ES2842960T3 - Sistema de banco de células para crioconservación cerrado y de alta capacidad y uso del mismo - Google Patents

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Abstract

Sistema de banco de células para crioconservación cerrado y de alta capacidad, que comprende: a. un interfaz de usuario para controlar y monitorizar la dispensación de materiales biológicos líquidos en una pluralidad de bolsas de crioconservación; b. una pluralidad de bolsas de crioconservación (1), en la que cada bolsa es una bolsa de crioconservación de alta capacidad, que está adaptada para usarse en un sistema de banco para crioconservación de material biológico cerrado y de alta capacidad, y que es resistente a temperaturas de nitrógeno líquido; c. una pluralidad de conexiones fluídicas adaptadas para llenar la pluralidad de bolsas; d. un medio de termosellado para sellar los tubos y las bolsas; e. una pluralidad de casetes metálicos para contener, congelar, almacenar y descongelar las bolsas; y en el que dicha bolsa de crioconservación de alta capacidad comprende: f. un primer recinto (7) de etileno propileno fluorado (FEP); g. al menos un conducto de entrada (5) rígido de FEP, en conexión fluídica con el primer recinto y que se puede conectar a un primer conducto flexible soldable estéril que es un tubo de PVC (2); h. al menos un conducto de salida (6) rígido de FEP, en conexión fluídica con el primer recinto, y que se puede conectar a un segundo conducto flexible soldable estéril que es un tubo de PVC (3); y d. una bolsa de FEP (8), que inicialmente está abierta en un extremo (9), y que está contigua al primer recinto, pero que está termosellada del mismo, y que rodea tanto el conducto de entrada rígido como el conducto de salida rígido, de modo que la bolsa no está en comunicación fluídica con el primer recinto, ni con los conductos de entrada y de salida; y en la que la bolsa se expande lo suficiente como para que cuando el primer recinto se haya llenado con el material biológico, los tubos de PVC se puedan retirar a la bolsa, que, a continuación, se pueden termosellar para formar un segundo recinto (11), que ahora contiene ambos tubos de PVC.

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema de banco de células para crioconservación cerrado y de alta capacidad y uso del mismo
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere a un sistema de banco de células para crioconservación cerrado y de alta capacidad y un uso del mismo en un procedimiento para congelar y almacenar células.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] Los productos biotecnológicos, incluidos los vectores virales recombinantes, normalmente implican la introducción de alguna modificación genética en células eucariotas y, a continuación, el crecimiento de estas células en un biorreactor o en múltiples placas o recipientes de cultivo de células grandes. Otros productos importantes incluyen cepas de vacunas de virus y virus vivos modificados.
[0003] Para la producción de vectores virales recombinantes, cepas de vacuna de virus, y virus vivos modificados, se necesita una fuente de células uniforme para inocular biorreactores o recipientes de cultivo celular. Las fuentes de células típicas incluyen líneas específicas de células eucariotas modificadas genéticamente y clones de células controladas que tienen estado de GMPc. Esto proporciona una base para un Banco de células de trabajo del fabricante (Manufacturer's Working Cell Bank - MWCB). Un MWCB consta de muchas alícuotas (porciones) de una suspensión celular, cada una de las cuales contiene el mismo tipo de células y aproximadamente el mismo número de células. Estas alícuotas se preparan el mismo día y se congelan a la misma hora. A continuación, las alícuotas se mantienen a temperaturas muy frías (crioconservadas). Para cada ciclo, una o más de estas alícuotas de células se descongelan para proporcionar el mismo punto de partida que cualquier otro ciclo con las mismas células.
[0004] La inoculación con éxito de un biorreactor o recipientes de cultivo celular con células eucariotas requiere una densidad celular mínima para lograr un crecimiento celular apropiado. Si la densidad celular está por debajo del nivel mínimo, se requiere tiempo adicional para lograr los niveles comerciales de crecimiento celular, lo que agrega gastos al proceso y aumenta la oportunidad de que los contaminantes entren en el entorno celular. Si la densidad celular es demasiado alta, los nutrientes en el medio pueden agotarse, lo que puede dar lugar a un crecimiento celular reducido, una productividad celular más baja y posiblemente la muerte del cultivo celular.
Otras referencias
[0005] El documento US 6.670.175 (de Bayer Pharmaceuticals) describe y reivindica bolsas de crioconservación de politetrafluoroetileno (PTFE), mientras que la descripción proporciona bolsas de etileno propileno fluorado (FEP) y un procedimiento para usar las bolsas en un esquema de un sistema de bancos de células cerrado. El FEP es un copolímero de hexafluoropropileno y tetrafluoroetileno. Se diferencia de las resinas de PTFE en parte en que se puede procesar en estado fundido utilizando moldeo por inyección y técnicas convencionales de extrusión por tornillo. El etileno propileno fluorado fue inventado por DuPont y se comercializa bajo la marca Teflon® FEP. Otras marcas son NEOFLON® de Daikin o DYNEON® FEP de Dyneon/3M.
[0006] El documento US 8.177.123 (de Sartorius Stedim) da a conocer sistemas y procedimientos para congelar, almacenar y descongelar materiales biofarmacéuticos.
[0007] El documento WO 2006/078796 A2 (Michael Cohen) describe un aparato y un procedimiento para la conservación y el uso de células madre.
[0008] El documento WO 2011/140076 A1 describe un aparato para realizar un procedimiento que implica conectar una bolsa de crioconservación a través de una red de tubos de plástico estériles a un recipiente con la fuente celular a efectos de llenar la bolsa con células. El aparato comprende además una bomba de dispensación, una bomba de vacío, una bomba de purga y medios para soldar de forma estéril la bolsa de crioconservación y los tubos.
[0009] Las bolsas de crioconservación KryoSure® (American Fluoroseal Corporation) incluyen bolsas de FEP separadas que rodean los respectivos conductos de entrada/salida y están inicialmente abiertos en un extremo.
[0010] Sin embargo, a pesar de los anteriores y otros esfuerzos en el campo, el riesgo de contaminación durante el llenado, la descongelación y vaciado de bolsas de congelación sigue siendo un desafío crítico. En consecuencia, se requieren aparatos y procedimientos para reducir el riesgo de contaminación y controlar mejor la crioconservación, en relación con los enfoques actuales de bancos de células.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
[0011] En la actualidad, el tiempo de espera para la amplificación celular es inaceptablemente largo y hay demasiadas fases abiertas durante las etapas de llenado y drenaje. Para resolver este problema, la presente divulgación proporciona un nuevo conjunto de bolsa de almacenamiento y congelación de células y un procedimiento para usar el conjunto en obtención de bancos de crioconservación de células eucariotas para la posterior expansión del tren de semillas.
[0012] La presente invención proporciona un sistema de banco de células para crioconservación cerrado y de alta capacidad, tal como se define en la reivindicación 1, y un uso del sistema de banco de células para crioconservación cerrado y de alta capacidad, tal como se define en la reivindicación 7. Las realizaciones preferidas se definen en las reivindicaciones dependientes.
[0013] La bolsa está construida principalmente de un tejido de etileno-propileno fluorado (FEP). La bolsa está diseñada para llenarse hasta una fracción de su capacidad máxima, de modo que la suspensión celular tiene una sección transversal muy delgada. El diseño de la bolsa incluye al menos un conducto de entrada y un conducto de salida o de inoculación, que se pueden soldar de forma estéril a la fuente de las células eucariotas. El uso de al menos dos conductos soldables estériles permite el llenado de las bolsas en un "sistema cerrado", lo que reduce significativamente el riesgo de contaminación en relación con otros procedimientos de obtención de bancos de células.
[0014] La bolsa también incluye una funda, que puede estar termosoldada para formar un recinto, que protege los conductos de entrada y de salida frente a la contaminación y los daños mecánicos (PVC es frágil a bajas temperaturas) durante la congelación, almacenamiento y posterior descongelación. En el procedimiento, una vez que se llena cada bolsa, se sella su correspondiente conducto de entrada, y tanto el conducto de entrada como el de salida se encierran dentro de la funda de la bolsa. La funda se separa del recinto que contiene las células y puede recibir una etiqueta. Debido a que la funda está cerrada, se evita el contacto entre el conducto de salida y el agua del baño de agua durante la descongelación, disminuyendo el riesgo de contaminación. Durante la inoculación, el contenido de la bolsa se drena a través de un conducto de salida soldable estéril o una línea de inoculación. Los cartuchos de protección "openwork" permiten una transferencia térmica óptima entre el entorno exterior (por ejemplo, baño de agua o nitrógeno líquido) y las alícuotas de células.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0015] Los dibujos adjuntos ilustran diversos aspectos de las presentes invenciones, y junto con la descripción sirven para explicar los principios de las invenciones. Los componentes de los dibujos no están necesariamente a escala, sino que se hace hincapié en ilustrar claramente los principios de las presentes invenciones.
La figura 1A es un dibujo de una realización particular de la bolsa de crioconservación;
La figura 1B es un dibujo de otra vista de la bolsa de crioconservación;
La figura 1C es un dibujo de una bolsa de crioconservación real, fabricada de acuerdo con la descripción, con su funda sellada para encerrar los conductos de entrada y salida;
La figura 2A presenta una vista frontal (izquierda) y una vista posterior (derecha) de un cartucho de metal protector, que encierra las bolsas durante la congelación, almacenamiento y descongelación;
La figura 2B presenta otro ejemplo de los cartuchos en su posición cerrada;
La figura 3A es una imagen de un termosoldador de mano típico;
La figura 3B es una imagen de un sellador de mesa que puede emplearse para sellar bolsas de crioconservación; La figura 3C es una imagen de un dispositivo de termosoldado, que une asépticamente tubos de plástico (por ejemplo, conductos de entrada y salida);
La figura 4 es un dibujo esquemático que representa la inoculación de bolsas descongeladas en un biorreactor. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0016] Tal como se usa en este documento, el término "cultivo discontinuo" se refiere a una técnica de cultivo de células en la que una cantidad de medio de cultivo fresco se inocula con células que entran rápidamente en una fase de crecimiento logarítmico y en la que el medio de crecimiento del cultivo no se retira continuamente y es reemplazado por medio fresco.
[0017] Tal como se usa en este documento, el término "cultivo semicontinuo" se refiere a una técnica de cultivo de células en la que una cantidad de medio de cultivo fresco se inocula con células inicialmente, y se alimentan nutrientes de cultivo adicionales (de forma continua o en incrementos discretos) al cultivo durante el proceso de cultivo, con o sin recolección periódica de células y/o producto antes de la terminación del cultivo.
[0018] Tal como se usa en este documento, el término "cultivo de perfusión" se refiere a una técnica de cultivo de células en la que una cantidad de medio fresco se inocula con células que entran rápidamente en una fase de crecimiento logarítmico (como anteriormente) y en la que se retira continuamente medio de crecimiento de un cultivo y es reemplazado por medio fresco.
[0019] Tal como se usa en este documento, el término "biorreactor" se refiere a un recipiente para el cultivo de células.
[0020] El biorreactor puede ser un "biorreactor de bolsa flexible". Un "biorreactor de bolsa flexible" es una cámara estéril capaz de recibir un medio líquido y que además comprende conectores, puertos, adaptadores y tubos flexibles. La cámara puede estar fabricada de plástico. La cámara puede estar fabricada además de plástico transparente laminado de múltiples capas y más específicamente, puede estar fabricada de plástico transparente laminado de múltiples capas y tener una capa de contacto con el fluido fabricada de FEP.
[0021] Además, los conectores, puertos, y los adaptadores pueden estar fabricados de cualquier tipo de plástico, incluyendo, pero no limitado a: polietileno, polipropileno, y policarbonato, mientras que el tubo puede estar construido de cualquier tipo de plástico, incluyendo, pero no limitado a: elastómero termoplástico o silicona (por ejemplo, silicona curada con platino).
[0022] Las cámaras del "biorreactor de bolsa flexible" apropiadas se pueden encontrar comúnmente en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 6.544.788.
[0023] Tal como se usa en este documento, "tejido de etileno propileno fluorado (FEP)" se refiere a un material flexible que se asemeja a una película o tela fabricada por cualquier medio de FEP. El etileno propileno fluorado fue inventado por DuPont y se comercializa bajo la marca Teflon® FEP. Otras marcas son NEOf Lo N® de Daikin o DYNEON® FEP de Dyneon/3M. Saint-Gobain también ofrece combinaciones similares de bolsa/tejido.
[0024] El "conducto de entrada" es un tubo flexible a través del cual se añaden las células a las bolsas de crioconservación antes de la congelación y el almacenamiento. El cloruro de polivinilo es un material preferido tanto para los conductos de entrada como de salida. De manera similar, el "conducto de salida" es un tubo flexible a través del cual las células salen de las bolsas de crioconservación después de la descongelación.
[0025] Cuando se utilizan bolsas de congelación de células de la presente invención, se colocarán de lado en un cartucho de metal (también referido como una caja o bote) en una orientación sustancialmente a nivel. El grosor de la suspensión celular en cualquier punto dentro de una bolsa no debe exceder aproximadamente los 10 u 11 milímetros. Si el grosor de la suspensión celular es sustancialmente superior a 10 u 11 milímetros, las células adyacentes a la superficie de la bolsa experimentarán diferentes condiciones de congelación y descongelación que las células en el interior de la suspensión, y pueden reaccionar de manera diferente durante el transcurso de la congelación y descongelación y cuando posteriormente se utilicen en un biorreactor. El término "sección transversal delgada" se refiere a las dimensiones anteriores.
[0026] Conjunto de bolsa de congelación y almacenamiento de células: el conjunto incluye la bolsa de congelación de células y los tubos, puertos e interconexiones asociados.
[0027] Tal como se usa en este documento, el término "crioconservación" se refiere a un proceso por el cual las células, tejidos, o cualquier otra sustancia susceptible a los daños causados por el tiempo o por la actividad enzimática o química se conservan mediante enfriamiento y almacenamiento a temperaturas bajo cero .
[0028] Tal como se usa en este documento, el término "obtención de bancos criogénicos" se refiere a una técnica mediante la cual las células se mezclan con un crioprotector (por ejemplo DMSO con o sin hidroxietil almidón (HES)) y se coloca en un contenedor apropiado para el almacenamiento en condiciones de crioconservación. A continuación, estos recipientes se congelan usando técnicas bien conocidas en la técnica y se almacenan a bajas temperaturas, típicamente entre aproximadamente -130 °C y aproximadamente -196 °C. La recolección de células obtenidas por el proceso es un banco de células.
[0029] Tal como se usa en este documento, el término "banco madre de células" se refiere a un cultivo de células (por ejemplo células completamente caracterizadas) que se han desarrollado a partir de un solo clon, se dispensan en recipientes de almacenamiento (por ejemplo, se dispensan en los recipientes en una sola operación) y se almacenan en condiciones de crioconservación como se describe anteriormente. Las células pueden ser adecuadas para su uso posterior en un cultivo celular de producción y una recolección adicional de proteínas y/o virus terapéuticamente relevantes, incluidos virus, producidos de ese modo.
[0030] Tal como se usa en este documento, el término "criobolsa" es una cámara estéril que es capaz de recibir un medio líquido, que es apropiado para almacenamiento en frío entre aproximadamente -130 °C y aproximadamente -196 °C, y puede comprender, además, conectores, puertos, adaptadores y tubos flexibles. Tal como se describe en el presente documento, la bolsa criogénica se construye idealmente de etileno propileno fluorado (FEP).
[0031] Tal como se usa en este documento, el término "matraz de agitación" se refiere a un recipiente utilizado como un frasco de cultivo en el que el medio se agita constantemente durante la incubación.
[0032] Tal como se usa en este documento, el término "tren de semillas en matraz de agitación" se refiere a un procedimiento para la expansión de células en el que se cultiva primero una alícuota de células (se siembran) en un matraz de agitación y se hacen crecer en el mismo. Las células se cultivan según su tasa de crecimiento y normalmente se dividen en recipientes más grandes y/o múltiples durante su crecimiento hasta que la biomasa ha alcanzado un nivel suficiente para inocular un biorreactor.
[0033] Tal como se usa en este documento, el término "densidad de semillas" se refiere a la densidad celular inicial a la que se inocula un matraz o biorreactor.
[0034] Tal como se utiliza en este documento, el término "proteína terapéuticamente relevante" se refiere a cualquier proteína que puede ser usada para crear un tratamiento para una enfermedad o trastorno o para tratar una enfermedad o trastorno en un animal, incluyendo mamíferos, tales como ratones, ratas, monos, simios y humanos. Estas proteínas pueden incluir, pero no se limitan a, polipéptidos de unión, tales como anticuerpos monoclonales, proteínas de fusión Fc, anticoagulantes, factores sanguíneos, proteínas morfogenéticas óseas, estructuras proteicas modificadas genéticamente, enzimas, factores de crecimiento, hormonas, interferones, interleucinas y trombolíticos.
[0035] Por consiguiente, la divulgación proporciona una bolsa de almacenamiento y congelación de células que soporta un nuevo procedimiento para un sistema de obtención de bancos de células en fase cerrada.
[0036] La bolsa está construida principalmente de FEP. La bolsa está diseñada para contener suficientes células para que un biorreactor o recipientes de cultivo celular puedan inocularse directamente a partir de su contenido. La bolsa está diseñada para llenarse hasta una fracción de su capacidad máxima, de modo que cuando se coloca de lado, la suspensión celular tiene una sección transversal muy delgada. El diseño de la bolsa incluye un equipo de transferencia que se puede soldar de forma estéril a la fuente de las células eucariotas. El diseño de la bolsa incluye al menos un conducto de entrada y un conducto de salida o de inoculación, que se pueden soldar de forma estéril a la fuente de las células eucariotas. El uso de al menos dos conductos soldables estériles permite el llenado y drenaje de las bolsas en un "sistema cerrado", lo que reduce significativamente el riesgo de contaminación en relación con otros procedimientos de almacenamiento de células.
[0037] La bolsa también incluye una funda, que puede estar termosoldada para formar un recinto, que protege los conductos de entrada y de salida frente a la contaminación y los daños mecánicos durante la congelación, almacenamiento y posterior descongelación. En el procedimiento, una vez que se llena cada bolsa, se sella su correspondiente conducto de entrada, y tanto el conducto de entrada como el de salida están encerrados dentro de la funda de la bolsa. La funda está separada del recinto que contiene las células, de modo que no interfiere con la transferencia térmica. Durante la inoculación, el contenido de la bolsa se drena a través de un conducto de salida soldable estéril o una línea de inoculación.
[0038] La bolsa de congelación de células de la presente invención está fabricada de un tejido de FEP en lugar de EVA y PFE (bolsas de la técnica anterior). El tejido de FEP es flexible a menos 196 °C (la temperatura del N2 líquido). Debido a su flexibilidad a baja temperatura y, a su vez, a la posibilidad reducida de fractura a baja temperatura, esta característica del tejido proporciona protección adicional al contenido de la bolsa de congelación celular durante la congelación, el almacenamiento a largo plazo y la descongelación.
[0039] La bolsa de congelación de células está diseñada para contener hasta 400 ml de suspensión celular, 400 veces el volumen típicamente congelado en viales de tapa de rosca. También son posibles volúmenes desde tan solo varios mililitros hasta al menos aproximadamente 400 ml, o incluso volúmenes mayores, utilizando el diseño de bolsa de crioconservación divulgado. Las densidades celulares son comparables para las nuevas bolsas de congelación de células y los viales que se utilizan actualmente. Debido a esta diferencia de volumen, las bolsas pueden contener aproximadamente 100 (o hasta aproximadamente 400) veces más células que los viales. Una única bolsa de congelación de células contiene suficientes células para permitir la inoculación directa de un biorreactor u otro recipiente de cultivo celular adecuado. Se pueden usar varias bolsas para inocular recipientes muy grandes.
[0040] Los volúmenes de suspensión celular a congelar son una fracción de la capacidad potencial de las bolsas de congelación celular. Esto limita el grosor de la suspensión celular. Debido a que la suspensión celular es delgada, la transferencia de calor es rápida y las células se pueden congelar y descongelar uniformemente a una velocidad óptima. La congelación y descongelación uniformes ayudan a garantizar la homogeneidad de las células.
[0041] Las bolsas de congelación de células se fabrican con un conducto de entrada y conducto de salida o de inoculación integrados. Los conductos se componen de tramos de tubería flexible y, en particular, de PVC. Cuando se llenan las bolsas, el conducto de entrada se suelda de forma estéril a un tramo de tubo que está en comunicación fluídica con la fuente de la suspensión celular. Los dispositivos y procedimientos de soldadura estéril son bien conocidos por los expertos en la técnica de conservar células u otros materiales biológicos. Este procedimiento de "sistema cerrado" prácticamente elimina la posibilidad de contaminación cuando las bolsas se llenan y se vacían.
[0042] Cada pata del equipo de transferencia está conectada a la bolsa de congelación celular. Cada pata tiene una pinza de tornillo o un dispositivo similar para controlar el flujo de células a la bolsa de congelación de células unida. El equipo de transferencia y las bolsas unidas están esterilizados y se suministran como una unidad. Para cada bolsa, la secuencia de llenado es:
a) el conducto de entrada se suelda de forma estéril a una pata, que está en comunicación fluídica con una fuente de células;
b) se abre la pinza de tornillo de la pata del equipo de transferencia unido;
c) la suspensión celular se bombea a la bolsa a través de su conducto de entrada;
d) la pinza de tornillo se cierra;
e) el conducto de entrada se termosella,
f) la bolsa se corta por encima del sellado realizado en e), desconectando la bolsa del equipo de transferencia sin haber expuesto su contenido al aire exterior (es decir, fase cerrada);
g) los conductos de entrada y salida se retiran dentro de la funda de la bolsa, y la bolsa se coloca dentro de una envoltura metálica protectora, que se utilizará para albergar la bolsa durante la congelación y el almacenamiento (esta etapa es útil cuando se deben procesar una pluralidad de bolsas);
h) la bolsa se retira temporalmente de su envoltura protectora y su funda se termosella de manera estéril para producir un nuevo compartimiento, que encierra los conductos de entrada y salida. El recinto protege los conductos de entrada y salida de la exposición directa al N2 líquido y los baños de agua;
i) la envoltura de metal ahora se cierra alrededor de la bolsa llena y sellada, y se baja a la temperatura de almacenamiento adecuada.
[0043] Si la suspensión de células se bombea a una velocidad constante, las bolsas pueden llenarse sobre la base de un intervalo de tiempo fijo. Una vez que el conducto de entrada está sellado y cortado, el equipo de transferencia ya no está unido a la bolsa. Esto elimina uno de los puntos de vulnerabilidad durante el almacenamiento.
[0044] El conducto de salida se puede utilizar para el drenaje del contenido de las bolsas. Este conducto permanece sellado de forma estéril durante el llenado, congelación, almacenamiento y descongelación de la bolsa. El conducto de salida se puede denominar alternativamente como línea de inoculación. Un extremo de la línea de inoculación está unido al cuerpo de la bolsa de congelación celular. Este extremo unido se comunica libremente con el compartimento que contiene la suspensión celular. Durante el almacenamiento, la línea de inoculación está protegida contra daños mecánicos al estar cerrada de forma estanca (junto con el conducto de entrada sellado) en un compartimento (es decir, el recinto formado cuando la funda de la bolsa se termosella en la etapa (h) anterior. Cuando se va a utilizar el contenido de la bolsa, el extremo libre de la línea de inoculación se suelda de forma estéril a un tramo del tubo que está conectado al biorreactor de inoculación o los recipientes de cultivo celular.
[0045] Por consiguiente, la divulgación comprende un nuevo procedimiento para la expansión del tren de semillas de células eucariotas. Con este nuevo procedimiento, se aumenta el número de células en cada alícuota del Banco de células de trabajo del fabricante (MWCB). Esto reduce el grado en que las células deben multiplicarse en la expansión del tren de semillas. También es posible aumentar el número de células por alícuota concentrándolas (ver, por ejemplo, el documento US 2014/0273206, de Genzyme). El solicitante prevé que una combinación del procedimiento actual de obtención de un banco de células en fase cerrada de alto volumen combinado con un procedimiento de concentración, sería extremadamente ventajoso.
[0046] Un biorreactor de inoculación destinado puede ser inoculado directamente mediante la transferencia de forma estéril del contenido de la bolsa de congelación celular al biorreactor u otros recipientes de cultivo celular apropiado. Esta inoculación puede tener lugar sin frascos de cultivo de tejidos, frascos giratorios, frascos de agitación o recipientes comparables intermedios. El volumen inicial del cultivo en el biorreactor de inoculación destinado puede ser, por ejemplo, de 2 litros, aumentando hasta 15 litros a medida que las células se multiplican. En consecuencia, con una concentración de células común de 150 x 106/ml y una capacidad de bolsa de 400 ml, es posible sembrar un recipiente de 200 litros directamente a una concentración de siembra de células habitual de aproximadamente 0,3 x 106/ml.
[0047] El sistema de obtención de un banco de células en fase cerrada se puede usar para congelar y almacenar cualquiera de los siguientes: células procariotas, líneas celulares eucariotas, líneas celulares modificadas, líneas celulares que albergan un vector viral recombinante, antígenos concentradas (por ejemplo, virus o viriones de la fiebre aftosa inactivados) y vacunas de ADN.
[0048] En una realización, las células son células de mamífero. En otra realización, las células de mamífero se seleccionan del grupo que consiste en: CHO, CHO-10-DBX11, CHODG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Ils578T, HTB2, BT20, T47D, NSO, CRL7030, células HsS78Bst, PER.C6, SP2/o-Agl4 y células de hibridoma. Las células de insectos como Sf9 también podrían ser una diana para Merial
[0049] En otra realización, las células son células transfectadas de forma estable o transducidas.
Ejemplos
Ejemplo 1
[0050] La figura 1 representa una bolsa de acuerdo con la presente divulgación. Tal como se muestra en la figura 1A y 1B son una bolsa de FEP (1); un primer conducto de PVC (2); un segundo conducto de PVC (3); y un filtro poroso opcional, para permitir un proceso de esterilización de gas (4) (por ejemplo, óxido de etileno). El conducto de entrada (2) y el conducto de salida (3) permanecen ambos fijados de forma estéril al conducto de entrada rígido (5) y al conducto de salida rígido (6) durante las etapas de llenado, congelación, almacenamiento y descongelación. Y mientras que los conductos rígidos realmente representados son de la variedad de puerto con punta, la bolsa de crioconservación también puede emplear pendientes de botón con lengüeta de FEP.
[0051] Tal como se muestra en la figura 1, la bolsa tiene un primer recinto de etileno propileno fluorado (FEP) (7), que está adaptado para recibir y contener asépticamente un volumen de materiales biológicos (por ejemplo, células). El primer recinto (7) está en conexión fluídica con un conducto de entrada rígido de FEP (5), que se puede conectar a un primer tubo flexible de PVC (2). El primer recinto también está en conexión fluídica con un conducto de salida rígido de FEP (6), que se puede conectar a un segundo tubo de PVC flexible (3). La bolsa también incluye una bolsa de FEP (8), que inicialmente está abierta en un extremo (9), y que en cualquier caso está contigua al recinto (7), pero no está conectada de forma fluídica con el mismo debido a un sellado (10) entre el recinto (7) y la bolsa (8). Los conductos rígidos (5, 6) están así acoplados de forma estanca y están rodeados por el FEP que forma el recinto (7) y la bolsa (8), y rodeados por ellos, y la bolsa (8) no está en comunicación fluídica con el primer recinto, ni con los puertos de entrada (5) y de salida (6).
[0052] Tal como se muestra en las figuras 1A y 1B, la bolsa (8) se expande lo suficiente como para que cuando el primer recinto (7) se haya llenado con el material biológico, los tubos de PVC puedan retirarse a la bolsa (ver figura 1C), que a continuación se termosella en un punto aproximadamente indicado por la letra "S", para formar un segundo recinto (11), que ahora contiene ambos tubos de PVC (2, 3), los cuales han sido sellados asépticamente (marcados en la figura 1C con las letras "AS "). La bolsa (1) también contiene un orificio (12), que es adecuado para recibir un medio para colgar la bolsa (por ejemplo, para facilitar el llenado y vaciado de material biológico de las bolsas). Cualquier etiqueta adecuada (20) puede estar impresa en la bolsa (1), e idealmente, debería estar ubicada en la parte (21) de la bolsa que contiene el orificio para colgar (12). Esta parte (21) se separa de forma estanca del resto de la bolsa mediante un termosellado (22) entre ésta y el recinto (7).

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Sistema de banco de células para crioconservación cerrado y de alta capacidad, que comprende:
a. un interfaz de usuario para controlar y monitorizar la dispensación de materiales biológicos líquidos en una pluralidad de bolsas de crioconservación;
b. una pluralidad de bolsas de crioconservación (1), en la que cada bolsa es una bolsa de crioconservación de alta capacidad, que está adaptada para usarse en un sistema de banco para crioconservación de material biológico cerrado y de alta capacidad, y que es resistente a temperaturas de nitrógeno líquido;
c. una pluralidad de conexiones fluídicas adaptadas para llenar la pluralidad de bolsas;
d. un medio de termosellado para sellar los tubos y las bolsas;
e. una pluralidad de casetes metálicos para contener, congelar, almacenar y descongelar las bolsas; y
en el que dicha bolsa de crioconservación de alta capacidad comprende:
f. un primer recinto (7) de etileno propileno fluorado (FEP);
g. al menos un conducto de entrada (5) rígido de FEP, en conexión fluídica con el primer recinto y que se puede conectar a un primer conducto flexible soldable estéril que es un tubo de PVC (2);
h. al menos un conducto de salida (6) rígido de FEP, en conexión fluídica con el primer recinto, y que se puede conectar a un segundo conducto flexible soldable estéril que es un tubo de PVC (3); y
d. una bolsa de FEP (8), que inicialmente está abierta en un extremo (9), y que está contigua al primer recinto, pero que está termosellada del mismo, y que rodea tanto el conducto de entrada rígido como el conducto de salida rígido, de modo que la bolsa no está en comunicación fluídica con el primer recinto, ni con los conductos de entrada y de salida; y en la que la bolsa se expande lo suficiente como para que cuando el primer recinto se haya llenado con el material biológico, los tubos de PVC se puedan retirar a la bolsa, que, a continuación, se pueden termosellar para formar un segundo recinto (11), que ahora contiene ambos tubos de PVC.
2. Sistema de banco de células, según la reivindicación 1, en el que el segundo recinto comprende una funda u otro medio para recibir y contener una etiqueta, que puede usarse para indicar información sobre el contenido de la bolsa.
3. Sistema de banco de células, según la reivindicación 1, en el que el conducto de entrada rígido de FEP se puede conectar al tubo de PVC flexible de entrada a través de un conector cónico de plástico rígido de tipo lengüeta, y en el que el conducto de salida rígido de FEP se puede conectar al tubo flexible de salida a través de un conector de tipo lengüeta de plástico rígido, cada conector estrechado por ambos lados de manera que puedan encajar firmemente dentro de sus respectivos conductos y tubos de PVC.
4. Sistema de banco de células, según la reivindicación 2, en el que los conductos comprenden además anillos de retención.
5. Sistema de banco de células, según la reivindicación 1, en el que la bolsa se ha llenado con el material biológico y en el que los tubos de PVC se han retirado al segundo recinto termosellado.
6. Sistema de banco de células, según la reivindicación 1, en el que la bolsa comprende un orificio, que es adecuado para recibir un medio de suspensión para colgar la bolsa.
7. Uso del sistema de banco de células para crioconservación cerrado y de alta capacidad, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en un procedimiento para congelar y almacenar células.
8. Uso, según la reivindicación anterior, en la obtención de bancos criogénicos de células eucariotas para la posterior expansión del tren de semillas.
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