ES2828086T3 - Confórmeros abiertos de HLA-B57 - Google Patents

Abstract

Un confórmero abierto de HLA-B57 aislado.

Description

DESCRIPCIÓN

Confórmenos abiertos de HLA-B57

La presente invención se refiere al uso de confórmenos abiertos de HLA-B57, particularmente para su uso en la profilaxis o tratamiento del cáncer y para su uso como inmunomodulador.

Los antígenos leucocitarios humanos (HLA, por sus siglas en inglés) pertenecen a la clásica familia de proteínas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés). El complejo HLA ayuda al sistema inmunitario a distinguir las proteínas propias del cuerpo de las proteínas producidas por invasores extraños tal como virus y bacterias. Los seres humanos tienen tres genes clásicos principales del MHC de clase I, conocidos como HLA-A, HLA-B y HLA-C. Los genes HLA clásicos tienen muchas variaciones posibles, permitiendo que el sistema inmunitario de la persona reaccione a una amplia gama de invasores extraños. Algunos genes HLA tienen cientos de versiones (alelos) identificadas, cada una de los cuales recibe un número particular (tal como HLA-B57). Los alelos estrechamente relacionados se clasifican juntos; por ejemplo, al menos 82 alelos muy similares son subtipos de HLA-B57. Estos subtipos se designan como h La -B*5701 a HlA-B*5782, y el HLA-B*5801 estrechamente relacionado.

Las moléculas clásicas de MHC-I (denominadas HLA-I en seres humanos) son estructuras triméricas que comprenden una cadena pesada unida a la membrana con tres dominios extracelulares (a l, a2 y a3) que se asocia de forma no covalente con p2-microglobulina (p2m) y un péptido pequeño. Las cadenas pesadas de HLA I pueden existir en una forma no asociada a p2-microglobulina o péptido. Estas formas se conocen como confórmeros abiertos.

Como todas las demás moléculas HLA, la función principal de HLA-B57 es presentar péptidos derivados de células a linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+, como parte de la respuesta inmunitaria adaptativa. En condiciones fisiológicas normales, las moléculas HLA-B57 forman complejos heterotriméricos que consisten en cadenas pesadas B57, p2-microglobulina y péptidos que derivan de autoproteínas, virus o bacterias, tal como se conoce, por ejemplo, de infecciones por VIH (Stephens y col., Trends in Immunology 2005, vol. 26, n.° 1, páginas 41-47). A este respecto, HLA-B57 se parece a todos los demás alelos HLA de clase I. Sin embargo, las moléculas HLA también pueden estar presentes en las células como cadenas pesadas libres que carecen de p2m-microglobulina y péptido, y pueden denominarse confórmeros abiertos de HLA-B57 (Arosa y col. Open conformers: the hidden face of MHC-I molecules, Trends in Immunology Marzo de 2007; 28(3): 1l5-23).

El cáncer es un grupo de enfermedades caracterizadas por células anormales del cuerpo que experimentan un crecimiento descontrolado y destructivo. Las células cancerosas pueden propagarse por el cuerpo y hacer metástasis para formar tumores; este patrón de crecimiento se llama maligno. El cáncer se puede tratar mediante cirugía, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia dirigida e inmunoterapia. La elección de la terapia depende del tipo de cáncer, el estadio del cáncer (cuánto se ha propagado), edad, estado de salud y características personales adicionales. No existe un tratamiento único para el cáncer y los pacientes con frecuencia reciben una combinación de terapias y cuidados paliativos.

La inmunoterapia contra el cáncer se refiere a un conjunto diverso de estrategias terapéuticas diseñadas para inducir al propio sistema inmunitario del paciente a combatir el tumor, y se basa en la idea de que la progresión del cáncer, que implica la acumulación de diversas mutaciones, está controlada por el sistema inmunitario. Las inmunoterapias estimulan las actividades de componentes celulares específicos del sistema inmunitario o contrarrestan las señales producidas por las células cancerosas que suprimen las respuestas inmunitarias (Mahoney y col., Nat Rev Drug Discov. Agosto de 2015;14(8):561-84.

Diferentes tipos de células inmunitarias están implicadas en la respuesta inmunitaria contra el cáncer. Dentro de este grupo de glóbulos blancos (contextura inmunitaria), las células más notorias son: linfocitos T (linfocitos T citotóxicos CD8+, linfocitos T auxiliares CD4+ fenotipo -Th1, Th2 y Th17), linfocitos T reguladores (Tregs), Macrófagos (tipo M1 -proinflamatorio y tipo M2 -protumoral), células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), linfocitos citolíticos naturales (linfocitos NK) y células dendríticas (DC). Estas células inmunitarias pueden ubicarse en el centro del tumor, en el margen invasivo o en las estructuras linfoides terciarias adyacentes (Fridman y col., Nat. Rev. Cancer. 2012, 12 de Abril, 298-306).

La densidad y composición del microambiente inmunitario son heterogéneos entre pacientes y tumores. Ahora está bien establecido que, en general, la infiltración tumoral con macrófagos y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) de fenotipo M2 promueve la progresión del tumor, mientras que la infiltración de linfocitos T citotóxicos CD8+, las células de fenotipo Th1 y los macrófagos de tipo M1 con frecuencia se asocia con un buen resultado clínico y una buena respuesta a la inmunoterapia. El impacto clínico de otras poblaciones de células linfoides y mieloides es menos consistente y parece depender del tipo y estadio del tumor. La presencia de linfocitos Th17 y NK, y la ausencia/reducción de linfocitos Treg en los infiltrados tumorales se correlaciona con una buena evolución en algunas indicaciones de cáncer (Giraldo y col., Current Opinion in Immunology 2014, 27:8-15).

Ma y col., documento WO2014/029071 y Birnbaum y col., documento WO2015/153969 muestra péptidos de alta inmunogenicidad y procedimientos para identificar un conjunto de péptidos que se unen a un receptor de linfocitos T. En la Fig. 1 se revisa una descripción general del equilibrio entre los infiltrados de leucocitos y el resultado clínico. (Becht y col. Current Opinion in Immunology. 2016, 39:17-13).

En general, modular la contextura inmunitaria de los tumores favoreciendo la infiltración de macrófagos de tipo M1, linfocitos T citotóxicos CD8 y linfocitos Th1, y/o reducir la infiltración de MDSC y macrófagos de tipo M2 es una enorme vía terapéutica para tratar el cáncer que se explora en este documento con el uso de proteínas B572-Fc en diversas indicaciones de cáncer.

Expresiones y definiciones

Las secuencias de aminoácidos se dan desde el extremo amino al carboxilo. Las letras mayúsculas para posiciones de secuencia se refieren a L-aminoácidos en el código de una letra (Stryer, Biochemistry, 3a ed. pág. 21).

La expresión confórmero abierto como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a una molécula HLA cadena pesada aislada no asociada a p2-microglobulina ni como monómero ni como dímero (homodímero o heterodímero). Determinadas realizaciones de los confórmeros abiertos desvelados en el presente documento son monómeros o dímeros de proteínas de fusión, en los que la cadena pesada de HLA está unida covalentemente a una región polipeptídica estabilizadora, particularmente un dominio de inmunoglobulina de fragmento cristalizable.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, las expresiones identidad de secuencia y porcentaje de identidad de secuencia se refieren a los valores determinados comparando dos secuencias alineadas. Los procedimientos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación de secuencias para la comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988) o mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos, incluyendo, pero sin limitación: CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. El programa informático para realizar análisis BLAST está disponible públicamente, p. ej., a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Un ejemplo de comparación de secuencias de aminoácidos es el algoritmo BLASTP que utiliza la configuración predeterminada: Umbral esperado: 10; Tamaño de palabra: 3; Coincidencias máximas en un intervalo de consulta: 0; Matriz: BLOSUM62; Costes de hueco: Existencia 11, Extensión 1; Ajustes de composición: Ajuste de matriz de puntuación de composición condicional. Un ejemplo de comparación de secuencias de los ácidos nucleicos es el algoritmo BLASTN que utiliza la configuración predeterminada: Umbral esperado: 10; Tamaño de palabra: 28; Coincidencias máximas en un intervalo de consulta: 0; Puntuaciones de coincidencia/falta de coincidencia: 1.-2; Costes de hueco: Lineal. A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad de secuencia proporcionados en el presente documento se refieren al valor obtenido con el conjunto de programas BLAST (Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)) utilizando los parámetros predeterminados identificados anteriormente para la comparación de proteínas y ácidos nucleicos, respectivamente.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, la expresión complejo principal de histocompatibilidad (MHC) se utiliza en su significado conocido en la técnica de la biología y bioquímica celular; se refiere a una molécula de la superficie celular que muestra una fracción específica (péptido), también conocido como epítopo, de una proteína. Hay dos clases principales de moléculas MHC: de clase I y de clase II.

Las moléculas de cadena pesada del MHC de clase I normalmente (es decir, cuando no están en forma de confórmero abierto) se producen como una cadena alfa enlazada a una unidad de la molécula p2-microglobulina no de MHC. La cadena alfa comprende, en dirección desde el extremo N al extremo C, un péptido señal, tres dominios extracelulares (a1-3, siendo a1 en el extremo N), una región transmembrana y una cola citoplásmica C-terminal. El péptido que se muestra o presenta está sostenido por el surco de unión del péptido, en la región central de los dominios a1/a2.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, la expresión domino ¡52-microglobulina se utiliza en su significado conocido en la técnica de la biología y bioquímica celular; se refiere a una molécula no de MHC que forma parte de la molécula heterodímera del MHC de clase I. En otras palabras, constituye la cadena p del heterodímero del MHC de clase I.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, la expresión antígeno leucocitario humano (HLA) se utiliza en su significado conocido en la técnica de la biología y bioquímica celular; se refiere a locus de genes que codifican las proteínas del MHC de clase I humano. Los tres genes principales del MHC de clase I en HLA son HLA-A, HLA-B y HLA-C y todos estos genes tienen un número variable de alelos, por ejemplo, HLA-B tiene 3590 alelos conocidos. Los alelos estrechamente relacionados se combinan en subgrupos de un determinado alelo. Por ejemplo, el alelo HLA-B57 tiene más de 100 alelos estrechamente relacionados que son, de acuerdo con el Comité de nomenclatura de la OMS para los factores del Sistema HLA, HLA-B*57:01:01 a HLA-B*57:82 marcados. La secuencia completa o parcial de todos los genes HLA conocidos y sus correspondientes alelos están disponibles para el experto en la materia en bases de datos especializadas tal como IMGT/HLA. (http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/) y se proporcionan en la tabla 1 de esta memoria descriptiva.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, la expresión agente inhibidor de puntos de control o anticuerpo inhibidor de puntos de control está destinado a abarcar un agente, en particular, un anticuerpo (o molécula similar a un anticuerpo) capaz de alterar la cascada de señales que conduce a la inhibición de los linfocitos T después de la activación de los linfocitos T como parte de lo que se conoce en la técnica como mecanismo de puntos de control inmunitario. Ejemplos no limitantes de un agente inhibidor de puntos de control o anticuerpo inhibidor de puntos de control incluyen anticuerpos de CTLA-4 (Uniprot P16410), PD-1 (Uniprot Q15116), PD-L1 (Uniprot Q9NZQ7), B7H3 (CD276; Uniprot Q5ZPR3), Tim-3, Gal9, VISTA, Lag3.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, la expresión agente agonista de puntos de control o anticuerpo agonista de puntos de control está destinado a abarcar un agente, particularmente, pero sin limitación, un anticuerpo (o molécula similar a un anticuerpo) capaz de acoplarse a la cascada de señales que conduce a la activación de los linfocitos T como parte de lo que se conoce en la técnica como mecanismo de puntos de control inmunitario. Ejemplos no limitantes de receptores que se sabe que estimulan la activación de linfocitos T incluyen CD122 y CD137 (4-1BB; Uniprot Q07011). la expresión agente agonista de puntos de control o anticuerpo agonista de puntos de control incluye anticuerpos agonistas de CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), CD357 (GITR) CD278 (ICOS), CD27, CD28.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término anticuerpo se utiliza en su significado conocido en la técnica de la biología e inmunología celular; se refiere a anticuerpos completos que incluyen pero sin limitación, inmunoglobulina de tipo G (IgG), de tipo A (IgA), de tipo D (IgD), de tipo E (IgE) o de tipo M (IgM), cualquier fragmento de unión a antígeno o cadenas sencillas de las mismas y construcciones relacionadas o derivadas. Un anticuerpo completo es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (Vh) y una región constante de cadena pesada (Ch). La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como Vl) y una región constante de cadena ligera (Cl). La región constante de cadena ligera comprende un dominio, Cl. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedador, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) y el primer componente del sistema del complemento clásico.

La expresión molécula similar a un anticuerpo en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a una molécula capaz de unirse específicamente a otra molécula o diana con alta afinidad/a Kd < 10E-8 mol/l. Una molécula similar a un anticuerpo se une a su diana de manera similar a la unión específica de un anticuerpo. La expresión molécula similar a un anticuerpo abarca una proteína con repeticiones, tal como una proteína con repeticiones de anquirina diseñada (Molecular Partners, Zurich), un polipéptido derivado de proteínas con repeticiones armadillo, un polipéptido derivado de proteínas repetidas ricas en leucina y un polipéptido derivado de proteínas con repeticiones tetratricopeptídicas.

La expresión molécula similar a un anticuerpo abarca además un polipéptido derivado de dominios de proteína A, un polipéptido derivado del dominio FN3 de fibronectina, un polipéptido derivado de dominios de fibronectina consenso, un polipéptido derivado de lipocalinas, un polipéptido derivado de dedos de zinc, un polipéptido derivado del dominio 2 de homología de Src (SH2), un polipéptido derivado del dominio 3 de homología Src (SH3), un polipéptido derivado de dominios PDZ, un polipéptido derivado de gamma-cristalina, un polipéptido derivado de ubiquitina, un polipéptido derivado de un polipéptido con nudo de cisteína y un polipéptido derivado de una knotina.

La expresión polipéptido derivado de dominios de proteína A se refiere a una molécula que es un derivado de la proteína A y es capaz de unirse específicamente a la región Fc y la región Fab de las inmunoglobulinas.

La expresión proteína con repeticiones armadillo se refiere a un polipéptido que comprende al menos una repetición armadillo, en el que una repetición armadillo se caracteriza por un par de hélices alfa que forman una estructura de horquilla.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, la expresión región de fragmento cristalizable (Fc) se utiliza en su significado conocido en la técnica de la biología e inmunología celular; se refiere a una fracción de un anticuerpo que comprende dos fragmentos de cadena pesada idénticos compuestos por un dominio Ch2 y Ch3, enlazados covalentemente por enlaces disulfuro.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término dímero se refiere a una unidad que consiste en dos subunidades.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término homodímero se refiere a un dímero que comprende dos subunidades que son idénticas o son miembros muy similares de la misma clase de subunidades. Un ejemplo de homodímero sería un dímero que consiste en dos subunidades seleccionadas independientemente de la lista de alelos HLA-B57. En determinadas realizaciones, los homodímeros consisten en dos alelos HLA-B57 idénticos.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, la expresión enlazador de aminoácidos se refiere a un polipéptido de longitud variable que se usa para conectar dos polipéptidos con el fin de generar un polipéptido de cadena sencilla. Realizaciones ejemplares de enlazadores útiles para practicar la invención especificada en el presente documento son cadenas de oligopéptidos que consisten en 1,2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 o 50 aminoácidos. Un ejemplo no limitante de un enlazador de aminoácidos es el polipéptido GGGGSGGGGGSGGGGS que enlaza un polipéptido HLA-B57 con un dominio Fc.

La presente invención proporciona confórmenos abiertos de HLA-B57.

De acuerdo con un aspecto, la invención proporciona confórmeros abiertos de HLA-B57 para su uso como medicamento.

De acuerdo con un aspecto alternativo, la invención proporciona confórmeros abiertos de HLA-B57 para su uso en la prevención o el tratamiento del cáncer, o como inmunomodulador.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una proteína aislada de confórmero abierto de HLA-B57, particularmente como medicamento, más particularmente para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona una proteína de confórmero abierto de HLA-B57 aislada como agente inmunomodulador o para su uso como modulador negativo de linfocitos T reguladores (Tregs), para su uso en enfermedades humanas en las que los Treg alteran el desarrollo de la inmunidad protectora, como el cáncer y las enfermedades infecciosas (von Boehmer y col. ibídem.).

En determinadas realizaciones, el confórmero abierto de HLA-B57 comprende dos cadenas polipeptídicas HLA-B57 idénticas. En determinadas realizaciones, el confórmero abierto de HLA-B57 comprende dos cadenas polipeptídicas HLA-B57 diferentes.

De acuerdo con otro aspecto alternativo de la invención, se proporciona un confórmero abierto de HLA-B57 para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer.

Una divulgación adicional en el presente documento, no reivindicada como una realización, es el uso como agente inmunomodulador para tratar enfermedades infecciosas, particularmente para su uso en la prevención o terapia del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis A, B, C, (HAV HBV, HCV, por sus siglas en inglés, respectivamente), virus de la gripe, Virus sincitial respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés), virus del sarampión, virus del herpes y/o virus de la fiebre amarilla. El confórmero abierto de acuerdo con este aspecto es una proteína de fusión que existe como un dímero de dos monómeros, y cada monómero independientemente del otro monómero comprende una cadena de HLA-B57 y un dominio polipeptídico conocido por estabilizar metabólicamente un polipéptido in vivo. Un ejemplo de tal dominio estabilizador es un dominio Fc (fragmento cristalizable) de una inmunoglobulina, particularmente el dominio polipeptídico Fc de una gamma inmunoglobulina. La cadena de HLA-B57 y el dominio estabilizador pueden unirse opcionalmente mediante un enlazador de aminoácidos. Una proteína de fusión de confórmero abierto que comprende la cadena de HLA-B57 y un fragmento Fc de inmunoglobulina se denomina en adelante en el presente documento confórmero abierto de HLA-B57 Fc o B572-Fc.

La presencia del dominio Fc en la proteína de fusión facilita el aumento de la solubilidad, estabilidad, avidez, semi vida y desde un punto de vista tecnológico, una producción y purificación rentables en sistemas de mamíferos (purificación de proteína A o G).

En determinadas realizaciones, el homodímero del confórmero abierto de HLA-B57 comprende además un fragmento de epítopo peptídico.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un monómero del confórmero abierto de HLA-B57 (es decir, el HLA-B57 no unido a un segundo polipéptido de cadena pesada de HLA-B57, y no unido a p2-microglobulina) para su uso en el tratamiento o prevención de En determinadas realizaciones de este aspecto, el monómero de HLA-B57 comprende adicionalmente un fragmento de epítopo peptídico.

En determinadas realizaciones de uno cualquiera de los aspectos de la invención expuestos anteriormente, un fragmento de epítopo peptídico está fijado de forma no covalente al polipéptido dentro del dominio presentador de antígeno de la cadena peptídica de HLA-B57.

En determinadas realizaciones de uno cualquiera de los aspectos de la invención expuestos anteriormente, la cadena de HLA-B57 comprende solo los dominios extracelulares alfa 1,2 y 3 de HLA-B57. En estas realizaciones, los dominios transmembrana e intracelular de la cadena de HLA-B57 no están incluidos en el polipéptido terapéutico de la invención para permitir su expresión extracelular en células recombinantes. El experto en la materia puede identificar fácilmente los dominios correspondientes incluso en secuencias de HLA-B57 previamente desconocidas mediante la alineación de secuencias por pares con secuencias de HLA-B57 anotadas.

En determinadas realizaciones de uno cualquiera de los aspectos de la invención expuestos anteriormente, la cadena de HLA-B57 del homodímero se selecciona de HLA-B*57:01, hasta HLA-B*57:82.

En determinadas realizaciones de uno cualquiera de los aspectos de la invención expuestos anteriormente, la cadena de HLA-B57 comprende solo los dominios alfa 1, 2 y 3 de HLA-B57, pero no el dominio transmembrana e intracelular de una secuencia seleccionada de la Tabla 1.

En determinadas realizaciones de uno cualquiera de los aspectos de la invención expuestos anteriormente, la cadena de HLA-B57 tiene > 70 %, > 80 %, > 85 %, > 90 %, > 92 %, > 93 %, > 94 %, > 95 %, > 96 %, > 97 % o > 98 %, o 100 % de identidad de secuencia en comparación con una cualquiera de las secuencias proporcionadas en la Tabla 1. En determinadas realizaciones, el confórmero abierto de HLA-B57 consiste en dos subunidades seleccionadas independientemente de los alelos HLA-B57 anteriores. En determinadas realizaciones, los homodímeros consisten en dos alelos HLA-B57 idénticos.

En determinadas realizaciones, el confórmero abierto de HLA-B57 comprende un dominio Fc. En determinadas realizaciones particulares, el dominio Fc comprende regiones constantes de cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina de tipo G (IgG), de tipo A (IgA), de tipo D (IgD), de tipo E (IgE) o de tipo M (IgM).

En determinadas realizaciones, el confórmero abierto de HLA-B57 comprende un enlazador de aminoácidos que une un dominio estabilizador, particularmente un dominio Fc, al polipéptido HLA. En determinadas realizaciones particulares, el enlazador de aminoácidos comprende de 1 a 50 aminoácidos, particularmente de 5 a 40 aminoácidos, más particularmente de 10 a 30 aminoácidos, incluso más particularmente de 15 a 25 aminoácidos que unen la cadena de HLA-B57 al dominio Fc como una única cadena polipeptídica.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un monómero del confórmero abierto de HLA-B57, particularmente un monómero Fc del confórmero abierto, de acuerdo con los aspectos anteriores de la invención para su uso en el tratamiento o la terapia del cáncer. La expresión del confórmero abierto in vivo a partir de la molécula de ácido nucleico, después de la dimerización, conducirá al polipéptido de proteína de fusión de la invención. El concepto de expresar polipéptidos farmacéuticamente activos a partir de ácidos nucleicos que los codifican en el cuerpo del paciente es bien conocido y puede conferir beneficios significativos al paciente.

En determinadas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica un monómero del confórmero abierto de HLA-B57, particularmente un monómero Fc del confórmero abierto que comprende un fragmento de epítopo peptídico. En determinadas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica un monómero del confórmero abierto de HLA-B57, particularmente un monómero Fc del confórmero abierto que comprende solamente los dominios extracelulares alfa 1, 2 y 3 de HLA-B57. En determinadas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica un monómero del confórmero abierto de HLA-B57, particularmente un monómero Fc del confórmero abierto que comprende solamente los dominios extracelulares alfa 1, 2 y 3 de HLA-B57, y un fragmento de epítopo peptídico.

En determinadas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica un monómero del confórmero abierto de HLA-B57, en particular, un monómero Fc del confórmero abierto que comprende un enlazador de aminoácidos y/o un dominio Fc (fragmento cristalizable), y se usa en el tratamiento o la terapia del cáncer.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con el tercer aspecto de la invención para su uso en el tratamiento o la terapia del cáncer.

En determinadas realizaciones, el vector de expresión recombinante es un plásmido que comprende un promotor que es operable en una célula de mamífero, particularmente en una célula humana. El promotor está operativamente unido a la molécula de ácido nucleico de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un virus que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con el tercer aspecto de la invención para su uso en el tratamiento o la terapia del cáncer. La molécula de ácido nucleico está bajo el control de una secuencia promotora operable en una célula de mamífero, particularmente en una célula humana. En determinadas realizaciones, el virus es un adenovirus, virus adenoasociado, un virus del herpes o un lentivirus.

Se describe pero no se reivindica otro aspecto, se proporciona una célula hospedadora genéticamente modificada in vitro que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con el tercer aspecto de la invención. Asimismo se describe pero no se reivindica el uso del homodímero del confórmero abierto de HLA-B57 Fc o del homodímero de proteína de fusión de acuerdo con el primer y segundo aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención del cáncer. De acuerdo con otro aspecto más no reivindicado, la aplicación proporciona un procedimiento de tratamiento para el cáncer, que comprende administrar un confórmero abierto de HLA-B57 Fc de acuerdo con el primer y segundo aspecto de la invención a un paciente que lo necesite.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un medicamento combinado, en el que el medicamento combinado comprende:

- un confórmero abierto de HLA-B57, particularmente un confórmero abierto de HLA-B57 Fc, de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos o realizaciones anteriores de la invención, y

- un agente inhibidor de puntos de control, en particular, un anticuerpo inhibidor de puntos de control seleccionado de un inhibidor de la interacción de la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA4; también conocida como CD152) con CD80 o CD86, un inhibidor de la interacción de la proteína 1 de muerte celular programada (PD-1; también conocida como CD279) con su ligando PD-L1, y un ligando de proteína 3 que contiene dominios de inmunoglobulina de linfocitos T y de mucina (TIM-3)

- un agente agonista de puntos de control, particularmente un anticuerpo agonista de puntos de control seleccionado para unirse a y activar el receptor del factor de necrosis tumoral 4-1BB (también conocido como CD137 o TNFRSF9).

En determinadas realizaciones, el agente inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de la interacción de CTLA4 con CD80 o CD86.

En determinadas realizaciones, el agente inhibidor de puntos de control inmunitario es ipilimumab (Yervoy; Número CAS 477202-00-9).

En determinadas realizaciones, el agente inhibidor de puntos de control inmunitario es un inhibidor de la interacción de la proteína 1 de muerte celular programada (PD-1) con su receptor PD-L1. En determinadas realizaciones, el agente inhibidor de puntos de control inmunitario se selecciona de los fármacos de anticuerpos clínicamente disponibles nivolumab (Bristol-Myers Squibb; Número CAS 946414-94-4), pembrolizumab (Merck Inc.; Número CAS 1374853-91­ 4), pidilizumab (Número c As 1036730-42-3), atezolizumab (Roche AG; Número CAS 1380723-44-3) y Avelumab (Merck KGaA; Número CAS 1537032-82-8).

En determinadas realizaciones, el agente agonista de puntos de control inmunitario es utomilumab (PF-05082566), un anticuerpo monoclonal IgG2 completamente humano contra 4-1 BB que se encuentra actualmente en ensayos clínicos. En determinados ejemplos no reclamados, el confórmero abierto de HLA-B57, particularmente el confórmero abierto de HLA-B57 Fc, se proporciona como forma de dosificación parenteral, especialmente confeccionado para inyección. En determinados ejemplos no reclamados, el agente inhibidor de puntos de control y/o el agente agonista de puntos de control se proporcionan como forma de dosificación parenteral, especialmente confeccionado para inyección. En determinadas realizaciones, tanto el confórmero abierto de HLA-B57 como el agente inhibidor de puntos de control y/o el agente agonista de puntos de control están presentes en la misma forma de administración.

Asimismo, en el presente documento se describe un procedimiento para producir polipéptidos de cadena pesada de HLA recombinantes. Este procedimiento se resume en los siguientes artículos:

Artículo A: Un procedimiento para producir, por procedimientos de biotecnología recombinante, un polipéptido de cadena pesada de HLA humano, en el que dicho procedimiento comprende las siguientes etapas:

a. Etapa de expresión:

i. una secuencia del ácido nucleico que codifica HLA que codifica al menos la cadena alfa 1, la cadena alfa 2 y la cadena alfa 3 de una cadena pesada de HLA bajo el control de una secuencia promotora operable en una célula, particularmente una célula eucariota, más particularmente una célula de mamífero, y ii. una secuencia del ácido nucleico que codifica p2-microglobulina que codifica la beta 2 microglobulina de HLA humana (Un-iProt P61769) bajo el control de una secuencia promotora operable en dicha célula (la misma célula que en el artículo 1.a.) se expresan conjuntamente en una célula de mamífero ("línea celular de producción");

b. Etapa de purificación: el complejo HLA-cadena pesada/p2-microglobulina resultante se purifica a partir de la célula de mamífero (la línea celular de producción);

C. Etapa de disociación: el complejo HLA-cadena pesada/p2-microglobulina purificado se disocia en condiciones adecuadas y los polipéptidos de cadena pesada de HLA se separan de los polipéptidos de p2-microglobulina;

d. Etapa de replegamiento: los polipéptidos de cadena pesada de HLA separados se incuban en condiciones que conducen al replegamiento (de su estructura de proteína terciaria natural que se encuentra en moléculas de confórmeros abiertos de HLA fisiológicamente activas).

Artículo B: El procedimiento para producir un polipéptido de cadena pesada de HLA humano de acuerdo con el artículo A, en el que la secuencia del ácido nucleico que codifica HLA comprende, del extremo N al C del polipéptido codificado, la cadena alfa 1, la cadena alfa 2, la cadena alfa 3 y una secuencia estabilizadora.

Artículo C: El procedimiento para producir un polipéptido de cadena pesada de HLA humano de acuerdo con el artículo B, en el que la secuencia estabilizadora se selecciona de albúmina de suero bovino y un fragmento constante de inmunoglobulina (Fc), particularmente un fragmento constante de inmunoglobulina G, más particularmente un Fc de IgG4.

Artículo D: El procedimiento para producir un polipéptido de cadena pesada de HLA humano de acuerdo con cualquiera de los artículos anteriores, en el que la secuencia del ácido nucleico que codifica HLA y la secuencia del ácido nucleico que codifica p2-microglobulina están presentes en la misma molécula de vector de ácido nucleico (particularmente, un plásmido de expresión de ADN).

Artículo E: El procedimiento para producir un polipéptido de cadena pesada de HLA humano de acuerdo con cualquiera de los artículos A a C, en el que la secuencia del ácido nucleico que codifica HLA y la secuencia del ácido nucleico que codifica p2-microglobulina están presentes en diferentes moléculas de vector de ácido nucleico (particularmente, diferentes plásmidos de expresión de ADN).

Artículo F: El procedimiento del artículo E, en el que el vector de ácido nucleico que comprende la secuencia del ácido nucleico que codifica HLA está presente en un exceso de aproximadamente 1 a 5 veces, particularmente un exceso de 1,5 a 5 veces con respecto al vector de ácido nucleico que comprende la secuencia del ácido nucleico que codifica la p2-microglobulina, particularmente en un exceso de aproximadamente 3 veces.

Artículo G: El procedimiento de cualquiera de los artículos anteriores, en el que la secuencia del ácido nucleico que codifica HLA comprende un fragmento Fc de inmunoglobulina como secuencia estabilizadora y la etapa de purificación se efectúa adsorbiendo los polipéptidos de cadena pesada de HLA recombinantes a una superficie unida a la proteína A.

Artículo H: El procedimiento de cualquiera de los artículos anteriores, en el que la etapa de disociación se efectúa mediante tratamiento en condiciones ácidas, particularmente a aproximadamente pH 2, y diálisis en condiciones reductoras.

Artículo I: El procedimiento de cualquiera de los artículos anteriores, en el que la etapa de replegamiento se efectúa mediante tratamiento en condiciones neutras.

Más específicamente apuntando a los confórmeros abiertos de B57 especificados en el presente documento, el procedimiento se puede resumir en los siguientes artículos:

Artículo A': Un procedimiento para producir, por procedimientos de biotecnología recombinante, un polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 humano, en el que dicho procedimiento comprende las siguientes etapas:

a. Etapa de expresión:

i. una secuencia del ácido nucleico que codifica HLA-B57 que codifica al menos la cadena alfa 1, la cadena alfa 2 y la cadena alfa 3 de una cadena pesada de HLA-B57 bajo el control de una secuencia promotora operable en una célula, particularmente una célula eucariota, más particularmente una célula de mamífero, y

ii. una secuencia del ácido nucleico que codifica p2-microglobulina que codifica la beta 2 microglobulina de HLA humana (Un-iProt P61769) bajo el control de una secuencia promotora operable en dicha célula (la misma célula que en el artículo 1.a.) se expresan conjuntamente en una célula de mamífero ("línea celular de producción");

b. Etapa de purificación: el complejo HLA-B57-cadena pesada/p2-microglobulina resultante se purifica a partir de la célula de mamífero (la línea celular de producción);

C. Etapa de disociación: el complejo HLAB57-cadena pesada/p2-microglobulina purificado se disocia en condiciones adecuadas y los polipéptidos de cadena pesada de HLA se separan de los polipéptidos de p2-microglobulina;

d. Etapa de replegamiento: los polipéptidos de cadena pesada de HLA-B57 separados se incuban en condiciones que conducen al replegamiento (de su estructura de proteína terciaria natural que se encuentra en moléculas de confórmeros abiertos de HLA fisiológicamente activas).

Artículo B': El procedimiento para producir un polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 humano de acuerdo con el artículo A', en el que la secuencia del ácido nucleico que codifica HLA-B57 comprende, del extremo N al C del polipéptido codificado, la cadena alfa 1, la cadena alfa 2, la cadena alfa 3 y una secuencia estabilizadora.

Artículo C': El procedimiento para producir un polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 humano de acuerdo con el artículo B', en el que la secuencia estabilizadora se selecciona de albúmina de suero bovino y un fragmento constante de inmunoglobulina (Fc), particularmente un fragmento constante de inmunoglobulina G, más particularmente un Fc de IgG4.

Artículo D': El procedimiento para producir un polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 humano de acuerdo con cualquiera de los artículos anteriores, en el que la secuencia del ácido nucleico que codifica HLA y la secuencia del ácido nucleico que codifica p2-microglobulina están presentes en la misma molécula de vector de ácido nucleico (particularmente, un plásmido de expresión de ADN).

Artículo E': El procedimiento para producir un polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 humano de acuerdo con cualquiera de los artículos A' a C', en el que la secuencia del ácido nucleico que codifica HLA y la secuencia del ácido nucleico que codifica p2-microglobulina están presentes en diferentes moléculas de vector de ácido nucleico (particularmente, diferentes plásmidos de expresión de ADN).

Artículo F': El procedimiento del artículo E', en el que el vector de ácido nucleico que comprende la secuencia del ácido nucleico que codifica HLA está presente en un exceso de aproximadamente 1 a 5 veces, particularmente un exceso de 1,5 a 5 veces con respecto al vector de ácido nucleico que comprende la secuencia del ácido nucleico que codifica la p2-microglobulina, particularmente en un exceso de aproximadamente 3 veces.

Artículo G': El procedimiento de cualquiera de los artículos anteriores, en el que la secuencia del ácido nucleico que codifica HLA-B57 comprende un fragmento Fc de inmunoglobulina como secuencia estabilizadora y la etapa de purificación se efectúa adsorbiendo los polipéptidos de cadena pesada de HLA recombinantes a una superficie unida a la proteína A.

Artículo H': El procedimiento de cualquiera de los artículos anteriores, en el que la etapa de disociación se efectúa mediante tratamiento en condiciones ácidas, particularmente a aproximadamente pH 2, y diálisis en condiciones reductoras.

Artículo I': El procedimiento de cualquiera de los artículos anteriores, en el que la etapa de replegamiento se efectúa mediante tratamiento en condiciones neutras.

Siempre que en el presente documento se expongan como "realizaciones", las alternativas para características individuales separables como, por ejemplo, un alelo o una secuencia codificante, debe entenderse que dichas alternativas pueden combinarse libremente para formar realizaciones discretas como se desvela en el presente documento.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y figuras, de los que pueden extraerse otras realizaciones y ventajas. Estos ejemplos están destinados a ilustrar la invención pero no a limitar su ámbito.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 Representación esquemática que representa tres clasificaciones diferentes de tumores de acuerdo con sus infiltrados de células inmunitarias. Los 'tumores inmunogénicos' se caracterizan por una abundante infiltración de linfocitos T citotóxicos (CTL), Macrófagos de tipo M1, la presencia de estructuras linfoides terciarias (TLS, por sus siglas en inglés) y vascularización baja/moderada, mientras que se asocia con la supervivencia más larga del paciente. Los tumores 'inmunitarios desatendidos' se caracterizan por la carencia de infiltración por células inmunitarias, vascularización baja/moderada y pronóstico intermedio. Finalmente, los 'tumores inflamatorios' se caracterizan por abundantes CTL en ausencia de TLS, infiltración conspicua con macrófagos M2, vascularización grave y mal pronóstico (Becht y col. Current Opinion in Immunology. 2016, 39:17-13).

La Fig. 2 muestra que B572-Fc bloquea la conversión de linfocitos CD4+ de ratón en iT reg. La incubación de B572-Fc de una manera dependiente de la dosis con linfocitos T CD4+ no tratados previamente bloquean la conversión a iTregs. A) B572-Fc bloquea la expresión de CD25 (marcador de linaje de Tregs) de una manera dependiente de la dosis (|jg/200 j l) (C). B) B572-Fc bloquea la expresión de FoxP3 (marcador de diferenciación de Tregs) de una manera dependiente de la dosis (jg/200 j l ) (D). B57-p2m-Fc de control, isotipo, los medios suplementados con TGFp e IL-2 y los medios sin suplementación demuestran la influencia específica de B572-Fc en la conversión de iTreg.

La Fig. 3 muestra que B572-Fc altera la supresión de Tregs murinos de una manera dependiente de la dosis. A) histograma de proliferación de linfocitos T CD8+ y Treg que representa B572-Fc bloqueando la supresión de Tregs de ratón y permitiendo la proliferación de linfocitos T CD8+. El B57-(p2m-Fc de control y el isotipo no alteran la función de supresión de los Tregs murinos. B) % de supresión de iTreg de linfocitos T c D8+ murinos a diferentes concentraciones de B572-Fc (jg/200 jl).

La Fig. 4 muestra que B572-Fc suprime los linfocitos T del linfoma. A-C) ensayos de supresión para determinar la proliferación de células en presencia de (A) isotipo de control, (B) B57-p2m-Fc de control, y (C) B572-Fc. B572-Fc suprime las líneas celulares de linfoma humano (Jurkat) y de ratón (EG.7) de una manera dependiente de la dosis (jg/200 j l) en comparación con las líneas celulares de control.

La Fig. 5 muestra la interacción de B572-Fc a diferentes receptores inmunorreguladores de poblaciones de leucocitos. A) KIR3DL1 (expresado en linfocitos NK y subconjuntos de linfocitos T); B) KIR3DL2 (expresado en linfocitos NK y subconjuntos de linfocitos T); C) KIR3DL3 (expresado en linfocitos NK y subconjuntos de linfocitos T); D) LILRB1 (expresado en poblaciones de linfocitos NK, linfocitos T, monocitos y macrófagos); E) LILRB2 (expresado principalmente en macrófagos y MDSC) y F) PirB (homólogo murino de LILRB2) mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

La Fig. 6 muestra la representación esquemática de casetes de ADN de B57-Fc y (p2m y expresión de moléculas B57-(p2m-Fc de células CHO. A) dominios alfa 1,2 y 3 de la cadena pesada de HlA-B57 insertados en un casete de vector IgG4-Fc humano; y la microglobulina p2 humana insertada en un casete de vector separado. B) Las transfecciones en células de ovario de hámster chino (CHO) se realizan utilizando tanto el vector B57-Fc el vector p2m en una relación de 1:1 para la producción extracelular de la proteína B57-p2m-Fc. Se recogieron los sobrenadantes y se purificó B57-p2m-Fc usando protocolos de purificación de anticuerpos convencionales. p2m se elimina del complejo B57-p2m-Fc y los siguientes monómeros de B57-Fc se repliegan para formar homodímeros de B572-Fc

La Fig. 7 muestra que la combinación de B572-Fc con anticuerpos de PD-1 reducen el tamaño de los tumores en el modelo de carcinoma de colon singénico murino C38. A) Diseño experimental de puntos temporales de inyección de células de carcinoma de colon (C38) e inyección de compuestos. B) Volumen tumoral promedio de la media mm3 de los grupos tratados (n = 6). C)% de inhibición tumoral de grupos tratados con B572-Fc y PD-1 en comparación con el isotipo. El diseño experimental de inyección de sustancias fue el siguiente: vehículo PBS Q3Dx7, isotipo (10 mg/kg) Q3Dx7; B572-Fc (10 mg/kg) Q3Dx7; PD-1 bisem x 2 (200 |jg); y B572-Fc PD-1 (Q3Dx7 y bisem x 2, respectivamente). Los volúmenes tumorales se expresan como media ± EEM y se analizan mediante ANOVA bidireccional seguido de análisis post-hoc de Bonferroni, **p < 0,01. Q = días entre inyecciones; Dx = número de inyecciones, bisem = dos veces por semana.

La Fig. 8 muestra que la combinación de B572-Fc con anticuerpos de PD-1 reduce el tamaño de los tumores en el modelo de ratón de cáncer de páncreas (Pan02). A) Diseño experimental de puntos temporales de inyección de células de cáncer de páncreas (Pan02) e inyección de compuestos. B) Volumen tumoral promedio de la media mm3 de los grupos tratados (n = 8) con B572-Fc y/o PD-1. El diseño experimental de inyección de sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/kg) bisem x 3; B572-Fc (5 mg/kg) bisem x 3; PD-1 (5 mg/kg) bisem x 3; y B572-Fc PD-1 (bisem x 3). Los volúmenes tumorales se expresan como media ± EEM y se analizan mediante ANOVA bidireccional seguido de análisis post-hoc de Bonferroni, *p < 0,05; **p < 0,01; **** p < 0,0001. bisem = dos veces por semana.

La Fig. 9 muestra que la combinación de B572-Fc con anticuerpos de PD-L1 reduce el tamaño de los tumores en el modelo de ratón de cáncer de páncreas (Pan02). A) Volumen tumoral promedio de la media mm3 de los grupos tratados (n = 8) con B572-Fc y/o PD-L1. B) % de inhibición tumoral de grupos tratados con B572-Fc, PD-1 y PD-L1 en comparación con el isotipo. El diseño experimental de inyección de sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/kg) bisem x 3; B572-Fc (5 mg/kg) bisem x 3; PD-L1 (5 mg/kg) bisem x 3; y B572-Fc PD-L1 (bisem x 3). Los volúmenes tumorales se expresan como media ± EEM y se analizan mediante ANOVA bidireccional seguido de análisis posthoc de Bonferroni, *p < 0,05; **p < 0,01; **** p < 0,0001. bisem = dos veces por semana.

La Fig. 10 muestra el análisis de contextura inmunitaria de leucocitos infiltrados en tumores de ratones con cáncer de páncreas tratados (Pan02) con B572-Fc y PD-1 por citometría de flujo. Leucocitos relevantes analizados infiltrando el tumor: A) linfocitos NK; B) relación CD8/Treg; y C) Células Supresoras Derivadas de Mieloides (MDSC); Los números de leucocitos se expresan como media ± EEM y se analizan mediante ANOVA de una vía seguida de análisis post-hoc de Turquía, *p < 0,05.

La Fig. 11 muestra el análisis de contextura inmunitaria (continuación de la Fig. 10) de leucocitos infiltrados en tumores de ratones con cáncer de páncreas tratados (Pan02) con B572-Fc y PD-1 por citometría de flujo. Leucocitos relevantes analizados infiltrando el tumor: A) Macrófagos y B) Relación de macrófagos M1/M2. Los números de leucocitos se expresan como media ± EEM y se analizan mediante ANOVA de una vía seguida de análisis post-hoc de Turquía, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.

La Fig. 12 muestra el análisis de contextura inmunitaria de leucocitos infiltrados en tumores de ratones con cáncer de páncreas tratados (Pan02) con B572-Fc y PD-L1 por citometría de flujo. Leucocitos relevantes analizados infiltrando el tumor: A) linfocitos NK; B) relación CD8/Treg; y C) Células Supresoras Derivadas de Mieloides (MDSC). Los números de leucocitos se expresan como media ± EEM y se analizan mediante ANOVA de una vía seguida de análisis post-hoc de Turquía, *p < 0,05.

La Fig. 13 muestra el análisis de contextura inmunitaria (continuación de la Fig. 12) de leucocitos infiltrados en tumores de ratones con cáncer de páncreas tratados (Pan02) con B572-Fc y PD-L1 por citometría de flujo. Leucocitos relevantes analizados infiltrando el tumor: A) Macrófagos y B) Relación de macrófagos M1/M2. Los números de leucocitos se expresan como media ± EEM y se analizan mediante ANOVA de una vía seguida de análisis post-hoc de Turquía, *p < 0,05; **p < 0,01.

La Fig. 14 muestra que la combinación de B572-Fc con anticuerpos agonistas de puntos de control 4-1BB reduce el tamaño de los tumores en el modelo de ratón con cáncer de melanoma (B16F10). A) Diseño experimental de puntos temporales de inyección de células de cáncer de melanoma (B16F10) e inyección de compuestos. B) Volumen tumoral promedio de la media mm3 de los grupos tratados (n = 8) con B572-Fc y anticuerpo de 4-1BB. El diseño experimental de inyección de sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/kg) bisem 3 inyecciones; B572-Fc (5 mg/kg) bisem 3 inyecciones; anticuerpo de 4-1BB (1 mg/kg) bisem x 3 inyecciones; y B572-Fc 4-1BB bisem 3 inyecciones. Los volúmenes tumorales se expresan como media ± EEM y se analizan mediante ANOVA bidireccional seguido de análisis post-hoc de Bonferroni, **p < 0,01; **** p < 0,0001. bisem = dos veces por semana.

La Fig. 15 muestra que la combinación de B572-Fc con anticuerpos agonistas de puntos de control de 4-1BB y combinaciones con anticuerpos antagonistas de PD-1 reducen el tamaño de los tumores en el modelo de ratón con cáncer de melanoma (B16F10) (continuación del experimento de la Fig. 14). A) Volumen tumoral promedio de la media mm3 de los grupos tratados (n = 8) con B572-Fc, anticuerpos de PD-1 y 4-1BB. B)% de inhibición tumoral de B572-Fc, Grupos tratados con 4-1BB y PD-1 en comparación con el isotipo. El diseño experimental de inyección de sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/kg) bisem 3 inyecciones; B572-Fc (5 mg/kg) bisem 3 inyecciones; Anticuerpo de 4-1BB (1 mg/kg) bisem 3 inyecciones; PD-1 bisem 3 inyecciones (5 mg/kg); y B572-Fc 4-1BB bisem 3 inyecciones, B572-Fc PD-1 bisem 3 inyecciones, PD-1 4-1BB bisem 3 inyecciones y B572-Fc 4-1BB PD-1 bisem 3 inyecciones. Los volúmenes de los tumores se expresan como media ± EEM. bisem = dos veces por semana.

La Fig. 16 muestra el análisis de contextura inmunitaria de leucocitos infiltrados en tumores de ratones con melanoma (B16F10) tratados mediante citometría de flujo. Leucocitos relevantes analizados infiltrando el tumor: A) linfocitos NK; B) relación CD8/Treg; y C) Células Supresoras Derivadas de Mieloides (MDSC). Los números de leucocitos se expresan como media ± EEM y se analizan mediante ANOVA de una vía seguida de análisis posthoc de Turquía, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001.

La Fig. 17 muestra el análisis de contextura inmunitaria (continuación de la Fig. 16) de leucocitos infiltrados en tumores de ratones con melanoma (B16F10) tratados mediante citometría de flujo. Leucocitos relevantes analizados infiltrando el tumor: A) Macrófagos; y B) Relación de macrófagos M1/M2. Los números de leucocitos se expresan como media ± EEM y se analizan mediante ANOVA de una vía seguida de análisis post-hoc de Turquía, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.

Ejemplos

Los inventores descubrieron sorprendentemente que los confórmeros abiertos de HLA-B57 interactúan con diferentes receptores de superficie inmunomoduladores presentes en linfocitos NK, linfocitos T, células derivadas de mieloides (macrófagos y MDSC) y regulan la función de diferenciación y supresión de Tregs in vitro.

Los inventores encontraron sorprendentemente que los confórmeros abiertos de HLA-B57, particularmente cuando están presentes como proteínas de fusión que comprenden un fragmento de inmunoglobulina Fc, podrían ser útiles en la terapia del cáncer. Las moléculas HLA-B57-Fc pueden usarse solas o en combinación con otros agentes terapéuticos del cáncer.

De manera adicional, se descubrió un nuevo modo de acción in vivo con inyecciones de B572-Fc como monoterapia o enfoques combinatorios utilizando inhibidores de puntos de control o anticuerpos agonistas. La terapia con B572-Fc sola o en combinación puede regular la infiltración de diversos conjuntos de leucocitos en los tumores como se determina por el aumento de la proporción de células M1/M2, aumento de la infiltración de linfocitos NK, aumento de la relación linfocito T CD8+/Treg y la reducción de la infiltración de MDSC. En general, el modo de acción de B572-Fc sola o en un enfoque combinatorio con anticuerpos antagonistas/agonistas es de indudable relevancia en el tratamiento del cáncer y se correlaciona con la necesidad clínica actual en inmunoterapia del cáncer.

Los confórmeros abiertos de HLA-B57 Fc se pueden utilizar como agente terapéutico para dirigirse a enfermedades en las que la inmunomodulación es un enfoque terapéutico, como es el caso del cáncer y las enfermedades infecciosas.

Pruebas in vitro

La molécula B572-Fc es capaz de modular las respuestas inmunitarias a través del bloqueo de la diferenciación de iTreg e influyendo negativamente en la supresión de Treg (Fig. 2-3)

B572-Fc bloquea la conversión de linfocitos T CD4+ murinos en iTregs

La influencia de las moléculas HLA con linfocitos T CD4+ no tratados previamente para la conversión de iTreg se analizó de una manera dependiente de la dosis (pg/ml) con B572-Fc, B57-p2m-Fc, isotipo y PBS incubados con linfocitos T CD4+ no tratados previamente en condiciones óptimas de cultivo para la conversión de iTreg. B572-Fc demostró modular negativamente la inducción de CD25 (Fig. 2A, C) y FoxP3 (Fig. 2B, D).

B572-Fc altera la supresión de linfocitos T CD8+ de ratón por Tregs

Se determinó la función supresora de los Treg murinos usando linfocitos T CD8+ no tratados previamente marcados con violeta como células que responden (Fig. 3). Los Treg se cultivaron conjuntamente con B572-Fc y B57-p2m-Fc de control e isotipo de anticuerpo y se midió la proliferación de linfocitos T CD8+ después de 96 h. Los linfocitos T CD8+ solos mostraron una fuerte proliferación y, tal como se esperaba, los linfocitos Treg suprimieron la proliferación de linfocitos T CD8+ cuando se incubaron con controles (B57-p2m-Fc e isotipo). De manera llamativa, la función supresora de Tregs se vio muy alterada en presencia de B572-Fc indicado por una fuerte proliferación de linfocitos T CD8+ (Fig. 3A). El efecto de B572-Fc dependía de la dosis (Fig. 3B).

B572-Fc altera la proliferación de linfocitos T de leucemia.

Se determinó el efecto del efecto de la proliferación de B572-Fc en diferentes líneas celulares cancerosas (Fig. 4). Los resultados demostraron que B572-Fc modula la proliferación de líneas de linfocitos T de linfoma, en comparación con el B57-p2m-Fc homólogo de control o el isotipo IgG4, indicando su posible aplicación al tratamiento del linfoma como terapia dirigida.

B572-Fc se une a receptores inmunomoduladores expresados en diversos tipos de leucocitos

Se determinó si B572-Fc interactúa con receptores reguladores inmunitarios específicos mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Los resultados demostraron que B572-Fc interactúa con los receptores KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LILRB1, LI^l R^b2 y Pirb de una manera diferente a sus homólogos de control B57-p2m-Fc (Fig. 5 A-D). Además, se compararon B272-Fc y B27-p2m-Fc adicionalmente para demostrar si moléculas de confórmeros abiertos de HLA similares interactúan con los mismos receptores, pero con afinidades diferentes.

Producción de confórmeros abiertos de B57 como proteína de fusión con Fc humana en células CHO

Una estrategia válida, desde un punto de vista terapéutico, es producir moléculas de confórmero abierto de HLA-B57 en formato estable (fusión con Fc), para aumentar la solubilidad, estabilidad, avidez, semi vida y desde un punto de vista tecnológico, producción y purificación rentables en sistemas de mamíferos. El complejo B57-p2m-Fc se produjo con éxito insertando los dominios alfa 1, 2 y 3 de HLA-B57 en un casete de vector IgG4-Fc humano (Fig. 6A), junto con un vector con p2m humana, necesarios para la producción extracelular de la proteína B57-p2m-Fc (Fig. 6A, B). Las transfecciones en células de ovario de hámster chino (CHO) se realizaron usando tanto el vector B57-Fc el vector p2m en una relación de 1:1. Se recogieron los sobrenadantes y se purificó B57-p2m-Fc usando protocolos de purificación de anticuerpos convencionales (Recombinant Protein Purification Handbook, principles and methods.

2009. GE Healthcare, 18-1142-75) (Fig. 6B). La separación de p2m de las cadenas pesadas libres de B57-Fc se realizó usando condiciones de desnaturalización por SEC o procedimientos de diálisis. Se evaluó el plegamiento de B572-Fc utilizando el procedimiento de dilución en tampón de replegamiento y se analizó mediante transferencia Western (datos no mostrados).

Pruebas preclínicas de terapia de combinación de B572-Fc con anticuerpos de PD-1, PD-L1 y 4-1BB en diversos modelos de ratones con cáncer de colon singénicos

La prueba in vivo de estudio de concepto de B572-Fc como molécula terapéutica inmunomoduladora se demostró en modelos de ratones singénicos de carcinoma de colon murino (C38), cáncer de páncreas (Pan02) y melanoma (B16-F10) como monoterapia y en combinación con anticuerpos de PD-1, PD-L1 o 4-1BB.

Para el modelo de carcinoma de colon, siguiendo los protocolos establecidos, los tumores del fragmento C38 se inyectaron por vía subcutánea en el flanco de ratones singénicos. Una vez que el tumor alcanzó “ 80 mm3 (entre 1-2 semanas después del trasplante de tumores), los ratones se distribuyeron estadísticamente de acuerdo con su volumen tumoral. Se inyectó i.p. B572-Fc siete veces cada 3er día (Q3Dx7) y PD-1 se inyectó 4 veces dos veces por semana (bisem x 2) (Fig. 7A).

En el cáncer de colon (C38), los datos demostraron que la combinación de B572-Fc con anticuerpos de PD-1 reduce significativamente los tumores (Fig. 7B). La terapia de combinación B572-Fc PD-1 frente a anticuerpo de control de isotipo redujo de manera llamativa el volumen tumoral (333 mm3 frente a 2120 mm3, respectivamente p < 0,01). De manera adicional, La terapia de combinación B572-Fc PD-1 frente a la monoterapia con PD-1 también mostró una reducción significativa del tamaño tumoral (333 mm3 frente a 1423 mm3, respectivamente, p <0,01) (Fig. 7B). La monoterapia con B572-Fc o monoterapia con PD-1 no mostró diferencias frente al control de isotipo al final del experimento, sin embargo, el día 24, los ratones tratados con B572-Fc fueron significativamente diferentes del isotipo (384 mm3 frente a 652 mm3, p < 0,05), así como PD-1 frente al isotipo (151 mm3 frente a 652 mm3, p< 0,01), (Fig. 7B), lo que indica que la monoterapia con B572-Fc también tiene efectos inmunomoduladores sobre la progresión tumoral de ratones con cáncer de colon.

Para los modelos de ratón de páncreas (Pan02) y melanoma (B16F10), siguiendo los protocolos establecidos, las células se inyectaron a 1x105 en el flanco derecho de ratones singénicos respectivamente. Una vez que el tumor alcanzó ~ 80 mm3 (entre 1-2 semanas después de la inyección de células), los ratones se distribuyeron estadísticamente de acuerdo con su volumen tumoral (Fig. 8A, 14A)

En páncreas (Pan02), los datos demostraron que la monoterapia con B572-Fc y la combinación con anticuerpos de PD-1 pueden reducir significativamente los tumores (Fig. 8B, 9B). La terapia de combinación B572-Fc PD-1 frente al anticuerpo de control de isotipo demostró una llamativa reducción significativa del volumen tumoral (216 mm3 frente a 799 mm3, respectivamente p < 0,0001) (Fig. 8B). De manera adicional, La terapia de combinación B572-Fc PD-1 frente a la monoterapia con PD-1 también mostró una reducción significativa del tamaño tumoral (216 mm3 frente a 445 mm3, respectivamente, p <0,01) (Fig. 8B). la monoterapia con B572-Fc fue significativamente diferente en comparación con el isotipo (545 mm3 frente a 799 mm3, respectivamente, p < 0,05). la monoterapia con PD-1 fue significativamente diferente en comparación con el isotipo (445 mm3 frente a 799 mm3, respectivamente p < 0,0001) (Fig. 8B).

En páncreas (Pan02), el estudio de B572-Fc en combinación con anticuerpos de PD-L1 redujo significativamente los tumores (Fig. 9A-B). La combinación B572-Fc PD-L1 frente al isotipo mostró una reducción significativa del tamaño tumoral (397 mm3 frente a 799 mm3, respectivamente, p < 0,0001) (Fig. 9A). La monoterapia con PD-L1 fue significativamente diferente en comparación con el isotipo (531 mm3 frente a 799 mm3, respectivamente, p < 0,01) (Fig. 9A).

La contextura inmunitaria tumoral de ratones de páncreas (Pan02) demostró la influencia de la terapia con B572-Fc contra diversos conjuntos de leucocitos infiltrantes de tumores (Fig. 10-13). La monoterapia con B572-Fc aumentó la infiltración de linfocitos NKen comparación con el isotipo de control (p < 0,05) (Fig. 10A), y modificó significativamente la relación de células de Macrófagos M1/M2 (p < 0,05) favoreciendo la presencia de macrófagos de tipo M1 dentro del tumor (Fig. 11B). La terapia combinatoria de B572-Fc con PD-1 redujo significativamente la infiltración de células MDSC en el tumor en comparación con la monoterapia con PD-1 (p < 0,05) (Fig. 10C), redujo la infiltración de macrófagos (Fig. 11A) (p < 0,05) y modificó significativamente la relación de Macrófagos M1/M2 en comparación con el isotipo y la monoterapia con PD-1 (Fig. 11B) (p < 0,001). La terapia combinatoria de B572-Fc con PD-L1 (Fig. 12-13) modificó significativamente la proporción de células de macrófagos M1/M2 en comparación con el isotipo (p < 0,01) y PD-L1 (p < 0,05) (Fig. 13E).

En melanoma (B16F10), los datos demostraron que B572-Fc en combinación con anticuerpos agonistas de 4-1BB puede reducir significativamente los tumores (Fig. 14-15). La terapia de combinación B572-Fc 4-1BB frente al anticuerpo de control de isotipo mostró una llamativa diferencia significativa en la reducción del volumen tumoral (756 mm3 frente a 1424 mm3, respectivamente p < 0,0001) (Fig. 14B). De manera adicional, La combinación B572-Fc 4-1BB frente a la monoterapia con 4-1 BB también mostró una reducción significativa del tamaño tumoral (756 mm3 frente a 1199 mm3, respectivamente, p <0,01) (Fig. 14B). La monoterapia con 4-1BB no fue significativamente diferente en comparación con el isotipo (1199 mm3 frente a 1424 mm3, respectivamente). La terapia mono y combinatoria con PD-1 no mostró significación entre los grupos (Fig. 15A). Sin embargo, la terapia de combinación triple (B572-Fc 4-1BB PD-1) mostró una alta diferencia significativa en comparación con el isotipo (p < 0,0001), pero no fue mejor que la combinación B572-Fc 4-1BB (Fig. 15A-B).

La contextura inmunitaria tumoral de los animales tratados con melanoma (B16F10) demostró la influencia de la terapia con B572-Fc con diversos conjuntos de leucocitos infiltrantes de tumores (Fig. 16-17). La monoterapia con B572-Fc redujo significativamente la presencia de células MDSC dentro del tumor en comparación con el isotipo (p < 0,05) (Fig. 16C). La terapia combinatoria de B572-Fc con anticuerpos de 4-1BB modificó significativamente la presencia de linfocitos T c D8+ frente a linfocitos Treg, como se mide a través de la relación de linfocitos T CD8+/Treg (p < 0,05) (Fig. 16B), redujo significativamente la presencia de células MDSC dentro del tumor (p < 0,05) (Fig. 16C), y modificó significativamente la proporción de células de Macrófagos M1/M2 en comparación con el isotipo y la monoterapia con 4-1BB (p < 0,05) (Fig. 17B). La terapia combinatoria triple de B572-Fc con anticuerpos de 4-1BB y PD-1 indujo significativamente la infiltración de linfocitos NK en el tumor (p < 0,05) (Fig. 16A), modificó de manera llamativa la proporción de Linfocitos T CD8+ /Treg en comparación con el isotipo (158 % frente a 23 %, respectivamente, p <0,0001), y también en comparación con todos los otros grupos (Fig. 16B). Asimismo, redujo significativamente la presencia de células MDSC dentro del tumor (p < 0,001) (Fig. 16C), y modificó significativamente la proporción de células de Macrófagos M1/M2 en comparación con todos los otros grupos (Fig. 17B).

Conclusión

La prueba de principio para usar moléculas B572-Fc para combatir el cáncer se demostró utilizando modelos preclínicos de ratones singénicos de colon, páncreas y melanoma. Los datos actuales demuestran el potencial terapéutico de B572-Fc como monoterapia y/o terapia combinatoria con conjuntos de agentes inhibidores de puntos de control y/o agentes agonistas de puntos de control tal como anticuerpos de PD-1, PD-L1 o 4-1BB.

El modo de acción de B572-Fc también se evaluó in vivo en modelos de ratón de páncreas y melanoma mediante el establecimiento de la infiltración tumoral de leucocitos. La terapia con B572-Fc puede regular la infiltración de diversos conjuntos de leucocitos en los tumores de ratones como se determina por el aumento de la proporción de células de Macrófagos M1/M2, la reducción de la infiltración de MDSC, aumento de la tasa de infiltración de la relación linfocitos T CD8+/Treg y aumento de la infiltración de linfocitos NK. En general, el modo de acción de B572-Fc sola o en un enfoque combinatorio con anticuerpos antagonistas/agonistas es de indudable relevancia en el tratamiento del cáncer y se correlaciona con la necesidad clínica actual en inmunoterapia del cáncer.

B572-Fc surge como una nueva clase de fármaco inmunomodulador. Los datos in vitro e in vivo apuntan a un mecanismo en el que las moléculas B572-FC actúan como mecanismo de activación para la activación de la inmunidad antitumoral. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los presentes inventores plantean la hipótesis de que la interacción de los confórmeros abiertos de HLA-B57 se unen a diversos receptores inmunomoduladores presentes en las células mieloides (Macrófagos, MDSC), los linfocitos T y los linfocitos NK participan de forma sinérgica e intensifican la respuesta inmunitaria.

Materiales y Procedimientos

Animales y líneas celulares

Los experimentos in vivo se realizaron en ratones C57BI/6 utilizando la línea celular C38 de carcinoma de colon derivada de ratón, la línea celular de ratón Pan02 de adenocarcinoma ductal pancreático; y la línea celular de ratón B16F10 de melanoma.

Líneas celulares de experimentos in vitro: EG.7, linfoma de linfocitos T de ratón; Jurkat, linfoma de linfocitos T humanos; L428, linfoma de Hodgkin humano; L540, linfoma de Hodgkin humano; L1236, linfoma de Hodgkin humano; Daudi, Linfoma de linfocitos B; IMR-5, neuroblastoma; SK-N-AS, neuroblastoma; y M130428, Melanoma.

Tratamientos in vivo

Los fragmentos de tumor C38 se inyectaron por vía subcutánea en los flancos derechos de ratones C57BL/6 hembra singénicos en la semana 6. Las líneas celulares Pan02 y B16F10 se inyectaron a 1x105 en el flanco derecho de ratones singénicos en la semana 6. Una vez que el tumor alcanzó ± 80 mm3 en colon (C38), páncreas (Pan02) y melanoma (B16F10), los animales se distribuyeron de acuerdo con el tamaño del volumen tumoral individual y se dividieron en grupos que no mostraban diferencias estadísticas entre ellos. Los diámetros de los tumores se midieron usando una pinza y el volumen se calculó de acuerdo con la fórmula, D/2x < fi en la que D y d son el diámetro más largo y más corto del tumor en mm, respectivamente.

El diseño experimental de los puntos temporales de inyección de células y la inyección de sustancias se estableció como sigue para el vehículo de colon (C38) (PBS 200 jl); isotipo (10 mg/kg) Q3Dx7; B572-Fc (10 mg/Kg); PD-1 bisem x 2 (200 jg); B572-Fc PD-1 (Q3Dx7 y bisem x 2, respectivamente), B2072-Fc PD-1 (Q3Dx7 y bisem x 2, respectivamente). Para páncreas (Pan02), el diseño experimental de inyección de sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/kg) bisem x 3; B572-Fc (5 mg/kg) bisem x 3; PD-1 bisem x 3 (5 mg/kg); PD-L1 bisem x 3 (5 mg/kg); B572-Fc PD-1 (bisem x 3) y B572-Fc PD-L1 (bisem x 3). Para melanoma (B16F10), el diseño experimental de inyección de sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/kg) bisem 3 inyecciones; B572-Fc (5 mg/kg) bisem 3 inyecciones; Anticuerpo de 4-1BB (1 mg/kg) bisem 3 inyecciones; PD-1 bisem 3 inyecciones (5 mg/kg); B572-Fc 4-1BB bisem 3 inyecciones, B572-Fc PD-1 bisem 3 inyecciones, PD-1 4-1BB bisem 3 inyecciones y B572-Fc 4-1BB PD-1 bisem 3 inyecciones.

La preparación de muestras tumorales para la citometría de flujo se realizó utilizando protocolos descritos por eBioscience (https://www.ebioscience.com/media/pdf/best-protocols/cell-preparation-for-flow-cytometry.pdf, consultado el 21 de febrero de 2017).

Anticuerpos

Se tiñeron poblaciones de leucocitos de ratón para pruebas in vitro con: CD3 (PE-Cy7-eBioscience), CD4 (FITC-BD Bioscience), FoxP3+ (efluor 450-eBioscience), , CD45 (PerCP-eBioscience), CD3 (PE-eBioscience), NK1.1 (BV421-eBioscience), CD11b (FITC-eBioscience), CD11c (FITC-eBioscience), CD25 (PE-Cy7-Biolegend).

El Acm HC10 (IgG2a) que se une a cadenas pesadas libres de p2m de los alelos HLA-B y -C y, por lo tanto, a B572 fue un regalo del Dr. Hidde Ploegh (MIT, MA).

Se tiñeron anticuerpos para citometría de flujo de muestras tumorales con: CD45 (FITC; clon 30-F11; Biolegend), CD3 (PerCP/Cy5.5; clon 17A2; Biolegend), CD4 (BV510; clon GK1.5; Biolegend), CD8 (APC-H7; clon 53-6.7; BD), FoxP3 (PE; clon FJK-16S; eBioscence), CD11b (BV650; clon M1/70; Biolegend), F4/80 (PE/Cy7; clon BM8; Biolegend), Gr-1 (APC-R700; clon RB6-8C5; BD), NK1.1 (BV605; clon PK136; Biolegend), CD206 (APC; clon C068C2; Biolegend), CD86 (BV421; clon GL-1; Biolegend), tinción L/D (BUV395; Invitrogen).

El clon RMP1-14 del anticuerpo inhibidor de puntos de control anti-PD-1 de ratón se obtuvo de Bio X Cell. El clon 10F.9G2 del anticuerpo inhibidor de puntos de control anti-PD-L1 de ratón se obtuvo de Bio X Cell. El clon 3H3 del anticuerpo agonista anti-4-1BB de ratón se obtuvo de Bio X Cell.

Citometría de flujo de leucocitos

El análisis por citometría de flujo se realizó usando un FACS canto II (BD Bioscience) y los datos se analizaron con FlowJo versión 7.6.4.

Generación de Tregs

Para inducir la expresión de Foxp3 en linfocitos T CD4+ murinos, se recogieron células de bazo de esplenocitos C57BL/6 y se purificaron ((Kit de aislamiento Easy Sep de linfocitos T CD4+ de ratón no tratados previamente) para obtener linfocitos T CD4+ no tratados previamente. Después, las células se cultivaron durante 96 h a 105 células/200 jl/pocillo en placas de 96 pocillos con Acm anti-CD3 recubierto 5 jg/m l (eBioscience), Acm anti-CD28 soluble 2 jg/m l (Biolegend), 10 jg/m l de TGF-p1 (R&D systems) y 100 UI/ml de IL-2 (R&D systems).

Conversión de iTreg en presencia de B572-Fc

Se incubaron linfocitos T CD4+ no tratados previamente en condiciones de cultivo óptimas para la conversión de iTreg en presencia de diferentes concentraciones de dosis (jg/200 j l) de B572-Fc, B57-p2m-Fc, B27-p2m-Fc, Isotipo IgG4 y PBS durante 72 h. La conversión de iTreg se midió mediante citometría de flujo.

Ensayo de supresión

Se purificaron linfocitos T efectores CD4+ o CD8+ de PBMC de ratón o de ser humano (Kit de aislamiento Easy Sep de linfocitos T CD4+ de ratón no tratados previamente; Dynabeads® FlowComp™ CD8 de ratón-life technologies; Dynabeads® CD8 humano-Life Technologies) y marcado con tinción violeta de proliferación de trazas celulares 10 jM (Molecular Probes). Los linfocitos Tregs (2,5 x 104) y los linfocitos T efectores (2,5 x 104) se cultivaron en placas de 96 pocillos con fondo en U con anticuerpo de CD3 recubierto (eBioscience) (3 jg/m l) y de CD28 soluble (eBioscience) (1 jg/m l) durante 96 horas. La proliferación de linfocitos T efectores se midió usando un FACS canto II y los datos se analizaron usando el programa informático de análisis de proliferación de FlowJo versión 7.6.4.

Ensayo de proliferación

Las células se sembraron en placas redondas de 96 pocillos a una densidad de 5 x 105 células/pocillo tras la adición de fármacos a diferentes concentraciones (10, 5 y 2 pg/pocillo) durante 1 día. El ensayo de proliferación XTT se realizó de acuerdo con las instrucciones del manual (kit de proliferación celular II, Roche). Los resultados se obtuvieron con la absorbancia de los pocillos a 450 nm utilizando un lector de placas de microtitulación.

Ensayos ELISA

Los ensayos ELISA competitivos se realizaron usando placas de 96 pocillos Maxisorp (Nunc, Suiza) recubiertas con 10 pg/ml de receptores de leucocitos recombinantes seleccionados (KIR3DL1 humano, KIR3DL2 humano, KIR3DL3 humano, LILRB1 humano, LILRB2 humana y Pirb de ratón). Los receptores se incubaron para ON 4 °C, se bloquearon con leche en polvo al 5 %-PBS 2 h. Se añadieron B572-Fc, B57-p2m-Fc, B272-Fc, B27-p2m-Fc y el isotipo IgG4 a 2 pg/ml durante 2 horas a TA. Se utilizaron como detectores anticuerpos conjugados con HRP contra Fc humano.

Producción, purificación y replegamiento de B572-Fc

La producción recombinante de B57-p2m-Fc se logró insertando los dominios alfa 1, 2 y 3 de HLA-B57 en un vector IgG4-Fc humano y la p2-microglobulina humana (p2m) en un vector separado. La producción de B57-p2m-Fc recombinante se realizó mediante cotransfección del vector B57-Fc y el vector p2m en células de ovario de hámster chino (CHO). La producción de B57-p2m-Fc se subcontrató a Evitria AG.

La purificación de B57-p2m-Fc se realizó usando protocolos convencionales para la purificación de anticuerpos. La producción de B572-Fc se realizó con la adición de una etapa de desnaturalización para eliminar p2m del complejo B57-p2m-Fc.

En resumen, la etapa de captura de B57-p2m-Fc se realizó después de hacer pasar los sobrenadantes (5 ml/min) a través de columnas de proteína G (Amersham Pharmacia). Las etapas de purificación intermedias se realizaron eluyendo el B57-p2m-Fc de las columnas de proteína G utilizando tampón de elución (glicina 100 mM, pH 2,0) y recuperando fracciones en urea 8M, Tris-HCl 100 mM pH 8,0. La 1a etapa de pulido consistió en separar las fracciones de monómeros de B57-Fc de p2m mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) utilizando superdex 200 prep grade o Sephacryl S-100 HR (GE Lifescience) con un sistema AKTA (GE Lifescience), o mediante diálisis con membranas de tamaño de poro de 30 KDa o 50 KDa (Millipore). Los monómeros de B57-Fc recuperados de ambos protocolos se volvieron a plegar mediante el procedimiento de dilución después de la pulsación de los monómeros de B57-Fc 3 veces con intervalos de 8 horas cada uno en 100 veces el volumen de tampón de replegamiento (Tris-HCI 50 mM pH 8.5, 500 mM de L-arginina, EDTA 1 mM, NaCl 0,15 mM, sacarosa al 1 %, Tween-20 al 0,01 %. La 2a etapa de pulido por SEC se realizó para eliminar más impurezas y para el intercambio de tampón de fracciones recién recuperadas de moléculas B572-Fc en tampón de dilución (PBS, sacarosa al 1 % y Tween-20 al 0,01 %). Se esterilizaron por filtración soluciones purificadas de B572-Fc usando membranas de 0,2 pm (Millipore).

Se analizaron complejos de fracciones B57-p2m-Fc y B572-Fc se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) y transferencia Western usando anticuerpos HC10 (específicos para cadenas pesadas libres de HLA). Se realizaron transferencias Western de p2m con y sin condiciones desnaturalizantes (DTT 10 mM) (datos no mostrados).

Secuencias completas y parciales de alelos HLA-B57

Los dominios funcionales de la cadena alfa de HLA-B57 de longitud completa desde el extremo N al extremo C son: Péptido señal, alfa 1, alfa 2, alfa 3, dominio transmembrana y cola citoplásmica.

Tabla 1: Alelos de HLA-B57

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un confórmero abierto de HLA-B57 aislado.

2. Un confórmero abierto de HLA-B57 aislado para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer, o para su uso como agente inmunomodulador para tratar enfermedades infecciosas.

3. Un confórmero abierto de HLA-B57, en el que dicho confórmero abierto comprende, o consiste en, un primer y un segundo monómero, y cada monómero independientemente del otro monómero comprende una cadena pesada de HLA-B57.

4. El confórmero abierto de HLA-B57 de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende adicionalmente una secuencia polipeptídica de Fc (fragmento cristalizable) y opcionalmente, un enlazador de aminoácidos que une la cadena de HLA-B57 y el fragmento Fc.

5. El confórmero abierto de HLA-B57, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en el que el primer y/o segundo monómero comprende adicionalmente un fragmento de epítopo peptídico.

6. El confórmero abierto de HLA-B57, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 anteriores, en el que la cadena de HLA-B57 solamente consiste en los dominios alfa 1,2 y 3 de HLA-B57.

7. El confórmero abierto de HLA-B57, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 anteriores, en el que la cadena de HLA-B57 comprende el dominio transmembrana y no comprende el dominio intracelular.

8. El confórmero abierto de HLA-B57, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 anteriores, en el que la cadena de HLA-B57 tiene > 85 %, > 90 %, > 92 %, > 93 %, > 94 %, > 95 %, > 96 %, > 97 % o > 98 %, o el 100 %, de identidad de secuencia en comparación con una cualquiera de las secuencias identificadas en la Tablal.

9. Un confórmero abierto de HLA-B57 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer.

10. El confórmero abierto de HLA-B57 de acuerdo con las reivindicaciones 3 a 8, en el que el dominio Fc comprende regiones constantes de cadena pesada Ch2 y Ch3 seleccionadas de una cualquiera de inmunoglobulina de tipo G (IgG), de tipo A (IgA), de tipo D (IgD), de tipo E (IgE) o de tipo M (IgM), para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer.

11. Un medicamento combinado que comprende

a. un confórmero abierto o un homodímero de proteína de fusión de HLA-B57 como se especifica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 8, y

b. un agente inhibidor de puntos de control, particularmente un anticuerpo inhibidor de puntos de control y/o un agente agonista de puntos de control, particularmente un anticuerpo agonista de puntos de control.

12. El medicamento de combinación de acuerdo con la reivindicación 11, en el que

a. dicho agente inhibidor de puntos de control se selecciona de un inhibidor de la interacción de PD-1 con su ligando PD-L1 o PD-L2, particularmente en el que el agente se selecciona de un anticuerpo contra uno cualquiera de PD-1 o PD-L1, incluso más particularmente en el que el agente es un anticuerpo monoclonal contra PD-1 o PD-L1 humanos; o

b. dicho agente agonista de puntos de control es un anticuerpo para potenciar las respuestas inmunitarias mediante la unión a 4-1BB, particularmente un anticuerpo monoclonal contra 4-1BB.

13. Una molécula de ácido nucleico para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer, en el que dicha molécula de ácido nucleico codifica un confórmero abierto de HLA-B57 (monómero de proteína) o un monómero de proteína de fusión de HLA-B57 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 8.

14. Un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13, particularmente un plásmido que comprende un promotor que es operable en una célula de mamífero, particularmente en una célula humana, para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer.

15. Un virus que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13 bajo el control de una secuencia promotora operable en una célula de mamífero, particularmente en una célula humana, particularmente un adenovirus, virus adenoasociado, un virus del herpes o un lentivirus, para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer.