ES2853351T3 - Identificación y aislamiento de células endoteliales corneales humanas (HCECs) - Google Patents

Abstract

Un método para formar una composición enriquecida con células endoteliales corneales humanas que comprende: poner en contacto una población celular que contiene células corneales humanas con un primer reactivo de afinidad positiva que se une selectivamente a células endoteliales corneales humanas en relación con las células endoteliales corneales humanas que han sufrido una transformación fibroblástica y seleccionar células a las que se une el primer reactivo de afinidad positiva, en las que dicho primer reactivo de afinidad positiva comprende un anticuerpo CD56; y que comprende además poner en contacto dicha población celular que contiene células de la córnea humana con un reactivo de afinidad adicional, en el que el reactivo de afinidad adicional es uno cualquiera de: un segundo reactivo de afinidad positiva que comprende un anticuerpo CD248; un segundo reactivo de afinidad positiva que comprende un anticuerpo del receptor del virus coxsackie y adenovirus; o un segundo reactivo de afinidad que comprende un anticuerpo CD109.

Description

DESCRIPCIÓN

identificación y aislamiento de células endoteliales corneales humanas (HCECs)

Antecedentes de la invención

Cuando la capa más interna de la córnea, el endotelio, se daña, por ejemplo, por un traumatismo (por ejemplo, por una cirugía de cataratas), una enfermedad o distrofia, la córnea se hincha con líquido (edema) y pierde su claridad óptica. En consecuencia, los pacientes sufren pérdida de visión y dolor, y su única opción para tratar la enfermedad avanzada es con cirugía de trasplante de córnea (también conocida como queratoplastia penetrante, PK) o queratoplastia endotelial con pelado de la membrana de Descemet (DSAEK), ambos procedimientos técnicamente difíciles y muy invasivos para el paciente y tienen limitaciones importantes, tales como el número de córneas de donantes disponibles.

Estudios recientes han propuesto el uso de células endoteliales corneales humanas (HCECs) obtenidas de donantes cadavéricos para reemplazar las células dañadas. Véase, por ejemplo, Joyce and Zhu, Cornea. 2004 Nov, 23 (8 Suppl): S8-S19; Engelmann et al., Exper. Eye Res., Vol. 78, no. 3, pp. 573-578, 2004. Una ventaja potencial de dicho enfoque podría ser la expansión de las HCECs ex vivo antes de la implantación en los pacientes, superando así la disponibilidad limitada de tejido. Las HCECs se pueden expandir en medios de cultivo de tejidos definidos durante al menos 5 pases, ampliando en gran medida el número de células derivadas de un solo donante.

Uno de los principales problemas con dicha técnica es que la falta de marcadores de superficie definidos específicos para las HCECs hace que sea difícil confirmar la identidad de las HCECs después de varios pases, o seleccionar las HCECs lejos de las células contaminantes, o identificar el subconjunto de HCECs que es probable que tengan la mayor eficacia clínica entre la población completa de HCECs, ya que los criterios de identificación actuales se limitan a la morfología celular y la expresión de genes funcionales, tales como ATP1A1 (véase, por ejemplo, Kaye and Tice, Invest Ophthalmol. 1966; 522-32; Leuenberger and Novikoff, J Cell Biol. 1974; 60721 - 731; McCartney et al., Curr Eye Res. 1987; 61479-1486) o el marcador de unión estrecha zonula occludens-1 (ZO-1) (véase, por ejemplo, Petroll et al., Curr Eye Res. 1999 Jan; 18 (1): 10-9), ninguno de los cuales es específico de las HCECs. También es difícil aislar las HCECs de fibroblastos contaminantes en cultivo, de células vecinas en córneas completas o de córneas residuales de DSAEK.

En este sentido, el método de aislamiento actual para obtener HCECs a partir de córneas intactas comprende un paso de despegado, en el que el endotelio y su membrana basal (membrana de Descemet) se despegan del estroma y se recogen. Véase, por ejemplo, Ko-Hua Chen et al., "Transplantation of Adult Human Corneal Endothelium Ex Vivo; A Morphologic Study", Cornea 20 (7): 731-737, 2001. Por tanto, el tejido recogido contiene HCECs, pero también puede contener queratinocitos corneales (fibroblastos especializados que residen en el estroma). Los queratinocitos corneales (también denominados en la presente memoria simplemente como "queratinocitos") son contaminantes indeseables en el cultivo de las HCECs, ya que crecen más rápido que estas últimas células y pueden apoderarse de la placa de cultivo, haciendo así el producto final esencialmente inútil. Además del tejido estromal residual, los queratinocitos también pueden surgir de células endoteliales humanas que se transforman espontáneamente en otros tipos de células tales como los queratinocitos (véase, por ejemplo, G S. L. Peh et al., "Optimization of Human Corneal Endothelial Cells for Culture: The Removal of Corneal Stromal Fibroblast Contamination Using Magnetic Cell Separation", International Journal of Biomaterials, volume 2012 (2012), article ID 601302, 8 pages). El documento de Patente WO2005/038015A1 describe un método para el aislamiento y enriquecimiento de células endoteliales corneales humanas y los usos terapéuticos de las mismas. "Stem cells of the adult cornea: From cytometric markers to therapeutic applications" de Lili Takács et al. 2009, Cytometry, Part A, vol. 75A no.1, pages 54 a 66 revisa varios tipos de células de la córnea humana adulta que tienen características similares a las células madre y combinaciones de marcadores utilizadas para identificar y enriquecer esas células. El documento de Patente EP3029140A1 describe paneles de marcadores para la identificación y enriquecimiento de células endoteliales corneales humanas. "Novel Identity and Functional Markers for Human Corneal Endothelial Cells" de Alena Bartakova et al. 2016, Investigative Ophthalmology and Visual Science, vol. 57, no 6, page 2749 describe una serie de marcadores indicativos de un cambio en las HCECs humanas cultivadas de morfología canónica a fibroblástica. El documento de Patente WO2013/012087A1 describe un método para preparar un cultivo celular progenitor endotelial corneal. "CD marker expression profiles of human embryonic stem cells and their neural derivatives, determined using flow-cytometric analysis, reveal a novel CD marker for exclusión of pluripotent stem cells" de Sundberg M et al. 2009, vol. 2, no. 2, pages 113 to 124 describe que los derivados neurales de las hESCs tienen altos niveles de los marcadores CD90, CD56 y CD166.

Compendio de la invención

Algunos aspectos de la invención están dirigidos a métodos para la identificación, enriquecimiento y/o aislamiento de células endoteliales corneales humanas (HCECs).

En algunas realizaciones, se emplean dos o más reactivos de afinidad positiva diferentes que se unen a las HCECs pero que no se unen a células distintas de las HCECs.

Como se define en la presente memoria, "células distintas de las células endoteliales corneales humanas" (o "células distintas de las HCECs") incluyen queratinocitos corneales así como HCECs de menor utilidad (por ejemplo, HCECs que han sufrido una transformación fibroblástica o mesenquimal, etc.).

En algunas realizaciones, el método comprende tanto (a) selección positiva usando uno o más agentes de reactivos de afinidad como (b) selección negativa usando uno o más reactivos de afinidad negativa.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para formar una composición enriquecida con células endoteliales corneales humanas como se reivindica en la reivindicación 1.

Además, el primer reactivo de afinidad positiva se puede acoplar a un marcador, en el que el segundo reactivo de afinidad positiva se puede acoplar a un marcador y en el que el segundo reactivo de afinidad se puede acoplar a un marcador.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un kit como se reivindica en la reivindicación 3. Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición enriquecida con células endoteliales corneales humanas como se reivindica en la reivindicación 4.

Estos y varios aspectos y realizaciones distintas, así como diversas ventajas de la presente invención, resultarán inmediatamente evidentes para los expertos en la técnica tras la revisión de la Descripción detallada y las reivindicaciones adjuntas que siguen.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1C son micrografías de campo brillante de HCECs y queratinocitos en cultivo.

La Figura 2 ilustra en forma de gráfico de barras la expresión de cuatro marcadores de superficie en diferentes poblaciones de células de la córnea analizadas por citometría de flujo.

Las Figuras 3A-3C son histogramas de fluorescencia de dos colores de HCECs y queratinocitos.

La Figura 4 presenta perfiles de fluorescencia que ilustran la expresión de cuatro marcadores de superficie en tres poblaciones de HCECs diferentes analizadas por citometría de flujo.

La Figura 5 ilustra en forma de gráfico de barras la expresión de cuatro marcadores de superficie en tres poblaciones de HCECs diferentes analizadas por citometría de flujo.

La Figura 6 ilustra histogramas de fluorescencia de dos colores para varios pares de marcadores de superficie en tres poblaciones de HCECs diferentes.

La Figura 7 ilustra la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) en función del tiempo para cultivos celulares de tres poblaciones de HCECs diferentes.

Descripción detallada

Está disponible una comprensión más completa de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada de numerosos aspectos y realizaciones de la invención. La descripción detallada de la invención que sigue está destinada a ilustrar, pero no limitar la invención.

Como se señaló anteriormente, en algunos aspectos, la presente divulgación, no según la presente invención, se refiere a procesos de selección positiva en los que las poblaciones de células que contienen células de la córnea humana se ponen en contacto con uno o más reactivos de afinidad positiva que se unen selectivamente a las HCECs en relación con las células distintas de las HCECs (por ejemplo, queratinocitos corneales, etc.), incluyendo los reactivos de afinidad positiva que se unen selectivamente a las HCECs que probablemente tengan una mayor eficacia clínica en relación con la población general de HCECs.

En otros aspectos, no según la presente invención, la divulgación se refiere a procesos de selección negativa en los que las poblaciones de células que contienen células corneales humanas se ponen en contacto con uno o más reactivos de afinidad negativa que se unen selectivamente a células distintas de las HCECs (por ejemplo, queratinocitos corneales, etc.) en relación con las HCECs.

Estos métodos de selección negativa y positiva se pueden utilizar de forma independiente o en combinación entre sí, por ejemplo, para identificar HCECs, aislar HCECs y/o enriquecer poblaciones celulares con HCECs, entre otros usos. Las poblaciones de células adecuadas para el enriquecimiento o aislamiento de HCEC incluyen las obtenidas de córneas humanas intactas o residuales, que pueden provenir, por ejemplo, de tejido embrionario, fetal, pediátrico o adulto. Por ejemplo, las córneas intactas pueden someterse a una etapa de despegado en la que el endotelio y su membrana basal (membrana de Descemet) se despegan del estroma y se recogen. Véase Ko-Hua Chen et al., "Transplantation of Adult Human Corneal Endothelium Ex Vivo: A Morphologic Study", Cornea 20 (7): 731-737, 2001.

En otras realizaciones, las poblaciones de células pueden obtenerse de córneas residuales (por ejemplo, tejido ocular que queda después de que se ha utilizado un botón corneal para DSAEK).

El tejido de las córneas intactas y residuales puede separarse en células individuales mediante procesos tales como la disociación enzimática y/o mecánica. En esta etapa, las células se incuban durante un período de tiempo a temperatura ambiente o a 37°C con una sola enzima o una combinación de enzimas que incluye algunas de las siguientes: colagenasa, papaína, dispasa, elastasa, tripsina/EDTA y/o DNAsa. Posteriormente, los tejidos se disocian mecánicamente usando una pipeta convencional o una pipeta de vidrio para obtener células individuales o grupos de células que luego se pueden expandir en cultivo. Véase, por ejemplo, Li W. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 2007; 48: 614; Ishino Y. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 2004; 45: 800; Chen K.H. et al., Cornea 2001; 20: 731.

El medio en el que se pueden suspender las células será cualquier medio que mantenga la viabilidad de las HCECs. Varios medios están disponibles comercialmente y pueden usarse, incluyendo el medio esencial mínimo (MEM), el medio de cultivo Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Opti-MEM®, el medio 199 o M199, el medio de cultivo Eagle modificado de Dulbecco con mezcla de nutriente F-12 (d Me M/F-12), F99 Ham's F12, SHEM Ham's F12, medio de crecimiento endotelial EGM-2 frecuentemente suplementado con suero de origen humano o animal, BSA, HSA, factores de crecimiento, antioxidantes, antibióticos, agentes antimicóticos, hormonas, aminoácidos y péptidos. En la siguiente Tabla 1 se muestran ejemplos específicos de medios.

Tabla 1.

Los cultivos celulares de córneas intactas y residuales contienen células contaminantes no deseadas que surgen de tejido no endotelial residual (por ejemplo, estroma, epitelio, etc.) que pueden estar presentes en la muestra. En un cultivo de las HCECs, las HCECs que son de baja utilidad para el trasplante de células en comparación con otras HCECs de alta utilidad para el trasplante de células también pueden considerarse, de alguna manera, "contaminantes".

Las poblaciones de células adecuadas para el enriquecimiento o aislamiento de HCEC también incluyen cultivos de HCEC en los que las células contaminantes se han multiplicado por encima de las HCECs o en las que las HCECs se han transformado espontáneamente en otros tipos de células (por ejemplo, queratinocitos, etc.). Como se señaló anteriormente, las células contaminantes tales como los queratinocitos son particularmente indeseables cuando se desea expandir un cultivo de HCEC ex vivo, porque tales células crecen más rápido que las HCECs y, por lo tanto, pueden asumir el control de un cultivo celular.

En consecuencia, varios aspectos, no según la presente invención, se refieren a métodos, reactivos y kits para la separación de HCECs de otras células, particularmente, queratinocitos y/o HCECs de menor utilidad. Las HCECs se separan de las mezclas de células mediante técnicas que seleccionan las células que tienen características particulares.

Las células endoteliales corneales humanas pueden identificarse o seleccionarse (a) a través de marcadores celulares positivos, que son marcadores celulares que se encuentran en las superficies de las HCECs pero que no se encuentran en las superficies de las células contaminantes que pueden estar entremezcladas con las HCECs (por ejemplo, selección positiva ), (b) a través de marcadores celulares negativos, que son marcadores celulares que se encuentran en la superficie de las células contaminantes que se entremezclan con las HCECs y que no se encuentran en las superficies de las HCECs (por ejemplo, selección negativa), y mediante una combinación de marcadores celulares positivos y negativos. En otras palabras, las células endoteliales corneales humanas pueden identificarse o seleccionarse mediante un primer reactivo de afinidad positiva y un segundo reactivo de afinidad.

Por ejemplo, en el caso de que se utilicen córneas humanas enteras como fuente de células endoteliales, los marcadores celulares positivos pueden seleccionarse de las proteínas corneales que se encuentran en el endotelio (que se forma a partir de las HCECs) pero que no se encuentran en otro tejido corneal (es decir, el estroma y/o el epitelio). Por el contrario, los marcadores celulares negativos pueden seleccionarse de proteínas corneales que se encuentran en el tejido corneal distinto del tejido del endotelio (es decir, el estroma y/o el epitelio) pero que no se encuentran en el endotelio corneal.

Como otro ejemplo, en el caso en el que la fuente de células endoteliales es un endotelio y una membrana basal que se han separado del estroma y del epitelio de una córnea intacta, los marcadores celulares positivos pueden seleccionarse de las proteínas de las células corneales que se encuentran en el endotelio pero que no se encuentran en el estroma, mientras que los marcadores celulares negativos pueden seleccionarse de proteínas de células corneales que se encuentran en el estroma pero que no se encuentran en el endotelio corneal.

Las proteínas de la córnea que pueden ser útiles como marcadores celulares junto con la presente invención incluyen las proteínas adecuadas seleccionadas de las presentadas en la Tabla 2 establecida en el Apéndice A.

Los marcadores celulares positivos incluyen proteínas corneales adecuadas seleccionadas de productos proteicos de los genes X1-X26 en la Tabla 2 (por ejemplo, SEQ ID NO (1) a SEQ ID NO (58)) que están presentes en el endotelio corneal pero no están presentes en el estroma o el epitelio.

Los marcadores celulares negativos incluyen (a) proteínas corneales adecuadas seleccionadas de productos proteicos de los genes Y1-Y23 en la Tabla 2 (por ejemplo, SEQ ID NO (59) a SEQ ID NO (96)), que están presentes en el estroma y en el epitelio pero no están presentes en el endotelio y (b) proteínas corneales adecuadas seleccionadas de productos proteicos de los genes Z1-Z8 en la Tabla 2 (por ejemplo, SEQ ID NO (97) a SEQ ID NO (109)), que están presentes en el estroma pero no están presentes en el endotelio (o epitelio) de la córnea.

Como se señaló anteriormente, en algunos aspectos, no según la presente invención, la divulgación se refiere a (a) procesos de selección positiva en los que las poblaciones de células que contienen células corneales humanas se ponen en contacto con uno, dos, tres, cuatro o más reactivos de afinidad positiva que se unen selectivamente a las HCECs en relación con las células distintas de las HCECs (p. ej., queratinocitos corneales, etc.), (b) procesos de selección negativa en los que las poblaciones celulares que contienen células corneales humanas se ponen en contacto con uno, dos, tres, cuatro o más reactivos de afinidad negativa que se unen selectivamente a células distintas de las HCECs (por ejemplo, queratinocitos corneales, etc.) en relación con las HCECs, y (c) combinaciones de (a) y (b).

Para este fin, se emplean reactivos de afinidad que se unen preferentemente a diversas proteínas de la córnea. Los reactivos de afinidad positiva son aquellos que se unen preferentemente a marcadores celulares positivos asociados con las HCECs, mientras que los reactivos de afinidad negativa son aquellos que se unen preferentemente a marcadores celulares negativos asociados con células contaminantes distintas de las HCECs.

Varios marcadores celulares positivos se describen anteriormente e incluyen proteínas corneales que se encuentran en el endotelio (que se forma a partir de HCECs) pero que no se encuentran en otro tejido corneal (es decir, el estroma y/o el epitelio). También se han descrito anteriormente varios marcadores celulares negativos e incluyen proteínas corneales que se encuentran en tejido corneal distinto del endotelio (es decir, el estroma y/o el epitelio) pero que no se encuentran en el endotelio corneal.

Los expertos en la técnica reconocerán que los reactivos de afinidad positiva y negativa adecuados se pueden emplear en cualquier orden y/o en cualquier combinación.

Los reactivos de afinidad adecuados para su uso en la presente divulgación pueden comprender cualquier especie que se una selectivamente a un marcador de superficie dado, incluyendo reactivos de afinidad positiva que se unen selectivamente a marcadores celulares positivos y reactivos de afinidad negativa que se unen selectivamente a marcadores celulares negativos.

Los reactivos de afinidad especialmente útiles para la práctica de la invención son anticuerpos (también denominados en la presente memoria "anticuerpos de afinidad"), aptámeros de ácido nucleico y otras formas modificadas genéticamente de estructuras proteicas. Los anticuerpos incluyen anticuerpos completos y fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, Fab, F(ab')² , fragmentos de cadenas ligeras o pesadas, etc.

Los anticuerpos de afinidad seleccionados para su uso tendrán un bajo nivel de interacciones no específicas.

Los anticuerpos de afinidad pueden ser policlonales o monoclonales y, cuando no estén disponibles comercialmente, pueden producirse fácilmente mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

Por ejemplo, pueden obtenerse anticuerpos de afinidad para una proteína corneal dada inmunizando un huésped mamífero inmunocompetente xenogénico (incluyendo murino, roedor, lagomorfos, ovino, porcino, bovino, etc.) con la proteína corneal de interés. Las inmunizaciones se realizan según las técnicas convencionales, en las que las proteínas de la córnea se pueden inyectar por vía subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravascular, etc., durante el curso de una o más inyecciones. Una vez completado el programa de inmunización, el antisuero se puede recolectar según los métodos convencionales para proporcionar antisueros poligonales específicos para la proteína corneal de interés. Los linfocitos también se pueden recolectar del tejido linfoide apropiado, por ejemplo, bazo, ganglio linfático de drenaje, etc., y fusionar con una pareja de fusión apropiada, por ejemplo, una línea de mieloma, produciendo un hibridoma que secreta un anticuerpo monoclonal específico. La selección de clones de hibridomas para la especificidad antigénica de interés se realiza según los métodos convencionales.

En numerosas realizaciones, los anticuerpos de afinidad se acoplan a un sustrato adecuado, por ejemplo, un marcador o una matriz sólida. Los marcadores incluyen marcadores magnéticos tales como perlas magnéticas o micropartículas o nanopartículas, incluyendo nanopartículas superparamagnéticas, que permiten una fácil separación. Los marcadores también incluyen biotina, que se une con gran afinidad a la avidina o la estreptavidina. Los marcadores incluyen además fluorocromos, que se pueden usar con citometría de flujo, por ejemplo, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), o similares, para permitir una fácil separación de un tipo de célula particular. Los clasificadores de células activados por fluorescencia tienen diversos grados de sofisticación, tal como múltiples canales de color, canales de detección de dispersión de luz de ángulo bajo y obtuso, tales como canales de impedancia, etc. Los fluorocromos incluyen ficobiliproteínas, por ejemplo, ficoeritrina y aloficocianinas, fluoresceína y rojo Texas, cy7 y cy5, entre otros. Múltiples anticuerpos, cada uno con afinidad por una proteína corneal particular, pueden marcarse cada uno con un fluorocromo diferente, para permitir la clasificación independiente (análisis multicolor) para cada proteína celular asociada.

La selección de células también se puede lograr mediante el método "panning" con un anticuerpo de afinidad unido a una matriz sólida, por ejemplo una placa, una perla inmovilizada, etc. Por ejemplo, un anticuerpo de afinidad que tiene especificidad por una proteína corneal particular puede unirse a una matriz sólida y las células corneales que muestran esa proteína corneal particular pueden ser capturadas por el anticuerpo inmovilizado mientras que las otras células permanecen en suspensión y pueden eliminarse.

Puede emplearse cualquier técnica de clasificación que no sea excesivamente perjudicial para la viabilidad de las células seleccionadas. Se pueden usar combinaciones de las técnicas anteriores.

El método preciso para acoplar un anticuerpo a un sustrato dado (por ejemplo, un marcador, una matriz sólida, etc.) no es crítico para la práctica de la presente divulgación, y se conocen varias alternativas en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos de afinidad pueden acoplarse directa o indirectamente a un sustrato. El acoplamiento directo a un sustrato se puede lograr mediante el uso de varios grupos de enlace químicos, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo puede acoplarse a un sustrato a través de grupos amino o sulfhidrilo de una cadena lateral y reactivos de reticulación heterofuncionales. Hay muchos compuestos heterofuncionales disponibles para unirse a diversas entidades. Los ejemplos específicos incluyen éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridilditio) propiónico (SPDP) o éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1 -carboxílico (SMCC), que puede reaccionar con un grupo sulfhidrilo reactivo sobre el anticuerpo y un grupo amino reactivo sobre el sustrato.

Alternativamente, los anticuerpos de afinidad pueden acoplarse indirectamente a un sustrato mediante un hapteno o un anticuerpo secundario, no según la presente invención. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse directamente con un hapteno y las especies de unión específicas de hapteno pueden conjugarse con el sustrato. Los haptenos adecuados incluyen digoxina, digoxigenina, FITC, dinitrofenilo, nitrofenilo, avidina, estreptavidina, biotina, etc. Por ejemplo, un anticuerpo puede acoplarse a un miembro de un sistema de unión de alta afinidad (por ejemplo, biotina) y a otro miembro de un sistema de unión de alta afinidad (por ejemplo, avidina) unido a un sustrato. Los métodos para la conjugación de un hapteno a una proteína se conocen en la técnica y los kits para tales conjugaciones están disponibles comercialmente. El anticuerpo secundario puede unirse directa o indirectamente al sustrato.

Durante la separación celular, los anticuerpos acoplados pueden combinarse con una suspensión de células e incubarse durante un período de tiempo suficiente para que los anticuerpos se unan a las proteínas de las células. La cantidad de anticuerpo necesaria para unirse a un subconjunto de células en particular puede determinarse empíricamente realizando una separación y un análisis de prueba. Las células y los anticuerpos se incuban durante un período de tiempo suficiente para que se produzca la unión.

El medio en el que se separan las células será cualquier medio que mantenga la viabilidad de las células. Hay varios medios disponibles comercialmente e incluyen los enumerados anteriormente.

Los anticuerpos de afinidad acoplados incluyen anticuerpos de afinidad positiva acoplados específicos para las proteínas de la córnea que están presentes en las células endoteliales de la córnea humana y que no están presentes en las células contaminantes tales como las células del estroma y/o epiteliales (para la selección positiva) y los anticuerpos de afinidad negativa acoplados específicos para las proteínas de la córnea que están presentes en células contaminantes tales como células del estroma y/o epiteliales y que no están presentes en células endoteliales corneales humanas (selección negativa).

Una vez que el anticuerpo se une a la célula, las células unidas se separan según la preparación del anticuerpo específico. Por ejemplo, la separación por FACS puede usarse con anticuerpos marcados con fluorocromo, la selección inmunomagnética puede usarse con anticuerpos marcados magnéticamente, el método ''panning'' puede usarse con anticuerpos inmovilizados, y así sucesivamente.

Las células se pueden separar de los anticuerpos de afinidad usando técnicas conocidas, según se desee. Como ejemplo específico, cuando un anticuerpo en un proceso de inmunoselección mediante el método “panning” es un anticuerpo de selección positiva, la matriz con células endoteliales unidas se puede lavar para eliminar las células no unidas y las células endoteliales se liberan utilizando una técnica adecuada (por ejemplo, digestión con tripsina).

Si bien en la presente memoria se describen específicamente varias realizaciones específicas que emplean anticuerpos como reactivos de afinidad, debe entenderse que se pueden usar otros reactivos de afinidad para unir marcadores celulares positivos o negativos de la misma manera, incluyendo aptámeros de ácido nucleico y otras formas modificadas genéticamente de estructuras proteicas. Los aptámeros son oligonucleótidos sintéticos seleccionados de grupos de oligonucleótidos de secuencia aleatoria que se unen a una amplia gama de dianas biomoleculares con alta afinidad y especificidad. Véase, por ejemplo, J. Wang and G. Li, "Aptamers against cell Surface receptors: selection, modification and application", Curr Med Chem. 2011; 18 (27): 4107-16.

Las células separadas se pueden recoger en cualquier medio apropiado que mantenga la viabilidad de las células.

Por tanto, se pueden conseguir poblaciones de células enriquecidas con HCECs de esta manera. La población de HCEC puede constituir el 50% o más de las células en la composición celular, preferiblemente en el 75% o más de las células en la composición celular, más preferiblemente en el 90% o más de las células en la composición celular, y puede ser como hasta el 95% o más (por ejemplo, sustancialmente puras) de las células en la población celular. Por el contrario, las poblaciones de células pueden contener hasta un 50% de células distintas de las HCECs (por ejemplo, queratinocitos corneales, etc.), por ejemplo, 50% o menos de dichas células, preferiblemente 25% o menos de dichas células, más preferiblemente 10% o menos de dichas células, y puede ser tan poco como un 5% o menos de dichas células.

La población de células enriquecidas puede usarse inmediatamente o almacenarse. Por ejemplo, a temperatura ambiente, a 4°C, a 37°C o las células pueden congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse durante largos períodos de tiempo.

En determinadas realizaciones, no según la presente invención, las células enriquecidas pueden expandirse además in vitro añadiendo medios de cultivo como se describe ampliamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Li W et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 2007; 48: 614.; Ishino Y et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 2004; 45: 800; Chen KH et al., Cornea 2001; 20: 731.

Las composiciones de HCEC enriquecidas así obtenidas tienen una variedad de usos con fines de terapia clínica, investigación, desarrollo y comerciales.

Por ejemplo, con fines terapéuticos, las células endoteliales corneales humanas se pueden administrar ocularmente al ojo de un paciente para tratar la pérdida o disfunción de las células endoteliales corneales.

Otros aspectos, no según la presente invención, se refieren a kits para realizar las separaciones de células como se describe en la presente memoria. Dichos kits pueden incluir cualquier combinación de los siguientes, entre otros elementos: (a) uno, dos, tres o más reactivos de afinidad positiva, cada uno de los cuales puede estar, por ejemplo, en forma de un anticuerpo de afinidad positiva unido a un sustrato adecuado tal como una matriz sólida (por ejemplo, una placa, una perla inmovilizada, etc.) o un marcador (por ejemplo, un marcador magnético, un marcador fluorescente, etc.), (b) uno, dos, tres o más anticuerpos de afinidad positiva sin marcar, que el usuario final podría marcar utilizando métodos estándar, eligiendo sus marcadores preferidos (por ejemplo, fluoróforos, haptenos, etc.), (c) uno, dos, tres o más reactivos de afinidad negativa, cada uno de los cuales puede estar, por ejemplo, en forma de un n anticuerpo de afinidad negativa unido a un sustrato adecuado, tal como una matriz sólida (por ejemplo, una placa, una perla inmovilizada, etc.) o un marcador (por ejemplo, un marcador magnético, un marcador fluorescente, etc.), (d) o uno, dos, tres o más anticuerpos de afinidad negativa sin marcar, que el usuario final podría marcar utilizando métodos estándar, eligiendo sus marcadores preferidos (por ejemplo, fluoróforos, haptenos, etc.); (e) una combinación de (a) y (c); (f) una combinación de (b) y (d); (g) empaquetamiento; (h) materiales impresos con uno o más de los siguientes: (i) información de almacenamiento e (ii) instrucciones sobre cómo utilizar los materiales contenidos en el kit (por ejemplo, reactivos de afinidad positiva, reactivos de afinidad negativa, una combinación de anticuerpos para su uso secuencial, etc.).

EJEMPLO 1

Las HCECs se aislaron de córneas de donantes cadavéricos (Tampa Lions Eye Bank) y se cultivaron y expandieron siguiendo el método descrito por Joyce y Zhu en Cornea. 2004 Nov; 23 (8 Suppl): S8-S19. Brevemente, el endotelio y la membrana de Descemet se despegaron del estroma y después de la estabilización durante la noche a 37°C en medio Opti-MEM® (Gibco, Life Technologies Corp, Carlsbad, CA), suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 8%, se incubaron durante 1 hora a 37°C con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para aflojar las interacciones célulacélula. A continuación, las células se disociaron mecánicamente para obtener una suspensión unicelular, se sembraron en pocillos de cultivo recubiertos con FNC y se marcaron como "P0" (pase cero). Después de alcanzar la confluencia, se tripsinizaron y expandieron aún más en más pocillos para aumentar su número. Después de una o dos rondas de expansión, las células se recogieron y se incubaron con diferentes anticuerpos como se indica a continuación. También se obtuvieron queratinocitos corneales de donantes cadavéricos utilizando el método descrito por Stramer et al. en ''Monoclonal antibody (3G5)-defined ganglioside: cell Surface marker of corneal Keratocytes", Invest. Oftalmol. Vis. Sci. 2004 vol. 45 no. 3807-812. Mientras que uno de los cultivos de HCEC conservó su morfología típica de adoquines en el paso 2 (Fig. 1A), un segundo cultivo experimentó una transición endotelial a mesenquimal durante el paso 3 (P3) y las células se volvieron fibroblásticas (Fig. 1B). Dichas células se denominan generalmente en la presente memoria como células endoteliales corneales humanas de menor utilidad (por ejemplo, HCECs que han sufrido una transformación fibroblástica o mesenquimal, etc.). El cultivo de queratinocitos, no según la presente invención, muestra la morfología celular alargada fibroblástica típica (Fig. 1C).

Las HCECs de cada cultivo y los queratinocitos, no según la presente invención, se recogieron e incubaron con uno o más de los siguientes anticuerpos marcados: (a) APC-CD56 que es un anticuerpo monoclonal de ratón frente a un producto proteico del gen X15 de la Tabla 2 (denominado en la presente memoria como proteína de superficie CD56) acoplada a aloficocianina (BD Biosciences, # 555518), (b) PE-CD166, no según la presente invención, que es un anticuerpo monoclonal de ratón frente a un producto proteico del gen X1 de Tabla 2 (denominado aquí como proteína de superficie CD166) acoplada a ficoeritina (BD Biosciences # 559263), (c) FITC-CAR, que es un anticuerpo monoclonal de ratón frente a un producto proteico del gen X25 de la Tabla 2 (denominado como proteína de superficie CAR) acoplado a fluoresceína-5-isotiocianato (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA #sc-56892) y (d) PECy7-CD90, no según la presente invención, que es un anticuerpo monoclonal de ratón frente a un producto protéico del gen Z8 de la Tabla 2 (denominado como proteína de superficie CD90) acoplado a un conjugado en tándem de PE (donante de energía) que tiene una longitud de onda de excitación de 565 nm y Cy7 (aceptor de energía) que tiene una longitud de onda de emisión de 778 nm) (BD Biosciences # 561558).

La expresión de los marcadores de superficie se analizó usando un sistema de citometría de flujo BD LSR™ II (BD Biosciences, San José, CA). Los datos que se muestran en la Figura 2 son representativos de un experimento. Se obtuvieron resultados similares tras repetidos experimentos. La cuantificación del % de células positivas para cada marcador muestra que en cultivos fibroblásticos hay una expresión disminuida de CD56 y CAR, lo que indica que los anticuerpos para estas proteínas pueden usarse junto con reactivos de afinidad positiva para HCECs "buenas". No se detectó una diferencia significativa en la expresión de CD166 o CD90 usando este anticuerpo en particular.

Las Figuras 3A-3C son gráficos de puntos de fluorescencia de dos colores de las HCECs y los queratinocitos. Estos gráficos de puntos muestran la expresión diferencial de dos marcadores de superficie en cada población celular según el marcador. El porcentaje de células positivas para un marcador individual se muestra en la Figura 2.

EJEMPLO 2

Las HCECs se aislaron de córneas de donantes cadavéricos como se describe en el Ejemplo 1. También como se discutió en el Ejemplo 1, se obtuvieron cultivos de HCEC (a) que evidenciaron una morfología típica de adoquines (referida en este Ejemplo 2 como un cultivo celular "canónico"), (b) donde todas las células habían experimentado una transición endotelial a mesenquimal (referido en este ejemplo como un cultivo celular "fibroblástico") y (c) donde algunas HCECs habían experimentado una transición endotelial a mesenquimal (referido en este ejemplo como cultivo celular "mixto").

Los marcadores de superficie de HCEC se identificaron mediante datos de micro-matrices, y se seleccionaron varios con alta expresión en el endotelio (cultivado y recién diseccionado) pero baja expresión en el estroma para probarlos mediante el análisis de citometría de flujo. Además de APC-CD56, PE-CD166 no según la presente invención, FITC-CAR y PECy7-CD90 no según la presente invención, descritos en el Ejemplo 1, también se probaron (e) CD109-PE, (es decir , anti-CD109 de ratón), que es un anticuerpo monoclonal frente a un producto proteico del gen Y6 de la Tabla 2 (denominado como antígeno CD109) conjugado con ficoeritrina (PE), BD Biosciences Cat # 556040 y (f) CD 248-BV, (es decir, anti-Endosialina de ratón), que es un anticuerpo monoclonal no conjugado frente a un producto proteico del gen X5 de la Tabla 2 (denominado como antígeno CD248 o Endosialina), (Millipore, Temecula, CA, USA, Cat # MAB2626), incubado con anticuerpo secundario policlonal de cabra de igG anti-ratón conjugado con Brilliant Violent 421 (Biolegend, Inc., San Diego, CA, USA., n° de cat. 405317).

Para determinar si la expresión de esos marcadores en las HCECs se vio afectada por la conversión fibroblástica descrita anteriormente, se inmunoteñieron cultivos de HCEC que demostraban dos morfologías diferentes (canónica y fibroblástica) y un cultivo de queratinocitos corneales como un control para las proteínas de superficie CD90 no según la presente invención, CAR, CD56 y CD166 (véase el Ejemplo 1, Figura 2). La expresión de CD56, CAR, CD109 y CD248 también se comparó entre las HCECs canónicas (buenas), mixtas y fibroblásticas (véanse las Figuras 4 y 5). El análisis del porcentaje de células que expresan uno cualquiera de los marcadores individuales en cultivos canónicos y fibroblásticos demostró que la expresión de CD56, CAR y CD248 se redujo en el cultivo fibroblástico (véase Figura 5), mientras que CD109 se elevó (véase Figura 5); la expresión de CD90 no según la presente invención, y la expresión de CD166 no cambió significativamente entre cultivos buenos/canónicos y fibroblásticos (véase Ejemplo 1, Fig. 2). Se observó una tendencia comparable en el cultivo de queratinocitos utilizado como control para la expresión de CD90, CAR, CD56 y CD166 (véase el Ejemplo 1, Figura 2).

Los histogramas duales de diagrama de puntos de cultivos canónicos, mixtos y fibroblásticos mostrados en la Figura 6 demostraron que las HCECs canónicas son predominantemente positivas para CD56, CD248 y CAR, y negativas para CD109; la expresión de CD56 y CD248 se pierde y la expresión de CD109 aumenta a medida que el cultivo se vuelve fibroblástico.

Finalmente, se midió la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) de cultivos celulares. Las HCECs (a) de cultivos "buenos" o "canónicos" que expresaban altos niveles de CD56, (b) de cultivos mixtos y (c) de cultivos fibroblásticos se sembraron en inserciones con poros de 0,4 mm en placas de cultivo de 24 pocillos (Transwell, Corning Costar, Acton, MA) a una densidad de 20000 células/inserción y se incubó en medio de crecimiento como se describe en el Ejemplo 1. Se midió la TEER usando un voltímetro EVOM con electrodo STX2 (World Precision Instrument, Inc., Sarasota, FL) hasta 65 días después de la siembra inicial. La TEER mide la resistencia de la membrana plasmática apical y basal y la resistencia paracelular y se utiliza como índice de integridad de confluencia de monocapa de uniones estrechas. Para calcular la resistencia final (Q ■ cm2), se restó la resistencia de los filtros en blanco de la de los filtros con células. Se promediaron cuatro pocillos por condición. Las HCECs que muestran una morfología canónica y que son positivas para CD56 demostraron una capacidad superior de formación de barrera medida por TEER (Figura 7).

Por lo tanto, hemos identificado un panel de marcadores de superficie que pueden usarse para caracterizar un cultivo de HCEC canónico y funcionalmente superior, y pueden usarse como criterios de control de calidad o para separar potencialmente las mejores subpoblaciones de HCEC para la expansión.

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un método para formar una composición enriquecida con células endoteliales corneales humanas que comprende: poner en contacto una población celular que contiene células corneales humanas con un primer reactivo de afinidad positiva que se une selectivamente a células endoteliales corneales humanas en relación con las células endoteliales corneales humanas que han sufrido una transformación fibroblástica y seleccionar células a las que se une el primer reactivo de afinidad positiva, en las que dicho primer reactivo de afinidad positiva comprende un anticuerpo CD56; y que comprende además poner en contacto dicha población celular que contiene células de la córnea humana con un reactivo de afinidad adicional, en el que el reactivo de afinidad adicional es uno cualquiera de: un segundo reactivo de afinidad positiva que comprende un anticuerpo CD248; un segundo reactivo de afinidad positiva que comprende un anticuerpo del receptor del virus coxsackie y adenovirus; o un segundo reactivo de afinidad que comprende un anticuerpo CD109.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el primer reactivo de afinidad positiva se acopla a un marcador, en el que el segundo reactivo de afinidad positiva se acopla a un marcador y en el que el segundo reactivo de afinidad se acopla a un marcador.

3. Un kit que comprende (a) un reactivo de afinidad positiva que se une selectivamente a células endoteliales corneales humanas en relación con células endoteliales corneales humanas que han sufrido una transformación fibroblástica, en el que dicho reactivo de afinidad positiva comprende un anticuerpo CD56 y (b) un reactivo de afinidad adicional, en el que el reactivo de afinidad adicional es uno cualquiera de: un segundo reactivo de afinidad positiva que comprende un anticuerpo CD248; un segundo reactivo de afinidad positiva que comprende un anticuerpo del receptor del virus coxsackie y adenovirus; o un segundo reactivo de afinidad que comprende un anticuerpo CD109.

4. Una composición enriquecida con células endoteliales corneales humanas que comprende: (a) células corneales humanas; (b) un primer reactivo de afinidad positiva que se une selectivamente a células endoteliales corneales humanas en relación con células endoteliales corneales humanas que han sufrido una transformación fibroblástica, en el que dicho primer reactivo de afinidad positiva comprende un anticuerpo CD56; y (c) un reactivo de afinidad adicional, en el que el reactivo de afinidad adicional es uno cualquiera de: un segundo reactivo de afinidad positiva que comprende un anticuerpo CD248; un segundo reactivo de afinidad positiva que comprende un anticuerpo del receptor del virus coxsackie y adenovirus; o un segundo reactivo de afinidad que comprende un anticuerpo CD109.