ES2824253T3 - Composiciones que comprenden unos precursores de plaguicida y métodos de fabricación y utilización - Google Patents

Abstract

Un sistema precursor de plaguicida de dos partes que comprende menos de un 0,5 % de productos de degradación de glucosinolatos, que comprende dos partes separadas, (a) una primera parte que comprende un concentrado de sinigrina y (b) una segunda parte que comprende una harina de semillas de Sinapis alba, que comprende un complejo de mirosinasa activa en una concentración suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos tras mezclar la primera y la segunda parte en presencia de agua, en donde tras mezclar las dos partes se obtiene una formulación en la que las unidades de actividad de mirosinasa por unidad de masa de sinigrina son menos de 0,96 unidades de mirosinasa/mg de sinigrina.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que comprenden unos precursores de plaguicida y métodos de fabricación y utilización

Campo de la invención

La invención que se describe en el presente documento se refiere a composiciones nuevas útiles para el tratamiento de plagas y a métodos de fabricación y utilización de las mismas, particularmente, a composiciones obtenibles a partir de materiales vegetales.

Antecedentes de la invención

Los siguientes párrafos se proporcionan a modo de antecedentes de la presente divulgación. Sin embargo, no son una admisión de que nada de lo debatido en ellos es una técnica anterior o parte del conocimiento de las personas expertas en la materia.

Los plaguicidas se utilizan para controlar plagas en áreas tales como cosechas, hogares y zonas de almacenamiento de alimentos. Sin embargo, la utilización a gran escala de plaguicidas, particularmente en la segunda mitad del siglo veinte y primera parte del siglo veintiuno, ha dado como resultado una preocupación considerable respecto al impacto medioambiental, una mayor resistencia contra los plaguicidas en las poblaciones de plagas, así como una toxicidad para los organismos no diana, incluyendo los seres humanos. Es controvertida, por ejemplo, la utilización de hidrocarburos policlorados, tales como el DDT, que persisten durante períodos prolongados en el medio ambiente y son perjudiciales para, por ejemplo, los peces y las aves de presa. Otra clase de plaguicidas, los metilbromuros, además ser tóxicos para el sistema nervioso y respiratorio humano, suponen un daño a la capa ozono estratosférico, como resultado cual los gobiernos en muchas jurisdicciones han restringido severamente la utilización de metilbromuros. Otros plaguicidas eficaces ampliamente utilizados incluyen los organofosforados y los carbamatos y si bien estos compuestos se descomponen más rápidamente en el medio ambiente, todavía se consideran altamente tóxicos.

Una alternativa es la utilización de plaguicidas obtenibles a partir de fuentes naturales, también denominados en la técnica como bioplaguicidas. Estos bioplaguicidas se preparan a partir fuentes, tales como las plantas, que frecuentemente comprenden defensas naturales contra insectos y otras plagas. Los glucosinolatos, que se encuentran ubicuamente en la familia de las plantas de la mostaza (también conocidos alternativamente en la técnica como "Cruciferae" o "Brassicaceae"), que incluye, por ejemplo, la mostaza y la colza, actúan como plaguicidas en muchas plantas. La eficacia plaguicida del material vegetal de mostaza se atribuye a los productos de degradación de glucosinolatos, que incluyen sinigrina, tiocianato de alilo e isotiocianato de alilo, más que a los propios glucosinolatos. Estos productos de degradación de glucosinolatos se forman tras una reacción enzimática que implica enzimas presentes de forma endógena en el material vegetal de mostaza, en particular, la mirosinasa. La mirosinasa se ha identificado en una pluralidad de familias de plantas y se ha aislado y caracterizado con una cantidad considerable de detalles, véase, por ejemplo: Bor, M., Ozden, O, Ozedmir, F y Turkan I. Plant Mol. Biol. Rep. (2009) 27: 518-525 y Shen L., Su, G., Wang X., Du, Q y Wang K. (2010) Food Chemistry 119: 987-994.

Los productos plaguicidas basados en material vegetal, incluyendo el material vegetal de mostaza, son conocidos en la técnica anterior. La solicitud de patente de los Estados Unidos US 2008/0182751, por ejemplo, describe el uso de material vegetal de mostaza para controlar plagas de plantas, incluidos los insectos y la patente de Estados Unidos n.° 5.747.056 muestra la utilización del salvado de mostaza para controlar plagas del suelo. La utilización de harina de mostaza para controlar plagas de plantas se desvela en Brown, J. y Morra, M. J, 2005, Subcontract Report National Renewable Energy Laboratory NREl/SR-510-35254. También se conocen productos purificados y extractos orgánicos obtenibles a partir plantas de mostaza para utilizar en el tratamiento de plagas en la técnica anterior. En este sentido, la patente de Estados Unidos n.° 7.087.553 desvela un proceso para eliminar organismos no deseados en agricultura que comprende la aplicación conjunta de aceite de mostaza en agua y una solución de fósforo en agua. La patente de Estados Unidos n.° 6.545.043 muestra métodos para la supresión de plagas objetivo utilizando una composición que comprende un producto de degradación de glucosinolatos purificado obtenible a partir de plantas de mostaza. Adicionalmente, Gendy et al. (Gendy A. A., Gindi, O.D., Hafez, Al.S. y Ateya A.M. (2010) Food Chemistry 118: 519 -524, demuestran la actividad antimicrobiana de productos degradación de glucosinolatos obtenidos a partir de Erysimum corinthium. Se ha demostrado que los productos de glucosinolatos a base de harina de mostaza muestran efectos inhibidores contra artrópodos, así como malas hierbas, hongos y bacterias (véase: Brown, J. y Morra, M. J, 2005, Subcontract Report National Renewable Energy Laboratory NREL/SR-510-35254).

El documento US2008/311192 A1 desvela composiciones precursoras quimioprotectores de recubrimiento entérico que comprenden glucosinolato, beta-tioglucosidasa y un excipiente y métodos para convertir glucosinolato en isotiocianato en el intestino delgado.

Lazzeri et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 52, n.° 22, 2004, páginas 6703-6707, investiga la actividad biocida de once glucosinolatos y sus productos de degradación en juveniles de segundo estadio del nematodo formador de agallas M. incógnita. Ninguno de los glucosinolatos intactos mostraron tener un efecto biológico.

El documento WO2012/074412 A1 desvela un producto quimioprotector de cáncer que comprende glucorafanina y/o un compuesto de glucorafanina y enzima mirosinasa de fuentes vegetales de Brassicaceae.

El documento WO2013/057675 A1 desvela una composición de alqueniglucosinolato que en condiciones estomacales genera el correspondiente derivado de epitionitrilo, que tiene propiedades desintoxicantes. También describen composiciones alimentarias y usos de la composición.

El documento CA2820392 A1 desvela mezclas de material vegetal de mostaza a partir de Sinapis alba y Brassica júncea para el control de plagas y métodos de fabricación de dichas mezclas.

El documento CA2693262 A1 describe un método para convertir glucosinolato en un material vegetal que contiene glucosinolato en productos de degradación de glucosinolatos.

Worthington: "Substrate Concentration (Introduction to Enzymes)" de "The Manual of Clinical Enzyme Measurements", 1972, páginas 1-2, describe las constantes y ecuaciones de Michaelis para calcular la actividad enzimática.

El documento US2013/072554 describe composiciones que comprenden una mezcla de semilla de brócoli y de semilla de mostaza y métodos para la administración y utilización de isotiocianatos para profilaxis y/o terapia del cáncer de vejiga.

No obstante lo anterior, la potencia de los plaguicidas derivados de material vegetal conocidos en la técnica anterior es menor de lo deseable, permitiendo el control limitado de plagas y requiriendo una utilización y aplicación de volúmenes sustanciales de material vegetal para controlar las plagas.

Por tanto, todavía existen deficiencias importantes en las formulaciones a base de material vegetal capaces de controlar plagas que se conocen en la técnica anterior. En particular, existe una necesidad de un plaguicida más potente preparado a partir de material vegetal, que permita la aplicación de menos material vegetal y formulaciones de plaguicidas menos costosas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona nuevas formulaciones que comprenden material vegetal que son útiles en el tratamiento de plagas. Las formulaciones reivindicadas son superiores a las formulaciones basadas en material vegetal conocidas hasta ahora en muchos aspectos, incluso con respecto a su potencia, facilidad fabricación, seguridad y facilidad almacenamiento, transporte y aplicación.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un sistema precursor de plaguicida de dos partes, que comprende menos de un 0,5 % de productos de degradación de glucosinolatos, que comprenden dos partes separadas, (a) una primera parte que comprende un concentrado de sinigrina y (b) una segunda parte que comprende una harina de semillas de Sinapis alba, que comprende un complejo de mirosinasa activa en una concentración suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos tras mezclar la primera y la segunda parte en presencia de agua, en donde tras mezclar las dos partes se obtiene una formulación en la que las unidades de actividad de mirosinasa por unidad de masa de sinigrina son inferiores a 0,96 unidades de mirosinasa/mg de sinigrina.

Las dos partes están separadas hasta la aplicación de las mismas en presencia de agua a la plaga. Tras tal aplicación, se forman productos de degradación de glucosinolatos. Tras la aplicación de la mezcla a la plaga en presencia de agua, se forman productos de degradación de glucosinolatos.

En ciertas realizaciones, la primera parte comprende un concentrado seco de sinigrina y la segunda parte comprende una harina seca de semillas de Sinapis alba. En esta realización, las dos partes pueden mantenerse, almacenarse y/o transportarse por separado hasta su aplicación en presencia de agua a la plaga. Proporcionar agua a la mezcla da como resultado la liberación de una cantidad eficaz de productos de degradación de sinigrina. Por consiguiente, los presentes inventores describen en el presente documento un sistema precursor de plaguicida inactivo de dos partes, que comprende una mezcla esencialmente libre de productos de degradación de glucosinolatos, comprendiendo dicha mezcla (a) una primera parte, que comprende un concentrado de glucosinolato seco y (b) una segunda parte, que comprende un material vegetal seco que comprende un complejo de mirosinasa activa en una concentración suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos tras la adición de agua a la mezcla. En el presente documento, los presentes inventores describen un material vegetal que comprende un complejo de mirosinasa activa que es una harina de semillas. La harina de semillas puede resultar obtenible o se obtiene de una planta de mostaza.

La cantidad de complejo de mirosinasa en la formulación obtenida tras mezclar las partes puede variar, pero puede ser tan baja como 0,004 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina.

La presente invención proporciona adicionalmente métodos de preparación de un sistema precursor de plaguicida de dos partes, que comprende menos de un 0,5 % de productos de degradación de glucosinolatos, que comprenden preparar (a) una primera parte, que comprende un concentrado de sinigrina y (b) una segunda parte, que comprende una harina de semillas de Sinapis alba que comprende un complejo de mirosinasa activa en una concentración suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos tras mezclar el primer y el segundo componente en presencia de agua, en donde tras mezclar las dos partes se obtiene una formulación en la que las unidades de actividad de mirosinasa por unidad de masa de sinigrina es inferior a 0,96 unidades de mirosinasa por mg de sinigrina.

En realizaciones preferidas, la primera parte es un concentrado seco de sinigrina y la segunda parte es una harina seca de semillas de Sinapis alba. Los presentes inventores describen en el presente documento métodos de preparación de un precursor de plaguicida inactivo que comprende preparar una mezcla esencialmente libre de productos de degradación de glucosinolatos, comprendiendo dicha mezcla (a) un concentrado de glucosinolato seco y (b) un material vegetal seco que comprende un complejo de mirosinasa activa en una concentración suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos tras la adición de agua a la mezcla.

La presente invención proporciona adicionalmente métodos para controlar plagas que comprenden:

(a) proporcionar un sistema precursor de plaguicida de dos partes que comprende menos de un 0,5% de productos de degradación de glucosinolatos, comprendiendo dicho sistema:

(i) una primera parte que comprende un concentrado de sinigrina; y

(ii) una segunda parte que comprende una harina de semillas de Sinapis alba que comprende un complejo de mirosinasa activa en una concentración suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos tras la adición de agua a la mezcla, en donde tras mezclar las dos partes se obtiene una formulación en la que las unidades de actividad de mirosinasa por unidad de masa de sinigrina son inferiores a 0,96 unidades de mirosinasa/mg de sinigrina;

(b) mezclar la primera y la segunda parte del sistema para obtener una mezcla que comprende la primera y la segunda parte;

(c) añadir agua a la mezcla; y

(d) aplicar el sistema a un sustrato que necesita tratamiento con plaguicida.

Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Breve descripción de los dibujos

Para una mejor comprensión de ciertas realizaciones ejemplares descritas en el presente documento y para mostrar más claramente cómo pueden ponerse en práctica estas realizaciones ejemplares, se hará referencia, a modo de ejemplo, a las figuras acompañantes que muestran al menos una realización ejemplar y las figuras se describirán brevemente, a continuación. Debe entenderse que las figuras en el presente documento se proporcionan solo con fines ilustrativos y no pretenden limitar la presente divulgación.

La Figura 1 representa un gráfico que muestra el control nematicida y fungicida utilizando un sistema precursor de plaguicida de dos partes preparado de acuerdo con la presente divulgación.

La Figura 2 representa un gráfico que muestra el control nematicida utilizando formulaciones que comprenden diversas concentraciones de mirosinasa.

Descripción detallada de la invención

A continuación, se describirán diversas composiciones y métodos para proporcionar un ejemplo de una realización de cada materia objeto reivindicada. Es posible que una composición, sistema, método o proceso descrito a continuación no sea una realización de ninguna materia objeto reivindicada.

Debería observarse que expresiones de grado tales como "sustancialmente", "esencialmente", "alrededor de" y "aproximadamente" como se usan en el presente documento, significan una cantidad razonable de desviación del término modificado, de manera que el resultado final no cambia significativamente. Estas expresiones de grado deben interpretarse como que incluyen una desviación del término modificado si esta desviación no niega el significado del término que modifica.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "y/o" pretende representar un o inclusivo. Es decir, "X y/o Y" significa X o Y o ambos, por ejemplo. Como un ejemplo adicional, "X, Y y/o Z" pretende significar X o Y o Z o cualquier combinación de los mismos.

Como se ha mencionado hasta ahora, la presente invención se refiere a un nuevo sistema precursor de plaguicida de dos partes que comprende harina de semillas de Sinapis alba para su utilización en el control de plagas. Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que un sistema de dos partes que comprende un concentrado de sinigrina y una harina de semillas de Sinapis alba, que comprende un complejo de mirosinasa activa, puede utilizarse para preparar un plaguicida. Tras la adición de agua a la composición, se genera una cantidad eficaz de productos plaguicidamente activos, permitiendo su utilización como un plaguicida contra una amplia gama de plagas diferentes que incluyen, sin limitación, plagas bacterianas, plagas fúngicas, plagas de plantas y plagas de insectos. En particular, las composiciones de la presente invención requieren concentraciones sorprendentemente bajas de complejo de mirosinasa activa, relativas a la concentración de sustrato sinigrina, para producir un producto potente y plaguicidamente eficaz tras la adición de agua, dando como resultado una economía superior de fabricación de plaguicida y la utilización de cantidades limitadas de plaguicida. Las potencias que se pueden conseguir utilizando las nuevas composiciones de las presentes divulgaciones superan las potencias de las composiciones conocidas en la técnica anterior sobre una base unitaria de actividad mirosinasa. Además, las composiciones proporcionadas permiten el control sobre la reacción enzimática responsable de la conversión de los productos de degradación de la sinigrina en productos plaguicidamente activos, permitiendo la preparación de composiciones con un amplio intervalo de potencias variables. Además, las composiciones proporcionadas son fáciles de utilizar dado que son plaguicidamente inactivos y que se activan cuando están listos para utilizarse añadiendo agua a las composiciones, facilitando por tanto el almacenamiento y transporte. Finalmente, las composiciones proporcionadas en el presente documento son adicionalmente beneficiosas ya que son naturales, orgánicas y biodegradables.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un sistema precursor de plaguicida de dos partes que comprende menos de un 0,5% de productos de degradación de glucosinolatos, que comprende dos partes separadas, (a) una primera parte que comprende un concentrado de sinigrina y (b) una segunda parte que comprende una harina de semillas de Sinapis alba, que comprende un complejo de mirosinasa activa en una concentración suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos tras mezclar la primera y la segunda parte en presencia de agua, en donde tras mezclar las dos partes se obtiene una formulación en la que las unidades de actividad mirosinasa por unidad de masa de sinigrina son menos de 0,96 unidades de actividad mirosinasa por mg de sinigrina. Términos y definiciones

La expresión "producto de degradación de glucosinolatos" se refiere a productos obtenibles tras la hidrólisis de glucosinolato. El término "glucosinolato" como se utiliza en el presente documento se refiere a un compuesto químico que tiene la fórmula (I):

Entre los ejemplos de glucosinolatos se incluyen epiprogoitrina, sinigrina y/o sinalbina. El término "epiprogoitrina" como se utiliza en el presente documento se refiere a un compuesto químico que tiene la fórmula (II):

El término "sinigrina" como se utiliza en el presente documento se refiere a un compuesto químico que tiene la fórmula (III):

El término "sinalbina" como se utiliza en el presente documento se refiere a un compuesto químico que tiene la fórmula (IV):

Incluidos dentro de la expresión "productos de degradación de glucosinolatos", se encuentran tres clases generales de productos de degradación de glucosinolatos, los nitrilos, tiocianatos e/o isotiocianatos. Como se utiliza en el presente documento, el término "nitrilo" se refiere a un compuesto químico que tiene la fórmula (VI):

Como se utiliza en el presente documento, el término "tiocianato" se refiere a un compuesto químico que tiene la fórmula (VII):

(VII).

Como se utiliza en el presente documento, el término "isotiocianato" se refiere a un compuesto químico que tiene la fórmula (VIII):

(VIII).

Otros productos de degradación de glucosinolatos incluyen el tiocianato de alilo, isotiocianato de alilo y cianuro de alilo, siendo todos ellos productos de degradación de la sinigrina de 8 glucosinolatos. Las expresiones "tiocianato de alilo" o "ATC" como se utilizan en el presente documento se refieren a un compuesto químico que tiene la fórmula (IX):

Los términos "alilisotiocianato" o "AITC", como pueden utilizarse indistintamente en el presente documento, se refieren a un compuesto químico que tiene la fórmula (X):

Las expresiones "cianato de alilo" o "AC", como pueden utilizarse indistintamente en el presente documento, se refieren en el presente documento a un compuesto químico que tiene la fórmula (XI):

Otros productos de degradación de glucosinolatos incluyen 1-ciano-2-hidroxi-3-buteno ("CHB") y goitrina, que se obtienen tras la degradación del glucosinolato epiprogoitrina. Otros productos de glucosinolatos incluyen los hidroxilbenzoles.

Las expresiones "mirosinasa" y "complejo de mirosinasa activa" se refieren a cualquier complejo enzimático que es capaz de convertir glucosinolatos en productos de degradación de glucosinolatos plaguicidamente activos. La actividad de mirosinasa se expresa aquí en unidades de actividad de mirosinasa. En donde 1 unidad de actividad de mirosinasa se define como la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar 1 micromol de sinigrina por minuto a pH 6,5 y 37 °C. Asimismo, la concentración de mirosinasa en el presente documento puede expresarse como la cantidad de actividad de mirosinasa por unidad de masa de glucosinolato, por ejemplo, una determinada preparación puede comprender, por ejemplo, 1 unidad de actividad de mirosinasa por miligramo (mg) de sinigrina.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "esencialmente libre de productos de degradación de glucosinolatos" significa que una preparación, de acuerdo con la presente invención, comprende una concentración de productos de degradación de glucosinolatos de menos de un 0,5% o aproximadamente un 0,5%, más preferentemente menos de un 0,25% o aproximadamente un 0,25% y más preferentemente un 0%.

Implementación general

Preparación de la primera parte - Concentrado de sinigrina

De acuerdo con la presente invención, se prepara una primera parte, que comprende concentrado de sinigrina. El concentrado se puede preparar convenientemente mediante la extracción de la misma de fuentes naturales. Tales fuentes naturales incluyen plantas que comprenden sinigrina.

Las plantas que comprenden glucosinolatos incluyen plantas que pertenecen a las familias Brassicaceae (Cruciferae), Akaniaceae, Bataceae, Bretschneideraceae, Capparaceae, Caricaceae, Drypetes (Euphorbiaceae), Gyrostemonaceae, Limnanthaceae, Moringaceae, Pentadiplantdraceae, Resedaceae, Salvodoraceae, Tovariaceae y Tropaeolaceae. Entre los ejemplos representativos de plantas de mostaza se incluyen Brassica napus (colza), Brassica júncea (mostaza oriental, india o marrón), Brassica carinata (mostaza abisinia o etíope), Brassica nigra (mostaza negra), Brassica rapa (colza), Sinapis alba (mostaza amarilla o blanca), Sinapis arvensis (mostaza silvestre), Erysimum corinthium y cualquier cultivar o variante de las anteriores que incluye el cultivar Canola de Brassica napus. De acuerdo con la presente invención, el concentrado de sinigrina se prepara de tal manera que está esencialmente libre de productos de degradación de glucosinolatos. Como se utiliza en el presente documento, "esencialmente libre de productos de degradación de glucosinolatos" significa que el concentrado de sinigrina, preparado de acuerdo con la presente invención, comprende una concentración de productos de degradación de glucosinolatos de menos de un 0,5% o aproximadamente un 0,5%, más preferentemente menos de un 0,25% o aproximadamente un 0,25% y más preferentemente un 0%.

Un concentrado de sinigrina puede prepararse convenientemente a partir de un extracto vegetal acuoso. Tal extracto se puede preparar obteniendo material vegetal que comprende sinigrina, por ejemplo, semillas de plantas, hojas, raíces, tallos. El material de semillas de plantas contiene normalmente cantidades sustanciales de sinigrina. El material vegetal se tritura normalmente (por ejemplo, utilizando un triturador o un molino) y se mezcla en presencia de agua en condiciones en las que los glucosinolatos altamente solubles en agua entran en la fase acuosa de una mezcla o suspensión de agua:material vegetal. Una harina se puede obtener a partir de semillas de plantas, por ejemplo, una harina de Brassica juncea. Cuando se utiliza material vegetal que comprende mirosinasa como material fuente de glucosinolatos, preferentemente la enzima se inactiva, por ejemplo, llevando a cabo el proceso de extracción a temperatura elevada, por ejemplo, utilizando agua o más de aproximadamente 80 °C, más preferentemente más de aproximadamente 90 °C y más preferentemente a aproximadamente 97 °C. A continuación, los sólidos en la suspensión se separan del agua, utilizando procesos establecidos, tales como centrifugación y/o filtración (utilizando, por ejemplo, papel de filtro). Opcionalmente, los glucosinolatos en el extracto acuoso pueden concentrarse adicionalmente mediante la separación de otros componentes solubles en agua del extracto utilizando procesos establecidos, tales como la nanofiltración o concentrarse adicionalmente mediante el proceso de evaporación. Opcionalmente, el aceite residual en el extracto se puede eliminar utilizando procesos establecidos tales como la centrifugación de discos apilados o la coalescencia del aceite seguida de la separación en un tanque de sedimentación. Se puede preparar harina de semillas, por ejemplo, harina de semillas de Brassica júncea, la eliminación del aceite puede dar como resultado una harina desaceitada, que comprende, por ejemplo, menos de un 20 % de aceite residual o menos de un 15 % de aceite residual, por ejemplo, un 14 %, un 13 %, un 12 %, un 11 % o un 10 % de aceite residual. La preparación puede comprender una cantidad sustancial de agua, por ejemplo, desde aproximadamente un 10% hasta aproximadamente un 90% y la preparación puede ser una relativamente pura, por ejemplo, un concentrado de glucosinolato puro al 60% (p/p), al 75% (p/p), al 80% (p/p), al 90% (p/p), al 95% (p/p) o al 99% (p/p) o un concentrado de glucosinolatos relativamente bruto, por ejemplo, un concentrado de glucosinolato puro al 50% (p/p), al 40% (p/p), al 30% (p/p), al 28% (p/p), al 26% (p/p), al 24% (p/p), al 22% (p/p) o al 20% (p/p). En realizaciones de la presente invención en donde la primera parte comprende una preparación de sinigrina seca, después de que se haya concentrado la sinigrina, el agua se elimina, por ejemplo, mediante procesos de evaporación y/o secado térmico para generar un concentrado de sinigrina seco final. Los concentrados de glucosinolatos pueden estar compuestos sustancialmente por un solo glucosinolato, sinigrina o pueden estar compuestos por una mezcla de dos o más glucosinolatos. En las realizaciones de esto en las que se prepara una sinigrina seca, el concentrado contiene preferentemente menos de aproximadamente un 15% o aproximadamente un 15% de agua, más preferentemente menos de aproximadamente un 10% o aproximadamente un 10% de agua y más preferentemente menos de un 3% o aproximadamente un 3% de agua. Otras metodologías para la extracción de glucosinolatos se describen en, por ejemplo: C. Tao y B. B. He, 2004, Isolation of glucosinolates from mustard seed meal to increase the sustainability of biodiesel utilization, presentación en el ASAE/CSAE Meeting, Ottawa, Ontario, Canadá.

Preparación de la segunda parte - Harina de semillas de Sinapis alba que comprende un complejo de mirosinasa activa

De acuerdo con la presente invención, se prepara una segunda parte que comprende una harina de semillas de Sinapis alba, que comprende un complejo de mirosinasa activa.

Preferentemente, el material vegetal como se utiliza en el presente documento, se trata tal como para producir una harina de semillas procesada. El material vegetal puede, por ejemplo, triturarse o prensarse para obtener un material vegetal triturado o prensado. De acuerdo con la presente invención, el material vegetal se procesa de tal manera que se retiene la actividad de mirosinasa. Las condiciones de procesamiento adecuadas para retener la actividad de mirosinasa incluyen temperaturas por debajo de preferentemente 60 °C, más preferentemente por debajo de 50 °C y más preferentemente por debajo de 35 °C. En tales condiciones, se puede obtener y utilizar material vegetal seco que comprende un complejo de mirosinasa activa de acuerdo con la invención actual. Cuando se utiliza material vegetal rico en aceite de acuerdo con el presente documento, tal como semillas, es preferible eliminar el aceite del material vegetal. Esto se puede lograr a través de métodos tales como extracción con disolvente, prensado hidráulico, prensado con expulsor, prensado en frío y otros procesos de eliminación del aceite, que serán bien conocidos por el experto en la materia y de esta forma, un material vegetal desaceitado, por ejemplo, un desaceitado. Se puede obtener una harina de semillas de Sinapis alba que contiene menos de un 20% de aceite residual o menos de un 15% de aceite residual, por ejemplo, un 14 %, un 13 %, un 12 %, un 11% o un 10% de aceite residual. Otras fracciones, por ejemplo, las cáscaras de semillas, pueden eliminarse del material vegetal para obtener un material vegetal que comprende un complejo de mirosinasa activa. El complejo de mirosinasa se puede concentrar también mediante procesos tales como extracción acuosa y fraccionamiento del extracto y puede obtenerse una fracción de mirosinasa más o menos pura. La mirosinasa es una proteína soluble en agua y se concentrará en las fracciones acuosas. Puede utilizarse un procesamiento acuoso adicional para concentrar adicionalmente la mirosinasa antes del secado. La ultrafiltración es un ejemplo de una técnica de procesamiento acuoso que se puede utilizar para concentrar la mirosinasa. La cantidad de agua presente en las preparaciones de mirosinasa es normalmente de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 90%.

Para obtener material vegetal seco, el material vegetal se seca dando como resultado la eliminación del agua endógena presente en el material vegetal. El secado del material vegetal de acuerdo con el presente documento se logra utilizando metodologías generalmente conocidas por el experto en la materia. Dichos métodos incluyen, sin limitación, el procesamiento del material vegetal mediante el uso de un secador de granos o un acondicionador de semillas diseñado para eliminar la humedad del material hasta un nivel definido, que puede combinarse como se mencionó anteriormente con el procesamiento adicional del material vegetal utilizando la extracción acuosa y el fraccionamiento. Otros ejemplos de metodologías que pueden utilizarse de acuerdo con el presente documento para obtener material vegetal seco que comprende un complejo de mirosinasa activa, incluyen el secado por pulverización, secado instantáneo y criodesecación. Como se mencionó anteriormente, las condiciones de procesamiento aplicadas para preparar el material vegetal seco de acuerdo con el presente documento son relativamente suaves. De manera similar, las condiciones de secado aplicadas son relativamente suaves, con temperaturas que preferentemente no exceden los 60 °C, más preferentemente no exceden los 50 °C y más preferentemente no exceden los 35 °C. El secado del material vegetal puede realizarse antes y/o después de cualquier otro procesamiento opcional del material vegetal. Una vez completado el secado del material vegetal, por ejemplo, harina, la humedad relativa del material vegetal es preferentemente menor del 15% o aproximadamente del 15%, más preferentemente menor del 10% o aproximadamente el 10% y más preferentemente menor del 7% o aproximadamente el 7%, por ejemplo, un 6 %, un 5 %, un 4 %, un 3 %, un 2 %, un 1 % o un 0 %.

La harina de semillas se prepara a partir de Sinapis alba. Se conocen en la técnica muchos procesos para procesar semillas de mostaza crudas en aceite y harina. Los procesos ilustrativos son aquellos enseñados por Morra, M. J, 2000-2002, Subcontract Report National Renewable Energy Laboratory NREIJSR-510-3628. Es típico de estos procesos la recepción de semillas de mostaza del campo por medios de transporte convencionales, por ejemplo, ferrocarril o camión, en unas condiciones sucias y a menudo húmedas. A continuación, la semilla de mostaza se somete a un procedimiento de separación elemental, por ejemplo, se pone en contacto con una criba vibratoria o utilizando una máquina limpiadora de granos, por ejemplo, una máquina limpiadora de granos fabricada por Damas A/S (Dinamarca), en la que se separa la semilla de mostaza del material que no sea semilla de mostaza, como rocas, palos, tierra, hojas, malas hierbas, cascarillas sueltas, etc. Es preferible que tras la limpieza la semilla de mostaza se seque, utilizando, por ejemplo, un secador de granos fabricado por Vertec Industries Limited (Canadá), de manera que el contenido de humedad de la semilla se reduzca entre un 5% y un 7%. Tras la eliminación de los contaminantes que no son semilla de mostaza y del secado, la semilla de mostaza puede almacenarse, mezclarse con otras semillas de mostaza o procesarse para obtener harina de semillas de mostaza. En este punto del proceso, el recubrimiento exterior de la semilla, que también se conoce como la cascarilla o salvado de la semilla, se puede eliminar de la semilla moliendo o partiendo la semilla o utilizando otro proceso abrasivo adecuado para obtener el grano de la semilla. Sin embargo, tal eliminación del salvado es opcional y no tiene una importancia crítica. El siguiente paso del proceso depende en gran medida del contenido de aceite (también conocido como "lípido" o "grasa") de la harina de mostaza que se desee. Si se desea una harina "entera", los granos se someten a un proceso que no da como resultado la extracción de aceite. Si, por otra parte, se desea una harina "desgrasada", a continuación, los granos se someten a un proceso que da como resultado la eliminación del aceite. En realizaciones preferidas de la presente invención, se prepara una harina desgrasada. Por consiguiente, la semilla de mostaza o el grano de mostaza (en los casos en donde se ha eliminado el salvado) se muele preferentemente, utilizando, por ejemplo, un molino de martillos, para obtener harina de mostaza. A continuación, el aceite se elimina de la harina mediante extracción con disolvente orgánico, por ejemplo, utilizando, por ejemplo, hexano o por separación mecánica de los componentes no oleosos de la semilla utilizando, por ejemplo, un expulsor de aceite o una prensa, como una prensa de aceite tal como una prensa Taby fabricada por Skeppsta Maskin AB (Suecia) o un expulsor de aceite Komet fabricado por Monforts Oekotec GmbH (Alemania). También se puede utilizar una combinación de eliminación mecánica del aceite seguida de extracción con disolvente orgánico para lograr la máxima eliminación de aceite de la semilla. Preferentemente, la harina de semillas de mostaza comprende entre un 2% y un 50% del aceite de semilla disponible y más preferentemente aproximadamente entre un 10 y un 15% y más preferentemente un 15% del aceite de semilla disponible. Preferentemente, la harina de semillas de mostaza obtenida en este punto que tiene un contenido de humedad inferior al 12% en el proceso, está lista para utilizarse como ingrediente para la formulación con otros ingredientes opcionales mencionados en esta solicitud.

Preparación de precursores de plaguicida de dos partes

La presente invención proporciona un sistema precursor de plaguicida de dos partes, que comprende menos de un 0,5 % de productos de degradación de glucosinolatos, que comprenden dos partes separadas, (a) una primera parte que comprende un concentrado de sinigrina y (b) una segunda parte que comprende una harina de semillas de Sinapis alba, que comprende un complejo de mirosinasa activa en una concentración suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos tras mezclar la primera y la segunda parte en presencia de agua, en donde tras mezclar las dos partes se obtiene una formulación en la que las unidades de actividad de mirosinasa por unidad de masa de sinigrina es inferior a 0,96 unidades de mirosinasa por mg de sinigrina.

Los precursores de plaguicida de dos partes están esencialmente libres de productos de degradación de glucosinolatos. Por tanto, el concentrado de sinigrina está esencialmente libre de productos de degradación de glucosinolatos y la harina de semillas de Sinapis alba que comprende una cantidad eficaz del complejo de mirosinasa está esencialmente libre de productos de degradación de glucosinolatos. Lo anterior es aplicable en realizaciones de la divulgación en donde las partes del sistema de dos partes están separadas. Solo tras la adición posterior de agua a las partes se forman los productos de degradación de glucosinolatos.

Las dos partes están separadas hasta la aplicación de las mismas en presencia de agua a la plaga. Por tanto, las dos partes pueden transportarse y/o almacenarse convenientemente hasta que estén listas para aplicarse a un sustrato que necesita tratamiento con un plaguicida. En estas realizaciones, una o ambas partes pueden ser más o menos acuosas (es decir, que contienen más de un 10% (v/v) de agua, por ejemplo, más de un 50% (v/v), de un 60 % (v/v), de un 70 % (v/v), de un 80 % (v/v) o de un 90 % (v/v)) o una o ambas partes pueden prepararse en forma seca, como un polvo o partículas (es decir, que contengan menos de aproximadamente un 10 % v/v agua). Al mezclar las dos partes en presencia de agua, que puede añadirse exógenamente (en las realizaciones en donde las dos partes están presentes en forma seca) o que puede estar presente endógenamente (cuando se utilizan preparaciones acuosas), se forman productos de degradación de sinigrina y el producto está listo para su aplicación a un sustrato que lo necesite. Las dos partes se pueden incorporar para formar una mezcla en condiciones de mezcla que no den como resultado la formación de productos de degradación de glucosinolatos. Tales condiciones implican normalmente la ausencia de agua, es decir, la mezcla es una mezcla de polvo seco que comprende un contenido de agua de no más de un 15% (v/v), preferentemente no más de un 5% (v/v) y más preferentemente no más de un 1% (v/v). Al mezclar la mezcla de polvo en presencia de agua, se forman productos de degradación de glucosinolatos y el producto puede aplicarse a un sustrato que necesite tratamiento con un plaguicida.

En unas ciertas realizaciones, la primera parte comprende un concentrado seco de sinigrina y la segunda parte comprende una harina seca de semillas de Sinapis alba. En esta realización, las dos partes secas pueden mantenerse, almacenarse y/o transportarse por separado hasta su aplicación en presencia de agua al sustrato que necesita un tratamiento plaguicida. Proporcionar agua a la mezcla en presencia de agua da como resultado la liberación de una cantidad eficaz de productos de degradación de sinigrina. Los presentes inventores describen en el presente documento un sistema precursor de plaguicida inactivo de dos partes, que comprende una mezcla esencialmente libre de productos de degradación de glucosinolatos, comprendiendo dicha mezcla (a) una primera parte, que comprende un concentrado de glucosinolato seco y (b) una segunda parte, que comprende un material vegetal seco que comprende un complejo de mirosinasa activa en una concentración suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos tras la adición de agua a la mezcla.

El material vegetal que comprende un complejo de mirosinasa activa puede ser una harina de semillas. La harina de semillas puede resultar obtenible o se obtiene de una planta de mostaza. La concentración de complejo de mirosinasa en la mezcla puede variar, pero puede ser tan baja como 0,1 unidades por gramo de material vegetal.

La presente invención proporciona además métodos para preparar un sistema precursor de plaguicida de dos partes. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método de preparación de un sistema precursor de plaguicida de dos partes que comprende menos del 0,5% de productos de degradación de glucosinolatos que comprende preparar (a) una primera parte que comprende un concentrado de sinigrina y (b) una segunda parte que comprende una harina de semillas de Sinapis alba que comprende un complejo de mirosinasa activa en una concentración suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos al mezclar el primer y el segundo componente en presencia de agua, en donde al mezclar las dos partes se obtiene una formulación en la que las unidades de actividad de mirosinasa por unidad de masa de sinigrina son menos de 0,96 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina.

En realizaciones preferidas, la primera parte es un concentrado seco de sinigrina y la segunda parte es una harina seca de semillas de Sinapis alba. Los métodos para preparar un precursor de plaguicida inactivo pueden comprender preparar una mezcla esencialmente libre de productos de degradación de glucosinolatos, comprendiendo dicha mezcla (a) un concentrado seco de sinigrina y (b) una harina seca de semillas de Sinapis alba que comprende un complejo de mirosinasa activa en una concentración suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos tras la adición de agua a la mezcla, en donde tras mezclar las dos partes se obtiene una formulación en la que las unidades de actividad de mirosinasa por unidad de masa de sinigrina son menos de 0,96 unidades de mirosinasa/mg de sinigrina.

Para preparar un producto plaguicida activo a partir de los precursores de plaguicida inactivos de la presente invención, el concentrado de sinigrina se mezcla con la harina de semillas de Sinapis alba en presencia de agua. En este sentido, se pueden utilizar metodologías de mezcla convencionales, utilizando un equipo de agitación o movimiento. De acuerdo con la presente invención, la mirosinasa está presente en la mezcla en una concentración que es suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos. "Cantidad eficaz", como se utiliza en el presente documento, es cualquier cantidad que da como resultado la reducción de la gravedad o el efecto perjudicial causado por una plaga durante un período de tiempo limitado o prolongado. La cantidad de agua utilizada puede variar, pero excede normalmente los 4546 litros por 453,6 kilogramos (kg) (1000 galones por 1000 libras) de las partes mezcladas, cuando se utilizan formulaciones secas. A modo de ejemplo, una mezcla que comprende 228,6 kg (504 lbs) de harina de Sinapsis alba y 228,6 kg (504 lbs) de un concentrado seco de sinigrina al 24% se mezclan preferentemente con entre 22.730 y 136.383 litros (5.000 y 30.000 galones) de agua. Cuando se utilizan formulaciones acuosas, las cantidades de formulación acuosa utilizadas normalmente son inferiores, por ejemplo, se pueden aplicar 22,7 litros (5 galones) de formulación acuosa en presencia de 22.730-136.383 litros (5,000 - 30,000 galones) de agua. En donde 1 galón son 4,546 litros y 1 lb son 0,4536 kilogramos.

Los inventores han determinado que la harina de semillas de Sinapis alba que comprende la mirosinasa utilizada puede comprender concentraciones sorprendentemente bajas de unidades de actividad de mirosinasa, relativas a la concentración del glucosinolato sinigrina en el producto. En particular, los inventores han determinado que la cantidad de mirosinasa relativa a la cantidad de glucosinolato utilizado para preparar el sistema de dos partes de la presente invención, puede ser sustancialmente menor que la cantidad de mirosinasa relativa a la cantidad de glucosinolato que está presente naturalmente en materiales vegetales, por ejemplo, harina de semillas. Preferentemente, la actividad de mirosinasa por unidad de masa de sinigrina es menos de la mitad de la actividad de mirosinasa por unidad de masa de sinigrina presente de forma natural en el extracto de semilla, más preferentemente más de 10 veces menos, más de 50 veces menos, más de 100 veces menos, más de 250 veces menos o más de 1.000 veces menos. Al mezclar las dos partes, se obtiene una formulación que comprende menos de 0,96 o aproximadamente 0,96 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina, por ejemplo, menos de 0,50 o aproximadamente 0,50 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina o por ejemplo, menos de 0,25 unidades o aproximadamente 0,25 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina, por ejemplo, menos de 0,20 o aproximadamente 0,20 unidades por mg de sinigrina o por ejemplo, menos de 0,15 o aproximadamente 0,15 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina o por ejemplo, menos que, por ejemplo, 0.10 unidades o aproximadamente 0,10 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina o por ejemplo, menos de 0,05 unidades o aproximadamente 0,05 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina o por ejemplo, menos de 0,01 unidades o aproximadamente 0,01 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina o por ejemplo, menos de 0,0075 unidades o aproximadamente 0,0075 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina, por ejemplo, menos de 0,005 unidades o aproximadamente 0,005 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina o por ejemplo, menos de 0,004 unidades o aproximadamente 0,004 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina o por ejemplo, menos de 0,001 unidades o aproximadamente 0,001 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina. La velocidad de hidrólisis lograda en las formulaciones anteriores excede la velocidad de hidrólisis lograda cuando el material vegetal que comprende naturalmente mirosinasa y sinigrina se mezcla en presencia de agua. Preferentemente, la velocidad de hidrólisis en las formulaciones de la presente invención es al menos 2 veces la velocidad de hidrólisis lograda cuando el material vegetal que comprende de forma natural mirosinasa y sinigrina se mezcla en presencia de agua, por ejemplo, al menos 5 veces o al menos 10 veces o al menos 20 veces. Preferentemente, la velocidad de hidrólisis de las formulaciones de la presente invención es más de 12,5 jm ol de sinigrina hidrolizada por minuto, más preferentemente más de 25 o aproximadamente 25 jm ol de sinigrina/minuto, por ejemplo, 50 o aproximadamente |jmol de sinigrina/minuto, 75 o aproximadamente 75 jm ol de sinigrina/minuto o 100 o aproximadamente 100 jm ol de sinigrina/minuto.

Los productos de degradación de glucosinolatos que se forman tras al hidrolizarse un glucosinolato pueden variar e incluir cualquier nitrilo, tiocianato o isotiocianato y mezclas de los mismos. El concentrado de glucosinolato es un concentrado de sinigrina y los productos de degradación de la sinigrina son aliltiocianato, alilisotiocianato o alilcianato y mezclas de los mismos.

Las formulaciones preparadas de acuerdo con la presente invención adicionalmente comprenden preferentemente un vehículo. El término "vehículo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a los medios por los cuales el plaguicida se administra a la plaga objetivo y se expone al plaguicida. Los vehículos que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención incluyen aceites, incluyendo cualquier tipo de aceite vegetal, tal como el aceite de Canola, aceite de soja y similares, polímeros, plásticos, madera, geles, coloides, pulverizaciones, medios de empapado, concentrados emulsionables y así sucesivamente. La selección del vehículo y la cantidad de vehículo utilizado en una formulación puede variar y depende de varios factores, incluida la utilización de plaguicida específico y el modo de aplicación preferido. Sin embargo, es preferible que el vehículo sea seco.

Otros ingredientes que pueden utilizarse en la formulación del producto final, de acuerdo con la presente invención, incluyen activadores enzimáticos potenciales, tales como el ácido ascórbico o modificadores de pH, tales como tampones fosfato para proporcionar un pH óptimo para la reacción cuando se agrega agua al producto.

La preparación final del precursor del plaguicida se puede formular en forma de aerosol, polvo fino, humo o polvo o en cualquier otra forma seca según se desee.

Utilización de formulaciones de plaguicida

Las composiciones descritas en el presente documento son plaguicidamente inactivas, sin embargo, se pueden utilizar para preparar una composición plaguicidamente activa, añadiendo agua a la composición. La adición de agua dará como resultado la generación de productos de degradación de sinigrina, a partir de sinigrina y por tanto, dará como resultado un producto plaguicidamente activo. Por consiguiente, la presente invención proporciona todavía adicionalmente un método para controlar plagas que comprenden:

(a) proporcionar un sistema precursor de plaguicida de dos partes que comprende menos de un 0,5% de productos de degradación de glucosinolatos, comprendiendo dicho sistema:

(i) una primera parte que comprende un concentrado de sinigrina; y

(ii) una segunda parte que comprende una harina de semillas de Sinapis alba que comprende un complejo de mirosinasa activa en una concentración suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos tras la adición de agua a la mezcla, en donde al mezclar las dos partes se obtiene una formulación en la que las unidades de actividad de mirosinasa por unidad de masa de sinigrina son menos de 0,96 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina;

(b) mezclar la primera y la segunda parte del sistema para obtener una mezcla que comprende la primera y la segunda parte;

(c) añadir agua a la mezcla; y

(d) aplicar el sistema a un sustrato que necesita tratamiento con plaguicida.

De acuerdo con la presente invención, se añade agua a la mezcla de concentrado de sinigrina y harina de semillas de Sinapis alba que comprende un complejo de mirosinasa activa tras haberse preparado.

La mezcla se prepara de tal manera que se obtienen menos de 0,96 o aproximadamente 0,96 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina, por ejemplo, menos de 0,50 o aproximadamente 0,50 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina o por ejemplo, menos de 0,25 unidades o aproximadamente 0,25 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina, por ejemplo, menos de 0,20 o aproximadamente 0,20 unidades por mg o por ejemplo, menos de 0,15 o aproximadamente 0,15 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina o por ejemplo, menos que, por ejemplo, 0.10 unidades o aproximadamente 0,10 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina o por ejemplo, menos de 0,05 unidades o aproximadamente 0,05 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina o por ejemplo, menos de 0,01 unidades o aproximadamente 0,01 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina o por ejemplo, menos de 0,0075 unidades o aproximadamente 0,0075 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina, por ejemplo, menos de 0,005 unidades o aproximadamente 0,005 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina o por ejemplo, menos de 0,004 unidades o aproximadamente 0,004 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina. La velocidad de hidrólisis alcanzada en las formulaciones anteriores es preferentemente más de 12,5 pmol de sinigrina hidrolizada por minuto, más preferentemente más de 25 o aproximadamente 25 pmol de sinigrina/minuto, por ejemplo 50 o aproximadamente pmol de sinigrina/minuto, 75 o aproximadamente 75 pmol de sinigrina/minuto o 100 o aproximadamente 100 pmol de sinigrina/minuto.

La plaga diana puede ser cualquier plaga, incluida cualquier plaga procariota, incluida cualquier plaga procariota perteneciente al reino Monera y cualquier plaga eucariota perteneciente a los reino Protista, hongos, plantas y animales. Por consiguiente, las composiciones se pueden aplicar a cualquier sustrato que requiera tratamiento con plaguicidas. Las plagas a las que se pueden aplicar composiciones incluyen cualquier plaga de insectos, arácnidos o crustáceos, incluyendo garrapatas, ácaros, gorgojos, hormigas, mosquitos, etc. Otras plagas a las que se pueden aplicar composiciones son gusanos y nematodos. La formulación aplicada final puede ser un aerosol, polvo fino, humo, polvo, líquido o cualquier otra forma que se desee. La ruta de administración a las plagas puede variar y puede ser como se desee, por ejemplo, el producto plaguicida puede administrarse como un fumigante o a través de una exposición acuática o contacto directo. Tras la aplicación del plaguicida a la plaga, la incidencia o gravedad de la infestación o actividad de la plaga se limitará o se reducirá al menos durante un período de tiempo limitado o más prolongado y como tales, los métodos y composiciones nuevos desvelados en el presente documento proporcionan un medio para controlar plagas. El plaguicida puede aplicarse a cualquier sustrato que necesite tratamiento con plaguicida. Por ejemplo, el plaguicida se puede aplicar a cualquier cultivo agrícola, por ejemplo, cualquier cultivo de cereales, frutas u hortalizas en cualquier etapa de su desarrollo o antes o a un sustrato de crecimiento del cultivo, por ejemplo, suelo, antes del crecimiento del cultivo y/o producción o postproducción del cultivo.

Las tasas y los regímenes de aplicación de plaguicidas variarán y dependerán, entre otros, de la plaga a tratar, el sustrato al que se aplica el plaguicida, temperatura y otros factores ambientales y similares, sin embargo, los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las tasas y regímenes de aplicación. Cuando se aplica una formulación plaguicida seca de la presente divulgación a cultivos agrícolas, normalmente se mezclan 453,6 kg (1.000 lbs) de partes mezcladas con al menos 4.545 litros (1.000) galones de agua. Esta cantidad será suficiente para tratar 4.046,9 metros cuadrados (un acre) de cultivo. A modo de ejemplo, una mezcla que comprende 228,6 kg (504 lbs) de harina de Sinapis alba y 228,6 kg (504 lbs) de un concentrado de sinigrina al 24% se mezclan preferentemente con entre 22.730 y 136.383 litros (5.000 y 30.000 galones) de agua y se aplican a 4.046,9 metros cuadrados (un acre) de cultivo. Cuando se utiliza una formulación acuosa, se pueden usar cantidades en kilogramos de ambas partes. Solo a modo de ejemplo, se pueden mezclar 3,5 kg de un concentrado de sinigrina al 24% con 1,3 kg de harina de Sinapis alba (utilizando 0,08 unidades de actividad de mirosinasa/mg de sinigrina) y aplicarse a un cultivo utilizando entre 22.730-13.683 litros (5.000 y 30.000 galones) de agua, en donde 1 galón son 4,546 litros, 1 lb son 0,4537 kilogramos y 1 acre son 4.046,9 metros cuadrados.

Ejemplo 1. Preparación de precursores de plaguicida inactivos que comprenden material vegetal de mostaza y concentrado de glucosinolato

La sinigrina purificada se preparó de la siguiente manera: se produjo un concentrado semipurificado de sinigrina, comenzando primero con semilla molida de Brassica júncea de la que se había expulsado el aceite. Se añadió agua a la semilla molida en 10 partes de agua por 1 parte de material vegetal y la suspensión resultante se agitó de manera que la sinigrina entrara en solución en la suspensión. A continuación, la suspensión se procesó mediante centrifugación utilizando un decantador para generar una fase líquida enriquecida en sinigrina y sólidos extraídos. La concentración de sinigrina en la fase líquida se incrementó adicionalmente mediante nanofiltración para separar la sinigrina de los minerales y otros componentes solubles en agua de menor peso molecular (esto es opcional). La concentración de sinigrina en el extracto se concentró adicionalmente mediante la eliminación del aceite residual en el extracto mediante separación en una centrífuga de discos apilados (esto es opcional). A continuación, la fase líquida se evaporó para concentrar adicionalmente. A continuación, el concentrado semipurificado final se secó utilizando un secador por pulverización hasta una concentración final de > 30% de sinigrina. El material de prueba final que contiene las diversas concentraciones de sinigrina se preparó mezclando el concentrado de sinigrina semipurificado con material vegetal seco que contiene mirosinasa activa, en proporciones apropiadas para lograr la concentración final objetivo de sinigrina.

La harina de mostaza seca se preparó de la siguiente manera: se secaron semillas enteras de mostaza blanca (Sinapsis alba) previamente hasta <6% de humedad residual, seguido de la expulsión de la semilla para eliminar la mayor parte del aceite. La harina final contenía menos del 15 % de aceite residual. Las temperaturas durante el presecado y la expulsión de la semilla se mantuvieron por debajo de 70 °C para evitar la desnaturalización y por tanto, la pérdida de actividad de mirosinasa.

Se prepararon muestras de precursores de plaguicida que comprenden harina de mostaza de Sinapis alba y concentraciones variables de sinigrina seca.

Ejemplo 2. Determinación de la actividad de mirosinasa de origen natural en la harina de semillas de mostaza Se preparó harina de semillas de mostaza desaceitada prensada en frío de varias especies de mostaza y se determinaron las unidades de actividad de mirosinasa por gramo de harina de semillas de mostaza desaceitada prensada en frío. Los resultados se exponen en la Tabla 1.

Tabla 1: Actividad de mirosinasa en diferentes es ecies de mostaza

La actividad de mirosinasa se determinó midiendo el área del pico de sinigrina utilizando GC de espacio de cabecera en muestras de una mezcla de harina de semillas (que contiene mirosinasa y sinigrina) y tampón durante varios puntos temporales y calculando los jmoles de sinigrina convertidos por minuto de incubación.

Ejemplo 3. Determinación del contenido de sinigrina de origen natural en la harina de semillas de mostaza

Se preparó harina de semillas de mostaza desaceitada prensada en frío de varias especies de mostaza y se determinó la cantidad de sinigrina por gramo de harina de semillas de mostaza desaceitada prensada en frío. Los resultados se exponen en la Tabla 2.

Tabla 2: Concentraciones de sini rina en diferentes es ecies de mostaza

El contenido de sinigrina de la harina de semillas se determinó utilizando HPLC con detección UV, comparando el área del pico de un estándar de referencia puro con el de los extractos de harina de semillas y las mezclas de prueba. Ejemplo 4. Determinación de la actividad de mirosinasa en función de la sinigrina de origen natural en la harina de semillas de mostaza

Basándose en los resultados descritos en los Ejemplos 2 y 3, se determinó la actividad de mirosinasa/mg de sinigrina en diversas semillas de mostaza. Los resultados se presentan en la Tabla 3.

Tabla 3: Pro orción de mirosinasa res ecto a sini rina

Por tanto, en Brassica júncea por cada mg de sinigrina presente en la harina desaceitada prensada en frío, hay 0,96 unidades de actividad de mirosinasa y cuando se considera Brassica carinata, por cada mg de sinigrina presente en la harina desaceitada prensada en frío, hay 0,86 unidades de actividad de mirosinasa. Este conjunto de datos muestra adicionalmente, que Sinapis alba tiene una actividad de mirosinasa mayor que Brassica júncea o Brassica carinata, pero como se indica en la Tabla 2 anterior, Sinapis alba no contiene sinigrina de forma natural.

Ejemplo 5. Actividad de mirosinasa en harina de mostaza de Brassica júncea

Se preparó harina de Brassica júncea y se midió la hidrólisis de sinigrina en función del tiempo. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: Actividad de mirosinasa de Brassica júncea

Los datos muestran que la harina de Brassica júncea desaceitada prensada en frío que tiene una proporción de unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina de 0,96:1, presenta una velocidad de reacción de 12,5 |jmol de sinigrina hidrolizada por minuto. Esto representa la velocidad de reacción obtenible utilizando harina de semillas de mostaza sin la inclusión de sinigrina exógena.

Ejemplo 6. Tasas de reacción en sistemas precursores de plaguicida de dos partes

Se prepararon diversas muestras conteniendo sinigrina y harina de mostaza y se utilizaron para ensayar la actividad de mirosinasa. Se mezclaron muestras de sinigrina y de harina de mostaza y la reacción se inició mediante la adición de agua. La Tabla 5 muestra las composiciones de las diversas muestras, así como las unidades de actividad de mirosinasa en las muestras. Las muestras 1-4 son solo para referencia. La actividad de mirosinasa se midió como se describe en el Ejemplo 2.

Tabla 5: Velocidades de hidrólisis de mirosinasa

Las velocidades de hidrólisis de origen natural en material vegetal de mostaza son de 12,5 jm ol de sinigrina por minuto (véase: muestra n.° 1). En una proporción de unidad de actividad de mirosinasa/mg de sinigrina decreciente, la velocidad de hidrólisis de sinigrina aumenta de 28 jm ol de sinigrina por minuto en una proporción de unidad de actividad de mirosinasa/mg de sinigrina de 2,36:1 (véase: muestra n.° 3) a 96,9 jm ol de sinigrina por minuto en una proporción de unidad de actividad de mirosinasa/mg de sinigrina de 0,47:1 (véase: muestra n.° 7). Por tanto, sorprendentemente, se requiere una cantidad mucho menor de unidades de actividad de mirosinasa/mg de sinigrina para lograr una mayor velocidad de hidrólisis que la cantidad que está presente naturalmente en la harina de semillas. En las condiciones seleccionadas para los ensayos, la velocidad de la reacción de hidrólisis puede aumentarse de 12,5 jm ol de sinigrina por minuto a 96,8 jm ol de sinigrina por minuto. Este aumento en la velocidad de reacción representa un aumento del 87% en la velocidad de reacción, en comparación con la velocidad de hidrólisis que se produce cuando se utiliza material vegetal de mostaza (harina de Brassica júncea desaceitada prensada en frío). Al mismo tiempo, es posible reducir la disponibilidad de unidades de actividad de mirosinasa en casi un 50 % por gramo de formulación final, cayendo la actividad de mirosinasa por mg de sinigrina de 0,96 en la harina de Brassica júncea a 0,47 en la muestra n.° 7.

Ejemplo de referencia 7. Producción de isotiocianato de alilo en la producción del sistema precursor de plaguicida de Brassica carinata de dos partes

Se prepararon y mezclaron muestras de harina de Brassica carinata y de sinigrina y se inició la reacción de hidrólisis mediante la adición de agua. Tras 10 minutos de incubación, se utilizó cromatografía de gases para identificar un pico de AITC. Los resultados se muestran en la tabla 6.

T l : r i n i i i n lil n Br i rin

Puede verse a partir de los resultados mostrados en la Tabla 6 que al disminuir la proporción de unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina de 0,86 a 0,7, el pico de AITC aumenta de un área de pico de 68 a 307. Adicionalmente, este pico todavía se puede mantener reduciendo las unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina a 0,58. Estos datos complementan los datos del Ejemplo 5, perfilando la velocidad de hidrólisis aumentada de |jmol de sinigrina por minuto, ya que el isotiocianato de alilo es un producto de degradación formado tras la hidrólisis de sinigrina catalizada por mirosinasa. La producción de AITC se determinó utilizando Headspace GC (cromatografía de gases de espacio de cabecera), tomando muestras del espacio de cabecera por encima de los extractos de harina de semillas y mezclas de prueba y midiendo el área de pico del pico de AITC en comparación con el de un estándar de referencia puro.

Ejemplo de referencia 8. Producción de isotiocianato de alilo en la producción del sistema precursor del plaguicida de Brassica carinata de dos partes

Se prepararon y mezclaron muestras de harina de Sinapis alba y de sinigrina y se inició la reacción de hidrólisis mediante la adición de agua. Tras 10 minutos de incubación, se utilizó cromatografía de gases para identificar un pico de AITC. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

T l 7: r i n i i i n lil n in i l

Puede verse a partir de los resultados mostrados en la Tabla 7 que al disminuir las unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina de 9,34 a 4,22, el pico de AITC aumenta desde un área de pico de 227 a 448. Esto representa un aumento en la producción de AITC en 10 minutos de aproximadamente un 50%, incluso con un contenido reducido de mirosinasa en la formulación final de aproximadamente un 55%. Estos datos complementan los datos del Ejemplo 5, perfilando la velocidad de hidrólisis aumentada de jm ol de sinigrina por minuto, ya que el isotiocianato de alilo es un producto de degradación formado tras la hidrólisis de sinigrina catalizada por mirosinasa.

La producción de AITC se determinó utilizando Headspace GC (cromatografía de gases de espacio de cabecera), tomando muestras del espacio de cabecera por encima de los extractos de harina de semillas y mezclas de prueba y midiendo el área de pico del pico de AITC en comparación con el de un estándar de referencia puro.

Ejemplo 9. Actividad nematicida y fungicida del sistema precursor de plaguicida de dos partes

Se preparó un extracto de harina de Brassica júncea para tratar nódulos radiculares en plantas de tomate. El extracto de harina se aplicó a un cultivo de tomate tras mezclar el extracto con agua utilizando diferentes tasas de aplicación 680,4 kg/4.046,9 metros cuadrados; 453,6 kg/4.046,9 metros cuadrados; 340 kg/4.046,9 metros cuadrados (1.500 lbs/acre; 1.000 lbs/acre y 750 lbs/acre), manteniendo una proporción de unidades de actividad de mirosinasa por mg de concentración de sinigrina de 0.96. Las especificaciones se muestran adicionalmente en la Tabla 8. Como se muestra en la Tabla 8 y la Figura 1, en las diferentes tasas de aplicación, se obtuvo un control de nódulos radiculares que variaba de un 87% - 100%. Se preparó un conjunto de dos partes de la preparación del precursor de plaguicida utilizando harina de Sinapis alba como la primera parte y la fuente de mirosinasa y un extracto de sinigrina al 24% como la segunda parte. Cada una de las partes se mezcló con agua y a continuación, las dos partes se incorporaron y se aplicaron diferentes cantidades a un cultivo de tomate para controlar una infección de nódulos radiculares de las raíces. La proporción de unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina de la mezcla para cada cantidad aplicada fue de 0,21. La Tabla 8 y la Figura 1 muestran que en unas unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina que son 4,57 veces menores (0,21) que la actividad presente de forma natural en la harina (0,96), se puede obtener la misma actividad plaguicida. Se utilizaron las mismas formulaciones para controlar el hongo Phythium sobre las plantas de tomate. Como puede observarse en la Figura 1, utilizando la formulación de Brassica júncea que tiene una unidad de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina de 0,96, se puede obtener un nivel de control de plagas de entre un 86 % y un 95 % (utilizando las diferentes proporciones de aplicación especificadas). De nuevo, utilizando la formulación de dos partes que tiene una unidad de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina de 0,21, se pueden conseguir niveles de control similares, que varían entre un 83 % y un 87 %, a pesar de las cantidades mucho menores de mirosinasa presentes en estas formulaciones.

T l : n r l n l r i l r iliz n n i m r

En un experimento adicional, la unidad de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina de una formulación de Sinapis alba de dos partes se redujo adicionalmente, de 0,21 a 0,004 unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina, reduciendo la cantidad relativa de harina de Sinapis alba en la formulación y cada una de las formulaciones se aplicó en dos tasas de aplicación diferentes a un cultivo de tomate para controlar los nematodos formadores de agallas. La Tabla 9 y la Figura 2 muestran las especificaciones y los resultados. La reducción de 50 veces en las unidades de actividad de mirosinasa por mg de sinigrina dio como resultado niveles similares de control de plagas. En este experimento, las unidades de actividad de mirosinasa/mg de sinigrina relativas a las unidades de actividad de mirosinasa presentes de forma natural/mg de sinigrina (0,96) se redujeron 240 veces. Este Ejemplo demuestra por tanto adicionalmente que pueden incluirse niveles inesperadamente bajos de mirosinasa en el sistema precursor de dos partes para obtener un producto eficaz.

Tabla 9: Control de nódulos radiculares utilizando diferentes concentraciones de actividad de^ mirosinasa/sini rina

continuación

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un sistema precursor de plaguicida de dos partes que comprende menos de un 0,5 % de productos de degradación de glucosinolatos, que comprende dos partes separadas, (a) una primera parte que comprende un concentrado de sinigrina y (b) una segunda parte que comprende una harina de semillas de Sinapis alba, que comprende un complejo de mirosinasa activa en una concentración suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos tras mezclar la primera y la segunda parte en presencia de agua, en donde tras mezclar las dos partes se obtiene una formulación en la que las unidades de actividad de mirosinasa por unidad de masa de sinigrina son menos de 0,96 unidades de mirosinasa/mg de sinigrina.

2. El sistema precursor de plaguicida de dos partes de acuerdo con la reivindicación 1, en donde tras la mezcla se obtiene una formulación que comprende menos de 0,5 unidades de actividad de mirosinasa/mg de sinigrina.

3. El sistema precursor de plaguicida de dos partes de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde tras la mezcla se obtiene una formulación que comprende menos de 0,20 unidades de actividad de mirosinasa/mg de sinigrina.

4. El sistema precursor de plaguicida de dos partes de acuerdo con la reivindicación 1, en donde más de 12,5 pmol de sinigrina se hidroliza por unidad de complejo de mirosinasa activa tras la mezcla de la primera y la segunda parte en presencia de agua.

5. Un sistema precursor de plaguicida de dos partes de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera parte es un concentrado seco de sinigrina y la segunda parte es una harina seca de semillas de Sinapis alba y el primer y el segundo componente se incorporan para formar una mezcla, en donde la humedad relativa del concentrado de sinigrina y la de la harina seca de semillas de Sinapis alba es de un 15 % o menos.

6. El sistema precursor de plaguicida de dos partes de acuerdo con la reivindicación 1, en donde al menos una de las dos partes se prepara en forma líquida.

7. Un método de preparación de un sistema precursor de plaguicida de dos partes que comprende menos de un 0,5 % de productos de degradación de glucosinolatos, que comprende preparar (a) una primera parte, que comprende un concentrado de sinigrina y (b) una segunda parte, que comprende una harina de semillas de Sinapis alba que comprende un complejo de mirosinasa activa en una concentración suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos tras mezclar el primer y el segundo componente en presencia de agua, en donde tras mezclar las dos partes se obtiene una formulación en la que las unidades de actividad de mirosinasa por unidad de masa de sinigrina son menos de 0,96 unidades de mirosinasa/mg de sinigrina.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde tras la mezcla se obtiene una formulación que comprende menos de 0,5 unidades de actividad de mirosinasa/mg de sinigrina.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde más de 12,5 pmol de sinigrina se hidroliza por unidad de complejo de mirosinasa activa tras la adición de agua a la mezcla.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la primera parte es un concentrado seco de sinigrina y la segunda parte es una harina seca de semillas de Sinapis alba y la primera y la segunda parte se incorporan para formar una mezcla, en donde la humedad relativa del concentrado de sinigrina y la de la harina seca de semillas de Sinapis alba que comprende un complejo de mirosinasa activa es menor de un 15 %.

11. Un método para controlar plagas que comprende:

(a) proporcionar un sistema precursor de plaguicida de dos partes que comprende menos de un 0,5% de productos de degradación de glucosinolatos, comprendiendo dicho sistema:

(i) una primera parte que comprende un concentrado de sinigrina; y

(ii) una segunda parte que comprende una harina de semillas de Sinapis alba que comprende un complejo de mirosinasa activa en una concentración suficiente para liberar una cantidad eficaz de productos de degradación de glucosinolatos tras la adición de agua a la mezcla, en donde tras mezclar las dos partes se obtiene una formulación en la que las unidades de actividad de mirosinasa por unidad de masa de sinigrina son inferiores a 0,96 unidades de mirosinasa/mg de sinigrina;

(b) mezclar la primera y la segunda parte del sistema para obtener una mezcla que comprende la primera y la segunda parte;

(c) añadir agua a la mezcla; y

(d) aplicar el sistema a un sustrato que necesita tratamiento con plaguicida.