ES2842215T3 - Lisado antibacteriano de bacterias probióticas - Google Patents

Abstract

Una composición formulada para administración tópica para su uso en el tratamiento o la prevención de infecciones cutáneas, que comprende material secretado de una bacteria probiótica, en la que la composición no comprende sustancialmente ninguna bacteria probiótica intacta, bacteria lisada o fragmento bacteriano.

Description

DESCRIPCIÓN

Lisado antibacteriano de bacterias probióticas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones antibacterianas derivadas de bacterias probióticas.

Antecedentes de la invención

El concepto de que los probióticos son beneficiosos para la salud del intestino se ha investigado durante varios años. Estudios han demostrado que los probióticos mejoran potencialmente la función del intestino a través de varios mecanismos que incluyen el aumento de la función de barrera epitelial (40) y la modulación de la respuesta inmunitaria (6, 51). También hay evidencia de que los probióticos pueden prevenir la colonización del intestino mediante patógenos. Esto puede ser por medio de mecanismos tales como la regulación por disminución de los factores de virulencia y la inhibición de la adherencia de los patógenos al epitelio (2). Por ejemplo, las especies de lactobacilo inhiben la adhesión de Enterobacter sakazakii a la mucosa intestinal mediante exclusión competitiva (32). Otros estudios demostraron que algunos probióticos aumentan la producción de mucina intestinal, inhibiendo así la adherencia de los patógenos a las células epiteliales intestinales (31). Los probióticos también son capaces de producir péptidos antimicrobianos (bacteriocinas) y ácidos. Colectivamente, hay numerosos mecanismos mediados por probióticos que limitan la colonización mediante patógenos (33).

Dado que los probióticos pueden tener impactos positivos sobre el intestino, también se ha empezado a investigar sus efectos potenciales sobre otros sistemas, tales como la boca (18) y el tracto urogenital (44). Un estudio en 2001, que examina el impacto de la administración oral de lactobacilos en un ensayo clínico de mujeres con vaginosis bacteriana, mostró que los lactobacilos podían inhibir de hecho la colonización de células uroepiteliales mediante patógenos (44). Recientemente se ha estudiado la aplicación tópica de probióticos a la piel en un número limitado de estudios (tal como en el documento WO2013/153358).

La aplicación tópica de cepas de Streptococcus salivarius sonicadas a pacientes que sufren dermatitis atópica dio como resultado una función de barrera mejorada aparentemente a través del aumento del nivel de ceramidas en el estrato córneo (13). L. plantarum aplicado de manera tópica para el tratamiento de heridas infectadas dio como resultado una reparación tisular mejorada en un modelo de quemadura en ratones y la prevención de infección en úlceras en la pierna crónicas y quemaduras en humanos (41, 42). Sin embargo, en general los mecanismos subyacentes a estos efectos no se entienden bien.

Staphylococcus aureus es tanto un colonizador transitorio de la piel como un gran patógeno de la piel oportunista, que provoca enfermedades que van desde impétigo hasta estados potencialmente mortales tales como sepsis (25). Previamente, nuestro laboratorio demostró que el probiótico L. reuteri podía proteger los queratinocitos epidérmicos frente a los efectos tóxicos de S. aureus por medio de la exclusión competitiva del patógeno de los sitios de unión a queratinocitos (43). Los inventores han identificado ahora L. rhamnosus GG como un segundo probiótico con la capacidad de proteger las células cutáneas frente a los efectos de S. aureus. Sin embargo, L. rhamnosus GG usa múltiples mecanismos de protección frente a infección que incluyen la inhibición del crecimiento de S. aureus, la exclusión competitiva y el desplazamiento del patógeno de los queratinocitos.

Sumario de la invención

Pocos estudios han evaluado los beneficios potenciales de la aplicación tópica de bacterias probióticas o material derivado de las mismas. Los inventores han investigado si una bacteria probiótica, Lactobacillus rhamnosus GG, puede inhibir la infección por Staphylococcus aureus de queratinocitos primarios humanos en cultivo. Cuando se expusieron queratinocitos humanos primarios a S. aureus, solo el 25% de los queratinocitos seguían siendo viables 24 h después. Sin embargo, en presencia de 108 UFC/ml de L. rhamnosus GG vivo, la viabilidad de los queratinocitos infectados aumentaba hasta el 57% (P=0,01). De manera interesante, lisados de L. rhamnosus GG y fluido de cultivo gastado también proporcionaron una protección significativa a los queratinocitos, siendo un 65% (P=0,006) y un 57% (P=0,01) de células, respectivamente, viables tras 24 h de incubación. La supervivencia de los queratinocitos se mejoraba significativamente independientemente de si el probiótico se aplicaba en forma viable, o como lisados, 2 h antes o simultáneamente (P=0,005) o 12 h después (P=0,01) de la infección por S. aureus. Sin embargo, el fluido de cultivo gastado solo protegía si se añadía antes o simultáneamente a S. aureus. Con respecto al mecanismo, tanto el lisado de L. rhamnosus GG como el fluido de cultivo gastado inhibían aparentemente la adherencia de S. aureus a los queratinocitos mediante exclusión competitiva, pero solo bacterias viables o el lisado podían desplazar a S. aureus (P=0,04 y 0,01, respectivamente). Además, el crecimiento de S. aureus se inhibió mediante o bien bacterias vivas o bien lisado, pero no fluido de cultivo gastado. Conjuntamente, estos datos sugieren al menos dos actividades independientes implicadas en los efectos protectores de L. rhamnosus GG frente a S. aureus, la inhibición del crecimiento y la reducción de la adhesión bacteriana.

Los inventores han demostrado previamente que las bacterias probióticas y lisados de las mismas en la protección de células frente a infección mediante bacterias patógenas tales como S. aureus (véase el documento WO2013/153358). Ahora han demostrado que el sobrenadante de cultivo libre de células, en el que se han cultivado previamente las bacterias probióticas, también es capaz de prevenir que las bacterias patógenas se adhieran a, o infecten, las células. Por tanto, las bacterias probióticas son capaces de proteger las células frente a la infección mediante al menos dos mecanismos. En primer lugar, las bacterias probióticas pueden ser capaces de reducir o inhibir el crecimiento de bacterias patógenas a través de uno o más agentes contenidos dentro de la bacteria probiótica que son capaces de inhibir directamente el crecimiento y/o la viabilidad de las bacterias patógenas. En segundo lugar, y tal como se identifica en el presente documento, uno o más agentes que se secretan de las bacterias probióticas (y por tanto presentes en los medios de cultivo) son capaces de inhibir la capacidad de las bacterias patógenas de infectar las células, posiblemente a través de prevenir la adhesión de las bacterias patógenas a las células. Por tanto, el material secretado por las bacterias probióticas protege frente a una infección bacteriana patógena. Por tanto, el material secretado tiene propiedades antibacterianas, o antiinfecciosas, que pueden aprovecharse en una variedad de composiciones antibacterianas tal como se describe en el presente documento.

Descripción

La invención se define en las reivindicaciones.

La invención incluye la combinación de los aspectos y las características preferidas descritos excepto cuando una combinación de este tipo sea claramente no permisible o se evite expresamente.

Los encabezamientos de sección usados en el presente documento son solo con fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes del contenido descrito.

Bacterias probióticas

La invención se refiere al uso de bacterias probióticas. Los probióticos se definen comúnmente como “microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio para la salud en el huésped”. Estudios en el intestino han demostrado la capacidad de las bacterias probióticas de inhibir la colonización mediante patógenos a través de mecanismos que incluyen exclusión, competición y desplazamiento del acoplamiento de los patógenos a los tejidos huésped. Tal como se usa en el presente documento, el término “bacteria probiótica” también puede hacer referencia a tales bacterias cuando ya no están vivas, por ejemplo, tras la inactivación mediante calor o radiación.

Lactobacillus rhamnosus

La invención se refiere particularmente a bacterias probióticas de la especie Lactobacillus rhamnosus. Tales bacterias se consideraron originariamente una subespecie de Lactobacillus casei, pero posteriormente la investigación genética encontró que era una especie en sí misma. Se conocen varias cepas de L. rhamnosus. Por ejemplo, las cepas I-1720 (Pasteur collection Nationale de Cultures de Microorganismes), AC413, GR-1 (Karlsson etal., BMC microbiology 2012, 12:15), JB-1 (Bravo et al., PNAS 2011 108(38) 16050-16055) GG y LC705 (Savijok et al., J. Proteome Research 2011 10(8) 3460-3474). Otras cepas de L. rhamnosus pueden aislarse fácilmente.

En particular, la invención se refiere a L. rhamnosus GG. L. rhamnosus GG (también denominado en el presente documento LGG) está depositado en la ATCC (American Tissue Culture Collection) con el número de registro ATCC 53103. LGG se aisló en 1983 del tracto intestinal de un ser humano sano por Gorbach y Goldin.

Composiciones

Las composiciones según la invención comprenden o consisten en material secretado de bacterias probióticas.

El material secretado se refiere a material secretado de una bacteria probiótica. El material secretado puede ser un único agente. Puede ser una mezcla de más de un agente. El material secretado puede incluir proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos o lípidos. El material secretado puede incluir el secretoma, que es todas las proteínas secretadas y la maquinaria secretora de la bacteria probiótica. Puede abarcar adicionalmente moléculas que no son proteínas, tales como carbohidratos, lípidos y ácido nucleico.

Algunas composiciones descritas en el presente documento contienen material secretado en un portador. El portador es habitualmente una disolución en la que el material secretado está disuelto, suspendido, diluido o mezclado.

En algunos casos, el portador puede ser el medio que ha estado en contacto con la bacteria probiótica durante el cultivo. La composición del medio habrá cambiado durante el cultivo, por ejemplo, por la secreción de material de la bacteria probiótica. Las composiciones pueden consistir en o comprender medio de cultivo en el que han estado creciendo las bacterias probióticas.

Los medios adecuados para cultivar bacterias probióticas se conocen ampliamente por los expertos en la técnica. Tal como se usan en el presente documento, los términos “medios” y “medio” abarcan cualquier líquido que contenga nutrientes en el que puedan soportarse, mantenerse vivos, hacerse crecer y/o expandirse microorganismos tales como bacterias. Los medios pueden contener los nutrientes mínimos para soportar la vida bacteriana, y opcionalmente otros nutrientes. Los nutrientes a modo de ejemplo contenidos dentro del caldo incluyen azúcar, magnesio, fosfato, fósforo y azufre. Los medios pueden estar hechos de, o modificados a partir de, una combinación de nutrientes que se conoce ampliamente en la técnica, tal como caldo de Wilkins-Chalgren. Los medios pueden obtenerse premezclados de una fuente comercial, o pueden prepararse internamente.

La bacteria probiótica puede haber estado en contacto con los medios durante al menos seis horas, al menos doce horas, al menos dieciocho horas, al menos veinticuatro horas, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos dos semanas o más.

Las bacterias probióticas pueden haberse cultivado en los medios, o haber estado en contacto con los medios, en condiciones aerobias o anaerobias. Preferiblemente, las bacterias probióticas se han cultivado en condiciones anaerobias. Por ejemplo, el cultivo puede realizarse bajo el 10% de H², el 10% de CO², el 80% de N².

Las bacterias probióticas pueden haberse cultivado en los medios en condiciones que facilitan el crecimiento y la expansión de las bacterias probióticas. Tales condiciones son ampliamente conocidas para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el cultivo puede incubarse a 37°C.

La composición no contiene ninguna bacteria probiótica. Las bacterias probióticas pueden haberse retirado de los medios, por ejemplo, mediante centrifugación y/o filtración. Por ejemplo, las bacterias pueden haberse retirado sedimentándolas a partir de los medios en una centrífuga a 15.000 x g durante un periodo de tiempo suficiente para que sustancialmente todas las bacterias sedimenten a partir de los medios. Los medios pueden filtrarse usando un filtro microporoso con poros de un tamaño adecuado para retirar sustancialmente todas las bacterias de los medios. Estos métodos pueden retirar bacterias intactas, y también pueden retirar residuos bacterianos, tales como los restos de cualquier bacteria que haya experimentado lisis celular tal como mediante apoptosis. Los medios que contienen material secretado no se han obtenido de un cultivo que ha experimentado un proceso de lisis, y por tanto no son, y no se han obtenido de, un lisado.

La composición puede ser estéril. Es decir, que el material secretado se ha sometido a un proceso de esterilización, tal como irradiación, calor, productos químicos, presión o filtración, o cualquier combinación de los mismos. Esto puede incluir someter a autoclave, esterilización por rayos x o esterilización por luz UV. En el caso de medios que contienen el material secretado, los medios pueden haberse esterilizado antes de que se hayan introducido y cultivado las bacterias probióticas, y también después de que las bacterias se hayan retirado de esos medios.

La composición que comprende material secretado no contiene sustancialmente ninguna bacteria intacta. La composición también está sustancialmente libre de bacterias lisadas o fragmentos bacterianos, tales como bacterias que han experimentado apoptosis. Las bacterias intactas y/o bacterias lisadas o fragmentos bacterianos se separan del material secretado. Las separación puede producirse mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica, tal como centrifugación o filtración. Con “sustancialmente libre de” quiere decirse que el material secretado no contiene o contiene una contaminación mínima de componentes bacterianos no secretados, tales como bacterias completas, bacterias lisadas o fragmentos bacterianos. Por tanto, la composición puede contener el 100% de material secretado, al menos el 99% de material secretado, al menos el 95% de material secretado, al menos el 90% de material secretado, al menos el 85% de material secretado, al menos el 80% de material secretado, al menos el 75% de material secretado o al menos el 70% de material secretado. El material secretado puede comprender componentes adicionales de origen no bacteriano, tal como disoluciones de portador, otros agentes activos o conservantes, tal como se describen en el presente documento.

Las composiciones tal como se describen en el presente documento pueden prepararse cultivando bacterias probióticas en medios, separando las bacterias probióticas de los medios y preparando una composición a partir de los medios. Las bacterias probióticas pueden cultivarse en condiciones anaerobias. Las bacterias probióticas pueden cultivarse a una temperatura por encima de la temperatura normal del cuerpo humano. Las bacterias probióticas pueden cultivarse a 302C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C o 41°C. Preferiblemente, las bacterias probióticas se cultivan a 37°C. Las bacterias probióticas pueden cultivarse en los medios durante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días. Las bacterias probióticas o bacterias lisadas o fragmentos de bacterias pueden separarse de los medios mediante centrifugación, tal como centrifugación a 15000 x g. Los medios pueden separarse de las bacterias probióticas, bacterias lisadas o fragmentos de bacterias mediante filtración. Los medios pueden separarse mediante una combinación de filtración y centrifugación. Los medios pueden someterse a esterilización, antes o después de retirar las bacterias probióticas. Por ejemplo, tras la separación de los medios de las bacterias completas, bacterias lisadas o fragmentos bacterianos, los medios pueden someterse a esterilización. Los medios pueden someterse a concentración, de modo que la proporción de material secretado aumente en relación con el volumen total de medios. La concentración puede producirse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como evaporación. El material secretado puede separarse de los medios. Puede usarse cualquier método de separación de material de una disolución de portador.

Por ejemplo, el material secretado puede separarse de los medios mediante cromatografía, cristalización, destilación, secado, electroforesis o precipitación. Una vez aislado de los medios, o concentrados en los medios, el material secretado puede disolverse o diluirse en un portador, o formularse de otro modo para dar una composición tal como se da a conocer en el presente documento.

Aplicaciones terapéuticas

Los compuestos y las composiciones de la presente invención son útiles en el tratamiento de una amplia gama de enfermedades y estados. En particular son útiles en el tratamiento y la prevención de infecciones cutáneas, incluyendo infecciones bacterianas. En particular, los compuestos y las composiciones son útiles en el tratamiento o la prevención de infecciones por S. aureus. Los compuestos y las composiciones son particularmente útiles en el tratamiento de infecciones bacterianas de tejidos blandos, tales como infecciones cutáneas. Los compuestos y las composiciones de la presente invención son particularmente útiles en la prevención o el tratamiento de infecciones cutáneas por S. aureus.

La invención se refiere a la prevención o el tratamiento de infecciones. Las composiciones probióticas de la presente invención presentan actividad antiinfecciosa. Por ejemplo, actividad antiadhesión, incluyendo prevenir la adhesión de S. aureus a células. Por tanto, las composiciones son útiles para la prevención o el tratamiento de infecciones cutáneas incluyendo infecciones bacterianas, tal como la prevención o el tratamiento de infecciones bacterianas resistentes a múltiples fármacos, infecciones bacterianas adquiridas en hospitales, infecciones bacterianas resistentes a antibióticos, infecciones por infecciones bacterianas gram negativas y/o gram positivas.

Las composiciones de la invención son útiles en la prevención de infecciones por Staphylococcus spp., tal como S. saprophyticus, S. xylosus, S. lugdenensis, S. schleiferi, S. caprae, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. warneri, S. aureus, S. hominis, S. aureus resistente a meticilina (MRSA), S. pyrogenes, S. salivariu, S. mutans y S. pneumonia.

En particular, las composiciones de la invención presentan actividad antiadhesión de estafilicocos, y por tanto son útiles en la prevención o el tratamiento de infección por estafilococos. Por ejemplo, las composiciones de la invención presentan actividad anti-Staphylococcus aureus, y por tanto son útiles en la prevención o el tratamiento de infecciones por S. aureus.

Las infecciones se producen cuando microorganismos que provocan enfermedad invaden los tejidos del cuerpo. La multiplicación de esos microorganismos y las toxinas que producen reaccionan con los tejidos del cuerpo, provocando a menudo reacciones inmunitarias por parte del huésped infectado. Las infecciones pueden estar provocadas por bacterias, virus, viroides, hongos y otros parásitos. Las infecciones pueden producirse por medio de cualquiera de los tejidos del cuerpo, tal como la piel, el intestino o membranas. La invención se refiere al tratamiento o la prevención de infección de la piel.

Las composiciones según la invención pueden usarse en la prevención o el tratamiento de infecciones cutáneas. La infección puede deberse a una bacteria, tal como una bacteria estafilocócica, incluyendo S. aureus. La composición puede aplicarse por separado, secuencial o simultáneamente con exposición al agente infeccioso. Preferiblemente, la composición se aplica antes de la exposición al agente infeccioso.

Las composiciones de la invención se usan preferiblemente para la prevención de infección bacteriana. Se administran preferentemente a un sujeto antes de que ese sujeto se exponga al agente infeccioso, tal como S. aureus. El sujeto puede haberse identificado como que corre riesgo de infección por el agente infeccioso. Los sujetos pueden identificarse como que corren riesgo de infección por un agente infeccioso debido a su entorno, por ejemplo, al estar situados en un entorno en el que se conoce que el agente inventivo existe, o debido a la salud del sujeto, tal como la existencia de una herida abierta o salud inmunitaria pobre. Por ejemplo, las composiciones pueden usarse en un hospital u otro entorno clínico en el que se conoce, o se sospecha, que una bacteria patológica está presente.

En algunos casos, el paciente va a someterse, o se ha sometido recientemente, a cirugía. Las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse para prevenir la infección de una herida abierta tal como una incisión quirúrgica o injerto por una bacteria patógena.

En algunos casos, se determina que el sujeto no tiene una infección por el agente infeccioso. Por ejemplo, puede determinarse que el sujeto no tiene una infección por S. aureus. Métodos para determinar si un sujeto tiene una infección se conocen ampliamente en la técnica, y pueden incluir el análisis de una muestra obtenida del sujeto para la presencia del agente infeccioso.

Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, o bien simultáneamente o bien secuencialmente, dependiendo del estado que deba tratarse.

El material secretado puede disolverse en, suspenderse en o mezclarse con uno o más de otros componentes farmacéuticamente aceptables. La bacteria probiótica o lisado de la misma puede presentarse en un liposoma u otra micropartícula.

En algunas realizaciones, el material secretado puede proporcionarse como suspensión en un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la bacteria probiótica puede proporcionarse como liofilizado.

Formulaciones

Aunque es posible que el material secretado se use solo, es preferible presentarlo como formulación que comprende el material y un portador. El material secretado puede disolverse en, suspenderse en o mezclarse con uno o más de otros componentes. En algunos casos, el material secretado se presenta en un liposoma u otra micropartícula.

Las formulaciones dadas a conocer en el presente documento incluyen formulaciones para el cuidado de la piel, para el cuidado de heridas, para el cuidado respiratorio y para el cuidado oral, incluyendo productos médicos, de cuidado personal y de consumo.

Las formulaciones pueden estar de manera adecuada en forma de líquidos, disoluciones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), suspensiones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), emulsiones (por ejemplo, aceite-en-agua, agua-en­ aceite), tinturas, geles, pastas, pomadas, cremas, lociones, aceites, espumas o pulverizaciones.

Las formulaciones pueden proporcionarse de manera adecuada como parche, tirita adhesiva, vendaje, apósito o similar, que se impregna con uno o más compuestos activos y opcionalmente uno o más de otros componentes farmacéuticamente aceptables, incluyendo, por ejemplo, potenciadores de la penetración, permeación y absorción. Las formulaciones también pueden proporcionarse de manera adecuada en forma de un depósito o reservorio.

En algunas formulaciones, el material secretado se formula con uno o más componentes farmacéuticamente aceptables. Los componentes farmacéuticamente aceptables son ampliamente conocidos para los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, portadores, adyuvantes, excipientes, diluyentes, cargas, tampones, conservantes, antioxidantes, lubricantes, estabilizadores, solubilizantes, tensioactivos (por ejemplo, agentes humectantes), agentes de enmascaramiento, agentes de coloración, agentes aromatizantes y agentes edulcorantes farmacéuticamente aceptables. La formulación puede comprender además otros agentes activos, por ejemplo, otros agentes terapéuticos o profilácticos.

Los productos y las formulaciones en el presente documento son adecuados para el cuidado de la piel o cuidado de heridas. “Cuidado de la piel” significa productos para el cuidado personal y/o el cuidado para la salud tópico incluyendo productos útiles para el tratamiento de la piel adulta o infantil para mantener o mejorar la salud de la piel o mejorar el aspecto de la piel. “Cuidado de heridas” incluye productos para el tratamiento de una herida para ayudar en el cierre o la curación de la herida, y/o para reducir el dolor o la cicatrización asociados con la herida, mantener o mejorar la salud de tal tejido o piel, reparar tal tejido o piel, y reducir la irritación, picazón y/o rojez de tal tejido o piel.

El material secretado según la invención se formula para administración tópica, particularmente para su uso o aplicación a, o sobre, la piel.

Las formulaciones adecuadas para administración tópica incluyen geles, pastas, pomadas, cremas, lociones y aceites, así como parches, tiritas adhesivas, vendajes, apósitos, depósitos, cementos, pegamentos y reservorios.

Las pomadas se preparan normalmente a partir del material secretado y una base de pomada parafínica o una miscible con agua.

Las cremas se preparan normalmente a partir de la bacteria probiótica o lisado y una base de crema de aceite-en­ agua. Si se desea, la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, al menos aproximadamente el 30% p/p de un alcohol polihidroxilado, es decir, un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilo tal como propilenglicol, butano-1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol y mezclas de los mismos. Las formulaciones tópicas pueden incluir de manera deseable un compuesto que potencia la absorción o penetración del compuesto activo a través de la piel u otras áreas afectadas. Los ejemplos de tales potenciadores de la penetración dérmica incluyen dimetilsulfóxido y análogos relacionados.

Las emulsiones se preparan normalmente a partir de la bacteria probiótica o lisado y una fase oleosa, que puede comprender opcionalmente meramente un emulsionante (conocido por lo demás como emulgente), o puede comprender una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa o un aceite o tanto con una grasa como con un aceite. Preferiblemente, se incluye un emulsionante hidrófilo junto con un emulsionante lipófilo que actúa como estabilizador. También se prefiere incluir tanto un aceite como una grasa. Conjuntamente, el/los emulsionante(s) con o sin estabilizador(es) constituyen la denominada cera emulsionante, y la cera junto con el aceite y/o la grasa constituyen la denominada base de pomada emulsionante que forma la fase dispersada oleosa de las formulaciones de crema.

Los emulgentes y estabilizadores de emulsión adecuados incluyen Tween 60, Span 80, alcohol cetoestearílico, alcohol miristílico, monoestearato de glicerilo y laurilsulfato de sodio. La elección de aceites o grasas adecuados para la formulación se basa en conseguir las propiedades cosméticas deseadas, dado que la solubilidad del compuesto activo en la mayoría de los aceites cuyo uso es probable en formulaciones en emulsión farmacéuticas puede ser muy baja. Por tanto, la crema debe ser preferiblemente un producto no graso, que no mancha y lavable con una consistencia adecuada para evitar la fuga de tubos u otros recipientes. Pueden usarse ésteres alquílicos mono- o dibásicos, de cadena lineal o ramificada, tales como di-isoadipato, estearato de isocetilo, diéster de propilenglicol de ácidos grasos de coco, miristato de isopropilo, oleato de decilo, palmitato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de 2-etilhexilo o una combinación de ésteres de cadena ramificada conocida como Crodamol CAP, siendo los tres últimos los ésteres preferidos. Estos pueden usarse solos o en combinación dependiendo de las propiedades requeridas. Alternativamente pueden usarse lípidos de alto punto de fusión tales como parafina blanda blanca y/o parafina líquida u otros aceites minerales.

Algunas formulaciones dadas a conocer en el presente documento se proporcionan de manera adecuada como parche, tirita adhesiva, vendaje, apósito o similar, que se impregna con, o recubre con, uno o más materiales secretados según la invención y opcionalmente uno o más de otros componentes farmacéuticamente aceptables, incluyendo, por ejemplo, potenciadores de la penetración, permeación y absorción.

Las composiciones y formulaciones según la invención pueden comprender además otros agentes activos, por ejemplo, otros agentes antibacterianos tales como agentes bactericidas.

En algunas realizaciones, una formulación para su uso según la presente invención puede comprender al menos aproximadamente el 0,01%, aproximadamente el 0,05%, aproximadamente el 0,1%, aproximadamente el 0,2%, aproximadamente el 0,3%, aproximadamente el 0,4%, aproximadamente el 0,5%, aproximadamente el 0,6%, aproximadamente el 0,7%, aproximadamente el 0,8%, aproximadamente el 0,9%, aproximadamente el 1,0%, aproximadamente el 1,5%, aproximadamente el 2,0%, aproximadamente el 3,0%, aproximadamente el 4,0%, aproximadamente el 5,0%, aproximadamente el 6,0%, aproximadamente el 7,0%, aproximadamente el 8,0%, aproximadamente el 9,0%, aproximadamente el 10,0%, aproximadamente el 11,0%, aproximadamente el 12,0%, aproximadamente el 13,0%, aproximadamente el 14,0%, aproximadamente el 15,0%, aproximadamente el 16,0%, aproximadamente el 17,0%, aproximadamente el 18,0%, aproximadamente el 19,0%, aproximadamente el 20,0%, aproximadamente el 25,0%, aproximadamente el 30,0%, aproximadamente el 35,0%, aproximadamente el 40,0%, aproximadamente el 45,0%, aproximadamente el 50,0% en peso de material secretado.

En algunas realizaciones, la formulación puede comprender uno de al menos aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 30%, de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 20%, de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 5%, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 30%, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 20%, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 15%, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 10%, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 5%, de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 5%, de aproximadamente el 0,3% a aproximadamente el 5%, de aproximadamente el 0,4% a aproximadamente el 5%, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 5%, de aproximadamente el 1% a 10 aproximadamente el 5%, en peso de material secretado.

Preparaciones farmacéuticas

Las preparaciones probióticas según la invención pueden formularse como composiciones farmacéuticas para uso clínico y pueden comprender un portador, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Se formulan para administración tópica.

La administración es preferiblemente en una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva, siendo esta una cantidad suficiente para mostrar beneficio para el individuo. La cantidad real administrada, y la tasa y el curso del tiempo de administración dependerán de la naturaleza y la gravedad de la enfermedad que esté tratándose. La prescripción de tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosificación, etc., está dentro de la responsabilidad de los médicos generales y otros doctores médicos, y normalmente tiene en cuenta el trastorno que debe tratarse o prevenirse, el estado del paciente individual, el sitio de administración, el método de administración y otros factores conocidos por los médicos. Ejemplos de las técnicas y los protocolos mencionados anteriormente pueden encontrarse en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20a edición, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins. Un experto en la técnica apreciará que las dosificaciones apropiadas de los compuestos activos y las composiciones que comprenden los compuestos activos pueden variar de paciente a paciente.

Las composiciones de la presente invención pueden formularse como medicamentos, es decir formularse como medicamento. El medicamento puede incluir otros componentes farmacéuticamente aceptables ampliamente conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, portadores, adyuvantes, excipientes, diluyentes, cargas, tampones, conservantes, antioxidantes, lubricantes, estabilizadores, solubilizantes, tensioactivos (por ejemplo, agentes humectantes), agentes de enmascaramiento, agentes de coloración, agentes aromatizantes y agentes edulcorantes farmacéuticamente aceptables. La formulación puede comprender además otros agentes activos, por ejemplo, otros agentes terapéuticos o profilácticos.

Ahora se ilustrarán aspectos y realizaciones de la presente invención, a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas. Aspectos y realizaciones adicionales resultarán evidentes para los expertos en la técnica.

Breve descripción de las figuras

Ahora se comentarán realizaciones y experimentos que ilustran los principios de la invención con referencia a las figuras adjuntas, en las que:

Figura 1: L. rham nosus GG protege a los queratinocitos de los efectos tóxicos de S. aureus. Las células no infectadas tenían una viabilidad media del (90%). Las células infectadas por S. aureus tenían una viabilidad media del (25% ± 3,4). En queratinocitos infectados con una combinación de S. aureus y L. rhamnosus GG (LGG+SA), la viabilidad tras 24 horas era del 57%± 2,7 (P=0,01, n=3).

Figura 2: Lisado y flu ido de cultivo gastado (CM) de L. rham nosus GG protegen a los queratinocitos de los efectos de S. aureus. La viabilidad de queratinocitos infectados por S. aureus con lisado de L. rhamnosus GG (LGGLYS+SA) era del 65%± 2,4 y con fluido de cultivo gastado (LGGCM+SA) era del 57%±1,5 en comparación con el 25%±3,1 en queratinocitos infectados con S. aureus (SA) solo (P=0,006, P= 0,01 respectivamente, n=3).

Figura 3: L. rham nosus GG protege a los queratinocitos de la infección con S. aureus. El porcentaje de viabilidad de los queratinocitos era significativamente mayor en células que se habían expuesto previamente a L. rhamnosus GG (LGG SA), lisado (LGG LYS+ SA) o fluido de cultivo gastado (LGG CM+SA) (58% ± 1,4, 57% ± 1,9, 55% ± 0,5, P=0,006, P=0,005, P=0,004) en comparación con células infectada por S. aureus (SA) (25% ±1,3) (n=3).

Figura 4: L. rham nosus GG pero no su flu ido de cultivo gastado rescata a los queratinocitos de toxicidad mediada por S. aureus. A) Se incubaron queratinocitos no infectados durante la noche; aproximadamente el 90% de las células eran viables tras 24 horas. La viabilidad de queratinocitos infectados por S. aureus era significativamente mayor en células expuestas posteriormente con L. rhamnosus GG (P=0,003, n=3) 2 h (52%±1,6), 4 h (54%±1,4), 6 h (57%±1,3), 8 h (58%±1,3) o 12 h (58%±1,5). B) Había una diferencia significativa entre la viabilidad de las células (P=0,01, n=3) tratadas con lisado de L rhamnosus GG 2 h (574%±3,1), 4 h (58%±2,1), 6 h (63%±1,2), 8 h (63%±1,3) o 12 h (55%±2,4) tras haber empezado la infección, y la viabilidad de queratinocitos que se habían infectado con S. aureus (SA) solo (25%±1,7). C) Las células expuestas posteriormente con fluido de cultivo gastado de L. rhamnosus GG (CM) no tenían una protección significativa (P=0,15, n=3) 2 h (32% ±2,6), 4 h (39%±2,4), 6 h (37%±1,8), 8 h (36%±1,3) o 12 h (35%±3,5), mientras que las células expuestas conjuntamente tenían una protección significativa frente a infección por S. aureus (56%±2,1, P=0,01, n=3).

Figura 5: Lisado de L. rham nosus GG, pero no flu ido de cultivo gastado, redujo la viabilidad estafilocócica. A) Las densidades ópticas de cultivos de S. aureus (SA) que crecen en presencia de queratinocitos y tratados con lisado de L. rhamnosus GG (LGG LYS) o fluido de cultivo gastado (LGG CM) se determinó cada hora para monitorizar el crecimiento de las bacterias. El crecimiento de S. aureus en presencia de los lisados probióticos era significativamente menor que en cultivos de S. aureus (P=0,02, n=3), mientras que el fluido de cultivo gastado no tenía ningún efecto. B) El número de S. aureus (SA) viables en cultivo de queratinocitos solo era de 8 log UFC/ml o con fluido de cultivo gastado (LGG CM) de 7,87 log UFC/ml, mientras que 5 log UFC/ml de S. aureus (SA) eran viables en presencia de lisado de L. rhamnosus GG. C) El número total de estafilococos viables en cultivo de queratinocitos se redujo mediante el lisado de L rhamnosus GG en un ensayo posterior a la infección (2-4-6-8 y 12 horas), también mostró una reducción significativa en la viabilidad de S. aureus tras una incubación de 2 h (P=0,05, n=3) en comparación con S. aureus solo.

Figura 6: L. rham nosus GG vivo, lisado o flu ido de cultivo gastado inhibió la adhesión de S. aureus a queratinocitos mediante la exclusión competitiva de sitios de unión. Capacidad de bacterias para adherirse a queratinocitos S. aureus (SA) (106), cuando se aplicó a queratinocitos durante 1 h adhirió a las células a aproximadamente 7,5 ± 0,6 log UFC/ml, mientras que L. rhamnosus GG (LGG) (108) se adhirió a aproximadamente 7,9 ± 0,5 log UFC/ml. Células expuestas previamente con L. rhamnosus g G (LGG+s A), lisado (LGGLYS+SA) o fluido de cultivo gastado (LGG CM+SA) tenían significativamente menos estafilococos adheridos a las mismas (5,83 ± 0,2 log UFC/ml, 5,9 ± 0,6 log UFC/ml y 6,4 ± 0,7 log UFC/ml respectivamente) en comparación con células infectadas con S. aureus (SA) solo (7,9 ± 0,6 log UFC/ml) (P=0,04, n=3).

Figura 7: L. rham nosus GG vivo o lisado inhibió la adhesión de S. aureus a queratinocitos mediante el desplazamiento competitivo a sitios de unión. Células expuestas posteriormente con L. rhamnosus GG (LGG-12h) o lisado (LGGLYS-12h) tenían significativamente menos estafilococos adheridos a las mismas tras 12 h (5,8 ± 0,7 log UFC/ml, 5,4 ± 0,3 log UFC/ml respectivamente) en comparación con células infectadas con S. aureus (SA) solo (7,95 ± 0,6 log UFC/ml) (P=0,01, n=3). Mientras, las células expuestas posteriormente con fluido de cultivo gastado de L. rhamnosus GG (LGG CM-12 h) no redujeron el índice de adhesión de S. aureus (7 ± 0,6 log UFC/ml, P>0,05, n=3).

Ejemplos

Ejemplo 1: Materiales y métodos

Cultivo de células de mamífero

Se usaron queratinocitos epidérmicos humanos normales (NHEK) cultivados en medio basal para queratinocitos (Promocell, Heidelberg, Alemania) que contenía una mezcla de suplementos (extracto pituitario bovino 0,004 mg/ml, factor de crecimiento epidérmico (humano recombinante) 0,125 ng/ml, insulina (humana recombinante) 5 pg/ml, hidrocortisona 0,33 pg/ml, epinefrina 0,39 pg/ml y transferrina, holo (humana) 10 pg/ml) y CaCl²0,06 mM (Promocell, Heidelberg, Alemania) como sistema de modelo. Estos se cultivaron de manera rutinaria a 37°C en una atmósfera húmeda de CO² al 5% en matraces de cultivo T-75 tal como se describió previamente (43).

Cultivo de células bacterianas

Se hizo crecer Lactobacillus rhamnosus Goldin y Gorbach (L. rhamnosus GG) (ATCC 53103, ATCC, Middlesex, R. U.) de manera rutinaria en caldo de Wilkins-Chalgren o agar (Oxoid, Basingstoke, R. U.) a 37°C en incubado en un armario anaerobio (atmósfera, 10:10:80, H²-CO²-N²). Se hizo crecer Staphylococcus aureus de manera aerobia a 37°C en caldo de nutrientes (Oxoid, Basingstoke, R. U.) tal como se describió previamente (43).

Tratamiento de queratinocitos con bacterias

Se centrifugaron bacterias (108 UFC/ml de probióticos y 106 UFC/ml de S. aureus) a 15.000 x g, se lavaron dos veces en NaCl al 0,85% y se resuspendieron en medio basal para queratinocitos. Esta suspensión se añadió directamente a 5 x 103 células/cm2 de NHEK en crecimiento en placas de 24 pocillos. Para experimentos usando un lisado probiótico, se centrifugaron 10 ml de 108 UFC/ml de L rhamnosus GG, se lavaron, se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH=7,4 (10 mM) y se lisaron usando un MSE Soniprep 150. Se filtraron las muestras usando un filtro de poros de 0,22 pm (Millipore, Billerica, EE. UU.) para retirar cualquier bacteria completa restante. Aproximadamente 100 pl de este lisado se usaron para tratar los queratinocitos (5 x 103 células/cm2). En algunos experimentos, se sedimentaron células en una centrífuga a 15.000 x g durante 5 minutos y el sobrenadante libre de células (fluido de cultivo gastado) se recogió y se filtró usando un filtro de poros de 0,22 pm (Millipore, Billerica, EE. UU.) para retirar cualquier bacteria completa restante. En otros experimentos, se coinfectaron monocapas de queratinocitos con patógenos más probióticos o lisados simultáneamente. En experimentos independientes, se expusieron células a lisado de L. rhamnosus GG 2, 4, 6, 8 y 12 horas tras haberse consumado la infección por S. aureus. En todos los experimentos, se desprendieron los queratinocitos y se determinó la viabilidad celular usando ensayos de exclusión con azul de tripán tal como se describe en (43).

Medición de la viabilidad de S. aureus en cultivo celular

Para determinar si los lisados de L. rhamnosus GG o queratinocitos eran capaces de inhibir el crecimiento de S. aureus en cultivo celular, se hicieron crecer los queratinocitos hasta confluencia en una placa de 24 pocillos. Estos se expusieron a S. aureus solo, o S. aureus más lisados de L. rhamnosus GG o medio acondicionado. En experimentos independientes, se expusieron células a lisados de L. rhamnosus GG 2, 4, 6, 8 y 12 horas tras la infección con S. aureus. El número total de estafilococos viables se determinó contando las colonias tal como se describió previamente (43).

Medición de la adhesión bacteriana a queratinocitos

Se expusieron queratinocitos confluentes a bacterias durante 1 h. Entonces se lavaron las células tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH=7,4 (10 mM) (Invitrogen, Life Technologies Ltd, Paisley, R. U.) para retirar las bacterias no adherentes. Se tripsinizaron las células y se realizaron recuentos de placas con dilución en serie para evaluar el número de bacterias adherentes. Se usó agar selectivo para el crecimiento de estafilococos.

Determinación de antagonismo bacteriano

Se inoculó una alícuota de 10 pl de un cultivo durante la noche de S. aureus en 7 ml de los medios de agar blando (agar al 0,7%) y se añadió directamente a placas, en las que se había vertido previamente base de agar. Se sembraron puntualmente 100 pl de cada organismo o extracto de cultivos de L. rhamnosus GG sobre el lecho de S. aureus.

Determinación del desenlace del cocultivo (ensayos de competición)

Se inocularon alícuotas (100 pl) de lisados de L. rhamnosus GG y S. aureus en 10 ml de caldos WCB. Se midieron el pH y la densidad óptica de cultivos a 0 y 24 h. A intervalos regulares (indicados en el texto) se contaron las bacterias mediante recuentos de placas con dilución en serie usando agar selectivo.

Análisis estadísticos

Todos los experimentos se realizaron un mínimo de tres veces, con tres repeticiones dentro de cada experimento. Los datos generados se analizaron mediante ANOVA de una vía y prueba de Tukey post hoc usando el programa SPSS (IBM SPSS Statistics versión 16.0). Los resultados se consideraron significativos si P<0,05. Los datos se expresan como medias ± errores estándar de las medias (SEM).

Ejemplo 2: Resultados

L. rham nosus GG protege a los queratinocitos de los efectos patógenos de S. aureus.

Inicialmente, se investigó si la viabilidad de queratinocitos se veía afectada por la incubación con L. rhamnosus GG. Sin embargo, tras 24 h de incubación, no había diferencia en la viabilidad de queratinocitos incubados con las bacterias probióticas frente al control de queratinocitos no tratados (datos no mostrados). A continuación, se investigó la capacidad de L. rhamnosus GG para proteger a los queratinocitos de los efectos de S. aureus. De acuerdo con nuestros hallazgos previos (43), la exposición de 24 h de queratinocitos a 106 UFC/ml de S. aureus dio como resultado una muerte celular de queratinocitos significativa. Sin embargo, los queratinocitos incubados simultáneamente con patógeno y L. rhamnosus GG tenían un porcentaje de viabilidad significativamente mayor (57% P=0,01) que las monocapas infectadas con patógeno solo (Figura 1).

Lisados de L. rham nosus GG y flu ido de cultivo gastado protegen a los queratinocitos de los efectos de S. aureus.

Se investigó si se requería bacteria viva para el efecto protector de L. rhamnosus GG examinando el efecto de lisado probiótico y fluido de cultivo gastado sobre queratinocitos infectados por S. aureus. Ni el lisado ni el fluido de cultivo gastado afectaron significativamente a la viabilidad de queratinocitos (P>0,05) (datos no mostrados). Sin embargo, tanto el lisado como el fluido de cultivo gastado redujeron la toxicidad de S. aureus de modo que la viabilidad de queratinocitos tratados era del 65% y del 57,93% respectivamente en comparación con el 25% en queratinocitos infectados con S. aureus solo (P= 0,006 y P=0,01 respectivamente) (Figura 2).

Lisado de L. rham nosus GG, pero no flu ido de cultivo gastado, rescata a queratinocitos de toxicidad por S. aureus.

A continuación, se investigó el momento justo del efecto protector de L. rhamnosus GG añadiendo las bacterias vivas o el lisado o bien antes o bien después de la infección de queratinocitos con S. aureus. El porcentaje de viabilidad de queratinocitos era significativamente mayor en monocapas expuestas a L. rhamnosus GG o fluido de cultivo gastado para 2 h antes de la infección con S. aureus, que en monocapas infectadas con S. aureus solo (P=0,006). Tanto el lisado como el fluido de cultivo gastado proporcionaron niveles similares de protección (P=0,005, p=0,004), (Figura 3). En un experimento tras la infección, se expusieron los queratinocitos a S. aureus durante 2 h, 4 h, 6 h, 8 h y 12 h antes de la adición del L. rhamnosus GG vivo, lisado, o fluido de cultivo gastado. Entonces se midió la viabilidad de los queratinocitos a las 24 h tras la infección con S. aureus. Los datos en la Figura 4 (A, B) muestran que tanto el probiótico vivo como su lisado podían proteger los queratinocitos cuando se añadía después S. aureus. Incluso 12 h tras la infección por S. aureus, L. rhamnosus GG o lisado todavía proporcionaba protección a los queratinocitos de modo que el 58% y el 55% respectivamente de células seguían siendo viables en comparación con el 25% cuando se exponían a S. aureus solo (P=0,003, P=0,01 respectivamente). Sin embargo, el fluido de cultivo gastado de L. rhamnosus GG no tenía ningún efecto protector sobre los queratinocitos cuando se añadía después de S. aureus (Figura 4 C).

Lisado de L. rham nosus GG, pero no flu ido de cultivo gastado, inhibe el crecim iento de S. aureus.

Se exploró el mecanismo mediante el cual el lisado de L. rhamnosus GG ejercía su efecto protector. Se investigó si el lisado probiótico tenía efectos directos sobre el crecimiento del patógeno haciéndolos crecer simultáneamente en cultivo. Los ensayos de competición mostraron una reducción significativa en el crecimiento de S. aureus a lo largo de un periodo de 24 h en medio de cultivo para queratinocitos en presencia del lisado de L. rhamnosus GG en comparación con cultivos no tratados (P=0,02) (Figura 5A). Sin embargo, el fluido de cultivo gastado de L. rhamnosus GG no tenía ningún efecto sobre el crecimiento de S. aureus (Figura 5A). El número total de estafilococos viables también se reducía significativamente en presencia del lisado (pero no el fluido de cultivo gastado) hasta 5 log¹⁰ ufc/ml, en comparación con 8 log¹⁰ ufc/ml para S. aureus hecho crecer solo (P=0,02) (Figura 5B). Además, el número total de cultivo de estafilococos viables se redujo con el tiempo mediante el lisado de L. rhamnosus GG (Figura 5C). Dado que los lactobacilos pueden producir ácidos orgánicos, se midió el pH de los medios para queratinocitos infectados durante 24 h con S. aureus, lisado de L. rhamnosus GG o ambos simultáneamente. Sin embargo, no hubo una diferencia significativa en el pH entre grupos de tratamiento (datos no mostrados). También se midió el pH de lisado solo y se encontró que era pH= 7,2, eliminando así la posibilidad de efectos mediados por ácido.

L. rham nosus GG inhibe la adhesión de S. aureus a queratinocitos.

Otro mecanismo mediante el cual bacterias vivas, lisado o fluido de cultivo gastado de L. rhamnosus GG pueden proteger los queratinocitos es mediante la inhibición de la adhesión patógena. Previamente, se mostró que la adhesión es un requisito para los efectos tóxicos de S. aureus y un probiótico específico tal como L. reuteri protegía los queratinocitos mediante la exclusión competitiva de patógenos de sitios de unión a queratinocitos (43). Por tanto, se consideró que la inhibición de la adhesión también era parte del mecanismo protector de lisado de L. rhamnosus GG o fluido de cultivo gastado. Se realizaron ensayos de adhesión para determinar si la inhibición se debía a competición, exclusión o desplazamiento de patógeno de sitios de unión en queratinocitos (Figura 6 A&B y Figura 7). Nuestros resultados demostraron que L. rhamnosus GG vivo o lisado eran capaces de inhibir la adhesión de patógenos si los queratinocitos se coinfectaban (competición, P= 0,03), se exponían previamente (exclusión, P= 0,04) o incluso se aplicaban 12 h después de que hubiese empezado la infección con S. aureus (desplazamiento, P= 0,01). Sin embargo, el fluido de cultivo gastado solo inhibía la adhesión de patógeno si se añadía a los queratinocitos o bien antes o bien al mismo tiempo que el patógeno (Figura 7).

Discusión

Este estudio exploró si un probiótico entérico, L. rhamnosus GG podía proteger a los queratinocitos de los efectos patógenos de S. aureus. Experimentos preliminares para determinar el efecto de añadir S. aureus y L. rhamnosus GG simultáneamente sobre la viabilidad de queratinocitos indicaron un efecto protector significativo tal como se observa mediante un aumento en el número de queratinocitos viables en presencia del probiótico en comparación con queratinocitos infectados con S. aureus solo (Figura 1). Además, el efecto protector de L. rhamnosus GG no requería bacterias viables porque un lisado y fluido de cultivo gastado del probiótico también proporcionaban protección de queratinocitos frente a S. aureus. El momento exacto de aplicación de L. rhamnosus GG o lisado no afectaba al grado de protección conferido por el probiótico o lisado para proteger a los queratinocitos frente a muerte celular inducida por S. aureus (Figura 3). Los datos demuestran que los queratinocitos expuestos previamente, posteriormente o conjuntamente a L. rhamnosus GG o lisado se protegían frente a muerte celular inducida por S. aureus. Sin embargo, el fluido de cultivo gastado de probiótico solo protegía a los queratinocitos si se añadía o bien antes o bien al mismo tiempo que el patógeno. Estos datos sugieren que hay al menos dos actividades independientes implicadas en los efectos protectores de L. rhamnosus GG frente a S. aureus, una contenida dentro del fluido de cultivo gastado y una contenida dentro del lisado. Nuestros datos muestran que la actividad contenida dentro del fluido de cultivo gastado tiene probablemente efectos antiadhesivos. Esto se basa en las siguientes observaciones: A) el fluido de cultivo gastado de L. rhamnosus GG solo inhibe la adhesión de patógenos a queratinocitos si se añade antes o al mismo tiempo que la infección con S. aureus. B) Se ha mostrado previamente que S. aureus tiene que adherirse a los queratinocitos con el fin de ser tóxico para los mismos y agentes que inhiben la adhesión protegen a los queratinocitos de este patógeno (43). C) De acuerdo con esto, el fluido de cultivo gastado solo es protector cuando se añade antes de o conjuntamente con la infección con S. aureus. Otros estudios in vitro demostraron que sobrenadantes de cultivo libre de células (CFCS) de los supuestos probióticos (Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus, Streptococcus) eran capaces de inhibir la adhesión de varios patógenos tales como Salmonella typhimurium, S. aureus y Escherichia coli, a células Caco-2 (11).

La protección de queratinocitos mediante el lisado de lactobacilo puede implicar al menos dos mecanismos. En primer lugar, el lisado puede ser capaz de reducir el crecimiento de S aureus. Los ensayos de competición demostraron que el lisado de L. rhamnosus GG reducía el número total de estafilococos viables (Figura 5A, B, C). Además, en ensayos de inhibición, se observaron zonas de inhibición cuando se exponía S. aureus a lisados de probiótico hecho crecer de manera anaerobia (tabla 1). Estos datos sugieren una capacidad del lisado de L rhamnosus GG para inhibir el crecimiento de S. aureus. Esto podía deberse a la presencia de una(s) molécula(s) tóxica(s) dentro del probiótico que eran capaces de inhibir directamente el crecimiento y/o la viabilidad de S. aureus. Es posible que esta(s) molécula(s) puedan sintetizarse, pero no secretarse, porque no había ningún efecto de fluido de cultivo gastado de L. rhamnosus GG sobre la viabilidad de S. aureus. Si L. rhamnosus GG contiene sustancias bacteriostáticas, entonces esto también puede explicar, al menos parcialmente, el efecto protector del probiótico en ensayos de supervivencia de queratinocitos. Los probióticos, especialmente lactobacilos, han mostrado previamente que ejercen un fuerte efecto inhibidor sobre el crecimiento de S. aureus. Se ha notificado que ciertas cepas de Lactobacillus son altamente antagonísticas para S. aureus formador de formación de biopelículas (28, 30). Otros estudios han notificado que los probióticos pueden mejorar la salud del intestino inhibiendo el crecimiento de patógenos a través de la producción de bacteriocinas (16, 48). Además, se ha mostrado que L. rhamnosus GG inhibe el crecimiento de Salmonella enterica a través de la producción de ácido láctico (29). Sin embargo, en el presente estudio, no se pudo encontrar ninguna evidencia de la implicación de la producción de ácido como parte de los efectos protectores de L. rhamnosus GG. De hecho, el lisado de este organismo era neutro (pH 7,2), pero todavía era capaz de inhibir el crecimiento de S. aureus.

Tabla 1: Zonas de Inhibición (ZOI) para S. aureus en ensayos de punto sobre el lecho (n=3). El ensayo de punto sobre el lecho que demuestra zonas de inhibición producidas por L. rhamnosus (LGG) y lisado (LGg LYS) en condición anaerobia, pero no en condición aerobia. Los resultados se expresan como la media ± SEM

Un segundo mecanismo mediante el cual bacteria viva o lisado de L. rhamnosus GG podían proteger a los queratinocitos es mediante la inhibición de adhesión patógena. De hecho, nuestros datos demostraron una reducción en la adhesión de S. aureus a queratinocitos en presencia de L. rhamnosus GG o su lisado. Estos datos sugieren un mecanismo de exclusión tal como se ha observado previamente para L. reuteri (43). Sin embargo, de manera interesante, L. rhamnosus GG viable o su lisado también inhibían la adhesión de S. aureus cuando se añadían a infecciones existentes, demostrando otro mecanismo de protección, es decir que L. rhamnosus GG puede desplazar al patógeno de los queratinocitos (Figura 7). De manera similar, se ha mostrado que L. rhamnosus GG vivo desplaza los patógenos de las células intestinales en el intestino (47). Sin embargo, nuestros datos demostraron que la presencia de bacteria viva no es necesaria para el desplazamiento de S. aureus de los queratinocitos. De manera importante, nuestros datos demostraron diferencias dependientes de la especie en los mecanismos usados por los lactobacilos para reducir la toxicidad del patógeno. Nuestro trabajo previo destacó L. reuteri como organismo capaz de excluir S. aureus de sitios de unión a queratinocitos (43). En este estudio se ha mostrado que L. rhamnosus GG puede, no solo, excluir patógenos, sino también puede reducir el crecimiento de patógeno y desplazar el patógeno de los queratinocitos. Naturalmente, es posible que esta actividad de desplazamiento pueda estar relacionada con la capacidad de L. rhamnosus GG de inhibir el crecimiento y se requerirán estudios adicionales para aclarar este punto.

En conclusión, notificamos que L. rhamnosus GG es un nuevo agente potencial para inhibir la patogenicidad de S. aureus. Además, nuestros datos muestran que la utilidad de L. rhamnosus GG sobre la piel no estará limitada por si puede crecer y sobrevivir en la piel, porque un lisado de los organismos es igual de eficaz a la hora de prevenir la colonización con S. aureus que bacterias vivas. Además, el lisado podía ser útil como profilaxis, por ejemplo, en lavados de manos, pero potencialmente como adyuvante o incluso una alternativa a antibióticos en infección existente.

Referencias

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Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1 Una composición formulada para administración tópica para su uso en el tratamiento o la prevención de infecciones cutáneas, que comprende material secretado de una bacteria probiótica, en la que la composición no comprende sustancialmente ninguna bacteria probiótica intacta, bacteria lisada o fragmento bacteriano.
2. 2. - La composición para su uso según la reivindicación 1, que comprende material secretado en un portador, y opcionalmente, en la que el portador comprende medios obtenidos de un cultivo que contiene una bacteria probiótica.
3. 3. - La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la bacteria probiótica es una bacteria de Lactobacillus spp.
4. 4. - La composición para su uso según la reivindicación 3, en la que el lactobacilo es L. rhamnosus y, opcionalmente, en la que el lactobacilo es L. rhamnosus GG o L. rhamnosus ATCc 53103.
5. 5. - La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está formulada para su uso como crema, gel o pulverización.
6. 6. - La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las bacterias probióticas se cultivaron en condiciones anaerobias.
7. 7. - La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento o la prevención de infecciones cutáneas bacterianas.
8. 8. - La composición para su uso según la reivindicación 7, en la que la infección es una infección por estafilococos.
9. 9. - La composición para su uso según la reivindicación 8, en la que la infección es una infección por S. aureus.