CN112980768A - 一种新型肝成纤维细胞株的建立方法 - Google Patents
一种新型肝成纤维细胞株的建立方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及结肠癌肝转移发生机制研究的技术领域，特别是涉及一种新型肝成纤维细胞株的建立方法，本发明提供了来源于同一结肠癌肝转移患者的肝肿瘤相关成纤维细胞和肝正常成纤维细胞，用于结肠癌肝转移的发生发展机制的研究，既能够相互配对，又能排除因个体差异引起的组织异质性；包括以下步骤：S1、无菌培养基准备；S2、分离组织；S3、组织清洗；S4、组织处理；S5、组织培养；S6、鉴定细胞株；S7、细胞株命名，本方法客观性强、直观性强、快速、准确，能够为结肠癌患者肝转移的发生、进展的基础研究提供新型的细胞模型。
Description
技术领域
本发明涉及结肠癌肝转移发生机制研究的技术领域，具体涉及一种新型肝成纤维细胞株的建立方法。
背景技术
遗传和细胞生物学研究表明，肿瘤生长不仅仅是由肿瘤细胞决定的，也由肿瘤基质决定。肿瘤相关成纤维细胞，是多种肿瘤基质成分中最主要的细胞类型，也是肿瘤生长和进展的重要促进因子[1.Mueller MM,Fusenig NE.Friends or foes-bipolar effects ofthe tumour stroma in cancer.Nature reviews Cancer,2004,4,(11):839-849.；2.Tlsty TD,Hein PW.Know thy neighbor:stromal cells can contribute oncogenicsignals.Current opinion in genetics&development,2001,11,(1):54-59.]。例如，在小鼠体内建立来自人乳腺癌细胞的移植瘤模型依赖于人肿瘤源性成纤维细胞的存在[3.Kuperwasser C,Chavarria,Wu M,Magrane G,Gray JW,Carey L,Richardson A,Weinberg RA.Reconstruction of functionally normal and malignant human breasttissues in mice.Proceedings ofthe National Academy of Sciences ofthe UnitedStates ofAmerica,2004,101,(14):4966-4971.]。在肿瘤的研究领域中，成纤维细胞已成为肿瘤生长、侵袭和转移等研究内容的要素。肿瘤的类型复杂，成纤维细胞的建立和组织来源问题也受到了更多的关注。因此，选择合理的成纤维细胞株组织来源，快速建立纯度高的成纤维细胞株显得尤为重要。
成纤维细胞是结缔组织中的非血管、非上皮和非炎症细胞的一种外形上呈现纺锤形或纺锤形的细胞。一方面，它们能合成纤原性细胞外基质(ECM)的成分，如I型、III型和V型胶原和纤维连接蛋白，还可以分泌IV型胶原和层粘连蛋白促进基底膜的形成[5.TomasekJJ,Gabbiani G,Hinz B,Chaponnier C,Brown RA.Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling.Nature reviews Molecular cellbiology,2002,3,(5):349-363.；6.Rodemann HP,Muller GA.Characterization ofhumanrenal fibroblasts in health and disease:II.In vitro growth,differentiation,and collagen synthesis offibroblasts from kidneys with interstitialfibrosis.American Journal of Kidney Diseases,1991,17:684–686.；7.Chang HY,ChiJT,Dudoit S,Bondre C,van de Rijn M,Botstein D,Brown PO.Diversity,topographicdifferentiation,and positional memory in human fibroblasts.Proc.NatlAcad.Sci.USA,2002,99,12877–12882.]。另一方面，成纤维细胞又是ECM降解蛋白酶的重要来源，促进基底膜的降解[8.Simian M,Hirai Y,Navre M,Z Werb Z,Lochter A,BissellMJ.The interplay of matrix metalloproteinases,morphogens and growth factorsis necessary for branching of mammary epithelial cells.Development(Cambridge,England),2001,128,(16):3117-3131.]。因此，成纤维细胞通过调节ECM的状态在维持ECM稳态中起关键作用。在健康的组织器官中，成纤维细胞主要负责伤口修复。它们侵入病变组织，产生ECM作为其他细胞的支架，同时还可以作为细胞骨架促进伤口收缩、愈合。在组织受到损伤时，上皮细胞和浸润的单核细胞等释放产生各种刺激因子，包括转化生长因子-β(TGFβ)、表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子2(FGF2)等生长因子[9.Zeisberg M,Strutz F,Müller GA.Role offibroblast activation ininducing interstitial fibrosis.Journal ofnephrology,2000,13Suppl 3:S111-120.]。在这些因子的刺激作用下，成纤维细胞便会激活为活化的成纤维细胞。活化的成纤维细胞常常存在于愈合伤口和硬化组织中，与肿瘤的形成有关。从伤口或纤维化区域分离出来的肿瘤相关成纤维细胞，在体外培养时能够保持其激活表型，在体外进行几次传代仍然保持其表型，直到细胞进入衰老期[10.Müller GA,Rodemann HP.Characterization ofhuman renal fibroblasts in health and disease:I.Immunophenotyping of culturedtubular epithelial cells and fibroblasts derived from kidneys withhistologically proven interstitial fibrosis.Americanjournal ofkidneydiseases:the officialjournal ofthe National Kidney Foundation,1991,17(6):680-683.]。
建立的成纤维细胞株通常通过纺锤形的形态、粘附塑料的能力以及区别于其他细胞株的标志物进行鉴定。在成纤维细胞几种确定的标志物中，纤维母细胞特异性蛋白1(FSP-1)是检测体内成纤维细胞最具特异性的标志物[11.Kalluri R,ZeisbergM.Fibroblasts in cancer.Nature Reviews Cancer,2006,6(5):392-401.]。α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)是活化的成纤维细胞的特征性标志物[12.Muller GA,RodemannHP.Characterization of human renal fibroblasts in health and disease:I.Immunophenotyping of cultured tubular epithelial cells and fibroblastsderived from kidneys with histologically proven interstitialfibrosis.American Journal ofKidney Diseases.1991,17(6):680-683.；13.GabbianiG.The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases.JournalPathology,2003,200:500–503.]。但是，每种标志物并不是成纤维细胞特有的，它们也会存在于其他细胞中。因此，缺乏可靠和特异的成纤维细胞分子标志物便成为体内成纤维细胞建立的最大挑战。
在结肠癌肝转移的发生机制研究中，成纤维细胞作为肿瘤转移微环境中占主导地位的、长寿命的、高度可塑性的基质细胞，在肿瘤侵袭性特征中发挥非常重要的作用[13.Najafi M,Mortezaee K,Majidpoor J.Stromal reprogramming:A target for tumortherapy.Life sciences,2019,239:117049.]。为了促进致瘤性，首先向肿瘤间质招募正常成纤维细胞至转移前微环境后，便向具有间质表型的肿瘤成纤维细胞进行转化，在转化过程中分泌多种生长因子、细胞因子、趋化因子和降解细胞外基质的蛋白从而促进肿瘤的发生发展，甚至转移[14.Liu T,Zhou L,Li D,Andl T,Zhang Y.Cancer-AssociatedFibroblasts Build and Secure the Tumor Microenvironment.Frontiers in cell anddevelopmental biology,2019,7:60.]。据目前的报道，已有从肝硬化组织建立的肝纤维化相关的成纤维细胞，适用于肝脏纤维化发生机制的研究[15.赵亚磊，张开明,孙玉玲,李文奇,张言鹏,赵一璞.肝硬化组织来源纤维母细胞的分离、培养及鉴定.2017,44(4):243-246.]。但是，从结肠癌患者发生肝转移的癌组织和正常的肝脏组织来源的成纤维细胞尚未建立。
现有的肝成纤维细胞株的建立方法为：取术中患者肝硬化组织，分离和培养原代肝纤维化成纤维细胞株，并选择所培养的第三代肝成纤维细胞株，观察细胞株的形态，利用细胞免疫荧光和Western blotting实验测定细胞特异性蛋白的表达，经过荧光显微镜下计数FSP1蛋白和波形蛋白的阳性率，来计算细胞的纯度[15.赵亚磊，张开明,孙玉玲,李文奇,张言鹏,赵一璞.肝硬化组织来源纤维母细胞的分离、培养及鉴定.2017,44(4):243-246.]。该技术建立的细胞株可用于肝硬化发生发展的机制研究。
但是现有的肝纤维化组织来源的成纤维细胞的建立方法存在细胞纯度检测方法不够客观的缺点，该细胞模型适用于肝纤维化形成机制的研究，不适用于结肠癌肝转移发生发展机制的研究。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种来源于同一结肠癌肝转移患者的肝肿瘤成纤维细胞和肝正常成纤维细胞，用于结肠癌肝转移的发生发展机制的研究，既能够相互配对，又能排除因个体差异引起的组织异质性。
本发明提供了一种新型肝成纤维细胞株的建立方法，包括以下步骤：
S1、无菌培养基准备：准备两管20ml的DMEM/F12无菌培养基，密封冰上预冷后备用；
S2、分离组织：选择结肠癌肝转移患者的肝转移瘤组织和距离肿瘤边缘＞5.0cm的肝正常组织，分别放入事先准备好的两管DMEM/F12培养基中，在组织离体20分钟内由实验室人员带回实验室；
S3、组织清洗：在超净台中，用含1％青-链霉素溶液的1xPBS清洗立体组织3次，清除其中的坏死组织及其他杂质；
S4、组织处理：将组织剪碎成1.0～2.0mm3大小的碎块，经过1500r/min离心5分钟,弃去上清液，取得组织碎块，并用DMEM/F12培养基重悬组织碎块；
S5、组织培养：将重悬的组织碎块均匀铺在25ml细胞培养瓶中，并放入37℃培养箱培养1小时后，倒置培养瓶，继续培养24小时；再用DMEM/F12无菌培养基进行正置培养，每3～4天换液一次，长至80％时进行细胞传代；
S6、鉴定细胞株：选用第三代指数生长期的细胞，进行细胞免疫荧光实验和流式细胞术鉴定细胞株；
S7、细胞株命名：细胞鉴定完毕后，将来源于肝转移瘤组织建立的细胞株命名为人肝肿瘤相关成纤维细胞(HLCF)，将肿瘤周围组织建立的细胞株命名为人肝正常成纤维细胞(HLNF)。
进一步的，所述S1中的DMEM/F12无菌培养基中含有10％的胎牛血清和1％的青链霉素，即在DMEM/F12无菌培养基中加入10％的胎牛血清、100u/ml青霉素钠和100u/ml硫酸链霉素。
进一步的，所述S4中的DMEM/F12培养基中含有20％的胎牛血清和1％的青链霉素，即在DMEM/F12培养基中加入20％的胎牛血清、100u/ml青霉素钠和100u/ml硫酸链霉素。
进一步的，所述S5中的DMEM/F12无菌培养基中含有10％的胎牛血清、1％的青链霉素和10ng/ml的表皮生长因子，即在DMEM/F12无菌培养基中加入10％的胎牛血清、100u/ml青霉素钠、100u/ml硫酸链霉素和10ng/ml的表皮生长因子。
进一步的，所述S6中细胞免疫荧光实验鉴定细胞的方法为：
A、将第三代指数生长期的细胞用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，5000个/孔的浓度接种于24孔板，长至60％时，弃去培养液，PBS冲洗3次，5分钟一次；
B、再用4％多聚甲醛固定15分钟，1xPBS冲洗3次，5分钟一次；
C、再用0.3％triton-X-100破细胞膜，室温20分钟，1xPBS冲洗3次，每次5分钟；
D、加入免疫染色封闭液，摇床缓慢摇1小时，吸去免疫染色封闭液，按1:300分别加入稀释好的α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)、纤维母细胞特异性蛋白1(FSP-1)和细胞角质蛋白-18(CK-18)，4℃过夜孵育；
E、再加入稀释好的二抗，避光室温孵育45分钟；
F、洗去二抗，1xPBS冲洗3次，每次5分钟；
G、再加入DAPI避光室温孵育5分钟，1xPBS冲洗3次，每次5分钟；
H、最后加入抗荧光淬灭剂封片并采用荧光显微镜观察拍照。
进一步的，所述S6中流式细胞术鉴定细胞株的方法为：
A、收集成纤维细胞，用1xPBS冲洗2次，并放入至100～300μl(终浓度约1x106)的FACS缓冲液中(1xPBS，含0.5％BSA和2mmol/L EDTA，pH7.2)；
B、实验组分别加入α-平滑肌肌动蛋白和细胞角质蛋白-18至终浓度1:500；
C、阴性对照加入等量同型IgG；
D、37℃孵育30分钟后，用1xPBS洗2次后，3000rpm/min离心细胞；
E、将细胞重悬在200μl FACS缓冲液中；
F、实验组同时加入Alexa-555山羊抗兔抗体至终浓度为1:500，室温37℃避光孵育30分钟；
G、用1xPBS洗2次，再次离心；
H、将细胞重悬在200μl FACS缓冲液中；
I、用BDAria II流式细胞仪检测细胞的阳性率。
与现有技术相比本发明的有益效果为：
针对现有技术中细胞纯度的检测方法不够客观的缺点，本发明建立细胞株的方法是采用了细胞免疫荧光和流式细胞仪实验检测成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白、纤维母细胞特异性蛋白1和细胞角质蛋白-18表达的阳性率，通过细胞阳性率显示所建立细胞株的纯度，具有客观性强、直观性强、快速和准确的优点；
针对现有技术缺乏自身正常的细胞作对照的缺点，本发明选择来源于结肠癌肝转移患者自身的肝转移瘤组织和癌旁的肝脏正常组织(＞5.0cm)，利用组织块培养技术建立了一对肝成纤维细胞的原代细胞株，即人肝正常成纤维细胞和人肝肿瘤相关成纤维细胞，能够为结肠癌患者肝转移的发生、进展的基础研究提供排除组织异质性的新型细胞模型。
附图说明
图1是组织块法建立原代成纤维细胞株的步骤示意图(其中A为肿瘤相关成纤维细胞HLCF，B为正常成纤维细胞HLNF)；
图2是人肝肿瘤相关成纤维细胞(HLCFs)和人肝正常成纤维细胞(HLNFs)的示意图；
图3是细胞免疫荧光实验检测HLCFs和HLNFs细胞中CK-18的表达；
图4是细胞免疫荧光实验检测HLCFs和HLNFs细胞中FSP-1的表达；
图5是细胞免疫荧光实验检测HLCFs和HLNFs细胞中a-SMA的表达；
图6是流式细胞术检测HLCFs和HLNFs细胞中阴性同型对照；
图7是流式细胞术检测HLCFs和HLNFs细胞表达CK-18的阳性率；
图8是流式细胞术检测HLCFs和HLNFs细胞表达a-SMA的阳性率。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例
如图1所示，一种新型肝成纤维细胞株的建立方法，包括以下步骤：
S1、无菌培养基准备：准备两管20ml的DMEM/F12无菌培养基，其中含有10％的胎牛血清和1％的青链霉素，即在DMEM/F12无菌培养基中加入10％的胎牛血清、100u/ml青霉素钠和100u/ml硫酸链霉素，密封冰上预冷后备用；
S2、分离组织：选择结肠癌肝转移患者的肝转移瘤组织和距离肿瘤边缘＞5.0cm的肝正常组织，分别放入事先准备好的两管DMEM/F12培养基中，在组织离体20分钟内由实验室人员带回实验室；
S3、组织清洗：在超净台中，用含1％青-链霉素溶液的1xPBS清洗立体组织3次，清除其中的坏死组织及其他杂质；
S4、组织处理：将组织剪碎成1.0～2.0mm3大小，经过1500r/min离心5分钟,弃去上清液，取得组织碎块，并用DMEM/F12培养基重悬组织碎块，DMEM/F12培养基中含有20％的胎牛血清和1％的青链霉素，即在DMEM/F12培养基中加入20％的胎牛血清、100u/ml青霉素钠和100u/ml硫酸链霉素；
S5、组织培养：将重悬的组织碎块均匀铺在25ml细胞培养瓶中，并放入37℃培养箱培养1小时后，倒置培养瓶，继续培养24小时；再用DMEM/F12无菌培养基进行正置培养，每3～4天换液一次，长至80％时进行细胞传代，DMEM/F12无菌培养基中含有10％的胎牛血清、1％的青链霉素和10ng/ml表皮生长因子，即在DMEM/F12无菌培养基中加入100u/ml青霉素钠、100u/ml硫酸链霉素和10ng/ml表皮生长因子；
S6、鉴定细胞洗：选用第三代指数生长期的细胞，进行细胞免疫荧光实验鉴定细胞(结果参照图3-5)：
A、将第三代指数生长期的细胞用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，5000个/孔的浓度接种于24孔板，长至60％时，弃去培养液，PBS冲洗3次，5分钟一次；
B、再用4％多聚甲醛固定15分钟，1xPBS冲洗3次，5分钟一次；
C、再用0.3％triton-X-100破细胞膜，室温20分钟，1xPBS冲洗3次，每次5分钟；
D、加入免疫染色封闭液，摇床缓慢摇1小时，吸去免疫染色封闭液，按1:300分别加入稀释好的α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)、纤维母细胞特异性蛋白1(FSP-1)和细胞角质蛋白-18(CK-18)，4℃过夜孵育；
E、再加入稀释好的二抗，避光室温孵育45分钟；
F、洗去二抗，1xPBS冲洗3次，每次5分钟；
G、再加入DAPI避光室温孵育5分钟，1xPBS冲洗3次，每次5分钟；
H、最后加入抗荧光淬灭剂封片并采用荧光显微镜观察拍照；
选用第三代指数生长期的细胞，进行流式细胞术鉴定细胞株(结果参照图6-8):
A、收集成纤维细胞，用1xPBS冲洗2次，并放入至100～300μl(终浓度约1x106)的FACS缓冲液中(1xPBS，含0.5％BSA和2mmol/L EDTA，pH7.2)；
B、实验组分别加入α-平滑肌肌动蛋白和细胞角质蛋白-18至终浓度1:500；
C、阴性对照加入等量同型IgG；
D、37℃孵育30分钟后，用1xPBS洗2次后，3000rpm/min离心细胞；
E、将细胞重悬在200μl FACS缓冲液中；
F、实验组同时加入Alexa-555山羊抗兔抗体至终浓度为1:500，室温37℃避光孵育30分钟；
G、用1xPBS洗2次，再次离心；
H、将细胞重悬在200μl FACS缓冲液中；
I、用BDAria II流式细胞仪检测细胞的阳性率。
S7、细胞株命名：细胞鉴定完毕后，将来源于肝转移瘤组织建立的细胞株命名为人肝肿瘤相关成纤维细胞(HLCF)，将肿瘤周围组织建立的细胞株命名为人肝正常成纤维细胞(HLNF)。
针对现有技术中细胞纯度的检测方法不够客观的缺点，本发明建立细胞株的方法是采用了细胞免疫荧光和流式细胞仪实验检测成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白、纤维母细胞特异性蛋白1和细胞角质蛋白-18表达的阳性率，通过细胞阳性率显示所建立细胞株的纯度，具有客观性强、直观性强、快速和准确的优点；
针对现有技术缺乏自身正常的细胞作对照的缺点，本发明选择来源于结肠癌肝转移患者自身的肝转移瘤组织和癌旁的肝脏正常组织(＞5.0cm)，利用组织块培养技术建立了一对肝成纤维细胞的原代细胞株，即人肝正常成纤维细胞和人肝肿瘤相关成纤维细胞，能够为结肠癌患者肝转移的发生、进展的基础研究提供排除组织异质性的新型细胞模型。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种新型肝成纤维细胞株的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、无菌培养基准备：准备两管DMEM/F12无菌培养基，密封冰上预冷后备用；
S2、分离组织：选择结肠癌肝转移患者的肝转移瘤组织和距离肿瘤边缘＞5.0cm的肝正常组织，分别放入事先准备好的两管DMEM/F12培养基中，在组织离体20分钟内由实验室人员带回实验室；
S3、组织清洗：在超净台中，用1xPBS清洗立体组织3次，清除其中的坏死组织及其他杂质；
S4、组织处理：将组织剪碎成1.0～2.0mm3大小的碎块，离心5分钟,弃去上清液，取得组织碎块，并用DMEM/F12培养基重悬组织碎块；
S5、组织培养：将重悬的组织碎块均匀铺在细胞培养瓶中，并放入37℃培养箱培养1小时后，倒置培养瓶，继续培养24小时；再用DMEM/F12无菌培养基进行正置培养，每3～4天换液一次，长至80％时进行细胞传代；
S6、鉴定细胞株：选用第三代指数生长期的细胞，进行细胞免疫荧光实验和流式细胞术鉴定细胞株；
S7、细胞株命名：细胞鉴定完毕后，将来源于肝转移瘤组织建立的细胞株和肿瘤周围组织建立的细胞株分别命名。
2.如权利要求1所述的一种新型肝成纤维细胞株的建立方法，其特征在于，所述S1中的DMEM/F12无菌培养基中含有10％的胎牛血清和1％的青链霉素，即在DMEM/F12无菌培养基中加入10％的胎牛血清、100u/ml青霉素钠和100u/ml硫酸链霉素。
3.如权利要求1所述的一种新型肝成纤维细胞株的建立方法，其特征在于，所述S3中所使用的1xPBS中含有1％的青-链霉素溶液。
4.如权利要求1所述的一种新型肝成纤维细胞株的建立方法，其特征在于，所述S4中的DMEM/F12培养基中含有20％的胎牛血清和1％的青链霉素，即在DMEM/F12培养基中加入20％的胎牛血清、100u/ml青霉素钠和100u/ml硫酸链霉素。
5.如权利要求1所述的一种新型肝成纤维细胞株的建立方法，其特征在于，所述S5中的DMEM/F12无菌培养基中含有10％的胎牛血清、1％的青链霉素和10ng/ml的表皮生长因子，即在DMEM/F12无菌培养基中加入10％的胎牛血清、100u/ml青霉素钠、100u/ml硫酸链霉素和10ng/ml的表皮生长因子。
6.如权利要求1所述的一种新型肝成纤维细胞株的建立方法，其特征在于，所述S6中细胞免疫荧光实验鉴定细胞株的方法为：
A、将第三代指数生长期的细胞用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，5000个/孔的浓度接种于24孔板，长至60％时，弃去培养液，PBS冲洗3次；
B、再用4％多聚甲醛固定15分钟，1xPBS冲洗3次；
C、再用0.3％triton-X-100破细胞膜，室温20分钟，1xPBS冲洗3次；
D、加入免疫染色封闭液，摇床缓慢摇1小时，吸去免疫染色封闭液，按1:300分别加入稀释好的α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)、纤维母细胞特异性蛋白1(FSP-1)和细胞角质蛋白-18(CK-18)，4℃过夜孵育；
E、再加入稀释好的二抗，避光室温孵育45分钟；
F、洗去二抗，1xPBS冲洗3次；
G、再加入DAPI避光室温孵育5分钟，1xPBS冲洗3次；
H、最后加入抗荧光淬灭剂封片并采用荧光显微镜观察拍照。
7.如权利要求1所述的一种新型肝成纤维细胞株的建立方法，其特征在于，所述S6中流式细胞术鉴定细胞株的方法为：
A、收集成纤维细胞，用1xPBS冲洗2次，并放入至100～300μl的FACS缓冲液中；
B、实验组分别加入α-平滑肌肌动蛋白和细胞角质蛋白-18至终浓度为1:500；
C、阴性对照加入等量同型IgG；
D、37℃孵育30分钟后，用1xPBS洗2次后，3000rpm/min离心细胞；
E、将细胞重悬在200μl FACS缓冲液中；
F、实验组同时加入Alexa-555山羊抗兔抗体至终浓度为1:500，室温37℃避光孵育30分钟；
G、用1xPBS洗2次，再次离心；
H、将细胞重悬在200μl FACS缓冲液中；
I、用BDAriaII流式细胞仪检测细胞的阳性率。
8.如权利要求7所述的一种新型肝成纤维细胞株的建立方法，其特征在于，所述FACS缓冲液为1xPBS，其中含0.5％BSA和2mmol/L EDTA，pH为7.2。
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| CN108070561A (zh) * | 2016-11-15 | 2018-05-25 | 江苏齐氏生物科技有限公司 | 一种人原代结肠癌细胞的分离及培养方法 |
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