadenamiento de hidrocarburos que une dos aminoácidos Xaa en las posiciones n y n+4 de dicha secuencia peptídica, donde Xaa en la posición n es una alanina modificada de fórmula (I): -NH-C(CH3)(R)-C(O)- donde R es un encadenamiento de hidrocarburos -(CH2)3-CH=CH-(CH2)3- unido a una Xaa posterior en la posición n+4, y donde Xaa en la posición n+4 es una alanina modificada de fórmula (I): -NH-C(CH3)(R')-C(O) - donde R' es un enlace sencillo unido al encadenamiento de hidrocarburos de dicha Xaa en la posición n.

8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el péptido mimético tiene:

(i) una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 19 y la reticulación interna es un puente de lactama que une un ácido glutámico (E) en la posición 19 y una lisina (K) en la posición 23; o

(ii) una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 15 y la reticulación interna es un encadenamiento de hidrocarburos que une (R)-2-(7'-octenil)-Alanina en la posición 16 y (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 23; o

(iii) una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 16 y la reticulación interna es un encadenamiento de hidrocarburos que une (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 13 y (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición (iv) una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 17 y la reticulación interna es un encadenamiento de hidrocarburos que une (R)-2-(7'-octenil)-Alanina en la posición 9 y (S)-2-(4'-pentenil)-Alanina en la posición 16.

9. Un procedimiento según la reivindicación 1, donde el péptido mimético consiste en SEQ ID NO: 19.

10. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el péptido mimético tiene el grupo amino libre en el extremo N-terminal acetilado y el grupo carboxi libre en el extremo C-terminal amidado.

11. Un péptido mimético que consiste en SEQ ID NO: 19.

12. Un kit para la detección de anticuerpos anti-ApoA-I endógenos como biomarcadores de una enfermedad cardiovascular en una muestra de fluido biológico, que comprende un péptido mimético según la reivindicación 11.